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Generic
(14/ 109)
[6][_]
Ribonucleotide
(41)
[7][_]
NUCLEOTIDES
(27)
[8][_]
dinucleotide
(16)
[9][_]
oligonucleotide
(7)
[10][_]
trinucleotide
(6)
[11][_]
acid
(3)
[12][_]
phosphodiester
(2)
[13][_]
Nucleic Acids
(1)
[14][_]
mononucleoside diphosphate
(1)
[15][_]
nucleoside
(1)
[16][_]
phosphoester
(1)
[17][_]
nucleotide monophosphate
(1)
[18][_]
mononucleotides
(1)
[19][_]
phosphates
(1)
[20][_]
Molecule
(36/ 106)
[21][_]
ADENOSINE TRIPHOSPHate
(25)
[22][_]
phosphate
(7)
[23][_]
TEAB
(6)
[24][_]
OH
(5)
[25][_]
DTT
(5)
[26][_]
Cytosine
(4)
[27][_]
MOPS
(4)
[28][_]
HEPES
(4)
[29][_]
dimethylsulfoxide
(4)
[30][_]
adenine
(3)
[31][_]
guanine
(3)
[32][_]
uracile
(3)
[33][_]
inosine
(3)
[34][_]
mercury
(3)
[35][_]
Guanosine
(2)
[36][_]
pyrophosphate
(2)
[37][_]
Tris
(2)
[38][_]
Cl
(2)
[39][_]
methanol
(2)
[40][_]
Adenosine
(1)
[41][_]
Uridine
(1)
[42][_]
triethyl bicarbonate ammonium
(1)
[43][_]
DL-dithiothreitol
(1)
[44][_]
o-nitrobenzyl phosphate
(1)
[45][_]
3-(N-morpholino)propane
(1)
[46][_]
N-2-hydroxyethylpiperazine
(1)
[47][_]
YOH
(1)
[48][_]
ADP
(1)
[49][_]
p11-adenosine
(1)
[50][_]
citrate
(1)
[51][_]
ammonium formate
(1)
[52][_]
2-mercaptoethanol
(1)
[53][_]
sodium citrate
(1)
[54][_]
water
(1)
[55][_]
4 Ap
(1)
[56][_]
tri-adenosine phosphate
(1)
[57][_]
Gene Or Protein
(16/ 85)
[58][_]
LIGASE
(30)
[59][_]
Etre
(15)
[60][_]
Kinase
(10)
[61][_]
Phosphatase
(8)
[62][_]
PNK
(6)
[63][_]
Protein
(3)
[64][_]
Frac
(3)
[65][_]
Polynucleotide Phosphorylase
(2)
[66][_]
Phosphorylase
(1)
[67][_]
OPO
(1)
[68][_]
Phosphodiesterase
(1)
[69][_]
Fbz
(1)
[70][_]
BAP C
(1)
[71][_]
Cl 2
(1)
[72][_]
Ap A
(1)
[73][_]
Pke
(1)
[74][_]
Physical
(34/ 70)
[75][_]
1 l
(10)
[76][_]
de 100 m
(6)
[77][_]
4 l
(6)
[78][_]
de 20 m
(4)
[79][_]
de 1 M
(4)
[80][_]
de 1,0 m
(4)
[81][_]
de 300 watts
(2)
[82][_]
0,8 M
(2)
[83][_]
260 nm
(2)
[84][_]
5 g
(2)
[85][_]
1,0 M
(2)
[86][_]
de 3,3 m
(2)
[87][_]
de 0,1 M
(2)
[88][_]
de 100 percent
(2)
[89][_]
280 nm
(1)
[90][_]
800 volts
(1)
[91][_]
de 15 m
(1)
[92][_]
0,87 m
(1)
[93][_]
58 g
(1)
[94][_]
3,4 m
(1)
[95][_]
50 m
(1)
[96][_]
50 g
(1)
[97][_]
30 minutes
(1)
[98][_]
de 26 m
(1)
[99][_]
90 minutes
(1)
[100][_]
de 5 cm
(1)
[101][_]
15 minutes
(1)
[102][_]
de 25 g
(1)
[103][_]
1 mg/cm
(1)
[104][_]
1,2 m
(1)
[105][_]
120 g
(1)
[106][_]
100 percent
(1)
[107][_]
10 mg/cm
(1)
[108][_]
2,0 M
(1)
[109][_]
Substituent
(4/ 35)
[110][_]
phosphoryl
(21)
[111][_]
hydroxyl
(12)
[112][_]
se-9-phosphoryl
(1)
[113][_]
phospho
(1)
[114][_]
Polymer
(6/ 26)
[115][_]
Polynucleotide
(15)
[116][_]
DEAE Sephadex A-25
(6)
[117][_]
Ribonucleic Acid
(2)
[118][_]
POLYRIBONUCLEOTIDES
(1)
[119][_]
DEAE Sephadex
(1)
[120][_]
Sephadex
(1)
[121][_]
Organism
(2/ 2)
[122][_]
Escherichia coli
(1)
[123][_]
bacteriophage
(1)
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Publication
_________________________________________________________________
Number FR2522682A1
Family ID 2023022
Probable Assignee Innovax Lab Ltd
Publication Year 1983
Title
_________________________________________________________________
FR Title PROCEDE DE PRODUCTION DE POLYRIBONUCLEOTIDES PREDETERMINES
Abstract
_________________________________________________________________
L'INVENTION CONCERNE UN PROCEDE DE SYNTHESE D'ARN D'UNE SEQUENCE
PREDETERMINEE DE BASES EN UTILISANT L'ENZYME T4 ARN LIGASE, SELON
LEQUEL ON AJOUTE UN DONNEUR DE MANIERE SPECIFIQUE A L'EXTREMITE 3
HYDROXYLEE D'UN RECEVEUR COMPORTANT AU MOINS DEUX BASES, DU ADENOSINE
TRIPHOSPHate ETANT PRESENT COMME SOURCE D'ENERGIE POUR L'ADDITION SI
LE DONNEUR EST CONSTITUE DE DEUX BASES DE NUCLEOTIDES OU PLUS.
Description
_________________________________________________________________
-1- Il y a trois etapes generales impliquees dans la production d'une
protein par utilisation de techniques de genie genetique La premiere
etape comprend la production en laboratoire ou l'isolement et la
purification du gene desire qui gouverne la synthese d'une protein
particuliere. La deuxieme etape est la recombinaison du gene avec un
vecteur de transfert approprie tel qu'un plasmide La troisieme etape
comprend le transfert du vecteur recombine dans un microorganisme
particulier et l'induction du micro- organisme a produire le produit
correspondant au gene particulier. La presente invention concerne un
procede pour l'execution de la premiere etape La methodologie courante
pour la production in vitro de genes par addition successive de
nucleotides consiste a utiliser des techniques chimiques (Itakura, K
et Riggs, A, Science 209:1401 (1980), (Khorana, H G, Science 203:614
(1979), des techniques enzymatiques (S Gillam, P Jahnke, C Astell, S
Phillips, C.A Hutchinson, M Smith, Nucleic Acids Res 6,2973 (1979) et
des techniques en phase solide pour produire les mole- cules desirees
d'ADN ou d'ARN Les techniques chimiques de synthese d'ADN sont
fastidieuses parce que les reactions impliquees sont non-specifiques,
de sorte qu'une purification poussee du produit desire est necessaire
apres chaque etape operatoire Ainsi, la synthese d'ARN ou d'ADN par
des techniques chimiques est notablement moins avantageuse que des
systemes enzymatiques parce que de plus grandes quan- tites de matiere
de depart sont necessaire pour l'obtention de productions comparables,
ce qui augmente les couts, les techniques de purification sont longues
et entrainent de grandes pertes de matiere, un peu de produit etant
perdu a chaque etape, et le grand nombre d'etapes impliquees dans le
blocage et le deblocage de sites reactifs entraine de nombreuses
occasions d'erreurs et un risque de contamination par des enzymes
degradantes qui detruisent le produit forme par synthese.
-2- La synthese enzymatique d'ARN en utilisant de la polynucleotide
phosphorylase et de la T 4 ARN ligase a ete rapportee La methode
utilisant la polynucleotide phosphorylase est limitee a la production
d'oligodesoxynucleo- tides Dans des conditions controlees, la
polynucleotide phosphorylase ajoute principalement un seul nucleotide
a un oligodesoxynucleotide court qui est ensuite isole par des
techniques chromatographiques Les techniques en phase solide sont
mises en oeuvre en liant la cha Tne du nucleotide a une matiere solide
de support et en utilisant la methodologie chimique ci-dessus pour
ajouter des nucleotides d'une maniere echelonnee.
La presente invention enseigne la composition et le procede de
production d'un compose utile dans la synthese d'une sequence
predeterminee d'ARN en utilisant l'enzyme T 4 ARN ligase Des procedes
pour la transcription de i'ARN forme par synthese en ADN de maniere
que le gene obtenu par synthese puisse etre incorpore dans un
plasmide, insere dans un microorganisme et exprime sont connus dans la
technique.
L'existence, la purification et le mecanisme de l'enzyme T 4 ARN
ligase qui est isolee a partir d'Escherichia coli infecte de
bacteriophage T 4 ont ete decrits (Silber, R., Malathi, V G et
Hurwitz, J, Proc Natl Acad Sci. (1972) 69:3009) Cette enzyme catalyse
la formation d'une liaison phosphodiester entre le groupe phosphate
sur l'extremite 5 ' d'un nucleotide donneur et le groupe hydroxyl sur
l'extremite 3 ' de l'oligonucleotide receveur comme indique
ci-dessous.
3 ' 5 ',
OH + H 203 PO OPO + H 2
OH La demande de brevet japonais 1980-19003 (publiee le 9 fevrier
1980) enseigne l'utilisation de la T 4 ARN ligase -3- pour
l'elongation d'un polynucleotide par attachement d'un seul
mononucleoside diphosphate (p Np) sur l'extremite 3 ' d'une sequence
de nucleoside sans groupes phosphate ter- minaux Cette methodologie
exige comme substrat de depart un trinucleotide, que l'on doit se
procurer dans le com- merce ou preparer par synthese par des
techniques chimiques, et exige du adenosine triphosphate (adenosine
triphosphate) comme source d'energie pour la reaction, De plus,
l'invention enseigne seulement l'addition d'une base unique et n'est
pas capable de produire des oligo ou polynucleotides pour lesquels des
additions successives sont necessaires.
HO Ap Ap AOH +p Cp + adenosine triphosphate HO Ap Ap Ap Cp + AMP+ P Pl
Les abreviations utilisees pour des raisons de com- modite dans la
presente demande de brevet sont indiquees dans le Tableau 1.
Abreviation A C G U
N,X,Y,Z
ADN ARN BAP VPD App Np jil nm TEAB DTT PNK
Tableau 1
Definition Adenosine Cytosine Guanosine Uridine Ribonucleotide
quelconque Acide desoxyribonucleiquacid ribonucleic acid Phosphatase
alcaline bacterienne Phosphodiesterase de venin
' 5 ' 3 '
A p N p (voir texte pour explication complementaire) liaison de
phosphoester cyclise en 2 ' 3 ' Microlitre Nanometre
Tampon triethyl bicarbonate ammonium DL-dithiothreitol (reactif de
Cleiland) Polynucleotide kinase -4pnbzl 'Groupe o-nitrobenzyl
phosphate UV Rayons ultra-violets
MOPS acid3-(N-morpholino)propane- sulfonique HEPES
acidN-2-hydroxyethylpiperazine- N'-2-ethanesulfonique
La presente invention enseigne la synthese de mole- cules d'ARN et
d'ADN biologiquement actives Toutes les sequences de nucleotides sont
indiquees par leurs abre- viations selon le Tableau 1 Toutes les
liaisons phospho-diester entre nucleotides sont des liaisons 3 '-5 ',
a moins d'indication contraire.
L'invention decrite ici enseigne des procedes de synthese de molecules
d'ARN a un seul brin d'une sequence de basespredeterminee en utilisant
l'enzyme T 4 ARN ligase pour ajouter specifiquement un mono-, di-,
oligo ou polynucleotide (le donneur) sur l'extremite 3 ' d'une
sequence de ribonucleotide de deux bases ou plus longue (le receveur)
par une liaison 5 '-3 ' Le receveur le plus court sur lequel la T 4
ARN ligase agira dans la catalyse est un dinucleotide phosphoryl dans
la position 5 ' Si le receveur est un tri-nucleotide ou est plus long,
l'extremite terminale 5 ' peut etre phosphorylee ou hydroxylee pour
permettre une addition specifique du donneur a l'extremite 3 ' du
receveur A propos de la methode d'addition d'une base unique comme
donneur sur l'extremite d'un receveur, si la matiere de depart pour le
receveur est un dinucleotide obtenu commer- cialement ou obtenu par
synthese par des techniques chi- miques connues de l'homme de l'art,
la premiere etape consiste a phosphoryler l'extremite 5 ' libre On
conduit cette etape en melangeant le dinucleotide avec adenosine
triphosphate en presence de l'enzyme polynucleotide kinase (PNK)
(Richardson, C C, Proc Natl Acad Sci U S A 54, 158 (1965)) qui
phosphoryl de maniere specifique l'extremite 5 ' d'un nucleotide comme
represente dans l'equation 1 Si le receveur est un trinucleotide ou
est plus long, cette etape - de phosphorylation n'est pas necessaire.
(1)OH Xp YOH + adenosine triphosphate P Xp Yo H + ADP La deuxieme
etape consiste a melanger le dinucleotide receveur avec le compose
chimique p11-adenosine, p 2-(3 ' nucleotide monophosphate)-5 '
pyrophosphate de la formpyrophosphate (App Np), o N est un
ribonucleotide choisi dans le groupe adenine, cytosine, guanine,
uracile et inosine Le compose App Np et sa synthese sont decrits dans
la demande de brevet au nomr de la Demanderesse intitule Composition
et procede pour former A 5 p p N p (App Np) La reaction du
ribonucleotide receveur connu avec le compose App Np en presence d'ARN
ligase entraine la pro- duction d'un nucleotide comme represente dans
l'equation 2.
Cette reaction n'exige pas adenosine triphosphate comme source
d'energie.
(2) p Xp Yo H + App Np ARN ligase p Xp Yp Np + A p p OH pp p >p p pp p
La presente invention decrit aussi un procede pour l'addition d'une
molecule d'ARN donneur d'une longueur de 2 bases ou plus a un
ribonucleotide receveur de maniere que le groupe phosphate en position
5 ' sur le donneur se lie specifiquement au groupe hydroxyl a la
position 3 ' du receveur en presence d'adenosine triphosphate et d'ARN
ligase pour former un ribonucleotide allonge (equation 3) Le groupe
phosphate sur l'extremite 3 ' de la molecule du donneur rend cette
extremite non-reactive avec l'ARN ligase, de facon a empecher une
addition supplementaire des molecules de donneur Pour ce procede
egalement, si le receveur est un dinucleotide, il doit etre phosphoryl
sur l'extremite ', tandis que si c'est un trinucleotide ou s'il est
plus long, une phosphorylation n'est pas necessaire
(equation 4).
(3) p Xp Yo H+ p Yp Zp ARN ligase > p Xp Yp Yp Zp (4) X Yo + Appnbzl
ARN ligase, p Xp Ypnbz 4) p p OH ppnbzl? p p pnbzl Pour phosphoryler
l'extremite 3 ' de la molecule du donneur, on fait reagir le
dinucleotide phosphoryl en 5 ' -6- avec le compose Appnbzl en presence
d'ARN ligase (equation 4) La portion nbzl peut etre eliminee du
nucleotide resultant par exposition a une lumiere intense (equation
5).
(5)p Xp Ypnbzlumiere Xy + nbzl p ppnbzl > XY +fbz Le ribonucleoride
allonge resultant peut etre traite ensuite par une phosphatase
alcaline bacterienne (BAP) qui elimine les groupes phosphate
terminaux, le preparant a servir de receveur, ou il peut etre traite
par une polynucleotide kinase (PNK) phosphorylant la position 5 ' de
facon a le transformer en un donneur (equation 6).
ARN l i a e p p p p D (6) X X X+ Y Z AR se X X X Y Z XX YZ p p p p p
adenosine triphosphate P pp P P - p pp pp Ap K X X X y Z qrp XXXYZ Les
reactions decrites ci-dessus sont des exemples d'un certain nombre de
procedes de production de nucleotides Ces procedes peuvent etre
utilises efficacement sur des oligonucleotides plus longs aussi bien
que sur les dinucleotides decrits dans la presente description De
cette maniere, on peut faire la synthese de molecules entieres d'ARN
gouvernant la production de proteins particulieres. Pour chacune des
reactions decrites ci-apres, il est necessaire de determiner
l'identite des produits de reaction L'identification des produits de
reaction dans tous ces exemples est effectuee en determinant les
rapports d'absorption a 250, 260 et 280 nm et en les comparant a des
etalons connus L'identification et la determination de la purete sont
effectuees aussi par electrophorese sur papier au p H 5,0 dans un
tampon citrate de sodiumecitrate au p H 2,8 dans du tampon ammonium
formate a 800 volts pendant
1 heure.
La presente invention enseigne l'utilisation de T 4 ARN ligase dans la
preparation de nucleotides d'une -7- sequence de bases predeterminee
Comme decrit ci-dessus d'une maniere generale, deux procedes sont
enseignes Un procede enseigne l'addition de mononucleotides donneurs a
un ribonucleotide receveur comportant au moins deux -bases L'autre
procede enseigne l'addition de nucleotides donneurs ayant deux bases
ou plus, La decision en ce qui concerne lequel de ces procedes on doit
utiliser depend de la composition de la sequence de bases du
nucleotide desire et de la nucleotides prepares commercialement a
utiliser comme matieres de depart.
Dans la synthese d'un trinucleotide d'une sequence de bases
predeterminee a partir d'un dinucleotide connu et d'un compose App Np,
il est necessaire d'abord de phosphoryler l'extremite 5 ' libre du
dinucleotide On utilise a cet effet l'enzyme polynucleotide kinase
dans des conditions connues dans la technique.
Apres l'etape de phosphorylation, il est necessaire d'isoler le
dinucleotide phosphoryl des autres constituants du melange de reaction
On effectue cela en fractionnant le melange de reaction et en traitant
les fractions combinees contenant le dinucleotide phosphoryl par l'AT
Pase qui elimine un pyrophosphate de pyrophosphate 'adenosine
triphosphate contaminant la masse de dinucleotide phosphoryl
L'isolement du dinucleotide phosphoryl par fractionnement est alors
possible.
L'AT Pase utilisee dans l'exemple 1 ci-apres a ete obtenue et purifiee
comme sous-produit de la purification de la T 4 ARN ligase, toutefois
n'importe quelle AT Pase serait efficace. On fait ensuite incuber le
dinucleotide phosphoryl ou une autre forme de nucleotide receveur avec
un compose App Np, le compose particulier a utiliser etant un compose
pour lequel N est le nucleotide a ajouter a l'extremite 3 ' du
dinucleotide Les conditions preferees de reaction sont indiquees dans
les exemples ci-apres.
-8- Finalement, le nucleotide resultant peut etre traite par une
phosphatase qui elimine les phosphates terminaux, laissant des groupes
hydroxyl sur les extremites 5 ' et 3 ' Les conditions pour les
reactions des phosphatases, dependant de la phosphatase utilisee, sont
bien connues dans la technique Le nucleotide traite par la phosphatase
est ensuite prepare par des additions suivantes comme decrit ci-apres.
L'addition de ribonucleotides donneurs ayant deux bases ou plus peut
etre effectuee a l'extremite 3 ' d'un ribonucleotide receveur en
phosphorylant les extremites ' et 3 ' du donneur et en mettant a
incuber le donneur phosphoryl avec le receveur en presence d'ARN
ligase et d'adenosine triphosphate Le ribonucleotide receveur pour
cette reaction doit etre un dinucleotide phosphoryl en 5 ' ou un
oligo- nucleotide avec une extremite 5 ' phosphorylee ou libre.
Pour phosphoryler l'extremite 5 ' du ribonucleotide donneur, on fait
incuber le ribonucleotide avec Appnbzl en presence d'ARN ligase, de
maniere a lier la portion pnbzl a l'extremite 3 ' On fait bouillir le
melange de reaction pour inactiver l'ARN ligase et ensuite on le
melange avec adenosine triphosphate en presence de polynucleotide
kinase pour phosphoryler l'extremite 5 ' de la molecule du donneur.
On isole le donneur et on peut ensuite l'exposer a une lumiere intense
comme celle d'une lampe a vapeur de mercury de 300 watts pour eliminer
la portion nbzl, laissant le donneur se phosphoryler aux extremites 5
' et 3 ' On peut ajouter le donneur au receveur avec ou sans
elimination de la portion nbzl.
Apres l'addition du ribonucleotide donneur au receveur, le nucleotide
allonge resultant peut etre traite par une phosphatase pour
elimination de tous les groupes phosphate terminaux de facon qu'il
soit mis a une forme dans laquelle il pourra agir comme receveur En
variante, le nucleotide allonge peut etre traite par PNK de facon
qu'il se-9-phosphoryl a l'extremite 5 ' et qu'il puisse etre utilise
comme donneur.
On envisage que toutes les etapes de purification dans lesquelles la
methode preferee decrite est un frac- tionnement utilisant une colonne
de DEAE Sephadex peuvent aussi etre effectuees par chromatographie en
phase liquide a haute pression, chromatographie sur couche mince,
electrophorese sur gel et sur papier et d'autres techniques connues de
separation, sans qu'on sorte pour autant du cadre general de la
presente invention.
Exemple 1
Synthese d'Ap Gp A On melange d'abord de l'edenylyl (3 ' 5 ')
guanosine (Ap G) avec adenosine triphosphate en presence de
polynucleotide kinase de maniere a former p Ap G Le melange
reactionnel contenant gl de 15 m M AG (SIGMA), 60 gl de l M Tris-H Cl
(p H 8,1), il de 2-mercaptoethanol, 100 il de 100 m M Mg C 12, 150 il
de 20 m M adenosine triphosphate, 50 il de H 20 et 100 il de PNK (1500
unites/ cm 3) est mis a incuber a 37 C pendant 1 heure, puis frac-
tionne par une colonne de DEAE Sephadex A-25 sur un gradient lineaire
de 0,2 a 0,8 M TEAB (p H 7,6) Le qua- trieme pic contenant adenosine
triphosphate et p Ap G comme identifie par - absorption UV est
combine, porte a sec avec du methanol sous vide et ensuite lyophilise.
Pour separer l'adenosine triphosphate du p Ap G, la fraction combinee
est traitee par l'AT Pase et fractionnee sur une colonne. il du
melange p Ap G/adenosine triphosphate (A 260 = 49,2), 100 gl de m M
DTT, 100 il de 1 M MOPS, p H 7,9, 150 gl de 100 m M Mg C 12, 800 i 1
de H 20 et 250 il de T 4 AT Pase (5000 unites/ cm 3) sont melanges et
mis a incuber pendant 1 heure a 37 C.
Le produit resultant est fractionne sur une colonne de DEAE Sephadex
A-25 sur un gradient lineaire de 0,2 0,8 M TEAB (p H 7,6) On combine
le deuxieme pic majeur a 260 nm, la fraction p Ap G. -10- La fraction
de p Ap G provenant de la reaction ci-dessus est utilisee ensuite dans
la synthese de p Ap Gp Ap On obtient la T 4 ARN ligase en utilisant la
methode de Silber et autres 112 1 l de p Ap G (0,87 m M), 58 g 1 d'App
Ap (3,4 m M), 15 gl de l M HEPES, p H 7,5 et 50 U 1 d'ARN ligase (1500
unites/cm 3) sont melanges et mis a incuber pendant 1 heure a la
temperature ambiante On fractionne le melange resultant sur DEAE
Sephadex A-25 et le pic de p Ap Gp Ap est identifie par electrophorese
sur papier au p H 5,0 dans du tampon sodium citrate 50 m M La fraction
de p Ap Gp Ap combinee est evaporee a sec en presence de methanol sous
vide et lyophilisee.
On traite ensuite l'echantillon par de la phosphatase alcaline
bacterienne (BAP) 40 il de p Ap Gp Ap (environ 1,0 unite a 260 nm), 5
g 1 de 1 M Tris-H Cl, p H 8,1, 5 g 1 de BAP C (200 unites/cm 3,
Worthington Biochemical) et 50 g 1 de H 20 sont mis a incuber pendant
30 minutes a 65 C et fractionnes sur une colonne de DEAE Sephadex A-25
avec un gradient lineaire de 0,1 a 1,0 M TEAB, p H 7,6 On combine les
fractions contenant Ap Gp A.
Exemple 2
Synthese de p GA Up a partir de GAU
On determine par electrophorese la purete du tri-nucleotide GAU
(Collaborative Research) Un melange reac- tionnel contenant 225 il de
26 m M Appnbzl, 300 1 de 3,3 m M Gp Ap U, 75 il de 1 M MOPS, p H 7,9,
300 Al de 0,1 M Mg Cl 2, 4 l de 100 m M DTT, 120 4 l de H 20, 180 4 l
d'ARN ligase et 4 l de 100 percent dimethylsulfoxide DMSO sont mis h
incuber a la temperature ambiante pendant 2 heures On fait bouillir
ensuite le melange de reaction pendant deux minutes et on melange
ensuite 1400 il d U melange ayant bouilli avec 300 4 l de 20 m M
adenosine triphosphate, 200 4 l de 100 m M DTT et 100 gl de PNK (1500
unites/cm 3) et on fait incuber l'ensemble pendant 90 minutes a 37 C.
-11- On fractionne ensuite le melange de reaction sur une colonne de
DEAE Sephadex A-25 avec un gradient lineaire de 0,1 M A 1,0 M de TEAB,
p H 7,6, On combine le quatrieme pic contenant le p Gp Ap Upnbzl et on
l'expose ensuite a une lampe a vapeur de mercury de 300 watts a une
distance de 5 cm pendant 15 minutes dans une chambte refroidie par
enveloppe d'water.
Exemple 3
Ap Ap A + p Gp Anbzl >AAAGA Le melange reactionnel constitue de 34 Ul
de 3,3 m M AAA (Boehringer), de 70 1 l de 1,0 m M p Gp Apnbzl (prepare
par synthese par la methode de l'exemple 2), de 40 1 l de 1,0 M HEPES,
p H 7, 83, de 5 il de 1,0 M Mg C 12, de 25 g 1 de 20 m M adenosine
triphosphate (SIGMA), de 2 1 l d'albumine de serum bovin (BSA)(1 mg/cm
3), de 40 i 11 d'ARN ligase (1500 unites/cm 3 et de 20 il de 100
percent dimethylsulfoxyde est mis a incuber toute une nuit a la
temperature ambiante On fractionne le melange de reaction sur une
colonne de DEAE Sephadex A-25.
Le sixieme pic ayant les rapports d'absorption a 250/260 = 1,17 et a
280/260 = 0,667 est identifie comme etant le produit AAAG Apnbzl
L'oligonucleotide est ensuite expose a la lampe a vapeur de mercury
comme decrit dans l'exemple 2 pour elimination du groupe nbzl.
Exemple 4
Ap Cp Cp U + p Cp Cp Gp Ap 4 Ap Cp Cp Up Cp Cp Gp Ap Le melange
reactionnel contenant 75 il de (1,2 m M) ACCU (qui peut etre prepare
par synthese en operant comme dans l'exemple 1), 90 il de 1 m M p CCG
Ap (exemple 1), 30 1 l de 1,0 M MOPS (p H 7,9), 120 g 1 de 100 m M Mg
C 12, 70 1 l de 100 m M DTT, 60 1 l de DMSO (100 percent), 60 1 l de
20 m M adenosine triphosphate, 1 l de BAS (10 mg/cm 3), 60 gl d'ARN
ligase (1500 unites/ cm 3) et 100 1 l de H 20 est mis a incuber a la
temperature ambiante (environ 240 C) pendant 16 heures, On fractionne
le melange sur une colonne de PEAE Sephadex A-25 avec un gradient
lineaire de 0,1 a 2,0 M TEAB, p H 7,5, et le sixieme -12- pic est
identifie par absorption UV comme etant le polynucleotide Ap Cp Cp Up
Cp Cp Gp Ap.
-13-
Claims
_________________________________________________________________
REVENDICATIONS
1 Un procede de synthese d'ARN d'une sequence pke- determinee de bases
en utilisant l'enzyme T 4 ARN ligase, selon lequel on ajoute un
donneur de maniere specifique a l'extremite 3 ' hydroxylee d'un
receveur comportant au moins deux bases, du adenosine triphosphate
etant present comme source d'energie pour l'addition si le donneur est
constitue de deux bases de nucleotide ou plus.
2 Un procede pour ajouter un ribonucleotide unique predetermine a un
ribonucleotide receveur ayant au moins deux bases, selon lequel: on
melange le ribonucleotide receveur avec un com- pose de la forme App
Np en presence de T 4 ARN ligase dans des conditions qui favorisent le
transfert de la portion p Np du compose App Np au ribonucleotide
phosphoryl a l'extremite
3 ', le N du compose App Np etant un ribo- nucleotide choisi parmi
l'adenine, la guanine, la cytosine, l'uracile et l'inosine. 3 Un
procede pour ajouter un ribonucleotide pre- determine comportant au
moins 2 bases a un ribonucleotide receveur comportant au moins deux
bases, qui comprend les etapes consistant a: phosphoryler
specifiquement l'extremite 3 ' du ribonucleotide donneur; phosphoryler
l'extremite 5 ' du ribonucleotide donneur; faire incuber le
ribonucleotide receveur avec le ribonucleotide donneur phosphoryl en
presence de T
4 ARN ligase dans des conditions qui permettent la formation d'une
liaison covalente entre le ribonucleotide receveur et le donneur. 4 Un
procede selon la revendication 2, caracterise en ce que le
ribonucleotide receveur est choisi parmi un diribonucleotide
phosphoryl en
5 ' et hydroxyl en 3 ', un oligonucleotide phosphoryl a l'extremite 5
' et hydroxyl a l'extremite 3 ' et un oligonucleotide hydroxyl aux
extremites 5 ' et 3 '. Un procede selon la revendication 3,
caracterise en ce que le nucleotide receveur est choisi parmi un
diribonucleotide phosphoryl en 5 ' et hydroxyl en 3 ', un
oligonucleotide phosphoryl a l'extremite 5 ' et hydroxyl a l'extremite
3 ' et un oligonucleotide hydroxyl aux extremites 5 ' et 3 '.
6 Un procede selon la revendication 5, caracterise en ce qu'il
comprend en outre l'etape consistant a faire la synthese du
ribonucleotide phosphoryl en 5 ' et hydroxyl en 3 ' en faisant reagir
un ribonucleotide hydroxyl aux extremites 3 ' et 5 ' libres avec du
tri-adenosine phosphate (adenosine triphosphate) en presence de
polynucleotide kinase.
7 Un procede selon la revendication 6, caracterise en ce qu'il
comprend en outre les etapes selon lesquelles: on fait reagir un
ribonucleotide hydroxyl aux extremites 3 ' et 5 ' libres avec
adenosine triphosphate en presence de polynucleotide kinase de maniere
a former un ribonucleotide phosphoryl; on fractionne le melange de
reaction par une chromatographie sur colonne echangeuse; on traite la
portion du melange de reaction frac- tionne contenant le
ribonucleotide phosphoryl au moyen d'une AT Pase; on fractionne le
melange de reaction traite par l'AT Pase de maniere a isoler le
ribonucleotide phosphoryl.
8 Un procede selon la revendication 5, caracterise en ce qu'il
comprend en outre l'etape consistant a phospho- ryler de maniere
specifique l'extremite 5 ' d'un ribo- nucleotide receveur en faisant
reagir ce ribonucleotide avec adenosine triphosphate en presence de
polynucleotide kinase.
9 Un procede selon la revendication 3, caracterise -15- en ce que
l'etape de phosphorylation de l'extremite 5 ' du ribonucleotide
donneur comprend l'etape consistant a faire reagir ce ribonucleotide
avec adenosine triphosphate en presence de polynucleotide kinase.
10 Un procede selon la revendication 1, caracterise en ce que l'etape
de phosphorylation de l'extremite 3 ' du ribonucleotide donneur
comprend l'etape consistant a faire reagir un ribonucleotide
comportant au moins deux bases avec le compose Appnbzl en presence de
T 4 ARN ligase dans des conditions qui favorisent la fixation du
groupe pnbzl sur l'extremite 3 ' du ribonucleotide.
11 Un procede de synthese d'ARN d'une sequence predeterminee de bases,
comprenant les etapes qui consistent a: a) phosphoryler un
ribonucleotide d'une sequence de bases connue comportant au moins deux
bases a l'extre- mite 5 '; faire reagir cet ARN avec App Np en
presence de T 4 ARN ligase de maniere a fixer la portion p Np de App
Np sur l'extremite 3 ' du ribonucleotide; c) traiter l'ARN allonge
resultant avec une enzyme qui elimine les groupes phosphate terminaux;
d) repeter les etapes b et c jusqu'a ce que l'ribonucleic acid de la
sequence predeterminee soit produit; N etant un ribonucleotide choisi
parmi l'adenine, la guanine, la cytosine, l'uracile et l'inosine.
12 Un procede selon la revendication 2, caracterise en ce que les
conditions dans lesquelles le transfert de la portion p Np est
favorise consistent en l'incubation du ribonucleotide receveur avec le
compose App Np en presence d'ARN ligase dans un petit volume de tampon
HEPES pendant 1 heure a 370 C.
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