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Gene Or Protein
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ETRE
(17)
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Protein A
(9)
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Est-a
(8)
[9][_]
La Protein
(7)
[10][_]
Protein
(6)
[11][_]
Galactosidase
(6)
[12][_]
?-fetoprotein
(5)
[13][_]
Phosphatase
(3)
[14][_]
DANS
(2)
[15][_]
Enolase
(2)
[16][_]
Calmodulin
(2)
[17][_]
CES
(1)
[18][_]
Dit Protein
(1)
[19][_]
Sepa
(1)
[20][_]
Gir
(1)
[21][_]
Malate Dehydrogenase
(1)
[22][_]
Acti
(1)
[23][_]
Trai
(1)
[24][_]
Protease
(1)
[25][_]
Ote
(1)
[26][_]
Chro
(1)
[27][_]
Molecule
(25/ 48)
[28][_]
thyroxine
(9)
[29][_]
calcitonin
(8)
[30][_]
anti-thyroxine
(5)
[31][_]
DES
(2)
[32][_]
water
(2)
[33][_]
glucose
(2)
[34][_]
oNPG
(2)
[35][_]
styrene
(1)
[36][_]
minee
(1)
[37][_]
triiodothyronine
(1)
[38][_]
glutaraldehyde
(1)
[39][_]
carbodiimide
(1)
[40][_]
dimaleimide
(1)
[41][_]
succinimide
(1)
[42][_]
cyanogen bromide
(1)
[43][_]
sodium periodate
(1)
[44][_]
epichlorohydrin
(1)
[45][_]
carbonyldiimidazole
(1)
[46][_]
p-toluenesulfonyl chloride
(1)
[47][_]
sodium chloride
(1)
[48][_]
ammonium sulfate
(1)
[49][_]
2-mercaptoethylamine
(1)
[50][_]
o-nitrophenol
(1)
[51][_]
CO
(1)
[52][_]
malate
(1)
[53][_]
Physical
(16/ 22)
[54][_]
0,1 ml
(4)
[55][_]
de 1 ml
(3)
[56][_]
1 ml
(2)
[57][_]
20 mg
(1)
[58][_]
10 mg/ml
(1)
[59][_]
2 ml
(1)
[60][_]
0,1 M
(1)
[61][_]
420 nm
(1)
[62][_]
de 0,5 ml
(1)
[63][_]
3 pl
(1)
[64][_]
151-ng/mg
(1)
[65][_]
192 ng/ml
(1)
[66][_]
de 0,1 ml
(1)
[67][_]
0,5 ml
(1)
[68][_]
5 pg/dl
(1)
[69][_]
11,0 pg/dl
(1)
[70][_]
Polymer
(9/ 20)
[71][_]
Polysaccharides
(4)
[72][_]
Dextrane
(3)
[73][_]
Cellulose
(3)
[74][_]
Polystyrene
(3)
[75][_]
Agarose
(2)
[76][_]
Polyacrylamide
(2)
[77][_]
Silicone
(1)
[78][_]
Sephadex
(1)
[79][_]
Sepharose
(1)
[80][_]
Substituent
(4/ 4)
[81][_]
N,N-o-phenylene
(1)
[82][_]
N,N'-o-phenyl
(1)
[83][_]
o-nitrophenyl-5-D
(1)
[84][_]
amino
(1)
[85][_]
Chemical Role
(2/ 3)
[86][_]
hormones
(2)
[87][_]
antibiotic
(1)
[88][_]
Generic
(3/ 3)
[89][_]
N-hydroxy-m-maleimidobenzoyl-ester
(1)
[90][_]
salt
(1)
[91][_]
galactoside
(1)
[92][_]
Organism
(1/ 1)
[93][_]
mene
(1)
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Publication
_________________________________________________________________
Number FR2519764A1
Family ID 1921780
Probable Assignee Amano Pharma Co Ltd
Publication Year 1983
Title
_________________________________________________________________
FR Title PROCEDE D'IMMUNODETERMINATION D'ENZYMES EN PHASE SOLIDE PAR
APPLICATION DE CHROMATOGRAPHIE A UNE SEULE COLONNE
Abstract
_________________________________________________________________
LA PRESENTE INVENTION EST CARACTERISEE EN CE QUE, DANS
L'IMMUNODETERMINATION (OU IMMUNODOSAGE) D'ENZYMES CLASSIQUE EN PHASE
SOLIDE, TOUTES LES ETAPES ALLANT DE L'ETAPE DE REACTION IMMUNOLOGIQUE
DU OU DES COMPOSANTS A REACTION IMMUNOLOGIQUE, OU D'UN COMPLEXE
IMMUNOLOGIQUE DE CES PRODUITS, AVEC UN PRODUIT REAGISSANT ADSORBE SUR
UN SUPPORT, JUSQU'A L'ETAPE DE MESURE D'ACTIVITE DE L'ENZYME CONTENUE
DANS LE PRODUIT INSOLUBILISE RESULTANT, SONT REALISEES PAR APPLICATION
DE CHROMATOGRAPHIE A UNE SEULE COLONNE. LE PROCEDE DE LA PRESENTE
INVENTION A DES AVANTAGES TELS QU'UN GRAND NOMBRE D'ANTIGENES OU
D'ANTICORPS PEUVENT ETRE DETERMINES EN UTILISANT UNE ENZYME IDENTIQUE
OU UN SUPPORT INSOLUBLE IDENTIQUE, CETTE GRANDE SENSIBILITE ET CETTE
GRANDE PRECISION POUVANT ETRE OBTENUES SANS OPERATIONS DIFFICILES POUR
LE PROCEDE.
Description
_________________________________________________________________
1. La presente invention se rapporte a un nouveau
procede d'immunodetermination (ou immunodosage) pour la de-
termination de quantites de substances infinitesimales
presentes dans les fluides de l'organisme (ou fluides bio-
logiques),tels que le serum et le fluide cerebrospinal, de mammiferes.
Le terme "immunodetermination", tel qu'utilise ici, se refere a un
proced dans lequel la reaction d'une substance antigene de maniere
immunologique (de maniere serologique) (un produit dit antigene) avec
un produit dit anticorps, qui lui correspond du point de vue
immunologique, est appliquee a la determination de la quantite ou de
la concentration d'antigene ou d'anticorps present dans le fluide.
Classiquement, divers procedes, tels que la bio-
determination ou des procedes de mesure d'activite d'enzy-
mes, ont ete disponibles pour la determination de quantites de
substances infinitesimales presentes dans les fluides
biologiques Cependant, ces procedes ne sont pas satisfai-
sants par suite de leur fonctionnement ennuyeux et de leur
sensibilite ou de leur precision inadequates Par opposi-
tion, la technique d'immunodetermination, qui a ete recem-
ment mise au point, peut fournir une sensibilite et une pre-
cision nettement elevees sans exiger d'operations diffici-
2,
les En consequence, cette technique est maintenant emplo-
yee dans les domaines de la biochimie et de la medecine clinique.
Divers genres de procedes d'immunodetermina-
tion (ou d'immunodosage) ont ete proposes, parmi lesquels les procedes
utilisant un antigene ou un anticorps combine (ou marque) avec un
radioisotope,ure matiere fluorescente ou une enzyme ont trouve une
large application De maniere plus specifique, les modes dits en phase
solide dans ces procedes d'immunodetermination en utilisant les
matieres de
marquage ont ete considere comme etant les plus avanta-
geux. Dans le procede d'immunodetermination en phase solide, le
produit reagissant dit adsorbe sur un support est utilise comme
matiere de reaction, qui a ete preparee
en adsorbant, dans des conditions reactionnelles specifi-
ques, un anticorps, un produit dit antianticorps (c'est-a-
dire un anticorps produit en utilisant un anticorps comme antigene),
ou un produit dit protein A (c'est-a-dire une protein speciale
produite par certains microorganismes et ayant l'aptitude a reagir
avec divers anticorps) sur un
support insoluble dans l'eau,tel que des morceaux de poly-
styrene ou de silicone,des polysaccharides insolubles dans
l'water etc pour insolubiliser le premier produit, ces pro-
duits reagissants adsorbes sur un support dans des cas
particuliers etant designes ci-apres sous le nom d'anti-
corps sur un support,d'antianticorps sur un support, ou de
protein A sur un support, respectivement.
On explique maintenant ci-dessous le principe general du procede
d'immunodetermination (ou immunodosage) en phase solide en utilisant
une enzyme comme matiere de
marquage, avant de proceder a la description de la presente
invention.
Au moins un membre choisi dans le groupe se com-
posant d'un antigene, d'un anticorps, d'un antigene marque
et d'un anticorps marque (ces produits sont designes gene-
ralement ci-apres sous le nom de composants a reaction immu-
nologique), ou un complexe immunologique de ces produits, 3, est mis a
reagir de maniere immunologique avec un produit reagissant adsorbe sur
un support,choisi dans le groupe se composant d'un anticorps sur un
support, d'un antianticorps sur un support et d'une protein A sur un
support, en une seule fois ou en deux fois, pour fournir ainsi un
produit insolubilise forme par la liaison de l'antigene marque (ou de
l'anticorps marque) ou de son complexe immunologique sur le produit
reagissant adsorbe sur le support,avec une
partie soluble non liee de l'antigene marque (ou de l'an-
ticorps marque) Apres que l'antigene marque non lie (ou l'anticorps
marque) a ete separe du produit insolubilise,
l'activite de l'enzyme contenue dans le produit insolubili-
se (particulierement la capacite d'adsorption du melange
reactionnel de l'enzyme avec son substrat) est mesuree.
Typiquement, les memes modes operatoires que ci-dessus sont
repetes avec diverses quantites de l'antigene (ou de l'an-
ticorps) et, en utilisant les valeurs mesurees, on cons-
truit une courbe de calibrage qui represente la relation entre la
quantite d'antigene (ou d'anticorps) initialement
utilisee et l'activite de l'enzyme qui y est fixee Ensui-
te, on realise les memes modes operatoires avec un fluide biologique
contenant une quantite inconnue de l'antigene (ou de l'anticorps) pour
mesurer l'activite de l'enzyme contenue dans le produit resultant
insolubilise Ensuite, on calcule la quantite ou la concentration de
l'antigene (ou
de l'anticorps) present dans le fluide a partir de la va-
leur mesuree, en se referant a la courbe de calibrage.
Alors que le procede d'immunodetermination d'enzymes en phase solide,
comme indique ci-dessus, a une
sensibilite et une precision elevees, de maniere avantageu-
se, il presente l'inconvenient d'exiger des operations en-
nuyeuses. La demanderesse a realise des etudes sur le
procede d'immunodetermination (ou d'immunodosage) d'enzy-
mes classique en phase solide et a invente une technique tres
efficace, en conduisant toutes les etapes, a partir
de l'etape de la reaction immunologique du ou des compo-
sants a reaction immunologique ou d'un complexe immunolo-
gique de ces produits avec un produit reagissant adsorbe 4, sur un
support jusqu'a l'etape de mesure de l'activite de l'enzyme contenue
dans le produit insolubilise resultant,
en appliquant la chromatographie avec une seule colonne.
Selon le procede de la presente invention, on peut determiner un grand
nombre d'antigenes ou d'anticorps en utilisant une enzyme identique ou
un support insoluble
identique et une sensibilite et une precision elevees peu-
vent etre obtenues sans etre affectees par les composants
interferants indesirables presents dans le fluide biologi-
que, alors qu'aucune operation difficile n'est exigee pour
le procede En particulier, le procede de la presente inven-
tion permet la determination fortement sensible d'anticorps dans du
serum, ce qui a ete considere comme difficile
dans la technique anterieure.
En outre,en plus du procede d'immunodetermina-
tion d'enzymes en phase solide,on connait jusqu'a present une autre
technique d'immunodetermination d'enzymes, dans laquelle un melange
reactionnel immunologique de composants a reaction immunologique est
soumis a un mode operatoire physico-chimique, tel que la
chromatographie and permeatiop sur
gel, la chromatographie a affinite ou analogues, pour sepa-
rer l'antigene marque (ou l'anticorps marque) libre,suivi de la mesure
de l'activite de l'enzyme contenue dans le restant pour determiner la
concentration de l'antigene ou de
l'anticorps initialement present Cependant,le procede con-
nu d'immunodetermination (ou d'immunodosage) d'enzymes com-
me ci-dessus, differe par sa conception technique du proce-
de de la presente invention, parce que la chromatographie du
premier procede s'applique non pas a la reaction immunologi-
que mais a une reaction physico-chimique En outre, le pro-
cede utilisant la chromatographie physico-chimique a,par op-
position avec le procede de la presente invention, des in-
convenients du fait que les genres d'enzymes de marquage et de
materiaux d'adsorption pour l'utilisation doivent
etre soigneusement choisis dans des cas particuliers.
La presente invention sera maintenant decrite en relation avec les
dessins ci-joints dans lesquels: La figure 1 est un tableau de marche
schematique ' illustrant divers modes de fonctionnement de l'etape de
reaction immunologique (c'est-a-dire l'etape precedant l'etape de
mesure d'activite d'enzyme) impliquee dans le procede de la presente
invention; La figure 2 est un graphique illustrant la courbe
de calibrage obtenue dans l'exemple 1 qui sera donne ulte-
rieurement; et La figure 3 est un graphique illustrant la courbe de
calibrage obtenue dans l'exemple 5 qui sera egalement
donne ulterieurement.
Tout d'abord, l'etape de reaction immunologique, c'est-a-dire l'etape
precedant l'etape de mesure d'activite
d'enzyme, impliquee dans le procede de la presente inven-
tion,peut etre realisee suivant divers modes de fonctionne-
ment Ces modes de fonctionnement sont expliques ci-dessous en se
referant au tableau de marche schematique represente sur la figure 1
On doit, cependant,comprendre que, dans
la description suivante, on ne mentionne pas les produits
de la reaction immunologique ne contenant pas d'enzyme de marquage
parce que leur presence n'exerce pas d'influence
sur l'immunodetermination selon la presente invention.
Lorsque l'on mentionne une quantite plus ou moins grande d'un
composant a reaction immunologique, cela signifie une
quantite respectivement plus ou moins grande que l'equi-
valent reactionnel par rapport a la quantite donnee du com-
posant a reaction immunologique a faire reagir.
Mode (a): une quantite predeterminee d'un anti-
corps marque 2-4 est mise a reagir avec une plus petite
quantite d'un antigene 1 pour fournir un complexe immuno-
logique 1-2-4 se composant de l'anticorps marque 2-4 et de
l'antigene 1, avec une partie libre non liee 2-4 de l'anti-
corps marque On fait passer le melange reactionnel a tra-
vers une colonne garnie d'un support 5 ayant une plus gran-
de quantite de l'anticorps 2 adsorbe dessus, et, de ce fait,
un produit insolubilise forme par liaison du complexe anti-
corps marque-antigene 1-2-4 sur l'anticorps sur le support -2 est
produit, alors que l'anticorps marque non lie 2-4 est evacue de la
colonne, 6.
Mode (b): Contrairement au mode (a), on fait rea-
gir une quantite predeterminee d'un antigene marque 1-4 avec une plus
petite quantite d'un anticorps 2 pour fournir * un complexe antigene
marque-anticorps 2-1-4 et une partie non liee 1-4 de l'antigene marque
On fait passer le melan- ge reactionnel a travers une colonne garnie
d'un support ayant une plus grande quantite d'un antianticorps ou
d'une protein A 3 adsorbee dessus, et de ce fait, un pro-
duit insolubilise forme par liaison du complexe antigene
marque-anticorps 2-1-4 sur l'antianticorps sur le support ou la
protein A sur le support 5-3 est produit, alors que
l'antigene marque non lie 1-4 est evacue de la colonne.
Mode (c): Ce mode est le meme que le mode (b) ci-dessus, sauf que
l'antigene 1 est ajoute au systeme reactionnel en quantite equivalente
a ou differente de celle de l'antigene marque 1-4 (ci-apres designee
brievement par
"quantite differente"), et, de ce fait, la reaction immuno-
logique est effectuee pour fournir un complexe antigene
marque-anticorps 2-1-4 et une partie libre non liee 1-4 de l'antigene
marque On fait passer le melange reactionnel a travers une colonne
garnie d'un support 5 ayant une plus grande quantite d'un
antianticorps ou d'une protein A-3 adsorbee dessus Ainsi, un produit
insolubilise forme par
liaison du complexe antigene marque-anticorps 2-1-4 sur l'an-
tianticorps sur le support ou la protein A sur le support -3 est
produit, alors que l'antigene marque non lie 1-4
est evacue de la colonne.
Mode (d): Une quantite predeterminee d'un anti-
gene marque 1-4 est melangee avec une quantite differente d'un
antigene non marque 1 et on fait passer le melange a travers une
colonne garnie d'un support 5 ayant une plus petite quantite d'un
anticorps 2 adsorbee dessus Ainsi, un produit insolubilise forme par
liaison de l'antigene marque 1-4 sur l'anticorps sur le support 5-2
est produit, alors
que l'antigene marque non lie 1-4 est evacue de la colonne.
Mode (e): Une quantite predeterminee d'un anti-
gene 1 est envoyee a travers une colonne garnie d'un sup-e
port 5 ayant une plus grande quantite d'un anticorps 2 ad-
7, sorbee dessus pour fournir un antigene-anticorps sur un support
5-2-1 Ulterieurement, une plus grande quantite
d'un anticorps marque 2-4 est envoyee a travers la colon-
ne et, de ce fait, un produit insolubilise forme par liai-
son de l'anticorps marque 2-4 sur l'antigene-anticorps sur le support
5-21 est produit,alors que l'anticorps
marque non lie 2-4 est evacue de la colonne.
Mode (f): On fait passer une quantite predeter-
minee d'un anticorps 2 a travers une colonne garnie d'un
support 5 ayant une plus grande quantite d'un antianti-
corps ou d'une protein A 3 adsorbee dessus pour fournir
un anticorps-antianticorps ou une protein A sur un sup-
port 5-2-3 Ulterieurement, une plus grande quantite d'un antigene
marque 1-4 est envoyee a travers la colonne et, de ce fait,un produit
insolubilise forme par la liaison de l'antigene marque 1-4 sur
l'anticorps-antianticorps sur un support ou sur l'anticorps-protein A
sur un support -2-3 est produit, alors que l'antigene marque non lie
1-
4 est evacue de la colonne.
Ensuite, selon le procede de la presente inven-
tion, l'etape de mesure d'activite enzymatique, apres
l'etape de reaction immunologique comme expliquee ci-des-
sus, est realisee comme suit.
Apres que l'etape de reaction immunologique a ete
realisee par l'un quelconque des modes operatoires (a) -
(f),la colonne est lavee avec une solution tampon, et
l'activite de l'enzyme de marquage 4, contenue dans le pro-
duit insolubilise qui a ete maintenu dans la colonne, est mesuree par
passage a travers la colonne d'une solution contenant un substrat pour
l'enzyme Typiquement, les modes
operatoires precedents sont prealablement repetes, avec di-
verses quantites de l'antigene 1 ou de l'anticorps 2, et
les valeurs mesurees sont portees graphiquement en fonc-
tion des quantites d'antigene 1 ou d'anticorps 2 initiale-
ment utilisees pour construire une courbe de calibrage.
Ensuite, les memes modes operatoires que ci-dessus sont conduits en
utilisant un fluide biologique contenant une
quantite inconnue de l'antigene 1 ou de l'anticorps 2 En-
8. suite, la concentration de l'antigene 1 ou de l'anticorps
2 dans le fluide est calculee a partir de la valeur mesu-
ree par reference a la courbe de calibrage.
Dans la mise en pratique de la presente inven-
tion, la reaction immunologique, la reaction d'un antigene
ou d'un anticorps avec une matiere de marquage, et l'ad-
sorption d'un anticorps, d'un antianticorps ou d'une protei-
ne A sur un support insoluble, sont obtenues a une tempera-
ture allant d'environ 40 C a environ 40 C, comme cela est courant avec
les reactions biochimiques Dans la plupart des cas, le temps exige
pour achever ces reactions est 10
minutes ou davantage.
L'antigene 1 a determiner (ou a doser) par le procede de la presente
invention peut etre l'une quelconque
des hormones et des proteins contenues dans divers flui-
des biologiques, les fonctions de certaines de ces protei-
nes n'ayant pas ete expliquees Des exemples specifiques de l'antigene
comprennent l'insuline, la triiodothyronine,
la thyroxine, la calcitonin, l'?-fetoprotein, la protei-
ne dite S-100, l'enolase, la calmodulin, l'immunoglobuline A de
secretion et analogues En outre, les niveaux dans le
sang de produits pharmaceutiques administres exterieure-
ment, tels que les antibiotic, peuvent etre aussi deter-
mines L'anticorps 2 pour l'utilisation dans le procede de
la presente invention est un anticorps correspondant a l'an-
tigene 1 indique ci-dessus La plupart de ces antigenes 1, de ces
anticorps 2, de ces antianticorps 3, ou de fluides biologiques les
contenant sont disponibles dans le commerce sous forme purifiee, et
ces preparations commerciales ont 3 Q ete utilisees dans les exemples
de la presente invention
donnes ulterieurement.
Des exemples specifiques de l'enzyme de marquage pour l'utilisation
dans le procede de la presente invention comprennent la
e-D-galactosidase, une phosphatase alcaline, la peroxydase, la glucose
oxydase, la malate dehydrogenase
et analogues Une telle enzyme 4 peut etre couplee a un an-
tigene 1 ou a un anticorps 2 par n'importe quel mode opera-
toire classique Ainsi, ceci peut etre realise en utilisant 9, un
reactif bifonctionnel comme agent de couplage, tel que
le glutaraldehyde, la carbodiimide, la N,N-o-phenylene-
dimaleimide, l'N-hydroxy-m-maleimidobenzoyl-ester-
succinimide, ou analogues.
Des exemples specifiques du support insoluble 5 pour l'utilisation
dans le procede de la presente invention comprennent des
polysaccharides, tels que l'agarose, le dextrane, la cellulose, etc,
des resines synthetiques telles que le polystyrene, la polyecrylamide,
etc, et des morceaux de verre Dans la realisation du procede de la
presente invention, il est souhaitable que le produit rea-
gissant adsorbe sur le support, se composant d'un anticorps 2, d'un
antiant corps 3 ou d'une protein A 3 adsorbe sur le support insoluble
5, soit sous forme finement spherique ou finement fibreuse, tant que
le taux d'ecoulement du melange reactionnel immunologique a travers la
colonne
n'est pas reduit en proportion excessive.
La reaction d'adsorption d'un anticorps 2, d'un
antianticorps 3 ou de la protein A 3 sur un support insolu-
ble 5 peut etre realisee par n'importe quel mode operatoi-
re classique Par exemple, ceci peut etre realise en acti-
vant un polysaccharide insoluble avec un agent d'activation tel que le
cyanogen bromide, le sodium periodate, l'epichlorohydrin, le
l,l'carbonyldiimidazole, le p-toluenesulfonyl chloride ou analogues,
suivi d'addition d'un
anticorps ou analogues au polysaccharide active La quanti-
te d'anticorps 2, d'antianticorps 3 ou de protein A 3 pour
l'utilisation dans ce but est convenablement dans la gamme
de 0,1 a 20 mg par millilitre du support insoluble.
L'anticorps 2,1 'antianticorps 3 ou
la protein
A 3 pour l'utilisation dans le procede de la presente inven-
tion peut etre constitue de fragments dits actifs, isoles.
Dans le cas d'un anticorps 2 ou d'un antianticorps 3, par
exemple, les fragments actifs peuvent etre isoles par trai-
tement avec une protease telle que la papaine, la pepsine
ou analogues.
Par suite de petits volumes d'echantillons ordi-
nairement disponibles pour l'immunodetermination, de la 10.
simplification des operations et de l'obtention d'un
temps de fonctionnement raisonnablement court, il est sou-
haitable que la capacite de la colonne pour l'utilisation
dans le procede de la presente invention ne soit pas supe-
rieure a 1 ml. En outre, en realisant le procede de la presente
invention, toute interference avec la reaction immunologi-
que peut etre empechee par la technique prealablement pro-
posee par la demanderesse, c'est-a-dire par l'addition d'une protein
hydrophobe (par exemple la gelatine) avec un salt (par exemple le
chlorure de sodium chloride) au systeme de
reaction immunologique.
Le procede selon la presente invention est plus specifiquement
illustre par les exemples suivants, sans
aucune limitation.
Exemple 1 Determination d'insuline ( 1 &#x003E; Preparation d'un
anticorps et d'un anticorps marque Une preparation commerciale
d'insuline de porc,
ayant ete extraite du pancreas de porc, a ete utilisee com-
me antigene Une preparation commerciale de serum contenant
un anticorps, ayant ete produite par injection de l'antige-
ne a un-cochon d'Inde, a ete traitee selon les modes operatoires
classiques, tels que le fractionnement avec du
ammonium sulfate et une chromatographie sur DEAE (die-
thylaminoethyl)-cellulose pour isoler l'anticorps L'anti-
corps ainsi obtenu a ete partage par addition de pepsine et puis
soumis a une chromatographie sur colonne en utilisant
le produit dit Sephadex G-150, et, de ce fait, les frag-
ments actifs de l'anticorps ont ete isoles Ces fragments
actifs ont ete reduits par la 2-mercaptoethylamine a la ma-
niere ordinaire et puis mis a reagir avec la N,N'-o-phenyl-
lenedimaleimide pour la reunir aux fragments actifs re-
duits Ensuite, le produit reactionnel a ete en outre mis
a reagir avec une preparation commerciale de e-D-galactosi-
dase pour preparer les fragments actifs marques par la e-D-
galactosidase (ci-apres designes simplement par anticorps marque).
L'antigene indique precedemment (c'est-a-dire l'in-
11.
suline de porc) et son anticorps correspondant ont generale-
ment l'aptitude a reagir de maniere immunologique avec d'au-
tres insulines de serum (en tant qu'antigenes) provenant d'un grand
nombre d'especes animales (comprenant l'espece humaine) et leurs
anticorps correspondants, si bien qu'ils peuvent etre utilises dans la
determination des insulines (en tant qu'antigenes) ou de leurs
anticorps correspondants
contenus dans les fluides biologiques de nombreuses espe-
ces animales (par exemple l'espece humaine).
( 2) Preparation d'un anticorps sur un support Un anticorps sur un
support a ete prepare en
adsorbant l'anticorps obtenu en ( 1) ci-dessus sur un sup-
port insoluble dans l'water (produit dit Sepharose active par CNBR) a
la maniere ordinaire, ( 3) Construction d'une courbe de calibrage
A des parties de 1 ml d'une solution tampon conte-
nant 100 p U/ml d'un anticorps marque indique en ( 1) ci-
dessus, on a ajoute 0,1 ml de chacune des solutions aqueu-
ses contenant de plus petites quantites (c'est-a-dire O a 320 i U/ml)
de l'antigene, et les melanges ont ete soumis a
l'incubation a 37 C pendant 2 heures pour fournir un com-
* plexe anticorps marque-antigene avec une partie non liee de
l'anticorps marque, Dans cet exemple et dans d'autres exemples, "U"
represente la quantite unitaire d'une hormone
ayant ete adoptee dans le procede de determination stan-
dard Alors, on a fait passer chacun des melanges reaction-
nels a travers une colonne garnie d'une plus grande quanti-
te de l'anticorps sur le support prepare en ( 2) ci-dessus, et, de ce
fait, le produit insolubilise forme par liaison du complexe anticorps
marque-antigene sur l'anticorps sur le support est produit,alors que
l'anticorps marque non lie a ete evacue de la colonne Apres que la
colonne a ete lavee
avec une solution tampon, 0,1 ml d'une solution aqueuse con-
tenant 10 mg/ml d'o-nitrophenyl-5-D-galactoside (ci-apres designe par
oNPG) a ete deverse dans la colonne, qui a ete alors soumise a
l'incubation a 37 C pendant 2 heures pour produire de l'o-nitrophenol
La colonne a ete lavee avec
2 ml d'une solution 0,1 M de Na 2 CO 3 et la capacite d'absorp-
12. tion a 420 nm du filtrat a ete mesuree pour determiner
l'activite de l'enzyme ayant ete contenue dedans Les va-
leurs mesurees ont ete portees graphiquement par rapport aux quantites
d'antigene initialement utilisees pour construire une courbe de
calibrage, comme presente sur la
figure 2.
D'autre part,le mode operatoire ci-dessus a ete
modifie en preparant une serie de solutions contenant l'an-
tigene suivant les memes quantites que precedemment et en
faisant passer chacune de ces solutions a travers une co-
lonne garnie d'anticorps sur le support Apres que la co-
lonne a ete lavee, on a fait passer la meme quantite de
l'anticorps marque,suivi de mesure de la capacite d'absorp-
tion du filtrat De cette maniere, une courbe de calibrage
tres semblable a celle de la figure 2 a ete obtenue.
( 4 &#x003E; Determination de l'insuline dans du serum humain
Un echantillon de serum humain, ayant une con-
centration inconnue (mais tombant dans la gamme de 0-320
11 U/ml comme defini en ( 3) ci-apres, c'est la meme defini-
tion) d'insuline, a ete utilise comme antigene, et on a
realise le meme mode operatoire que dans la premiere par-
tie de ( 3) Ainsi, on a fait reagir 0,1 ml de l'echantil-
lon avec l'anticorps marque, et on a fait passer le melange
reactionnel a travers une colonne garnie d'anticorps sur le support
Apres que l'on a deverse de l'o-NPG dans la colonne
et qu'on l'a soumise a l'incubation, on a mesure la capaci-
te d'absorption du filtrat de colonne Quand on l'a calcu-
lee a partir de la valeur mesuree par reference a la courbe de
calibrage representee sur la figure 2, la concentration d'insuline
dans l'echantillon a ete trouvee a une valeur de 92 p U/ml A titre de
comparaison, le meme echantillon a
ete soumis au mode semblable dans la radio-immunod&termina-
tion classique en phase solide (ci-apres designee par RIA) en
utilisant un radio-isotope comme materiau de marquage, si bien que la
concentration d'insuline dans l'echantillon
a ete estimee a 102 p U/ml.
D'autre part, le meme echantillon a ete traite dans le meme mode
operatoire que dans la derniere partie de 13,
( 3) Ansi, la concentration d' nsuline dans l'echantil-
lon a ete trouvee a 95 p U/Ml, A titre de comparaison, le meme
echantillon a ete soumis a une RIA classique, si bien que la
concentration d'insuline dans l'echantillon a ete estimee a 105 p
U/Ml. Exemple 2 Determination de l'anticorps anti-thyroxine ( 1)
Preparation d'un antigene marque d'un anticorps Une preparation
commerciale de thyroxine ayant ete isolee a partir d'un extrait de
glandes de thyroide de porc a ete utilisee comme antigene Le groupe
amino de
cet antigene a ete couple au groupe SH de la B-D-galacto-
sidase a la maniere ordinaire pour former un antigene
marque D'autre part, une preparation commerciale de se-
rum contenant un anticorps, ayant ete produite par injec-
tion d'antigene a un lapin, a ete immediatement utili-
see comme anticorps.
( 2) Preparation d'un antianticorps sur un support
Generalement, l'immunoglobuline G (ci-apres desi-
gnee par Ig G), qui est un genre de protein presente de par sa nature
dans le serum d'animaux, a l'aptitude a reagir avec des substances
antigenes, provenant d'un grand
nombre d'especes animales, et, de fait, avec les proprie-
tes d'un anticorps qui leur correspond En consequence, l'Ig G a ete
utilisee largement pour la preparation d'un
antianticorps. Dans cet exemple,une preparation commerciale de serum
contenant un
antianticorps, ayant ete produite par injection d'Ig G de lapin a une
chevre, a ete traitee de la meme maniere que dans ( 1) de l'exemple 1
pour isoler
l'antianticorps En utilisant l'antianticorps ainsi iso-
le, on a realise le meme mode operatoire que dans ( 2) de
l'exemple 1 pour preparer un antianticorps sur un support.
( 3) Construction d'une courbe de calibrage
A des parties de 0,5 ml d'une dilution de l'anti-
gene marque prepare en ( 1) ci-dessus, on a ajoute 3 pl
de chacune des dilutions de serum contenant de plus peti-
tes quantites de l'anticorps, et,apres achevement de la reaction,
chacun des melanges reactionnels a ete envoye a 14. trayers une
colonne garnie d'une plus grande quantite de l'antianticorps sur un
support prepare en ( 2), Ensuite, le
mode operatoire en ( 3) de l'exemple 1 a ete suivi pour cons-
truire une courbe de calibrage.
D'autre part, le mode operatoire ci-dessus a ete modifie en preparant
une serie de dilutions de serum ( 0,5
ml chacune) contenant l'anticorps, suivant les memes quan-
tites que precedemment, et en faisant passer chacune des solutions a
travers une colonne garnie d'antianticorps sur un support Apres que la
colonne a ete lavee, on a fait passer,and travers, la meme quantite de
l'antigene marque, suivi de mesure de la capacite d'absorption des
filtrats de colonne De cette maniere, on a obtenu une courbe de
calibrage tout a fait semblable a celle decrite ci-dessus.
( 4) Determination d'anticorps anti-thyroxine dans du se-
rum de lapin Un echantillon de serum de lapin a concentration inconnue
d'anticorps anti-thyroxine a ete traite dans le meme mode operatoire
que dans la premiere partie de ( 3) pour mesurer la capacite
d'absorption du filtrat Quand on l'a calculee a partir de la valeur
mesuree par reference a la courbe de calibrage construite en ( 3)
ci-dessus,la
concentration de l'anticorps anti-thyroxine dans l'echantil-
lon a ete trouvee a 1,05 U/ml De maniere semblable le meme echantillon
a ete traite de la meme maniere que dans la deuxieme partie de ( 3),
ce qui a permis de determiner la
concentration d'anticorps anti-thyroxine a 1,10 U/ml.
Exemple 3 Determination de l'anticorps anti-insuline ( 1) Preparation
d'un antigene marque Une preparation commerciale d'insuline de porc a
ete utilisee comme antigene Le meme mode operatoire qu'en
( 1) de l'exemple 1 a ete realise pour marquer la $-D-galac-
tosidase sur l'antigene D'autre part, une preparation com-
merciale de serum contenant un anticorps, ayant ete produi-
te par injection de l'antigene a un cochon d'Inde, a
ete immediatement utilisee comme anticorps.
( 2) Preparation d'un antianticorps sur un support Une preparation
commerciale de serum contenant un 15. antianticorps (c'est-a-dire
anticorps vis-a-vis de l'Ig G de cochon d'Inde) ayant ete produite par
injection d'Ig G de cochon d'Inde a un lapin a ete traitee a la
maniere
ordinaire pour isoler l'antianticorps En utilisant l'an-
tianticorps,le mode operatoire en ( 2) de l'exemple 2 a ete
suivi pour preparer un antianticorps sur un support.
( 3) Construction d'une courbe de calibrage
A des parties de 1 ml d'une solution tampon con-
tenant l'antigene marque prepare en ( 1), on a ajoute une
serie de dilutions de serum contenant de plus petites quan-
tites de l'anticorps, et, apres achevement de la reaction, chacun des
melanges reactionnels a ete envoye a travers une
colonne tassee d'une plus grande quantite de l'antianti-
corps sur le support prepare en ( 2) Ensuite, la colonne a
ete traitee dans le meme mode operatoire que dans la pre-
miere partie de ( 3) de l'exemple 2 pour mesurer la capacite
d'absorption du filtrat de colonne, Les valeurs mesurees ont ete
portees graphiquement par rapport aux quantites
d'anticorps initialement utilisees pour construire une cour-
be de calibrage.
( 4) Determination d'anticorps anti-insuline dans du serum de cochon
d'Inde
Un echantillon de serum de cochon d'Inde a concen-
tration inconnue en anticorps anti-insuline a ete traite
dans le meme mode operatoire qu'en ( 3) ci-dessus, pour mesu-
rer la capacite d'absorption du filtrat Quand on calcule a partir de
la valeur mesuree par reference a la courbe de calibrage en ( 3)
ci-dessus, la concentration de l'anticorps
anti-insuline dans l'echantillon a ete trouvee a 0,76 p U/ml.
Exemple 4 Determination d'?-fetoprotein ( 1) Preparation d'un
anticorps marque Une preparation commerciale d'"-fetoproteine ayant
ete isolee a partir d'un serum humain a ete utilisee comme antigene
Une preparation commerciale de serum contenant un anticorps ayant ete
produite par injection de l'antigene a une chevre a ete traitee a la
maniere ordinaire pour
isoler i'anticorps En utilisant l'anticorps, le mode ope-
ratoire en ( 1) de l'exemple 1 a ete suivi pour preparer un 16.
anticorps marque.
( 2) Preparation d'un anticorps sur un support
En utilisant le produit dit Toyopearl HW-55 (mar-
que deposee) en tant que support insoluble, on a prepare un anticorps
sur un support a la maniere ordinaire. ( 3) Construction d'une courbe
de calibrage A des parties de 1 mi d'une solution contenant
l'anticorps marque prepare en ( 1), on a ajoute de plus pe-
tites quantites de l'antigene, et, apres achevement de la reaction, on
a fait passer chacun des melanges reactionnels a travers une colonne
garnie d'une plus grande quantite de l'anticorps sur un support
prepare en ( 2), Ensuite, la
capacite d'absorption du filtrat de colonne a ete mesuree.
Les valeurs mesurees ont ete portees graphiquement par rap-
port aux quantites d'antigene initialement utilisees pour
construire une courbe de calibrage.
( 4) Determination d'?-fetoprotein dans du serum humain Un echantillon
de serum humain,a concentration inconnue d'?-fetoprotein, a ete traite
par le meme mode operatoire qu'en ( 3) ci-dessus, pour mesurer la
capacite d'absorption 'du filtrat de colonne Quand on l'a calculee a
partir de la valeur mesuree par reference a la courbe de
calibrage en ( 3) ci-dessus, la concentration d'a-fetopro-
teine dans l'echantillon a ete trouvee a 151-ng/mg A titre de
comparaison, le meme echantilloi a'Ote soumis au mode
semblable dans la RIA, si bien que la concentration d'a-feto-
protein dans l'echantillon a ete estimee a 192 ng/ml.
Exemple 5 Determination de calcitonin ( 1) Preparation d'un anticorps
Une preparation commerciale de calcitonin, ayant ete isolee a partir
d'un extrait de glandes thyroides de porc, aoute utilisee comme
antigene Une preparation commerciale
de serum contenant un anticorps, ayant ete produite par in-
jection de l'antigene dans un lapin, a ete traitee de la meme maniere
qu'en ( 1) de l'exemple 1 pour isoler ainsi l'anticorps. 17, ( 2)
Preparation d'un antigene marque et d'un antianticorps sur un support
Le mode operatoire en ( 1) de l'exemple 2 a ete suivi pour preparer un
antigene marque D'autre part, un antianticorps sur un support a ete
prepare en conduisant
le meme mode operatoire qu'en ( 2) de l'exemple 2.
( 3) Preparation de solutions d'antigene ayant differentes
concentrations Une solution aqueuse de l'antigene a ete diluee pour
preparer une serie de solutions d'antigene contenant 0 a 150 MRC m
U/ml de l'antigene ("MRC U" se refere a la quantite unitaire de
calcitonin dans ld procede standard
de biodetermination).
( 4) Construction d'une courbe de calibrage A des parties de 0,1 ml
d'une solution contenant l'antigene marque prepare en ( 2) ci-dessus,
on a ajoute 0,5 ml de chacune des solutions contenant de plus petites
quantites de l'anticorps en ( 1), ainsi que 0,1 ml de cha-
cune des solutions d'antigene preparees en ( 3) Apres ache-
vement de la reaction, chacun des melanges reactionnels a ete envoye a
travers une colonne Ensuite, la colonne a
ete traitee dans le meme mode operatoire qu'en ( 3) de l'exem-
ple 2 pour mesurer la capacite d'absorption du filtrat Les valeurs
mesurees ont ete portees graphiquement par rapport
aux quantites d'antigene initialement utilisees pour cons-
truire une courbe de calibrage,comme presente sur la figure 3.
( 5) Determination de calcitonin dans un extrait de thyroi-
de de porc Un echantillon d'extrait de thyroide de porc, ayant une
concentration inconnue en calcitonin, a ete traite dans le meme mode
operatoire qu'en ( 3) ci-dessus pour mesurer la capacite d'absorption
du filtrat Quand on l'a calculee a partir de la vapeur mesuree par
reference a
la courbe de calibrage presentee sur la figure 3, la concen-
tration de calcitonin dans l'echantillon a ete trouvee a
MRC m U/ml.
18. Exemple 6 Determination de la thyroxine ( 1) Preparation d'un
antigene marque et d'un anticorps Une preparation commerciale de
thyroxine, ayant ete isolee a partir d'un extrait de glandes thyroldes
de
porc, a ete utilisee comme antigene Le meme mode operatoi-
re qu'en ( 1) de l'exemple 2 a ete conduit pour preparer un antigene
marque D'autre part, une preparation commerciale de serum contenant
l'anticorps correspondant a l'antigene a ete traitee de la meme
maniere qu'en ( 1) de l'exemple 1
pour isoler l'anticorps.
( 2) Preparation d'un anticorps sur un support Le meme mode operatoire
qu'en ( 2) de l'exemple 1
a ete conduit pour preparer un anticorps sur un support.
( 3) Preparation de solutions d'antigene ayant differentes
concentrations Une solution aqueuse de l'antigene a ete diluee
pour preparer une serie de solutions d'antigene ayant dif-
ferentes concentrations.
( 4) Construction d'une courbe de calibrage A des parties de 1 ml
d'une solution contenant l'antigene marque prepare en ( 1), on a;
ajoute les solutions d'antigene preparees en ( 3) Chacun des melanges
resultants a ete passe a travers une colonne garnie d'une plus petite
quantite de l'anticorps sur un support, et la colonne a ete traitee
parle meme mode operatoire qu'en ( 3) de l'exemple 1 pour mesurer la
capacite d'absorption du filtrat de la colonne Les valeurs mesurees
ont ete portees graphiquement
par rapport aux quantites d'antigene initialement utili-
sees pour construire une courbe de calibrage.
( 5) Determination de thyroxine dans un extrait de thyroide de porc Un
echantillon d'extrait de thyroide de porc, a concentration inconnue en
thyroxine, a ete traite dans le mene mode operatoire qu'en ( 3)
ci-dessus pour mesurer la capacite d'absorption du filtrat de colonne,
Quand on 4 l'a calculee a partir de la valeur mesuree par reference a
la
courbe de calibrage construite en ( 4) ci-dessus, la concen-
tration de thyroxine dans l'echantillon a ete trouvee a 19,,5 pg/dl, A
titre de comparaison, le meme echantillon a ete soumis au mode
semblable dans la RIA, si bien que
la concentration de thyroxine a ete estimee a 11,0 pg/dl.
La presente invention n'est pas limitee aux exem-
ples de realisation qui viennent d'etre decrits, elle est au contraire
susceptible de modifications et de variantes
qui apparaitront a l'homme de l'art.
20.
Claims
_________________________________________________________________
REVENDICATIQNS1 Procede d'imrunodetermination (ou d'"immunodo-sage)
d'enzymes en phase solidequi consiste (a) a fairereagir par voie
immunologique au moins un composant a reac-tion immunologique choisi
dans le groupe se composant d'unantigene, d'un anticorps, d'un
antigene marque et d'un an-ticorps marque, ou d'un complexe
immunologique de ces pro-duits, avec un produit reagissant adsorbe sur
un support, choisi dans le groupe se composant d'un anticorps sur
unsupport, d'un antianticorps sur un support et de la protei-ne A sur
un support, en une seule fois ou en deux fois, pour fournir un produit
insolubilise forme par liaison de l'anticorps marque (ou de
l'anticorps marque) ou de son complexe immunologique sur le produit
reagissant adsorbesur le support avec une partie soluble non liee de
l'anti-gene'marque (ou de l'anticorps marque); (b) a separer
l'antigene marque (ou l'anticorps marque) non lie; (c) a mesurer
l'activite de l'enzyme contenue dans le produitinsolubilise; (d) a
construire, en repetant les etapes (a)-(c) ci-dessus, une courbe de
calibrage representant larelation entre la quantite d'antigene (ou
d'anticorps) ini-tialement presente et l'activite de l'enzyme qui y
est fi-xee, (e) a realiser les memes modes operatoires que ci-dessus
avec un fluide biologique contenant une quantite in-connue de
l'antigene (ou de l'anticorps) pour mesurer ain-si l'activite de
l'enzyme contenue dans le produit insolu-hilise resultant, et (f) a
calculer la quantite (concentra-tion) d'antigene (ou d'anticorps)
presente dans le fluidebiologique par reference a la courbe de
calibrage, caracte-rise en ce que toutes les etapes allant de l'etape
de reac-tion immunologique du ou des composants a reaction
immunolo-gique, ou d'un complexe immunologique de ces produits,avec un
produit reagissant adsorbe sur un support (a) jus-qu'a l'etape de
mesure de l'activite d'enzyme contenue dansle produit insolubilise
resultant quand le fluide biologi-que a ete utilise (e) sont realisees
par application de chro-matographie a une seule colonne,.2 Procede
selon la revendication 1, caracterise21 2519764en ce que le complexe
immunologique ( 1-2-4) a ete prepare par la reaction d'une quantite
predeterminee d'un anticorps marque ( 2-4) avec une plus petite
quantite d'un antigene ( 1), alors que le produit reagissant adsorbe
sur un support se compose d'une plus grande quantite d'un anticorps (
2)adsorbe sur un support ( 5).3 Procede selon la revendication 1,
caracterise en ce que le complexe immunologique ( 2-1-4) a ete prepare
par la reaction d'une quantite predeterminee d'un antigene marque (
1-4) avec une plus petite quantite d'un anticorps ( 2), alors que le
produit reagissant adsorbe sur un support se compose d'une plus grande
quantite d'un antianticorps oude la protein A ( 3) adsorbee-sur un
support ( 5).4 Procede selon la revendication 1, caracterise en ce que
le ccmplexe immunologique ( 2-1-4) a ete prepare par la reaction d'une
quantite predeterminee d'un antigene marque ( 1-4) avec une plus
petite quantite d'un anticorps ( 2) ainsi qu'une quantite differente
d'un antigene ( 1), alors que le produit reagissant adsorbe sur un
support se compose d'une plus grande quantite d'un antianticorps oude
la protein A ( 3) adsorbee sur un support ( 5).Procede selon la
revendication 1, caracterise en ce que les composants a reaction
immunologique sontfournis par une quantite predeterminee d'un antigene
mar-que ( 1-4) et une quantite differente d'un antigene ( 1), alors
que le produit reagissant adsorbe sur un supportse compose d'un
anticorps ( 2)adsorbe sur un support ( 5).6 Procede selon la
revendication l,caracterise en ce que les composants a reaction
immunologique sont constitues par une quantite predeterminee d'un
antigene( 1) et une plus grande quantite d'un anticorps marque ( 2-4),
et ces composants a reaction immunologique sont en-voyes
successivement a travers une colonne garnie du pro-duit reagissant
adsorbe sur un support, se composant d'une plus grande quantite d'un
anticorps ( 2) adsorbee surun support ( 5).7 Procede selon la
revendication 1, caracterise en ce que les composants a reaction
immunologique sont
22. constitues par une quantite predeterminee d'un anticorps( 2) et
une plus grande quantite d'un antigene marque ( 1-4), et ces
composants a reaction immunologique sont envo-yes successivement a
travers une colonne garnie du produit reagissant adsorbe sur un
support, se composant d'une plus grande quantite d'un antianticorps ou
de la protein A( 3) adsorbee sur un support ( 5).8 Procede selon l'une
quelconque des revendica-tions 2 a 7, caracterise en ce que l'antigene
( 1) consti-tuant un des composants a reaction immunologique est un
membre choisi dans le groupe se composant d'insuline,
detriiodothyronine, de thyroxine, de calcitonin, d'?-fetoprotein, de
protein dite S-100, d'enolase, de calmodulin,et d'immunoglobuline A de
secretion.9 Procede selon l'une quelconque des revendica-tions 2 a
7,caracterise en ce que le support insoluble ( 5) constituant le
produit feagissant adsorbe sur le supportest un membre choisi dans le
groupe se composant d'agaro-se, de dextrane, de cellulose, de
polystyrene, de polyacrylamide et des morceaux de verre.Procede selon
la revendication 8, caracteri-se en ce que le support insoluble ( 5)
constituant le pro-duit reagissant adsorbe sur un support est un
membre choi-si dans le groupe se composant d'agarose, de dextrane,
decellulose, de polystyrene, de polyacrylamide et de mor-Geaux de
verre.11 Procede selon l'une quelconque des revendica-tions 2 a 7,
caracterise en ce que l'enzyme de marquage ( 4) constituant l'antigene
marque ou l'anticorps marque est unmembre choisi dans le groupe se
composant de -D-galactosidase, de phosphatase alcaline, de peroxydase,
de glucose-oxydase et de malatedeshydrogenase.12 -Procede selon la
revendication 8, caracterise en ce que l'enzyme de marquage ( 4)
constituant l'antigene marque ou l'anticorps marque est un membre
choisi dans le groupe se composant de a-D-galactosidase, de
phosphatasealcaline, de peroxydase,de glucoseoxydase et de
malatede-shydrogenase. 23,13 Procede selon la revendication 9,
caracteri-se en ce que l'enzyme de marquage ( 4) constituant
l'antige-ne marque ou l'anticorps marque est unmentbre choisi dans le
groupe se composant de C-D-galactosidase, de phosphatase alcaline, de
peroxydase, de glucoseoxydase et de malate- deshydrogenase.14 Prodede
selon la revendication 10,caracteri-se en ce que l'enzyme de marquage
( 4) constituant l'antige-ne marque ou l'anticorps marque est un
membre choisi dans le groupe se composant de e-D-galactosidase, de
phosphatasealcaline,de peroxydase,de glucoseoxydase et de
malatedeshy-drogenase.Procede selon la revendication 9, caracte-rise
en ce que le produit reagissant adsorbe sur un sup-port est sous forme
finement spherique ou finement fibreu-se,tant que le taux d'ecoulement
du melange reactionnel immunologique a travers la colonne n'est pas
reduit enquantite excessive.16 Procede selon la revendication 9,
caracteri-se en ce que la capacite de la colonne pour
l'utilisationdans la chromatographie du present procede n'est pas
supe-rieure a 1 ml.
? ?
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