close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

3951 djaksibaeva g.g. sultumbaeva a.k kultura tkaney i biotehnologiya rasteniy

код для вставкиСкачать
57
Д40
Г. Г. Джаксыбаева, А. К. Султумбаева
КУЛЬТУРА ТКАНЕЙ И
БИОТЕХНОЛОГИЯ
РАСТЕНИЙ
Учебное пособие
Павлодар
Министерство образования и науки Республики Казахстан
Павлодарский государственный университет
им. С. Торайгырова
Г. Г. Джаксыбаева, А. К. Султумбаева
КУЛЬТУРА ТКАНЕЙ И
БИОТЕХНОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ
Учебное пособие
Павлодар
Кереку
fit. от. ? з ; £ н ез. о-/
УДК 631.53.01(075.8)
ББК 41.3я 7з
Д40
Рекомендовано к изданию учебно-методическим советом
Павлодарского государственного университета
им. С. Торайгырова
Рецензенты:
У. X. Альмишев - доктор сельскохозяйственных наук, профессор
Павлодарского Государственного университета им. С. Торайгырова;
Ж. Ж. Боранбаев - зам. начальника Павлодарской областной
территориальной инспекции Министерства сельского хозяйства
Республики Казахстан;
А. Ш. Смайлов - начальник отдела Павлодарской областной
территориальной инспекции министерства сельского хозяйства
Республики Казахстан.
Джаксыбаева Г. Г., Султумбаева А. К.
Д40 Культура тканей и биотехнология растений : учебное пособие /
Г. Г. Джаксыбаева,
А. К. Султумбаева. - Павлодар :
Кереку, 2015. - 99 с.
В учебном пособии кратко изложены основные принципы и
методы культивирования растительных клеток, тканей и органов в
асептических
условиях.
Приведены
методики
проведения
лабораторных работ, связанных с получением, культивированием
каллусных
и
суспензионных
культур,
микроклональным
размножением и оздоровлением посадочного материала, гаплоидной
технологией, эмбриокультурой, выделением протопластов.
Учебное пособие предназначено для студентов, магистрантов,
обучающихся
по
специальностям
биотехнология,
биологид,
агрономия.
УДК 631.53.01(075.8)
\
ББК 4 1 3 ,7 3
© Джаксыбаева Г. Г., Султумбаева А. К., 2015
~ ПГУ им. С. Торайгырова, 2015
За достоверность материалов, грамматические и орфографические ошибки
ответственность несут авторы и составители
Введение
Культивирование изолированных клеток и тканей растений в
условиях in vitro — метод сохранения жизнеспособности и
размножения органов или их частей, участков тканей или отдельных
клеток вне организма растения донора. В асептических условиях
клетки и ткани служат в качестве биологических моделей, на которых
контролируемых условиях, близких во многих случаях к
естественным, представляется возможность изучения механизмов
межклеточных взаимодействий контактов, их регуляторных функций.
Освобождение клетки из-под влияния коррелятивных связей и
зависимости от материнского организма открывает широкие
перспективы для теоретических исследований и прикладных
разработок.
В
основе
практически
всех
методических
приемов
культивирования клеток и тканей in vitro лежат три следующих
принципа:
- изолирование экспланта (клетка, фрагмент ткани, орган) от
исходного материала;
- перенос экспланта в строго контролируемые, тщательно
подобранные условия;
- соблюдение стерильных условий выращивания материала.
В настоящее время метод культуры изолированных клеток,
тканей и органов растений в условиях in vitro, является
самостоятельной отраслью биотехнологии. Это связано как с
увеличением
роли
клеточных
культур
в фундаментальных
исследованиях по генетике и молекулярной биологии, физиологии и
цитоэмбриологии растений, так и с возможностями практического
использования
клеточных
и
тканевых
технологий
в
агропромышленном комплексе, фармацевтической и пищевой
промышленностях.
Последние
достижения
современной
биотехнологии в области клеточной и генетической инженерии во
многом определяются развитием методических подходов и
совершенствованием приемов культивирования отдельных клеток,
тканей и органов в асептических условиях.
Основные
направления
работ,
связанных
культурой
изолированных
тканей
растений,
включают
получение,
культивирование каллусных и суспензионных культур, гаплоидную
технологию, выделение и культивирование протопластов, клеточную
селекцию,
эмбриокультуру,
микроклональное
размножение,
криосохранение генофонда.
3
1 Общие требования к организации работ
Для проведения работ по культивированию изолированных
клеток,
тканей
и
органов растений
необходимо
наличие
специализированной лаборатории, которая включает:
- комнату для приготовления питательных сред;
- комнату для стерилизации питательных сред (автоклавная
комната);
- стерильный бокс или ламинарную комнату;
- светокультуральную комнату;
- термостатную комнату;
- моечную комнату.
Указанные помещения должны быть оснащены следующим
оборудованием, приборами, инструментами, лабораторной посудой и
реактивами:
а) оборудование:
- ламинарный бокс, обеспечивающий подачу стерильного
потока воздуха;
- автоклав для стерилизации питательных сред;
- сушильный шкаф для просушивания и стерилизации посуды;
- термостаты с режимом работы 2 0 -3 0 °С для культивирования
эксплантов;
- настольные центрифуги для разделения протопластов и
клеточных суспензий;
- автоматические пипетки, дозаторы для точного отбора нужных
объемов растворов;
- бинокулярная стереоскопическая лупа для работы с мелкими
объектами;
инвертированный
микроскоп
для
наблюдения
за
суспензионными культурами;
- качалка (шейкер) для суспензионных культур;
- дистиллятор для получения дистиллированной воды;
- бытовой холодильник для хранения растворов питательных
сред;
- магнитные мешалки для смешивания растворов;
- водяные бани для подогрева питательных сред и их
компонентов;
- штативы для пробирок (металлические, пластиковые);
- электрическая плитка (с закрытой спиралью) для нагревания
растворов;
б) приборы:
- весы (аптечные, аналитические, торсионные) для взвешивания
химических реактивов;
- рН-метр для измерения pH питательных сред;
- люксметр для измерения интенсивности освещения;
- термометры для измерения задачных температурных режимов;
- фотометр для определения вирусов растений методом ИФА
(Приложение Б);
- приборы для проведения исследований ДНК методом ПЦР
(вортекс, амплификатор, миницентрифуга, камера для электрофореза,
детектор и т.д.);
в) инструменты:
- препаровальные иглы;
- скальпели;
- пинцеты;
- ножницы;
- бритвенные лезвия и держатели для них;
- набор инструментов для глазной хирургии;
г) лабораторная посуда:
- пробирки диаметром 15-25 мм;
- чашки Петри диаметром 4 0 -9 0 мм;
- пипетки стеклянные объемом 1—20 мл;
- мерные цилиндры объемом 25-1000 мл;
- мерные стаканы объемом 50-1000 мл;
- фарфоровые стаканы объемом 200-500 мл;
- колбы конические объемом 250-1000 мл;
- часовые стекла;
- воронки стеклянные;
- стеклянные палочки;
- спиртовые горелки;
д) химические реактивы:
- соли;
- фитогормоны;
- витамины;
- углеводы;
- аминокислоты;
- агар;
е) стерилизующие вещества:
- этиловый спирт;
- бром;
- фенол;
- гипохлорит натрия;
- гипохлорит кальция;
- двухлористая ртуть (сулема).
Кроме этого необходимого иметь следующие аксессуары: бумагу
(фильтровальную, оберточную, пергаментную), шпагат, вату, марлю,
алюминиевую фольгу, парафильм, карандаши по стеклу, маркеры.
1.1 Подготовка посуды, инструментов и их хранение
Посуда для приготовления и хранения питательных сред,
культивирования растительного материала тщательно моется. Самым
надежным методом очистки посуды является мытье смесью серной
кислоты и двухромовогокислого калия (хромпик). Затем посуда
тщательно отмывается от следов хромпика 10-кратным полосканием
сильной струей водопроводной воды с последующим 5-кратным
ополаскиванием дистиллированной водой (Приложение В).
Если посуда моется моющими средствами, полоскать ее следует
не менее 10 раз водопроводной водой и 3-мя порциями
дистиллированной воды. После мытья посуду просушивают в
сушильном шкафу.
Основное требование при работе с тканевыми культурами соблюдение условий стерильности, поэтому для работы необходимо
иметь предварительно выдержанные в сушильном шкафу посуду и
инструменты. Кроме суховоздушного способа, посуду можно
стерилизовать и автоклавированием.
Металлические инструменты во избежание покрытия ржавчиной
не рекомендуется автоклавировать. Чистую посуду и инструменты,
завернутые в оберточную бумагу, хранят в закрытых шкафах, в
условиях, не допускающих загрязнения даже следами химических
веществ.
Непосредственно перед работой инструменты погружают в 96 %
раствор этилового спирта и прожигают их рабочие поверхности над
пламенем спиртовки.
1.2 Приготовление питательных сред
Питательные среды для культур изолированных тканей имеют
сложный
состав.
Основой
всех
питательных
сред
для
культивирования
растительных
эксплантов
является
смесь
6
минеральных солей. К необходимым макроэлементам относят азот,
фосфор, калий, кальций, магний, серу, железо, а к микроэлементам бор, марганец, цинк, медь, молибден, кобальт и др. (Приложение Г).
В
состав
питательных
сред
обязательно
входит
этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) или ее натриевая соль
(Ыа2ЭДТА), которые улучшают доступность железа.
В качестве источника углерода для биологических макромолекул,
а также при культивирований гетеротрофных тканей (каллусов и
суспензий) в питательные среды добавляют углеводы. Чаще всего в
качестве углеводов используют сахарозу в концентрации 20-30 г/л.
Для стимуляции биохимических процессов в клетке используют
витамины группы В: тиамин-НС 1 (В1), рибофлавин (В2),
Са-пантогенат (В5), пиридоксин-HCl (В 6), аскорбиновая кислота (С),
никотиновая кислота (РР), мезоинозит.
Для процессов роста и морфогенеза в культуре тканей
необходимы регуляторы роста и развития - фитогормоны. Эти
вещества индуцируют деление и растяжение клеток, влияют на
дифференциацию и дедифференциацию клеток и тканей. В
биотехнологических исследованиях чаще используют фитогормоны,
стимулирующие
рост
и
развитие:
ауксины,
цитокинины,
гиббереллины.
В качестве биологических добавок для индукции первичного
каллуса можно использовать растительные экстракты. Как правило,
>то эндоспермы незрелых зародышей (кокосовое молоко, вытяжки из
незрелых зерновок кукурузы) и весенняя пасока некоторых деревьев
(березовый сок). Добавление их в среду почти всегда эффективно, но
при этом эксперименты трудновоспроизводимы, так как действующий
компонент, как правило, точно неизвестен.
Растворы макро- и микросолей готовят согласно прописям из
реактивов высокой химической чистоты (имеющих маркировку ХЧ, Ч,
ЧДА) с проверенным сроком годности. Особой тщательности и
аккуратности
следует
придерживаться
при
взвешивании
микроэлементов и регуляторов роста, так как даже минимальные
ошибки могут сказаться на росте эксплантов. Не допускается
использование грязных шпателей во избежание перекрестного
шгрязнения солей. Навески макро- и микроэлементов взвешивают в
стеклянных стаканчиках, а витаминов, фитогормонов и других
добавок - на часовых стеклах. Углеводные компоненты среды и агар
можно взвешивать на пергаментной бумаге.
В целях экономии времени удобно готовить маточные
(концентрированные) растворы солей. Растворы макросолей готовят в
7
10 раз более концентрированными, а растворы микросолей - в 100 раз
более концентрированными. Для приготовления маточного раствора
макро- и микроэлементов навеску каждой соли по отдельности
растворяют в небольшом объеме дистиллированной воды при
нагревании, затем растворы солей макро- и микроэлементов
объединяют, каждый в отдельности и доводят до нужного объема
дистиллированной водой. В охлажденную смесь микросолей
последним добавляют раствор солей молибдена, а в макросоли раствор солей магния (для предотвращения выпадения осадка).
Маточные растворы хлористого кальция (С аС Ь ) и хелата железа
готовят и хранят отдельно от растворов других солей.
Растворы хранят в холодильнике при температуре 4 -7 °С в
течение месяца. На сосудах с маточными растворами обязательно
должны быть указаны название среды, концентрация раствора, дата
приготовления. Использование мутных растворов и растворов с
осадками - недопустимо.
Большинство фитогормонов плохо растворяется в воде. Поэтому
ауксины и гиббереллины растворяют в небольших количествах
этилового спирта, а цитокинины в небольших количествах 0,5-1 Н
NaOH или КОН, затем подогревают на водяной бане до полного
растворения и доводят дистиллированной водой до нужного объема.
Растворы фитогормонов хранят в холодильнике при 4 -7 °С в течение
месяца.
Растворы
витаминов
готовят
в
100
раз
более
концентрированными, замораживают в небольших объемах (50 мл) и
хранят в течение года. Перед употреблением растворы витаминов
размораживают.
Растворы ИУК, углеводов, глицина, мезоинозита, дрожжевого
экстракта, гидролизата казеина готовят непосредственно в день
приготовления питательной среды.
Важное значение имеет pH среды. От величины pH зависит
устойчивость и усвояемость ряда компонентов питательной среды.
Наиболее чувствительные к pH ИУК, гиббериллиновая кислота,
витамины (тиамин, пантотеновая кислота). При низких величинах pH
не происходит желатинизации агара. Кроме того, от pH среды зависит
доступность для культуры ткани различных соединений железа.
Большинство культур изолированных тканей растет на средах с
pH 5,5-5,8. Величину pH готовой среды доводят до требуемого
значения с помощью 0,5-1 Н раствора КО Н или NaOH (если
показатель отклоняется в кислую сторону) и 0,5—1Н НС1 (если
показатель отклоняется в щелочную сторону). Для этого кислоту или
щелочь добавляют в среду по каплям, перемешивают, наливают в
мерный стакан небольшой объём среды и каждый раз проверяют pH
(Приложение Д).
Среды готовят жидкие и твердые (агаризо ванные). Для
приготовления твердых питательных сред в качестве затвердителя
наиболее часто используют агар. Это полисахарид, получаемый из
морских водорослей и изготавливаемый в виде пластин, зерен и
порошка желтовато-белого цвета. Некоторые примеси агара,
выпускаемого в виде пластин и зерен, могут отрицательно влиять на
рост культур. Их можно удалить путем промывания агара
дистиллированной водой. Промывание ведут в течение двух дней при
комнатной температуре, многократно меняя дистиллированную воду.
1[ромытый агар распределяют на чистом стекле или эмалированных
кюветах и сушат при комнатной температуре. Бактериальный агар
«Difco», «Bakto-Agar», выпускаемый в виде порошка содержит
меньше примесей и не требует предварительного промывания. Агар
образует с водой гель, плавящийся при температуре 70-80 °С и
ш гвсрдевающий при температуре 4 5 -5 0 °С.
При использовании пластинчатого и гранулированного агара,
очищенную и высушенную его навеску помещают в термостойкий
стакан, заливают холодной дистиллированной водой ( 1/2 объема
срсды) на 10-15 мин, для лучшего разбухания, а затем нагревают до
температуре 7 0 -8 0 °С, пока он не превратиться в однородный
коллоидный раствор. Навеску порошкового агара можно вносить
сраэу в среду, не нагревая. Затем питательную среду нагревают до
50 60 °С, объединяют с горячим раствором агара и доводят до
| ребуемого объема подогретой дистиллированной водой. Готовую
среду разливают в культуральные сосуды. При необходимости точный
oGi.cm среды можно отмерять пипеткой, цилиндром или использовать
дозаторы.
Для предохранения питательных сред от инфицирования,
культуральные
сосуды
закрывают
предварительно
11ром h i оклавированными
пробками,
приготовленными
из
мп ш роскопической ваты. Такие пробки хорошо пропускают воздух и
препятствуют испарению влаги из среды. Можно использовать в
качестве пробок колпачки из мягкой алюминиевой фольги. Для их
it и отовления кусок фольги прямоугольной формы помещают над
культуральным сосудом и придавливают его пальцами так, чтобы он
плотно пристал к горлышку сосуда. Доступ воздуха через такой
колпачок достигается через маленькие каналы в сложенной вокруг
горлышка фольге. Фольговые колпачки используются только один
9
раз. Нельзя закрывать культуральные сосуды резиновыми или
корковыми пробками (это приводит к удушению тканевой культуры).
Не следует делать пометки на сосудах карандашом по стеклу, так
как во время автоклавирования они смываются. Для маркирования
сосудов пометки можно делать маркером (на спиртовой основе) или
оставлять пометки на фольге. Колбы со средами помещают на
специальные металлические лотки, пробирки - в штативы.
Среды стерилизуют автоклавированием при давлении 0,8-1 атм.
Продолжительность стерилизации зависит от объема питательной
среды. Сосуды, содержащие 15-25 мл среды, стерилизуют в течение
15-20 мин, содержащие от 1 до 4 л среды - 30-40 мин. Стерилизацию
больших объемов жидкостей лучше проводить в вертикальном
автоклаве.
После окончания автоклавирования следует медленно снижать
давление в автоклаве и открывать его крышку лишь после того, как
внутреннее давление станет равно внешнему. В противном случае изза резкого изменения давления жидкость в сосудах бурно вскипает,
что может привести к выбросу пробок.
Чтобы убедиться в отсутствии бактериального заражения,
культуральные сосуды с питательной средой оставляют на 4 -6 дней
при температуре 20-250 °С. Сосуды с зараженной средой необходимо
немедленно удалять для
избежания заражения воздуха в
лабораторном помещении. Готовые среды хранят при температуре
4 -7 °С не более 2-х недель.
1.3 Порядок работы в ламинар-боксе
При работе в ламинар-боксе необходимо соблюдать следующие
правила.
Перед работой продезинфицировать поверхность стола 96 %
раствором этилового спирта. Затем разместить на рабочем столе
необходимые для работы принадлежности, культуральные сосуды со
средой и провести стерилизацию рабочего объема ламинар-бокса
ультрафиолетом в течение 15-20 мин с помощью ртутно-кварцевой
лампы. Приступать к работе сразу после стерилизации нельзя, следует
дать 15-20 мин для удаления окисла азота, образующего под
влиянием
ультрафиолета.
Непосредственно
перед
работой
обязательно тщательно мыть руки под струей теплой воды. Затем
руки и рабочую поверхность стола протереть 70 % раствором
этилового спирта. После этого надо обжечь инструменты над
пламенем спиртовки и дать им остыть перед использованием.
10
В процессе работы необходимо воздерживаться от лишних
движений, периодически проводить дезинфекцию рук 70 % раствором
си л ового спирта, использовать инструменты только для одноразовой
операции. При извлечении растительного материала избегать
движении руками над открытыми культуральными сосудами. Перед
открыванием и закрыванием культурального сосуда с питательной
средой нужно слегка обжечь, его горлышко, поворачивая сосуд над
плнмонем спиртовки. При посадке нужно держать сосуды под углом к
поверхности стола, т.е. в наклонном положении. Нельзя пользоваться
•ксил антами, которые случайно уронили на поверхность стола. После
посадки обжечь на пламени пробку (крышку) сосуда. Выполнять
посадку желательно как можно быстрее, сводя к минимуму время, при
котором культуральные сосуды остаются открытыми.
После окончания работы следует запечатать (обмотать) пробки
культуральных сосудов, боковые грани чашек Петри специальной
пипкой лентой (парафильмом). Культуральные сосуды с эксплантами
поместить в термостаты или световую комнату. Освободить рабочий
стол
от
принадлежностей,
неиспользованного
растительного
ма териала и продезинфицировать поверхность стола 96 % раствором
и илового спирта.
1.4. Правила стерилизации растительного материала
11оверхностные покровы всех органов растений обычно
mi рмщепы спорами микроорганизмов и грибов, тогда как внутренние
п..щи здоровых, неповрежденных растений считаются стерильными.
Дли поверхностной стерилизации растительных тканей применяют
| m u.т о й набор химических веществ. Наиболее часто употребляют
соединения, содержащие активный хлор (гипохлорит натрия,
гимпхлорит калия, хлорная известь, хлорамин), ртуть (сулема,
днпцид), иерекись водорода, этиловый спирт. Реже используют бром,
серную кислоту, фенол и в особых случаях для стерилизации
применяют антибиотики. Выбор стерилизующего вещества, его
....... . трация и продолжительность применения зависят от плотности
и ч у т тительн ости ткани, которая должна быть простерилизована.
( и рп лизующие вещества должны отвечать следующим требованиям:
н|к|>ективно обеззараживать грибные и бактериальные споры на
пи'чпией поверхности растительных объектов без повреждения
mis гренних тканей;
легко удаляться из ткани промыванием стерильной
ши'I и.илированной водой или подвергаться разложению.
11
При правильном подборе стерилизующего вещества и времени
стерилизации инфицирование посаженного материала не должно
превышать 1-3 процентов. Для получения удовлетворительных
результатов
обычно
пользуются
уже
известной
техникой
стерилизации с внесением некоторых модификаций для каждого
конкретного случая, так как одни и те же ткани у разных видов
растений нуждаются в различных способах и продолжительности
стерилизации.
Прежде чем приступить к стерилизации, необходимо подготовить
4 стерильных сосуда с крышками. Один из них заполняют
стерилизующим раствором, остальные стерильной водой.
Очищенный и промытый в дистиллированной воде растительный
материал помещают на несколько секунд в 96 % этиловый спирт,
затем в стерилизующий раствор и отмечают время начала
стерилизации. Не рекомендуется использовать для посадки клубни и
корнеплоды, которые плавают на поверхности раствора. Концы
отрезков стеблей, корней, черешков, листьев, пазушных и
верхушечных почек парафинируют во избежание попадания
стерилизующего вещества, которое может вызвать повреждение
тканей. Если эта процедура не выполняется, то перед вычленением
ткани концы стебля, корня или черешка отсекаю стерильным
скальпелем. Мелкие объекты (семена, почки, флоральные органы)
удобно стерилизовать и промывать в марлевых мешочках, затянутых
сверху ниткой.
Растительный материал, погруженный в стерилизующий раствор,
вносится в ламинар-бокс. По истечении времени стерилизации
растительный материал стерильным пинцетом переносят в сосуды со
стерильной водой, выдерживая в каждом из них по 5 мин.
Простерилизованные и промытые объекты, помещенные в стерильные
чашки Петри, готовы для вычленения фрагментов тканей и переноса
их на питательные среды.
О
Работа № 1 Подготовка посуды и инструментов
Порядок работы:
1) посуду тщательно вымыть в растворах детергентов
(стиральный порошок, мыльная вода);
2) отмыть от детергентов 8-10-ти порциях проточной воды;
3) поместить на 4 -6 часов в хромпик, в 10-ти повторностях
промыть теплой однопроводной водой, затем 5 раз сполоснуть
дистиллированной водой;
12
4) чистую посуду поместить в сушильный шкаф на 2 часа при
температуре 130-170 °С;
5) металлические инструменты завернуть в плотную бумагу и
поместить в сушильный шкаф для стерилизации сухим жаром при
юмпературе 170-200 °С в течение 2 часов;
6) сухую посуду, инструменты обернуть бумагой или
целлофаном и хранить в стеклянных шкафах или в выдвижных полках
набориторных столов.
Материалы и инструменты:
Пробирки диаметром 15-25 мм, чашки Петри диаметром 40-90
мм, пипетки стеклянные объемом 1-25 мл, мерные цилиндры
объемом 25-1000 мл, мерные стаканы объемом 50-1000 мл,
фарфоровые стаканы объемом 200-500 мл, конические колбы
объемом
250-500
мл,
инструменты
(пинцеты,
скальпели,
препаровальные иглы), моющие средства (стиральный порошок,
м г.| но), хромпик, бумага оберточная, фольга, целлофан.
1'нПога № 2
uni т е л ь н ы х сред
Приготовление
маточных
растворов
для
11орядок работы:
1) приготовить маточный раствор макроэлементов согласно
иромиси. Для этого взять 10 кратную навеску каждой соли, растворить
111 m
i iпабом нагревании в небольшом объеме дистиллированной воды,
омшдить до комнатной температуры, слить растворы в мерный
цпнипдр и довести дистиллированной водой до 200 мл. Раствор
ч пористого кальция (СаС12) готовить и хранить отдельно. На 1 л среды
брить 20 мл маточного раствора;
1) приготовить маточный раствор микроэлементов согласно
прописи. Для этого взять 100 кратную навеску каждой соли,
Iон то р и ть
при
слабом
нагревании в небольшом
объеме
mu I ил лированной воды, охладить до комнатной температуры, слить
pm 'шоры в мерный цилиндр и довести дистиллированной водой до
'0(1 мп. 1la 1 л среды брать 2 мл маточного раствора;
1)
приготовить маточный раствор хелата железа (приложение А).
I In I п среды брать 5 мл раствора;
4)
приготовить концентрированные растворы ауксинов. Для этого
100 m i вещества (ИУК, 2,4-Д, ИУК, ИМК) растворить в 1-2 мл
и и юного спирта (каждый в отдельности), подогреть, довести
13
дистиллированной водой до 100 мл. 1 мл раствора будет содержать 1
мг вещества;
5) приготовить концентрированные растворы цитокининов. Для
этого 100 мг вещества (кинетин, зеатин, БАП) растворить в
небольшом объёме 0,5-1Н раствора NaOH (КОН) при слабом
нагревании, довести дистиллированной водой до 100 мл. 1 мл
раствора будет содержать 1 мг вещества;
6) приготовить маточные растворы витаминов. Для этого ампулу
(аптечную) содержащую 1 мл (1 или 5 %) раствора витамина довести
до 100 мл дистиллированной водой. 1 мл раствора будет содержать
соответственно 0,1 или 0,5 мг витамина;
7) на сосудах с маточными растворами обязательно указать
название среды, концентрацию раствора, дату приготовления и
поместить в холодильник. Хранить при температуре 4 -7 °С в течение
месяца.
Материалы и инструменты:
- соли, фитогормоны, витамины, этиловый спирт, 1Н раствор
NaOH или КОН;
- химические стаканы, колбы, мерные цилиндры объёмом от 10
мл до 1 л, пробирки, пипетки объёмом 1-10 мл или автоматические
пипетки, весы аптечные, весы торсионные, пинцеты, ножницы,
шпатели, электроплитка, водяная баня, магнитные мешалки, тонкая
фольга, пергаментная бумага.
Работа № 3 Приготовление питательной среды
Порядок работы:
1) подготовка маточных растворы макро- и микроэлементов,
витаминов, регуляторов роста;
2) для приготовления 1 л среды в стакан объемом 1 л, пипеткой
перенести необходимый объём каждого из исходных растворов;
3) растворить в небольших объемах дистиллированной воды
(каждый в отдельности) мезоинозит, глицин, сахарозу и полученные
растворы внести в стакан с маточными растворами;
4) полученную жидкую питательную среду из стакана слить в
мерный цилиндр и дистиллированной водой довести объем до 950 мл;
5) довести pH среды до требуемого значения. Если pH выше
наружного значения - добавить несколько капель 1Н HCI, если ниже
этого значения - добавить несколько капель 1Н NaOH (КОН) в
мерный цилиндр, тщательно перемешать. Отлить небольшой объем
14
среды в стакан, измерить pH. Измерения pH среды проводить до
установления требуемой величины;
6) навеску пластинчатого агара (6-7 г) поместить в стакан со
средой, растворить, нагревая на плитке (не доводя до кипения), при
постоянном помешивании;
7) питательную среду нагреть 50-60 °С, объединить с горячим
раствором агара. Порошкообразный агар можно вносить сразу в
срсду, не нагревая;
8) довести объем среды до метки
1 л подогретой
дне шллированной водой и тщательно перемешать;
9) готовую питательную среду разлить в пробирки на 1/4 объема,
шкрыть пробирки колпачками из ваты или фольгой, поместить
пробирки в металлические штативы;
10) поместить штативы в автоклав и автоклавировать в течение
I *>мин при давлении 0,7-1 атм;
11) через 4 -6 дней проверить пробирки с питательными средами
ни наличие заражения. Пробирки с зараженной средой удалить.
Материалы и инструменты:
маточные растворы макро- и микроэлементов, витаминов,
фшогормонов, глицин, мезоинозит, сахароза, агар;
мерные стаканы на 50-1000 мл, колбы на 250-500 мл,
цилиндры на 25-1000 мл, пипетки на 1-25 мл, пробирки, магнитная
мешалка, водяная баня, электрическая плитка, автоклав.
Работа № 4 Стерилизация растительного материала
11орядок работы:
1) отобрать неповрежденные зерновки пшеницы или ячменя;
2) и ламинар-боксе поместить по 15 семян в 5 чашек Петри (на
ка ж П.1 Й вариант) со следующими стерилизующими веществами:
вариант I - 6 % раствор хлорамина;
вариант II - 6 % раствор гипохлорита кальция;
вариант III - 70 % раствор этилового спирта;
вариант IV - 0,1 % раствор сулемы;
вариант V - стерильная дистиллированная вода (контроль);
1) отметить продолжительность стерилизации;
4) отмыть зерновки от стерилизующих растворов в 3-х порциях
am шллированной стерильной воды;
5) поместить зерновки для проращивания в стерильных чашки
Петри
со
стерильной
фильтровальной
бумагой,
смоченной
15
дистиллированной водой. Чашки Петри закрыть и перенести в
термостат. Зерновки проращивать при температуре 20-25 °С в
темноте;
6)
через 4 - 6 дней определить степень зараженности. Сделат
выводы об эффективности стерилизующих растворов.
Материалы и инструменты:
- зерновки пшеницы и ячменя;
- 6 % раствор хлорамина, 6 % раствор гипохлорита кальция, 7 0 %
раствор этилового спирта, 0,1 % раствор сулемы, стерильная
дистиллированная вода;
- ламинар-бокс, термостат, стерильные чашки Петри, спиртовка,
пинцеты, фильтровальная бумага.
Работа № 5 Посадка в асептических условиях (в ламинарбоксе) зрелых зародышей пшеницы
Порядок работы:
1) предварительно замочить на сутки зерновки пшеницы;
2) под ламинаром отобрать 10 зерновок, поместить в 70 %
раствор этилового спирта на 3 мин, промыть стерильной
дистиллированной водой;
3) зерновку, бороздкой вниз, поместить на стерильную чашку
Петри;
4) придерживая зерновку пинцетом, препаровальной иглой
надрезать оболочку вокруг зародыша;
5) боковой частью иглы надавить на зародыша (на границе с
эндоспермом) и вычленить его из зерновки;
6) взять из штатива пробирку с безгормональной питательной
средой Мурасиге и Скуга (МС), обжечь горлышко пробирки над
пламенем спиртовки, снять колпачок из фольги. Пробирку держать
открытой частью в направлении от себя;
7) препаровальной иглой перенести зародыш на поверхность
питательной среды щитком вниз (не заглублять);
8) горлышко пробирки обжечь на пламени спиртовки и закрыть
пробирку колпачком;
9) пробирки с зародышами поставить в штатив и перенести на
стеллаж в световую комнату;
10) через 3—4 дня подсчитать количество проросших зерновок.
Оценить качество посадки (степень заражения);
16
Материалы и инструменты: .
- зерновки пшеницы;
- ламинар-бокс, безгормональная питательная среда МС, 70 %
pm m op этилового спирта, стерильная дистиллированная вода;
- пробирки, чашки Петри, препаровальные иглы, пинцеты,
i к.шьнели, фольга.
Контрольные вопросы
1. Как устроена биотехнологическая лаборатория?
2.
Как
простерилизовать
питательные
среды,
посуду,
/пн Iминированную воду, инструменты, помещение лаборатории?
J.
Какие
стерилизующие
растворы
используются
для
Iми ппельны х эксплантов?
4. Какие вещества входят в состав питательных сред, и какую
функцию они выполняют в культуре клеток и тканей in vitro?
'
- .... ........■
С.Торайгыров
аты ндаш ПМУ~дщ
академик С .Бейсе?:!:
а т ь ^ а г ы гылы
7!
j
2
Дедифференциация
растительных клеток и тканей
и
каллусогенез
в
культуре
Каллус - ткань, возникшая in vitro путем неорганизованной
пролиферации клеток, тканей растений. Для растений in vitro каллус это группа клеток, возникающая при травмах и защищающая место
поранения (раневая паренхима) в которых накапливаются вещества
необходимые для регенерации поврежденных тканей. Каллусные
ткани in vitro — основной объект для манипулирования при работе с
изолированными культурами.
В
асептических
условиях
клетки
тканей
экспланта
де дифференцируются, т.е. утрачивают прежние функции и
морфологию и переходят к пролиферации. Причем, чем меньше
структурно и химически дифференцирована клетка, тем легче
получить каллус.
Каллусная ткань, полученная в условиях in vitro , состоит из
аморфной массы тонкостенных паренхимных клеток, не имеющих
строго определенной структуры. Клетки каллуса, в большинстве
случаев, либо бесцветны, либо имеют желтоватый оттенок. В
зависимости от структуры и морфологии различают каллусы рыхлые
- с сильно оводненными, легко отделяющимися друг от друга
клетками и плотные - с зонами меристематической активности.
Каллусная ткань может быть индуцирована из многих органов и
тканей растений, например: листьев, побегов, стеблей, корней, семян,
пыльцевых зерен, эндосперма. При этом клетки растений,
находящиеся
на
конечном
стадии
дифференцировки,
под
воздействием ростовых регуляторов (в основном ауксинов и
цитокининов) переходят в дедифференцированное состояние и
возобновляют меристематическую активность. Необходимо отметить
успех индукции каллусообразования. Молодые ткани более пригодны
для этой цели, чем зрелые. Для стимулирования каллусогенеза
наиболее часто используют питательные среды с высоким (до 10кратного) соотношением ауксинов к цитокининов.
После образования каллуса, его отделяют от исходного экспланта
и в асептических условиях переносят (пассируют) на новую
агаризованную питательную среду. Получается стерильная культура
каллусной ткани, рост которой можно поддерживать в культуре
неограниченно долгое время, периодически разделяя на фрагменты и
пересаживая на свежую питательную среду.
18
Для оценки роста каллусных- тканей определяют прирост сырой
м т i ы или сухого веса, а так же количество клеток на единицу веса
I КИНИ.
11олучсние растений-регенерантов является наиболее важным
чипом работ в культуре изолированных тканей. Регенерация растений
н культуре протекает в два этапа. На первом этапе в процессе
iIг 1111|>ференцировки клетки специализированных тканей теряют свою
| ж чцш литцию и дают начало клеткам каллусной ткани. На втором
чипе, и каллусных тканях процессе дедифференцировки происходит
морфогенез (рисунок 1).
растение-регенерант
Рисунок 1 - Дифференциация придаточных почек в каллусной
I HIIHI1
Кик правило, спонтанное или индуцированное формирование
м|>| .щон наблюдается у недавно введенных в культуру эксплантов, т.к.
II Аолмпинстве случаев морфогенетический потенциал каллусных
куш.гур значительно снижается в ходе многократных пассажей.
I'm Iсиня-регенеранты, полученные из многократно пересаживаемых
мшлусных
тканей,
обычно
слабые,
т.к.
при
длительном
иv иминировании изменяется число хромосом, что приводит к
.ни-уилоидии и эуплоидии, возникают различные хромосомные
иирушения.
Работа № 1 Получение и культивирование
|||||м-н*нмной ткани корнеплода моркови
каллуса из
11орядок работы:
1) корнеплод моркови тщательно вымыть в мыльной воде, затем
промыть п проточной (водопроводной) воде и погрузить на 15 мин в
(■ ".I риствор хлорамина или гипохлорита кальция. После отмыть в 3-х
порциях стерильной дистиллированной воды (по 5 мин в каждой);
2) под ламинаром отделить среднюю часть корнеплода, разрезать
ми диски толщиной 5 -7 мм, каждый из которых разделить на 10
19
сегментов и из каждого сегмента вычленить сердцевинную
паренхиму;
3) полученные сегменты перенести в пробирки, содержащие
5 -8 мл питательной среды МС со следующими концентрациями
фитогормонов:
вариант I - безгормональная среда (контроль);
вариант II - 20 мг/л ИУК и 2 мг/л кинетина;
вариант III - 12 мг/л НУК и 1 мг/л Б АП;
вариант IV - 10 мг/л 2,4-Д и 1 мг/л Б АП;
4) пробирки с эксплантами поместить в термостат и
культивировать в темноте при температуре 2 5 -2 7 °С;
5) после появления каллусной ткани (через 15-20 дней
культивирования), для поддержания роста, пассировать ее на среду
МС со следующими концентрация фитогормонов:
вариант I - безгормональная среда (контроль);
вариант II - 2 мг/л ИУК;
вариант III - 1мг/л НУК;
вариант IV - 1 мг/л 2,4-Д;
6) результаты эксперимента оценить по следующим показателям:
интенсивность
(частота) каллусообразования, т.е. подсчитать
количество образовавшихся каллусов по вариантам;
7) провести морфологическое описание (цвет, структура)
полученных каллусов;
8) определить прирост сырой массы каллусной ткани. Для чего
через 10 дней от начала пассирования, каллусы взвесить на
торсионных весах. Прирост каллусной ткани вычислить по формуле:
( 2. 1)
W i-W o/W o,
где W| - конечный вес каллуса;
Wo - начальный вес каллуса.
О
Материалы и инструменты:
- корнеплоды моркови;
- растворы макро- и микроэлементов, витаминов для среды МС,
ИУК, НУК, 2,4-Д, кинетин, БАП, этиловый спирт, мыло (стиральный
порошок),
хлорамин
или
гипохлорит
кальция,
стерильная
дистиллированная вода;
- ламинар, термостат, пинцеты, скальпели, препаровальные иглы,
чашки Петри, пробирки, стаканы, парафильм, вата алюминиевая
фольга.
20
1'абота № 2 П о л у ч ен и е к ал л у сн о й т к а н и из л и с т ь е в та б а к а
11орядок работы:
1) листья табака поместить в 6 % раствор хлорамина на 5 мин,
ином промыть стерильной дистиллированной водой 3 раза;
2) стерильным скальпелем вырезать срединную жилку листа с
уч;н жом паренхимы длинною 1,5-2 см, шириной 1см. Поместить
ни п и и т ы на питательную среду МС, содержащую 2мг/л ИУК,
о,.' мг/л кинетина и 30 г/л сахарозы;
1) чашки Петри с эксплантами перенести в термостат для
miisKHiiH каллусогенеза, инкубировать в темноте при температуре
J!5i2 "С;
4) Отметить сроки и частоту появления каллуса от начала
ucpfiioca жсплантов на питательную среду.
Ма териалы и инструменты:
мистья табака;
■ среда МС, ИУК, кинетин, сахароза, 6 % раствор хлорамина,
ч миопий спирт;
чашки Петри, пробирки, скальпели, пинцеты, препаровальные
in мы, спиртовка.
I’lidoia № 3 Получение каллусной ткани из корешков фасоли
11орядок работы:
I ) семена фасоли поместить в чашки Петри (по 15 штук в чашку),
шипи, нодой, до полного погружения семян в жидкость и оставить на
I о мин, ири этом поврежденные семена всплывут на поверхность;
.’) промыть семена стерильной дистиллированной водой 3 раза;
I ) семена залить стерильной водой и оставить для набухания на
М ч;
4) удалить семена с поврежденной кожурой, а остальные
| и-римичовать 0,1 % раствором гипохлорита натрия 10 мин;
5) промыть семена стерильной дистиллированной водой 3 раза;
(i) семена перенести в стерильные чашки Петри (по 5 штук в
чашку);
7)
пери льн ы м скальпелем и препаровальной иглой изолировать
омринки (2-3 мм) и перенести в чашки Петри со стерильной
п т цитированной водой (по 15 штук в чашку);
N) корешки стерильной препаровальной иглой поместить в чашки
П при , содержащие по 10 мл питательной среды Шенка и
21
Хильдебрандта, дополненной 10 мг/л парахлорфеноксиуксусной
кислоты (п-ХФУК), 2 мг/л,2,4-Д и 0,1 мг/л кинетина;
9) запечатать чашки парафильмом и перенести в термостат.
Экспланты культивировать в темноте при температуре 25±2 °С;
10) отметить сроки и частоту индукции каллусообразования.
М атериалы и инструменты:
- семена фасоли. Питательная среда Шенка и Хильдебрандта,
2.4-Д, кинетин, парахлорфеноксиуксусная кислота, 0,1 % раствор
гипохлорита натрия, этиловый спирт, стерильная дистиллированная
вода.
- пинцеты, скальпели, препаровальные иглы, стерильные чашки
Петри.
Работа № 4 Получение каллусной
зародышей и узлов кущения пшеницы
ткани
из
незрелых
Порядок работы:
1) незрелые зерновки поместить в 6 % раствор хлорамина на
5 мин;
2) промыть 3 раза стерильной дистиллированной водой;
3) простерилизованные зерновки поместить на стерильные чашки
Петри;
4) препаровальной иглой вычленить зародыши и перенести в
пробирки с питательной средой МС, дополненной 4 мг/л 2.4-Д.
Инкубировать в темноте при 25-27 °С до появления каллусов;
5) пробирки с зародышами закрыть пробками и поставить в
штатив;
6) пробирочные растения пшеницы выложить на стерильные
чашки Петри и разрезать на небольшие части по 5—10 мм, выделить
междоузлия с участками листового влагалища;
7) перенести экспланты на питательную среды МС, содержащую
2.4-Д в концентрации 4 мг/л. Инкубировать в темноте при 25-27 °С до
появления каллусов;
8) рассмотреть каллусные клетки под микроскопом и описать их
морфологию.
Материалы и инструменты:
- незрелые зародыши пшеницы, пробирки со стерильными
растениями;
- среда МС, 2,4-Д, 6 % раствор хлорамина, этиловый спирт;
22
- пробирки, препаровальные иглы, пинцеты, скальпели.
Работа № 5 Определение митотического индекса в каллусных
тканях
При изучении деления клеток нередко приходится определять
митотическую активность, т.е. относительное число делящихся
клеток.
Соотношение делящихся и общего числа клеток.
Соотношение делящихся и общего числа клеток в тканях выражают в
процентах или в виде показателя, который называют митотическим
индексом. Под ним понимают отношение числа клеток находящихся в
митозе к общему числу клеток исследуемой ткани. Процесс
определения митотической активности состоит из нескольких этапов:
фиксации, мацерации, окраски материала и подсчета клеток.
Порядок работы:
1) фиксация - 1 г каллуса фиксировать в 10 мл фиксатора Карнуа
(приложение А) в течение 3-6 ч. После однократно промыть 70 %
раствором этилового спирта. Можно хранить в холодильнике в 70 %
растворе этилового спирта в течение месяца;
2) мацерация - зафиксированные каллусные ткани выдержать в
смеси концентрированной соляной кислоты и воды, в соотношении
1:1, в течение 15 мин. Затем промыть в трех порциях
дистиллированной воды;
3) окрашивание - материал окрасить в растворе ацетоарсеина или
ацетокармина в течение суток при комнатной температуре. В целях
ускорения процесса окрашивания, материал можно подогреть над
пламенем спиртовки до 60 °С. Окрашенный материал можно хранить
в холодильнике в течение 2-3 сут;
4) подсчет клеток - кусочки каллусной ткани поместить на
предметное стекло, добавить каплю 4 % уксусной кислоты, накрыть
покровным стеклом, раздавить до получения одного слоя клеток
легким постукиванием карандашом по покровному стеклу и
рассмотреть под микроскопом. Во избежание подсыхания препарата
на края покровного стекла нанести расплавленный парафин. До
проведения подсчета необходимо научиться различать клетки,
находящиеся на разных стадиях митоза от неделящихся клеток.
Процент клеток, вступивших в митоз, определяют путем подсчета
клеток, которые в данный момент находятся в состоянии деления;
5) для определения митотического индекса каллусной ткани
следует просмотреть под микроскопом не менее 10 препаратов,
23
просчитывая подряд 500-700 клеток. Затем рассчитать митотический
индекс по формуле:
М = число клеток в митозе / сумма всех клеток х 100,
(2.2)
где М - митотический индекс.
Результаты выражаются в процентах.
Материалы и инструменты:
- каллусные ткани;
- фиксатор Карнуа, смесь концентрированной соляной кислоты и
воды (в соотношении 1:1), 4 % раствор уксусной кислоты, раствор
ацетоарсеина, раствор ацетокармина, парафин;
- микроскоп, предметные и покровные стекла, спиртовка.
Работа № 6 Субкультивирование каллусов
В цикле выращивания каллусные клетки после ряда делений
проходят обычный онтогенез: растут растяжением.
Дифференцируются и деградируют. Рост каллуса внешне
отражает образная кривая. Ростовой цикл начинается с посадки
экспланта на среду (начало культивирования), а завершается в момент
прекращения митозов (стационарная фаза).
В лагфазе (латентной фазе) клетки не делятся, не увеличиваются
в размере, имеют низкую метаболическую
активность. В
экспоненциальной фазе (фазе логарифмического роста) клетки
активно делятся митозом. В ранней экспоненте увеличивается
количество митохондрий (синтезируется АТФ), рибосом, всех видов
РНК, синтезируются белки, активизируется метаболизм, интенсивно
поглощается кислород. Поздняя экспонента или фаза латентного
роста, характеризуется снижением удельной скорости роста,
замедлением клеточного деления, увеличением среднего размера
клеток за счет растяжения. В стационарной фазе размер клеток
продолжает увеличиваться, а их деление прекращается. В поздней
стационарной фазе (фаза деградации) за счет истощения среды клетки
стареют и умирают.
Продолжительность ростового цикла каллусных клеток 21-28
дней. В процессе культивирования каллус пассируют (пересаживать
на свежую питательную среду) каждые 4 -6 недель. Масса
24
цчнн'млшггата (фрагмента ткани,, который пассируют на свежую
пи мп-.-м.ную среду) составляет 60-100 мг на 20-40 мл среды.
11<>рядок работы:
I ) и асептических условиях извлечь каллусы из пробирок и
цнм1ч и н ь на стерильную поверхность (столик ламинар-бокса,
иГцщГюншный 96 % спиртом и УФ-излучением);
стерильной препаровальной иглой выделить отделить зоны с
м. |чн Ii-мнгической активностью (белые, плотные участки);
I) кусочки каллусной ткани величиной 2-3 мм поместить на
........
. питательной среды МС, дополненной 0,5 мг/л ИУК,
н,
mi
н мшетина;
I) и течение 4-х недель, с интервалом в одну неделю определять
. I III'm массу каллусных тканей. По результатам взвешиваний
п т I |>«>п п. график роста каллусной культуры.
М шериалы и инструменты:
киллусные ткани;
мм тигельная среда МС, ИУК, кинетин, этиловый спирт.
UiiMiiHup, чашки Петри, пинцеты, препаровальные иглы, спиртовка.
Контрольные вопросы
I 11м тать основные способы культивирования каллусов?
' 11го такое дедифференциация и пролиферация клеток?
I 11см характеризуется основные фазы ростового цикла каллуса?
I
<Сличаются ли по морфологии каллусы различных видов
|НН 10НИЙ?
25
3 С у с п ен зи о н н ы е к у л ь т у р ы
Суспензионные культуры - это одиночные клетки, мелкие,
средние и крупные агрегаты (крупы клеток), выращиваемые в жидкой
питательной среде при постоянной аэрации (доступ кислорода) в
асептических условиях.
Суспензии используют для получения важных химических
веществ: органических кислот, ферментов, алкалоидов, красителей,
белков, аминокислот, которые применяются в фармакологии,
парфюмерии, пищевой и химической промышленности, сельском
хозяйстве. Суспензионные культуры имеют большое значение в
генетике и, особенно в молекулярной биологии: из суспензионных
клеток получают протопласты, необходимые для соматической
гибридизации, генетической инженерии, а так же для изучения
метаболизма клеток.
Суспензии в большинстве случаев получают из каллусов. Для
инициации суспензионной культуры необходимо 2-3 г свежей рыхлой
массы каллусных клеток на 60-100 мл жидкой питательной среды.
Первичную суспензию культивируют в колбах с жидкой питательной
средой на круговых качалках со скоростью 100-120 об/мин.
Модельная кривая рост суспензии имеет S-образную форму и
включает: лаг-фазу, экспоненциальную фазу, стационарную фазу и
фазу деградации. Форма реальных ростовых кривых отличается
продолжительностью фаз. Это зависит от генетики популяции,
количества инокулюма и состава питательной среды. Скорость
нарастания биомассы колеблется от 15 до 70 суток.
По плотности суспензии можно не только охарактеризовать
состояние
клеточной
популяции,
но и определить
время
субкультивирования (отбора инокулянта и пересадки на свежую
питательную среду). В большинстве случаев суспензию для
субкультивирования отбирают в конце экспоненциальной фазы (через
14-16 дней после начала культивирования). При пострбении кривой
роста показатели снимают через день. Плотность суспензии за 2-3
недели культивирования возрастает в 20 раз. Клетки суспензий
удобнее всего подсчитывать в специальных счетных камерах ФуксаРозенталя или Горяева. Для подсчета клеток суспензии иногда
используют временные препараты, но это более трудоемкий процесс:
значительно увеличивается число повторностей.
Объем выборки должен составлять не менее 1000 клеток.
Подсчет клеток затрудняется, если в суспензии преобладает фракция
агрегатов. В таких случаях к 1 объему культуры добавляют 2 объема
26
8 % оксида хрома и нагревают до 70 °С в течение 2-15 мин. После
охлаждения культуру встряхивают, чтобы распались агрегаты. Для
разрушения агрегатов в суспензию добавляют пектиназу - 0,25 %
объема.
Плотность суспензии можно определить и по соотношению
объема биомассы к общему суспензии. Измеряют средний объем
клетки и получают число клеток в 1 мл суспензии.
В зависимости от целей исследования условия культивирования и
состав питательной среды подбирают так, чтобы в суспензии
преобладала определенная фракция клеток. Особенно в суспензии
различают 4 основные фракции: одиночные клетки, мелкие агрегаты,
средние агрегаты, крупные агрегаты. Степень агрегированности
определяют, подсчитывая клетки в нескольких полях зрения на
временных препаратах под малым увеличением микроскопа (не менее
1000 клеток).
При работе с суспензиями необходимо учитывать и ее
жизнеспособность. О жизнеспособности клеток можно судить по
движению цитоплазмы, по степени проницаемости клеточной стенки
для красителей, по активности ферментов.
Прижизненные красители, такие как метиленовый синий, клетки
не убивают и через оболочки живых клеток в цитоплазму не
проникают. Суспензия считается жизнеспособный, если более 70 %
клеток не окрашиваются в синий цвет; агрегат жизнеспособен, если
более 50 % его клеток не окрасились.
Для количественного определения жизнеспособности суспензии
используют вещества, участвующие в метаболизме клетки;
флуоресцеиндиацетат
расщепляется
в
клетке
эстерезами
с
образованием флуоресцеина, дающего флуоресценцию цитоплазмы
живых
клеток.
Активность
эстеразы
определяют
на
спектрофотометре. Окрашивание клетки солями тетразоля позволяют
определить интенсивность дыхания клетки.
Работа
суспензий
№
1 Получение
и
культивирование
клеточных
Порядок работы:
1) в асептических условиях извлечь каллусы из пробирок,
стерильным скальпелем разделить их на кусочки размером 2-Змл;
2) с помощью препаровальных игл, кусочки каллуса перенести в
колбы, содержащие 100 мл жидкой питательной среды МС в
следующих вариантах:
27
вариант I - МС+2мг/л 2,4-Д;
вариант II - МС+10мг/л ИУК;
вариант III - МС+10 мг/л ИУК +0,1 мг/л Б АП;
вариант IV - МС без гормонов (контроль);
3) колбы с суспензиями поместить на круговые качалки при
100-120 об/мин и оставить на 2 недели;
4) отметить роста клеточных суспензий на различных по составу
средах и сделать выводы.
Материалы и инструменты:
- рыхлые каллусные ткани;
- среда МС, 2,4-Д, ИУК, БАЛ, этиловый спирт;
- ламинар, чашки Петри, колбы конические на 250 мл, пинцеты,
препаровальные иглы, качалка.
Работа № 2 Подсчет плотности клеточной суспензии
Порядок работы:
1) колбу с суспензией каллусных клеток встряхнуть и отобрать
пипеткой в пробирку 10 мл суспензии;
2) 1 мл суспензии смешать с 2 мл 8 % оксида хрома и поместить
на 15 мин в термостат при температуре 70 °С;
3) смесь пропустить 3 раза через шприц с толстой иглой
(пипетировать);
4) камеру Фукса-Розенталя (Горяева) заполнить суспензией,
подсчитать клетки под микроскопом;
5) плотность суспензии рассчитать по формуле:
Х = ( М х п х 1 000/3,2),
где X —число клеток;
М - среднее число клеток в камере;
N - разведение.
(3.1)
в
Материалы и инструменты:
- суспензия каллусных клеток;
- 8 % раствор оксида хрома;
- микроскоп, центрифуга, стерильная пипетка, предметные и
покровные стекла, камера Фукса-Розенталя (Горяева), фильтровальная
бумага.
28
Работа
суспензий
№
3
Определение
жизнеспособности
клеточных
Порядок работы:
1) аккуратно встряхнуть колбу, содержащую клеточную
суспензию;
2) пипеткой отобрать небольшое количество суспензии;
3) поместить каплю суспензии на предметное стекло, добавить
каплю 0,1 %-го раствора метилового синего, накрыть покровным
стеклом, излишки жидкости убрать фильтровальной бумагой;
4) поместить препарат на столик микроскопа и рассмотреть при
40 кратном увеличении;
5) определить процент жизнеспособных клеток. Окрашиваться
будут мертвые клетки.
Материалы и инструменты:
- клеточная суспензия;
- 0,1 % раствор метилового синего;
- микроскоп, предметные и покровные стекла, фильтровальная
бумага, дистиллированная вода, марлевые салфетки, пипетки.
Контрольные вопросы
1. Что такое суспензионные культуры, и каковы основные
способы их получения?
2. Как определить степень агрегированности и жизнеспособности
суспензии?
3. Как подсчитать плотность суспензии?
4. Каковы основные способы культивирования одноклеточных
суспензий?
29
4
тканей
Регуляция процессов морфогенеза в культуре клеток и
Фитогормоны - это биологические регуляторы роста и развития
растений, осуществляющие взаимодействие клеток, тканей и органов
стимулирующие
и
ингибирующие
морфогенетические
и
физиологические процессы в растительных организмах. Фитогормоны
влияют на деление и рост клеток растяжение, состояние покоя,
созревание, старение, формирование пола, устойчивость к стрессу,
тропизмы,
транспирацию:
обеспечивают
функциональную
целостность
растительного
организма,
закономерную
последовательность фаз индивидуального развития.
По химической природе гормоны растений подразделяются на
две группы: производные мевалоновой кислоты (гиббереллины,
абсцизины, брассины, фузикокцины, цитокинины), производные
аминокислот (ауксины - из триптофана, этилен - из метионина и
аланина). Биосинтез фитогормонов происходит в определенных
частях растений: в апексах побегов образуется ИУК - индолил-3уксусная кислота, лист служит донором ключевого продукта синтеза
гиббереллинов - каурена, а также абсцизовой кислоты, в апексах
корней синтезируется кинетин, а в зоне растяжения корня гиббереллины,
источником
зеатина
является
эндосперм
прорастающих семян.
По функциональному действию различают 5 основных групп
фитогормонов: ауксины, цитокинины, гиббереллины, абсцизины и
этилен. Ауксины в культуре тканей вызывают рост клеток
растяжением, в больших концентрациях - деление клеток, в сочетании
с цитокининами - органогенез. В биотехнологии применяют как
природные ауксины (ИУК), так и синтетические - ИМК (индолил-3масляная кислота), ИПК (индолил-3-пропионовая кислота), 2,4-Д
(2,4-дихлорфеноксиуксусная
кислота),
НУК
(нафтилуксусная
кислота).
°
Цитокинины в сочетании с ауксинами индуцируют митозы,
пролиферацию клеток, почек и побегов. К природным цитокининам
относятся:
зеатин,
кинетин
( 6-фурфуриламинопурин),
NN-дифенилмочевина (кокосовое молоко); к синтетическим - 6-БАП
( 6-бензиламинопурин).
Гиббереллины стимулируют рост клеток растяжением, а также
синтез ауксинов и цитокининов. В настоящее время известно около 60
видов гиббереллинов. В культуре ткани используется гибберелловая
кислота.
30
Абсцизины (АБК - абсцизовая кислота) и этилен ингибируют
ростовые процессы, деление клеток, в сочетании с цитокининами и
хлорхолинхлоридом
индуцируют
органогенез
(образование
микроклубней).
Гормональная система тесно связана с генетическим аппаратом
клетки. Фитогормоны не только влияют на степень метилирования
ДНК и таким образом регулируют экспрессию генов, но и
связываются с белками-репрессорами на опероне, что приводит к
активации структурных генов и синтезу определенных ферментов.
Следовательно, изменяя соотношение гормонов в питательных средах,
можно в какой-то степени изменять и генетические программы клеток
и тканей. Эти процессы известны как дедифференциация,
редифференциация и дифференциация клеток и тканей.
В растениях фитогормоны находятся в тесном взаимодействии
друг с другом: ИУК индуцирует синтез этилена и цитокининов,
ГК увеличивает содержание ИУК, цитокинины усиливают синтез
ИУК, но снижают содержание свободной АБК, этилен тормозит
транспорт ИУК и увеличивает содержание АБК.
В культуре ткани фитогормоны, добавленные в различных
концентрациях и соотношениях, регулируют синтез эндогенных
гормонов
растений,
что
проявляется
в
разнообразных
морфогенетических реакциях клеток и тканей.
В 1955 г. Скуг и Миллер предложили гипотезу гормональной
регуляции в культуре клеток и тканей, которая сейчас известна как
правило Скуга-Миллера: если концентрация ауксинов и цитокининов
в питательной среде относительно равны или концентрация ауксинов
незначительно
превосходит
концентрацию
цитокининов,
то
образуется каллус; если концентрация ауксинов значительно
превосходит концентрацию цитокининов, то формируются корни;
если концентрация ауксинов значительно меньше концентрации
цитокининов, то образуются почки, побеги.
Кроме того, фитогормоны способны изменять проницаемость
клеточных мембран. Под действием ауксинов и гиббереллинов
усиливается выброс протонов из клетки, что приводит к подкислению
клеточной стенки и ослаблению связей между целлюлозными
фибриллами в результате частичного кислотного гидролиза
пектиновых веществ. Поэтому клеточная стенка становится более
эластичной и под действием тургорного давления вакуоли клетка
приобретает способность к растяжению.
31
Работа №
моркови
1 Регенерация растений
из каллусной ткани
Порядок работы:
1) каллусные ткани с плотной структурой, полученные из
паренхимной ткани моркови в предыдущей работе, в стерильных
условиях извлечь из пробирок и разделить на кусочки размером 5 мм;
2) фрагменты каллуса пересадить на среду МС, оптимальную для
роста каллуса и культивировать при температуре 20-22 °С на свету с
16 ч фотопериодом с интенсивностью освещения 1000 лк. Спустя 2-3
недели в каллусных тканях появляются меристематические очаги,
имеющие зеленую окраску;
3) через 4-5 недель после пересадки начинается формирование
проростков. На 7 -8 неделе проростки или их группы отделить от
остальной
массы,
содержащей
каллус
и
пересадить
на
безгормональную среду, содержащую 1/2 солей среды МС, для
укоренения. Культуры инкубируют на свету с 16 ч фотопериодом с
интенсивностью освещения 3000 лк при 25-27 °С;
4) укоренившиеся проростки моркови по достижении ими длины
10—15 см перенести в специальную почвенную смесь. Для этого
растения поместить в дистиллированную воду на 10-15 мин во
избежание дегидратации и для удаления остатков питательной среды.
Трижды промыть дистиллированной водой и перенести в пластиковые
или торфяные горшочки диаметром 7-10 см на 1/3 заполненные
вермикулитом, смоченным питательной средой Гельригеля. Для
поддержания влажности проростки накрыть стаканами или
бумажными кулёчками и выставить на рассеянный свет;
5) периодически стаканы убирать и оставлять растения на
воздухе, для адаптации их к внешним условиям;
6) выращенные таким способом растения-регенеранты пригодны
для пересадки в открытый грунт.
Q
Материалы и инструменты:
- каллусы с плотной структурой, полученные из паренхимной
ткани моркови;
- питательные среды МС, Гельригеля, этиловый спирт,
стерильная дистиллированная вода;
- ламинар-бокс, термостат, световая комната;
- пинцеты, скальпели, препаровальные иглы, чашки Петри,
пробирки, стаканы,
парафильм, вата, алюминиевая
фольга,
32
пластиковые
вермикулит.
или
торфяные
горшочки
диаметром
Работа № 2 Индукция органогенеза
эмбриогенеза в каллусах табака
и
7-10
см,
соматического
Порядок работы:
1) стерильным пинцетом переложить каллусы на стерильную
поверхность стола ламинар-бокса;
2) стерильным скальпелем разделить на кусочки размером 5 мм;
3) поместить в колбы с питательными средами, содержащими
различные
наборы
фитогормонов для
индукции процессов
побегообразования,
корнеобразования,
соматического
эмбриоидогенеза;
4) колбы перенести в культуральную комнату с температурой
25±2 °С, влажностью воздуха 70 % и интенсивностью освещения
5 тыс. лк;
5) описывать порядок и сроки появления морфогенных структур
каждые 2 недели.
Материалы и инструменты:
- пробирка с каллусами табака;
среда МС с наборами фитогормонов для индукции
побегообразования,
корнеобразования,
соматического
эмбриоидогенеза, этиловый спирт;
- ламинар, стерильные пинцеты и препаровальные иглы,
спиртовка.
Контрольные вопросы
1. Что такое фитогормоны, и какие процессы в растительных
клетках и тканях они стимулируют?
2. Какие группы фитогормонов стимулируют и ингибируют рост
и развитие растений?
3. Как осуществляется гормональная регуляция в культуре клеток
и тканей?
4. Какова химическая природа фитогормонов, и в каких органах
растения они синтезируются?
33
5 Микроклональное размиоженмг ............ nil
оздоровленного посадочного мшериалн
и получение
5.1. Микроклональное ра шппжешн pm in iiill
Микроклональное размножение
ни м .т и и н г fire полое
размножение в культуре in vitro, при мнпрнм но i м, мм. ртчеиня
генетически
идентичны
исходной
ро/пн. и•■i«*•(! фирме
От
традиционных методов вегетативного рп .м т м .м и и рп. нчшй оно
отличается рядом преимуществ:
- получение большего числа копий hi миннмннмини ноиичесгва
исходного материала;
- возможностью отбирать in vitro pm пне ii.iti.ill мни’риал с
полезными признаками;
- возможностью получения оздороииещнч о (rte тирусного)
посадочного материала;
- возможностью вести размножение pmчений нм пронгжонии
всего года, вне зависимости от сезона;
- возможностью размножать растопим, к о то р ы е . iрудом или
вовсе не размножаются вегетативно, например пит.мм,
- получением, в зависимости от целей iu « иецоиишш, как
генетически однородного материала,
гаи и сомни помольных
вариантов.
Весь процесс микроклонального размножении ш и пи (чиделпть
на три стадии:
- индукция асептической культуры;
индукция
множественных
побегом
при
моторны х
пассированиях на среде для размножении;
- подготовка сформировавшихся in vitro рииемиИ к переносу в
открытый грунт.
В целом метод микроклонального размножении оеноимп на
индуцированном фитогормонами разрастании
иерчушечпых и
пазушных меристем, каждая из которых дает начало очагу побегов.
После формирования очага побегов, его разделяют ни fioiier мелкие
группы побегов, переносят на свежую питательную . рс.м\ и процесс
повторяется.
Скорость
микроклонального
размножения
иирьируп
в
зависимости от вида растения, но часто возможно иоиучип. из
единичной почки до миллиона растений в год.
Основными факторами, оказывающими влияние пи процесс
микроклонального размножения, является генотип
исходного
34
®
материала, тип экспланта и его физиологическое состояние, состав
питательных сред и условия культивирования.
Исходным материалом могут служить верхушечные и пазушные
меристемы стебля, молодые листья, элементы соцветия и цветка,
луковиц и клубнелуковиц. Наиболее подходящим материалом для
получения множественных побегов являются апикальные и пазушные
почки здоровых и активно растущих растений.
Микроклональное
размножение
пробирочных
растений
осуществляют с помощью черенкования. Такое размножение
основано на подавлении апикального доминирования и активации
пазушных меристем при удалении верхушки побега. Из пазушных
почек на питательных средах образуются побеги. Растения,
сформировавшие 5—6 листочков, в стерильных условиях извлекают из
пробирок и разрезают на части (отрезок стебля с листом и пазушной
почкой). Черенки высаживают на глубину междоузлия в питательные
среды либо без гормонов, либо с добавлением ауксинов.
Черенки культивируют в тех же условиях, что и в меристемы:
при температуре 24-25 °С днем и 19-20 °С ночью, освещенности 5-6
kL x и продолжительности фотопериода 16 ч.
Рост стебля и корней начинается на 3 -4 день после посадки на
питательную среду, а полностью растения формируется через 12-15
дней.
Каждое последующее черенкование проводят через 14-20 дней.
Из одного растения можно получить 5 -8 черенков, а через 2-3 месяца
- 3-5 тыс. черенков (рисунок 2).
35
I путь - активация развития существующих меристем; II путь индукция возникновения адвентивных почек; 1 — выбор исходного
экспланта; 2 - получение стерильной культуры; 3 - образование
адвентивных почек на первичном экспланте; 4 - рост почек и
формирование микропобегов; 5 - размножение микропобегов; 6
укоренение микропобегов; 7 - депонирование растений-регенерантов;
8 - акклиматизация растений к грунту
Рисунок 2 —Схема клонального микроразмножения растений
Нижнюю часть растения используют для ИФА. Растения,
зараженные вирусами, бракуют, а здоровые дают начало мериклонам
(меристематическим клонам).
Если почки или черенки высадить на питательные среды с
высоким содержанием цитокининов, то образуется конгломерат почек
и побегов. Полученные побеги легко отделяются друг от друга, их
можно либо укоренить, либо использовать для дальнейшего
микрочеренкования.
В качестве питательных сред в большинстве случаев использую i
различные модификации среды МС, хотя некоторые виды растении
могут иметь индивидуальные потребности в питательных вещестних
Культивирование можно проводить как на твердых, так и в жидких
питательных средах.
36
В зависимости от комбинаций условий культивирования
исходной ткани (состав питательной среды, температура, световой
режим) можно вызвать развитие пазушных почек, индуцировать
проявление
адвентивных
почек
или
стеблевых
побегов
непосредственно из клеток экспланта или из каллуса.
Для индукции множественных побегов in vitro в качестве
экспланта обычно используют верхушечные и пазушные почки, в
тоже время находит широкое применение культура апикальных
меристем. Следует различать понятия «апикальная меристема» и
«стеблевой апекс», определяя апикальную меристему как участок
стеблевого апекса. Несмотря на некоторые трудности в работе
(необходимость манипулирования эксплантами с минимальными
размерами, невысокий процент выживаемости в асептических
условиях), культура апикальных меристем широко используется для
получения оздоровленного свободного от патогенов посадочного
материала.
Для оздоровления растений используют культуру апексов или
культуру апикальных меристем, так как в стеблевой апекс вирусы
проникают медленнее, чем в другие части растений. При
культивировании апексов размножение вирусов подавляется реакцией
растительного организма на травму, вызванную отсечением
верхушки. Обычно на питательные среды высаживают небольшую
часть меристемы до 0,5 мм.
В целом закономерность такова: чем меньше величина
меристемы, тем больше вероятность получения безвирусных
растений.
Биотехнология позволяет получать безвирусный оздоровленный
посадочный материал практически всех сельскохозяйственных
культур. Наиболее полно разработана технология получения
безвирусного картофеля. Система первичного семеноводства и
оздоровления посадочного материала картофеля включало следующие
этапы: подготовка клубней для вычленения апикальных меристем,
вычленение апикальных меристем, регенерация растений из
меристем, адаптация растений-регенерантов в защищенном грунте,
получение первой продукции безвирусного материала в открытом
грунте, выращивание безвирусного посадочного материала в
первичных звеньях семеноводства, сохранение коллекции сортов.
В культуре тканей используются апексы верхушечных и боковых
почек. Чтобы исключить влияние метаболитов клубня на проростки и
повысить регенерационную способность исходного материала из
средней части клубня вырезают глазки с частью паренхимы (1.5 х 1.5
37
см). Глазки проращивают на песке, предварительно обработанном
сухим жаром. Этиолированные проростки выращивают в темноте при
температуре 25±2 °С, влажности воздуха 70-80 % . Песок дважды в
день увлажняют, через 7 -10 дней проводят подкормку раствором
Кнопа.
Апикальные меристемы проростков изолируют на 12-13
пластохроне, т.е. промежутке времени между инициациями двух
листовых бугорков. Изолированные меристемы культивируют в
асептических условиях на питательных средах с богатым
содержанием макро- и микросолей, с повышенной концентрацией
цитокининов ( 6-БАП 2 мг/л). В культуральной комнате с
кондиционированным воздухом поддерживают температуру 25±2 °С,
влажность воздуха 70 %, освещенность 5 кЬх и фотопериод 16 часов.
В среднем от посадки меристемы на среду до формирования
проростков с 5 -6 листочками проходит 30-45 дней, в некоторых
случаях от 2 до 8 месяцев. Среды по мере истощения обновляют, и
проростки периодически пересаживают на новые среды в стерильных
условиях.
Для укоренения растений, образовавшихся при микро
черенковании, их необходимо пересадить на новую питательную
среду. Черенки и побеги легко укореняются на средах с обеденным
составом минеральных солей (среда Уайта, МС, разбавленная вдвое),
либо на средах с добавлением ауксинов (ИУК, НУК, ИМК).
Проростки, сформировавшиеся в пробирках со средами, можно
рассматривать как небольшие укоренные растения, которые
необходимо адаптировать к обычным условиям выращивания. Такие
растения
лучше
пересаживать
в
грунт,
когда
полностью
сформируются 5 -6 листьев и достаточно разрастутся корни. Однако,
разные виды культурных растений, по-разному приспосабливаются к
изменению условий среды. Каждое растение требует специально
подобранных
условий
культивирования
в
грунте,
которые
устанавливают экспериментально.
Схема оздоровления посадочного материала от вирусов показами
на рисунке 3.
38
1 - инфицированное вирусом растение, 2 - сегменты стебля; 3 вычленение апикальной меристемы из пазушной почки; 4 культивирование апикальной меристемы; 5 - растение, развившееся
из апикальной меристемы; 6 - тестирование растений на присутствие
вирусов; 7 - размножение в культуральных условиях растения,
свободного от вирусов; 8 - размножение свободных от вирусов
растений в грунте
Рисунок 3 - Схема оздоровления посадочного материала от
вирусов
Работа № 1 Микрочеренкование in vitro побегов стахиса
Порядок работы:
1) стерилизация питательных сред и растительного материала
провидится по методикам описанным выше;
2) простерилизованные побеги стахиса разрезать на черенки
длиной 2 -4 см с одним или двумя листочками;
3) затем поместить в пробирки или колбы Эрленмейра твердой
питательной средой МС. Для появления бактериального заражения на
первом этапе культивирования в среду можно вносить антибиотики,
например,
канамицин.
Раствор
антибиотика
предварительно
простерилизовать через мембранный фильтр и внести в питательную
среду, охлаждённую до 40 °С;
4) культивировать при температуре 20-25 °С на свету с 12 ч
фотопериодом;
5) через 3 -4 недели от начала культивирования микрочеренки
укореняются и дают побеги. Полученные побеги можно размножать
путем микрочеренкования и выращивать на безгормональной среде
МС или содержащей низкие (0,1-0,2 мг/л) концентрации ИУК.
Материалы и инструменты:
- побеги стахиса;
- питательная среда МС, ИУК, этиловый спирт, диоцид,
хлорамин, стерильная дистиллированная вода;
- термостат, пинцеты, скальпели, колбы Эрленмейера на 250 мл,
пробирки, мембранный фильтр.
Работа № 2 Ускоренное размножение стахиса через культуру
адвентивных почек
Порядок работы:
1) первый этап - индукция адвентивных почек. Для этого
верхушечные и пазушные почки простерилизованных побегов стахиса
перенести в колбы Эрленмейера, содержащих 5 мл жидкой
питательной среды МС, дополненной 4 -6 мг/л БАП. Культивировать
на свету при температуре 20—25 °С в течение 2-3 недель. В
большинстве случаев данного времени достаточно для снятия
апикального доминирования. Начинается интенсивная пролиферация
адвентивных почек;
2) второй этап - формирование побегов. После 2-3 недель от
начала культивирования сформировавшиеся побег# вычленить ич
пролиферирующих адвентивных почек и пересадить в пробирки,
содержащие агаризованную питательную среду МС с концентрацией
2 мг/л БАП. На этой среде через 1-2 недели начинается интенсивное
образование побегов. Пассировать на свежую питательную среду
каждые две недели.
3) третий этап - укоренение побегов. Д тя укоренении
сформировавшиеся побеги пересадить в пробирки с 8 мл среды МС.
содержащей 0,1-0,2 мг/л ИУК. Полностью сформированные,
укоренившиеся растения высаживают в почву.
40
Материалы и инструменты:
- верхушечные и пазушные почки стахиса;
- растворы макро- и микроэлементов, витаминов для среды МС,
БАП, ИУК, этиловый спирт, стерильная дистиллированная вода;
- ламинар, термостат, бинокулярная лупа, пинцеты, скальпели,
препаровальные иглы, лезвия, чашки Петри, колбы Эрленмейера на
250 мл, пробирки, стаканы, парафильм, вата, алюминиевая фольга.
Работа № 3 Пролиферация побегов и микрочеренкование
стерильных проростков стахиса и стевин
Порядок работы:
1) в ламинар-боксе извлечь стерильные проростки стахиса и
стевии из пробирок;
2) побеги разделить на микрочеренки (междоузлие с почкой) и с
помощью стерильного пинцета посадить на глубину междоузлия в
пробирки с питательной средой МС, содержащей 2 -4 мг/л кинетина;
3) пробирки закрыть колпачками из фольги, поместить в штатив
и перенести в культуральную комнату;
4) культивировать на свету при температуре 20-25 °С в течение
2-3 недель;
5) сделать выводы о степени пролиферации побегов стахиса и
стевии.
Материалы и оборудование:
- пробирки с проростками стахиса и стевии;
- питательная среда МС, кинетин, этиловый спирт;
- скальпели, пинцеты, пробирки биологические.
5.2 Получение безвирусного посадочного материала
Микроклональное размножение имеет большое значения для
получения и размножения растений, оздоровленных от вирусов и
патогенных
микроорганизмов.
Многие
культурные
растения
настолько инфицированы вирусными, бактериальными, грибковыми
болезнями, что ежегодные потери урожая достигают свыше 20 %.
Бороться с болезнями растений только традиционными
химическими методами невозможно, т.к. жизнедеятельность многих
патогенов связана с метаболизмом клеток растения-хозяина. В
последнее время для получения оздоровленных растений успешно
применяют метод культуры апикальных меристем в сочетании с
41
тестированием
на
наличие
вирусов,
термообработкой
и
химиотерапией.
Принцип
метода
иммуноферментного
анализа
(ИФА)
заключается в следующем: к носителю с иммобилизованными
антителами добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген.
В процессе инкубации на первой стадии на твердой фазе образуется
специфический комплекс антиген-антитело. Затем носитель отмывают
от несвязавшихся компонентов и добавляют меченные ферментом
антитела. После вторичной инкубации и удаления избытка коньюгата
антител с ферментом определяют ферментативную активность
носителя, которая пропорциональна начальной концентрации
исследуемого антигена (рисунок 4). Активность фермента, т.е.
количество
образовавшихся
комплексов
антиген-антитело
пропорционально содержанию вирусов. На стадии выявления
специфического иммунокомплекса антиген оказывается как бы
зажатым между молекулами иммобилизованных и меченых антител,
что послужило поводом для широкого распространения в литературе
названия «сэндвич»-метод (англ. sandwich).
Для анализа используют полистероловые плата, в лунки которых
добавляют сыворотку и антитела, полученные на основе тестируемых
вирусов из крови млекопитающих.
Антитела адсорбируются на поверхности ячеек плата в течение
6 ч. Остатки сыворотки удаляют специальным буфером. Затем в лунки
вносят исследуемые вытяжки растений (сок листьев, клубней). При
наличии вирусного заражения образуется комплекс вирус-антитело,
Обязательно готовят контрольные плата без заражения. Послс
промывания буфером в ячейки добавляют антитела в комплексе с
ферментами: фосфатазой или пероксидазой. В присутствии вируса на
поверхности плата образуется комплекс антиген-антитело-фермеш
Если материал стерилен, комплексы не образуются, а остатки
фермента отмываются буфером. После всех описанных выше
манипуляций в лунки плата добавляют субстрат, на котором работае i
фермент (для фосфатазы необходимы эритроциты крови, которые
разрушаются в ее присутствии).
В результате реакции между ферментом и субстратом окраски
растворов в лунках плата изменяются в зависимости от степени
заражения вирусом: нет окраски - «-» - вирус отсутствует, светло*
коричневая окраска - «+» - среднее заражение вирусом, ярки
коричневая окраска —«++» - высокая степень заражения вирусом.
42
Но
Н о *
Н
о
S -c + o
ч
о
о 2
Н О
> -©
I - < о + > -®
|- < 0 > - о
| “ < 0 > ~ ® + />~® ■
Н
и
>нэ
| ■—< 0 > — 0
J
'
'
5) определение
ферментативной
Н о^~®
г< о
а) схема «сэндвич»-метода ИФА
>-
О,
о-®,
Ю. К ,
б)
к
- антиген, сп ециф ические и антивндовые
антитела соответствен но
~ к ом пон ен т, в к о т о р ы й введена
ф ерм ентная м е тк а
- им м об ил и зован ны й к ом пон ен т
условные обозначения, используемы в схеме
Рисунок 4 - Принцип метода иммуноферментного анализа
Для успешного тестирования вирусов необходимо создать
стандартные условия, использовать высококачественные антитела,
ферменты, плата.
В случае заражения посадочного материала вирусами применяют
термотерапию или химиотерапию. При термотерапии предварительно
клубни без бактериальных и грибковых инфекций тестирует ИФА.
Затем их размещают в кюветах со стерильным песком и проращивают
1-2 недели при температуре 28-30 °С 4 недели при температуре
37-3 8°С и влажности воздуха 70 %.
В случаях заражения растений мозаичными, веретеновидными,
нитевидными, палочковидными вирусами термическая обработка
малоэффективна.
Поэтому
дополнительно
используют
биотехнологические методы: метод апикальных меристем. Для этого
43
перед термообработкой верхушки растений картофеля срезают и
помещают на 5 ч в раствор гетероауксина (50 мг/л). Укорененные
проростки помещают в культуральные камеры или комнату с
температурой воздуха 37 °С, почвы - 30-32 °С, с фотопериодом 16 ч
на 4-6 недель.
Термообработку обычно проводят осенью и зимой. Весной из
растений вычленяют пазушные почки от 0,3 до 1 мм и высаживают на
питательные среды (МС без гормонов, pH 5,7). Режим тепловой
обработки для каждого сорта подбирают экспериментально.
Для химиотерапии используют специальные вещества
ингибиторы вирусов - ферменты, влияющие на нуклеиновые кислоты
(РНК-азы). Непосредственную обработку клубней ферментом можно
проводить методом инфильтрации в вакуумной камере в течение
20 мин, что приводит к большому расходу вещества. Поэтому
эффективнее добавлять РНК-азы в питательные среды для
культивирования апексов.
РНК-азы стимулируют рост и развитие растений из апексов и
ингибируют развитие вирусов. В результате применения такой
технологии выращивания на 10-35 % повышается приживаемость
меристем на питательных средах, на 30-40 % больше образуется
растений-регенерантов.
Современным
методом
диагностики
вирусов
является
полимеразная цепная реакция (ПЦР). Принцип метода ПЦР
заключается в выявлении фрагментов видоспецифичной ДНК
(рисунок 5).
Работа № 1 Культура апикальных меристем картофеля
Порядок работы:
1) предварительно прорастить клубни картофеля;
2) у клубней картофеля отделить проростки, на 1 мин погрузи ть и
70 % раствор этилового спирта, затем переносят на 15 мин в 15 %
раствор гипохлорита кальция с последующей f - x кратной промывкоН
в дистиллированной воде;
3) в ламинар-боксе под бинокулярной лупой из верхушечмм почек вычленить меристемы величиной до 1 мм, отсекая лезвием
примордиальные листочки. Изолированные меристемы перенести к
чашки Петри, содержащие 5 мл жидкой или твердой питательной
среды Миллера с пониженными в 2 раза концентрациями сахарозы и
фитогормонов;
44
4) меристемы инкубировать при температуре 20-25 °С с 12 ч
фотопериодом и интенсивностью освещения 1500 лк в первый месяц
культивирования. Через 3 -4 недели от начала культивирования
образуются каллусы;
5) каллусы пассировать на среду МС, дополненную 1-2 мг/л
Б АП, для индукции побегообразования и содержать при 12 ч световом
режиме, с интенсивностью освещения 5000 лк на протяжении второго
месяца культивирования;
6) сформировавшиеся из каллуса побеги, длиной до 3 см,
перенести на среду Уайта, содержащую 0,2-0,5 мг/л ИУК, для
укоренения. Через 2 недели формируется укоренившиеся растения,
которые можно пересаживать в грунт.
Материалы и инструменты:
- апикальные меристемы картофеля;
- питательные среды МС, Миллера, Уайта;
- БАП, ИУК, гипохлорит кальция, 70 % раствор этилового
спирта, стерильная дистиллированная вода;
- ламинар, термостат, бинокулярная лупа, пинцеты, скальпели,
препаровальные иглы, лезвия, чашки Петри, колбы Эрленмейера на
250 мл, пробирки, стаканы, парафильм, вата, алюминиевая фольга.
Работа № 2 Получение безвирусного материала методом
термотерапии в сочетании с культурой апикальных меристем
картофеля
Порядок работы:
1) здоровые клубни картофеля тщательно промыть проточной
водой;
2) клубни обработать стерилизующим раствором (спирт,
хлорамин), промыть стерильной водой;
3) вырезать глазки с частью паренхимы (1,5 х 1,5 см) и поместить
в кюветы для проращивания и термотерапии;
4) проростки поместить в термостат и инкубировать при 37 °С в
течение суток;
5) проростки, прошедшие термотерапию, поместить в 6 %
раствор хлорамина на 5 мин, промыть стерильной дистиллированной
водой;
6) в ламинар-боксе под микроскопом вычленить апикальные
меристемы и поместить их в пробирки с питательными средами;
45
7) инрммк i. \ in. I it mi ...............
I........ II m u ■i> |'«i. I'M iiiuiiliil ичен
ОПИСШШОМу И рдОо|* № I
Материалы и mu i румын М
- клубни К п р и м ||......I ............... I
.
111 *» .............'Н И Н И Н
термотерапию р тю ни им и,
- ниппельные ip.iu.i Mi
uni I* МI II' I
этилоного спирта, f> "и pm n«np ■,мнримимн,
- ламинар-Гюм i > 111101 . 1 -11 и.......... in p .,,...... M|,I
скальпели, препиронильмые hi им
и прошедшими
/(I
111
рпствор
, и’рильные
Работа .Nil .< I In п чеши Or ш ирмшн о mu и 'р м и т методом
химиотерапии и ................ * ih ii h pull 1niMini11.111.1t меристем
картофели
Порядок работы:
1) раствор РНК him профиль гроннп. ' 1 1 4 1 * 4 фиш.гр Чейца,
добавить в 100 мл среды МС и риншн. и ирнПирки *' шетывшей
стерильной средой до 0,5 см;
2) простерилизоннть npopoem i 1. и|>i<м|м-<iи н о "и хлорамине
5 мин;
водой и
3) проростки промыть стерильной нн ... ........... ...
поместить стерильные чашки 1 1 етри;
4) в условиях ламинар-Сюксп под микроскопом вычленить
апикальные меристемы и п о м е с т и , ни среды бот ф ер м ен т (контроль)
и с ферментом (опыт);
5) пробирки с меристемими п еренеаи и культуральную комнату;
6 ) порядок культивирования апикальных мери*чем аналогичен
описанному в работе № 1 ;
7) сравнить результаты эксперимента с контролем.
Материалы и инструменты:
- проростки картофеля;
- питательные среды МС, Уайта, Б АП, ИУК, раствор РНК-азы
(0,01Н), 70 % раствор этилового спирта, 6 % раствор хлорамина;
- фильтр Зейтца, стерильные скальпели, препаровальные иглы,
пинцеты.
46
Работа
№
4 Тестирование растительного
материала
картофеля на содерж ание вирусов PVS, PVM , PV A, PVY, PLRV
методом И Ф А
а) Подготовка к анализу:
1) для проведения ИФА отобрать листовой материал, ростки
клубней длиной 1 - 2 см или пробирочные растения;
2 )
отобранные пробы измельчить до кашицеобразного
состояния в ступке, отжимают сок прессом;
б) приготовить рабочие растворы из набора реактивов для ИФА:
1 ) покровный буфер: содержимое флакона «покровный буфер»
растворить в 1 0 0 см 3 дистиллированной воды;
2 )
антитела: 0 , 1 см 3 концентрированного раствора антител
развести в 10 см 3 покровного буфера. Для приготовления
концентрированного раствора антител сухое содержимое флакона с
этикеткой «антитела» растворить в 1 см 3 покровного буфера;
3) промывочный буфер: содержимое флакона с этикеткой
«промывочный буфер» растворить в 2 дм 3 дистиллированной воды,
добавить 0,5 см 3 детергента на 1 дм 3 буферного раствора;
4) буфер для проб и разведения коньюгата: к 250 см 3
промывочного буфера добавить 1 , 0 г бычьего сывороточного
альбумина;
5) коньюгат: 0,02 см 3 концентрированного раствора из флакона
«коньюгат» смешать с 1 0 см 3 пробно-коньюгатного буфера;
6 )
положительный
контроль:
содержимое
флакона
«положительный контроль» растворить в 1 см 3 пробно-коньюгатного
буфера;
7) субстратный буфер. 1 объем буферного концентрата из
флакона
«субстратный
буфер»
разбавить
4
объемами
дистиллированной воды. В 10 см 3 буферного раствора растворить 4 мг
содержимого флакона «субстрат»;
8 )
одну таблетку перекиси водорода растворить в 2 0 см 3
дистиллированной воды. К 10 см 3 раствора добавить 0,05 см 3 раствора
перекиси водорода;
в) сок или измельченную ткань развести буфером для проб и
коньюгата в соотношении 1 : 1 0 .
Проведение анализа:
налить по 0 , 1 см 3 рабочего раствора антител в лунки платы,
накрыть ее крышкой и инкубировать в течении 15-16 ч при
температуре 4 °С или 2 ч при температуре 37 °С в термостате;
47
- удалить раствор из платы резким переворачиванием и
вытряхиванием;
- трижды промыть лунки промывочным буфером;
- тщательно удалить раствор из лунок легкими ударами
перевернутой платой по листу фильтровальной бумаги;
- в лунки платы нанести по 0 , 1 см 3 жидкости: в одну из лунок
внести «отрицательный» контроль, в другую «положительный», в
остальные - разведенный буферный экстракт анализируемых проб;
- накрыть плату крышкой и инкубировать 1 ч при 37 °С;
- лунки промыть промывочным буфером трижды;
- налить 0 , 1 см 3 рабочего раствора коньюгата в лунки платы,
накрыть крышкой и инкубировать 1 ч при 37 °С;
- лунки промыть промывочным буфером пять раз;
- налить по 0 , 1 см3 субстрата в лунки и инкубировать при
комнатной температуре в течение 5 -1 0 мин для развития окраски,
после чего реакцию остановить добавлением в лунки по 0,50 см 3
трёхморного раствора серной кислоты;
- наличие вирусной или бактериальной инфекции определить по
интенсивности окрашивания в лунках плат с помощью фотометра при
длине волны 490 нм или визуально.
При фотометрической оценке результатов получают числовые
значения оптической плотности (А 4 9 0 ) окрашенного продукта п
оптических
единицах.
Порог
достоверности
положительных
результатов (Р) вычислить по формуле:
Р = X + ЗЕ,
(5.1)
где X - среднее значение А 4 9 0 отрицательного контроля;
ЗЕ - тройное значение максимального отклонения А4 9 0 <я
среднего в отрицательном контроле.
Все значения А 4 9 0 выше значения "порога достоверности
положительных
результатов
(Р)
считают
положительными
результатами.
При визуальной оценке, дающей информацию «да» или «не i
применяют следующую шкалу:
- вирус отсутствует - едва заметное окрашивание (как н
отрицательном контроле);
- материал сильно заражен - слабое, но заметное окрашивание,
отличное от отрицательного контроля;
- материал сильно заражен - более интенсивное окрашивание.
48
Материалы и инструменты:
- полистирольные 96-луночные микроплаты;
- пипетки-дозаторы объемом 0,002-0,02 см3, 0,02-0,2 см3,
0,2-1,0 см3;
- пипетки стеклянные вместимостью 1-10 см3;
- ступку фарфоровую диаметром 5 см;
- фотометр;
- набор реактивов для ИФА;
- приспособление для отжатия соков, пресс электрический,
ножной или ручной;
- посуду мерную вместимостью 1; 0,5; 0,2; 0,1; 0,05; 0,01 дм3;
- весы аналитические;
- термостат;
- холодильник бытовой.
Р абота № 5 Диагностика вирусной патологии методом ПЦР.
П одготовка проб к анализу
Отбор образцов для исследования проводят таким образом,
чтобы не происходила перекрестная контаминация (загрязнение
одного образца другим). Для этого отбор проводят в перчатках, а
инструменты, применяемые для отбора и измельчения материала,
используют однократно или обрабатывают моющими средствами и
стерилизуют в пламени спиртовки при переходе от пробы к пробе.
Отбор проб проводят в чистую стеклянную или пластиковую посуду
или одноразовые пластиковые пакеты.
Порядок работы:
1) от доставленной пробы отобрать не менее 10 навесок
(5-10 каждая) в одноразовый полиэтиленовый пакет и перемешать
при помощи одноразового шпателя, формируя объединенную пробу
(50-100 г);
2) в одноразовую, герметично закрывающуюся пробирку или
контейнер отобрать около 10 г объединенной пробы, создавая
среднюю пробу, промаркировать;
3) перед началом исследования пробу поместить в фарфоровую
ступку и растереть фарфоровым пестиком до однородного
мелкодисперсного, гомогенного состояния;
4) с целью получения лабораторной пробы для выделения ДНК
при помощи одноразового шпателя отобрать от гомогенной средней
пробы 75-100 мкл материала, поместить его в одноразовую пробирку
вместимостью 1,5 см3, промаркировать;
49
5) пробу использовать для выделения ДНК;
Работа № 6 Д иагностика вирусной патологии мсюдом ПЦР.
Вы деление Д Н К
Сущность методики заключается в том, что нся /I I IK, полученная
в результате клеточного лизиса, связывается с сорбентом и в таком
состоянии проходит стадии отчистки, а затем при помощи элюции
переводится в раствор.
Порядок работы:
1) содержимое флаконов с ОБ1 и ОБ2 перенести в мерные
цилиндры и довести объем до 50 см3 96 %-ным этиловым спиртом;
хранить рабочие растворы с ОБ1 и ОБ2 в плотно закрытых флаконах
при температуре 4 °С в течение года;
2) в пробирку с подготовленной пробой вносят 400 мкл ЛБ и
прогомогенизировать;
3) пробу инкубировать в термостате 30 мин при температуре
65 °С;
4) содержимое пробирки перемешать на вортексе; пробу
процентрифугировать на высокоскоростной центрифуге 10 мин при
8000 об/мин;
5) надосадочную жидкость полностью отобрать с помощью
автоматического дозатора, не задевая осадка, и перенести в чистую
микропробирку вместимостью 1,5 см3, меняя наконечники при
переходе от пробы к пробе;
6) к надосадочной жидкости добавить 40 мкл суспензии сорбента.
Перед использованием сорбент перемешать на вортексе до получения
однородной суспензии. Содержимое микропробирки перемешать на
вортексе и инкубировать при комнатной температуре 7 -1 0 мин,
периодически перемешивая содержимое путем переворачивания
плотно закрытой пробирки 2 -3 раза. Содержимое микропробирки
процентрифугировать на высокоскоростной центрифуге 10 с при
10000 об/мин. Надосадочную жидкость полностью удалить при
помощи автоматического дозатора;
7) к осадку добавить 500 мкл рабочего раствора ОБ 1.
Содержимое пробирки сначала перемешать на вортексе до получения
однородной суспензии, а затем процентрифугировать 20 с при 2000
об/мин. Надосадочную жидкость полностью удалить при помощи
автоматического дозатора;
8) к осадку добавить 500 мкл рабочего раствор ОБ 2. Содержимое
пробирки сначала перемешивают на вортексе до получения
50
®
однородной суспензии, а затем центрифугируют 20 с при 2000 об/мин.
Надосадочную
жидкость
полностью
удалить
при
помощи
автоматического дозатора;
9) повторить операции, изложенные в п.7. В последний раз
надосадочную жидкость удалить как можно более полно, не задевая
при этом осадка;
10) микропробирку открыть, осадок высушить в термостате 5-7
мин при температуре 65 °С. К высушенному осадку добавить 75 мкл
ТЕ-буфера, перемешивают содержимое пробирки на вортексе до
получения однородной суспензии и термостатировать 10 мин при
температуре 65 °С;
11) содержимое микропробирки повторно перемешать на
вортексе и процентрифугировать на высокоскоростной центрифуге
2 мин при 10000 об/мин;
12) надосадочную жидкость (экстракт ДНК) перенести в чистую
микропробирку, не задевая при этом осадка. Полученный экстракт
ДНК передать на этап проведения амплификации. При необходимости
хранить при температуре 4 °С в течение 1 месяца или при температуре
минус 18 °С до 1 года;
13) в чистую микропробирку отобрать 30—80 мкл ТЕ-буфера и
передать на этап проведения амплификации для постановки
контролей амплификации.
Работа № 7 Д иагностика вирусной патологии методом ПЦР.
К ачественн ое определение ф рагм ентов видоспецифичной
Д Н К с использованием набор реагентов для П Ц Р с жидкими
праймерами
Для выявления фрагментов видоспецифичной ДНК используют
набор реагентов для ПЦР, содержащей праймеры, специфичные к
ДНК определенного вида.
Порядок работы:
1) в штативе размесить и промаркировать необходимое число
микропробирок с лиофильно высушенной амплификационной смесью
по
числу
анализируемых
проб,
включая
пробирки
для
положительного и отрицательного контроля;
2) в каждую пробирку с ПЦР-смесью при помощи
автоматического дозатора последовательно внести 10 мкл ПЦРрастворителя и 5 мкл смеси праймеров для выявления конкретного
фрагмента видоспецифичной ДНК. Перед использование смесь
праймеров необходимо разморозить в твердотельном термостате с
51
охлаждением при температуре 4 °С, перемешивая на нортексе 5 10 с,
а затем собрать осаждением на дно микропробирки путем
центрифугирования на вортексе 3 -5 с. Последующую работу с
праймерами рекомендуется проводить при температуре от 2 °С до
4 °С с использованием твердотельном термостате с охлаждением,
3) в микропробирку с ПЦР-смесью для отрицательного
контрольного образца внести 5 мкл ТЕ-буфера; затем в
микропробирки с ПЦР-смесью добавить по 5 мкл экстракта ДНК
каждого из исследуемых образцов. В последнюю очередь в
микропробирку с ПЦР-смесью для положительного контрольного
образца внести 5 мкл К+ из используемого набора реагентов для
проведения ПЦР;
4) содержимое микропробирок растворить путем легкого
перемешивания на вортексе. Собрать осаждением капли ПЦР-смеси
со стенок микропробирок путем центрифугирования на вортексе в
течение 3 -5 с;
5)
если
для
проведения
амплификации
используется
амплификатор без нагреваемой крышки, то в каждую микропробирку
добавить по 20-25 мкл (2 капли) минерального масла;
6) плотно закрытые микропробирки процентрифугировать на
вортексе при 2000 об/мин и поместить в амплификатор по программе,
указанной в таблице 1. По окончании действия программы пробирки
извлечь из амплификатора и в штативе передать на этап детекции
продуктов ПЦР.
Таблица 1 - Программа амплификации фрагментов видоспецифичной
ДНК
____________________________________________ __________ _
Этапы
программы
1
2
3
Режим амплификации
Температура, °С
Время, сек
94
180
94
45
70
30
72
40
72
240
52
Процесс
Денатурация
ДНК
Денатурация
ДНК
Отжиг
праймеров
Синтез ДНК
Синтез ДНК
Число
циклов
1
35
1
Работа № 6 Диагностика вирусной патологии методом ПЦР.
Детекция
продуктов
амплификации
фрагментов
видоспецифичной ДНК методом электрофореза
Детекцию продуктов амплификации проводят при помощи
метода «Детекция продуктов амплификации в агарозном геле».
Реагенты, для проведения детекции собраны в специальный набор.
Подготовку прибора для горизонтального электрофореза проводят в
соответствии с прилагаемым к нему техническим описанием.
Порядок работы:
1) содержимое пакета с надписью «Буфер для электрофореза»
полностью перенести в колбу вместимостью 1000 см3, растворить в
600-800 см3 дистиллированный воды и довести объем полученного
раствора до 1000 см3 дистиллированной водой. Буфер хранить в
течение года при комнатной температуре;
4) разместить прибор для горизонтального электрофореза на
столе и с помощью регулируемых по высоте ножек, ориентируясь по
уровням, установить прибор в фиксированное, строго горизонтальное
положение;
5) собирать кювету для заливки геля и установить в нее 1-4
гребенок (в зависимости от количества анализируемых проб) так,
чтобы расстояние между зубцами соседних гребенок и одной из
стенок кюветы составляло не менее 2 см;
6 ) содержимое одного из пакетов с надписью «Агароза»
полностью перенести в коническую термостойкую стеклянную колбу
вместимостью 250 см3, добавить 150 см3 готового раствора буфера
(концентрация геля —1,5 %). Суспензию агарозы в колбе довести до
кипения в СВЧ-печи (при средней мощности), периодически
помешивая, и продолжают нагревать до совершенно прозрачного
состояния (1 мин);
7) агарозу охладить до температуры от 55 °С до 60 °С, добавить
10 мкл раствора бромистого этидия (аккуратно перемешивая), а затем
налить в кювету для геля прибора для электрофореза, не допуская
образования воздушных пузырьков, так, чтобы толщина геля была не
менее 5 мм, а зубцы гребенок были погружены в него не менее чем на
4 мм;
8 ) после полного застывания геля (15-20 мин) из геля осторожно
извлечь гребенки так, чтобы не повредить образовавшиеся карманы.
Кювету с готовым агарозным гелем перенести в электрофорезную
камеру прибора;
53
9) в кам еру для электрофореш шипи. ............ill рас ш ор буфера
для электрофореза так, ч т О ы жидкое п. ................................ . ю илистину
слоем 2 - 3 мм;
10) отбирать 1 мкл продуктом I II 1,1' и oi ю р " * но nnei hi и карман
гелевой пластины. При этом с л е д у п * ш ........
. и нмощиИ порядок
внесения проб: сначала
содерж имое ироьнр! и * I . пнем исследуемые пробы в строго ф т и ........................... 'и аонще.м.посги, и в
последнюю очередь - содержимое мроПиркм . | i
)цскгрофорез
ПРОВОДЯТ При напряжении 10 50 И и 1е'|е||Ие ,'(( in мин. при этом
красящий компонент IIЦР емееи i «>м%.................... i..
н ироциинуться
не менее чем на 1 см от старта;
11) по окончании э л е к т р о ф о р е з п н номощинн ни (|>ильтр
трансиллю минатора сисномы для нокумеширомнннч i •• чеП и проводят
учет полученны х результатом и \ ii.i рафпонешмом eiieie е длиной
волны 312 нм. Регистрацию И ДОК\МеШИрОИИИИе полученных
результатов
путем
занесении
и fm i\
miim.iv.
компью тера
осущ ествляю т при помощи системы чип чотличиироиинии гелей в
соответствии с прилагаемы м к ней гсхмн'мп h i m они. анием
В продуктах амплификации п олож ш ещ .н ощ uom ponu наборов
для определения фрагментом мидосиецнфичиоИ ДНК должна
присутствовать одна яркая и четким i i o i m i a
специфический
фрагмент.
В пробирке с К- лю бого щ набором him I II 1.1" не должны
присутствовать как специфические, так и не специфические
фрагменты.
П олож ительны м и, то eci i. содерж ащ ими ш i...м i.111 i|ipai м е т ДНК,
считаю тся пробы , содерж ащ ие снетмщиет м ............. pm нопоженные на
таком
же
расстоянии
от
точки
с input,
чн>
и
полоса
соответствую щ его К+.
М атериалы и инструменты:
- П Ц Р-бокс, вортекс, ам п лиф икаю р, кам ера г ш пр.ни’ нения гельэлектрофореза, детектор;
- агарозны й гель, праймеры ДНК, р е а к п т м .... мыделения,
амплификации ДН К.
54
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Геномная Д НК
SSSSL
■ *' I F ' I' г*^' I \ 11 I I ~г
этап отжига праймеров (54‘С)*
I [" "Г " 1— 1— 1— I— г н — I— I— I— г
Н---Ч—f- I
I---1---(-
этап синтеза (72’С )
-I— e e V ..I ._ L ..../..... ................... I ...... i ..... i„*—
♦•г.........I________________
Второй цикл
амплификации
Наработка
длинных
фрагментов
3Tan ленатураш ш (94-C)
" .I'." " 1" “ V " T " ” I-----Г ^ т -
П— J 7 I T "
*•(»**
-0-
этап отжига праймеров (54‘С)
' I, ч ' ..'...
"*■ .......... .......... 'Л*
............. *1#в<
I
T ./ l f r .,,,. {
. ,1............ 1 . . .
этап синтеза (72*С)
I
I------ L_
ф •• •СТ^ТГТТТТГГТГГмТГТТГм^ТТТГП^^ЗТ»^
—
3—30-й д а й
амплификации
I
1
s s s s p v .
........<................ f ........... Г...........f » i
Наработка
(амплификация)
нужного
фрагмента Д Н К
К оличество Д Н К амплифицируемого фрагмента 2 , где п — количество циклов
— Фрагмент гена npt / /
. . . ♦ праймер А
_
.
г,
*■ п ”3'" лс<’ В
‘температура отжига
расчитывается для
каждой пары
праймеров
Рисунок 5 - Схема полимеразной цепной реакции
К онтрольны е вопросы
1. Что такое микроклональное размножение растений: Основные
этапы?
2. Каковы основные способы микроклонального размножения?
3. Как получить безвирусный посадочный материал?
4. Какой из способов получения безвирусного посадочного
материала вы бы предпочли в своей работе?
5. Принцип проведения ИФА.
6. Принцип проведения ПЦР.
55
6 Культура гаплоидных клеток
Гаплоиды - это растения, в клетках соматических тканей в
которых содержится половинный набор хромосом.
Экспериментальное
получение
гаплоидов
традиционными
методами селекции (внутривидовая и межвидовая гибридизация,
задержка опыления, опыление полученной пыльцой и др.)
малоэффективно и требует больших затрат времени. Использование
таких приемов как культивирование in vitro мужского и женского
гаметофитов намного облегчают и ускоряют получение гаплоидов.
Однако все методы получения гаплоидов основаны на аномальном
протекании процессов микро- и макроспорогенеза, развития
пыльцевых зерен, зародышевого мешка, зародыша и тесно связаны с
явлением апомиксиса.
Процесс
поучения
гаплоидных
растений
в
культуре
изолированного мужского гаметофита андрогенезом in vitro.
Основной интерес к гаплоидам связан с возможностью их
использования для ускоренного получения гомозиготных растений. У
гаплоидов легче выявить и отобрать ценные мутации, затем путем
удвоения у них набора хромосом закрепить полученные полезные
признаки. Такой способ получения гомозиготных линий открывает
большие перспективы для селекции растений, т.к. отпадает
надобность проведения длительного цикла инбредных скрещиваний
для их получения. Кроме того гаплоидия может широко применяться
при количественном генетическом анализе возделываемых растений,
включающем изучение взаимодействия генов и генетической
изменчивости, определение групп сцепления, установления числа
генов, действующих на количественные признаки.
Пыльцевые зерна, запрограммированные ни гаметофитный путь
развития, в условиях in vitro переключаю гея на спорофитный, что дает
уникальные преимущества при изучении процессов деления и
дифференцировки клеток.
В настоящее время почти у 300 видов растений получены
регенераты или каллусная ткань в культуре пыльников. В условиях
культуры индукция роста и развития микроспор может протекать
двумя путями - прямым и непрямым. В первом случае, >мбриоиды
образуются непосредственно из микроспор, во втором случае через
образования каллуса и индуцирования в нем органогенеза. В обоих
случаях это происходит совершенно отлично 0 1 гою, как это
осуществляется в естественных условиях. Образование мужских гамет
блокируется после 1—2 деления генеративной клетки, в то время как
56
вегетативная клетка делится подобно зиготе
эмбриоидам или каллусной ткани (рисунок 6, 7).
Пыльца
со сливш имися
ядрами
и
дает
начало
Ц • диплоид
Рисунок 6 - Схема развития микроспоры по спорофитному пути с
образованием эмбриоидов или каллусной ткани
57
Дигаплоидо-;
о .о о о
Г -» 1
f
f
Гаплоид
J
(п)
ft
О дноядерная
микроспора
\_ i_ j
О рганогенез
Регемераци»
п, 2п. Зл
Рисунок 7 - Гаплоидная технология
Показано, что более желателен прямой андрогенез, при котором
пыльца ведет себя аналогично зиготической клетке и проходит ряд
этапов эмбриогенеза, вплоть до формирования растеньиц на
пыльнике. В случае регенерации растений из каллуса, не все растения
будут иметь гаплоидный набор хромосом.
Иногда ошибочно считают, что полученные растения-регенераты
всегда гаплоидны, однако это не совсем правильно, так как на ранних
стадиях
культивирования
может
произойти
спонтанная
мультипликация генома микроспор или же начало новообразованиям
могут дать соматические клетки стенки пыльника.
Установлено что продуктивность андрогенеза in vitro зависит от
многих взаимосвязанных факторов. Необходимым условием для
успешной индукции андрогенеза является определение стадии
развития микроспор в пыльниках. Оптимальной стадией развития
мужского гаметофита для введения в культуру пыльников, у
большинства злаков является стадия одноядерной микроспоры
(рисунок 7). Для пшеницы и ячменя указанная стадия развития
микроспоры соответствует фазе выхода флагового листа из верхушки
главного стебля. Однако такой способ определения стадия развития
пыльцевых зерен не всегда надежен, т.к. морфологические признаки
растений могут меняться в зависимости от условия выращивания.
58
Поэтому обязателен дополнительный цитологический анализ возраста
микроспор.
К факторам, оказывающим благоприятное влияние на развитие
микроспор in vitro, относится холодовая предобработка растений,
колосьев и пыльников. Установлено, что низкие положительные
температуры способствуют синхронизации деления и повышают
жизнеспособность пыльцевых зерен. Такая
предварительная
предобработка может быть применена к колосьям, колоскам или даже
изолированным пыльникам. К сожалению, не существует стандартной
предварительной обработки, которую можно было бы рекомендовать,
поэтому для каждого вида растений необходимо определить
оптимальную температуру и время инкубации.
Работа № 1 Определение стадии развития микроспор в
пыльниках пшеницы и ячменя
Порядок работы:
1) срезать колосья пшеницы или ячменя, находящиеся в конце
фазы трубкования, когда флаговый лист выходит из верхушки
главного стебля (материал желательно отбирать в утренние часы.);
2) из колосьев, с помощью пинцета, вычленить колоски,
расположенные в средней его части и под бинокулярной лупой,
предварительной иглой, отделить пыльники;
3) выделенные пыльники зафиксировать в фиксаторе ФАА в
течение 2-4 ч. Для лучшего качества фиксации, фиксатор охладить до
температуры 10-15 °С;
4) после окончания фиксации, материал промыть в нескольких
порциях воды, до исчезновения запаха уксусной кислоты;
5) пыльники при помощи препаровальной иглы поместить на
предметное стекло и нанести 1 -2 капли 3 % раствора ацетокармина
для окрашивания. Если окрашивание препарата получилось
насыщенным, то его осветляют внесением 1-2 капель 5 % уксусной
кислоты;
6) для высвобождения микроспор из пыльника, кончиком острого
скальпеля или лезвия разрезать его на две половинки вдоль или
поперек и легким надавливанием на стенки пыльника пыльцу
выдавить в окружающую их среду;
7) стадию развития микроспор определяют под микроскопом при
10-20 кратном увеличении.
Мужской гаметофит большинства злаков, находящийся на
одноядерной стадии развития имеет следующие характеристики:
59
микроспора увеличена в размере, имеет хорошо развитую оболочку
(экзину), содержит одну большую вакуоль, цитоплазма разрежена,
ядро расположено между вакуолью и внутренней оболочкой
(интиной).
Материалы и инструменты:
- растения, находящиеся в фазе позднего трубкования, пыльники;
- фиксатор ФАА, 3 % раствор ацетокармина, 5 % раствор
уксусной кислоты;
- бионокулярная лупа МБС-10, микроскоп, ножницы, скальпели,
бритвенные лезвия, пинцеты, препаровальные иглы, стеклянные
стаканы объемом 25 мл, баночки из-под пенициллина.
Работа № 2 Холодовая предобработка пыльников пшеницы и
ячменя
Порядок работы:
а)
предобработку растений доноров и эксплантов можно
проводить различными способами:
1) центральные побеги донорных растений находящихся на
стадии трубкования срезать у основания, отметить этикеткой и
поместить в сосуды с водопроводной водой. Сосуды перенести в
холодильник, куда для контроля за температурой поместить
термометр. Для пшеницы оптимальным является выдерживание
материала в течение 3-7 суток при температуре 7 °С. После этого
срезать колосья, обработать их стерилизующим агентом, тщательно
промыть стерильной дистиллированной водой и в ламинаре выделить
пыльники;
2) колосья, отобранные у растений доноров задолго до
соответствующей для культивирования стадии развития микроспор,
срезать на 4-5 см ниже основания, поместить каждый в отдельности в
коническую колбу объемом 100 мл, содержащую только минеральную в
основу среды МС. Во избежание испарения питательной среды, горло
колбы закрыть ватным тампоном, с проделанным отверстием для
соломины колоса. Колбы с изолированными колосьями инкубировать
при 16 ч фотопериоде с интенсивностью освещения 20 ООО лк и
температуре 12 °С до наступления оптимальной фазы развития
пыльцевых зерен. После, колбу с колосом перенести в холодильник,
где поддерживается температура 4-7 °С на 14-21 суток;
3) срезанные колосья стерилизовать в 70 % растворе этилового
спирта в течение 3 мин, трижды промыть стерильной
60
дистиллированной водой. Затем в ламинаре под бинокулярной лупой
выделить пыльники и поместить их в чашку Петри (по 20-30 шт.)
диаметром 20 мм, во вторую чашку такого же диаметра наливают
2-3 мл стерильной воды. Обе чашки с открытыми крышками
перенести в чашку Петри большего диаметра - 90 мм, закрыть
крышкой, запечатать липкой лентой (парафильмом) и хранить в
холодильнике в течение 3-4 суток при температуре 4 °С.
Материалы и инструменты:
- целые побеги, колосья, пыльники пшеницы и ячменя;
- минеральная основа питательной среды МС;
- ламинар, бинокулярная лупа, ножницы, стаканы на 500 мл,
конические колбы на 100 мл, чашки Петри диаметром 20, 90 мм,
парафильм, ватные тампоны.
Работа № 3 Индукция андрогенных структур в культуре
пыльников пшеницы и ячменя
Порядок работы:
1) колосья, прошедшие холодовую предобработку поместить на
3 мин в 70 % раствор этилового спирта;
2) после промыть в 3-х порциях стерильной дистиллированной
воды;
3) с помощью пинцета отделить колоски из средней части колоса
(3-5 колоски от основания колоса);
4) под бинокулярной лупой раскрыть покровные чешуйки колоса
и с помощью препаровальных игл вычленить по 3 пыльника из
каждого колоска;
5) пыльники препаровальными иглами перенести в пробирки (по
15-20 шт. в каждую) или чашки Петри (по 60-80 шт. в каждую),
содержащие агаризованную питательную среду № 6 дополненную
1 мг/л 2,4-Д + 0,5 мг/л кинетина или 5 мг/л ИУК + 1 мг/л БАП;
6) инкубировать в темноте при температуре 25-27°С до
появления андрогенных структур;
7) через 3-4 недели от начала культивирования, по мере
появления андрогенных структур (глобулы, эмбриоиды) и достижения
ими размеров 1 -2 мм перенести их на среду без фитогормонов и
культивировать на свету с 16 ч фотопериодом и интенсивностью
освещения 5 тыс. лк, для регенерации растений;
8) зафиксировать время и интенсивность появления андрогенных
структур.
61
Материалы и инструменты:
- колосья пшеницы или ячменя, прошедшие холодовую
предобработку, пыльники;
- питательная среда № 6, 2,4-Д, ИУК, кинетин, БАП, 70 %
раствор этилового спирта;
- бинокулярная лупа, препаровальные иглы, пробирки, чашки
Петри диаметром 40-60 мм.
Работа № 4 Культура изолированных микропор пшеницы и
ячменя
Порядок работы:
1) простерилизовать колосья в 7 % растворе гипохлорита кальция
в течение 8 -10 мин. и ополоснуть в 3-х порциях стерильной
дистиллированной воды;
2) отделить колоски от колоса и под бинокулярной лупой
выделить пыльники (по 3 из каждого колоска);
3) пыльники с помощью препаровальных игл перенести в чашки
Петри (15-20 шт. в каждую), содержащие по 1 мл жидкой среды МС,
дополненных 0,1 мг/л БАП, 0,5 мг/л НУК и 0,1 мг/л;
4) кончиком острого скальпеля свежеизолированные пыльники
разрезать на две половинки в продольном или поперечном
направлении, и выдержать на качалке в течение 3-4 часов, для
высвобождения микроспор в жидкую среду;
5) чашки Петри, с изолированными микроспорами, запечатать
парафильмом и инкубировать в темноте при температуре 25-27 °С до
появления каллусов;
6) через 2—3 недели от начала культивирования каллусы
размером 2—3 мм перенести на агаризованную среду того же состава
содержащую 1 мг/л ИУК и 0,25 мг/л 2,4-Д и экспонировать на свету с
16 ч фотопериодом при интенсивности освещения 5 тыс. лк;
7) через неделю каллусы пассировать на среду МС с 0,05 мг/л в
кинетина и 1мг/л НУК для регенерации растений;
8) зафиксировать время и интенсивность появления каллусов.
Материалы и инструменты:
- колосья пшеницы или ячменя;
- среда МС, 7 % раствор гипохлорита кальция, 2,4-Д, НУК,
кинетин, БАП.
62
Работа № 5 Индукция каллусогенеза в культуре пыльников
яблони и вишни
Порядок работы:
1) цветочные бутоны яблони или вишни поместить в марлевый
мешочек, в количестве 20 штук;
2) поместить мешочки с бутонами в 6 % раствор хлорамина на 10
мин;
3) тщательно промыть бутоны в 5-6 порциях стерильной
дистиллированной водой;
4) пинцетом перенести бутоны на стерильную поверхность стола
ламинар-бокса, препаровальной иглой осторожно выделить пыльники
из цветков;
5) препаровальной иглой перенести пыльники в пробирки,
содержащие 8 мл питательной среды МС, дополненной 1 мг/л 2,4-Д и
1 мг/л ИУК. Плотность посадки - 5-10 пыльников в каждую
пробирку;
6) закрыть пробирки и перенести в термостат с температурой
25 °С, хранить в темноте до появления каллусов;
7) зафиксировать сроки появления каллусной ткани.
Материалы и инструменты:
- бутоны вишни и яблони.
- питательная среда МС, 96 % раствор этилового спирта, 6 %
раствор хлорамина.
- ламинар-бокс, пробирки, спиртовка, препаровальные иглы,
пинцеты, вата, фольга.
Работа № 6 Получение растений регенератов из пыльцевых
каллусов яблони и вишни
Порядок работы:
1) в условиях ламинар-бокса извлечь каллус из пробирки и
перенести на стерильную поверхность;
2)
стерильной
препаровальной
иглой
выделить
зону
морфогенного каллуса (белые мелкие клетки, каллус средней
плотности);
3) препаровальной иглой перенести кусочек (5-6 мм)
морфогенного каллуса в пробирку со средой МС для индукции
побегообразования, содержащую 1-2 мг/л 6-БАП, 1мг/л НУК;
63
4) закрыть пробирки колпачками из фольги и поместить
светокультурную комнату с температурой 25±2 °С, 16 ч
фотопериодом, освещенностью 4 тыс. лк;
5) через 4-6 недель от начала пересадки каллусов,
образовавшиеся побеги перенести на среду МС, дополненную 1-2
мг/л ИМК, 1мг/л ГК для индукции дополнительного образования
побегов;
6) побеги высотой 8-10 см перенести на безгормональную среду
МС для индукции корнеобразования.
Материалы и инструменты:
- морфогенные каллусы яблони и вишни, полученные в культуре
пыльников;
- питательная среда МС, БАП, ИУК, ИМК, гиббереллин,
этиловый спирт;
ламинар-бокс,
спиртовки,
пробирки,
чашки
Петри,
препаровальные иглы, пинцеты;
Контрольные вопросы
1. Методы гаплоидии.
2. Развитие микроспор in vivo и in vitro.
3. Какие факторы влияют на андрогенез in vitro.
4. Развитие женского гаметофита in vitro.
5. Влияние факторов на гиногенез.
6. Что называется эмбриокультурой?
7. Как получить культуру растительных эмбриокультур?
8. Какие вопросы можно решить с использованием методов
гаплоидной технологии?
9. Какие процессы можно наблюдать при культивировании
пыльников?
64
7 Культура изолированных зародышей
Отдаленные гибриды представляют собой ценный исходный
материал для создания новых форм и сортов растений, т.к. сочетают в
себе хозяйственно полезные признаки возделываемых видов с
устойчивостью к неблагоприятным факторам среды, болезням,
вредителям, привнесенными дикими сородичами. Однако широкое
использование отдаленной гибридизации в селекционной практике
связано с рядом трудностей. Главная - низкий выход гибридных
растений при межвидовом и межродовом скрещиваниях, вследствие
высокой частоты гибели гибридных зародышей. Одним из
эффективных методов получения новых форм растений при
отдаленной гибридизации является изолирование и культивирование
зародышей в асептических условиях. Такой метод называется
эмбриокультурой. Он позволяет решить проблему постгамной
несовместимости и получать гибридные линии в комбинациях, где
традиционные методы гибридизации оказывается малоэффектными.
Следует отметить, что культура зародышей может быть использована
и для ускорения селекционного процесса путем прерывания покоя
семян, сокращения цикла репродукции растений, преодоления
самостерильности семян, быстрой оценки на всхожесть.
Успех культивирования изолированных зародышей зависит от
многих факторов, среди которых определяющими являются стадия
развития и степень дифференцировки зародыша в момент его
переноса на питательную среду. Кроме того, трудность выращивания
зародыша
на
ранних
стадиях
эмбриогенеза
обусловлена
невозможностью воспроизведения in vitro гормональной функции
эндосперма. Существование тесной функциональной, зависимости
между зародышем и эндоспермом, особенно в раннем эмбриогенезе,
было установлено именно при помощи эмбриокультуры. Незрелый и
|релый эндосперм значительно отличаются по составу входящих в
них гормональных комплексов, и если первый стимулирует рост и
цифференцировку зародыша, то второй - ингибирует эти процессы.
Поэтому незрелые зародыши очень требовательны к составу
питательной среды для их культивирования.
Метод культивирования изолированных зародышей злаков
пк шочает себя следующие важные этапы:
1)
стерилизация посадочного материала. Поверхностные
покровы семян могут быть инфицированы. Для стерилизации семена
Moiyr быть инфицированы. Для стерилизации семена погружают в 70
"■I раствор этилового спирта на 10 мин. Затем промывают в 3-х
65
порциях стерильной дистиллированной воды и помещают в
стерильную чашку Петри;
2) и золирование зароды ш ей. Для извлечения зародышей из
семян используют стереоскопическую бинокулярную лупу с 10-ти
кратным увеличением. Придерживая пинцетом верхнюю часть семени
на препаровальном столике микроскопа, делают надрез у основания
семени. Затем с препаровальной иглой отделяют зародыш от
окружающих его тканей эндосперма и переносят на поверхность
питательной среды;
3) сроки изолирования зароды ш ей. Важным является
своевременное выделение зародышей от материнского растения. От
оптимального установления сроков изолирования в значительной
степени зависит возможность сохранения их жизнеспособности и
способности к дальнейшему развитию. Зародыши извлекают из семян,
не достигших зрелости, с интервалом 8-18 дней после опыления.
Важно отметить, что в каждом конкретном случае время выделения
зародышей устанавливают опытным путем;
4) питательная среда. При культивировании зародышей успех
во многом зависит от правильного подбора питательной среды.
Наиболее часто при культивировании зародышей используют
питательные среды МС, Уайта и Гамборга В5. В зависимости от
степени развития зародыша используют среды разные гормональному
и минеральному составу среды. Для развития зрелых зародышей
достаточно простой минеральной основы питательных сред, без
внесения ростовых стимуляторов. Для культивирования незрелых
зародышей
желательно
внесение в среду
культивирования
аминокислот;
5) прием ы культивирования. Плотность посадки зародышей
зависит от площади поверхности питательной среды. При
использовании пробирок содержащих 10 мл питательной среды в
каждую пробирку высаживают 3 зародыша. При использовании
диаметром 40-60 мм, содержащих тот же объем среды, высаживают
10-15 зародышей.
При культивировании зародышей особое внимание уделяется их
положению относительно поверхности питательной среды. Зародыши
переносятся на питательные среды двумя способами: щитком вверх
или
щитком
вниз.
Ориентация
зародыша
щитком
вверх
благоприятствует образованию каллуса. Расположение зародыша
щитком вниз способствует его прямому прорастанию. Изолированные
зародыши культивируют в темноте при температуре 22-24 °С в
66
течение 2-3 недель. До образования каллусной ткани или достижения
ими стадии автономности;
6)
регенерация
растений.
Регенерация
растений
эмбриокультуре является самым важным моментом и состоит из двух
этапов: индукция побегообразования и укоренение побегов. После
образования каллусной ткани или достижения незрелых зародышей до
стадии автономности их переносят на питательную среду,
содержащую приблизительно одинаковые концентрации ауксинов и
цитокининов. На этой среде через 3-7 дней начинается
побегообразование. Побеги для инициации корнеобразования
переносят на безгормональную среду того же состава. Побеги
высотой 8 -10 см с хорошо развитыми корнями извлекают из
пробирок, отмывают от агара, переносят в контейнеры с почвенной
смесью и накрывают полиэтиленовой пленкой или химическим
стаканом для поддержания влажности. В течение недели растения
адаптируют, затем переносят в открытый грунт в теплице.
Работа № 1 Индукция каллусогенеза с последующей
регенерацией растений в культуре изолированных зародышей
пшеницы
Порядок работы:
1) зерновки стерилизовать в 70 % растворе этилового спирта в
течение 10 мин с последующим промыванием 3 разовым
промыванием в стерильной дистиллированной воде. Затем перенести
в стерильные чашки Петри;
2) зерновку, с помощью пинцета, положить бороздкой вниз на
предметное стекло, перенести на рабочий столик стереоскопической
лупы. Затем зажимая верхний (слегка суженный) конец зерновки
пинцетом, скальпелем сделать надрез у ее основания, параллельно
бороздке и препаровальной иглой извлечь зародыш;
3) выделенный зародыш, щитком вверх, перенести в
культуральной сосуд, содержащий 10 мл питательной среды МС,
дополненной 2 мг/л 2,4-Д, 0,5 мг/л ИУК и 0,5 мг/л кинетина;
4) пробирки, содержащие по 3 зародыша, закрыть колпачками из
фольги и поместить в термостат, где инкубировать в темноте при
температуре 22-24 °С в течение 2-3 недель до образования каллусной
ткани;
5) формируется два типа каллусной ткани различающихся по
структуре: рыхлый - неморфогенный и плотный - морфогенный. Для
индукции процессов морфогенеза, отобрать плотные каллусы и
67
в
пассировать на свежую среду того же состава. Культивировать при
температуре 24 °С с 16 ч фотопериодом и интенсивности освещения
3000 лк;
6) через 2 недели отобрать каллусы с зелеными участками и
повторно пересадить на ту же среду. После 4-5 недель после первого
пассажа наблюдается формирование побегов;
7) для укоренения, фрагменты каллуса с образовавшимися
побегами перенести на среду МС, не содержащую фитогормоны;
8) хорошо укоренившиеся побеги высотой 8 -10 см осторожно
извлечь из пробирок, освободить от агара, перенести в горшки с
почвенной смесью и накрыть полиэтиленовой пленкой;
9) через 7-10 дней растения освободить из-под пленки (стакана)
на 30 мин, постепенно увеличивая время экспозиции на открытом
воздухе до нескольких часов, для привыкания к окружающей среде.
Материалы и инструменты:
- растения пшеницы на стадии молочной спелости, незрелые
зерновки пшеницы;
- питательная среда МС, 2,4-Д, ИУК, кинетин, этиловый спирт;
- бинокулярная стереоскопическая лупа МБС-10, пинцеты,
скальпели, препаровальные иглы, пробирки, чашки Петри диаметром
40-60 мм, полиэтиленовая пленка, химические стаканы объемом
500-1000 мл, горшки, почвенная смесь.
Работа № 2 Прямая регенерация
незрелых зародышей пшеницы
растений
в культуре
Порядок работы:
1) незрелые зерновки пшеницы на 10 мин погрузить в 70 %
раствор этилового спирта, промыть в трех порциях стерильной
дистиллированной воды;
2) с помощью пинцета зерновку положить бороздкой вниз на «
предметное
стекло
и
перенести
под
бинокулярную
стереоскопическую лупу. После, придерживая верхний конец
зерновки пинцетом, в нижней ее части скальпелем сделать надрез,
параллельно бороздке и препаровальной иглой освободить зародыш
от окружающих его тканей эндосперма;
3) выделенные зародыши (по 3 в каждой пробирке), щитком вниз,
перенести в культуральный сосуд, содержащий 10 мл питательной
среды Уайта в модификации Норстога (КН2РО4 - 90 мг/л, KCI - 750
68
мг/л), дополненной 400 мг/л глутамина, 400 мг/л аланина, 10 мг/л
тирозина, 10 мг/л цистеина и 10 мг/л триптофана.
4) культуру незрелых зародышей инкубировать в темноте при
температуре 22—24 °С в течение 14-20 дней до достижения ими
стадии автономности;
5) через 2 недели после начала посадки (размер зародышей
увеличивается в 1,5-2 раза), для индукции побегообразования
зародыши пассировать на среду МС, содержащую 0,5 мг/л ИУК и
0,5 мг/л кинетина, на которой после 2-х недель пересадки появляются
побеги;
6) образовавшиеся побеги для укоренения перенести на
безгормональную среду МС;
7) побеги высотой 8-10 см, с хорошо развитыми корнями
пересадить в горшки с почвенной смесью и накрыть полиэтиленовой
пленкой;
8) через 7-10 дней растения освободить из-под пленки (стакана)
на 30 мин, постепенно увеличивая время экспозиции на открытом
воздухе до нескольких часов, для привыкания к окружающей среде;
9) адаптировавшиеся растения выращивать при температуре
18-22 °С и естественном освещении.
Материалы и инструменты:
- растения пшеницы на стадии молочной спелости, незрелые
зерновки пшеницы;
- Питательная среда МС, среда Уайта в модификации Норстога,
2,4-Д, ИУК, кинетина, глутамин, аланин, тирозин, цистеина,
триптофан, этиловый спирт;
- бинокулярная стереоскопическая лупа МБС-10, пинцеты,
скальпели, препаровальные иглы, пробирки, чашки Петри диаметром
40-60 мм, полиэтиленовая пленка, химические стаканы объёмом
500-1000 мл, горшки, почвенная смесь.
Контрольные вопросы
1. В чем причина прогамной несовместимости и как она
определяется?
2. Почему погибает гибридный зародыш?
3. Как преодолевается постгамная несовместимость?
69
8 Выделение протопластов
Клеточная инженерия - это метод конструирования клеток
нового типа на основе их культивирования, гибридизации и
реконструкции. При гибридизации искусственно объединяют клетки с
образованием гибридного генома. Сущность этого способа
гибридизации заключается в том, что в качестве родительских
используют не половые клетки (гаметы), а клетки тела (сомы)
растения, из которых изолируют протопласты.
Изолированный
протопласт
представляет
собой
клетку
лишенную клеточной стенки механическим путем или с помощью
ферментативной мацерации, т.е. по существу протопласт - «голая
клетка». Протопласты растений представляют собой отправную точку
многих методик, используемых для генетической модификации целых
растений. Отсутствие клеточной стенки делает возможным слияние
протопласта с протопластами других видов растений, и получать,
таким
образом,
новые
гибридные растения.
Способность
протопластов к слиянию друг с другом с дальнейшей регенерацией
целого растения лежит в основе парасексуальной (неполовой) или
соматической гибридизации.
Исходным материалом для выделения протопластов могут
служить различные части растения - литься, корни, семядоли,
гипокотили, пыльцевые зерна, а также каллусные ткани. Важнейшим
требованием при работе является соблюдение стерильности. Поэтому
наличие асептических культур значительно упрощает процесс
выделения и культивирования протопластов.
Клеточная оболочка растений состоит в основном из целлюлозы,
гемицеллюлозы и пектиновых веществ. Поэтому для ее разрушения
используют
ферментативные
смеси
на
основе
целлюлаз,
гемицеллюлаз и пектиназ (Приложение Е).
Ферментативные растворы лучше готовить непосредственно
перед проведением эксперимента или за сутки до опыта. Растворы
необходимо отцентрифугировать для осаждения нерастворимых
частиц в течение 10-15 мин при 2 тыс. об/мин. После доведения pH до
требуемых значений, раствор при помощи шприца с насадкой
фильтруют через мембранный фильтр (фирма "Millipore") в
культуральную посуду. Для ферментативной мацерации обычно
использую молодые листья.
После перенесения на поверхность стерильной чашки Петри,
листья нарезают при помощи стерильного скальпеля или бритвенного
лезвия на полоски шириной 1 мм, затем сразу же помещают в
70
ферментный раствор. 1 г листовой ткани мацерируют в 10 мл
ферментного раствора при 28-30 °С в течение 15-18 ч.
Если нужно получить протопласты из суспензионной культуры,
то ее предварительно осаждают либо центрифугированием, либо
фильтрованием. После, переносят в раствор ферментов из расчета 2 г
на 10 мл маневрирующего раствора. Каллусные ткани, растущие на
твердых питательных средах, переносят в посуду с ферментной
смесью при помощи скальпеля или шпателя. Длительность
ферментации зависит от консистенции ткани, концентрации и
комбинации
ферментов, температуры
и продолжительности
инкубации. Поэтому целесообразно контролировать процедуру
мацерации
визуально,
с
использованием
инвертированного
микроскопа, для чего удобно проводить ферментации в чашке Петри,
а не в колбе.
Содержимое культуральной посуды после инкубации в смеси
ферментов фильтруют через воронку с нейлоновым фильтром в
стерильные колбы небольшого объема. Остатки тканей листа
остаются на ткани, в колбе остаются протопласты. Полученную
суспензию протопластов переносят в стерильные центрифужные
пробирки и центрифугируют в течение 3 мин при 1 тыс. об/мин.
Жизнеспособные протопласты всплывают на поверхность, и их
отбирают пипеткой и переносят в пробирку, до половины
заполненной средой для отмывки. Затем центрифугируют в данной
среде в течение 1-2 мин при 700 об/мин для их осаждения и отмывки
от ферментного раствора. Процедуру повторяют дважды.
Отмытые протопласты ресуспендируют в небольшом объеме
(0.5 мл) среды (рисунок 8).
71
Кусочки
листьев
2 часа а Осторожное
встряхивание
Стерилизация Удаление
листа
эпидермиса
vy
На среде для
регенерации
каллусы
дают растения.
Рисунок 8 - Схема выделения и культивирования растений из
мезофилла листа
Работа № 1. Выделение протопластов из листьев герани
Порядок работы:
1) отобрать около 30 растений с полностью развернувшимися
листьями с черешками;
"
2) поместить листья на 30 мин в 5 % раствор гипохлорита
кальция;
3) с помощью стерильного пинцета перенести листья в кювету и
промыть в 6 порциях стерильной дистиллированной воды;
4) листья надрезать с нижней стороны, удалить нижний
эпидермис и разрезать на сегменты длиной 2 см;
5) сегменты для плазмолиза перенести на 1 час в чашки Петри (d
-1 4 0 мм), содержащие 30 мл среды СПП 13 М. Очищенные кусочки
листьев должны полностью покрывать поверхность жидкой среды;
72
6) с помощью пипетки тщательно удалить среду СПП 13М и
внести 25 мл раствора ферментов содержащего: 1,5 %-ую мейцелазу,
0,05 %-ый мацерозим RI0. pH среды 5,8. Инкубировать 12-14 часов в
темноте при температуре 27 °С, без перемешивания;
7) по истечении времени, не трогая обработанные ферментами
сегменты листьев, пропустить инкубационную смесь через
нейлоновое сито для отделения протопластов от остатков тканей и
ресуспендировать в чашку Петри, содержащую 25 мл среды СПП;
8) затем отмыть суспензию протопластов от ферментов, для чего
с помощью пипетки перенести суспензию в центрифужные пробирки
и центрифугировать при 100 об/мин в течение 3-5 мин;
9) к отмытому осадку добавить 10 мл среды СПП 13М и
просмотреть под микроскопом;
10) подсчитать количество протопластов в камере Горяева или
Фукса-Розенталя. Для этого каплю суспензии нанести на верхнюю и
нижнюю сетки камеры и накрыть покровным стеклом, притирая его к
боковым граням до появления колец Ньютона;
11) Определить количество протопластов в 1 мл среды по
формуле:
А = А х 1 0 0 0 x 2 5 0 /В,
(8.1)
где А - число протопластов в больших квадратах;
В - число больших квадратов.
Оптимальная плотность протопластов в 1мл среды должна
составлять 5 х 105 до 1 х 10.
Материалы и инструменты:
- листья герани;
-5 % раствор гипохлорита кальция, среды СИП 13М и СИП 2 1C,
1,5 % раствор мейцелазы, 0,05 % раствор мацерозима R10;
-Настольная центрифуга, микроскоп, камера Горяева или ФуксаРозенталя, пипетки, нейлоновое сито, чашки Петри d — 140 мм,
центрифужные пробирки.
Работа № 2 Выделение протопластов т семядолей фасоли
Порядок работы:
1)
срезать 3-6
подсемядольного колена;
дневные
73
проростки
фасоли
на
уровне
2) простерилизовать в 5 % растворе гипохлорита кальция в
течение 10 мин и промыть в 3-х порциях стерильной
дистиллированной воды;
3) нарезать семядоли на полоски шириной 1мм и поместить на
1 час в среду СПИ 1ЗМ для плазмолиза;
4) перенести в раствор ферментов содержащий 2 %-ый розим
НР150, 2 %-ую мейцелазу. 0,03 %-ый мацерозим R10 (pH 5,8) и
инкубировать на круговой качалке (30 об/мин) в течение 16—17 часов
при 27 °;
5) слить инкубационную смесь на сито с размером пор 64 мкм и
высвободить протопласты, сжимая обработанные полоски семядолей;
6) осадить протопласты центрифугированием при 120 об/мин в
течение 10 мин, трижды промыть в среде СМИ 13М;
7) определить процент жизнеспособных протопластов, для чего
окрасить суспензию метиловой синью (0,02—0.1 %). Окрашиваться
будут мертвые клетки.
Материалы и инструменты:
- проростки фасоли;
- 5 % раствор гипохлорита кальция, среда СПП 13М, 2 % раствор
мейцелазы. 2 % раствор розима НР150, 0,03 % раствор мацерозима
R10, 0,02-0,1 % раствор метиловой сини;
- настольная центрифуга, микроскоп, нейлоновое сито, круговая
качалка.
Контрольные вопросы
1. Что такое соматическая гибридизация?
2. Методы выделения протопластов.
3. Методы культивирования протопластов.
4. Определение жизнеспособности протопластов.
74
Литература
1 Бутенко Р. Г Культура клеток растений и биотехнология. - М. :
Наука, 1986. - 28 с.
2 Бутенко Р. Г. Биология клеток высших растений in vitro и
биотехнологии на их основе. - М. : ФБК-ПРЕСС, 1999. - 152 с.
3 Бутенко Р. Г. Биология клеток высших растений in vitro и
биотехнологии на их основе. - М. : ФБК-ПРЕСС, 1999. —160 с.
4 Валиханова Г. Ж. Биотехнология растений. - Алматы :
Конжык, 1996. - 420 с.
5 Валиханова Г. Ж. Биотехнология растений. - Алматы : Конжык,
1996.-272 с.
6 Валиханова Г. Ж., Есмагулов К. Е. Русско-казахский словарь
терминов, используемых в биотехнологии растений. - Алматы : Казак
университет!, 1997. - 38 с.
7 Валиханова Г. Ж., Рахимбаев И. Р. Методическое руководство к
практическим занятиям по культуре тканей растений. - Алма-Ата :
КазГУ, 1 9 8 3 .- 152 с.
8 Валиханова Г. Ж., Рахимбаев И. Р. Методическое руководство к
практическим занятиям по культуре тканей растений. - Алма-Ата :
КазГУ, 1 9 8 3 .-2 8 с.
9 Валиханова Г. Ж.. Есмагулов К. Е. Русско-казахский словарь
терминов, используемых в биотехнологии растений. - Алматы :
Казак университет!, 1997. - 18 с.
10 Герасимова С. И., Дегтярев И. К. Лабораторно-практические
занятия по сельскохозяйственной биотехнологии: методические
указания - М. : МСХА, 1991. - 159 с.
11 Глеба Ю. Ю. Сытник К. М. Клеточная инженерия растений. Киев : Наука, 1984. - 13 с.
12 Жамбакин К. Ж.. Гаплоидная биотехнология растений. Алматы : Центр ОФ «Интерлигал», 2004. - 184 с.
13 Калинин Ф. Л., Кушнир Г. П., Сарнацкая В. В. Технология
микроклонального размножения растений. - Киев : Наукова думка,
1992,- 12 с.
14 Калинин Ф. Л., Сарнацкая В. В. Полищук В. Н. Методы
культуры тканей и клеток в физиологии и биохимии растений. Киев : Наукова Думка, 1980. - 420 с.
15 Калинин Ф. Л., Сарнацкая В. В. Полищук В. Е. Методы
культуры тканей и клеток в физиологии и биохимии растений. Киев : Наукова Думка, 1980. - 488 с.
75
16 Катаева П. В., Бутенко Р. Г. Клональное микроразмножение
растений. - М .: Наука, 1983.-68 с.
17 Муромцев Г. С., Бутенко Р. Г. Основы сельскохозяйственной
биотехнологии. - М. : Агропромиздат, 1990. - 126 с.
18 Мухамбетжанов С. К., Рахимбаев И. Р., Мурсалиева В. К.
Эмбриокультура пшеницы: методические рекомендации. - Алматы :
2 0 0 3 .-2 8 с.
19 Нутенко Р. Г., Русев М В., Киркин А. Ф. Клеточная инженерия
/ Биотехнология. - М .: Высшая школа, 1987. - Т 3. - 77 с.
20 Сейлова Л. Б. Репродуктивная биология растений. - Алматы :
КИЦ ОО «Школа XXI века», 2004. - 158 с.
21 Gainborg О. L., Phillips G. С. Plant Cell, Tissue and Organ
Culture. - Springer-Verlag, 1995. - 52 c.
22 Heslop-Harrison J., Dodds J. П., Roberts L. W. Experiments in
Plant Tissue Culture. - Cambridge University Press, 1995. - 68 c.
23 Vasil I. K., Thorpe T. A. Plant Cell and Tissue Culture. Information Services, 1995. - 152 c.
76
Приложение А
(обязательное)
Краткая терминология
Адвентивные почки - почки, возникшие из клеток и тканей в
растениях, обычно их не образующие.
Адвентивная эмбриония - возникновение зародышей из клеток
и тканей растений, в норме их не образующих.
Альбинизм - отсутствие нормального для данного вида
пигментации.
Альбиносы - растения в клетках, которых отсутствуют
пластиды.
Акропетальныи транспорт - транспорт веществ в растении по
направлению к апикальным меристемам стебля.
Андрогенез - мужской партеногенез — развитие гаплоидного
организма из ядра мужской гаметы в цитоплазме яйцеклетки.
Андрогенез in vitro (андроклиния) - процесс возникновения
растения из микроспоры путем прямого эмбриогенеза, либо через
образование каллуса.
Апекс - верхушечная часть стебля или корня.
Апикальное доминирование - подавление роста боковых почек
побега в присутствии терминальной (апикальной) почки.
Асептические условия соблюдение условий полной
стерильности.
Ауксины - фитогормоны индольной природы: индолил-3уксусная кислота (ИУК) и ее производные: (ИМК, НУК, 2,4-Д).
Активизируют рост стеблей и корней, стимулируют образование
корней у проростков.
Ауксотрофные клетки - клетки, нуждающиеся во внешних
факторах роста, которые не требуются нормальным (прототрофным)
клеткам.
Биореактор (ферментер) - аппарат для культивирования
микроорганизмов, клеток растений и животных в биотехнологическом
производстве.
Вегетативная клетка - одна из клеток микроспоры, образующая
пыльцевую трубку, не участвует при оплодотворении.
Витрификация - стекловидность. Нежелательное явление в
культуре тканей, приводящее к оводненности и прозрачности клеток.
Время генерации клетки —интервал между последовательными
клеточными делениями.
77
Время удвоения популяции - интервал времени, за который
число кЛеток в популяциях увеличивается вдвое.
Вторичные
метаболиты
вещества,
вырабатываемые
растительными клетками, но не являющиеся необходимыми для их
жизнедеятельности.
Гаметофит - половое поколение растений, несущее гаплоидный
(п) набор хромосом.
Гаметы - зрелые мужские и женские половые клетки,
содержащие гаплоидное (половинное) число хромосом по сравнению
с клетками тела (сомы).
Гаплоид - ядро, клетка, организм, характеризующиеся набором
хромосом, представляющим половину полного набора, свойственного
виду.
Генотип - конкретный набор генов особи.
Гетерозис - превосходство гибридов первого поколения по ряду
признаков и свойств над родительскими формами.
Геммогенез in vitro - один из видов морфогенеза в культуре
тканей, сопровождающийся формированием почек.
Гемморизогенез in vitro - одновременное формирование почек и
корней при морфогенезе в культуре тканей.
Генеративная клетка - одна из клеток микроспоры образующая
два спермия, участвующих в процессе двойного оплодотворения.
Гиббереллины - фитогормоны, преимущественно производные
флюоренового ряда — гибберелловая кислота (ГК) и другие.
Активизируют рост стеблей, выбывают прорастание семян.
Гибрид - организм, унаследовавший ядерные гены от обоих
родителей.
Гиногенез —процесс возникновения зародыша из яйцеклетки в
отсутствии оплодотворения.
Г иногенез in vitro — процесс возникновения гаплоидного
растения с материнским набором хромосом из элементов
зародышевого мешка путем прямого эмбриогенеза, либо через
образование каллуса.
Г истогенез in vitro - формирование в культуре тканей элементов
флоэмы и ксилемы.
Глобула - плотная структура шаровидной формы без видимых
признаков дифференцировки.
Гомозиготный организм - организм, соматические клетки
которого содержат идентичные гены, не расщепляющиеся при
размножении.
78
Гормональная система растений - регуляторный комплекс,
фитогормоны, их рецепторы и вторичные посредники.
Деструкция - разрушение вещества, сопровождаемое потерей
его физиологической активности .
Дедифференциация - переход специализированных клеток к
пролиферации и неорганизованному каллусному росту.
Детерминация развития - приобретение клеткой, тканью,
органом или организмом состояния готовности к развитию по
определенному
пути,
сопровождающееся
одновременным
ограничением возможностей развития в других направлениях. В
период детерминации создаются необходимые внутренние условия
для последующей морфологической реализации нового направления
развития.
Диплоид - ядро, клетка, организм, характеризующиеся двойным
набором
гомологичных
хромосом,
представленных
числом,
характерным для данного вида (символ 2 п ) .
Диплоидизация - превращение гаплоидного набора хромосом в
диплоидный путем удвоения каждой хромосомы .
Диплоидный набор хромосом - два гаплоидных набора
хромосом, содержащие хромосомы только одною или обоих
родителей.
Дифференциация - комплекс процессов, приводящих к
различиям между дочерними клетками, а также между материнскими
и дочерними клетками.
Дифференцировка
состояние специализации клеток,
отличающее их от других.
Женский гаметофит - то же что и зародышевый мешок.
Изолированный протопласт - растительная клетка, лишенная
клеточной стенки с помощью ферментативного разрушения или
механического способа.
Инокулюм - часть клеточной суспензии, используемая для
переноса на свежую питательную среду.
Каллус — ткань, возникшая in vitro путем неорганизованной
пролиферации клеток тканей растений.
Кариотип - набор хромосом, характерных для данного вида.
Клеточная селекция - метод выделения мутантных клеток и
сомаклональных вариаций с помощью селективных условий.
Клон - культура, возникшая из одной клетки.
Клональное микроразмножение - получение in vitro неполовым
путем растений, генетически идентичных исходному.
79
Клонирование - получение генетически идентичных популяций
организмов.
Компетенция - способность клетки, ткани, органа, организма
воспринимать
индуцирующее
воздействие
и
специфически
реагировать на него изменением развития.
Культура зиготических зародышей - стерильное выращивание
на питательной среде незрелых или зрелых изолированных
зародышей.
Культура изолированных протопластов - выращивание
клеток, лишенных стенок, в жидкой или на агаризованной среде,
содержащей в качестве дополнительного компонента осмотически
активное вещество (стабилизатор) в оптимальной для данного вида
концентрации. При регенерации стенок изолированные протопласты
превращаются в культуру клеток.
Культура каллусных тканей - выращивание в длительной
пересадочной
культуре
каллусов,
возникших
путем
дедифференцировки и пролиферации клеток, тканей, органов
растения.
Культура
корней
асептическое
выращивание
на
искусственной питательной среде в пересадочном режиме
изолированных корней.
Культура
меристем
асептическое выращивание на
питательной среде изолированного из апекса или пазушной почки
побега конуса нарастания с одним или двумя листовыми
примордиями.
Культура одиночных клеток - выращивание одиночных клеток
при низкой плотности высева на очень богатых питательных средах с
помощью культуры - «няньки» или питающего слоя.
Культура опухолевых тканей - выращивание в длительной
культуре тканей, изолированных из растительных опухолей разного
происхождения, освобожденных от патогенов, индуцировавших
развитие опухоли.
«
Культура «привыкших» тканей - выращивание тканей,
возникших путем редифференциации или мутации клеток
нормальных каллусных тканей, и способных расти на питательных
средах без гормонов.
Культура эксплантов - инкубация в стерильных условиях на
питательных
средах,
вызывающих
или
не
вызывающих
пролиферацию фрагментов, изолированных из разных органов
растений.
80
Линия - культура, возникшая из штамма путем селекции или
клонирования, имеющая маркерные признаки.
Меристема - образовательные ткани с активно делящимися
клетками.
Моноплоид - ядро, клетка, организм, характеризующиеся
основным числом хромосом в полиплоидной серии (символ X).
Морфогенез - процесс формирования роста и развития органов
(органогенез), тканей (гистогенез) и клеток (цитогенез или клеточная
дифференцировка).
Мужской гаметофит - то же, что и зрелое пыльцевое зерно.
Омнипотентность - сохранение ядрами соматических клеток
растений всех потенций ядра зиготы, т.е. сохранение всей
генетической информации.
Органогенез - процесс возникновения в неорганизованно
растущей массе каллусных клеток зачатков органов (корней и
побегов).
Пассаж - часть каллусной ткани пересаживаемой свежую
твердую питательную среду.
Плазмида — кольцевая внехромосомная ДНК, способная к
автономной репликации.
Половой процесс - слияние мужской спермии и женской
(яйцеклетка) половой клетки, в ходе которого образуется диплоидная
клетка (зигота) и определяется пол будущей особи.
Пролиферация - новообразование клеток и тканей путем
размножения.
Регенерация - восстановление целостного организма из клетки,
ткани, органа.
Редифференциация - переход специализированных клеток из
одного состояния дифференцировки в другое с предшествующими
делениями или непосредственно.
Ризогенез in vitro - процесс заложения, роста и развития корней
в культуре изолированных тканей.
Ростовой цикл - рост популяции клеток в цикле периодического
выращивания, характеризующийся сигмоидальной кривой. Фазы
ростового цикла: латентная, экспоненциальная, замедления роста,
стационарная, деградации.
Слияние изолированных протопластов - формирование одной
клетки из двух и более объединением их поверхностных мембран.
Сома - все клетки тела, за исключением половых.
Сомаклональные вариации и варианты - фенотипическое
выражение
непостоянства
ядерного
и
органелльных
81
цитоплазматических геномов культивируемых клеток. От истинных
генных мутаций отличаются большей частотой возникновения и
комплексностью изменений (изменения в структуре генов, хромосом,
геномов).
Сомаклоны - растения, регенерировавшие из культивируемых
клеток и несущие какие-либо отклонения от исходных форм.
Соматическая гибридизация - система, вовлекающая в
генетическую рекомбинацию хромосомы и гены ядра и органелл вне
сексуального цикла, например, путем слияния изолированных
протопластов. Приводит к появлению гибридных клеточных линий и
соматических гибридов растений.
Соматический
гибрид — растение, полученное путем
гибридизации изолированных протопластов.
Соматический
эмбриогенез
процесс
образования
зародышеподобных структур (эмбриоидов) в культуре ткани и клеток.
Субкультивирование - перенос транспланта (инокулюма) в
другой культуральный сосуд на свежую питательную среду.
Суспензионная культура - выращивание отдельных клеток или
небольших групп их во взвешенном состоянии в жидкой среде при
использовании аппаратуры, обеспечивающей их аэрацию и
перемешивание.
Тотипотентность - свойство соматических клеток растений
полностью реализовывать свой потенциал развития при определенных
условиях выращивания.
Фенотип - набор признаков, определяемых генотипом и
условиями выращивания.
Фитогормоны - (гормоны растений) - биологически активные
соединения, образующиеся в растениях в малых количествах,
вызывающие специфический ростовой или формообразовательный
эффект.
Фиторегуляторы - природные и синтетические препараты,
вызывающие ростовые или формативные эффекты и не обладающий
действием удобрений и гербицидов.
Цибрид — растение, полученное при слиянии изолированного
протопласта с цитопластом, протопластом с инактивированным ядром
или с энуклеированным протопластом.
Цикл выращивания - период от помещения клеточного
инокулюма или каллусного трансплантата до последующего
субкультивирования, протопласта.
82
Цитокинины - фитогормоны, производные пуринов. Природные
цитокинины - кинетин и зеатин. активизируют развитие меристем,
стимулируют образование почек.
Цитопласт - протопласт, не содержащий ядра.
Штамм
культура,
возникшая
после
первого
субкультивирования, состоит из многих клеточных линий, возникших
из клеток, присутствующих в первичной каллусной культуре.
Эксплант - фрагмент ткани или органа, инкубируемый на
питательной среде самостоятельно или используемый для получения
первичного каллуса.
Эмбриоид - зародышеподобная структура, возникающая в
культуре изолированных тканей.
Эмбриогенез процесс образования зародышеподобных
структур (эмбриоидов) неполовым путем в культуре тканей и клеток
in vitro.
Эпигенетические вариации - фенотипическое выражение
дифференциальной активности генов. От мутаций и сомаклональных
вариаций отличаются тем, что не сохраняются в цикле клетка растение - клетка.
Ю венильная фаза развития - период заложения, роста и
развития вегетативных органов от прорастания семени или
вегетативной почки до появления способности к образованию
репродуктивных органов.
In vitro - выращивание растительных объектов «в стекле»
(пробирке, колбе, биореакторе) на искусственных питательных средах
в асептических условиях.
In vivo - выращивание живого материала в естественных
условиях.
83
Приложение Б
(обязательное)
Условные сокращения
2,4-Д —2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота.
6-БАП - 6-бензиламинопурин.
Витамин В6 - пиридоксин-НС1.
Витамин В1 - тиамин-НС1.
Витамин В2 - рибофлавин.
Витамин ВЗ (РР) - никотиновая кислота.
Витамин В5 - Са-пантотенат.
Витамин С - аскорбиновая кислота.
ГК - гибберелловая кислота.
ИУК - В-индолилуксусная кислота.
ИФА - иммуноферментный анализ.
МК - индолилмасляная кислота.
НУК - а-нафтилуксусная кислота.
ПХФУК - парахлорфеноксиуксусная кислота.
ПЦР - полимеразная цепная реакция.
ФРДА - флуоресцеиндиацетат.
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота.
О
84
Приложение В
(справочное)
Стерилизующие вещества
Этиловый спирт (С2Н5ОН) применяется для стерилизации
большинства растительных объектов, кроме того, его внесение в
растворы других стерилизующих веществ заметно повышает
эффективность их действия. Для стерилизации клубней и корнеплодов
используют 96 % раствор спирта в течение 5 мин без дальнейшей
отмывки дистиллированной водой. Верхушечные почки, пыльники,
завязи стерилизуют в течение 1 мин в 70 % растворе спирта,
трёхкратно ополаскивают стерильной дистиллированной водой и
переносят в стерильную чашку Петри.
Гипохлорит натрия (NaCIO) используется для стерилизации
семян и другого растительного материала 5 % раствором в течение
10-20 мин. Используется также коммерческий препарат «Хлорокс»,
представляющий 5,25 % раствор гипохлорита натрия в воде. Для
стерилизации нежных тканей (апикальных меристем, семяпочек)
следует применять более слабый раствор гипохлорита натрия (0,5 %)
в течение 3-5 мин. Гипохлорит натрия является клеточным ядом.
После его применения для стерилизации и обычного режима
промывания дистиллированной водой остаются его следы, которые
могут препятствовать поглощению питательных веществ. Для
полного удаления NaCIO рекомендуется вначале проводить обработку
0,01 Н раствором HCI, после промывать в 8-10 порциях стерильной
воды (5 мин в каждой порции).
Гипохлорит кальция (Са (СЮ)г) менее токсичен для тканей
растений, чем гипохлорит натрия. Широко применяется для
стерилизации поверхностей клубней, корнеплодов, побегов, семян,
корней, почек, листьев, соцветий. Для стерилизации корнеплодов,
клубней, семян с плотными покровами используют 70-90 % раствор
гипохлорита калия в течение 20-30 мин, молодые побеги, листья,
стебли травянистых растений обрабатывают 20-40 % раствором в
течение 10-15 мин, верхушечные почки выдерживают в 5-7 %
растворе - 5-10 мин. Объекты после обработки промывают в 2-3
порциях стерильной дистиллированной воды (5 мин в каждой
порции).
Хлорамин
Б (C6H5S02N(Na)CI х ЗН20 ) действует на
растительные ткани слабее, чем гипохлориты натрия и кальция. Это
соединение применяется для стерилизации пыльников, завязей в
85
концентрации 0,2-6 % в течение 1-60 мин. Материал после
стерилизации подвергают 3-х кратной промывке стерильной
дистиллированной водой.
Для приготовления стерилизующих растворов, содержащих хлор,
нужную навеску препарата растворяют в 1 л дистиллированной воды,
взбалтывают в течение 8 -10 мин и фильтруют через бумажный
фильтр. Для стерилизации используют только свежеприготовленный
прозрачный раствор, желтого цвета. Все растворы, содержащие
активный хлор (гипохлориты натрия, кальция, хлорамин),
применяются для однократного пользования.
Двухлористая ртуть (сулема) (HgCI2) хорошее стерилизующее
средство для широко спектра растительных объектов. В основном
используют 0,1 % раствор HgC^ в дистиллированной воде. Средняя
продолжительность стерилизации в 0,1 % растворе для клубней и
корнеплодов - 15-20 мин; для листьев и стеблей древесных растений
— 4-8 мин; для зародышей и пыльников — 1-3 мин. После
стерилизации в растворе сулемы ткани необходимо промыть 4-5 раз
дистиллированной водой по 10-15 мин в каждой порции воды.
Раствор двухлористой ртути можно использовать 3-4 раза.
Перекись водорода (Н2О2) используют в основном для
стерилизации семян, реже стеблей и листьев в концентрации 2 -10 % в
течение 20-60 мин. После стерилизации Н2О2 не требуется
длительного промывания тканей водой, т.к. оставшийся в тканях
пергидроль быстро разлагается.
Бром (Вг) в виде 1 % раствора эффективное средство для
стерилизации семян в течение 5 мин. Раствор брома следует
применять для стерилизации сухих (не проросших) семян, т.к. он
токсичен и повреждает зародыши.
Фенол (С6Н5ОН) используют для стерилизации плодов, семян в
виде 5 % раствора. Время экспозиции - 5 мин.
Концентрированная серная кислота (H2S 0 4) применяется для
стерилизации семян с плотной семенной оболочкой или имеющий
сильное опушение. Продолжительность стерилизации 5-10 мин.
После стерилизации бромной водой, фенолом, серной кислотой
требуется тщательное отмывание объектов дистиллированной водой.
Хромовую смесь (хромпик) используют для мытья сильно
загрязненной посуды часто применяют хромовую смесь, гак как
хромовокислые соли являются сильными окислителями. Для
приготовления хромовой смеси в концентрированную серную кислоту
(H2SO4) добавляют около 5 % (от массы серной кислоты)
размельченного в порошок кристаллического двухромокислого калия
86
(К2СГ2О7) и осторожно нагревают в фарфоровой чаше на водяной бане
то его растворения.
При мытье хромпиком посуду споласкивают сначала водой, а
затем наливают слегка подогретую (40-60 °С) на водяной бане
хромовую смесь до 1/3-1/4 объема сосуда и осторожно смачивают его
внутренние стенки. После этого хромовую смесь выливают обратно в
тот же сосуд, в котором она хранится, причем стараются смочить ею
оставшиеся не смоченными стенки посуды и особенно наиболее
загрязненные ее края. Слив всю смесь, посуду оставляют постоять
несколько минут, затем ее тщательно моют теплой водопроводной
водой, потом ополаскивают 5-6 раз дистиллированной водой.
Хромовая смесь служит довольно долго. После длительного
употребления ее цвет из темно-оранжевого переходит в темно­
зеленый, что служит признаком ее дальнейшей непригодности для
мытья.
Хромовая смесь очень сильно действует на кожу и одежду,
поэтому обращаться с ней следует очень осторожно. При попадании
хромпика на кожу рук или одежду, их следует, прежде всего, обмыть
большим количеством воды, затем раствором соды или аммиака.
Хромовую смесь не применяют, если посуда загрязнена
парафином, керосином и другими продуктами перегонки нефти. В
этих случаях посуду моют органическими растворителями.
87
Приложение Г
(справочное)
Базовые составы питательных сред для культивирования
изолированных тканей и органов растений
Таблица Г. 1 - Среда Уайта
Компоненты среды
MgS04
CalN03
Na2S 04
KN03
КС1
NaH2P 04
Количество
360
200
200
80
65
16,5
________ ____________________ В мг/л
Компоненты среды
CuS04x 5Н20
ZnS04
Na2M o04 2Н20
KJ
Количество
0,02
1,5
0,0025
0,75
Тиамин (В1)
0,1
Пиридоксин (В6)
0,1
Никотиновая к-та (РР)
0,5
H3BO3
1,5
Глицин
3,0
4,5
MnS04
Fe2(SC>4)3
2,5
Сахароза
20 000
pH 5,6-5,8
Примечание - Среда используется для выращивания тканей табака, моркови,
является исходной для создания многих питательных сред.
Таблица Г .2 - Среда Мурасиге и Скуга
Компоненты среды
NH4NO3
KN03
СаС12х2Н 20
MgS04 х 7Н20
КН2Р 04
Н3ВО3
MnS04 х 4Н20
СОС12 х 6Н20
CuS04 х 5Н20
ZnS04 х 7Н20
Na2M o04 х 2Н20
KJ
Количество
1650
1900
440
370
170
6,2
22,3
0,025
0,025
8,6
0,25
0,83
Компоненты среды
FeS04 х 7Н20
ИагЭДТА х 2Н20
Тиамин (В1)
Пиридоксин (В6)
Никотиновая к-та (РР)
Мезоинозит
Глицин
Сахароза
В мг/л
Количество
27,8
37,7
0,1
0,5
0,5
100
2,0
30 000
pH 5,6-5,8
Примечание - Среда широко используется для введения в культуру,
пассирования различных тканей большинства видов растений.
Таблица Г.З - Среда Гамборга и Эвелега (В5)
Компоненты среды
NaH2P 0 4
KN03
(M W 2SO4
M gS04 х 7Н20
СаС12 х 2Н20
Н3ВО3
MnS04x H 20
СоС12 х 6Н20
CuS04 х 5Н20
ZnS04 х 7Н20
Количество
Компоненты среды
150
Na2M o04x 2Н20
2500
KJ
134
250
FeS04 х 7Н20
150
Тиамин (ВО
3,0
Пиридоксин (Вб)
10,0
Никотиновая к-та (РР)
С,025
Мезоинозит
В мг/л
Количество
0,25
0,75
28,0
10,0
1,0
1,0
100
0,025
2,0
20 000
Сахароза
pH - 5,5
Примечание - Среда широко применяется для выращивания каллусных и
суспензионных культур.
Таблица Г.4 - Среда Шенка и Хильдебрандта
Компоненты среды
K N 03
M gS04 7Н20
СаС12 х 2Н20
n h 4h 2p o 4
MnS04 х Н20
Н3В 0 3
ZnS04 х 7Н20
KJ
CuS04 х 5Н20
Na2M o04 х 2Н20
СоС12 х 6Н20
Количество
Компоненты среды
2500
FeS04 х 7Н20
400
№ 2ЭДТА х 2Н20
200
300
Тиамин (ВО
Пиридоксин (Вб)
10,0
Никотиновая к-та (РР)
5,0
Мезоинозит
1,0
1,0
0,2
Сахароза
0,1
0,1
pH - 5,9
В мг/л
Количество
15,0
20,0
5,0
0,5
5,0
1000
30 000
Примечание - Среда применяется для индукции образования каллусной ткани у
многих видов однодольных и двудольных растений.
89
Таблица Г.5 - Среда Нича
Компоненты среды
K N 03
NH4NO3
MgS04 х 7Н20
_____________________ _______ В мг/л
Количество
950
720
185
Компоненты среды
Количество
Мезоинозит
5 000
L-глутамин
800
L-серин
100
L-глутамин
400
MnS04 X Н ;0
50
3,0
L-аланин
L-цистеин
20
Н3ВО3
0,5
0,5
L-аргинин
10
ZnS04 х 7HjO
СоСЬ X 6Н2О
0,025
L-лейцин
10
C11SO4 х 5Н20
0,025
L-фенилаланин
10
0,025
L-тирозин
10
Na2Mo04
Fe-цитрат х 5Н20
10.0
Яблочная кислота
1000
Сахароза
34 200
pH 5,0
Примечание - Среда разработана для культуры изолированных не зрелых
зародышей.
Таблица Г .6 - Среда Велики и Роуза ( 7 IV )
Компоненты среды
(NH4)2S04
(NH4)2HP04
NH4NO3
N aN03
KNO3
Са (N 03)2 х 4Н20
MgCl2 х 6Н20
MnS04 х Н20
Н3ВО3
ZnS04 х 7Н20
СоС12 х 6Н20
CUSO4 х 5Н20
Количество
147
200
117
85
2190
324
210
4,0
5,0
1,5
0,25
0,25
Компоненты среды
Na2M o04 х 2Н20
KJ
В мг/л
Количество
0,25
0,25
FeS04 х 7Н20
№ 2ЭДТА х 2НгО
13.9
18,6
Тиамин (Bi)
Пиридоксин (Вб)
Никотиновая к-та
Са-пантотенат
Мезо-инозит
0,5
0,5
1,25
1,0
100
Сахароза
20 000
pH - 5,0
Примечание - Среда применяется для выращивания клеточной суспензионной а
культуры из корнеплода моркови._____________________________________________
Приготовление 20 кратного концентрата хелата железа
(Fe-хелата)
557 мг FeS04 х 7Н20 и 745мг Ьта2ЭДТА х 2Н20 растворяют по
отдельности, при нагревании (не доводя до кипения) в 30-40 мл
дистиллированной воды. Затем растворы объединяют и доводят до
общего объема - 100 мл. На 1 литр среды брать 5 мл концентрата.
90
Базовые составы питательных сред используемых для
культивирования протопластов
Т аблица Г .7 - С реда Као и М ихайлю ка__________________ _______ В мг/л
Компоненты среды
Количество Компоненты среды
Количество
NH3NO3
600
Мезоинозит
100
KNOj
1900
Никотинамид
1,0
600
СаС12 х 2Н20
Тиамин (В1)
1,0
M gS04x7H 20
300
Пиридоксин (Вб)
1,0
170
Са-пантотенат
КН2РО4
1,0
КС1
300
Фолиевая к-та
0,4
KJ
0,75
П-аминобензойная к-та
0,02
3,0
H3B03
Биотин
0,01
MnSC>4 х Н2О
10,0
Холинхлорид
1,0
2,0
ZnS04 x 7H20
Рибофлавин
0,2
Na2M o04 x 2H20
0,25
Аскорбиновая к-та
2,0
CuS04 x 5H20
0,025
Витамин А
0,01
CoC12 x 6H20
0,025
Витамин ДЗ
0,01
Витамин В12
0,02
FeS04 x7H20
28
Для клеток
Для протопластов
Сахароза
20 000
Сахароза
250
Глюкоза
10 000
Глюкоза
68 400
pH - 5,6
Примечание - Среда широко используется для культивирования протопластов
из листьев растений.
Т аблица Г .8 - С р еда КЗ
В мг/л
Компоненты среды
Количество Компоненты среды
Количество
NH3NO3
250
Na2M o04 х 2Н20
0,25
2500
M nS04 х Н20
K N 03
14,0
СаС12 х 2Н20
900
M gS04 х 7Н20
250
Fe-хвлат
250
NaH2P 04 х Н20
150
(NH4)2S 0 4
134
Мезоинозит
100
Никотиновая к-та
1,0
Н3ВО3
3,0
Тиамин
10,0
ZnS04х 7Н20
2,0
Пиридоксин
1,0
0,025
CuS04 х 5Н20
CoS04 х 720
0,025
Сахароза
10 000
KJ
0,75
Маннитол
72 800
pH - 5 ,7
Примечание - Среда КЗ рекомендована для культивирования протопластов из
каллусной ткани табака.____________________________________ _______________
91
Таблица Г.9 - Среда WSS
Компоненты среды
NH3NO3
СаС12 х 2НгО
MgSOi х 7Н20
КН2Р04
КС1
H3B03
ZnS04x7H 20
C11SO4 х 5Н20
C0SO4 х 7Н20
KJ
МпС12 х 4Н20
Na2M o04
2Н20
___________ _____ __________ В мг/л
Количество
Компоненты среды
1280
Fe-хвлат
600
300
Мезоинозит
170
Никотиновая кислота
300
Тиамин
Пиридоксин
6,0
10,0
Гидролизат казеина
0,025
0,025
Глюкоза
0,83
Ксилоза
24,0
0,25
Количество
250
100
1,0
10,0
1,0
500
72 000
250
p H -5 ,7
Примечание — Среда рекомендована для культивирования протопластов из
каллусной ткани картофеля.
Таблица Г. 10 - Базовые составы сред используемых для промывки
протопластов__________________ ___________________________В мг/л
Компоненты среды
Количество
Среда W5
NaCl
СаС12 х 2Н20
КС1
Глюкоза
9 000
18 400
800
1 000
Среда СПП
КН2 Р 04
KNO
СаС12 х 2Н20
M gS04 х 7НгО
KJ
CUSO4 х 5Н20
27
101
1 480
246
0,16
0,025
Среда СПП 13М
СПП
+13%маннита
Среда СПП 9М
СПП
+9 % маннита
Среда СПП 21С
СПП
+21 % сахарозы
p H -5 ,8
92
Таблица Г.11 —Базовые составы питательных сред для выращивания
водных культур растений_____________________________________В г/л
Количество
Компоненты среды
Среда Гельригеля
0,492
0,025
0,136
0,057
0,123
С а(Ш з )2
FeCl3
КН2РО4
КС1
M gS0 4 х 7Н20
Среда Кнопа
1,0
Ca(N0 3)2
KNO3
КС1
КН2РО4
M rS0 4 х 7Н20
5 % раствор FeCb
0,25
0,12
0,25
0,51
1 капля
93
Приложение Д
(справочное)
Расчеты приготовления растворов солей, ф иксаторов,
красителей
Расчеты при приготовлении водны х растворов солей.
Часто при приготовлении растворов макро- и микроэлементов
для питательных сред вместо безводных солей распоряжении
оказываются водные соли. Если взята водная соль, то необходимо
сделать перерасчет, так как нужно принимать во внимание и
кристаллизационную воду.
Например, при приготовлении среды Уайта требуется 200 мг/л
безводной N a2S04, а имеется только водная соль - N a 2S04 х ЮН20 .
Молекулярная масса N a2S 0 4 равна 142,04, a Na2S04 х 10Н20 322.20. Количество необходимой десятиводной соли находят из
расчета:
142,04 - 200
322,20 - X
X = 200 х 322,20/142,04 = 453,7 мг
Следовательно, следует взять 453,7 M rN a2S04 х 10Н20 на 1 литр
среды.
П риготовление абсолю тного(100 %) этилового спирта.
Абсолютный спирт готовят из 96 % этилового спирта тем
добавления в него соли безводного сульфата меди (CuS04). Водную
соль сульфата меди (медный купорос) предварительно измельчают в
ступке, затем прокаливают под тягой в фарфоровой чашке при
температуре 200 °С, постоянно перемешивая во избежание
потемнения порошка. В результате прокаливания водная соль теряет
кристаллизационную воду и приобретает беловато-серый цвет. Вт
стеклянную емкость, содержащую 1 л 96 % раствора этилового спирта
добавляют 200-50 г порошка обезвоженного сульфата меди.
Обезвоженная соль активно поглощает воду из спирта и порошок
приобретает первоначальный голубой цвет. Процедуру повторяют
несколько раз до прекращения изменения цвета порошка безводного
сульфата мели, что свидетельствует об удалении поды из спирта.
94
П ри готовлени е 70 % водного раствора этилового спирта.
Часто случается, что имеющийся 96 % этиловый спирт нужно
разбавить, т.е. уменьшить его концентрацию.
Возьмем наш случай, разбавления 96 % этилового спирта до
70 %. Пишем в начале так:
96
\
70,
/
0
где 96 концентрация взятого спирта;
0 - вода;
70 - требуемая концентрация.
Из 96 вычтем 70, и полученное значение пишем в правом нижнем
углу, затем вычтем 0 из 70, и значение запишем в правом верхнем
углу. Схема примет следующий вид:
96
70
\
/
/
\
0
26
Это значит, что к 70 мл 96 % раствора этилового спирта нужно
добавить 26 мл воды.
Данная схема дает приблизительные результаты и ее можно
пользоваться, когда не требуется особой точности.
Ф иксатор К арнуа.
Ш ироко используется в цитологической и эмбриологической
практике для изготовления постоянных препаратов. Он обладает
способностью быстро проникать в объекты. Продолжительность
фиксации 2-12 часов.
Состав фиксатора Карнуа (6:3:1): абсолютный этиловый спирт
или его 96 % раствор - 6 частей, хлороформ - 3 части, ледяная
уксусная кислота —1 часть.
М одификацией фиксатора Карнуа является фиксатор Кларка,
оказывающий более мягкое воздействие на объекты.
С остав ф иксатора К ларка (3:1): абсолютный этиловый спирт
или его 96 % раствор 3 части, ледяная уксусная кислота 1 часть.
95
Ф иксатор Ф А А .
Наиболее эффективен для фиксации каллусных тканей.
Преимущество данного фиксатора в том, что материал хранить в нем
можно в течение длительного периода времени. Минимальная
продолжительность фиксации 4 -6 часов.
Состав фиксатора ФАА (100 : 7 : 7): 70 % раствор этилового
спирта - 100 частей, формалин - 7 частей, ледяная уксусная кислота 7 частей.
П риготовление ацетокарм ина.
Для приготовления ацетокармина необходимо 60 мл ледяной
уксусной кислоты нагреть на водяной бане до появления паров,
добавить 1 г кармина, довести общий объем до 100 мл дистиллированной водой. Кипятить в течение 10 мин. Охладить и
перелить в емкость из темного стекла. Все операции проводить и
вытяжном шкафу!
Готовый раствор хранить в холодильнике при температуре
4-7 °С.
П р иготовление м етиленового синего.
Большинство рабочих растворов метиленовой сини готовится из
насыщенного спиртового раствора (3 г метиленового синего в 100 мл
96 % спирта).
Стандартный раствор метиленовой сини для окрашивания:
насыщенный раствор метиленового синего - 1 мл, вода 40 мл. Раствор
используют в течение месяца.
П риготовление сернистой воды.
К 200 мл проточной воды прибавляют 10 мл 10 % раствора
метабисульфита натрия и 10 мл 1ННС1.
П р иготовление 1Н НС1.
8,3
мл
концентрированной
соляной
дистиллированной водой до объема 100 мл.
кислоты
доводят
П р и готовл ен ие почвенной см еси.
Смешивают 1 часть легкой дерновой почвы с 1 частью хорошо
промытого крупного песка.
96
Приложение Е
(справочное)
Ф ерм енты , используем ы е и биотехнологии растений
Таблица Д. 1 - Список наиболее часто используемых ферментов
Название фермента
Onozuka RI
Cellulysin
Driselase
Celluiase
Cellulase RIO
Celluiase RS
Rhozyme HP 150
Hemicellulase
Macerozyme R IO
Macerase
Meicelase
Pectinol AC
Pectoliase 123
Pectinase
Производитель
Целлюлазы
Yakult Honsha Co., Nishinonyva, Japan Calbiochem, La
Jolla, CA, USA Kyowallakko Co.,: Tokyo, Japan Sigma
London Co.. Dorset, Yakult Honsha Co,. Nishinomiya,
Japan Yakult UK Honsha Co., Nishinomiya. Japan
Гемицеллюлазы
Rohm and Haas, NY, USA Sigma Chemical. St. Louis,
MO, USA
Пектиназы
Kiniki Yakult Co., Nishinomiya, Japan Calbiochem, La
Jolla, CA, USA Meiji Seika Kaisha, Tokyo, Japan Corning,
Glass, Corning, NY,USA Seishim Pharmaceutical, Tokyo,
Japan Sigma Chemical, St.Louise, MO,USA FarbwerkeHoechst AG, Frankfurt, Germany
Таблица Д.2 - Смеси ферментов, используемые для изолирования
протопластов___________ _______________________ ___________________
Смесь ферментов
Вид растения, ткань
Мейцелаза, 1,5 %
Листья герани, петунии,
Мацерозим R, 100,05 %
табака и большинства
Среда 13М
видов растений
СПП Антибиотики
pH 5,8
Мейцелаза, 1,5%
Растения с неотделяемым
Мацерозим R I0,0,05%
нижним эпидермисом
Среда СПП 21С
листьев
Антибиотики pH 5,8
Розим HP 150, 2 %
Каллусные
ткани
и
Мейцелаза, 2 %
суспензии
клеток
Мацерозим R10, 0,03 %
большинства растений
Среда СПП 13МрН5,8
Мейцелаза, 3%
Листья пшеницы или ячменя
Мацерозим R10, 0,08 %
Декстран сульфата калия, 0,75
%
Маннит, 14 %
Антибиотики pH 5,6
97
Примечания
Механически удаляют
нижний эпидермис
Предварительно
обрабатывают в
1 % растворе рогмента
Р, в среде СПП 13М
Можно использовать
для изолирования
протопластов из корней,
семядолей
Листья нарезают на
полоски, инкубируют
в течение ночи (без
удаления эпидермиса)
Продолжение таблицы Д.2
Дрейселаза, 2 %
Среда СПП 13М
Дрейселаза, 2 %
Среда СПП 9М
Целлюлизин, 2 %
Мацерозим
R10,
0,2
Гемицеллюлоза, 0,5 %
Декстран сульфата
калия, 1 %
Маннит, 11 %
pH 5,8
Целлюлизин, 1 %
Мацерозим R10,
Среда СПП 13М
pH 5,6
Проросшая
пыльца Перед проращиванием
большинства растений
пыльцу хранят при 4 °С
Пыльца
на
стадии
терады большинства видов
растений
Листья
злаков
с
% удаленным нижним
эпидермисом
Перед проращиванием
пыльцу хранят при 4 °С
Инкубируют 1-2 часа в
в темноте при 30 °С
Гипокотель,
стебель, Инкубируют в течение
черешок листа большинства ночи
в
темноте
видов растений
нарезанными на кусочки
98
I <не|||*нмм»>
1
2
3
4
5
6
7
8
Введение
Общие требомпмия к п р и н т типи рнПш
н мупьгург рис (игольных
Дедиффсрсмщтпин и ....... .
клеток и тканей
Суспензионные культуры
Регуляции процессом морфогонс ш и культуре клоток и тканей
Микроклональное ршмножение рясгепий и получение
оздоронлснноп) поопдочного митсримли
Культура гаплоидных клеток
Культура июлмрошшных шродышсй
Выделение протопластов
Литература
Приложение А. Краткая терминология
Приложение Б. Условные сокращения
Приложение В. Стерилизующие вещества
Приложение Г. Базовые составы питательных сред для
культивирования изолированных тканей и органов растений
Приложение Д. Расчеты приготовления растворов солей,
фиксаторов, красителей
Приложение Б. Ферменты, используемые в биотехнологии
растений
3
4
18
26
30
34
56
65
70
75
77
84
85
88
94
97
Г. Г. Джаксыбаева, А. К. Султумбаева
КУЛЬТУРА ТКАНЕЙ И
БИОТЕХНОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ
Учебное пособие
Технический редактор 3. Ж. Шокубаева
Ответственный секретарь Е. В. Самокиш
Подписано в печать 21.04.2015г.
Г арнитура Times.
Формат 29,7 х 42 %. Бумага офсетная.
Усл.печ. л. 4,11 Тираж 300 экз.
Заказ № 2557
Издательство «КЕРЕКУ»
Павлодарского государственного университета
им. С.Торайгырова
140008, г. Павлодар, ул. Ломова, 64
2015 г.
Авторы: Джаксыбасмп I Г , ( ’унтумбиоии Л К.
Kni|Hvipii «Киотехноло! ни»
Культура тканей и биотехнология растений
Учебное пособие
Одобрено на заседании кафедры d l
o<
l
2015 г. Протокол №
Заведующий кафедрой
Одобрено учебно-методическим советом АТФ clV
Протокол № Ъ
О-Ь
2015 г.
К. К. Сейтханова
Председатель УМС
Одобрено
учебно-методическим
советом
государственного
университета
имени
С.
04
2015 г. Протокол № Э
Павлодарского
Торайгырова
СОГЛАСОВАНО
деканом АТФ
//4 * ^
Т. К. Бексеитов <10 О Ъ
2015г.
Нормоконтролёр (
ОМ К
Г. С. Баяхметова 4 /
2015 г.
ОДОБРЕНО
Начальник УМО
g fe
А. Б. Темиргалиева jtjh О Ч
2015 г.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
1
Размер файла
2 355 Кб
Теги
rastenia, kultura, sultumbaeva, tkaney, 3951, biotehnologiya, djaksibaeva
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа