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[5][_]
Molecule
(53/ 176)
[6][_]
CATECHOL
(56)
[7][_]
HI
(21)
[8][_]
chloramphenicol
(8)
[9][_]
HOO
(4)
[10][_]
OH
(4)
[11][_]
phosphate
(4)
[12][_]
tetracycline
(4)
[13][_]
mitomycin C
(4)
[14][_]
ampicillin
(4)
[15][_]
TBAB
(4)
[16][_]
tris(hydroxymethyl)aminomethane
(4)
[17][_]
X-gal
(3)
[18][_]
acetone
(3)
[19][_]
Bamn
(3)
[20][_]
Cl
(3)
[21][_]
Xyl
(2)
[22][_]
toluene
(2)
[23][_]
water
(2)
[24][_]
kanamycin
(2)
[25][_]
streptomycin
(2)
[26][_]
thymine
(2)
[27][_]
dithiothreitol
(2)
[28][_]
adenosine triphosphate
(2)
[29][_]
DES
(2)
[30][_]
HOOD
(1)
[31][_]
OX
(1)
[32][_]
OOH
(1)
[33][_]
CHO
(1)
[34][_]
oxygen
(1)
[35][_]
3-pentadecylcatechol
(1)
[36][_]
adrenaline
(1)
[37][_]
noradrenaline
(1)
[38][_]
DOPA
(1)
[39][_]
DOPAMINE
(1)
[40][_]
4-methylcatechol
(1)
[41][_]
6,8-Phosphate
(1)
[42][_]
XPR
(1)
[43][_]
COOH
(1)
[44][_]
ORPR
(1)
[45][_]
ampicil
(1)
[46][_]
CSR
(1)
[47][_]
uracile
(1)
[48][_]
tris HCl
(1)
[49][_]
prit
(1)
[50][_]
ethidium
(1)
[51][_]
Tris-acetate
(1)
[52][_]
sodium
(1)
[53][_]
EDTA
(1)
[54][_]
acetate
(1)
[55][_]
ethidium bromide
(1)
[56][_]
riol
(1)
[57][_]
phenol
(1)
[58][_]
tryptophan
(1)
[59][_]
Gene Or Protein
(38/ 135)
[60][_]
Xyl
(31)
[61][_]
OXYGENASE
(23)
[62][_]
ETRE
(19)
[63][_]
TGB 1
(7)
[64][_]
Proteins
(6)
[65][_]
DANS
(4)
[66][_]
Endonucleases
(4)
[67][_]
Bgl
(3)
[68][_]
Plif
(2)
[69][_]
Est A
(2)
[70][_]
Galactosidase
(2)
[71][_]
Hsd
(2)
[72][_]
Spo
(2)
[73][_]
Cla
(2)
[74][_]
Hpa
(2)
[75][_]
Acti
(2)
[76][_]
LEURS
(1)
[77][_]
CES
(1)
[78][_]
Nuclease
(1)
[79][_]
Fragment C
(1)
[80][_]
Cys
(1)
[81][_]
Leu A
(1)
[82][_]
PAB
(1)
[83][_]
Tre
(1)
[84][_]
Ligase
(1)
[85][_]
Co I
(1)
[86][_]
Kpn
(1)
[87][_]
GATC
(1)
[88][_]
Pl-C
(1)
[89][_]
TGB
(1)
[90][_]
S1981
(1)
[91][_]
Escl
(1)
[92][_]
Psen
(1)
[93][_]
Gne
(1)
[94][_]
Teu
(1)
[95][_]
Cof
(1)
[96][_]
Arac
(1)
[97][_]
Rvn
(1)
[98][_]
Company Reg No.
(47/ 123)
[99][_]
TG 402
(15)
[100][_]
TG 408
(8)
[101][_]
TG 403
(7)
[102][_]
TG 406
(7)
[103][_]
TG 409
(7)
[104][_]
TG 405
(6)
[105][_]
TG 404
(6)
[106][_]
TG 407
(5)
[107][_]
TG 410
(5)
[108][_]
TG 200
(5)
[109][_]
TG 200 a
(3)
[110][_]
TG 200 R
(3)
[111][_]
TG 206
(3)
[112][_]
TG 411
(3)
[113][_]
TG 425
(3)
[114][_]
TG 427
(3)
[115][_]
TG 423
(2)
[116][_]
TG 412
(2)
[117][_]
TG 422
(2)
[118][_]
TG 4044 p
(1)
[119][_]
ts 857
(1)
[120][_]
TG 200 p
(1)
[121][_]
TG 201
(1)
[122][_]
TG 206 a
(1)
[123][_]
TG 402 a
(1)
[124][_]
TG 402 n
(1)
[125][_]
TG 424
(1)
[126][_]
TG 426
(1)
[127][_]
TG 428
(1)
[128][_]
TG 415
(1)
[129][_]
TG 4191 p
(1)
[130][_]
TG 420
(1)
[131][_]
TC 403
(1)
[132][_]
TG 402 E
(1)
[133][_]
TC-402
(1)
[134][_]
TG 414
(1)
[135][_]
TG 416 p
(1)
[136][_]
TG 417 p
(1)
[137][_]
TG 418 p
(1)
[138][_]
TC 419 p
(1)
[139][_]
TG 420 p
(1)
[140][_]
TG 421 p
(1)
[141][_]
TG 422 p
(1)
[142][_]
TG 426 p
(1)
[143][_]
TG 418
(1)
[144][_]
TG 421 M
(1)
[145][_]
TC 407
(1)
[146][_]
Organism
(18/ 87)
[147][_]
Bacillus subtilis
(23)
[148][_]
B subtilis
(21)
[149][_]
Escherichia coli
(20)
[150][_]
plasmid
(4)
[151][_]
Bacillus
(3)
[152][_]
Lactobacillus
(2)
[153][_]
Streptococcus
(2)
[154][_]
cat
(2)
[155][_]
Pseudomonas
(1)
[156][_]
Streptococcus lactis
(1)
[157][_]
Toxicodendron
(1)
[158][_]
Staphylococcus
(1)
[159][_]
Pseudomonas putida
(1)
[160][_]
Escherichia coli C
(1)
[161][_]
l Hind
(1)
[162][_]
TOL plasmid
(1)
[163][_]
Bacillus subtilis 168
(1)
[164][_]
phage lambda
(1)
[165][_]
Physical
(54/ 66)
[166][_]
0,1 M
(4)
[167][_]
20 pg/ml
(3)
[168][_]
4 l
(3)
[169][_]
1 l
(2)
[170][_]
10 minutes
(2)
[171][_]
50 pg/ml
(2)
[172][_]
6 m
(2)
[173][_]
1 pg
(2)
[174][_]
117 kb
(1)
[175][_]
50 percent
(1)
[176][_]
278 nm
(1)
[177][_]
375 mm
(1)
[178][_]
2,9 ml
(1)
[179][_]
0,1 ml
(1)
[180][_]
0,02 M
(1)
[181][_]
de 0,32 mg/ml
(1)
[182][_]
19 h
(1)
[183][_]
10 percent
(1)
[184][_]
de 0,10 pg/ml
(1)
[185][_]
15 pg
(1)
[186][_]
0,3 percent
(1)
[187][_]
de 20 pg/ml
(1)
[188][_]
5 pg/ml
(1)
[189][_]
2 d
(1)
[190][_]
6 mM
(1)
[191][_]
de 100 m
(1)
[192][_]
5 m
(1)
[193][_]
de 0,5 pg
(1)
[194][_]
50 pl
(1)
[195][_]
6,6 m
(1)
[196][_]
10 m
(1)
[197][_]
0,5 m
(1)
[198][_]
1 ml
(1)
[199][_]
de 8,90 kb
(1)
[200][_]
de 6 m
(1)
[201][_]
2 g
(1)
[202][_]
de 1 litre
(1)
[203][_]
de 1 ml
(1)
[204][_]
1 percent
(1)
[205][_]
0,8 percent
(1)
[206][_]
40 m
(1)
[207][_]
20 m
(1)
[208][_]
2 m
(1)
[209][_]
de 35 volts
(1)
[210][_]
0,5 pg/ml
(1)
[211][_]
30 minutes
(1)
[212][_]
2 h
(1)
[213][_]
409 M
(1)
[214][_]
33 M
(1)
[215][_]
416 M
(1)
[216][_]
420 M
(1)
[217][_]
423 M
(1)
[218][_]
1 J
(1)
[219][_]
11 W
(1)
[220][_]
Generic
(11/ 23)
[221][_]
semi-aldehyde
(7)
[222][_]
galactoside
(3)
[223][_]
acid
(3)
[224][_]
catecholamines
(2)
[225][_]
D-galactoside
(2)
[226][_]
catechols
(1)
[227][_]
aldehyde
(1)
[228][_]
oligonucleotide
(1)
[229][_]
amino acids
(1)
[230][_]
nucleotide
(1)
[231][_]
salt
(1)
[232][_]
Polymer
(3/ 11)
[233][_]
DNA
(7)
[234][_]
Agarose
(3)
[235][_]
Ribonucleic Acid
(1)
[236][_]
Chemical Role
(5/ 9)
[237][_]
colorant
(3)
[238][_]
poison
(3)
[239][_]
antibiotic
(1)
[240][_]
reagent
(1)
[241][_]
dye
(1)
[242][_]
Substituent
(7/ 7)
[243][_]
oxo
(1)
[244][_]
5-bromo-4-chloro-3-indolyl
(1)
[245][_]
isopropyl-o-D
(1)
[246][_]
5-bromo-4-chloro
(1)
[247][_]
3-indolyl
(1)
[248][_]
3-indolyl-o-D
(1)
[249][_]
deoxy
(1)
[250][_]
Disease
(1/ 2)
[251][_]
Allergies
(2)
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Images Mosaic View
Publication
_________________________________________________________________
Number FR2520753A1
Family ID 2433477
Probable Assignee Transgene Sa
Publication Year 1983
Title
_________________________________________________________________
FR Title NOUVEAUX VECTEURS D'EXPRESSION DE LA CATECHOL 2,3-OXYGENASE,
ENZYMES OBTENUES ET LEURS APPLICATIONS
Abstract
_________________________________________________________________
LA PRESENTE INVENTION CONCERNE UN PLASMIDE VECTEUR CARACTERISE EN CE
QU'IL COMPORTE AU MOINS:
-LE GENE Xyl CODANT POUR LA SYNTHESE DE LA CATECHOL 2,3-OXYGENASE, ET
-UN PROMOTEUR DE L'EXPRESSION FONCTIONNELLE DU GENE Xyl DANS UNE
BACTERIE GRAM.
LES BACTERIES TRANSFORMEES A L'AIDE DE CES PLASMIDES PEUVENT ETRE
UTILISEES POUR LE CLONAGE D'ADN ET EGALEMENT POUR LA SYNTHESE DE LA
CATECHOL 2,3-OXYGENASE.
Description
_________________________________________________________________
La presente invention concerne de facon generale le clonage et
l'expression du gene codant pour la catechol 2,3-oxygenase dans
differents microorganismes, notamment des bacteries gram + telles que
Bacillus subtilis et le phage M 13. Plus particulierement, la presente
invention concerne de nouveaux vecteurs, et en particulier des
plasmides vecteurs, de clonage et d'expression, ainsi
que leurs applications.
Enfin, la presente invention concerne l'application dans differents
domaines de l'enzyme
obtenue, a savoir la catechol 2,3-oxygenase.
Il est deja connu que certaines souches de
Pseudomonas ont la propriete de degrader le toluene.
Ces souches possedent, en effet, un plasmide appele TOL ou plif O (117
kb) codant pour une serie d'enzymes qui transforment progressivement
le toluene en derive directement assimilable par la cellule selon un
schema rappele ci-apres + HOODOJ UHa ale Anxxd 0113 z H 3 H apxqgple
ajeouaquad oxo Z alexele Aoxo-z go v anbluoanm qa 9 lej apxqgpleiulas
HOZ m HO u a 1:,Kx j-1,Kx Og: * HSWH HOO HO
HO HO
asr-qrapacq HOOD HOOZ)-Iry
0 O
D' -)a) v A (1-l,Kx (ajenjo-,) a 4 eozu Dq
D 1 "X
(1 swil(-Lou,:?) (O-1; aleuol OX 3012 xo HOO HOO HO HOO (a UQIAX) au
Qn Joi enbilxzuaq 7 lOOZ)le ap iqep 12 zuaq V-Eacx ox E Ha El A c w +
'i Il V 9 z DIAX IIGZul " 003 Vk MI 135 Z
USZOZSZ
aselople La catechol 2,3-oxygenase (C 2,3-0) est l'une de-ces enzymes
(EC n 1 13 11 2) Elle transforme le catechol en semi-aldehyde
muconique selon la reaction suivante:
OH OH
OH
02 OOH
CHO L'activite d'une telle enzyme peut etre facilement mise en
evidence par un test colore puisque le catechol se presente sous forme
incolore, alors que le produit de degradation, a savoir le
semialdehyde
muconique, presente une couleur jaune.
On appellera ci-apres et par abreviation la catechol 2,3-oxygenase: C
2,30, et le gene codant pour la synthese de cette enzyme: xyl E ou
bien
gene C 2,3-0.
Compte tenu du fait que, comme cela a ete indique precedemment, cette
enzyme degrade le catechol incolore pour le transformer en
semialdehyde jaune, il y a 1 l une possibilite d'obtenir un test
colore permettant de trier facilement un grand nombre de colonies
bacteriennes pour determiner lesquelles ont ete transformees par un
plasmide determine portant le gene xyl E ou bien dans lesquelles, au
contraire,
le gene xyl E a ete inactive.
Certains auteurs (ref 6,9,27) ont reussi a
faire exprimer le gene xyl E dans Escherichia coli.
Il etait donc interessant de mettre au point des plasmides comportant
le gene xyl E qui s'exprime dans des bacteries gram + car il est a
noter qu'il n'existe actuellement aucun test colore chez Bacillus
-subtilis par exemple qui est une bacterie de grande
importance industrielle.
Dans le cas des phages, en particulier du phage M 13, lequel est
utilise couramment sous forme notamment de phage M 13 mp 7 a titre de
moyen pour sequencer des ADN, le remplacement du test colore utilisant
le
colorant X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-B-D-
galactoside) par un test colore mettant en oeuvre le catechol
constituerait certainement un avantage considerable, tant sur le plan
de l'efficacite que sur le plan du prix, le catechol etant environ 1
000 fois
moins cher que le colorant X-gal.
Enfin, l'enzyme catechol 2,3-oxygenase ainsi preparee presente un
interet industriel important, tant par son action sur le catechol
lui-meme que sur
les derives dudit catechol.
Les applications selon la present 9 invention de l'enzyme catechol
2,3oxygenase peuvent etre regroupees autour de deux centres d'interet
essentiels: Tout d'abord l'industrie alimentaire; en effetl les fruits
contiennent une quantite importante de catechols qui, sous l'action de
la lumiere et de l'oxygen, sont transformes par les polyphenoloxydases
en composes colores qui sont responsables du brunissement
des fruits.
L'utilisation de la C 2,3-0 pour transformer le catechol des fruits en
aldehyde en empechant ainsi l'action des polyphenoloxydases peut donc
permettre
d'eviter le brunissement des fruits.
Pour cette utilisation, il est bien entendu possible d'utiliser
l'enzyme purifiee, mais on peut envisager egalement d'utiliser
directement la bacterie contenant ladite enzyme, en particulier
lorsqu'il s'agit deja de bacteries d'interet alimentaire telles
que Lactobacillus ou Streptococcus lactis.
L'enzyme C 2,3-0 est egalement utilisable dans l'industrie
pharmaceutique et cosmetique En effet, il est bien connu que le
catechol et certains derives du catechol constituent des allergenes
puissants, le plus connu, le 3-pentadecylcatechol de formule: H _OH
(CH 2)14-CH 3
etant present dans differentes especes de Toxicodendron tels que le
"poison ivy" et le "poison oak" ou "arbre poison"lesquels sont
responsables d'une allergie
de contact touchant presque 50 percent des americains.
Or, on a constate que la C 2,3-0 degradait le cycle aromatique de
derives apparentes et devait ainsi en diminuer
tres fortement l'allerginicite.
On peut envisager egalement dans le domaine pharma-
ceutique d'utiliser le C 2,3-0 pour modifier la structure des
catecholamines (adrenaline, noradrenaline, DOPA, DOPAMINE,).
Dans le domaine cosmetique, la C 2,3-0 peut egalement etre utilisee
pour limiter la presence de composes de type catechol qui apparait
lors de la degradation de certaines
bases cosmetiques.
Pour ces deux types d'application alimentaire et
cosmeto-pharmaceutique, il est particulierement interessant
de pouvoir preparer la C 2,3-0 a partir de Bacillus subtilis.
L'interet de Bacillus subtilis comme souche hote est qu'il s'agit, a
la difference d'Escherichia coli, d'un organisme non pathogene qui
n'est relie en aucune
maniere a une affection quelconque humaine ou animale.
C'est pourquoi l'utilisation de B subtilis ou des produits de son
metabolisme au stade industriel
est autorisee, a la difference d'E coli.
En outre B subtilis est parmi les bacteries gram + celle qui est la
plus connue et qui a ete le
plus largement etudiee.
Enfin, B subtilis est une bacterie largement utilisee dans l'industrie
pour la production d'enzymes, notamment d'amylases et de prbteases
dont les
conditions de culture industrielles sont bien connues.
Pour ce faire, la presente invention concerne des plasmides vecteurs
caracterises en ce qu'ils comportent au moins: le gene xyl E codant
pour la synthese de la catechol 2,3-oxygenase, et
un promoteur assurant l'expression fonction-
nelle du gene xy E dans une bacterie gram +.
Le promoteur de l'expression fonctionnelle du gene xyl E est, de
preference, obtenu a partir d'une sequence d'ADN chromosomique d'une
bacterie gram + Il est evident que les promoteurs envisages dans le
cadre de la presente invention peuvent etre divers et
s'adapter a chaque type particulier de souche gram +.
Comme cela a ete indique precedemment, l'interet de ces plasmides
vecteurs etant en priorite de pouvoir cloner des genes determines dans
Bacillus subtilis, ou bien d'obtenir l'enzyme C 2,3-0 par culture de B
subtilis, on recherchera de preference un promoteur de l'expression
fonctionnelle du gene xyl E dans une sequence d'ADN chromosomique de
Bacillus et plus particulierement de Bacillus subtilis.
Lorsque le plasmide vecteur selon la presente invention doit servir de
vecteur de clonage, il est particulierement interessant qu'il comporte
au moins un site unique de restriction situe a un endroit tel que
l'insertion d'une sequence d'ADN dans ce site conduise a
l'inactivation du gene xyl E Ainsi ce site peut etre situe, soit dans
le gene xyl E, ou bien en aval du promoteur et en amont du gene xyl E
Une telle inactivation peut facilement etre mise en evidence par une
pulverisation de catechol sur l'ensemble des colonies et selection des
colonies qui, bien que transformees, ne se colorent pas en jaune du
fait que
le gene xyl E n'est pas exprime.
Parmi les sites de restriction uniques
presentant un interet, il faut citer plus particuliere-
ment un site de restriction Bam Hl qui peut etre aisement introduit,
comme cela sera demontre dans les exemples pour les plasmides derives
de p TG 402 tels que
p TG 403, p TG 4044 p TG 405,p TG 406, p TG 407, p TG 408,p TG 409 et
p TG 410.
La presente invention concerne egalement des souches de Bacteries gram
+, en particulier les souches de Bacillus subtilis, transformees par
les plasmides selon la presente invention Parmi les genes de bacteries
gram + utilisables, il faut citer egalement les genres
Lactobacillus, Streptococcus et Staphylococcus.
La presente invention concerne egalement un autre type de vecteur qui
est un phage derive du phage M 13, caracterise en ce que son ADN
comporte au moins le gene xyl E codant pour la synthese de la catechol
2,3-oxygenase. De preference, l'ADN de ce phage comportera au moins un
site unique de restriction place de facon que l'insertion d'une
sequence ADN dans ce site inactive l'expression du gene xyl E De
preference, il existera plusieurs sites uniques de restriction
(appeles sites "de clonage multiple") qui joueront
la meme fonction.
L'interet du phage M 13 est le suivant; un derive de ce coliphage
filamenteux est utilise pour cloner et sequencer les ADN, il s'agit en
particulier du phage M 13 mp 7 developpe par le Dr J Messing et qui
est distribue par Bethesda Research Laboratories et PL Labs sous forme
d'ensemble pour cloner et sequencer les ADN. Ce phage comporte un site
de clonage multiple dans lequel il est possible d'inserer de nombreux
fragments de restriction tels que des fragments Eco Rl,
Bam Hl, Acc I, Hindll, Pst I et Sall.
Ainsi, lorsque l'on introduit dans le milieu de croissance d'une
souche et du phage M 13 mp 7 de
l'isopropyl-o-D-galactoside et du 5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-e-D-galactoside, 1 'isopropel-e-D-galactoside induit une
partie du gene lac Z sur le phage M 13 qui, lorsqu'il est complemente
par la partie finale du gene porte sur le facteur F' dans la meme
cellule, conduit a un phenotype 0-galactosidase positif Ceci a pour
effet de faire virer l'indicateur 5-bromno-4-clchloro-
3-indolyl-o-D-galactoside (colorant X-gal) au bleu.
L'insertion de fragment d'ADN au niveau du site de clonage multiple
cornduit a l'linactivation de la complementation a de la
g-galactosidase, dans ces
conditions l'indicateur colore ne change pas de couleur.
Toutefois, il faut remarquer que cet indicateur est tres cher, en
effet, il faut compter environ 3 francs d'indicateur par boite de
Petri, et comme dans chaque experience on est oblige d'utiliser un
grand nombre de boites, ceci conduit parfois a des depenses tres
importantes. L'utilisation du phage selon la presente invention permet
d'avoir recours a un indicateur beaucoup moins onereux, le catechol,
et, en outre, de pouvoir utiliser le phage M 13 dans differentes
souches sans etre dependants d'une complementation et donc de souches
particulieres contenant le gene
lac ZA M 15 comme dans le cas du phage M 13 mp 7.
Rappelons que pour son utilisation dans le sequencage, il faut
hybrider avec le DNA du phage un oligonucleotide d'une quinzaine de
bases complementaires
a la region du DNA tres proche du site d'insertion.
Independamment des vecteurs decrits precedemment en eux-memes, la
presente invention concerne egalement leur application au clonage de
genes dans des bacteries ainsi que les bacteries transformees par ces
plasmides et leur utilisation a la preparation de la catechol 2,3-
oxygenase Enfin, la presente invention concerne l'application de la
catechol 2,3-oxygenase obtenue, notamment par la mise en oeuvre de
bacteries selon
l'invention, a titre d'additif alimentaire, en parti-
culier d'agent de conservation dans l'industrie alimentaire et comme
conservateur en cosmetique, et a titre de principe actif en
therapeutique pour le traitement et la prevention des allergies
provoquees notamment par le catechol et des composes derives du
catechol.
Les proprietes de la catechol 2,3-oxygenase
ont ete etudiees sur des extraits bruts bacteriens.
L'extrait bacterien s'est revele capable d'oxyder, outre le catechol,
le 4-methylcatechol, avec l'apparition d'un produit jaune presentant 2
pics
d'absorption: 326 et 278 nm.
Pour mesurer l'activite enzymatique des
souches obtenues on utilise une technique spectrophoto-
metrique en mesurant l'accroissement d'absorbance a 375 mm du a
l'accumulation dans le milieu reactionnel
du semialdehyde.
Protocole Dans une cuve spectro: 2,9 ml de tampon phosphate 0,1 M, p H
6, 8, 0,1 ml d'extrait bacterien, pl d'une solution de catechol 0,02
M.
cinetique effectuee a 30 C et mesuree sur une minute.
L'appareil (Uvikon 810/820) est dote d'une unite de calcul qui fournit
par l'intermediaire d'une imprimante les resultats suivants: DO pour
chaque mesure effectuee, a DO entre chaque mesure, vitesse exprimee en
DO/min, calcul du coefficient de correlation qui permet
de verifier la bonne linearite de la courbe.
Une mesure est effectuee toutes les 6 secondes pendant
une minute (10 points).
L'activite enzymatique est exprimee en m U/mg de proteins.
Une m U correspond a une nanomole de produit forme en une minute a 300
C dans les conditions precedemment
decrites.
Stabilite de l'enzyme en fonction de la temperature L'extrait est
traite 10 minutes a differentes temperatures et l'activite est mesuree
dans les
conditions decrites precedemment.
Temperature 300 C 550 C 60 C 650 C Activite de la 100 84 18 3
C 2,3-O (percent)1
L'extrait est traite, cette fois, a 550 C pendant
differents temps.
Duree (minutes) O 10 20 30 Activite de la 100 84 39 24
C 2,3-O (percent)
D'apres ces resultats, l'enzyme montre une bonne resistance vis-a-vis
de la temperature et les resultats
ci-dessous vont confirmer sa bonne stabilite.
L'extrait est place a temperature ambiante, dilue dans differents
tampons a une concentration en
proteins de 0,32 mg/ml.
O 19 h 2,5 jours 6 fjours Activite (percent) Apres stockage
dansl'water 100 O Phosphate 0,1 M p H 6,8-Phosphate 0,1 M p H 7,5 10
percent acetone
84
93 81
Ces resultats montrent l'effet stabilisant de l'acetone qui est
d'ailleurs utilisee dans la technique d'extraction par plusieurs
auteurs (ref 28, 29) Activite en fonction du p H Des essais
enzymatiques effectues dans du phosphate 0,1 M a des p H variables ont
montre un optimum
d'activite a 6,75.
,6 6 6,5 6,75 7 7,5
Activite (percent) 10
8 8,5 8,9
78 100 93 80 61 52 49
Temperature optimale En outre, il a ete demontre que l'activite
maximum se situe a 45 C.
Temperature d'incubation (C) Activite (percent)
27 30 35 40 45 50 53
100 125 162 200 131 119
On remarquera que l'activite a la temperature de reference (30 C)
represente la moitie de l'activite maximum Ql = 1,6 Duree p H Parmi
les compositions selon la presente invention incorporant la catechol
2,3-oxyg 6 nase, il faut citer plus particulierement les compositions
pour application topique externe dans le domaine cosmetique et
medicamenteux Les bases utilisables dans ce type de compositions sont
connues de l'homme de l'art et ne constituent pas des caracteristiques
de la presente invention Toutefois, on pourra tenir compte de l'effet
stabilisant de l'acetone pour la C 2,3-0 et du p H optimum d'activite
situe entre 6,5 et 7,5, pour la
realisation des compositions selon l'invention.
Lorsque la C 2,3-0 est utilisee comme conservateur dans l'industrie
alimentaire, en particulier pour eviter le brunissement des fruits, il
est possible d'utiliser l'enzyme purifiee ou un extrait bacterien,
mais il est possible d'envisager dans certains cas d'utiliser la
bacterie elle- mnme, en particulier lorsque le produit alimentaire
contenant
les fruits est deja un produit de fermentation bacterienne.
Les exemples ci-apres permettront de mettre en evidence d'autres
caracteristiques et avantages de la presente invention De facon
generale, les references
bibliographiques sont rassemblees en fin de description
et ne sont rappelees que par leurs numeros dans le
corps de la description.
Dans un premier temps, le gene xyl E, qui est entierement compris dans
un des fragments Xho I du plasmide p WWO, a ete clone sur de petits
plasmides de facon a disposer d'une source d'ADN de xyl E facile a
recloner pour la suite des experiences sans avoir a selectionner tous
les fragments de restriction de
ph O qui est un tres grand plasmide.
En outre, ces petits plasmides ont permis de preparer de grandes
catechol 2,3-oxygenase
pour l'etude de cette enzyme.
EXEMPLE 1 Clonage et expression du gene codant pour la catechol
2,3oxygenase dans Escherichia coli la) Souches et plasmides Le
plasmide pl O O a ete extrait d'une souche
de Pseudomonas putida.
Le plasmide vecteur est le plasmide p KT 230 (ref 6) qui code pour la
resistance a la kanamycin et a la streptomycin Ce plasmide possede un
site Xho I
unique dans le gene de resistance a la kanamycin.
A titre de plasmide vecteur, on a egalement utilise les plasmides p B
Xh 12 et p B Xh 3, construits comme decrits ci-dessous par Vince
Pirotta (European Molecular Biology Laboratories, Heidelberg), dans
lesquels les genes clones sont exprimes a partir du promoteur du
phage XPR qui a ete clone dans p BR 322.
Le plasmide p B Xh 3 a ete prepare de la facon suivante: On decoupe p
BR 322 avec l'enzyme de restriction Hindl II, on le traite avec la
nuclease 51 et les extremites franches sont ligaturees avec un
fragment Hae III de de 890 paires de base qui contient tous les
aminoacides du gene Ic I, sauf les six derniers amino acids de
l'extremite COOH, avec ts 857 qui contient egalement ORPR et 110
paires
de base du gene cro.
A 80 paires de base en aval de PR, se
trouve un site Bgl II qui est unique dans le plasmide.
Le promoteur est dans une orientation qui permet de transcrire le gene
de la tetracycline de p BR 322 Le plasmide p B Xh 12 est identique a
la seule difference que le plasmide p BR 322 est coupe a la fois avec
les endonucleases Eco R 1 et Hind III, avant d'etre ligature avec le
fragment c I. Le promoteur EL peut egalement etre utilise (ref 22) Les
promoteurs Xp L et XR sont reprimes par le produit du gene c I et il
existe des mutants sensibles a la temperature qui repriment la
transcription de chacun des promoteurs a basse temperature (ref 23)
Cette regulation a pour avantage de permettre la croissance a basse
temperature pour augmenter la masse cellulaire avec un systeme simple
d'induction pour, en quelque sorte, "allumer" le gene
clone.
Le plasmide p BR 322 a egalement ete
utilise comme vecteur de clonage.
Le plasmide p ED 5-1, "le vecteur d'expression
tr_" (ref 24), a egalement ete utilise.
Les souches hotes sont toutes des derives d'E coli K 12 SK 1592 est
gai thi sbc B 15 end A hsd R 4
hsd M+ (ref 25) B Z 18 rk mk+ gal lac y Su II (ref 19).
W 3110 trp OE met (ref 26).
lb) Procede Afin de cloner le gene xy E dans p KT 230, i'ADN de p WWO
a ete coupe avec l'enzyme de restriction Xhol et ligature avec un
fragment Xho I de l'ADN du
vecteur phosphate.
Des etudes precedentes ont demontre que ce gene xay E est entierement
situe dans le fragment de restriction I (Xho I)_ du plasmide p WWO et
dans un sous-fragment Bam Hl-Xho X de ce fragment (6,9) La souche SK
1592 a ete transformee a l'aide des plasmides obtenus et les colonies
resistant a la streptomycin ont ete triees grace a une
pulverisation de catechol.
En effet, les souches contenant l'enzyme catechol 2,3-oxygenase virent
au jaune lorsqu'elles sont mises en presence de catechol, compte tenu
de la
production du semialdehyde 2-hydroxymuconique (ref 14).
Les recombinants contenant l'ensemble du gene xyl E mais qui ont perdu
une portion de l'ADN du plasmide vecteur sont isoles La carte de
restriction du plasmide p TG 200 est representee sur la figure 1, en
traits doubles on a represente le fragment ADN de
p WWO.
Ce plasmide p TG 200 est utilise comme source d'ADN codant pour le
gene xl E dans les experiences suivantes: Le fragment Bam HI-Xhol du
plasmide p TG 200 a ete clone dans les sites Bam HI-Sall des plasmides
p Blh 3 et p B Xh 12 et egalement dans les sites Bgl II-Sal I
de p B Xh 3 et p B Xhl 2.
Le fragment Bam HI-Xhol de p TG 200 a egalement ete clone dans les
sites Bam HT et Sal T des plasmides p ED 5-1 et p BR 322 Les plasmides
derives sont decrits dans le tableau I.
TABLEAU 1
PLASM IDES PORTANT LE GENE xy IE BZ 18 / p TG 2 Oi BZI 8 / p TG 2 02
BZ 18 / p TG 2 03 BZ 18 / p TG 2 04 W 3110 I p TG 2 05 BZ 18 / p TG 2
06 SK 1592/p TG 200 p B)Xh 3 coupe avec pglll-Sall et integration du
fragment Bam HI-Xho I de p TG 200 (Ap R Tc S p B Xh 3 coupe avec Bam
Hl I-Sal I et integration du fragment Bam HI-Xho I de p TG 200 R S (Ap
Tc) p B>Xh 12 coupe avec PUIII-Sal I et integration du fragment Bam
HI-Xho I de p TG 200 (Ap R Tc S) p B Xh 12 coupe avec Bam HI-Sall et
integration du fragment Bamn HI-Xho I de p TG 200 R S (Ap Tc)
ptrp ED-51 coupe avec Bam HI-Sal I et integra-
tion du fragment Barn HI-Xhol de p TG 200 R S (Ap Tc> p BR 322 coupe
avec Bam HI-Sall et integration du fragmwent Bam HI-Xhol de p TG 200
(Ap R Tcs) plif O coupe avec Xho I et clone dans p KT 23 O aussi coupe
par Xho I Deletion d'une partie de l'ADN p KT 23 O proche du site Xho
I: Resistance a l'ampicil Jline: Sensibilite a la tetracycline Ap R Tc
5
Le niveau d'expression de la catechol 2,3-
oxygenase dans chacune des souches contenant les plasmides
recombinants obtenus ont 6 galement ete compares.
La concentration en proteins est determinee par la technique de Lowry
(ref 11) Les resultats mesures sont rassembles dans le
tableau 2.
TABLEAU 2
ACTIVITE Sp ElCf I IUE EN CATECHOL 213-OXYGENASE
DANS DIFFERENTES SOUCHES EN PIIASE EXPONENTIELLE
(activite en m U/mg) Comme cela ressort du tableau 2, la plupart des
souches obtenues presentent un degre eleve de catechol 2,3-oxyg 6 nase
et ainsi peuvent etre considerees
comme utilisables pour la synthese de cette enzyme.
La souche donnant les rendements maximums est celle contenant le
plasmide p TG 201, toutefois, pour des considerations industrielles,
il est possible que la souche la plus interessante soit en fait la
souche p TG 206, laquelle derive d'un plasmide
maintenant bien connu: p BR 322.
On a, ainsi, obtenu un ensemble de plasmides de petite taille grace
auxquels le gene xyl E peut
s'exprimer dans E coli.
Dans un deuxieme temps, a partir de ces "wsources' de gene xyl E, on
va construire des plasmides grace auxquels le gene xyl E pourra
s'exprimer dans
B subtilis.
Cette construction est effectuee en deux etapes, tout d'abord le
clonage du gene xyl E sur un plasmide capable de se repliquer dans B
subtilis, puis la selection d'un promoteur assurant l'expression
du gene xyl E dans B subtilis.
EXEMPLE 2 Clonage et expression du gene codant pour la catechol
2,3oxygenase dans Bacillus subtilis 2 a) Souches et plasmides Les
souches de Bacillus subtilis qui ont
ete utilisees sont derivees de la souche Marburg 168.
Une souche BZ 2 ys B 3 rec E 4 a ete construite en transformant a
l'aide d'un ADN donneur BD 224 thr 5 trp C 2 rec E 4 dans une souche K
527 his A 1 cys B 3 La selection a ete effectuee pour des colonies
his+ sensibles a la mitomycin C (mitomycin C) a une concentration
finale de 0,10 pg/ml La sensibilite a des niveaux faibles de mitomycin
C constitue une indication d'une deficience au niveau de la
recomnbinaison associee
avec la presence d'une mutation rec E 4 (ref 4, 5).
La souche TGB 1 tr/C 2 rec E 4 spo 331 a ete obtenue par
transformation de cellules receptrices RUB 331 thy Al thy B 1 trp C 2
spo 331 a l'aide d'un ADN donneur derive de BD 224 MI 112 leu A 8 arg
115 thr 5 rec E 4 r M m M (Tanaka 1979 La selection a ete effectuee
pour des +
cellules thy sensibles a la mitomycin C.
Les souches d'E coli utilisees sont derivees de BZ 18 rk mk+ xn al _ac
Y Su II et de C 600
rk mk+ et CSR 603 (ref 19).
Le plasmide p TG 206 a deja ete mentionne
dans l'exemple 1.
Le plasmide p HV 33 est decrit dans les references 16 et 18 Ce
plasmide est capable de se repliquer dans E coli en rendant les
cellules hotes resistantes a l'ampicillin (50 pg/ml), a ia
tetracycline (15 pg/mlyet au chloramphenicol (20 pg/ml) Ce plasmide se
replique egalement dans Bacillus subtilis, toutefois, dans ce dernier
hote, la resistance au chloramphenicol
(5 <g/ml) est la seule a s'exprimer.
2 b) Milieu de croissance et conditions de culture Toutes les souches
de B subtilis ont ete maintenues sur un milieu gelose-sang-tryptose
(TBAB, Difco Laboratories) auquel on ajoute 0,3 percent (poids/volume)
de gelose, de thymine et d'uracile, chacun a une concentration finale
de 20 pg/ml Du chloramphenicol (Sigma Chemical Corporation) est ajoute
au TBAB a pg/ml pour maintenir les souches contenant les plasmides. La
croissance des cultures cellulaires dans des milieux liquides riches
est effectuee dans un bouillon de Penassay (PAB, Difco Labordtories)
auquel on ajoute 20 pg/ml de thymine Du chloramphenicol
est ajoute lorsque cela est necessaire.
Toutes les souches d'Escherichia coli sont maintenues sur L-agar Les
cultures liquides sont effectuees en bouillon L Des antibiotic
sont ajoutes lorsque cela est necessaire.
Toutes les cultures sont effectuees a 37 C et l'aeration desdites
cultures est effectuee par agitation. Les cultures de Bacillus
subtilis, une fois qu lles sont etablies, sont maintenues sur TBAB a
la temperature de la piece (20-22 C) Les cultures d'E coli sont
maintenues sur L-agar a 40 C. 2 c) Transformation bacterienne La
transformation des ADN de plasmide dans les cellules receptrices d'E
coli est effectuee par la methode de Ledeberg et Cohen (ref 10) tel
que
cela est decrit dans l'article de Morrison (ref 13).
Les cellules competentes sont preservees par cryogenie
avant leur transformation.
La transformation conventionnelle de B subtilis (ref 20) est suivie
par la mise en oeuvre de la methode de Boylan (ref 2) Il est egalement
possible d'effectuer la transformation des protoplastes en utilisant
les ADN plasmidiques (ref 3) La selection des souches portant les
plasmides est effectuee sur milieu TBAB supplmnente avec 5 pg/ml de
chloramph Gnicol dans le cas de transformations conventionnelles et
sur un milieu de regeneration DM 3 supplemente avec 20 pg/ml de
chloramphenicol dans le
cas d'une transformation de protoplastes.
L'expression fonctionnelle du gene codant pour la C 2,3-0 est observee
et mesuree comme cela
a ete decrit a l'exemple 1.
2 d) Construction du plasmide p TG 402 Le plasmide p HV 33 est mis a
digerer avec l'endonuclease de restriction Bam Hl dans une solution
comportant 6 m M tris(hydroxymethyl)aminomethane
(tris(hydroxymethyl)aminomethane) p Hli 7,9, 6 mM Mg C 12, l O Om M Na
Cl, 1 pg ADN et 6 unites d'enzyme. La reaction est conduite pendant 1
heure a 37 "C avant ad'tre stoppee par chauffage pendant 10 minutes a
650 C Les conditions de tampon sont ajustees a l'aide de 100 m M
tris(hydroxymethyl)aminomethane, p H 7,4, 5 m M Mg C 12 et 5 Om M Na
Cl, puis l'on ajoute 3 endonuclease
de restriction Eco Rl.
L'incubation est poursuivie pendant 1 heure
a 37 e C La reaction est de nouveau stoppee par chauffage.
Le plasmide p TG 206 est traite de la meme
facon que le plasmide p HV 33.
Les fragments plasmidiques de 0,5 pg chacun sont ligatures dans 50 pl
de tampon qui contient 66 r M tris HCl, p H 7,9, 6,6 m M Mg C 12, 10 m
M dithiothreitol (dithiothreitol), 0,5 m M adenosine triphosphate
(adenosine triphosphate) et 0,1 unite ADN ligase T 4 (Boehringer
Mannheim) La reaction est effectuee a 10-12 C pendant
approximativement 18 heures, puis stoppee par chauffage de la solution
pendant
minutes a 65 C.
Les produits obtenus sont stockes a 4 C
ou bien sont utilises directement pour la transformation.
Ces produits de ligation sont utilises pour transformer E coli BZ 18
Les souches receptrices sont selectionnees pour leur resistance a
l'ampicillin et
au chloramphenicol et leur sensibilite a la tetracycline.
On obtient ainsi 7,6 x 104 transformants
par pg ADN plasmidique.
Ces transformants sont pulverises avec une solution de catechol et les
colonies qui virent au jaune sont transferees sur des plaques de
selection
contenant de l'ampicillin.
Parmi ces colonies chez lesquelles le gene xyl E s'exprime
fonctionnellement on en preleve 14 chacun dans 1 ml de culture et
l'ADN plasmidique en est extrait
puis resolu sur gel d'agarose.
La majorite des plasmides extraits sont plus grands que p TG 206 et
presentent un site de restriction Bam Hl et 4 sites de restriction Cla
I. L'un de ces plasmides appele p TG 402 a ete purifie a partir d'un
litre de culture et analyse avec
*diverses enzymes de restriction.
Ce nouveau plasmide p TG 402 porte le gene C 2,3-0 sur l'ADN d'un
plasmide vecteur qui est capable de se repliquer a la fois dans E coli
et dans B subtilis Dans ce dernier hote toutefois, le produit du gene
C 2,3- 0 code par p TG 402 n'est pas exprime fonctionnellement, en
effet tous les transformants de Bacillus subtilis TGB 1 resistant au
chloramphenicol demeurent blancs lorsqu'on les pulverise avec du cat 6
chol Ceci suggere que le gene C 2,3 O n'a pas ete transcrit ou traduit
dans B subtilis, ou bien a ete rearrange dans les processus de
transformation
ou de croissance.
Le plasmide a ete extrait de B subtilis pour etre ensuite reintroduit
dans E co i Toutes les souches d'E coli transformees deviennent jaunes
lorsqu'on les pulverise avec du catechol.
Dans ces conditions, le gene C 2,3-0 est demeure intact sur le
plasmide vecteur dans B subtilis mais celui-ci ne s'exprimait pas
Ainsi, on peut conclure a une absence d'expression du gene C 2,3-0
dans les souches gram + 2 e) Analyse par restriction de p TG 402 En
utilisant diverses enzymes de restriction pour digerer p TG 402, on
obtient la carte de restriction partielle representee figure 2 Le
tableau 3 rassemble
cette analyse de restriction de p TG 402.
252 o 753
TABLEAU 3
ANALYSE DES Si TES D'ENZYI-I,S DE PY-STRICTION DE pl'G 402 Nombre
total de sites Nombre de sites dans la region F,5 -11
2 O
1 1
1-Enz Vme Ava I Bamlil lq LI'I Clal Eco R'f ljpal lRn-ll Pst'I Sacl Sa
IT Sm.a'I phj Xbal Xhol Xmal Ce plasmide de 8,90 kb comprend un ADN
derive de p BR 322 (moins la petite region situee entre Bam Hl et Sal
I), p C 194, et le fragment Bam HI A Xho I de
pl WO qui contient le gene C 2,3-0.
p BR 322 et p C 194 ont deja ete sequences. La region de p TG 402 qui
contient le gene C 2,3-0 a ete partiellement sequencee Cette region
est reliee au site du plasmide par un site Bam HI et un site hybride
Xhol/Sal I Dans cette region il existe des sites uniques pour Hpa I,
Ava I, Cla I et Kpn I et 3 sites pour Sal I Il n'existe pas de site
Bgl II, Eco RI, Hindll, Sac I, Sma I, Sphl, Xbal, Xho I ou Xmal Le
sites Hpa I et pn I sont uniques pour l'ensemble du plasmide p TG 402
Le site Ava I se situe probablement a l'interieur du gene C 2,3-0 car
lorsque l'on decoupe p TG 402 avec Ave I et lorsque l'on effectue le
ligature des fragments resultats dans une orientation opposee a
l'orientation d'origine, ceci
supprime l'activite du gene.
2 f) Selection des promoteurs permettant la transcription du gqne C
213-O dans Bacillus subtilis L'ADN chromosomique est isole de la
souche de Bacillus subtilis BZ 2 L'ADN obtenu est mis a digerer avec
l'endonuclease de restriction Sau 3 A dans un tampon constitue de 6 m
M tris, HC 1, p H 7,4, 6 m M Mg C 12, m M Na Cl et 2 a 3 unites
d'enzyme Sau 3 A pour 1 pg d'ADN On obtient ainsi plusieurs centaines
de petits fragments d'ADN avec des extremites 5 ' GATC 3 ' a monobrin
cohesives Ces fragments sont ligatures avec p TG 402 qui a ete lin 6
arise a l'aide de Bamn HI (Cette linearisation produit des
terminaisons monobrin identiques a celles produites par Sau 3 A) Les
produits de ligature sont introduits directement dans les protoplastes
de Bacillus subtilis TGB 1 par transformation D'autre part, les
produits de ligature sont introduits par transformation dans
Escherichia coli C 600 rk mk+. Les transformants d'E coli sont
selectionnes par incubation pendant une nuit dans un bouillon L
supplemente avec 50 pg/ml d'ampicillin La population cellulaire mixte
est traitee par la methode des lysats clarifies (ref 7, 12) de facon a
isoler les ADN plasmidiques Une petite proportion d'ADN ainsi obtenu
est utilisee comme ADN donneur pour la transformation par des methodes
classiques de B subtilis TGB 1 ou M 1112 devenu cellule receptrice La
selection est effectuee pour la resistance au chloramphenicol des
cellules comportant
un plasmide.
Tous les transformants TGB 1 ou M I 12 qu'ils soient
obtenus par les methodes classiques ou bien par transfor-
mation protoplastique, sont soumis a une-pulverisation d'une solution
de catechol de facon a detecter l'expression du gene C 2,3-0 La
coloration jaune des colonies est utilisee comme une indication pour
selectionner les promoteurs qui autorisent la transcription du gene
C 2,3-0.
La transformation directe dans les protoplastes conduit a isoler sept
colonies qui deviennent jaunes lorsqu'on les pulverise avec du
catechol Les ADN plasmidiques qui se trouvent a l'interieur de ces
cellules sont appeles p TG 411, p TG 423; p TG 424, p TG 425,
p TG 426, p TG 427 et p TG 428.
Le passage Jcls ple 5 nidcs a Lrivers l'intermediaire d'l:sclierichia
coli condluit a iso(ler 18 colonies SUFJ Plcmenrltailes (le B su j
Ailis (lui deviennent jaunes lorsqu'on les pulvierise avuc du catechol
Les plasmirdes ainsi otnsn e p TCAO 03, p TG 404, p'1 G 405, p Tc 11;
406, p T'G 407, L 3 TC 4 o 08, p TG 4 009, p TG 41 O, p'TG 412, p TG 4
l 3, p TCG 4 l 4, p TG 415, p 1 YG 416, p 1 'l G 417, p Tl G 4 l 8, p
TG 4191 p'TG 420 et pi G 421, de-neurent associes avec une activite du
gene C 2,3- 0, sous reserve que la selection
pour la resistance au chloramph Cnicol soit rnaintenue.
Les origines de ces differents plasmides sont rassemblees
dans le tableau 4.
O
TA B J,) ' 4 U, 4
SELECTION DES DANS 13 JACILLUS S Uli'1 '31,lS Mr tli -)(le de Plasmide
transformation B subtilis TGB 1 p'IG 4 1 1 pi otoplaste E COI-i BZ 18
B subtilis TGB 1 p TC 403 classique Exl:)r rienc-e AIJN donneur BZ 2 +
pr G 402 (3:1) 3 i(ja tu re L 4 Z 2 + p'I'G 4 O 2 (3:1) ligature
lysats clarifies je exp 2 BZ 2 + p TG 402 (4:1) ligature lysats
clarifies de exp 4 E coli BZ 18 B subtilis TGBI classique p'l'G 404
r'j'G 4 1 2
1)'IG 4 1 3
BZ 2 + p TG 402 E coli
(2: 1) ligature C 6 E-O-
lysats clarifies de exp 6 BZ 2 + p TC-402 1 (2:1) ligature B subtilis
M 1112
c la S S i q e-
B subtilis MI 112 prit-6-p TA -Ste p i'G 405 p'2 G 406 p;i G 407 p-.r
G 408 p'l'G 409 p'PG 410 p TG 414
PTG 415
p TG 416 p TG 417 p TG 418 p TC 419 p TG 420 p TG 421 p TG 422 p TG
423 pl-C 424 p TG 42 5 p TG 426 p TG 427 2 g) Purification des ADN
plasmidiues, digestion par les enzymes de restriction et 6 lectroph
Lorese Les ADN plasmidiques sont isoles a partir des lysats d'un
bouillon de culture de 1 litre dans un
milieu liquide riche.
La purification des ADN plasmidiques est effectuee par centrifugation
sur les gradients de
densite au ethidium (ref 17).
Dans certains cas, les ADN plasmidiques sont prepares a partir de
culture de 1 ml par la methode d'extraction
alcaline (ref 1).
Le plasmide p TG 402 purifie est mis a digerer avec differentes
enzymes de restriction dans les conditions prevues pour son
utilisation Les derives de p TG 402 susceptibles de promouvoir
l'expression du gene C 2,3- 0 sont mis a digerer avec Bam Hl de facon
a rechercher des sites potentiels en aval du promoteur
mais en amont du gene C 2,3-0.
Ces fragments d'ADN sont resolus grace a un appareil d'electrophorese
horizontal sur gel
d'agarose 1 percent (poids/volume), ou bien 0,8 percent
(poids/volume).
On utilise pour ce faire un tampon Tris-acetate
(40 m M tris(hydroxymethyl)aminomethane, p H 7,8, 20 m M acetate de
sodium, 2 m M EDTAacetate).
L'electrophorese est effectuee sous difference de potentiel constante
de 35 volts pendant
14 a 18 heures a la temperature de la piece (20-22 C).
L'ADN est fixe grace au ethidium bromide 0,5 pg/ml pendant 30 minutes,
le gel est rince abondammnent avec de l'water distillee, les bandes
d'ADN sont visualisees avec des rayons ultra 7 violets de grandes
longueurs d'ondes provenant d'un transilluminateur UV (Ultra Violet
Products, Inc) La dimension des fragments d'ADN plasmidiques est
estimee en comparant la mobilite relative a celle de i'ADN de k C
185757 mis a digerer avec llind III La taille des fragments d'ADN est
obtenue a partir de la
publication de Philippsen et al (ref 15).
Chacun des plasmides testes est plus grand
que p TG 402.
Ce resultat demontre que le produit du gene C 2,3-0 est exprime
fonctionnellement dans Bacillus subtilis, sous reserve de
l'introduction de sequences d'ADN chromosomiquesde B subtilis qui
assurent la pronmotion de la transcription du gene C 2,3-0.
2 h) Activite enzyatigue _C 2 _ 3-O dans Bacillus subtilis Des
extraits de culture en phase stationnaire ont ete prepares pour
determiner le niveau d'activite enzymatique C 2,3-0 dans Bacillus
subtilis Ces
activites sont mesurees par la methode spectrophoto-
metrique decrite precedeirment et rassemblees dans le
tableau 5.
TABLEAU 5
CAT'ECHOL 2,3-OXYGENASE DANS BACILLUS SUBTILIS
Souche et plasmide TGB 31/PTAGt 02
TGBI/P?G 403
T'GB 1/p T 2 G 404 t:'l 1 id i/pla 2 G 405 1 111 112/p'2 G 406 4 \
11112/p'i G 407 Mi 2112/p TG 408 MI 2112/,p 1 G 409 M 1112/p TG 4 10 O
TGBI 3/p TLG 41 il AWGBI/p TG 412 TGI 31/p TG 4 33 M Ii 12/p"G 4124 Ml
il 2/p TG 4, 5 II i 12/p'2 G 416 M i 112/p TCG 4 17 Ai 1112/p TG 418
Mi il 2/pt"G 4 19 MI i 112/p WG 420 M 1112/p TG 421 M 41112/p TG 422
Mil' 2/p'3 G 423 M 1112/p'2 G 425 MI 112/p'2 G 426 MI 112/p TG 427 No
determinations 3. i 1 ' 2, N T.
IN T.
* 1 (c) Proteinc totale (a) (mg/m ") 1,59 1,59 1,59 1,86
1 L,74
2, 22 2, 21 2,03 1,93 0, 26
2,, 10
1,46 0, 90 1,44 2,30 1,50 (c) 1,34 1,06 1, 60 (c) (c) 1,64
1, 2,4
1,60 (a) Concentrations en proteins par la methode de Lowry
(b) 1 milliunite (m U) correspond a la formation de 2, mm-ol.
2-hydroxymuconique par minute a 3 O'C (c) N T Non Teste de
semialdehyde de Remarque Il est a noter que l'activite de la C 2,3-0
dans 13 subtalis peut etre
faible alors que la quantite d'enzymes peut etre g-rande.
(b) Acti vite (rmu/m-g) 238,0, 5
I 702, 5
l 124,0
373, 5
,0
169, 5
961,5 87,5 1.i 5,0 18,0 262,0
4 '67, O
2 011,0
394,0 407,0 274,O 164,0,0 127,0 1 3,0 VI r> C> j ui L 4 2 i) Caract
rrdjtion des pl-mdcs de J Bacillus:;ubtilis (ui expriment le _g ne C
2,30 La ligation (I'i N gernfre par SAU 3 A a un plasmide vecteur
lin(arise par P,m Hl (tel que p TG 402) prevoit avec une probabilite
de 1/4 la regeneration d'un site Bam Hl pour chacune des extreimites
du fragment SAU 3 A Les plasmides associes avec une activite du gene C
2,3-0 dans B subtilis sont mis a digerer avec B Aim H 1 Les plaslmides
p Ti(; 403, p T'G 404, p TG 405, p TG 406, p'IG 407, p TG 408, p TG
409, p TG 410, p TG 411, p 2 G 422 et p TG 425 presentent au moins un
site
Bamn H 1.
Les plasmides purifies sont mis a digerer par l Hind III et Bam HI
pour determiner si les sites Bam HI regeneres sont en amont ou en aval
des promoteurs qui se trouvent localises sur les fragments Sau 3 A. Un
site Bam HI unique est detecte en amont du promoteur sur p TG 411, p
TG 422 et p TG 425 Des sites Bam Hl uniques sont detectes en aval des
promoteurs sur p TG 403, p TG 404, p TG 40 05, p TG 406, p TG 407, p
TG 408, p TG 409 et
p TG 410.
Les dimensions approximatives du fragment Sau 3 A qui porte les
promoteurs de Bacillus subtilis sont de 500 paires de base pour p TG
403, 140 paires de base pour pk G 404, 575 paires de base pour p TG
405, 950 paires de base pour p TG 406, 335 paires de base pour p TG
407, 500 paires de base pour p TG 408, 900 paires de base pour p TG
409 et 100 paires de base pour p TG 41 O. 2 j) Developpcensnet des
vecteurs d'expression plasmidiques dans Bacillus subtilis Les
plasmides p TG 403, p TG 404, p TG 405, p TG 406, p TG 407, p TG 408,
p TG 409 et p'i G 410 presentent les caracteristiques suivantes:
1) Ils expriment le gene C 2,3-O.
) Les cellules hotes qui incorporent ces plasmides convertissent le
catechol en semialdehyde 2-hydroxymuconique, comme cela peut etre mis
en evidence par coloration en jaune des colonies et analyse
spectrophotometrique. 3) Ils presentent un site unique Bam Hl en
aval du promoteur mais en amont du gene C 2,3-0.
Ces plasmides sont importants, non seulement pour la conversion du
catechol, mais aussi parce qu'ils peuvent etre egalement utilises
commre vecteurs
d'expression dans Bacillus subtilis.
Le clonage de gene dans le site Bam H 1, aussi bien de p TG 403, p TG
404, p TG 405, p TG 406, p TG 407, p TG 408, p TG 409 et p TG 410,
aura selon toute probabilite
pour effet de supprimer l'activite du gene C 2,3-0.
De meme, le clonage de gene dans la region de p TG 403, p TG 404, p TG
405, p TG 406, p TC 407, p TG 408, p TG 409 et p TG 410, qui se situe
entre le site Bam HI et un site
quelconque a l'interieur du gene C 2,3-0, aura probable-
ment pour effet de supprimer l'activite du gene C 2,3-0.
Ainsi, l'insertion de nouveaux genes dans le vecteur d'expression peut
etre detectee en pulverisant les colonies avec une solution de
catechol et en
observant l'apparition ou non d'une coloration jaune.
En effet, les colonies qui demeurent blanches indiquent que le gene C
2,30 n'est plus exprime et qu'un nouveau gene a ete insere dans le
plasmide Par contre, les colonies jaunes indiquent que ce nouveau gene
n'a pas ete Jnsere dans le plasitdde Un nouveau ygne insereE dans le
site Bam HI a une grande etre exprime parce qu'un promoteur de B
sbtiilis est situe en amont de ce site Bamrn HI. Dans ces conditions,
les plasmides ainsi obtenus presentent un tres grand interet sur le
plan industriel pour l'expression d'un gene determine dans
Bacillus subtilis.
EXEMPLE 3 Clonage et expression du gene dans le phage M 13 Le phage M
13 est un coliphage filamenteux
distribue par Bethesda Research Laboratories et PL Labs.
sous forme de "kit" pour le sequencage et le clonage
de genes.
Le fragment Bam Hl-Xhol de p TG 200 a ete clon 6
dans les sites Bamr H Il-Sal I du phage M 13.
Le phage ainsi obtenu permet l'expression du gene xyl E dans les
souches d'Escherichia coli
mentionnees precedemmnent.
Le clonage de ce gene est mis en evidence, corme cela a ete indique a
l'exemple 1,par pulverisation de catechol et observation des colonies
presentant un
aspect jaune du a la degradation du catechol.
Les deux fragments Sal I (voir figure l) contenus dans le segment Bam
HIXho I ont ete clones dans M 13 de deux facons: en conservant leur
sens et leur ordre originaux, en conservant leur ordre original mais
en
inversant tous les deux leur sens.
Seul le phage recombinant construit selon le
premier mode a pu exprimer une activite de C 2,3-0.
i 7 Fil iiii 1 (GRAI, Il 1 E 1 Birnboim H C et J Doly 1979 A al Ja 1
ijie cxiy-acti cn fur
plamidDNA Nucleic Pc-s 7: 1513 3520.
2 Boylan R J, N H 1-il-,pulel-son, D Brools et F E Yoiing.
1972 Regulation of the bacterial, cell; nalysis of a itutant of
Pacilllis subtilis 3 (fcctive in biosynthesis of teichoic aci-d J
Racteriol 110:
281-290.
3 Chang S et S N Cohan 1 979 Hich Frequericy transformation of
Pacillus subtilis proi-Oplasts
by p 1 asnid DNA Molec r ',en Genet -1-6-8: 111-115.
4 Du Lnau D et C Cirigliaiio 1974 Gc-netic charactc-
rization of recciabination eficient viutants of Pacillus
subtilis J Bacteriol 117: 488 493.
Dubnau D, R Davidoff-Albelson, B Scher et
C Cirigliano 1973 Fate of transforming dec-xy-
ribonucleic acid after uptal-e by competent Racillu s subtil, is
hcnotypic characterizaition of radiation
sensitive reroi;biriation-eieficiuiit rtutants.
J Bacteriol 114: 273-286.
6 Franklin F C P, M Pagdcisarjan, M M Ear 3 (1,3;arxan et K.N Tiri-mi
s1981 and fenctional of the TOL plasmid pi percent '110 from
P-,oi,,iciiionas piat-ida nd cloning of ccnes for the entire
regnlatc-d arc,:- iti c ring r,ta t lcava(je pathway Proc Natl Acad
Sci.
U.S A, in press.
3 8
7 Cuc-rry P, D J, Le Blanc et S Falkow 1973 Geneial.
iftililirjd for the isolati on of pl;ibiid dr-oxyriboriucleic
acid J P,icteri ol 116: 10 G 4-1066.
8 G S et M G eliiiith19 '72'flic of T 5 1 J" Il llysjs of flic DNA by
(jel
J biol Biol -63: 383-395.
9 Taouye S, A Naazawa et T Na azawa 1981.
1.j'olc-cul ar cloning of TOL Mens -ind, xy_j E in
Escl-jerichia co 3 i J Bactr riol 145: 1137-1143.
Ledcrberg E- M et S N Coben 1974 Txansformation of Salitioriella Ly p
1-esriid(c-oxyrib(-,iiucleic
acid J Bactfriol il 9: lo 72-1074.
Il Lowry O H, N J Poscl-3 r()u(ih, A L Farr et R J Randall.
1951 Protein with the Folin phenol
reagent J Biol Chem 193: 265-275.
12 Meyers J A, D Sanchez, L P et S Falkow ' 11076 S Imnple agarose
electrophoretic mutlicd J'or the identification and characterization
of plasmid
eeoxyriboniicleic acid J r-acteriol 127: 1529-1537.
13 Morrison D A 1977 Traiisfoi-:-,,-tion in Es cherichia coli:
cryogenie preservation of co - pc 1 Lent cells J Bacteriol.
132: 349-351.
14 Nakaiawa T, S Tnouye et A 1980 Physical and functional eappinq of
RP-4 TOL plasinid re CC 7- 13 j-i-iants: analyses of insertion and
Cieletion
riutants J nacteriol 14-4:222 231.
Philir-psen P, R A Kra Tier et R W Davis 1978 Cloning of the yel-st
ribosomal DNA rercat unit in Sst 1 and Ilind 111 lambda vectors iising
gci)ct-ic and physical
size selections J Mol Biol 123: 371-386.
1 9 2205
16 Pr Jmrose S B et S D Ehrlich 1981 Isolation of plasmicl deletion
mutants and study of their
Jnstability Plasmnid 6: 193-201.
17 Radloff R W, W Bauer et J Vincqrad 1967 A dye-
Luoyant density mncthod for the detection and i solation of closed
circular comnplex DNA: the closed cixcular DNA in He La cells Proc
Natl Acad Sci U S A.
57: 1514-1521.
18 Rapoport G, A Kiier, A Billault, F Fargette et R Dedonder 1979
Construction of a colony bank of E coli containing hylbrid plasmids
reprsesntative
of the Bacillus subtilis 168 geno Tne Molec Gen.
Genet 176: 239-245.
19 Sancar A, A M Pack et W D Rupp 1979 Simple
method for identification of plasmid-coded proteins.
J Bacteriol 137: 692-693.
Sp Jzizen J 1958 Transformation of biochei-Lically
deficient strains of Bacillus subtilis by deoxy-
ribonucleate Froc Natl Acad Sci U S A 44:
1072-1078
21 Sutcliffe J G, 1979 Cc-iplete nucleotide sequence of the
Escherichia coli plasmnid p BR 322 Cold Spring
Harbor Symp Quant Biol 43: 77-90.
22 Renaut E, P Stanssens et W Fiers 1981 Plasmid vectors for high
efficiency expression controlled by the p L i Di-cxoior of coli phage
lambda Gene -1-5:
81 93.
23 Lieb M 1966 Studies of heat iniducible lambda bactmn 3 oip Vh-a'je
I order of genetic sites and j;ropertics of mnutant prophages J siol
Biol 16:
149-163.
O 24 liallcwell R A et S 1 nmta;je 1980 Plasinid vectors cont aining
the tryptophan'operon promotor suitable
for cf fiaic-nt regjulated expression of forgein genes.
Gene 9: 27-47 '
Xushner S R 1978 An 5 mproved Niichd for transfor-
n.ation of Escherichj'a coli with-Col El d 1 crived p 1 asnmids in
genetic engineer Thg, Eds Boyer, 11 W et
S Nicosia Elsevier/Morth-Ilolland Biomnedical press.
1978. 26 Murray N E et W J l 3 ramiprer 1973 The tepZE gene of
Escherichia coli K contains a recognition sequence for the
K-restriction systexn J MOI Biol 77:
615-624.
27 Franklin F C H, M Bagdasarian et K N Tixr-uins 1981.
Manipulation of degregative genes of soul ba 4 cteria.
Microtiol Begredation of Xenobiotics and Recalatrant Comapounds Eds R
Ilutter et T' Leisinger, Acaden-irtl
Press, London 1981.
28 Nozaki M, Kagamiyamna H Hayaishi Metapyrocatechax.
Purification, Crystallization and somwe Properties.
1963 Biochemnische Zeitschrift 338: 582-590.
29 Salat-Trepat Jose M, Evans C The mneta-cleavage of
catecholby Azotob'acter species 1971 Eur '-J.
Biochemu 20: 400-413.
Rh VE-i) 1 i'A'I'l ONS le e gne xyl EF coi (ntj ur la yn Ii he-3 e (le
la cut and lao 12,3 -xja eet -unj ol teu dei'cae:Az 3 onfetorl Ie du
gt"ie xyl F, cofns Urie I tri rami+ 2) Plasmride vecteur selon la 1
re-vendication 1, criract Cirise on ce que le promnoteur e st une S 3
eqluen Ce a'ADN chromios;ojrinue d'une bacterie yrain + 3) Plasmide
vecteur selon l'une des revenrdications i et 2, caracterise en ce que
le pla 1-micle comporte au moins un site unique de restriction situ 5
en un endroit tel que l'insertion d'une srequience d'ADI-,N dlans ce
site condui se a l'inactivation du gine xyl E. 4) Plasm;ide vu*ctcur
selon larl\e<ato 3, caracterise en ce que le-dit site unique est situe
dans le q U ne xyl E ou bien en amront de celui ci et en aval
du -roiiioteur.
) Plasmide vecteur salt on l'une des revendical ions 3 et 4, caracte 5
rise en ce que le site unique est un
site 13 ar 11.
6) lsid vecteur selon l'une des revendications
1 a 5, c-arac t;rise en ce aue la -bactierie gr;-,n + est un
B 3.cillus, Lactebacillus, Streptococcus ou Staph 1 y ococcus.
7) Pa Hd vecteur selon la codcain 6, cari cterise en ce que la
baspctre oreim + caest n
Facillus subtilis.
8) Pl asmnide vecteur solon la rvn ctin 1 car dcttrise c:n ce qu'ill S
'agit d'un Iasi De rive
aie p'i-C 402.
9) Plasmide vecteur selon la revendication 8, caracterise en ce qu'il
s'agit du plasmide p TG 403 ou
p TG 404.
) Souche bacterienne gram + transformee par
un plasmide selon l'une des revendications 1 a 9.
11) Catechol 2,3-oxygenase obtenue par
fermentation d'une souche selon la revendication 10.
12) Application d'un plasmide selon l'une des
revendications 1 a 9 au clonage d'un gene dans une
bacterie gram +.
13) Phage M 13 caracterise en ce que son ADN comporte au moins le gene
xyl E codant pour la synthese
de la catechol 2,3-oxygenase.
14) Phage selon la revendication 13, caracterise en ce qu'il comporte
au moins un site unique de restriction situe en un endroit tel que
l'insertion d'une sequence d'ADN dans ce site conduise a
l'inactivation du gene xyl E.) Phage selon la revendication 13,
caracterise en ce qu'il comporte un site de clonage multiple place de
facon que l'insertion d'une sequence d'ADN dans un point de ce site
inactive l'expression du gene xyl E. 16) Application du phage selon
l'une des
revendications 13 a 15 au clonage et au sequencage d'ADN.
17) Composition pour application topique externe,
caracteriseeen ce qu'elle comporte de la catechol 2,3-
oxygenase selon la revendication 11.
18) Composition selon la revendication 17, caracterisee en ce qu'elle
comporte, en outre, une base
cosmetique.
19) Composition selon la revendication 17, caracterisee en ce qu'elle
est destinee au traitement
et a la prevention des allergies.
) Application de la catechol 2,3-oxygenase selon la revendication 11 a
titre d'additif alimentaire. 21) Application de la catechol
2,3-oxygenase dans le domaine pharmaceutique pour modifier la
structure
des catecholamines.
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? ?
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