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[5][_]
Molecule
(169/ 759)
[6][_]
Et
(59)
[7][_]
Bzl
(46)
[8][_]
Me
(42)
[9][_]
Val
(26)
[10][_]
ACETic acid
(19)
[11][_]
citric acid
(18)
[12][_]
water
(17)
[13][_]
METHANOL
(17)
[14][_]
Glu
(17)
[15][_]
HEXANE
(16)
[16][_]
Glx
(16)
[17][_]
Cys
(16)
[18][_]
Cl
(16)
[19][_]
TFA
(16)
[20][_]
arginine
(15)
[21][_]
Gln
(15)
[22][_]
Met
(15)
[23][_]
Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-
(14)
[24][_]
DMF
(13)
[25][_]
Tyr
(11)
[26][_]
Gly
(10)
[27][_]
Thr
(9)
[28][_]
CO
(9)
[29][_]
hydrochloric acid
(8)
[30][_]
Boc-Cys
(8)
[31][_]
KOH
(8)
[32][_]
Asx
(7)
[33][_]
dicyclohexylurea
(7)
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DCC
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chloroform
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ethanol
(6)
[37][_]
ETHyl ACETate
(5)
[38][_]
ETHyl ether
(5)
[39][_]
acetone
(5)
[40][_]
OH
(5)
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anisole
(5)
[42][_]
HCO
(5)
[43][_]
Boc-Asp
(5)
[44][_]
-Arg(Mts)-Cys
(5)
[45][_]
BUTyl ACETate
(4)
[46][_]
BENZENE
(4)
[47][_]
ammonium acetate
(4)
[48][_]
-O
(4)
[49][_]
Boc-Val-OH
(4)
[50][_]
-Arg(Mts)-OH
(4)
[51][_]
H-Val-O
(4)
[52][_]
-Trp-Gln-Val-O
(4)
[53][_]
nitrogen
(4)
[54][_]
-Thr-MetArg(Mts)-Cys
(4)
[55][_]
-Met-O
(4)
[56][_]
H-Asp-Thr-Met-Arg-Cys-Met-Val-Gly-Arg-
(3)
[57][_]
isopropanol
(3)
[58][_]
anisoleOn
(3)
[59][_]
-Arg(Mts)-Val-Tyr
(3)
[60][_]
hydrazine
(3)
[61][_]
isoamyl nitrite
(3)
[62][_]
dimethylsulfoxide
(3)
[63][_]
-Met-Val-Gly-OH
(3)
[64][_]
pyridine-acetate
(3)
[65][_]
DES
(2)
[66][_]
Asp
(2)
[67][_]
aspartic acid
(2)
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proline
(2)
[69][_]
glutamic acid
(2)
[70][_]
chlor
(2)
[71][_]
acetate
(2)
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performic acid
(2)
[73][_]
fluorescein
(2)
[74][_]
isocyanate
(2)
[75][_]
Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Glx-Val-OH
(2)
[76][_]
Val-Tyr-Arg
(2)
[77][_]
H-Asx-Thr-Met-Arg-OH
(2)
[78][_]
-Thr-OH
(2)
[79][_]
-Arg
(2)
[80][_]
H-Pro-O
(2)
[81][_]
Boc-Trp-ONp
(2)
[82][_]
Boc-Gln-ONp
(2)
[83][_]
dioxan
(2)
[84][_]
p-toluenesulfonate
(2)
[85][_]
Boc-Trp-Gln-Val-O
(2)
[86][_]
-Arg(Mts)-ValTyr-Arg(Mts)Pro-OH
(2)
[87][_]
cyclohexylamine
(2)
[88][_]
Boc-Val-Tyr-O
(2)
[89][_]
Boc-Val-Gly-O
(2)
[90][_]
-Thr-Met-O
(2)
[91][_]
Thr-Met
(2)
[92][_]
Val-Gly-OH
(2)
[93][_]
-Thr-Met-Arg
(2)
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CF
(1)
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prostaglandine E
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theophylline
(1)
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etran
(1)
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Val-Tyr-Arg-Pro
(1)
[99][_]
Trp-Glx-Val-OH
(1)
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cystine
(1)
[101][_]
Tryptophane
(1)
[102][_]
asparagine
(1)
[103][_]
sulfuric acid
(1)
[104][_]
lactic acid
(1)
[105][_]
oxalic acid
(1)
[106][_]
fumaric acid
(1)
[107][_]
maleic acid
(1)
[108][_]
sodium hydroxide
(1)
[109][_]
CM-cellulose
(1)
[110][_]
trihydrochloride
(1)
[111][_]
H-Asx-Thr-Met-Arg-Cys-Met-Val-Gly-Arg-
(1)
[112][_]
-Glx-Val-OH
(1)
[113][_]
-Glu-Val-OH
(1)
[114][_]
Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Glu-Val-OH
(1)
[115][_]
Val-Met-Arg
(1)
[116][_]
thioglycolic acid
(1)
[117][_]
H-Val-Gly-Arg-Val-TyrOH
(1)
[118][_]
H-Arg-Pro-Cys-Trp-Glx-Val-OH
(1)
[119][_]
R-Cys-Met-OH
(1)
[120][_]
amino acetate
(1)
[121][_]
Met-Val-Gly-Arg-OH
(1)
[122][_]
H-Pro-Cys-Trp-Glx-Val-OH
(1)
[123][_]
H-Cys-Met-Val-Gly-Arg-OH
(1)
[124][_]
H-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Glx-
(1)
[125][_]
COOH
(1)
[126][_]
phenol
(1)
[127][_]
H-Me
(1)
[128][_]
R-Gly-O
(1)
[129][_]
-Arg(Mts)-O
(1)
[130][_]
R-Tyr-O
(1)
[131][_]
Np-
(1)
[132][_]
Boc-Gln-Val-O
(1)
[133][_]
triethylamine
(1)
[134][_]
Boc-Gln-
(1)
[135][_]
dimethylformamide
(1)
[136][_]
-Arg(Mts)-Pro-O
(1)
[137][_]
dicyclohexylcarbodiimide
(1)
[138][_]
Tyr-O
(1)
[139][_]
-Arg(Mts)-Val-Tyr-O
(1)
[140][_]
tetrahydrofuran
(1)
[141][_]
chloroformate
(1)
[142][_]
-Arg(Mts)-Val-Tyr-O-Et
(1)
[143][_]
-Pro-O
(1)
[144][_]
H-Met-O
(1)
[145][_]
DCHA
(1)
[146][_]
dicyclohexylamine
(1)
[147][_]
H-
(1)
[148][_]
isobutyl chloroformate
(1)
[149][_]
THF
(1)
[150][_]
n-hexaneOn
(1)
[151][_]
-Arg(Mts)-Val-
(1)
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-Met-Val-
(1)
[153][_]
succinimide
(1)
[154][_]
-Arg(Mts)-Val-Tyr-Arg(Mts)-Pro-Cys
(1)
[155][_]
ethanedithiol
(1)
[156][_]
-Arg(Mts)-Val-Tyr-Arg(Mts)-
(1)
[157][_]
N-hydroxybenzotriazole
(1)
[158][_]
methanesulfonate
(1)
[159][_]
Val-Gly-Arg(Mts)-Val-Tyr-Arg(Mts)-Pro-Cys
(1)
[160][_]
-Trp-Gln-Val
(1)
[161][_]
Boc-
(1)
[162][_]
m-cresol
(1)
[163][_]
ethanediol
(1)
[164][_]
trifluoromethanesulfonate
(1)
[165][_]
thioanisole
(1)
[166][_]
acetonitrile
(1)
[167][_]
n-butanol
(1)
[168][_]
peptide C
(1)
[169][_]
pentobarbital
(1)
[170][_]
Chlorpromazine
(1)
[171][_]
Hg
(1)
[172][_]
HAsp-Thr-I
(1)
[173][_]
Met-Arg-Cys-
(1)
[174][_]
Val-Gly-Arg
(1)
[175][_]
Physical
(282/ 456)
[176][_]
5 percent
(31)
[177][_]
3 N
(21)
[178][_]
Rf 1
(15)
[179][_]
24 h
(12)
[180][_]
16 l
(7)
[181][_]
10 ml
(6)
[182][_]
60 min
(6)
[183][_]
80 percent
(5)
[184][_]
Rf 2
(5)
[185][_]
6 N
(4)
[186][_]
1 h
(4)
[187][_]
50 ml
(4)
[188][_]
1 N
(4)
[189][_]
3 ml
(4)
[190][_]
6 l
(4)
[191][_]
5 ml
(3)
[192][_]
0,2 M
(3)
[193][_]
4 h
(3)
[194][_]
30 ml
(3)
[195][_]
2 percent
(3)
[196][_]
200 ml
(3)
[197][_]
28 N
(3)
[198][_]
7 percent
(3)
[199][_]
10 percent
(3)
[200][_]
6,67 N
(3)
[201][_]
3 h
(3)
[202][_]
45 min
(3)
[203][_]
0,5 ml
(3)
[204][_]
1 ml
(3)
[205][_]
280 nm
(2)
[206][_]
400 ml
(2)
[207][_]
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(2)
[208][_]
0,01 M
(2)
[209][_]
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(2)
[210][_]
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(2)
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(2)
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30 nmol
(2)
[213][_]
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(2)
[214][_]
5-50 percent
(2)
[215][_]
Rf 3
(2)
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(2)
[217][_]
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(2)
[218][_]
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(2)
[219][_]
2,36 ml
(2)
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18 h
(2)
[221][_]
83 percent de
(2)
[222][_]
56 N
(2)
[223][_]
7 ml
(2)
[224][_]
11,35 g
(2)
[225][_]
7,74 N
(2)
[226][_]
8,02 N
(2)
[227][_]
100 ml
(2)
[228][_]
20 ml
(2)
[229][_]
0,93 ml
(2)
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87 percent
(2)
[231][_]
3 percent
(2)
[232][_]
0,6 ml
(2)
[233][_]
0,055 ml
(2)
[234][_]
de 1 ng/kg
(1)
[235][_]
10 mg/kg
(1)
[236][_]
100 g
(1)
[237][_]
35 percent
(1)
[238][_]
90 ml
(1)
[239][_]
68 cm
(1)
[240][_]
de 320 ml
(1)
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139 mg
(1)
[242][_]
63,0 cm
(1)
[243][_]
500 ml
(1)
[244][_]
0,1 M
(1)
[245][_]
de 110 ml
(1)
[246][_]
1,5 mg
(1)
[247][_]
2,5 cm
(1)
[248][_]
de 15 percent
(1)
[249][_]
45 percent
(1)
[250][_]
de 1 ml/min
(1)
[251][_]
de 13,3 ml
(1)
[252][_]
> 51 mg
(1)
[253][_]
de 99 percent
(1)
[254][_]
concentration 0,166 m
(1)
[255][_]
4400 W
(1)
[256][_]
18 h.
(1)
[257][_]
66 g
(1)
[258][_]
40 nmol
(1)
[259][_]
10 nmol
(1)
[260][_]
110 pg
(1)
[261][_]
88 pg
(1)
[262][_]
16 J
(1)
[263][_]
Rf 5
(1)
[264][_]
1 J
(1)
[265][_]
300 ml
(1)
[266][_]
16,4 g
(1)
[267][_]
de 17,5 g
(1)
[268][_]
16,45 g
(1)
[269][_]
79 percent de
(1)
[270][_]
33 N
(1)
[271][_]
7,64 N
(1)
[272][_]
7,54 N
(1)
[273][_]
7,94 ml
(1)
[274][_]
8,00 g
(1)
[275][_]
2,57 ml
(1)
[276][_]
8,60 g
(1)
[277][_]
11,0 g
(1)
[278][_]
43 N
(1)
[279][_]
6,97 N
(1)
[280][_]
7,00 N
(1)
[281][_]
9,54 g
(1)
[282][_]
16,56 ml
(1)
[283][_]
120 min
(1)
[284][_]
7,09 g
(1)
[285][_]
10,76 g
(1)
[286][_]
6,68 N
(1)
[287][_]
6,74 N
(1)
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9,30 g
(1)
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3,63 g
(1)
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3,71 g
(1)
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7,80 g
(1)
[292][_]
73 percent de
(1)
[293][_]
10,86 g
(1)
[294][_]
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(1)
[295][_]
20,05 g
(1)
[296][_]
6,13 g
(1)
[297][_]
8,1 ml
(1)
[298][_]
35 ml
(1)
[299][_]
de 10,23 g
(1)
[300][_]
17 ml
(1)
[301][_]
de 2,31 ml
(1)
[302][_]
2 h
(1)
[303][_]
5 cm
(1)
[304][_]
9,80 g
(1)
[305][_]
81 percent de
(1)
[306][_]
Rf 0,74
(1)
[307][_]
5,0 g
(1)
[308][_]
3,6 ml
(1)
[309][_]
4,1 g
(1)
[310][_]
4,7 g
(1)
[311][_]
2,9 ml
(1)
[312][_]
12 ml
(1)
[313][_]
30 min
(1)
[314][_]
de 5,26 g
(1)
[315][_]
0,87 ml
(1)
[316][_]
0,92 ml
(1)
[317][_]
5,40 g
(1)
[318][_]
67 percent de
(1)
[319][_]
6,55 g
(1)
[320][_]
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(1)
[321][_]
4,2 ml
(1)
[322][_]
7,42 g
(1)
[323][_]
9,0 g
(1)
[324][_]
82 percent de
(1)
[325][_]
Rf 4
(1)
[326][_]
250 ml
(1)
[327][_]
17,07 g
(1)
[328][_]
de 9,99 g
(1)
[329][_]
7 g
(1)
[330][_]
65 percent de
(1)
[331][_]
Rf 0,89
(1)
[332][_]
34 N
(1)
[333][_]
7,04 N
(1)
[334][_]
7,09 N
(1)
[335][_]
10,0 g
(1)
[336][_]
4,29 g
(1)
[337][_]
4,89 g
(1)
[338][_]
8,50 g
(1)
[339][_]
92 percent de
(1)
[340][_]
128 N
(1)
[341][_]
6,59 N
(1)
[342][_]
6,85 N
(1)
[343][_]
4,3 g
(1)
[344][_]
5,7 ml
(1)
[345][_]
4,10 g
(1)
[346][_]
59 N
(1)
[347][_]
4,84 g
(1)
[348][_]
4 ml
(1)
[349][_]
1,4 ml
(1)
[350][_]
de 6,20 g
(1)
[351][_]
1,54 ml
(1)
[352][_]
1,58 ml
(1)
[353][_]
2 g
(1)
[354][_]
70 percent de
(1)
[355][_]
4,4 g
(1)
[356][_]
68 percent de
(1)
[357][_]
6,40 N
(1)
[358][_]
6,34 N
(1)
[359][_]
1,3 g
(1)
[360][_]
1,06 g
(1)
[361][_]
2 ml
(1)
[362][_]
1,1 ml
(1)
[363][_]
de 3,8 g
(1)
[364][_]
62 ml
(1)
[365][_]
1,32 ml
(1)
[366][_]
36 h
(1)
[367][_]
2,8 g
(1)
[368][_]
66 N
(1)
[369][_]
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(1)
[370][_]
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(1)
[371][_]
6,52 N
(1)
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480 mg
(1)
[373][_]
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(1)
[374][_]
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(1)
[375][_]
0,094 ml
(1)
[376][_]
0,18 ml
(1)
[377][_]
430 mg
(1)
[378][_]
90 percent de
(1)
[379][_]
82 N
(1)
[380][_]
6,54 N
(1)
[381][_]
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(1)
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0,3 ml
(1)
[384][_]
1,5 ml
(1)
[385][_]
0,077 ml
(1)
[386][_]
300 mg
(1)
[387][_]
78 percent de
(1)
[388][_]
93 N
(1)
[389][_]
0,85 g
(1)
[390][_]
1,08 ml
(1)
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1,22 g
(1)
[392][_]
153 g
(1)
[393][_]
0,25 g
(1)
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1,1 g
(1)
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(1)
[396][_]
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(1)
[397][_]
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[405][_]
26,8 mg
(1)
[406][_]
48 h
(1)
[407][_]
11 mg
(1)
[408][_]
14 mg
(1)
[409][_]
48 h.
(1)
[410][_]
275 mg
(1)
[411][_]
75 cm
(1)
[412][_]
530 ml
(1)
[413][_]
220 mg
(1)
[414][_]
59 percent
(1)
[415][_]
78 percent
(1)
[416][_]
120 mg
(1)
[417][_]
0,33 ml
(1)
[418][_]
0,11 ml
(1)
[419][_]
3,02 ml
(1)
[420][_]
1 M
(1)
[421][_]
412 nm
(1)
[422][_]
40 mg
(1)
[423][_]
95 cm
(1)
[424][_]
672 ml
(1)
[425][_]
de 4 ml
(1)
[426][_]
50 percent
(1)
[427][_]
0,1 percent
(1)
[428][_]
de 2 ml/min
(1)
[429][_]
4 ml/min
(1)
[430][_]
Rf = 0,44
(1)
[431][_]
4,4 pg
(1)
[432][_]
2 nmol
(1)
[433][_]
1 mg/ml
(1)
[434][_]
3 h.
(1)
[435][_]
1 ul
(1)
[436][_]
0,02 N
(1)
[437][_]
0,1 mg
(1)
[438][_]
50 mg
(1)
[439][_]
de 1 m
(1)
[440][_]
0,1 percent de
(1)
[441][_]
de 0,5 ml/min.
(1)
[442][_]
2 pg/ml
(1)
[443][_]
de 50 mg/kg
(1)
[444][_]
de 3,5 cm
(1)
[445][_]
de 3 cm
(1)
[446][_]
de 2 mg/kg
(1)
[447][_]
180 min
(1)
[448][_]
2000 g
(1)
[449][_]
5 min
(1)
[450][_]
15 min
(1)
[451][_]
300 min
(1)
[452][_]
61 L
(1)
[453][_]
84 L
(1)
[454][_]
9 L
(1)
[455][_]
60 L
(1)
[456][_]
8 L
(1)
[457][_]
0 N
(1)
[458][_]
Generic
(13/ 121)
[459][_]
PEPTIDE
(58)
[460][_]
ether
(29)
[461][_]
acid
(9)
[462][_]
salts
(6)
[463][_]
HEPTADECAPEPTIDE
(5)
[464][_]
addition salts
(3)
[465][_]
amino acids
(3)
[466][_]
anhydride
(2)
[467][_]
amine
(2)
[468][_]
fatty acids
(1)
[469][_]
polypeptide
(1)
[470][_]
inorganic acid
(1)
[471][_]
hydrazide
(1)
[472][_]
Gene Or Protein
(28/ 62)
[473][_]
Etre
(16)
[474][_]
Carboxypeptidase
(5)
[475][_]
DANS
(4)
[476][_]
Chymotrypsin
(4)
[477][_]
Proteins
(3)
[478][_]
Asp 1
(3)
[479][_]
Carboxypeptidase Y
(3)
[480][_]
LH-RH
(2)
[481][_]
Lic
(2)
[482][_]
GHRH
(2)
[483][_]
GLU
(1)
[484][_]
GLN
(1)
[485][_]
GH A
(1)
[486][_]
Xmax
(1)
[487][_]
BC 1
(1)
[488][_]
KOZA
(1)
[489][_]
Fic
(1)
[490][_]
Proteases
(1)
[491][_]
Tre
(1)
[492][_]
Parla
(1)
[493][_]
TMF
(1)
[494][_]
D-ii
(1)
[495][_]
Kiesel
(1)
[496][_]
Exopeptidase
(1)
[497][_]
Carboxypeptidase A
(1)
[498][_]
Cou
(1)
[499][_]
GRP
(1)
[500][_]
GPG
(1)
[501][_]
Chemical Role
(4/ 25)
[502][_]
HORMONE
(13)
[503][_]
refrigerant
(7)
[504][_]
stimulant
(4)
[505][_]
excipients
(1)
[506][_]
Organism
(5/ 21)
[507][_]
rats
(16)
[508][_]
animal
(2)
[509][_]
bovine
(1)
[510][_]
porcine
(1)
[511][_]
Oncorhynchus keta
(1)
[512][_]
Substituent
(11/ 14)
[513][_]
Dansyl
(3)
[514][_]
carboxy-methyl
(2)
[515][_]
carboxy
(1)
[516][_]
Boc
(1)
[517][_]
tert-butyloxycarbonyl
(1)
[518][_]
O-benzyl
(1)
[519][_]
O-methyl
(1)
[520][_]
mesitylene-2-sulfonyl
(1)
[521][_]
p'-methoxybenzyl
(1)
[522][_]
O-ethyl
(1)
[523][_]
cyclohexyl
(1)
[524][_]
Polymer
(2/ 5)
[525][_]
Sephadex
(4)
[526][_]
Heparin
(1)
[527][_]
Disease
(3/ 4)
[528][_]
Tic
(2)
[529][_]
Anaphylactic
(1)
[530][_]
Cancer
(1)
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Publication
_________________________________________________________________
Number FR2521133A1
Family ID 2022249
Probable Assignee Suntory Ltd
Publication Year 1983
Title
_________________________________________________________________
FR Title NOUVEL HEPTADECAPEPTIDE A EFFET DE LIBERATION D'HORMONE DE
CROISSANCE ET MEDICAMENT LE CONTENANT
Abstract
_________________________________________________________________
LE NOUVEAU PEPTIDE SELON L'INVENTION EST UN HEPTADECAPEPTIDE REPONDANT
A LA FORMULE:
(CF DESSIN DANS BOPI)
DANS LAQUELLE GLX EST GLU OU GLN, ET AYANT LES PROPRIETES PHYSIQUES
SUIVANTES:
1SPECTRE D'ABSORPTION UV: L 280NM;
2REACTION DE EHRLICH, REACTION DE SAKAGUCHI ET REACTION DE PAULY:
POSITIVES;
3CARACTERE BASIQUE;
4SOLUBLE DANS L'water, LE METHANOL ET L'ACETic acid, LEGEREMENT
SOLUBLE DANS L'ETHyl ACETate, L'BUTyl ACETate, L'ETHyl ether,
L'HEXANE, L'ETHER DE PETROLether, LE BENZENE ET LE chloroform; ET
5ETAT PHYSIQUE: POUDRE BLANCHE.
IL POSSEDE UN EFFET SPECIFIQUE DE LIBERATION DE L'HORMONE DE
CROISSANCE ET PAS DE SPECIFICITE A L'ESPECE.
APPLICATIONS: EN MEDECINE HUMAINE POUR LA THERAPIE DU NANISME ET LA
REPARATION DES BLESSURES, MAIS EGALEMENT EN MEDECINE VETERINAIRE POUR
LA STIMULATION DE LA CROISSANCE DES ANIMAUX DOMESTIQUES.
Description
_________________________________________________________________
La presente invention concerne un nouveau peptide et ses salts ayant
un effet de liberation d'hormone de croissance (ci-apres denommee
"GH") et un agent hormonal contenant ledit peptide comme ingredient
actif.
La GH est une des hormones hypophysaire capable de provoquer la
croissance, ayant un effet direct ou indirect sur les cellules
somatiques pour stimuler la synthese globale des proteins dans un
organisme animal et stimulant la liberation des fatty acids libres
pour augmenter l'energie disponible Bien que la GH ait ete appliquee
pour la therapie du nanisme, on peut fortement s'attendre d'apres
l'effet de la GH ci-dessus mentionnee que la GH soit encore appliquee
pour la reparation des blessures necessitant l'activation des cellules
somatiques.
A la difference de l'insuline, cependant, la GH ayant des specificites
a l'espece elevees ne peut pas etre appliquee a l'organisme humain si
elle est extraite de glandes hypophyses bovine ou porcine De plus, la
GH humaine etant un polypeptide unique consistant en 191 aminoacides
ayant un poids moleculaire eleve (environ 22 000) ne peut pas etre
synthetisee par une synthese organique La GH a donc ete extraite des
glandes hypophyses de la meme espece d'animaux, mais on en est tres a
court pour la therapie du nanisme.
La GH ainsi que l'hormone thyreostimulante (ci- apres denommee "TS-H'
percent l'hormone luteinisante ou gonadostimuline
(ci-apres denommee "LH"), etc sont sous le controle de l'hypotha-
lamus On a trouve que la secretion de chaque hormone hypophysaire est
stimulee specifiquement par l'hormone de liberation correspon- dante
(ci-apres denommee "RH") secretee par l'hypothalamus.
Par exemple, l'hormone de liberation de la thyrotropine (ci-apres
denommee 'ITRH") stimulant la secretion de TSH et l'hormone de
liberation de la gonadostimuline (ci-apres denommee "LH-RH") stimulant
la secretion de la LH ont ete isolees et identifiees.
En ce qui concerne l'hormone liberant l'hormone de croissance
(ci-apres denommee "GH-RH") stimulant la secretion de
GH, bien que l'on ait suggere que la GH-RH etait un peptide consis-
tant en 10 aminoacides et isole des tissus de l'hypothalamus de porc
par Shary en 1971, les resultats d'une etude ulterieure ont confirme
que le peptide ci-dessus est etranger and la GH-RH Jusqu'a prisent, la
GH-RH n'a ete trouvee encore chez aucun animal.
Par contre, il a ete trouve qu'il y a liberation d'un peu de GH de
maniere specifique par l'utilisation de certaines substances telles
qu'arginine, glucagone et TRH En outre, bien que l'on dise que la
prostaglandine E, la theophylline, l'acidcyclo- adenylique, etc, aient
un effet de liberation de GH, le mecanisme de l'effet n'est
apparemment pas specifique a la lumiere des prin- cipes En outre, bien
que l'on considere que certains peptides neurotransmetteurs aient un
certain effet de liberation de GH, le mode d'action semble n'etre pas
specifique D'autre part, il a ete confirme que la RH dans
l'hypothalamus n'a pas de specificite and l'espece conformement a
l'etude de ia TRH ou de la LH-RH.
A la suite de recherches poussees sur les pro- blemes ci-dessus, la
demanderesse a maintenant trouve qu'un nouveau' peptide derive de
l'hypothalamus peut etre isole d'un extrait de glandes hypophyses du
saumon et que le peptide ainsi obtenu a un effet de liberation de GH
specifique sur des especes animales etran- geres. Selon la presente
invention, on peut proposer un peptide ou ses salts repondant and la
formule dans laquelle suivantes:
H-Asp-Thr-Met-Arg-Cys-Met-Val-Gly-Arg-
Val-Tyr-Arg-Pro-Cs-Trp-Glx-Val-OH (1) Glx est Glu ou Gln, et ayant les
proprietes physiques (1) Spectre d'absorption UV: Xmax 280 nm; (2)
Reaction de Ehrlich, reaction de Sakaguchi et reaction de Pauly:
positives; (3) Caractere hasique; (4) Soluble dans l'water, le
methanol et l'acetic acid, legerement soluble dans l'ethyl acetate,
l'butyl acetate, l'ethyl ether, l'hexane, l'ether de petrolether, le
benzene et le chloroform; et
(5) Etat physique: poudre blanche.
On peut egalement proposer selon l'invention un agent hormonal
contenant comme ingredient actif le peptide ci-dessus ou un de ses
salts.
L'invention sera mieux comprise a la lecture de la description qui va
suivre en reference aux dessins annexes dans lesquels: la figure 1
represente un chromatogramme obtenu par chromatographie sur colonne de
filtration sur gel a l'exemple 1; la figure 2 represente un
chromatogramme obtenu par chromatographie d'echange d'ions a l'exemple
1; la figure 3 represente une courbe d'elution obte- nue par
chromatographie liquide haute pression a phase inversee (ci- apres
denommee "HPLC") a l'exemple 1; la figure 4 represente un spectre
d'absorption UV du peptide selon l'invention; la figure 5 et la figure
6 representent respec- tivement les courbes d'elution obtenues par
HPLC dans les exemples analytiques 7 et 8; la figure 7 represente une
courbe d'elution obtenue par HPLC a l'exemple 2; la figure 8 est un
diagramme representant la variation au cours du temps de l'activite in
vivo de liberation de GH de la GH-RH obtenue dans l'exemple d'essai
pharmacologique 2 at la figure 9 est un diagramme representant la
variation au cours du temps de l'activite in vivo de liberation de
GH de la lGln 163-G Hi-RH obtenue a l'exemple d'essai pharmacologique
3.
Dans la presente description, les abreviations suivantes representent
respectivement les aminoacides suivants: Asp: aspartic acid Thr:
threonine Met: methionine Arg: arginine Cys: 1/2 cystine Val: valine
Tyr: tyrosine Pro: proline Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-:Tryptophane Gln:
glutamine Glu:glutamic acid Asx:aspartic acid ou asparagine
Glx:glutamic acid ou glutamine Des exemples de salts du peptide de
l'invention sont par exemple les addition salts d'acidsavec
l'acidchlor- hydrique, l'sulfuric acid, l'acetic acid, l'lactic acid,
l'citric acid, l'oxalic acid, l'fumaric acid, l'maleic acid, etc. Le
peptide de l'invention peut etre obtenu par extraction des hypophyses
de saumon L'hypothalamus de saumon seul ne peut pas etre totalement
isole parce que l'hypothalamus de saumon penetre dans l'hypophyse, a
la difference de celui des mammiferes.
Donc, l'extraction doit etre effectuee a partir d'un melange isole' a
la fois de l'hypophyse et du l'hypothalamus En consequence, dans la
presente description, on entend par "hypophyse de saumon" l'hypo-
physe contenant de l'hypothalamus.
Le peptide de l'invention peut etre obtenu par extraction d'hypophyses
de saumon franchement lyophilisees par BC 1- acetone, relargage des
extraits, isolement du peptide desire par chromatographie de
filtration sur gel et chromatographie d'echange d'ions et ensuite
purification par HPLC Dans ce cas, le peptide ainsi obtenu est une
GR-RH ayant la formule (I) dans laquelle Glx est Glu Le peptide obtenu
peut etre facilement transforme en addition salt
d'acidpar'lyophilisation ou cristallisation apres traitement avec un
inorganic acid tel que l'hydrochloric acid.
D'autre part, a la suite de travaux pousses sur la synthese de ce type
de peptide, on a maintenant trouve que le peptide de l'invention peut
etre synthetise par une technique de synthese des peptides.
Selon l'invention, le peptide de la presente inven- tion peut etre
synthetise sur la base de la structure de la GB-RH ci- dessus obtenue
a partir des hypophyses de saumon Dans ce cas, on peut synthetiser la
lGln J-GB-RH lorsque l'on utilise Gln comme Glx, tandis que l'on peut
synthetiser lGlu 1-GR-RH en utilisant Glu comme Glx En ce qui concerne
la technique operatoire pour la synthese ci-dessus, on peut consulter
Haruaki Yajima et Syunpei Sakakibara (Tanpakushitsu no Kagaku (Protein
Chemistry), SEIKAGAKU JIKKEN KOZA (Experimental Biochemistry) (I), 4,
p 208-495 (1977) edite par Japanese Biochemical Son et publie par
Kabushiki Kaisha Tokyo Kagaku Dohjin) et Nobuo Izumiya et col (PEPTIDE
GORSEI
(SYNTHESIS) (1975) publie par Maruzen Kabushiki Kaisha).
Le peptide selon l'invention est une GH-RH ayant un effet specifique
de liberation de GH et pas de specificite de l'espece Donc, l'agent a
activite de GH-RH contenant le peptide selon l'invention comme
ingredient actif peut etre utilise non seulement pour la therapie du
nanisme humain et la reparation des blessures mais aussi pour stimuler
la croissance des animaux domes- tic. Le peptide selon l'invention
comme d'autres peptides doues d'activite physiologique, possede dans
l'organisme des recepteurs specifiques et provoque des reactions
specifiques par action specifique sur les recepteurs La GH-RH peut
liberer la GH dans l'hypphyae ayant des recepteurs specifiques, mais
n'a pas d'effet sur les autres tissus n'ayant pas de recepteursspeci-
fic. En outre, le peptide selon l'invention consistant en
L-aminoacides seuls est successivement digere par diverses proteases
et son effet ne peut pas etre maintenu.
D'autre part, le peptide ayant ce poids moleculaire (environ 2000) n'a
pas d'antigenicite et ne provoque ni production d'anticorps ni choc
anaphylactic, meme si l'on repete l'adminis- tration Le peptide n'est
pas toxique.
Le peptide selon l'invention presente son effet a une dose extremement
faible de l'ordre du ng/kg, qui est inferieure a celle de la GH
elle-meme, sur la base de la quantite de l'ingre- dient actif L'effet
est accru en proportion de la dose, et la dose peut etre augmentee
jusqu'a l'ordre du mg/kg La dose preferee est ordinairement de 1 ng/kg
a 10 mg/kg.
Le peptide selon l'invention est administre de preference par
injection, par exemple injection intraveineuse, injection
intramusculaire, injection sous-cutanee, etc, ordinaire- ment
utilisees pour les peptides Dans le cas de l'administration de
l'invention par voie orale, le peptide est digere dans les organes de
digestion et transforme en une forme inactive Dans ce cas, ce-
pendant, il peut etre utilise sous certaines formes de preparation
telles que des microcapsules enrobees dans le liposome, non digerees
dans les organes En outre, le peptide de l'invention est egalement
administre a partir des muqueuses autres que les organes de diges-
tion, comme le rectum, le dessous de la langue, le nez, etc Dans ce
Cas, on peut l'utiliser sous diverses formes de preparation telles que
suppositoires, pastilles sublinguales, pulverisations rhinolo- giques
Des exemples d'excipients sont ceux avec lesquels le peptide de
l'invention n'est pas digere.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter
la portee.
EXEMPLE 1
On extrait environ 100 g d'hypophyse fratche pre- levee sur des
saumons blancs femelles (Oncorhynchus keta) par 400 ml de melange
hydrochloric acid a 35 percent -acetone dans le rapport 1:28 et
ensuite 2 080 ml d'acetone a 80 percent On combine chaque extrait et
on l'ajoute and 10 1 d'acetone en agitant pour obtenir 3,0 g de pre-
cipite dans l'acetone acidOn ajoute le precipite obtenu a 90 ml
d'water, on ajuste a p H 3 et, si necessaire, on ajuste a nouveau par
l'sodium hydroxide O,l N ou l'hydrochloric acid O,l N On ajoute
ensuite 10 ml de solution saturee de Na Cl pour relarguer le produit.
Apres centrifugation du precipite obtenu, on chromatographie le
liquide surnageant resultant sur une colonne (5,5 x 68 cm) de
"Sephadex G 25 (M) " On effectue l'elution par l'acetic acid OIN
(volume de fraction: 10 ml par fraction) Le chromatogramme obtenu est
represente a la figure 1 La fraction III representee a la figure 1
ayant un volume de 320 ml est desalinisee avec un filtre a membrane
"UM-2 "(fabrique par la societee Amicon Co) et ensuite lyophilisee
pour donner 139 mg de poudre blanche La poudre resul- tante est encore
chromatographiee sur une colonne echangeuse d'ions (1,6 x 63,0 cm) de
"CM-cellulose" On effectue l'elution avec un gradient obtenu en
utilisant 500 ml de solution tampon d'acetate d'ammontuacetate 0,01 M,
p H 4,6, et en ajoutant goutte a goutte une solu- tion tampon
d'ammonium acetate 0,1 M, p H 7,0 Le chromatogramme resultant est
represente and la figure 2 La fraction (8) indiquee a la figure 2
ayant un volume de 110 ml est lyophilisee pour donner 1,5 mg de GH-RH
brute.
La GH-RH brute obtenue est encore chromatographiee par HPLC sur une
colonne (0,4 x 2,5 cm) de "fine packcyl C 18 " fabriquee par Nippon
Bunko Kogyo Kabushiki Kaisha, equilibree par l'ammonium acetate 0,01 M
a p H 5,0.
On effectue l'elution avec un gradient lineaire d'isopropanol
(concentration de 15 percent A 45 percent) dans un dispositif a niveau
constant a un debit de 1 ml/min et la colonne etant a la temperature
ambiante et l'effluent recueilli par fractions de 1 ml La courbe
d'elution resultante est representee a la figure 3 La fraction A
representee a la figure 3 ayant un volume de 13,3 ml est lyophilisee
pour donner O > 51 mg de peptide de l'invention ayant une purete
elevee de 99 percent ou davantage.
Les proprietes physiques du peptide basique obtenu sont les suivantes:
Aspect: poudre blanche
Poids moleculaire: 500 A 3000 (determine par filtra- tion sur gel)
Reactions colorees: reaction de Ehrlich (+), reaction de Sakaguchi
(+), reaction de Pauly (+) Solubilite: soluble dans l'water, le
methanol et l'acetic acid; legerement soluble dans l'ethyl acetate,
l'butyl acetate, l'ether de petrolether, l'ethyl ether, l'hexane, le
benzene et le chloroform Spectre d'absorption UV (dans l'acetic acid
O,l N, concentration 0,166 m M): le spectre est represente a la figure
4.
Dans 5 ml d'water distillee,on dissout 500 pg du peptide ci-dessus, on
le transforme en le addition salt d'acidavec quelques gouttes
d'hydrochloric acid 0,1 N et on lyophilise pour obtenir 500 pg du
hydrochloride du peptide de l'invention.
La composition en aminoacides et les enchainements d'aminoacides du
peptide obtenu a l'exemple 1 sont determines selon les exemples
analytiques 1 a 8 suivants.
EXEMPLE ANALYTIQUE 1
(Composition en aminoacides, determinee apres hydrolyse acide)
On effectue l'analyse des aminoacides sur un auto- analyseur
d'aminoacides "LXB 4400 W(fabrique par la societe LKB Biochrom Co.,
Ltd), apres hydrolyse du peptide obtenu a l'exemple 1 dans HC 1 6 N A
110 C pendant 18 h. Les resultats obtenus sont les suivants:
Aminoacides Trouve (moles) Calcule (moles) Asp 1,0 1 Thr 1,0 1 Glx 1,1
1 Pro 1,2 1 Gly 1,1 1 Cys 1,9 2 Val 3,0 3 Met 2,0 2 Tyr 0,8 1 Arg 2,5
3 Val-Tyr-Arg-Pro-Cys- 1, 2 i La valeur trouvee de Cys est determinee
par oxydation a l'performic acid.
EXEMPLE ANALYTIQUE 2
(Aminoacide N-terminal) L'aminoacide N-terminal du peptide obtenu A
l'exemple 1 est determine selon la methode Dansyl (voir Gray et col,
Biochemica.
J., 89 page 379 (1963)) qui montre qu'il consiste en Asx.
EXEMPLE ANALYTIQUE 3
(Aminoacide C-terminal) L'aminoacide C-terminal du peptide obtenu a
l'exemple 1 est determine selon une methode d'hydrazinolyse, voir
Akabori et col, Bulletin Chemical Soc Japan 25, page 214 (1952) et
l'on trouve qu'il consiste en Val.
On trouve d'apres les exemples analytiques 1 a 3 que le peptide selon
l'invention est un heptadecapeptide consistant en onze types
differents de 17 aminoacides ayant un poids moleculaire calcule de
2211 sous forme de trihydrochloride et contenant Asx comme aminoacide
N-terminal et Val comme aminoacide C-terminal.
EXEMPLE ANALYTIQUE 4
(Suite d'aminoacides (1))
En utilisant 66 g (environ 30 nmol) du peptide carboxy-methyl obtenu a
l'exemple 1, on determine la suite d'aminoacides a partir du residu
N-terminal selon la methode Edman-Dansyl, voir Hartley et col,
Biochimica, Biophysica Acta 21, page 58 (1956) Les resultats sont les
suivants:
H-Asx-Thr-Met-Arg-Cys-Met-Val-Gly-Arg-
Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-(Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-)-Glx-Val-OH
EXEMPLE ANALYTIQUE 5
(Suite d'aminoacides C))
En utilisant 88 /lg (environ 40 nmol) du peptide carboxy-methyl obtenu
a l'exemple 1, on determine la sequence d'aminoacides and partir du
residu N-terminal par la methode fluorescein-isocyanate, voir Muramoto
et col Agricultural and Biological Chemistry, 44, pages 1559 A 1563
(1978) Les resultats obtenus sont les suivants:
H-Asp-Thr-Met-Arg-Cys-Met-Val-Gly-Arg- l
Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Glx-Val-OH La methode fluorescein-isocyanate
ci-dessus de Muramoto et col est une methode particulierement fiable
pour determiner une suite d'aminoacides avec des echantillons assez
petits.
EXEMPLE ANALYTIQUE 6
(Digestion par la carboxypeptidase Y) A un tampon a l'acetate de
Nethylmorpholinacetate 0,2 M a p H 8,0, contenant de la
carboxypeptidase Y, on ajoute 10 nmol du peptide obtenu a l'exemple 1
et on fait incuber le melange de reaction d 37 O C Le rapport
carboxypeptidase Y/substrat est de 1:60 en poids.
On determine la composition en aminoacides des produits de digestion
obtenu en 1 h et en 5 h On trouve que deux d'entre eux sont comme
suit: Aminoacides 1 h (moles) 5 h (moles) Val 1,0 1,0 Glu 0,2 O 05
D'apres ces resultats, conjointement avec l'exemple analytique 3, il
est prouve que l'enchatnement C-terminal est -Glu-Val-OH. D'apres les
exemples analytiques 1 a 6, on elucide que la suite d'aminoacides
complete du peptide de l'invention est comme suit:
H-Asp-Thr-Met-Arg-Cys-Met-Val-Gly-Arg-
Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Glu-Val-OH (I)
En outre, on fait digerer le peptide de l'inven- tion avec la
chymotrypsin ou la trypsine, et on etudie ensuite la composition en
aminoacides, l'aminoacide N-terminal et l'enchaine- ment d'aminoacides
du produit digere obtenu selon les exemples analytiques 7 et 8 afin de
confirmer l'enchatnement complet d ' aminoacides.
EXEMPLE ANALYTIQUE 7
(Digestion par la chymotrypsin) On a)oute 110 pg du peptide obtenu a
l'exemple 1 a du tampon ammonium acetate 0,2 M a p Hi 8,0 contenant de
la chymotrypsin et on fait incuber le melange de reaction pendant 1 h
a 37 e C Le rapport chymotrypsin/substrat est de 1:250 en poids Le
produit digere obtenu est ensuite analyse par HPLC de la meme maniere
qu'a l'exemple percent sauf que l'elution est effectuee par
l'isopropanol a 5-50 percent La courbed'elution resultante est
indiquee dans la figure 1.
Les fractions (C-2), (C-4) et (C-13), respectivement, indiquees a la
figure 5 sont analysees de la meme maniere que dans les exemples
analytiques 1 et 2 et on determine les compositions en aminoacides et
les aminoacides N-terminaux de ces fractions Les resultats obtenus
sont les suivants: Fraction (C-2) Aminoacide Trouve (moles) Calcule
(moles) Asx 1, 0 1 Thr 1,0 1 Met 1,0 1 Arg 0,6 1 aminoacide
N-terminal: Asx Fraction (C4) Aminoacide Gly Val-Tyr-Arg aminoacide
N-terminal: Fraction (C-13) Aminoacide Glx Pro Cys Val-Met-Arg
Val-Tyr-Arg-Pro-Cys- Trouve (moles) Calcule (moles)
1,0 1
2,2 2
0,9 1
0,8 1
: Val Trouve (moles) Calcule (moles)
1,0 1
1,2 1
1,8 2
1,0 1
0,9 i
1,3 1
+ (decele et confirme par le reactif d'Ehrlich) aminoacide N-terminal:
Arg Les fractions (0-2), (C-4) et (C-13) sont ensuite analysees,
respectivement, de la meme maniere qu'a l'exemple analytique 4 pour
determiner les enchainements d'aminoacides Dans ce cas, les fractions
(C2) et (C-4) sont analysees telles quelles et la fraction (C-13) est
analysee apres carboxymethylation L'iden- tification de
Val-Tyr-Arg-Pro-Cys- est effectuee par la methode Edman-Dansyl dans
laquelle on determine Val-Tyr-Arg-Pro-Cys- sous la forme de
DNS-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys- par hydrolyse avec l'thioglycolic acid Cys
est determinee sous la forme de DNS-Cm-Cys de la meme maniere que
ci-dessus Les resultats sont indiques ci-apres.
Fraction (C-2) H-Asx-Thr-Met-Arg-OH Fraction (C-4)
H-Val-Gly-Arg-Val-TyrOH Fraction (C-13) H-Arg-Pro-Cys-Trp-Glx-Val-OH i
R-Cys-Met-OH
EXEMPLE ANALYTIQUE 8
(Digestion par la trypsine)
A une solution de tampon a l'amino acetate- nium 0,2 M, p H 8,0,
contenant de la trypsine, on ajoute 88 pg (environ 30 nmol) du peptide
obtenu a l'exemple 1 et on fait incuber le melange de reaction pendant
4 h a 37 C Le rapport trypsine/subs- trat est de 1:50 en poids Le
produit de digestion est ensuite analyse par HPLC de la meme maniere
qu'a l'exemplel, sauf que l'elution est effectuee par l'isopropanol a
5-50 percent La courbe d'elution resultante est representese a la
figure 6 Les fractions (T-6), (T-8), (T-26) et (T-28) indiquees a la
figure 6 sont analysees, respectivement, de la meme maniere qu'aux
exemples analytiques 1 et
2 et on determine leurs compositions en aminoacides et leurs amino
acidsN-terminaux Les resultats obtenus sont les suivants.
Fraction (T-6) Amihoacide Trouve (moles) Calcule (moles) Asx 1,0 1 Thr
0, 9 1 Met 1,0 1 Arg 1,0 1 aminoacide N-terminal: Asx Fraction (T-8)
Aminoacide Trouve (moles) Calcule (moles) Val 1,3 1 Tyr 1,0 1 Arg 1,0
1 aminoacide N-terminal: Val Fraction (T-26) Aminoacide Trouve (moles)
Calcule (moles) Glx 0,9 1 Pro 1 X 3 1 Gly 1,0 1 Cys 1, 6 2 Val 1,9 2
Met 1,0 1 Arg 0,9 1 Val-Tyr-Arg-Pro-Cys- + (decele et le reactif
aminoacide N-terminal: Val Fraction (T-28) Aminoacide Trouve (D Glx
1,1 1, Pro 1,3 Gly 1,3 Cys 1,6 Val 2,7 Met 1,1 Tyr 0,8 Arg 2,0
Val-Tyr-Arg-Pro-Cys- confirme par d'Ehrlich) moles) Calcule (moles) +
(decele et confirme par le reactif d'Ehrlich) aminoacide N-terminal:
Val Les fractions (T-6), (T-8), (T-26) et (T-28) sont ensuite
analysees, respectivement, de la meme maniere qu'a l'exemple
analytique 4 pour determiner leurs enchainements d'amino acidsDans ce
cas, les fractions (-6), (T-8) et (T-26) sont analysees telles quelles
et la fraction (T-28) est analysee apres carboxy- methylation Les
resultats obtenus sont les suivants.
Fraction (T-6) H-Asx-Thr-Met-Arg-OH Frattion (T-8) H-Val-Tyr-Arg-OH
Fraction (T-26) H-C s-Met-Val-Gly-Arg-OH H-Pro-Cys-Trp-Glx-Val-OH
Fraction (T-28) H-Cys-Met-Val-Gly-Arg-OH A¦
H-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Glx- Val-OH
Les resultats obtenus aux exemples analy- tic 7 et 8 sont totalement
en accord avec ceux des exemples ana- lytiques 1 and 6, et il est
clair que l'enchatnement d'aminoacides determine doit 4 tre exact.
MEXEPLE 2.
(Synthese de la lGln 16 J-GH-RH)
Dans l'exemple 2, on utilise pour la chromato- graphie sur couche
mince les solvants de developpement suivants Rf 1:(CRU 3: CH 3 OH: R
20 -8:3:1) Rf (CE Ci 3: CH 3 OH: CH 3 COOH 9: 1 O > 5) Rf 3 1 Cii 3:
CH 30 H = 9: O > 5) R *(CH Cl f 4 3 Rf 5 4 9 OH CH 3 COOC 2 H, 5CH 3 C
(-HR:: OO:HO 20 1: 1: iz 1 et on effectue l'hydrolyse dans 1101 6 N
avec du phenol a 110 'C pendant 24 h, sauf indication contraire.
On synthetise la LlGln 1 J -GMI-RH par une methode en phase liquide
sur la base de la structure de la GR-RH obtenue a l'exemple 1 Le
schema des etapes de synthese est le suivant Bo.c-Asp(O Bzl) -O Np Z(O
Me)-Thr-OH 11Met-OM Me T_ C Z(O Me)-Arg(mts)-o Hi (1-8)
Boc-Cys(Mzl)-OH 1 H-Me-O Me Boc-Val-OH R-Gly-O Bzl-1 H/d * Z (01 e)
-Arg(Mts)-O Boc-Val-OH B R-Tyr-O Et
(9-13) Z(ome)-Arg(Mts)-OH-
H-Pro-O Bzl-l H 2 P
Boc-Cys (M Bzl) -O Np-
A Boc-Trp-ONp (14-17) Boc-Gln-ONp
H-Val-O Bzlj-i-
Boc: groupe tert-butyloxycarbonyl O Bzl: groupa O-benzyl O Np:
0-pnitrophenol O Me: groupe O-methyl Z(O Me): groupe
pmethoxybenzyloxycarbonyle Mts: groupe mesitylene-2-sulfonyl M Bzl:
groupe p'-methoxybenzyl O Et: groupe O-ethyl (A) Synthese de Boc-Cys(M
Bzl)-Trp-Gln-Val-O Bzl (positions 14-17),
PM = 845,00
(A-i) Synthese de Boc-Gln-Val-O Bz (positions 16-17), PM = 435,508.
A 300 ml de solution dans le dioxan contenant 16,4 g de Boc-Gln-ONp et
H-Val-O Bzl prepare a partir de 17,5 g de p-toluenesulfonate et 6,45
ml de triethylamine (ci-apres denommee "Et 3 N"), on ajoute 6,45 ml de
Et 3 N On maintient le melange de reaction obtenu a la temperature
ambiante pendant 24 h, et ensuite on.concentre On dissout le residu
dans l'ethyl acetate (ci-apres denomme "Ac O Et"), on lave par
l'citric acid a 5 percent 7, Na 2 CO 3 A 5 percent et Na Cl aqueux, et
ensuite on seche sur Na 2 SO 4 Apres avoir chassa Ac O Et par
distillation, on ajoute au residu de l'ether de petrolether pour le
faire cristalliser La recristallisation dans Ac O Et-ether donne 16,45
g (79 percent de la theorie) du compose recherche.
Rfl = 0,60, Rf 2 = O > 43 Analyse elemantaire pour C 22 H 33 N 306
Calcule percent: C 60,67 H 7,64 N 9, > 65 Trouve percent: C 60,60 H
7,54 N 9,60 (A-ii) Synthese de Boc-Trp-Gln-Val-O Bzl (positions
15-17), Pl = 621,714
A 7,94 ml d'anisole, on ajoute 8,00 g de Boc-Gln-
Val-O Bzl On traite le melange de reactionaec 30 ml d'acidtri-
fluoroacetique (ci-apres denomme "TFA") pendant 60 min en refroidis-
sant par la glace > et ensuite on distille le TFA a la temperature
ambiante On ajoute le residu a du n-hexane, on lave par decantation et
ensuite on seche sur KOH Apres avoir dissous le produit huileux obtenu
dans 80 ml de dimethylformamide (ci-apres denomme "DMF") et neutralise
avec 2,57 ml de Et 3 N, on ajoute 8,60 g de Boc-Trp-ONp.
On maintient le melange de reaction a la temperature ambiante pendant
24 h pour provoquer la reaction Apres avoir chasse le solvant par
distillation a 300 C, on dissout le residu dans Ac O Et, on lave par
Na 2 CO 3 A 5 percent, par l'citric acid a 5 percent et par Na Cl
aqueux, et ensuite on seche sur Na 2 SO 4 Apres avoir distille Ac O
Et, on ajoute le residu a de l'etherpour la cristallisation La recris-
tallisation dans Ac O Et-ether donne 11,0 g (96 percent de la quantite
theorique) du compose recherche.
A* Rf 1 = 0,52, Rf 2 = 0,40 Analyse elementaire pour C 33 H 43 N 507
Calcule percent: C 63,75 H 6,97 N 11,28 Trouve percent: C 63,47 H 7,00
N 10,98 (A-iii) Synthese de Boc-Cys(M Bzl)-Trp-Gln-Val-O Bzl
(positions 14-17)
PM = 845,00
A 9,54 g de Boc-Trp-Gln-Val-O Bzl, on ajoute 16,56 ml
d'ethanedithitanisole a 2 percent On traite le melange de reaction par
ml de TFA sous nitrogen pendant 120 min en refroidissant par la glace
Apres avoir distille le TFA a 30 C, on ajoute le residu and de
l'etherpour obtenir une poudre que l'on seche sur KOH La poudre
blanche obtenue est dissoute dans 50 ml de D Me et ensuite on ajoute
2,36 ml de Et 3 N et 7,09 g de Boc-Cys(M Bzl)-O Np On maintient le
melange de reaction a la temperature ambiante pendant 18 h pour
provoquer la reaction et on neutralise par l'acetic acid Apres avoir
distille le solvant, on dissout le residu dans Ac O Et, on lave par Na
2 C 03 A 5 percent, par l'acetic acid a 5 percent et par Na Cl aqueux
et on seche sur Na 2 SO 4 Apres avoir distille Ac O Et, on triture
dans l'etherle produit gelatineux obtenu La precipitation par le
melange methanol-ether est repetee deux fois pour donner 10,76 g (83
percent de la quantite theorique) du compose recherche.
R 1: 0,57
Analyse elementaire pour C 44 H 56 N 6095 Calcule percent: C 62,54 H
6,68 N 9, 95 Trouve percent: C 62,38 R 6,74 N 9,81 (B) Synthese de Z(O
Fe)-Arg(Mts)-ValTyr-Arg(Mts)Pro-OH (position
9-13),PM: 707,824
(B-i) Synthese de Z(O Me)-Arg(Mts)-Pro-O Bzl (positions 12-13) Dans
200 ml de Ac O Et, on met en suspension 9,30 g de Z(O Me)-Arg(Mts)-OH,
CHA(cyclohexylamine) et 3,63 g de H Cl,H-Pro-O Bzl en refroidissant
par la glace, et ensuite on ajoute 3,71 g de dicyclohexylcarbodiimide
(ci-apres denomme')CC") en refroidissant par un melange refrigerant On
maintient le melange de reaction pendant 24 h dans les conditions
ci-dessus pour provoquer la reaction Apres avoir separe par filtration
la dicyclohexylurea precipitee, on lave le filtrat par l'citric acid a
5 percent, par Na 2 CO 3 A 5 7 et par Na Cl aqueux et ensuite on seche
sur Na 2 SO 4 Apres avoir chasse 2 4 Ac O Et par distillation, on
ajoute au residu du n-hexane pour le faire cristalliser La
recristallisation dans le melange Ac O Et-ether de petrolEt donne 7,80
g (73 percent de la quantite theorique) du compose recherche. Rf 1 =
0,80 (B-ii) Synthese de Boc-Val-Tyr-O Et (position 10-11), PM:
408,482) Dans 200 ml de Ac O Et, on dissout 10,86 g de Boc-Val-OH et
11-Tyr-O Et prepare a partir de 12,29 g du H-Tyr-hydrochloride t et 7
ml de Et 3 N, et on ajoute ensuite 11,35 g de DCC en refroidissant
avec un melange refrigerant On maintient le melange de reaction
pendant 24 h dans les conditions ci-dessus pour provoquer la reaction
Apres avoir separe par filtration la dicyclohexylurea, on lave le
filtrat par Na 2 CO 3 A 5 percent, par l'citric acid a 5 percent et
par Na Cl aqueux et on seche sur Na 2 SO 4 Apres avoir distille Ac O
Et, on ajoute du n-hexane au residu pour la cris- tallisation.
Rendement: 20,05 g (99 X de la quantite theorique).
Rf 1 = 0,68 Analyse elementaire pour CG 19 H 28 N 205 Calcule 7
percent: C 62, 62 H 7,74 N 7,69 Trouve o: C 62,80 H 8,02 N 7,65
(B-iii) Synthese de Z(O Me)-Arg(Mts)-Val-Tyr-O Et (positions 9-11)
PM: 810,944
A 6,13 g de Boc-Val-Tyr-O Et, on ajoute 8,1 ml d'anisoleOn traite le
melange de reaction par 32, ml de TFA pendant 60 min en refroidissant
par la glace Apres avoir distille le TFA a la temperature ambiante, on
lave le residu par le n-hexane par decantation et on seche sur KOR
Apres avoir dissous le residu huileux obtenu dans 30 ml de DMP, on
ajoute 2,1 mi de Et 3 N a la solution en refroidissant par la glace On
ajoute au melange de reaction obtenu dans 35 ml de tetrahydrofuran le
Z(O Me)-Arg(Mts)-OH prepare a partir de 10,23 g du cyclohexylamine et
17 ml d'hydrochloric acid 1 N et de l'anhydridemixte prepare a partir
de 2,31 ml de Et 3 N et 2,36 ml de chloroformiate d'isobutyle en
conditions anhydres On maintient le melange de reaction a -15 C
pendant 2 h et ensuite a O C pendant 4 h Apres avoir
distillechloroformate' le solvant, on dissout le residu dans Ac O Et,
on lave par l'citric acid a 5 percent, par Na 2 CO 3 A 5 percent O et
par Na Cl aqueux et on seche sur
Na 2804 Apres avoir distille Ac O Et, on ajoute de l'etherisopropy-
lic au residu pour le faire cristalliser Ensuite, on dissout le
produit cristallin obtenu dans une faible chloroform et on
chromatographie sur une colonne X x 5 cm) de gel de silice en eluant
par le melange chloroform-methanol 100:1 pour obtenir le compose brut
ayant un Rf 2 de 0,74 Apres distillation du solvant, on lave le
compose par l'ether de petrolether pour obtenir 9,80 g
(81 percent de la quantite theorique) du compose recherche.
Rf 1 = 0,90, Rf 0,74 Rf 3 = 0,47
2 ' > 3
(B-iv) Synthese de Z(O Me)-Arg(Mts)-Val-Tyr-N 2 _ 3 (positions 9-11).
PM: 796 924
On dissout 5,0 g de Z(O Me)-Arg(Mts)-Val-Tyr-O-Et dans 100 ml de
methanol et on ajoute 3,6 ml d'hydrazine aqueuse and 80 percent On
laisse reposer le melange de reaction a la temperature ambiante
pendant une nuit On triture dans l'ethyl ether le produit gelatineux
precipite Apres filtration, recristallisation dans le melange chaud
methanol-ether ethylique et dans l'ethanol, on obtient 4,1 g (83
percent de la quantite theorique) du compose recherche.
Rf 1 = 0,58
(B-v) Synthese de Z(Ole)-Arg(Mts)-Val-Tyr-Arg(Mts)-Pro-OH (posi- tions
9-13) On dissout 4,7 g de Z(O Me)-Arg(Mlts)-Pro-O Bzl dans 80 ml de
methanol et on ajoute quelques gouttes d'acetic acid.
* On reduit catalytiquement le melange de reaction par une quantite
efficace de charbon palladie a 10 percent On distille le solvant apres
filtration Si l'elimination de Z(O Me) n'est pas terminee, on ajoute
au residu 2,9 ml d'anisole et on traite le melange de reaction par 12
ml de TFA pendant 30 min en refroidissant par la glace Apres avoir
distille le TPA a la temperature ambiante, on lave le residu par le
n-hexane par decantation et on seche sur KOH On dissout le residu dans
20 ml de DMF et on ajoute 0,93 ml de Et 3 N en refroidissant parla
glace On melange le melange resultant a -10 C avec une solution de Z(O
Me)-Arg(Mts)-Val-Tyr- N 3 dans le DMF, preparee a partir de 5,26 g de
son hydrazide, 0,87 ml de isoamyl nitrite et 0,92 ml de Et 3 N et on
ajoute 0,93 ml de Et 3 N On maintient le melange de reaction obtenu a
-10 C pendant 24 h pour provoquer la reaction et on neutralise par
deux ou trois gouttes d'acetic acid Apres avoir distille le solvant,
on dissout le residu dans Na HCO 3 A 5 percent, on lave a l'ethyl
ether, on transforme en acidpar l'citric acid et on extrait par Ac O
Et La phase Ac O Et resultante est lavee par l'citric acid a 5
percent, par Na HCO 3 A 5 7 percent et par Na Cl aqueux et ensuite
sechee sur Na 2 SO 4 Apres distillation de Ac O Et, on ajoute de
l'ether de petrolether au residu pour le faire cristalliser.
La recristallisation dans le melange methanol- etherdonne 5,40 g (67
percent de la quantite theorique) du compose recherche, Rf 1 = 0,75
Composition en aminoacides
___ _________________- __ ___
Aminoacide Trouve (moles) Calcule (moles) Pro 0,96 1 Val 1,10 1 Tyr
1,00 1 Arg 2,12 2 rendement moyen: 87 percent (C) Synthese de
Boc-Asp(O Bzl)-Thr-MetArg(Mts)-Cys(M Bzl)-}et-Val Gly-OH (positions
1-8), PM: 1404,718 (C-i) Synthese de Boc-Val-Gly-O Bzl (positions
7-8), PM: 364,43 A une solution dans Ac O Et contenant 6,55 g de
Boc-Val-OH et H-Val-O Bzl prepare a partir de 10,12 g de son
p-toluene-sulfonate et 4,2 ml de Et 3 N, on ajoute 7,42 g de DCC en
refroidissant par un melange refrigerant On maintient le melange
resultant a la temperature ambiante pendant 24 h pour provoquer la
reaction Apres filtration de la dicyclohexylurea, on lave le filtrat
par l'citric acid a 5 percent par Na 2 CO 3 percent and 5 percent et
par Na Cl aqueux et ensuite on seche sur Na 2 SO 4 Apres avoir
distille Ac O Et, on ajoute du n-hexane au residu pour la
cristallisation La recristallisatiun dans le melange methanol-ether de
petrolmethanol donne 9,0 g (82 percent de la quantite theorique) du
compose recherche.
Rf 1 = 0,90, Rf 4 = 0,38 Analyse elementaire pour C 19 H 28 N 205
Calcule percent: C 62,62 H 7,74 N 7,69 Trouve 7: C 62,80 H 8,02 N 7,65
(C-ii) Synthese de Z(O Me)-Cys(M Bzl)-Met-O Me (positions 5-6)
PM: 486,636
A 250 ml de solution dans Ac O Et contenant 17,07 g de Boc-Cys(M
Bzl)-OH et H-Met-O Me prepare a partir de 9,99 g de son hydrochloride
et 7 ml de Et 3 N, on ajoute 11,35 g de DCC en refroidissant au moyen
d'un melange refrigerant On maintient le melange resultant a la
temperature ambiante pendant 24 h pour pro- voquer la reaction Apres
filtration de la dicyclohexylurea, on lave le filtrat par l'citric
acid a 5 percent, par Na 2 CO 3 A 5 percent et par Na Cl aqueux et
ensuite on seche sur Na 2 SO 4 Apres distillation de Ac O Et, on
ajoute du n-hexane au residu pour la cristallisation.
La recristallisation dans Ac O Et-ether donne
,7 g (65 percent de la quantite theorique) du compose desire.
Rf = O 233 Rf 0,89.
Analyse elementaire pour C 22 H 34 N 20652 Calcule percent: C 54,30 H
7,04 N 5, 76 Trouve percent: C 541,29 H 7,09 N 5,76 (C-iii) Synthese
de Z(O Me)-Thr-Met-O Me (positions 2-3) PM 428,494 Dans 200 ml de
dioxan, on dissout 10,0 g de
Z(O Me)-Thr-OH;DCHA (sel de dicyclohexylamine) et 4,29 g de H Cl,H-
Met-O Me et on ajoute 4,89 g de DCC en refroidissant avec un melange
refrigerant On maintient le melange resultant a temperature ambiante
pendant 18 h pour provoquer la reaction Apres avoir separe la
dicyclohexylurea par filtration et distille le solvant, on dissout le
residu dans Ac O Et, on lave par l'citric acid a 5 percent, par Na 2
CO 3 A 5 percent et par Na Cl aqueux et ensuite on seche sur Na 2504
Apres avoir distille Ac O Et, on ajoute de l'etherau residu pour la
cristallisation pour donner 8,50 g (92 percent de la quantite
theorique) du compose recherche.
Rf 1 = 0,60 Analyse elementaire pour C 19 128 N 2075 Calcule percent:
C 53,25 H 6,59 N 6,54 Trouve percent: C 53,23 H 6,85 N 6,68 (C-iv)
Synthese de Z(O Me)Thr-Met-N H 3 (positions 2-3), PM: 428,50 ' Dans
100 ml de methanol, on dissout 4,3 g de
Z(O Me)-Thr-Met-O Me et on ajoute 5,7 ml d'hydrazine aqueuse a 80
percent.
On laisse reposer le melange resultant a la temperature ambiante
pendant une nuit Apres avoir distille le solvant, on ajoute de
l'ethanol au residu pour la cristallisation pour donner 4,10 g
(96 percent de la quantite theorique) du compose recherche.
Rf 1 = 0,56 Analyse elementaire pour C 18 H 28 N 406 Calcule: C 50,45
H 6, 59 N 13,08 Trouve percent: C 50,49 H 6,67 N 13,02 Conp 2 osition
en aminoacides Aminoacide Trouve (moles) Calcule (moles) Thr 1,06 1
Met 1,00 1 rendement moyen: 87 7.
(C-v) Synthese de Z(O Me)-Arg(Mts)-Cys(Olzl)-'Iet-O O Me (positions
4-6).
PM: 889,098
A 4,84 g de Boc-Cys-(M Bzl)-Met-O Me, on ajoute,4 ml d'anisoleOn
traite le melange resultant par 20 ml de TFA pendant 60 min en
refroidissant par la glace On ajoute la solution obtenue a du n-hexane
et on lave par decantation On seche le produit huileux resultant sur
KOH et on le dissout dans 30 ml de DEF.
On ajoute a la solution resultante 1,4 ml de Et 3 N en refroidissant
par la glace et ensuite l'anhydridemixte prepare a partir de Z(O Me)-
Arg(Mts)-OH, prepare a partir de 6,20 g de son cyclohexyl- amine et 10
ml de HC 1 1 N, 1,54 ml de Et 3 N et 1,58 ml de isobutyl chloroformate
dans 50 ml de THF en conditions anhydres On maintient le melange de
reaction obtenu a -10 C pendant 3 h pour provoquer la reaction Apres
avoir distille le solvant, on dissout le residu dans Ac O Et, on lave
par l'citric acid a 5 percent par Na HICO 3 A 5 percent et par Na Cl
aqueux et ensuite on seche sur Na 2 SO 4 La cristallisation dans
l'ether, apres distillation de Ac O Et et reprecipitation dans le
melange methanol-ether repetee deux fois, donne 6, 2 g (70 percent de
la quantite theorique) du compose recherche.
Rf 1 = 0,61 (C-vi) Synthese de Z (O Mle)-Arg(Mts)-Cys(M Bzl)-Met-N 2,'
(positions 4-6)
PM: 889,104
Dans 50 ml de methanol, on dissout 4,4 g de Z(O Me)-Arg(Mts)-Cys(M
Bzl)Met-O Me et on ajoute 3 ml d'hydrazine aqueuse a 80 percent On
laisse reposer le melange resultant a la tempe- rature ambiante
pendant une nuit pour donner un produit gelatineux.
On triture le produit resultant dans l'etheron filtre La repre-
cipitation dans le melange DIF-ethanol donne 3,0 g (68 percent de la
quantite theorique) du compose recherche.
Rf 1 = 0,46 Analyse elementaire pour C 4 I 56 N 8 053,,05 H 20 Calcule
percent: C 53,49 H 6,40 N 12,48 Trouve 7 percent: C 53,47 H 6,34 N
12,55 (C-vii) Synthese de Z(O Me)-Arg(Mts)-Cys(}Bzl)-Nlet-Val-Gly-OH
(positions 4-8), PM: 1031,254 Dans 50 ml de methanol, on dissout 1,3 g
de
Boc-Val-Gly-O Bzl et on ajoute quelques gouttes d'acetic acid.
On reduit catalytiquement le melange resultant avec une quantite
efficace de charbon palladie a 10 percent pendant 3 h Apres
filtration, on distille le solvant On triture le residu avec du
n-hexaneOn obtient environ 1,06 g de poudre blanche a laquelle on
ajoute 2,09 iml d'anisole et on traite par 10 ml de TFA pendant 45 min
en refroidis- sant par la glace Apres distillation du TFA a la
temperature ambiante, on seche le residu sur KOH, on le dissout dans 2
ml de dimethylsulfoxide (ciapres denomme "DMSO")-10 ml de DMF et on
ajoute 1,1 ml de Et 3 N en refroidissant par la glace On ajoute au
melange resultant une solution dans le DMF de Z(O Me)-Arg(Mts)-Val-
Tyr-N 3 prepare a partir de 3,8 g de Z(O Me)-Arg(Mts)-Val-Tyr-N 2 H 3,
0, 62 ml de isoamyl nitrite et 1,32 ml de Et 3 N et on ajoute 0,6 ml
de Et 3 N pour provoquer la reaction a -10 C pendant 36 h Apres neu-
tralisation du melange obtenu avec quelques gouttes d'acetic acid et
distillation du solvant, on ajoute de l'citric acid au residu et on
laisse reposer pendant quelque temps On triture le precipite resultant
par l'citric acid a 5 percent et par l'water et ensuite on seche On
repete deux fois la precipitation dao DKF-Ac O Et pour obtenir 2,8 g
(69 7 de la quantite theorique) du compose recherche.
Analyse elementaire pour C 47 H 66 N 80 253,H 20 47 66 8 1283 l 20
Calcule percent: C 53,80 H 6,53 N 10,68 Trouve percent: C 53,74 H 6,52
N 10,54 Comnossition en aminoacides Aminoacide Trouve (moles) Calcule
(moles) Gly 1,00 1 Cys 0,79 1 Val 1,00 1 Met 0,90 1 Arg 0,98 1
rendement moyen: 87 percent (C-viii) Synthese de Z(O
Me)-Thr-Met-Arg(Mts)-Cys(M Bzl)-Met-Val-Gly-OH 1 S (positions 2-8),
PM: 1263:552
A 480 mg de Z(O Me)-Arg(Mts)-Cys(M Bzl)-Met-
Val-Gly-OH,on ajoute 0,6 ml d'anisoleOn traite le melange resu I- tant
par 3 ml de TFA pendant 45 min en refroidissant par la glace, on
ajoute du n-hexane, on lave par decantation et on ajoute ensuite O 20
de l'etherpour obtenir une poudre blanche On seche la poudre obtenue
sur KOH, on la dissout dans 5 ml de TMF et ensuite on ajoute 0,055 ml
de Et 3 N en refroidissant par la glace, On melange le melange obtenu
avec 15 ml de solution dans le DMIF contenant le Z(O Me)-Thr-
Met-N 3 prepare a partir de 254 mg de 2 (O Me)-Thr-Met-N 2 H 3, 0,094
ml de isoamyl nitrite et 0,18 ml de Et 3 N et on ajoute 0,055 ml de
Et 3 N pour provoquer la reaction a -100 C pendant 24 h Apres neutra-
lisation par quelques gouttes d'acetic acid et distillation du
solvant, on ajoute au residu de l'citric acid a 5 percent On triture
le precipite obtenu et on le lave par l'citric acid and 5 percent et
par l'water et ensuite on seche La precipitation dans DIF-Ac OET; puis
dans DMF-methanol, donne 430 mg (90 percent de la quantite theorique)
du compose recherche.
Rf 1 = 0,41 Analyse elementaire pour C 56 H 82 N 1001554 Calcule
percent: C 53, 23 H 6,54 N 11,O 9 Trouve percent: C 53,34 H 6,64 N
10,79
(C-ix) Synthese de Boc-Asp(C Bzl)-Thr-Met-Arg(Mts)-Cys(M Bzl)-Met-Val-
Gly-OH (positions 1-8) PM: 1404,718
A 348 mg de Z(O Me)-Thr-Met-Arg(Mts)-Cys(M Bzl)-
Met-Val-Gly-OH, on ajoute 0,3 ml d'anisole et on traite par 1,5 ml de
TFA pendant 45 min en refroidissant par la glace On ajoute du n-hexane
au melange de reaction, on lave par decantation et ensuite on traite
par l'etherpour obtenir une poudre blanche On seche la poudre obtenue
sur KOHR, on la dissout dans 3 ml de DMSO et 3 ml de DMF et on ajoute
ensuite 0,077 ml de Et 3 N et Boc-Asp(O Bzl) en refroidissant par la
glace On maintient le melange de reaction a la temperature ambiante
pendant 24 h pour provoquer la reaction et on neutralise par quelques
gouttes d'acetic acid Apres distillation du solvant, on ajoute au
residu de l'citric acid and 5 percent pour provoquer la precipitation,
on triture et on lave par l'acide citfiquacid and 5 percent et par H
20 et ensuite on seche On ajoute de l'ethanol au produit resultant et
on agite pendant 24 h tandis que la majeure partie du derive de
succinimide passe dans l'ethanol, pour donner 300 mg' (78 percent de
la quantite theorique) du compose desire.
Analyse elementaire pour C 63 H 93 N 101754 Calcule percent: C 53,86 H
6,67 N 10,97 Trouve percent: C 53,46 H 6,67 N 10,78 (D) Condensation
des fragments
(D-i) Synthese de Z(O Me)-Arg(Mts)-Val-Tyr-Arg(Mts)-Pro-Cys(}Bzl)-
Trp-Gln-Val-O Bzl((positions 9-17), PM:1945,298 A 0,85 g de Boc-Cys(M
Bzl) -Trp-Gln-Val-O Bzl, on ajoute 1,08 ml d'ethanedithiol-anisole a 2
percent et on traite par,00 ml de TFA a -50 C pendant 60 min dans un
courant d'nitrogen On ajoute du n-hexane an melange de reaction et on
lave par decantation.
On ajoute de l'etherau residu resultant pour obtenir une poudre
blanche que l'on triture par Na HCO 3 percent and 5 percent pour
donner la composition d'amine libre et ensuite on lave par l'water et
par l'etherOn seche le produit resultant sur KOH et on dissout dans 10
ml de DMF On ajoute a la solution obtenue 1,22 g de Z(O
Me)-Arg(Mts)-Val-Tyr-Arg(Mts)-
Pro-OH et O,153 g de N-hydroxybenzotriazole (ci-apres denomme "HO Bt")
et ensuite on ajoute 0,25 g de DCC en refroidissant a un melange
refrigerant pourprovoquer la reaction a la temperature ambiante
pendant 24 h Apres avoir elimine la dicyclohexylurea par filtration,
on distille le solvant en maintenant la temperature au-dessous de C
Apres addition de Ac O Et et de Na HCO 3 A 5 percent au residu, on
separe le precipite resultant par filtration, on le lave en agi- tant
dans l'citric acid a 5 percent et l'water et on seche La repreci-
pitation dans DMF-Ac O Et et dans DMF-Ac O Et + ethanol donne 1,1 g
(56 percent de la quantite theorique) du compose desire.
Rf 1 0,52, Rf 2 = 0,42 Analyse elementaire pour C 97 H 125 N 1702053
Calcule percent: C 59,89 H 6,48 N 12,24 Trouve 7: C 60,10 H 6,72 N
11,96 Compaositions en aminoacides Aminoacide Trouve (moles) Calcule
(moles) Glx 1,00 1 Pro 0,82 1 Cys i Val 2,17 2 Tyr 1,01 1 Arg 2,00 2
Val-Tyr-Arg-Pro-Cys- 1 rendement moyen: 80 percent On analyse le
Val-Tyr-Arg-Pro-Cys- avec le methanesulfonate 4 M.
On analyse Cysapres oxydation par l'performic acid.
(D-ii) Synthese de Boc-Asp(O Bzl)-Thr-Met-Arg(Nlts)-Cys(M Bzl)-Met-
Val-Gly-Arg(Mts)-Val-Tyr-Arg(Mts)-Pro-Cys(N Bzl)-Trp-Gln-Val-o Bzl
((Gln 16 l-GH-RH protegee en positions 1-17), PM:-3167,846.
A 230 mg du compose obtenu en (D-i), on ajoute 0,254 ml
d'ethanedithioanisole a 2 percent et on traite par 1,00 m de TFA a -50
C dans un courant d'nitrogen On ajoute du n-hexane au residu
resultant, on lave par decantation et on traite par l'etherpour
obtenir une poudre blanche.
On lave encore la poudre obtenue par Na HCO 3 a percent, l'water et
l'ether, on seche sur KOH et on dissout ensuite dans ml de DMF On
ajoute a la solution resultante 166 mg de Boc-Asp(O Bzl)-
Thr-Met-Arg(Myts)-Cys(M Bzl) -Met-Val-Gly-OH et 21,7 mg de HO Bt Apres
agitation, on ajoute au melange de reaction 26,8 mg de DCC en re-
froidissant par un melange refrigerant pour provoquer la reaction
pendant 48 h En outre, on ajoute au melange de reaction 11 mg de HO Bt
et 14 mg de DCC pour provoquer la reaction pendant 48 h. Apres
elimination de la dicyclohexylurea par filtration, on distille le
solvant en maintenant la temperature en dessous de 30 C On ajoute de
l'water au residu pour la precipitation, on triture et on lave a
racide citrique a 5 percent et a l'water et ensuite on seche Apres
avoir repete deux fois la precipitation dans le melange DMF-methanol,
on dissout les 275 mg de produit brut obtenu dans une faible quan-
tite de DM 14 F et on chromatographie ensuite sur une colonne (3 x 75
cm volume: 530 ml) de "Sephadex LHI-20 " On effectue l'elution par le
DMF et on recueille la fraction principale Apres distillation du DM 1
en maintenant la temperature au-dessous de 30 C, on traite le residu
par l'water pour obtenir 220 mg (59 percent 7 de la quantite
theorique) du compose recherche sous forme d'une poudre blanche.
Rf 1 0,60, Rf 2 = 0,55 co 22 osition en aminoacides Aminoacide Trouve
(moles) Calcule (moles) Asp 1,16 1 Thr 1,12 1 Glx 0,90 1 Pro 0, 78 1
Gly 1,28 1 Cys 2 Val 3,01 3 Met 1,66 2 Tyr 0,88 1 Arg 3,00 3
Val-Tyr-Arg-Pro-Cys- 1 rendement moyen: 78 percent (E) Elimination des
groupements protecteurs ("deprotection") et purification A 120 mg de
Boc-(positions 1-17)-O Bzl, on ajoute 0,33 ml de m-cresol et 0,11 ml
d'ethanediol et on ajoute 3,02 ml de solution de
trifluoromethanesulfonate-thioanisole 1 M dans TFA en refroidissant
par la glace On traite le melange de reaction a O C pendant 3 h pour
eliminer tous les groupements pro- tecteurs Apres avoir distille le
solvant avec une pompe a vide, on ajoute de l'etherau residu pour
obtenir une poudre blanche On separe la poudre par filtration et on
dissout immediatement le residu dans une faible water qui a ete
degazee par l'nitrogen et on separe le produit insoluble par
filtration On dilue le filtrat obtenu par 400 ml d'ammonium acetate
0,01 A, p Hl 7,0, pour obtenir une concentration de 0,1) mol/l et on
maintient a la temperature ambiante pendant 3 jours dans une piece
sombre pour l'oxydation par l'air Lorsque le test "Erumane" confirme
que l'absorption a 412 nm a eete reduite de 0,27 a 0,12 et maintenue
constante, on ajuste le filtrat dilue a p H 5,0 par l'acetic acid a 5
percent et on lyophilise pour obtenir environ 40 mg de la lGln 16
l-GH-RP brute.
16 ' On met en suspension la lGln 6 l-GH-RH dans une faible acetic
acid 1 N et on centrifuge On chromato- graphie le liquide surnageant
obtenu sur une colonne (3 x 95 cm, volume: 672 ml) de "Sephadex G-25 "
en eluant par l'acetic acid 1 N et on recueille l'effluent de la
colonne (eluat) par fractions de 4 ml pour la purification Le compose
filtre sur gel obtenu est lyophilise, dissous dans l'acetic acid O,LN
et ensuite centri- fuge pour separer les matieres insolubles Le
liquide surnageant resultant est chromatographie sur une colonne HPLC
("p Bondapak TM/C 18 ") On effectue l'elution au moyen d'un gradient
lineaire obtenu par l'acetonitrile a 10 percent et 50 percent dans TFA
a 0,1 percent dans un dispositif a niveau constant a un debit de 2
ml/min (4 ml/min pour le fractionnement).
La courbed'elution resultante est representee a la figure 7.
D'apres la figure 7, le peptide purifie presente un pic unique en HPLC
et son temps de retention est sensiblement en accord avec celui de la
GH-RH obtenue a partir du saumon.
Les proprietes physiques du peptide sont les suivantes: Rf = 0,44
(support: "Kiesel gel 60 F 2544 " fabrique par la societe E Merck G A,
solvant de develop- pement: n-butanol-Ac O Et-acide acetique-eau
1:1:1:1) l"lD 14,4 (O O 1, e 20) Co 2 mposition en aminoacides mm m m
mmmmmmmm Aminoacide Trouve (moles) Calcule (moles) Asp 1,08 1 Thr 1,00
1 Gix 1,00 1 Gly 1,14 1 Cys 2 Val 3,03 3 Met 1,93 2 Tyr 1,00 1 Arg
3,00 3 Val-Tyr-Arg-Pro-Cys- -* 1 Pro 1,01 Cys et Pro ne peuventlas
etre deceles dans le cas de l'hydrolyse dans H Cl 6 N.
EXEMPLE ANALYTIQUE 9
(Digestion par la carboxypeptidase P) Dans l'analyse des aminoacides
effectuee apres l'hydrolyse dans HC 1 6 N, on ne peut pas determiner
si on decele Glu ou Gin Pour cette raison, on effectue l'analyse de
l'aminoacide
C-terminal par la carboxypeptidase.
Dans 150 /ul de pyridine-acetate 0,1 N, a pli 5,5, on dissout-environ
4,4 pg (environ 2 nmol) de lGln 16 l-GH-RH obtenue a l'exemple 2 ou de
la GHRH{ de saumon obtenue a l'exemple 1 et on ajoute environ 2 /u 11
de solution de carboxypeptidase P (societe Protein Research
Foundation) a 1 mg/ml d'water On fait incuber le melange a 37 C
pendant 3 h. Apres elimination du solvant, on dissout le residu dans
300 1 ul de HC 1 0,02 N et on analyse sur un autoanalyseur d'amino
acids"Hitachi 835-50 " de la societe Hitachi Ltd Les resultats obtenus
sont indiques dans le tableau I ci-apres La carboxypeptidase P est une
exopeptidase qui attaque la liaison du peptide C-terminal pour liberer
des aminoacides simples.
Il apparait d'apres le tableau I que Gln est en seconde position a
partir du C-terminal dans la lGln 16-GH-RH tandis
Z 2521133 que Glu est dam la meme position que ci-dessus dans la GH-RH
obtenue a partir du saumon.
On obtient les memes resultats dans le cas o on utilise la
carboxypeptidase A (societe Sigma Chemical Company) quilibere
facilement Gln,mais libere peu Glu La reaction est effectuee dans les
memes conditions qu'avec la carboxypeptidase P, sauf qu'on utilise un
tampon pyridine-acetate, p H 7,8,au lieu de pyridine-acetate, p H 5,5
Les resultats obtenus sont indiques dans le tableau II ci-apres.
D'apres le tableau II, Gin est decelee avec Val dans la lGln 16
l-GH-R, tandis que Glu est relativement peu decelee par rapport a Val
dans la GHRH obtenue a partir du saumon Il va sans dire que Gln n'est
pas decelee dans la GH-RH obtenue a-partir du saumon.
Pour la raison ci-dessus, il est prouve que la position 16 de la GH-RH
synthetisee est Gln.
EXEMPLE 3
(Synthese de la lGlu 6 l-GH-RH) On repete le mode operatoire de
l'exemple 2 sauf que l'on utilise Glu comme produit de depart au lieu
de Gln.
LalGlu 16 l-GH-RH a sensiblement les memes proprietes physiques et la
meme activite pharmacologique que la GH-RH obtenue a partir du saumon
et la lGln 16-GH-RH.
EXEMPLE DE FORMULE
(Solution injectable) Dans 5 ml d'water distillee et sterilisee, on
dissout 0,1 mg du peptide de l'invention et 50 mg de glycine et on
divise ensuite la solution obtenue en 10 fioles et on lyophilise pour
le stockage On ajoute au melange lyophilise la quantite appropriee de
serum physiologique sterile pour preparer une solution injectable au
moment de l'emploi.
EXEMPLE D'ESSAI PHARMACOLOGIQUE 1
On place de petits morceaux d'hypophyses anterieures prelevees sur des
rats Wistar males-au sommet d'une colonne, qui est un cylindre a
injection ayant un diametre de 1 m garnie avec 0,3 a 0,5 ml de
"Sephadex G 25 " equilibree avec une solution tampon de
Xrebs-Ringer contenant 0,1 percent de serum de veau a un debit de 0,5
ml/min.
On chromatographie sur la colonne 1 ml d'une solution temoin (solution
tampon de Krebs-Ringer), 1 ml de solution de TRH a 2 pg/ml et 1 ml de
solution a 2 -pg/ml de la GH-RH obtenue a l'exemple l,dans cet ordre
On recueille i'effluent de la colonne en fractions de 1 ml et on
analyse chaque fraction par un dosage radio-immunologique avec un
anticorps antiGH de rat (etalon NIH) pour determiner la quantite de GR
de rat liberee dans le dosage Les resultats obtenus sont indiques dans
le tableau III ci-apres.
Comme on le voit dans le tableau III, lorsqu'on utilise le peptide
selon l'invention, la quantite de GH liberee est environ 5 fois celle
observee dans le temoin et la meme qu'avec la
TRH ayant un effet non specifique de GH-RH.
Le mode de liberation, cependant, est specifique, c'est-i-dire que le
mode de liberation de l'invention est pointu, tandis que celui de la
TRH est large (allure du pic).
EXEMPLE D'ESSAI PHARMACOLOGIQUE 2
(Activite de liberation de GH in vivo de la GR-RH) On utilise des rats
Wistar miles tages de semaines Les rats sont anesthesies au
pentobarbital administre par voie intraperitoneale (i p) a une dose de
50 mg/kg et attaches.
On place du c te du coeur de la veine jugulaire droite du rat une
canule de 3,5 cm en tube "Silastic" (diametre interieur 0,020,
diametre exterieur 0,037, societe Dow Corning) Chez le rat avec la
canule de 'veine placee en permanence, onreprend l'autre extremite de
la canule de 3 cm de l'arriere du cou et on la fixe sur la couche
exterieure de la peau.
On injecte par la canule 0,5 ml d'heparin a unites/ml et ensuite on
bouche la canule avec un bouchon en fil d'acier inoxydable On injecte
la GH-RH au rat et on recueille le sang du rat anesthesie le jour
suivant On administre du chlor- Chlorpromazine par voie i p 4 h avant
l'injection a une dose de 2 mg/kg Quatre rats recoivent par la canule
une injection de 440 p g/kg de GH-RH de saumon obtenue a l'exemple 1
D'autre part, trois rats temoins recoivent du serum physiologique.
Pour chaque rat, on recueille 0,5 ml de sang min avant l'injection et
15, 30, 60, 120 et 180 min apres l'injec tion. Le sang recueilli est
centrifuge a 2000 g pendant min Pour mesurer l'activite de liberation
de GR, on dose le liquide surnageant (plasma) par un dosage
radio-immunologique (ci-apres denomme
"RIA") selon une methode du double anticorps (voir C A Birge et col.
Endocrinology 81, page 195 (1967)) On effectue le RIA de la GR de rat
en utilisant un necessaire NIR Les resultats obtenus sont indiques
dans le tableau IV et la figure 8 o les symboles A a G du tableau IV
ci-apres correspondent a ceux decrits a la figure 8.
D'apres la figure 8, une augmentation evidente de la concentration en
GR dans le plasma est observee 60 min apres l'injection chez le groupe
recevant la GB-RH, par rapport a celle observee dans le groupe temoin,
bien que l'on observe une diffe- rence individuelle entre les rats.
En comparaison avec l'activite de liberation de CH du facteur de
liberation de GH isole sur le cancer du pancreas humain (ci-apres
denomme "hp GRP"), le hp GRF presente une augmentation de GB 5 min
apres l'injection (voir R Guillemin et col, Science, 21, page 585
(1982) tandis que la GB-RH obtenue chez le saumon presente une
augmentation de GH 1 h apres l'injection Les resultats ci-dessus
confirment que l'effet de liberation de GB de la GH-RH obtenue a
partir du saumon n'a pas d'effet directement sur l'hypophyse mais
d'une maniere differente.
EXEMPLE D 'ESSAI PHARMACOLOGIQUE 3
(Activite de liberation de GH in vivo de la lGln 6 l-GB-RH) On repete
le mode operatoire de l'exemple d'essai pharmacologique 2 sauf que
l'on utilise six rats dans le groupe recevant la lGln l-GH-RH et dans
le groupe recevant le serum physiologique, respectivement,et on
recueille le sang 15 min avant l'injection et 15, 30, 60, 120, 180,
240 et 300 min apres l'injection.
Les resultats obtenus sont indiques dans le tableau V ci-apres et la
figure 9 o les symboles G a L decrits dans le tableau V correspondent
a ceux decrits a la figure 9 Dans la figure 9, les donnees du groupe
temoin sont decrites seulement par la valeur moyenne.
D'apres la figure 9, une augmentation evidente de la concentration en
GR dans le plasma est observee entre 30 et 60 min apres l'injection
chez le groupe recevant la lGln lGH-RH, en compa- raison avec celle
observee dans le groupe temoin, bien que l'on observe des differences
individuelles entre les rats Bien que l'effet de liberation de GH de
lalGln 6 l-GR-RH tendea apparaitre plus t Ot que celui de la GR-RH
obtenue a partir du saumon, il est clair que la Gln 16 -GH-RH a un
effet de liberation de GR.
A partir des resultats ci-dessus obtenus dans les exemples d'essai
pharmacologiques 1 a 3, il est clair que les peptides selon
l'invention ont un effet de liberation de GR sur les especes animales
etrangeres.
Il est entendu que l'invention n'est pas limitee aux modes de
realisation preferes decrits ci-dessus a titre d'illus- tration et que
l'homme de l'art peut y apporter diverses modifica- tions et divers
changements sans toutefois s'ecarter du cadre et de l'esprit de
l'invention.
TA B LEAU I lGin 1-GII-RH Aminoacide Temps de retention Fraction
molaire Fraction molaire (min) Gin 19,98 0,84 Glu 23,42 * Val 41,88
1,02 GH-RH de saumon Aminoacide Aminoacide Temps de retention (min)
Fraction molaire Gln 19,98 Glu 23,92 0,73 Val 41,88 0,89 non decele t
t r 1 j ui ruj -a TAB LEAU Il lGln 16 l -M-RH Aminoacide Temps de
retention Fraction molaire (min) Gin 19,88 0,45
Glu 23,40 -
Val 41,88 0,79 GR-RH de saumon Aminoacide Temps de retention (Fraction
molaire (min) Gin 19,88 Glu 23,40 0, 08 Val 41,88 0,67 ti ru r, w OU
UTO Mj 00 ic mu osu uo Tque Aull uoles aplidea (lin/su) apiqqil lui op
Ho op qjjuvn Z) UOIIII Uvqoa M v- r- cm Ln Cu w m M a y Zia VI 9 CO 9
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8 si LWO 801,8
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91 FI oz 6 60 L el 01 quimu) si z 8 t, i: 85 I 1 o I (:ului) uolloacu
Tl vuuaxox (l M/'ulin/) Ho ua Uo T Ualua DUOD 9)xda a; >,xn(j
(Tm/ain/) Hg ue uoiquaqueauoo zs 1, OT 69 4 LI 081 ses E o Ip T 08 e 6
81 t 9 z ozi 061 8 066 ' L-1 LS'8 L 6 Sc zs csi os u?-Z 48 ozoloz u 19
IL ZO L 9 z,uu oc O 59 8 U 96 ' l is 6 8 li's ZPCLZ si ILU 9 0891 vi
49 6 4 e le LL 9 U 9 8 U 19 O COP-L D (Ulm) auucdo K cm/ai r() ulome:l
np Ho ue uorqua:lueoua D u OTIOB ui,l eqade aeana ulom?:i np ilo ue uo
T:zvx:lueouco pn M q- CM Ln cm percent O ci Ai il y a 1 il y 1
TABLEAU V
Concentration en GH du temoin Duree apres l'in Concentration en GH du
temoin (p IU/ml) (/u IU/ml)Moyenne + jection (min) A B C D E F 14120 +
298 -1 S (avant 1660 24,43 1310 9775 723 Il injection)
21,22 + 3,40 15 33,60 25; 98 13,23 17,03 24795 12,55
16,33 + 1,99 30 24 > 25 18,25 13,95 16733 15,63 9755
,96 + 2,57 60 8,63 17,08 17,50 20,63
,98 + 1 > 54 120 19,10 17,35 19 > 23 900 15,95 15,25
19,79 + 2,64 180 26740 23760 11,38 24; 95 19,95 12,48
14,57 + 2,00 240 12748 11,13 13153 24,30 14725 11,75
Concentration en GH (p IU/ml) Duree apres Concentration en GH (/u
IU/ml) l'injection (min) Moyenne + Or G H I J K L 8149 + 0,62 -15
(avant 10,52 9, 36 8,56 6,32 7,20 8,96 l'injection)
9,04 + 0,68 15 10,04 9,76 7,20 11,52 7,64 8,08
24,87 + 8,19 30 9,80 7,72 34 84 8,36 30,68 57,80
58,11 + 12,84 60 56,52 47,00 63,40 115,36 21,48 44,88
19,70 + 2,75 120 22 > 48 29,32 23,56 18,08 13,24 11,52
9,71 + 0,34 180 10,08 9,72 10,56 10,24 9,48 8,20
,00 + 5,04 240 25,84 8 '36 30,00 36,48 7,80 11,52
12)52 + 0,92 300 12 36 12,08 10,32 16; 64 12,96 10,76 ta -J- ul r
percent) r' > -A
Claims
_________________________________________________________________
REVENDICATIONS -R E V E N D I C A T I 0 N S 1 Nouvel heptadecapeptide
caracterise en ce qu'il repond and la formule: HAsp-Thr-I
Met-Arg-Cys-}let-Val-Gly-Arg Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Glx-Val-OH (I)
dans laquelle Glx est Glu ou Gin, et ayant les proprietes physiques
suivantes: (
1) Spectre d'absorption UV: max 280 nm; (
2) Reaction de Ehrlich, reaction de Sakaguchi et reaction de Pauly:
positives; (
3) Caractere basique; (
4) Soluble dans l'water, le methanol et l'acetic acid, legerement
soluble dans l'ethyl acetate, l'butyl acetate, l'etherethy- lic,
l'hexane, l'ether de petrolether, le benzene et le chloroform; et (
5) Etat physique: poudre blanche; et ses salts. 2 Peptide selon la
revendication 1, caracterise en ce que Glx est Glu. 3 Peptide selon la
revendication 1, caracterise en ce que Glx est Gln. 4 Nouveau
medicament hormonal utle notamment pour, la liberation de l'hormone de
croissance, caracterise en ce qu'il contient commea ingredient actif
un heptadecapeptide de formule I selon la revendication i ou un de ses
salts. Medicament selon la revendication 4, caracterise en ce que Glx
est Glu. 6 Medicament selon la revendication 4, caracterise en ce que
Glx est Gln.
? ?
Display vertical position markers.<br/><br/>This option will display
the relative positions of currently selected key terms within the full
document length.<br/><br/>You can then click the markers to jump to
general locations within the document, or to specific discoveries if
you know whereabouts in the document they occur. [533][_]
Open a preview window.<br/><br/>This window will provide a preview of
any discovery (or vertical marker) when you mouse over
it.<br/><br/>The preview window is draggable so you may place it
wherever you like on the page. [534][_]
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FR2521133
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sections below.
Simply type what you are looking for, any items that do not match
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within it that fit into these categories.
The specific items found are listed within the category headings.
Click the section header to open that section and view all the
identitfied items in that section.
If you click the checkbox all items in that section will be
highlighted in the publication (to the right).
The best thing to do is to experiment by opening the sections and
selecting and unselecting checkboxes.
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thereof if selected).
11. The Tools section contains tools to help you navigate the
"discovered" (highlighted) items of interest.
The arrows and counter let you move through the highlighted items
in order.
12. Other tools include a "Preview" option [ [preview.png] ] and the
ability to mark the relative locations of highlighted items by
using the "Marker" option [ [marker.png] ].
Try these out to best understand how they work, and to discover if
they are of use to you.
13. Items selected from the menu on the left will be highlighted in
the main publication section (here in the middle of the screen).
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