close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

4354 neverova o. a. gorelikova g. a. poznyakovskiy v. m pishevaya biotehnologiya produktov iz sirya rastitelnogo proishojdeniya

код для вставкиСкачать
663
Н40
г л
I
N
▲
«
А
ПРОДУКТОВ ИЗ СЫРЬЯ РАСТИТ
ПРОИСХОЖДЕНИЯ
[ПИТННИЕ1
УЧЕБН ИК
П Р А К Т И К А
ТЕХНОЛОГИЯ
ГИГИЕНА
К А Ч Е С Т В О
БЕЗОПАСНОСТЬ
Допущ ено УМО
по специальности ГОС ВПО
2 4 0 9 0 2 - Пищ евая биотехнология
СТРОЕНИЕ РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКИ
19
1 - Ядро
7
1
___Шероховатый
2 —Хроматин
эндоплазматический ретикулум
3 —Ядрышко
13 —Гладкий
эндоплазматический ретикулум
4 - Ядерная мембрана
5 - Центросома
6 - Аппарат Гольджи
7 —Митохондрия
8 —Пероксисома
9 - Плазматическая мембрана
10 - Клеточная стенка
11 - Стенка прилежащей клетки
14 - Рибосомы
15 - Центральная вакуоль и тонопласт
16 - Микрофиламенты
17 - Промежуточные филаменты
18 - Микротрубочки
19 - Цитоскелет
20 - Хлоропласт
21 - Плазмодесмы
СХЕМА ПОЛИМЕРАЗНОИ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
ДНТФ
ДНК-матрица
Фермент
Тад-полимераза
Олигонуклеотидные
затравки (праймеры)
Этап 1
Денатурация
(93-95 °С)
V
Искомые фрагменты ДНК
Этап 2
Отжиг
праймеров
(50-65 °С)
5 'I
т
Этап 3
Синтез
цепи ДНК
(72 °С)
I 3'
Н Л о
ПИТННИЕ
П Р А К Т И К А
ТЕХНОЛОГИЯ
ГИГИЕНА
К А Ч Е С Т В О
БЕЗОПАСНОСТЬ
О. А. НЕВЕРОВА, Г. А. ГО РЕЛ И КО В А , В. М . П О З Н Я К О В С К И Й
ПРОДУКТОВ ИЗ СЫРЬЯ РАСТИТЕЛЬНОГО
ПРОИСХОЖДЕНИЯ
УЧЕБНИК
Рекомендовано УМО по образованию в области технологии сырья и продуктов
животного происхождения в качестве учебника для студентов высших учебных
заведений, обучающихся по направлению 240900 «Биотехнология»,
специальности 240902 «Пищевая биотехнология»
\
©
СИБИРСКОЕ УНИВЕРСИТЕТСКОЕ ИЗДАТЕЛЬСТВО
НОВОСИБИРСК• 2007
с. с Ъ А ( о Ч Б , 9 }
УДК [664:573.6]:613.26(075)
ББК 65.304.25:30.16я7
Н40
Ш ИВ
щ ш ттш т
С.Терайгыров
атындагы ПМ У-дщ
академ ик С.Бейсембае
атындагы гылыми
Рецензенты:
;иректор ВНИИ пищевой биотехнологии РАСХН,
члф-корреспондент РАСХН, доктор технических наук,
профессор В. А. Поляков
К 1ТА П Х А Н А С Ь
зав. кафедрой химии и пищевой биотехнологии
Московского государственного университета прикладной биотехнологии,
доктор технических наук, профессор А. И. Жаринов
Н40
Неверова, О. А.
Пищевая биотехнология продуктов из сырья растительного про­
исхождения [Текст]: Учебник / О. А. Неверова, Г. А. Гореликова,
В. М. Позняковский. — Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2007. — 415 с.:
ил. — (Питание).
N9 * 1 ^
18ВМ-10; 5-379-00089-4
18В1Ч-13: 978-5-379-00089-9
Учебник отражает современное состояние пищевой биотехнологии как важнейшего
приоритетного направления науки XXI века и содержит базовые сведения для данной
научной дисциплины.
Авторами впервые систематизированы биотехнологические основы переработки
растительного сырья (технология ферментативной и микробной биоконверсии). Пред­
ставлены сведения о способах создания генетически модифицированных источников
пищи и законодательном регулировании их применения. Подробно охарактеризованы
биотехнологические процессы отдельных наиболее значимых пищевых производств —
хлебопечения, пивоварения, производства спирта и др. Включен материал по использо­
ванию в производстве продуктов питания нетрадиционных видов пищевого сырья, фер­
ментных препаратов, других компонентов, полученных методами биотехнологии.
Учебник предназначен для студентов, обучающихся по специальности «Пищевая
биотехнология», другим технологическим специальностям вузов пищевой и перерабаты­
вающей промышленностей, аспирантов и инженерно-технических работников.
\
18ВЫ-10: 5-379-00089-4
18ВЫ-13: 978-5-379-00089-9
УДК [664:573.6]:613.26(075)
ББК 65.304.25:30Л6я7
Неверова О. А., Гореликова Г. А.,
Позняковский В. М., 2007
О Сибирское университетское
издательство, оформление, 2007
СОДЕРЖАНИЕ
ПРЕДИСЛОВИЕ..........................................................................................................7
Часть I. ХАРАКТЕРИСТИКА РАСТИТЕЛЬНОГО С Ы Р Ь Я ...........................11
Глава 1. Традиционное растительное сы р ье.......................................................... 13
1.1.Общая характеристика и классификация растительного сырья.......................... 13
1.2. Химический состав и строение растительных клеток ........................................ 15
1.2.1. Пищевые волокна....................................................................................... 16
1.2.2. Белки....................................................................................................... . 26
1.2.3. Липиды..................................................................|....... ..... ........................ 29
1.2.4. Красящие и дубильные вещества.................................... ...... ................... 34
1.2.5. Минеральные вещества.................................................. ............. ............. 38
1.2.6. Витамины и витаминоподобные вещества.......................... .............. ..... 46
Глава 2. Генетически модифицированное растительное сы р ье.......................... 58
2.1. Создание и применение генетически модифицированных растений..................58
2.2. Обеспечение безопасности пищевой продукции из ГМИ................................... 64
Часть II. БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ПЕРЕРАБОТКИ
РАСТИТЕЛЬНОГО С Ы Р Ь Я ..................................................................77
Глава 3. Биоконверсия с использованием ферментов............................................ 79
3.1. Общая характеристика и классификация ферментов........................................... 79
3.2. Ферментативная переработка растительного сырья............................................ 86
3.2.1. Ферменты, трансформирующие органическое сырье.............................. 86
3.2.2. Гидролитические процессы........................... ...................... ....... ............. 88
3.2.3. Негидролитические реакции.............................. ......................................131
3.3. Ферментные препараты............................................ .......... .................................142
3.3.1. Технология получения..................................... .'..................... .................. 142
3.3.2. Характеристика основных отечественных ферментных препаратов....149
3.4. Продукты ферментативной биоконверсии..........................................................161
Глава 4. Микробная биоконверсий ................................................... ..................... 185
4.1. Сырье для микробной биоконверсии.................................................................. 185
4.2. Технология микробной биоконверсии................................................................ 188
4.3. Продукты микробной конверсии......................................................................... 198
Часть Ш . БИОТЕХНОЛОГИЯ ОТДЕЛЬНЫХ
ПИЩЕВЫХ ПРОИЗВОДСТВ............................................................. 209
Глава 5. Хлебопекарное производство..................................................................... 211
5.1. Сырье для хлебопечения ..................................................................................... 211
5.2. Технология производства хлеба и хлебобулочных изделий...............................213
5.3. Применение ферментных препаратов и гидролизатов в хлебопечении............ 224
Глава 6. Кондитерское производство....................................................................... 232
6.1. Сырье для производства мучных и сахарных кондитерских изделий...............232
6.2. Технология производства кондитерских изделий.............*................................. 237
6.3. Применение ферментных препаратов в кондитерской промышленности........ 238
6.4. Разработка новых видов кондитерских изделий.................................................240
Глава 7. Получение спиртопродуктов...................................................................... 244
7.1. Сырье для спиртового производства............................................ ...................... 244
7.2. Технология производства этилового спирта........................................................245
7.3. Технология производства различных видов спиртопродуктов .......................... 251
7.4. Применение ферментных препаратов в спиртовой промышленности............. 254
Глава 8. Пивоваренное производство ......................................................................260
8.1. Сырье для пивоварения......................................................................................... 260
8.2. Технология производства пива..............................................................................263
8.3. Применение ферментных препаратовв пивоварении.........................................270
Глава 9. Виноделие...................................................................................................... 275
9.1. Виноградные вина.............................................. 1.......... ......... .............. .............. 275
9.1.1. Классификация ...... .................................................................................... 275
9.1.2. Сырье для производства виноградных вин...............................................278
9.1.3. Основы получения виноградных вин....................................................... 279
9.1.4. Технология производства различных групп виноградных вин............... 291
9.2. Плодовые вина............................ .......................................................................... 312
9.2.1. Классификация ..................................................................... .................... 312
9.2.2. Сырье для производства плодовых вин........................... ........................ 314
9.2.3. Технология производства различных групп плодовых вин.................... 314
9.3. Применение ферментных препаратов в виноделии............................................. 320
Глава 10. Производство соков................................................................................. 326
10.1. Классификация соков ....................................................................................... 327
10.2. Сырье для производства соков..........................................................................330
10.3. Технология производства плодово-ягодных и овощных соков....................... 330
10.4. Применение ферментных препаратов в соковом производстве ..................... 341
Глава 11. Получение квашеных (соленых, моченых) плодов и овощей............348
11.1. Классификация квашеных плодов и овощей.................................................... 348
11.2. Технология квашения, соления, мочения ........................................................ 349
Глава 12. Производство к в а с а .......................................1............................ ........... 358
12.1. Сырье и микроорганизмы для квасоварения.................................................... 359
12.2. Технология производства хлебного кваса........................................................ 362
12.3. Особенности производства плодовых и ягодных квасов................................. 378
Глава 13. Производство ч а я .....................................................................................379
13.1. Классификация чая............................................................................................ 379
13.2. Химический состав и пищевая ценность чая....................................................382
13.3. Технология производства чая............................................................................388
13.4. Использование вторичных ресурсов чайного сырья........................................ 401
ЛИТЕРАТУРА.......................................................................................................... 405
П РИ Л О Ж ЕН И Я...................................................................................................... 409
Приложение 1. Пищевые продукты, полученные из ГМИ,
подлежащие этикетированию.......................................................... 411
Приложение 2. Правила работы с ферментами.........................................................413
ПРЕДИСЛОВИЕ
Биотехнология — уникальная наука, которая использует живые организмы и био­
логические процессы в практических интересах человека. Биотехнологические
процессы, в частности брожение, применяются людьми с древних времен. На раз­
личных видах брожения основано производство спирта, пива, вина, хлеба, кисло­
молочных продуктов, консервирование плодов и овощей (квашение, мочение, со­
ление), на процессах ферментации -— производство чая. Можно привести целый
ряд других общеизвестных и нетрадиционных примеров.
Интегрируя достижения человечества в различных областях знаний, биотех­
нология развивается по четырем направлениям: микробная биотехнология (про­
мышленная микробиология), инженерная энзимология, генная и клеточная инже­
нерия.
В середине XIX века Луи Пастер доказал, что представители микромира раз­
личаются не только внешним видом, но и особенностями обмена веществ. Работы
ученого послужили основой для развития микробной биотехнологии, изучающей
распространенные в природе микроорганизмы с точки зрения возможности их ис­
пользования в народном хозяйстве. Микробную биотехнологию можно считать
основным разделом биотехнологии. Исторический путь этого раздела биотехно­
логии тесно связан с производством различных пищевых продуктов (вино, хлеб,
молочные продукты и др.), а также с получением белка, аминокислот, витаминов,
ферментов, органических кислот путем микробного синтеза.
Расширение сфер использования микроорганизмов для практических целей
основывается на изучении их физиологических и биохимических особенностей,
а также на познании механизмов регуляции процессов метаболизма. В настоящее
время актуальным является поиск новых природных продуцентов, а также иссле­
дования по селекции и генетике известных видов микроорганизмов с целью по­
лучения штаммов с высокой продуктивностью. Для решения задачи используют
либо метод индуцированного мутагенеза и ступенчатого отбора лучших вариан­
тов, либо методы генной инженерии.
Инженерная энзимология — раздел биотехнологии, цель которого разработ­
ка технологических процессов с использованием ферментов. Знания о свойствах
ферментов, механизмах их действия используются при решении конкретных тех­
нологических задач: для создания нового продукта или улучшения его качества.
Предисловие
8
использования нетрадиционных видов сырья, разработки безотходных техноло­
гий и др.
Особое значение ферментативные процессы имеют для производства пище­
вых продуктов. Тканевые ферменты животных и растений способствуют форми­
рованию химических предшественников вкуса и аромата, влияют на консистен­
цию за счет специфической деструкции биополимерных систем пищевого сырья.
Кроме эндогенных ферментов большую роль в производстве пищевых продуктов
имеют экзогенные ферменты. Их используют в целях интенсификации технологи­
ческих процессов, модификации компонентов сырья и свойств пищевых систем,
изменения их качества, стабилизации при хранении, обеспечения биологической
и экологической безопасности.
В рамках инженерной энзимологии активное развитие получила иммобилиза­
ция ферментов на специальных носителях. Новое направление имеет ряд преиму­
ществ, в частности обеспечивает многократное использование ферментов.
Генная инженерия — раздел биотехнологии, отвечающий за направленное со­
здание организмов с заданными свойствами на основе рекомбинации хромосом.
Генная инженерия дает возможность изолировать и изменять отдельные гены, мо­
дифицируя молекулу ДНК и перенося ее из одного организма в другой. Возникнув
сравнительно недавно, генная инженерия в настоящее время стремительно разви­
вается, в том числе и в производстве пищевых продуктов — главным образом за
счет создания трансгенных животных и растений. Трансгенные культивируемые
растения обеспечивают более высокий и стабильный урожай, чем традиционное
растительное сырье.
с •^
^ ^
Методы генной инженерии применяют и для изменения некоторых метабо­
лических реакций. Например, если ввести ген, кодирующий фермент аминоглюкозидазу, в штаммы дрожжей, используемые в пивоварении, можно снизить кон­
центрацию сахара в сусле. Изменяя соотношения между ферментами гликолиза,
предположительно удастся изменить эффективность спиртового брожения.
Клеточная инженерия — раздел биотехнологии, изучающий культуры клеток
высших животных или растительных организмов, полученные выращиванием на
различных средах выделенных из организмов клеток, а также микроорганизмы,
полученные методом генной инженерии (гибридизация соматических клеток,
слияние/протопластов, перенос клеточных организмов и т. д.). Совершенствова­
ние техники культивирования растительных клеток и тканей позволяет создавать
улучшенные культурные виды и сорта растений.
Основные разделы биотехнологии — это те главные области научных иссле­
дований и методы, от которых зависит результативность многих направлений на­
учно-технического прогресса и в частности пищевых технологий, позволяющих
разрабатывать доступные продукты нового поколения.
Пищевая биотехнология выделилась отдельной ветвью из биотехнологии
в конце XX века. Это связано с значительным ухудшением структуры питания
населения, дефицитом важнейших компонентов пищи, постоянно действующими
неблагоприятными факторами окружающей среды. Данные о фактическом пита­
' ;ф
нии человека, а также современные достижения науки о питании, прежде всего
в области физиологии и биохимии, потребовали пересмотра укоренившихся под­
ходов в создании пищи и разработки реальных инженерных решений. Пищевая
биотехнология базируется на изучении и развитии нутрициологии, микробиоло­
гии, молекулярной биологии, генной инженерии, химии пищи применительно
к процессам и технологиям пищевых производств.
Предмет изучения пищевой биотехнологии — новые источники и способы
получения пищевого сырья, экзо- и эндоферментные системы, их регулирование,
ферментативный катализ, кинетика процессов модификации свойств сырья и пи­
щевых систем при применении ферментных препаратов, биологически активных
веществ, пищевых многофункциональных и белоксодержащих добавок; функционально-технологические свойства пищевых добавок, стартовые культуры, бакте­
риальные закваски, биопрепараты, тестирование и специфика переработки сырья
и препаратов, полученных из генетически модифицированных источников и пу­
тем биосинтеза.
Важными задачами пищевой биотехнологии являются: создание теорети­
ческих моделей прогнозирования характера изменений сырья и пищевых систем
в процессе биотрансформации; оценка биологической безопасности сырья, пи­
щевых добавок, биологически активных веществ и готовых пищевых продуктов;
разработка новых методов исследования сырья, пищевых систем, пищевых и био­
логически активных добавок, готовых продуктов питания.
Используя биотехнологические процессы при переработке пищевого сырья
и производстве продуктов питания, можно влиять на показатели их качества и бе­
зопасности. Знание биотехнологических процессов позволяет определить причи­
ны порчи продуктов и возникновения дефектов, приводящих к количественным
и качественным потерям товаров. Помимо этого, новые штаммы микроорганиз­
мов способны придать продукту новые оригинальные оттенки вкуса и аромата
и другие полезные свойства.
Применение ферментных, белковых препаратов, пищевых и биологически
активных добавок, а также других соединений, полученных биотехнологическим
способом, способствует оптимизации и интенсификации технологических про­
цессов производства пищевых продуктов, улучшает их потребительские свойства
и продлевает сроки хранения.
Основополагающими для развития пищевой биотехнологии являются фунда­
ментальные исследования академика Российской академии наук (РАН) А. А. Бае­
ва, зарубежных ученых И. Хиггинса, Д. Беста, Дж. Джонсона и др. Особого внима­
ния заслуживают работы И. М. Грачевой, посвященные технологии ферментных
препаратов, О. В. Кислухиной, касающиеся биоконверсии растительного сырья,
получения пектина, жирорастворимых витаминов и других продуктов из расти­
тельного сырья и Ътходов его переработки.
Большой вклад в становление и развитие научной дисциплины «Пищевая
биотехнология», в подготовку учебной и методической литературы для студентов
данной специальности (специальность 240902) внесли президент Московского
государственного университета прикладной биотехнологии (МГУПБ), академик
Российской академии сельскохозяйственных наук (РАСХН) И. А. Рогов, профес­
сора А. И. Жаринов, Н. И. Дунченко, заведующий кафедрой биотехнологии Мос­
ковского университета пищевых производств, профессор Л. А. Иванова.
Настоящий учебник — первый шаг в систематизации биотехнологических
процессов и основополагающих принципов переработки растительного сырья
и производства пищевых продуктов. Учебник состоит из трех частей. В первой
рассмотрены виды и химический состав растительного сырья, приведены све­
дения о способах создания генетически модифицированных источников пищи
и законодательном регулировании их применения. Вторая часть посвящена био­
технологическим основам переработки растительного сырья (ферментативной
и микробной биоконверсии). Третья часть включает подробную характеристику
биотехнологических процессов отдельных пищевых производств (хлебопечения,
пивоварения, виноделия и др.).
Авторы не претендуют на всеобъемлющую полноту раскрытия темы и с бла­
годарностью примут все замечания и пожелания, направленные на улучшение
структуры и содержания данного издания.
I
Часть I
ХАРАКТЕРИСТИКА
РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ
Традиционное растительное сырье
Гэнетически модифицированное растительное сырье
Глава 1
ТРАДИЦИОННОЕ РАСТИТЕЛЬНОЕ СЫРЬЕ
1.1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И КЛАССИФИКАЦИЯ
РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ
Растительное сырье — растительные организмы (как целые растения, так и от­
дельные их части — корни, стебли, почки, цветки, плоды), используемые челове­
ком в различных отраслях промышленности. Для производства продуктов питания
может использоваться сырье как одного вида (например, плодоовощное сырье при
выработке соков), так и разных (мучные кондитерские изделия с изюмом и др.).
При получении комбинированных продуктов питания, наряду с растительным,
применяют и другие виды сырья, например животное. В зависимости от цели
применения различают растительное сырье пищевое, кормовое, лекарственное,
техническое (эфиромасличное, красящее, дубильное и др.).
Пищевое растительное сырье используют в качестве основного ингредиента,
а также как вкусо-ароматическую добавку в производстве традиционных продук­
тов питания (хлебных и кондитерских изделий, спирта, вина, соков и др.). Для
создания специализированных продуктов питания — диетических и лечебно-профилактических продуктов, в том числе биологически активных добавок (БАД)
возможно применение лекарственных растений различной функциональной на­
правленности.
Различают две группы пищевого растительного сырья: культивируемое и ди­
корастущее (рис. 1.1). Каждая из этих групп включает сырье плодовоовощное
и травянистое. К культивируемому сырью также относят зерно и продукты его
переработки. Культивируемое сырье (зерновое и плодоовощное) может быть тра­
диционным и генетически модифицированным.
Органические и минеральные вещества растений обусловливают пищевую
и биологическую ценность растительного сырья. На 80 % растения состоят из уг­
леводов. Углеводы растений широко используются человеком в пищу, являясь для
него основным источником энергии. Главные усваиваемые углеводы в питании
человека — крахмал (примерно 80 % всех потребляемых человеком углеводов)
ПИЩЕВОЕ РАСТИТЕЛЬНОЕ СЫРЬЕ
Культивируемое
Дикорастущее
Плодоовощное традиционное
Плодоовощное
генетически модифицированное
традиционное
генетически модифицированное
Рис. 1.1. Классификация пищевого растительного сырья
и сахароза. Крахмал в пищевой промышленности получают из зерновых, бобо­
вых и картофеля; сахарозу — из сахарной свеклы и сахарного тростника.
Растения являются источниками пищевых волокон, объединяющих неперевариваемые углеводы (клетчатка, пектин, гемицеллюлоза, инулин, гумми, слизи).
Роль пищевых волокон в питании человека связана с их способностью улучшать
моторику желудочно-кишечного тракта, сорбировать тяжелые металлы, радионук­
лиды и выводить их из организма, снижать уровень холестерина в крови и пр.
В производстве продуктов питания крахмал, пектиновые вещества, клетчатка
используются в качестве структурообразователей. Пектин получают из сахарной
свеклы, фруктов и ягод. Источник клетчатки — стебли, листья, плоды растений.
Растения, содержащие инулин, служат сырьем для получения фруктозы, которая
используется в качестве заменителя сахарозы в питании больных сахарным диа­
бетом. Насыщенность жирами семян масличных культур — до 60 % сухого вещес­
тва (СВ) — делает их ценнейшим сырьем для производства масел, используемых
в пищевых и промышленных целях.
'‘ ’
Г*
чн .« ь
Традиционными источниками для производства белковых продуктов расти­
тельного происхождения служат соя и пшеница. Из сои получают муку-крупу,
концентраты и изоляты, из пшеницы и пшеничной муки — сухую пшеничную
клейковину.
Растения — основной поставщик витаминов для человека. Человек получа­
ет витамины или непосредственно из пищевых продуктов растительного проис­
хождения, или из пищевых продуктов животного происхождения, в которых ви­
тамины были предварительно накоплены из растительной пищи. Растения также
синтезируют физиологически активные соединения, например фенольные соеди­
нения, гликозиды, эфирные масла, алкалоиды и др. Некоторые из этих веществ
в значительной степени определяют пищевые и вкусовые достоинства различных
продуктов; многие из них используются в технике и медицине.
1.2. ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ И СТРОЕНИЕ
РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК
Химический состав растений имеет очень важное значение для пищевой биотех­
нологии, им определяется способ переработки сырья и пути его дальнейшего ис­
пользования в пищевых производствах.
Клетка — элементарная живая система, основная структурная единица рас­
тительных и животных организмов, способная к самообновлению, саморегуляции
и самовоспроизведению. Клетки образуют ткани и органы, структурная и функ­
циональная совокупность которых составляет целостный организм. Поэтому хи­
мический состав живых организмов целесообразно изучать на клеточном уровне.
Основными частями любой клетки являются ядро и цитоплазма, составляющие
вместе протопласт. Однако в отличие от животной растительная клетка имеет осо­
бенности, связанные с автотрофным питанием и специфическим образом жизни.
К числу таких отличий относятся клеточная стенка, большая центральная ваку­
оль, пласщоы, плазмодесмы (см. форзац 1).
Под микроскопом в клеточной стенке (оболочке) можно обнаружить два ком­
понента — более или менее рыхлый матрикс и прочную арматуру. Расположение
арматурных элементов имеет свои особенности: в ближней к протопласту зоне
оно отражает ориентацию специфических клеточных элементов — микротру­
бочек, в более удаленных слоях арматурные элементы располагаются хаотично.
Межклеточные связи осуществляются через поры в клеточной стенке с помощью
специфичных для растений достаточно сложно устроенных цитоплазматических
образований — плазмодесм.
Химический состав и структура клеточной стенки определяют ее важнейшие
свойства — прочность, эластичность, высокую гидрофильность. Основа химичес­
кого состава клеточной стенки — полисахариды. В общей массе растения клеточ­
ным стенкам принадлежит основная доля. Это отражается в химическом составе
целого растения. Так, в зрелом растении кукурузы углеводы составляют 83,3 %
сухой массы, белки — 8,7, липиды — 2,3, зола — 5,7 %.
Различают первичную и вторичную клеточную стенки. Средний состав пер­
вичной клеточной стенки высших растений таков, % от сухой массы: целлю­
лоза — 25, пектиновые вещества — 30, гемицеллюлозы — 40, белки и другие
вещества — 5 %. Вторичная клеточная стенка превосходит первичную по плот­
ности и отличается по химическому составу. Одним из основных ее компонентов
является целлюлоза. В зависимости от функций клеток конкретных тканей (про­
водящей, защитной, механической) доля целлюлозы может возрастать до 60 %
и более. Кроме того, во вторичной клеточной стенке могут находиться вещества,
усиливающие ее изолирующие свойства и прочность, — лигнин, суберин, мине­
ральные соли.
..
.. . >•; -.„м;
В клетках некоторых растительных тканей имеется третичная клеточная стен­
ка, которая образуется с внутренней стороны вторичной и обладает специфичес­
кой структурой. Эта оболочка в основном состоит из ксилана.
1.2.1. Пищевые волокна
Пищевые волокна представляют собой большую группу веществ различной хи­
мической природы, к которым относятся клетчатка (целлюлоза), гемицеллюлоза,
гумми (камеди), пектины, а также крахмал и не являющийся углеводом лигнин.
Термин «пищевые волокна» (англ. сНегагу йЬегз) был введен при изучении компо­
нентов растительных клеток и их использовании в лечебных диетах.
Клетчатка (целлюлоза) -— самое распространенное вещество на Земле, за
счет фотосинтеза ее образуется около 100 млрд тонн в год. Она является основ­
ным компонентом клеточных стенок растений и содержится в древесине, оболоч­
ках семян, льне, конопле, хлопчатнике и других однолетних растениях, в морских
и пресноводных водорослях. Очень редко встречается целлюлоза в бактериях
и животных, например в некоторых ракообразных и улитках. В химическом отно­
шении целлюлоза представляет собой полимер Р-Э-глюкозы, молекулы которой
соединены между собой 1-4-гликозидными связями со степенью полимеризации
8-12 тыс. (рис. 1.2).
При кипячении с концентрированной серной кислотой целлюлоза полностью
превращается в Р-глюкозу. При более слабом гидролизе из клетчатки получается
целлобиоза. В молекуле целлюлозы остатки целлобиозы связаны гликозидными
связями в виде длинной цепочки. Число глюкозных остатков в молекуле целлюло­
зы, а, следовательно, длина самих молекул резко различаются в клеточных оболоч­
ках различных растений. Так, для целлюлозы волосков хлопчатника степень поли­
меризации первичной клеточной стенки равна 2-6 тыс., вторичной — 13-14 тыс.;
для целлюлозы Асе(оЬас(ег хуИпит — 2-6 тыс.; для древесины — 8-10 тыс. Эк­
спериментально установлено, что максимальная молекулярная масса целлюлозы
характерна для льна и составляет 6 • 106.
С помощью рентгеноструктурного анализа установлено, что молекулы цел­
люлозы имеют нитевидную форму. Эти нитевидные молекулы объединяются
в — мицеллы. Каждая мицелла имеет кристаллическую структуру и состоит из
40-100 молекул. Мицеллы формируют «веревочки» — микрофибриллы, а послед­
ние — «канаты» — макрофибриллы. Отдельные молекулы целлюлозы соединяют­
ся в мицеллы водородными связями (как за счет водородных атомов гидроксиль­
ных групп целлюлозы, так и за счет адсорбированных целлюлозой молекул воды).
Гпава 1 . Традиционное растительное сырье
Целлюлозные фибриллы
в стенке растительной клетки
С.Торайгыров
академ ик С.Бейсембае
атындагы гылыми
КГГАПХАНАСЬ
Клеточные стенки
Макрофибрилла
Растительные
клетки
Мономеры глюкозы
Нити целлюлозы
Рис. 1.2. Строение целлюлозы на различных уровнях организации
Промежутки между микрофибриллами целлюлозы заполнены матриксом из
аморфных компонентов (пектиновых веществ и гемицеллюлоз). Цепи полисаха­
ридов матрикса короче, чем цепи целлюлозы, они часто разветвлены и определяют
такие характерные для клеточной оболочки свойства, как сильная набухаемость,
высокая проницаемость для воды других веществ с низкой степенью полимериза­
ции, катионообменные свойства. Помимо углеводных компонентов в состав мат­
рикса входит структурный белок — экстенсин.
Короткие целлюлозные фибриллы в пектиновом матриксе образуют рыхлую
сеть, за счет чего первичная клеточная стенка хорошо растягивается и становит­
ся проницаемой для воды и веществ. Во вторичной клеточной стенке молекулы
целлюлозы формируют микрофибриллы с параллельной ориентацией. Эта строго
упорядоченная ориентация создает высокие механические свойства вторичных
оболочек. Микрофибриллы третичной стенки растений расположены под углом
друг к другу.
Ггмицеллюлозы (полуклетчатки) объединяют большую группу высокомоле­
кулярных полисахаридов, растворимых в щелочных растворах. Большое количе­
ство гемицеллюлоз содержится в одревесневших частях растений: соломе, семе­
нах, орехах, древесине, кукурузных початках — и в отрубях.
В состав гемицеллюлоз входят моносахара: глюкоза, галактоза, ксилоза, арабиноза, манноза, фруктоза. Некоторые гемицеллюлозы содержат остатки уроновых кислот. Среди гемицеллюлоз встречаются как гомополимеры (глюкан, галактан), так и гетерополимеры (арабиноксилан, ксилоглюкан, фукогалактоманнан и др.). Большинство гемицеллюлоз имеют нерегулярное строение, содержат
разветвленные участки. Эти особенности структуры объясняют более высокую
Рис. 1.3. Молекулярное строение ксилана
растворимость гемицеллюлоз в воде по сравнению с растворимостью целлюло­
зы. Растворимость гемицеллюлоз возрастает с увеличением степени ветвления.
К числу наиболее распространенных видов гемицелпюлозы высших растений от­
носятся маннаны, галактаны, ксиланы, глюканы, ксилоглюканы.
Водорастворимые маннан и галактан выделяются мицелием плесневых гри­
бов, принадлежащих к роду РетсНИит. В молекуле маннана содержится от 200
до 400 остатков маннозы. Маннан — главная составная часть клеточных стенок
водорослей рода Асе1аЬи1апа и некоторых других, найден в дрожжах. Некоторое
количество маннана находится в древесине хвойных деревьев (от 2 до 7 %). Га­
лактаны широко распространены в растениях, входят в состав клеточных стенок
соломы, древесины и многих семян. Типичный представитель этой группы поли­
сахаридов — галактан семян люпина. В его молекуле около 120 остатков галактопиранозы.
Ксиланы содержатся в значительных количествах в соломе (до 28 %), древеси­
не (в дубовой до 25 %) и растительных волокнах. Основной структурный элемент
ксиланов — линейный или слегка разветвленный полисахарид, образованный ос­
татками Р-ксилопиранозы, соединенными между собой 1,4-связями (рис. 1.3).
Как правило, ксилан, содержащийся в каком-либо растительном объекте,
представляет собой смесь различных полисахаридов с близкими молекулярными
массами (обычно от 50 до 200 ксилозных остатков), но отличающихся природой
сахарного остатка в «ответвлениях» молекулы.
Глюканы входят в состав зерна злаков. Содержание глюканов в зерне без обо­
лочек составляет для пшеницы 0,6 %, ячменя — 3,8-4,5, овса — 3,9, ржи — 2,22,6 %; в эндосперме этих злаков — соответственно 0,3; 3,7-4,5; 1,4-2,3 и 1,5—
2,0% .
■ . '!л ~
Наиболее изучен глюкан ячменя. Он представляет собой полимер нерегуляр­
ной структуры, в котором остатки (3-глюкозы соединены 1,3- и 1,4-гликозидными
связями. Соотношение числа связей 1,3 и 1,4 составляет 3 : 7. Участки, состоящие
из р-1,4-связанных глюкозных остатков, соединены Р-1,3-связями. Молекулярная
масса ячменного глюкана колеблется в пределах от 38 до 300 кДа, что отражает
сортовые отличия, условия произрастания и хранения ячменя, особенности про­
цедуры выделения полимера.
Глюкан в клеточных стенках образует фибриллярные структуры благодаря
наличию строго линейных участков, состоящих из Р-1,4-связанных остатков глю­
козы. Линейные участки соседних молекул ориентируются параллельно по типу
целлюлозы. При замачивании зерна глюкан сильно набухает с образованием ге­
леобразных структур. В таком виде он становится доступным действию гидроли­
тических ферментов растения и в процессе прорастания зерна используется как
резервный полисахарид.
Ксилоглюканы относятся к разветвленным полимерам. Их линейная часть со­
стоит из Р~1,4-связанных остатков глюкозы, то есть имеет строение, идентичное
целлюлозе. Боковые цепочки присоединены к глюкозным остаткам основной цепи
в положении 1, 6 через первый углеродный атом остатка ксилозы (связь а -1,6).
Боковые цепочки могут быть представлены единственным остатком ксилозы или
двумя и более остатками сахаров. Остатки ксилозы, арабинозы, галактозы, фуктозы в боковых цепях соединены между собой связями 1,2.
Растительные ксилоглюканы различаются по степени замещения (ветвления),
составу и длине боковых цепочек. Ксилоглюканы двудольных растений имеют
более высокую степень ветвления, чем у однодольных. Первые могут быть пере­
ведены из щелочных экстрактов в водные растворы, вторые растворяются толь­
ко в щелочах. В состав ксилоглюкана ячменя входят глюкоза, ксилоза, арабиноза
и галактоза в соотношении 62 : 29 : 4 : 5, в ксилоглюкане риса те же сахара нахо­
дятся в соотношении 64 : 27 : 6 : 4.
Образцы ксилоглюканов, выделенные из одного источника, представляют со­
бой смесь полимеров, различающихся по величине молекулярной массы и сте­
пени ветвления. Молекулы с низкой степенью ветвления, имеющие достаточно
протяженные участки незамещенного Р-1,4-глюкана, ассоциируются с целлюлоз­
ными молекулами с помощью водородных связей. К ассоциированным молекулам
ксилоглюкана присоединяются ковалентной связью молекулы других полисаха­
ридов, составляющих структурную основу клеточной стенки растений.
Сильно разветвленные молекулы ксилоглюкана не ассоциируются с целлю­
лозой и могут находиться в свободном состоянии. В процессе развития растения
и индивидуальной растительной клетки изменяется фракционный состав ксило­
глюкана, прочность его связи с другими полисахаридами. Эти изменения проис­
ходят при участии ферментной системы растения.
Слизи и гумми — группа коллоидных полисахаридов, к которой принадлежат
растворимые в воде углеводы, образующие чрезвычайно вязкие и клейкие раство­
ры. Типичные представители этой группы — гумми, выделяемые в виде наплы­
вов вишневыми, сливовыми или миндальными деревьями в местах повреждения
стволов и ветвей. Слизи в большом количестве содержатся в льняных семенах
и зерне ржи.
Полисахариды вишневого клея образованы остатками галактозы, маннозы,
арабинозы, О-глюкуроновой кислоты и незначительного количества ксилозы.
Слизи ржаного зерна почти на 90 % состоят из пентозанов. Они сильно набухают
в воде и дают весьма вязкие растворы. Их вязкость значительно выше вязкости
растворов желатины, крахмального клейстера или белка. При кислотном гидро­
лизе слизи ржаного зерна образуют ксилозу, арабинозу и незначительные коли­
чества галактозы.
120
Арабан
Галактан
п
Метоксилированная полигалактуроновая кислота
Основные структурные элементы пектиновых
высокомолекулярные соединения
углеводной природы, содержатся в большом количестве в ягодах, фруктах, клубстеблях растений. В растениях пектиновые вещества присутствуют в виде
гворимого протопектина, представляющего собой соединение метоксилирой полигалактуроновой кислоты с галактаном и арабаном клеточной стенки
(рис
Протопектин переходит в растворимый пектин лишь после обработки раз­
бавленными кислотами или под действием фермента протопектиназы, а также
в результате процесса созревания плодов. Из водного раствора растворимый пек­
тин осаждается спиртом или 50%-ным ацетоном. При действии на растворимый
фермента пектазы метоксильные группы
отщепляются
пектиновая
полигалактуроновую кислоту.
Пектиновая кислота легко дает соли
пектаты. В виде пектата кальция
ю используют для количественно­
го определения пектиновых веществ. Пектиновая кислота в присутствии сахара
не способна образовывать студни подобно растворимому пектину. Поэтому при
промышленном получении пектина стараются по возможности избегать его ще­
лочного или ферментативного гидролиза, вызывающего снижение желирующей
способности пектина.
Студнеобразование начинается с того, что в растворе вокруг молекул пектина
образуется гидратная оболочка, в результате чего молекулы не соприкасаются друг
с другом. Поскольку в растворе происходит диссоциация карбоксильных групп
полигалактуроновых кислот, молекулы пектина приобретают отрицательный за­
ряд и взаимно отталкиваются. Для образования студневого каркаса необходимо,
прежде всего, ослабить или устранить силы электростатического отталкивания.
Присутствие в растворе кислоты более диссоциированной, чем полигалактуроновая, снижает степень диссоциации пектина, то есть уменьшает электростатичес­
кий заряд его частиц.
Одновременно под влиянием сахара происходит дегидратация молекул пек­
тина, и на них появляется некоторое количество «оголенных» участков, лишен­
ных полярности. Образование структурного каркаса происходит при сцеплении
отдельных молекул по дегидратированным участкам за счет сил межмолекулярного взаимодействия. Укрепление каркаса осуществляется за счет водородных
связей между карбоксильными и гидроксильными группами смежных цепей пек­
тиновых молекул. В результате такого взаимодействия между пектиновыми моле­
кулами образуется ячеистая структура.
Студнеобразующая способность пектина зависит от его молекулярной массы
(степени полимеризации) — с ее увеличением возрастает сила геля, количества
метальных групп, входящих в состав молекулы пектина (степени метоксилирования) и содержания свободных карбоксильных групп, связывания их металлами.
В зависимости от степени этерификации карбоксильных групп различают
высоко- и низкоэтерифицированные (степень этерификации менее 50 %) пекти­
ны, которые получают из исходного сырья кислотной или щелочной экстракцией
или ферментативным гидролизом. Пектины различной природы значительно раз­
личаются по студнеобразующей способности. Пектины лучшего качества (высокоэтерифицированные) получают из корочки цитрусовых и яблок, более низкого
(низкоэтерифицированные) — из свекловичного жома.
Для желирования высокоэтерифицированных пектинов необходим сахар
(вызывает дегидратацию пектиновых молекул, что способствует их сближению)
и снижение рН среды (подавляет диссоциацию свободных карбоксильных групп,
снижая тем самым электростатическое отталкивание цепей). Высокоэтерифицированные пектины используют в производстве мармелада, желе, фруктовых со­
ков, мороженого, рыбных консервов, майонеза.
Низкоэтерифицированные пектины могут образовывать гели без сахаров, но
требуют присутствия бивалентных катионов (Са2+ и др.). Добавка ионов кальция
вызывает образование кальциевых мостиков, соединяющих молекулы пектина.
При избытке кальция пектиновые цепочки сближаются очень сильно и простран­
ственная структура не образуется. Кроме того, может выпадать в осадок пектат
кальция. Хотя гелеобразование низкоэтерифицированного пектина и не требует
сахара, добавление 10-20 % сахарозы позволяет улучшить текстуру геля. Без са­
хара (или других пластификаторов) получают гели, как правило, хрупкие и менее
эластичные, чем обычный пектин. Низкоэтерифицированные пектины использу­
ют в производстве овощных желе, паштетов, студней.
Крахмал представляет собой химически индивидуальное вещество. В расте­
ниях он находится в виде крахмальных зерен, различающихся по своим физичес­
ким свойствам (рис. 1.5) и химическому составу.
Сферическая
(зерна пшеницы)
Овальная
(зерна картофеля)
Неправильная
(зерна овса)
Рис. 1.5. Форма крахмальных зерен
Различают крахмальные зерна простые и сложные: простые зерна представ­
ляют собой однородные образования (крахмальные зерна картофеля, пшени­
цы, ржи); сложные — сочетание более мелких частиц (крахмальные зерна овса
и риса). Характерная форма крахмальных зерен (овальная, сферическая или не­
правильная) дает возможность легко различать растения под микроскопом, что
используется для обнаружения примеси одного продукта к другому (например,
кукурузной или овсяной муки к пшеничной). Разделение зерновых культур на
культуры, имеющие простые и сложные крахмальные зерна, весьма условно. На­
пример, наряду с простыми крахмальными зернами у пшеницы есть сложные,
а среди преобладающих сложных у овса — простые.
Размеры (диаметр) крахмальных зерен колеблются в пределах от 0,002 до
0,15 мм. Наиболее крупные крахмальные зерна у картофеля, а самые мелкие —
у риса и гречихи. Плотность крахмала равна в среднем 1,5 кг/м3. В поляризаци­
онный микроскоп видно, что крахмальные зерна представляют собой кристал­
лическое тело. Кристаллическую структуру подтверждают рентгенографические
исследования.
Углеводная часть крахмала состоит лз полисахаридов двух типов, различаю­
щихся по своим физическим и химическим свойствам, — амилозы и амилопектина(рис. 1.6).
■'
'А ч '
Амилоза легко растворяется в теплой воде и дает растворы со сравнительно
невысокой вязкостью. Амилопектин растворяется в воде лишь при нагревании
под давлением и дает очень вязкие растворы. Молекулярная масса амилозы —
ЗТ05- 1 Т 0 б, амилопектина — достигает сотен миллионов. Растворы амилозы
весьма нестойки, и при хранении из них выделяются кристаллические осадки.
Амилопектин, наоборот, дает стойкие растворы.
В молекуле амилозы остатки глюкозы связаны гликозидными связями между
1-м и 4-м углеродными атомами и образуют длинную цепочку. В молекуле ами­
лопектина глюкозные остатки образуют разветвленную структуру за счет гликозидных связей не только между 1-м и 4-м углеродными атомами, но также между
1-м и 6-м.
Амилоза
Амилопектин
Рис. 1.6. Углеводная часть крахмала (структурные элементы)
Характерное свойство крахмала — способность окрашиваться в синий цвет
при добавлении раствора йода в водном растворе йодида калия. Амилоза окраши­
вается раствором йода в синий цвет, амилопектин — в сине-фиолетовый. Окраши­
вание амилозьг йодом сопровождается образованием комплексного химического
соединения. При этом молекулы йода располагаются внутри спирально изогнутых
цепочек амилозы. Окрашивание амилопектина йодом, предположительно, являет­
ся результатом образования как комплексных, так и адсорбционных соединений.
В холодной воде крахмальные зерна лишь набухают, но не растворяются.
Если взвесь крахмальных зерен в воде постепенно нагревать, то они будут набу­
хать все сильнее и при определенной температуре — температуре клейстеризации — крахмал образует вязкий коллоидный раствор (клейстер).
При кипячении с кислотами крахмал гидролизуется до глюкозы. При более
слабом воздействии кислот (например, 7,5%-ной НС1 в течение 7 сут. при комнат­
ной температуре) образуется так называемый растворимый крахмал.
Под действием ферментов амилаз происходит ферментативное осахаривание крахмала — он гидролизуется до мальтозы. В качестве промежуточных про­
дуктов при гидролизе крахмала образуются полисахариды разной молекулярной
массы — декстрины. На первых стадиях гидролиза получаются декстрины, мало
отличающиеся от крахмала по размерам молекулы и по свойствам. С йодом они
дают синюю или фиолетовую окраску. По мере дальнейшего гидролиза молеку­
лярная масса декстринов понижается, увеличивается их способность восстанав­
ливать фелингову жидкость.
В зависимости от молекулярной массы различают следующие виды декстринов:
| амилодекстрины — окрашиваются раствором йода в фиолетово-синий цвет
и представляют собой белые порошки, растворимые в 25%-ном спирте, но
осаждаемые 40%-ным спиртом; удельное вращение амилодекстринов [а]о ко­
леблется от +190° до +196°;
■ эритродекстрины — окрашиваются йодом в красно-бурый цвет; растворяют­
ся в 55%-ном этиловом спирте, осаждаются при концентрации спирта, равной
65 %; удельное вращение эритродекстринов [а]о +194°; из теплых алкоголь­
ных растворов они кристаллизуются в виде сферокристаллов;
■ ахродекстрины — не окрашиваются йодом, растворяются в 70%-ном спирте,
при выпаривании горячих спиртовых растворов образуют сферокристаллы;
удельное вращение [а]о +192°;
_
„
, -20
■ мальтодекстрины — не дают реакции с иодом и не осаждаются спиртом; [а]о
от +181° до +183°.
1*. кил .(# 4 * ■< ъ т ш
Ш т нСодержание минеральных веществ в крахмале составляет от 0,2 до 0,7 %, они
представлены в основном фосфорной кислотой. В одних видах крахмала — куку­
рузном, пшеничном, рисовом — фосфорная кислота представляет собой примесь,
удаляемую экстракцией теплой водой, спиртом или диоксаном, в других, напри­
мер в картофельном, она связана сложной эфирной связью с углеводной частью.
Наличие такой прочной химической связи фосфорной кислоты в картофельном
крахмале доказывается тем, что при его кислотном или ферментативном гидроли­
зе получается глюкозо-6-фосфат.
В крахмале найдены также некоторые высокомолекулярные жирные кисло­
ты — пальмитиновая, стеариновая и др., содержание которых достигает 0,6 %.
Эти жирные кислоты адсорбированы на полисахаридной фракции крахмала; они
могут быть удалены из него экстракцией нейтральными органическими раствори­
телями, например метиловым спиртом.
Лигнин — продукт растительного происхождения, наиболее устойчивый
и широко распространенный органический полимер в природе — занимает вто­
рое место после целлюлозы. В настоящее время лигнин является одним из самых
крупных промышленных отходов. Так, при промышленной обработке древесины
ежегодно во всем мире в виде отходов получают около 35 млн т лигнина. Лигнины разных растений и даже разных тканей одного и того же растения отличаются
друг от друга, несмотря на общее сходство в принципах строения (рис. 1.7).
Мономерными блоками лигнина являются производные фенилпропана — фенилпропаноидные спирты. Конифериловый спирт — мономер лигнина деревьев
хвойных пород, конифериловый и синаповый — лиственных, конифериловый
и п-кумаровый — травянистых растений. Точное химическое строение лигни­
на до сих пор не выяснено из-за большой сложности его молекулы. В лигнине
содержится значительное количество функциональных групп, в первую очередь
метоксильных и гидроксильных. Незанятые функциональные группы лигнина,
реагируя между собой, еще больше усложняют структуру полимера. Структур-
Модель ароматической части молекулы лигнина
осн
ООН
О
осн3
<
о
сн2
сн
-с — сн
о —с
он
осн
о
он
Мономеры лигнина
сн2он
сн2он
сн2он
сн
сн
сн
осн
Конифериловый
спирт
СН30
ОСН
Синаповый
спирт
п-Кумаровый
спирт
Рис. 1.7. Строение лигнина
ные звенья лигнина соединены более чем десятью типами связей, поэтому для
молекул лигнина характерна высокая степень разветвленное™.
В лигнинах предполагают наличие орто- и параориентированных бифенильных простых эфирных связей между мономерными звеньями и то, что сложные
эфиры алифатических кислот также входят в структуру макромолекулы лигнина.
Сложноэфирные связи играют важную роль в образовании лигнинполисахаридных комплексов. В формировании лигнинуглеводных комплексов помимо слож­
ноэфирных связей участвуют простые эфирные, фенилгликозидные, водородные
связи. Кроме химических связей между лигнином и углеводами действуют силы
Ван-дер-Ваальса и механического сцепления. Все эти связи создают возможность
образования трехмерных сетчатых структур, препятствующих растворению лиг­
нина при делигнификации растительных материалов. Предполагают, что 3/4 об­
щего лигнина связано с углеводами.
Для того чтобы лигнин перевести в растворимое состояние, нужно обрабо­
тать древесину гидросульфитом и сернистой кислотой. Кислотные лигнины хи­
мически очень сильно изменены и непригодны для изучения строения и свойств
лигнина. К малоизмененным препаратам лигнина относят: лигнин механического
размола (лигнин Бьеркмана), диоксан лигнин, а также препараты лигнина, полу­
ченные в результате взрывного автогидролиза и воздействия дереворазрушающих
грибов.
Ферментативный гидролиз лигнина затруднен, так как целлюлозные фиб­
риллы защищены лигногемицеллюлозным матриксом, поэтому для эффективной
ферментативной обработки сырья и выделения целлюлозы применяют различные
методы делигнификации.
1.2.2. Белки
Белки (протеины) — биологические азотсодержащие полимерные соединения,
мономерными единицами которых являются Ь-аминокислоты.
Содержание белков в растительных организмах колеблется в широких пре­
делах. В вегетативных органах культурных растений (стеблях, листьях, корнях,
клубнях и т. п.) белки составляют 5—10 % сухой массы, в зернах злаковых культур
(ячмень, пшеница, рожь, кукуруза и др.) — 10-20 %, в зернах бобовых и мас­
личных культур (горох, подсолнечник, соя и др.) — 25-35 % сухой массы. Мас­
совая доля азота в белках из различных биологических объектов составляет 1518%. Например, белки зерен пшеницы и ячменя содержат по 17,5 % азота, белки
риса — 16,8 %, белки молока — 15,7 % азота.
Белки и их производные — важная составная часть каждого живого организ­
ма, им принадлежит ведущая роль во всех процессах и явлениях жизни. Прежде
всего, белки выполняют структурную функцию. Так, известно, что более полови­
ны сухой массы цитоплазмы и ее органелл приходится на белки, основа строения
клетки — биологические мембраны — также наполовину построены из белков.
По своей химической природе белками являются все биологические катализато­
ры химических реакций в клетке — ферменты.
Некоторые белки, находящиеся в клеточных мембранах, участвуют в транс­
порте веществ. Транспортирование частиц (молекул, ионов) через мембрану мо­
жет осуществляться двумя способами. Первый — с участием белков-переносчиков. Транспортный белок находится в мембране, ему присущи важные особеннос­
ти — способность специфически связывать переносимый элемент и структурная
подвижность, позволяющая ему изменять свое положение в толще мембраны.
Соединяясь с молекулой или ионом на одной из поверхностей мембраны, он ме­
няет свое положение так, что переносимая частица оказывается на другой повер­
хности. Осуществив перенос, белок вновь занимает первоначальное положение.
Второй способ — с участием белков-организаторов. В мембране есть специаль­
ные участки — каналы, по которым способны двигаться гидрофильные вещества,
минующие таким образом гидрофобный матрикс.
Белки обеспечивают организм необходимой энергией. При окислении 1 г
белка освобождается порядка 16,8 кДж энергии. Калорийность других веществ,
также откладывающихся в запас в растительных клетках, кДж/г: глюкоза— 15,5,
крахмал— 17,6, жиры — 38,2. Пищевая ценность белков связана с наличием
в них незаменимых аминокислот. Особенно ценны незаменимые аминокислоты,
содержащие много азота, — лизин, аргинин, триптофан.
При прорастании семян запасные белки распадаются на аминокислоты, из
которых строятся новые белки, необходимые для роста и развития молодого ор­
ганизма. От содержания белка в сельскохозяйственной продукции во многом за­
висит ее кормовое значение. Так, вегетативная масса бобовых — ценного корма
для скота — содержит в 3-5 раз больше азота, чем солома злаков. Ученые всего
мира работают над проблемой селекции зерновых культур с высоким содержани­
ем лизина в белках. Остро эта проблема стоит в отношении кукурузы, в семенах
которой белков меньше, чем у других зерновых; к тому же белки кукурузы содер­
жат мало лизина и триптофана. Тридцать лет назад был открыт мутантный ген
опейк-2, ответственный за содержание лизина в зерне кукурузы. Опейк-2 успеш­
но используют в селекции.
Велика и разнообразна роль белков в защите растений от инфекции. Различ­
ные по иммунным свойствам объекты отличаются как по количеству и качеству
белков, имеющихся в здоровом организме, так и по тем изменениям, которые про­
исходят в белковом спектре после заражения. Высокая питательная ценность бел­
ков отчасти объясняет то, что растения с большим количеством белкового азота,
как правило, лучше противостоят заболеваниям. В качественном отношении бел­
ки устойчивых форм растений часто имеют в своем составе много аминокислот,
плохо переносимых тем или иным патогеном. Например, фитофтора «не любит»
белки с большим содержанием аргинина. В то же время легко заболевающие антракнозом сорта винограда отличаются повышенным содержанием аспарагина по
сравнению с устойчивыми сортами.
У устойчивых и неустойчивых к инфекции видов растений различны не толь­
ко состав, но и структура белков. Так, в клетках картофеля, устойчивого к раку,
обнаружены белки с очень плотной, жесткой глобулой. Наиболее активно про­
тивостоят инфекции так называемые антиферменты, способные ингибировать
ферменты паразита: из семян злаков выделены ингибиторы а-амилаз грибов;
ферменты глюконазы, хитиназы вызывают мацерацию мицелия многих грибовпаразитов.
Агглютинирующими (склеивающими) свойствами по отношению к многим
веществам углеводной природы, в том числе гликопротеинам патогенных грибов
и бактерий, обладают белки-лектины. Эти белки находятся на поверхности кле­
точной мембраны и даже проникают в клеточную стенку. Они очень специфичны
в отношении различных видов инфекции: в листьях яблони есть белки, «узнаю­
щие» даже отдельные штаммы бактерий. Пектины специфически связывают пато­
генные бактерии, образуя при этом как бы тромб, предотвращающий дальнейшее
распространение болезни. Известна способность белков из зародышей пшеницы,
специфичных к олигомерам хитина, связывать споры и кончики гиф грибов 2у§о~,
Азсо-, ВазШютусе1ез. Лектины из бобов, сои и арахиса специфически связывают
РетсИИит и Азрег%Шиз, препятствуя растяжению их мицелия. С момента зараже­
ния в клетках растений начинается синтез новых иммунных белков. Происхожде-
ние этих новых белков связано с экспрессией соответствующих генов в ответ на
действие патогена.
Очень важна роль белков в «реакции сверхчувствительности». Эта реакция
состоит в том, что при инфицировании определенного участка растительной тка­
ни в нем начинаются процессы некроза (ведущую роль при этом играют белкиферменты хозяина). Продукты распада отравляют клетки патогена, деструктивные
изменения в клетках предотвращают распространение инфекции. Жертвуя частью
своей ткани, растительный организм избавляется от патогена и не погибает.
Набор белков, ответственных за иммунные свойства, изменяется в процессе
эволюции организмов — в ответ на появление у патогенов новых белков, при­
чиняющих вред растению. Таким образом, происходит параллельное развитие
свойств вирулентности у патогена и устойчивости у растения.
Белки выполняют свойственные им функции только при определенных усло­
виях (оптимальные температура, рН, концентрация солей и т. п.). При воздействии
различных физических (температура свыше 60 °С, высушивание, ультразвук, уль­
трафиолетовое облучение и др.) и химических (крепкие кислоты и щелочи, моче­
вина, соли тяжелых металлов, дубильные вещества и др.) факторов белки срав­
нительно легко изменяют нативную структуру макромолекул, теряя при этом ряд
своих первоначальных свойств, и прежде всего растворимость и биологическую
активность. Это явление получило название денатурации. Денатурация связана
с нарушением четвертичной, третичной и частично вторичной структур белковой
молекулы и не сопровождается изменениями первичной структуры (рис. 1.8).
Процессы денатурации имеют важное значение для пищевой, легкой промыш­
ленности. На них основано консервирование пищевых продуктов, хлебопечение,
дубление кож и т. п. Денатурированные белки хорошо перевариваются и усваива­
ются организмом человека.
Нативная
молекула
Развертывание
полипептидной цепочки
Случайный
клубок
1.2.3. Липиды
группы
о
липофильные пигменты и амфипатические
ссн2
н -_0
—
с
__к
- 0- - с —
липиды. Общее свойство всех липидов — высокая гидрофоб
0
ность. Липиды растворяются в эфире,
II
сн
—
р
о
с
—
обусловлено наличием в их молекулах
0
неполярных углеводородных радикалов
II
сн2
-- 0
- сС — к
жиры являются сложными эфирами трехсн2—
О-—
атомного спирта глицерина
Высокомолекулярные жирш
Рис. 1.9. Общая
длинные углеводородные це
структура жирОЕ
сыщенными связями. От степени насыщенности жирных кис­
лот зависит консистенция жира: чем выше степень ненасыщенности, тем более
жидким при нормальных условиях будет жир (масло).
В жирах растений чаще других встречаются такие ненасыщенные кислоты, как
олеиновая (С п Н з э С О О Н ), линолевая (С 17Н 31С О О Н ), линоленовая (С 17 Н 2 9 С О О Н ),
из насыщенных — стеариновая (С 17 Н 3 5 С О О Н ) и пальмитиновая (С 15 Н 3 3 С О О Н ).
Собственно жиры отличаются очень высокой калорийностью: 1 г жира дает
38 кДж (больше, чем углеводы и белки). Это определяет основную функцию жи­
ров — запасную. Выше всего содержание жиров в семенах масличных культур,
% СВ:
—
Кунжут......................... ............. 48-63
Клещевина................................. 47-5 8
Арахис........................ ....... ..'..„..41-55
Рапс озимый...............................45-49
Лен масличный.......................,...30-49
П е р и л л а ......................... „... 26-49
Горчица сизая.............................35-47
Рыжик,.......................................25—46
Ляллеманция.............................. 35-38
Подсолнечник................ ............29-37
Сафлор....................................... 25-37
Соя............. ........................... 15-24
Насыщенность жирами семян масличных культур делает их ценнейшим сырьем
для производства масел, использующихся в пищевых и промышленных целях.
Воски — наиболее гидрофобные вещества из всех липидов, представляют со­
бой сложные эфиры одноатомных высокомолекулярных спиртов (от 22 до 32 ато­
мов углерода) и высших жирных кислот с числом углеродных атомов от 24 до 36.
В растительных восках часто встречается цетиловый спирт (СНз(СНг)]4СН20Н).
Помимо эфиров в чюстав восков могут входить и молекулы свободных высокомо­
лекулярных спиртов, кислот и углеводородов.
Растительные воски образуются в цитоплазме, накапливаются в виде отдельных пластинок в клеточной стенке эпидермальных клеток и выступают на ее по-
верхность в виде гранул, палочек, ячеек. Сформированная таким образом кутику­
ла защищает листья, стебли и плоды растений от высыхания при недостатке влаги
и вымокания в период длительных дождей. Восковой налет служит преградой для
проникновения в растение патогенных грибов и бактерий, а также ряда вредных
насекомых. Все виды восков используют для сходных целей — изготовления све­
чей, косметических средств, кондитерских изделий, жевательной резинки, поли­
ровальных
строения конденсированные структуры
четырех углеводородных циклов, представляющих собой высокомолекулярные
спирты или их сложные эфиры. Эти гидрофобные вещества играют определенную
роль в структуре клеточных мембран, стероидную природу имеют витамины груп­
пы Б (эргостерол). Наиболее богаты стероидами дрожжи и плесневые грибы.
Липофильные пигменты. К этой группе
органических растворителях пигменты (хлорофиллы и каротиноиды). Хлорофиллы
пигменты растений зеленого цвета. Молекула хлорофилла благодаря структурным
изменениям и физико-химическим особенностям способна выполнять три важ­
нейшие функции: избирательно поглощать энергию света; трансформировать ее
в энергию электронного возбуждения (или запасать ее в виде энергии электронно­
го возбуждения); фотохимически преобразовывать энергию возбужденного состо­
яния в химическую энергию.
В настоящее время известно несколько различных форм хлорофилла, которые
обозначают латинскими буквами. Хлоропласты высших растений содержат хлоросн
н*с
С
сн
сн
(
С
/
1
с
СН
СН
//
не
СН
сн
н*с
сн
НС
сн
сн
с
с
о
со
V
Остаток
фитола
Остаток
метилового спирта
С— СН
филл а (С55Н2205М4М§) и хлорофилл Ь (С55Н7оОбМ4М§). Они были идентифицирова­
ны русским ученым М. С. Цветом (1872—1919) с помощью разработанного им мето­
да хроматографии. Структурная формула хлорофилла а, предложенная Э. Г. Фише­
ром (1852-1919), получила окончательное подтверждение в 1960 г. (рис. 1.10).
Хлорофилл а содержит четыре соединенных между собой остатка пиррола
(пиррольные группы I, II, III, IV), которые образуют порфириновое ядро. Это ядро
связано двумя основными и двумя дополнительными валентностями с атомом
магния. Структурная формула свидетельствует о том, что хлорофилл а представ­
ляет собой сложный эфир двуосновной кислоты и двух спиртов — метилового
и высокомолекулярного непредельного спирта фитола. Именно наличие остатка
фитола в хлорофилле придает последнему липидные свойства, проявляющиеся
в его растворимости в неполярных растворителях.
Хлорофилл Ъ отличается от хлорофилла а тем, что у третьего углерода второ­
метальной находится альдегидная группа
Каротиноиды
пигменты
го цветов. Они входят в состав хлоропластов
окраска
хлорофиллом. С разрушением хлорофилла
неблагоприят
ных условиях
связано пожелтение листьев.
Каротины представляют собой углеводороды с формулой ЩЩб- По химичес­
кому строению каротиноиды являются тетратерпеноидами (8 остатков изопрена,
Сю). Каротиноиды могут быть ациклическими (алифатическими), моно- и бициклическими. Циклы на концах молекул каротиноидов — производные ионона.
В хлоропластах высших растений содержатся а- и Р-каротаны (рис. 1.11).
Р-Каротин имеет два 0-иононовых кольца (двойная связь между С5 и Сб). При
гидролизе Р-каротина по центральной двойной связи образуются две молекулы
витамина А (ретинола). а-Каротан отличается от Р-каротина тем, что у него одно
кольцо Р-иононовое, а второе — Е-иононовое (двойная связь между С4 и С5). Из
основных химических свойств каротиноидов следует отметить их склонность
к реакциям окисления-восстановления, которые сопровождаются изменением ок-
(X-Каротин
р*Кароган
4Н
^40^56^4
(Виолаксантин)
Свет
2НгО
С40Н56О2
(Зеаксантин)
2Н20
X
202 + 4Н
Рис. 1.12. Виолаксантиновыи цикл
раски. Как правило, восстановление каротиноидов вызывает ослабление окраски
до полного ее исчезновения.
Ксантофиллы — кислородсодержащие производные каротина. Ксантофилл
лютеин — производное а-каротина, а зеаксантин — Р-каротина. Они имеют по
одной гидроксильной группе в каждом иононовом кольце. Дополнительное вклю­
чение в молекулу зеаксантина двух атомов кислорода по двойным связям С5-С 6
(эпоксидные группы) приводит к образованию виолаксантина (рис. 1.12), при
включении эпоксидных групп в лютеин образуется неоксантин.
Каротиноиды являются обязательными компонентами пигментных систем.
Они выполняют роль дополнительных пигментов, которые передают энергию
поглощенных квантов хлорофиллу а для совершения фотохимической работы. Их
значение как светоулавливающих систем возрастает в сине-фиолетовой и синей
частях спектра (от 400 до 500 нм). При увеличении числа конъюгированных свя­
зей максимумы поглощения смещаются в длинноволновую область спектра. По­
добно хлорофиллам каротиноиды нековалентно связаны с белками и липоидами
мембран и типакоидов.
» «•••* •.
».
.\т '*■
Каротиноиды выполняют защитную функцию, предохраняя хлорофилл от
фотоокисления. Еще в 1913 г. Д. И. Ивановский установил, что в пробирках, вы­
ставленных на прямой солнечный свет, степень разрушения хлорофилла зависит
от концентрации каротиноидов в растворе. У дефектных по каротиноидам му­
тантов кукурузы и подсолнечника, а также при экспериментально нарушенном
образовании каротиноидов наблюдается быстрое фотоокисление хлорофилла.
Предположительно каротиноиды участвуют в расщеплении воды и кислородном
обмене при фотосинтезе.
Амфипатические липиды. Основное отличие этой группы заключается в том,
что ее представители обладают двойственными свойствами: как гидрофобностью,
так и гидрофильностью. Последнее обеспечивается тем, что с одной из спирто­
вых групп глицерина взаимодействует соединение с гидрофильными свойствами.
Наиболее часто в растениях встречаются гликолипиды, сульфолипиды и фосфо­
липиды (рис. 1.13).
Гликолипиды в качестве гидрофильного компонента содержат остаток галак­
тозы. В сульфолипидах галактоза связана с остатком серной кислоты. В молеку­
лах фосфолипидов с одним из гидроксилов глицерина взаимодействует ортофосфорная кислота, к которой присоединяется какое-либо гидрофильное соединение
(азотистые основания холин, этаноламин; аминокислота серии). В зависимости
от азотистого основания различают холинфосфолипиды (их называют лецитины),
коламинфосфолипиды (кефалины) и серинфосфолипиды. Соотношение различ-
со
со X
X о
о
со
X \|
о
X
X
о
см
а:
о=о
о
X
X
н
X
а*
ф
с;
о
х
О
о
о
о
о
с
м
X
о
осм
о
см
О
X
X
осм
X
о=о
см
(Г
0=0 о
о
осм
X
о
X
II
X
о
со
осм о
X
о
осм
X
О
о
а.
о
осм
X
о
X
осм
X
О— X
X
XX
оN
о
о
«
5
X
сX
о
о
X
о
х
О
■X0X
а
ф
о
см
§
X
-8
Л
с.
>»
о
см
X
О
X
см
(Г
У
0=0 о
а
о
о
о
о
осм
X
о
X
осм
X
осм
X
о
X
осм
X
о
о
X
х —о
X
о
Xч
о \ XX
о«V
—о
о о —X
I
X X
о О— X
со
О
сс.
о
х
х
X
о
см с
нX (0
О
О—X
см
о
I 9739
о=о
о
О
0=0
2
о:
О
а:
О
о
см
л
о
0 = 0
О
с(
X
с
X
с;
о
«■
о
о
8&
о
(г
хх
X
О
ОС
а:
X
о
х
О
х
х
я
*ф
Рис. 1.13. Строение амфипатических липидов
см
X
ных форм амфипатических липидов можно представить по анализу их содержа­
ния в листьях сахарной свеклы, мкмоль/г сырой массы:
Фосфолипиды:
фосфатидилхолин ................... 4,7
фосфатидилэтаноламин ........ 2,2
фосфатидилинозит...л..............1,1
фосфатидилглицерин...............0,5
Гликолипиды...................................3,7
Сульфолипиды................................ 0,9
Роль амфипатических липидов в живой клетке уникальна: они являются основой
всех биологических мембран.
1.2.4. Красящие и дубильные вещества
Красящие вещества растений представлены флавоноидами, каротиноидами,
хлорофиллами и т. д. В растениях они содержатся в различных частях культурных
и дикорастущих растений и придают им определенный цвет. О строении хлоро­
филлов и каротиноидов и их роли для растений см. разд. 1.2.3.
Флавоноиды входят в группу Сб-Сз-Св-соединений, включающую такие кра­
сящие вещества растений, как антоцианы, флавоны, флавонолы и др. Флавоноиды
можно рассматривать как производные флавана (рис. 1.14).
Антоцианы окрашивают плоды, листья, лепестки цветов в самые разнооб­
разные оттенки — от розового до черно-фиолетового. Строение антоцианов ус­
тановлено в 1913 г. крупнейшим немецким биохимиком Р. М. Вилыптеттером
(1872-1942).
Все антоцианы содержат в гетероциклическом кольце четырехвалентный кис­
лород (оксоний) и поэтому легко образуют соли, например хлориды. В отличие
от хлорофилла антоцианы сосредоточены не в пластидах, а в вакуолях. В тканях
растений они присутствуют, как прарило, в виде гликозидов. Реже встречаются
Флавоны
Флавонолы
ацилированные антоцианы. Так, красящее вещество красной капусты — рубробрассицин — представляет собой триглюкозид цианидина, в молекуле которого
к двум остаткам глюкозы в положении Сз присоединены две молекулы феруловой
кислоты; третий остаток глюкозы в его молекуле свободен.
Агликоны антоцианов называют антоцианидинами. Из антоцианидинов наи­
более широко распространен в растениях цианидин. Например, красящее веще­
ство василька цианин представляет собой 3,5-дигликозид цианидина. Гликозиды
цианидина входят в состав красящих веществ плодов вишни, сливы, земляники,
винограда и брусники. Очень часто в одном растении содержится серия антоциа­
нов, построенных на основе одного или нескольких антоцианидинов. Так, в цвет­
ках и клубнях культурного картофеля обнаружены 10 антоцианов.
Первоначально предполагалось, что разнообразие окраски антоцианов объяс­
няется их индикаторными свойствами и зависит от значения рН клеточного сока,
в котором они растворены. Позднее было установлено, что антоциановая пигмен­
тация растительных тканей определяется многими факторами, важнейшие из них:
■ комплексообразование с ионами металлов — соли калия (К-соли) имеют пур­
пурную окраску, Са- и М§-соли — синюю;
*
■ строение антоцианидина — метилирование изменяет окраску с появлением
красных оттенков;
| адсорбция на полисахаридах.
Флавоны — желтые красящие вещества, обычно встречаются в виде гликозидов. Наиболее распространенные флавоны: апигенин (Я=К-Н), лютеолин (К=ОН;
К.-Н) и трицин (К=К.'=ОСНз). Апигенин содержится в петрушке, цветках хризан­
темы, плодах кислого апельсина (СНгиз аигапНит)', трицин найден в пшенице,
рисе и люцерне.
Флавонолы — тоже желтые красящие вещества, чрезвычайно широко рас­
пространены в растениях. Образуют большое число разнообразных гликозидов,
чаще всего производных следующих агликонов: кемпферола (К=К-Н), кверцетина (К=ОН; К.-Н) и мирицетина (К.=К-ОН). З-Глюкозид кемпферола (астрагалин)
выделен из цветков астрагала и конского каштана, листьев чая и хурмы. З-Рамнозид кверцетина (кверцетин) содержится в коре многих видов дуба, листьях чая,
яблони, ягодах винограда, табаке, хмеле. З-Рамноглюкозид кверцетина (рутин)
встречается в растениях особенно часто. Рутином богаты шиповник, красная смо­
родина, цитрусовые, рябина.
Некоторые флавоноиды растений, например, катехины бесцветны, одна­
ко в процессе окислительных превращений — в производстве какао, виноделии
и особенно в чайной промышленности — они приобретают окраску. К более ред­
ким фенольным соединениям относятся полифенол кожуры зеленого грецкого
ореха и ценный природный антрахиноновыи краситель ализарин.
Самое важное свойство многих фенольных соединений — их участие в окис­
лительно-восстановительных реакциях. Производные фенольных соединений
в виде убихинонов переносят водород (электрон) в дыхательной цепи, локали-
зованной в митохондриях. Убихиноны встроены в дыхательную цепь на участке
между флавопротеидами и цитохромной системой.
Многие фенольные соединения являются антиоксидантами и находят все бо­
лее широкое применение в пищевой промышленности для стабилизации жиров.
А нтиоксид антная активность фенольных соединений объясняется, во-первых, их
способностью связывать ионы тяжелых металлов в устойчивые комплексы, тем
самым лишая последние каталитического действия; во-вторых, фенольные соеди­
нения служат акцепторами образующихся при самоокислении свободных радика­
лов (то есть они способны гасить свободнорадикальные процессы). Фенольные
соединения стимулируют деление клеток в культуре растительных тканей, подав­
ляют прорастание семян, разобщение окислительного фосфорилирования и др.
Дубильные вещества — это полимеры фенольной природы, которые содер­
жат некоторые растения; названы так, поскольку позволяют дубить невыделан­
ную шкуру, превращая ее в кожу. Эта способность дубильных веществ основана
на их взаимодействии с коллагеном (белком кожных покровов животных), при­
водящем к образованию устойчивой поперечносвязанной структуры. Несмотря
на многообразие синтетических дубителей, растительные дубильные вещества не
потеряли своего важного значения, так как они необходимы для получения кожи
высокого качества.
Термин «дубильные вещества» используется также в пищевой промышлен­
ности и технической биохимии для обозначения более низкомолекулярных соедивкусом
экстрактах
тимая адсорбция дубильных веществ на кожном (гольевом) порошке и осаждение
желатина из водных растворов.
Природные дубильные вещества обычно имеют молекулярную массу 1ООО—
5000 а. е. м. и представляют собой сложную смесь близких по составу соединений
(рис. 1.15). Строение дубильных веществ изучали отечественные и зарубежные
ученые: Э. Г. Фишер и Г. Поварнин (Россия), П. Каррер (Швейцария). По класси­
фикации К. Фрейденберга (1920) дубильные вещества подразделяют на гидроли­
зуемые и конденсированные.
Гидролизуемые дубильные вещества делят на подгруппы галловых и эллаговых дубильных веществ. При обработке разбавленными кислотами гидролизуераспадаются
фенольнойи неф
Характерный представитель галловых дубильных веществ — галлотаннин,
или китайский таннин, —
аллов
личных видов кустарника
обработке ферментом
галлотаннин
галловую кислоту.
Галлотаннин
пенкопгорои
оос
Н
с — ООО
НС— ООО
он
он
он
он
он
он
О НС— ООО
НС— оос
сн
он
он
он
н 2с — о о с
оос
ОН
оос
он
он
Галлотаннин
он
снон
он
х^СНОН
он
п
Катехин (линейный полимер)
Рис. 1. 15. Строение дубильных веществ
остатков может быть и меньше, и больше четырех, причем они могут присоеди­
няться в разных сочетаниях (ди-, три-, тетра- и пентагаллоил) к разным атомам
углерода глюкозы. У других галловых дубильных веществ место глюкозы может
занимать сахар с разветвленной углеродной цепочкой — гамамелоза (а-оксиметил-Э-рибоза). Таково, например, дубильное вещество коры каштана — произ­
водное дигаллоилгамамелозы. Дубильное вещество стручков тропического рас­
тения цезальпинии колючей (Саеза1рШа зртова) представлено пентагаллоилхинной кислотой и ее аналогами.
Эллаговые дубильные вещества отличаются от галловых тем, что при их
гидролизе образуется нерастворимая эллаговая кислота. Они содержатся в корке
граната, кожуре незрелых грецких орехов, миробаланах (плоды дерева ТегттаНа
сИеЬи1а), древесине эвкалипта.
Конденсированные дубильные вещества, в отличие от гидролизуемых, при
нагревании с разбавленными кислотами подвергаются дальнейшему уплотнению.
Они являются полимерами катехинов или лейкоантоцианов либо сополимерами
этих двух типов флавоноидных соединений. Строение конденсированных дубиль­
ных веществ до сих пор недостаточно изучено. По К. Фрейденбергу, конденсация
катехинов сопровождается разрывом гетероцикла и приводит к образованию ли­
нейных полимеров с большой молекулярной массой (см. рис. 1.15).
Источниками конденсированных дубильных веществ служат кора ивы, сосны,
ели, лиственницы; древесина некоторых видов акации, каштана и дуба.
Отечественные ученые А. Л. Курсанов и М. Н. Запрометов показали, что фер­
ментативное окисление катехинов, происходящее при изготовлении черного чая,
приводит к образованию лишь димерных продуктов конденсации. Такие диме­
ры — типичные «пищевые» дубильные вещества. Благодаря приятному слабовя­
жущему вкусу и характерной золотисто-красной окраске водных растворов они во
многом определяют качество черного чая. Димерные катехины частично сохраня­
ют свойственную исходным мономерам Р-витаминную активность.
В последнее время из бобов какао, плодов боярышника и яблок выделены
димеры катехинов и лейкоантоцианов, например, димер (-)-эпикатехина и лейкоцианидина. Подобные димеры могут рассматриваться как прототипы истинных
дубильных веществ. ;
1.2.5. Минеральные вещества
Растения способны поглощать из окружающей среды практически все элементы
периодической системы Д. И. Менделеева. Причем многие рассеянные в земной
коре элементы накапливаются в растениях в значительных количествах и включа­
ются в природный круговорот веществ, в частности в круговорот редких элемен­
тов. Однако для нормальной жизнедеятельности самого растительного организма
требуется лишь небольшая группа элементов.
Питательными веществами называются вещества, необходимые для жизни
организма. Элемент считается необходимым, если его отсутствие не позволяет
растению завершить свой жизненный цикл; недостаток такого элемента вызывает
специфические нарушения жизнедеятельности растения, предотвращаемые или
устраняемые внесением этого элемента. Питательное вещество непосредственно
участвует в процессах превращения веществ и энергии, а не действует на расте­
ние косвенно.
Необходимость элементов можно установить только при выращивании рас­
тений на искусственных питательных средах — в водных и песчаных культурах.
Для этого используют дистиллированную воду или химически чистый кварцевый
песок, химически чистые соли, химически стойкие сосуды и посуду для приготов­
ления и хранения растворов.
Четыре элемента — углерод (С), кислород (О), водород (Н), азот (Ы) — на­
зываемые органогенами, составляют 95 % сухой массы растительных тканей,
5 % приходится на зольные вещества. Зольными веществами называют входя­
щие в растение минеральные элементы, содержание которых обычно определя­
ют в тканях после сжигания органического вещества растений. Содержание золы
зависит от вида и органа растений, условий выращивания. В семенах количество
золы составляет в среднем 3 %, в корнях и стеблях — 4-5 %, в листьях — 5-15% .
Меньше всего золы в мертвых клетках древесины (около 1 %). Как правило, чем
богаче почва и чем суше климат, тем больше в растениях зольных элементов.
Для определения элементов-органогенов, в частности азота (Ь1), а также серы
(8) и фосфора (Р) используют либо кислотные методы озоления, либо атомно-абсорбционную спектрофотометрию, так как сухая минерализация приводит к зна­
чительным потерям данных элементов.
Вегетационными опытами установлено, что для жизнедеятельности высших
растений (помимо 45 % углерода, 6,5 % водорода и 42 % кислорода, усвояемых
в процессе воздушного питания) необходим еще ряд макро- и микроэлементов.
Макроэлементы — химические элементы, содержание которых в живых орга­
низмах составляет больше 0,001 %.
Азот (Ы) составляет около 1,5 % сухой массы растений. Он входит в состав
белков, нуклеиновых кислот, липидных компонентов мембран, фотосинтетических пигментов, витаминов и других жизненно важных соединений. Основными
усвояемыми формами азота являются ионы нитрата (ЫОз) и аммония (ТЧЩ). Вы­
сшие растения способны также усваивать нитриты и водорастворимые азотсодер­
жащие органические соединения (аминокислоты, амиды, полипептиды и др.). Но
в естественных условиях эти соединения редко бывают источником питания, пос­
кольку их содержание в почве, как правило, очень мало.
Недостаток азота тормозит рост растений. Это выражается не только в низкорослости и слабом кущении, но и в признаках ксероморфизма (уменьшение лис­
товой поверхности, мелколистность и др.). Одновременно снижается ветвление
корней, но соотношение массы корней и надземной системы может увеличивать­
ся. Уменьшение площади фотосинтетического аппарата и сокращение периода
вегетативного роста снижает фотосинтетический потенциал и продуктивность
посева. Так как снижается фотосинтез, растения хуже используют световую энер­
гию. Интенсивность дыхания может возрастать, но уменьшаются сопряженность
окисления с фосфорилированием и выработка АТФ. Кроме того, энергетические
затраты на поддержание структуры цитоплазмы возрастают. Все это вызывает се­
рьезные нарушения энергетического обмена и снижает урожай.
Кроме того, азотное голодание снижает водоудерживающую способность
растительных тканей, так как уменьшает количество коллоидно-связанной воды.
У растений ухудшается внеустьичное регулирование транспирации, возрастает
водоотдача. Поэтому низкий уровень азотного питания не только снижает урожай,
но и уменьшает эффективность использования воды посевом.
Фосфор (Р) содержится в количестве 0,2-1,2 % сухой массы растения. В от­
личии от азота фосфор поглощается и функционирует в растении только в окис­
ленной форме — в виде остатков ортофосфорной кислоты. Весь фосфорный
обмен сводится к фосфорилированию и трансфосфорилированию. Фосфорилирование — это присоединение остатка фосфорной кислоты к какому-либо орга­
ническому соединению с образованием эфирной связи, например фосфорилирование глюкозы, фруктозо-6 -фосфата в гликолизе. Трансфосфорилирование — это
процесс, при котором остаток фосфорной кислоты, включенный в состав одного
органического вещества, переносится на другое органическое вещество.
Несмотря на относительную простоту фосфорного обмена, значение обра­
зующихся при этом фосфорорганических соединений огромно. Фосфор — обя­
зательный компонент таких важнейших соединений, как нуклеиновые кислоты,
фосфопротеиды, фосфолипиды, фосфорные эфиры, нуклеотиды, принимающие
участие в энергетическом обмене (АТФ, НАД, ФАД и др.), обмене витаминов.
Поэтому дефицит фосфора вызывает серьезные нарушения биосинтетических
процессов, функционирования мембран, энергетического обмена. При недостатке
фосфора приостанавливается рост растений: корневая система буреет, слабо раз­
вивается, корневые волоски отмирают, задерживается созревание плодов.
Сера ( 8 ) содержится в растительных тканях в количестве 0,2-1,0 % сухой мас­
сы. Сера, как и фосфор, поступает в растение в окисленной форме, в виде аниона
8 О4 . В органические соединения сера входит только в восстановленной форме —
в составе сульфгидрильных групп ( - 8 Н) и дисульфидных связей ( - 8 - 8 -). Вос­
становление сульфата происходит преимущественно в листьях. Восстановленная
сера может вновь переходить в окисленную функционально неактивную форму.
В молодых листьях сера в основном находится в составе органических соедине­
ний, а в старых — накапливается в вакуолях в виде сульфата кальция.
Сера принимает активное участие в многочисленных реакциях обмена ве­
ществ. Почти все белки содержат серосодержащие аминокислоты — метионин,
цистеин, цистин. Важнейшие функции серы в белках— участие 8 Н-групп и - 8 - 8 связей в стабилизации трехмерной структуры белков и образование связей с коферментами и простетическими группами. Сочетание метальной и 8 Н-группы
обуславливает широкое участие метионина в образовании активных центров фер­
ментов. С этой аминокислоты начинается синтез всех полипептидных цепей.
Другая важная функция серы в растительном организме — поддержание оп­
ределенного уровня окислительно-восстановительного потенциала в клетке, необ­
ходимого для нормального функционирования всех ферментных систем. К серо­
содержащим окислительно-восстановительным системам клетки относятся сис­
тема цистеин - цистин и система глутатиона. Глутатаон является трипептидом,
состоящим из трех остатков аминокислот: глутаминовой, цистина или цистеина
и глицина. Его окислительно-восстановительные превращения связаны с перехо­
дом - 8 - 8 - групп цистина в 8 Н-группы цистеина:
0 8 - 8 0 г=±208Н
Освобождение или связывание водорода происходит в зависимости от преоб­
ладающих метаболических условий в клетке и при взаимодействии с тиоловыми
группами ферментов.
Сера является также компонентом важнейших биологических соединений —
кофермента А (СоА-ЗН) и витаминов (тиамина, липоевой кислоты, биотина), иг­
рающих положительную роль в тканевом дыхании и липидном обмене. Кофермент А поставляет ацетильные остатки (СН3СО - 8 К0 А) в цикл Кребса или для
биосинтеза жирных кислот. В составе этого комплекса сера образует макроэргическую связь, что значительно повышает реакционную способность соединения.
Липоевая кислота и тиамин входят в состав липотиаминдифосфата (ЛТДФ), участ­
вующего в окислительном декарбоксилировании пировиноградной и а-кетоглютаровой кислот.
Многие виды растений в малых количествах содержат летучие соединения
серы. Например, сульфоксиды входят в состав фитонцидов лука и чеснока. Пред­
ставители семейства крестоцветных синтезируют серосодержащие горчичные
масла.
Недостаточное снабжение растений серой тормозит белковый синтез, снижа­
ет фотосинтез и скорость роста, особенно надземной части.
Калий (К) содержится в растениях в количестве около 1 % (в расчете на су­
хую массу). В растительных тканях его гораздо больше, чем других катионов. Калия
в растениях в 100-1000 раз больше, чем во внешней среде. Поступает калий в расте­
ние в виде катиона К+. В клетках присутствует в ионной форме и не входит ни в одно
органическое соединение. В наибольшем количестве калий сосредоточен в молодых
растущих тканях, характеризующихся высоким уровнем обмена веществ.
Калий участвует в регуляции вязкости цитоплазмы, повышении гидратации
ее коллоидов и водоудерживающей способности; он служит основным противоионом для нейтрализации отрицательных зарядов неорганических и органичес­
ких анионов. Высокая подвижность калия создает ионную асимметрию и раз­
ность электрических потенциалов на мембране, то есть обеспечивает генерацию
биотоков в растении.
Калий составляет основную часть катионов клеточного сока и принимает ак­
тивное участие в осморегуляции. Важное значение имеет транспорт калия при
открывании и закрывании устьиц.
С перераспределением калия также связан транспорт углеводов в растении.
Установлено, что высокий уровень сахара в зрелых ягодах винограда коррелирует
с накоплением значительных количеств калия и органических кислот в соке не­
зрелых ягод с последующим выходом калия при созревании. Под влиянием калия
увеличивается накопление крахмала в клубнях картофеля; сахарозы в сахарной
свекле, моносахаридов в плодах и овощах; целлюлозы, гемицеллюлоз и пектино­
вых веществ в клеточных стенках растений. В результате повышается устойчи­
вость злаков к полеганию, грибным и бактериальным заболеваниям.
Калий активирует многие ферментные системы; он необходим для включения
фосфата в органические соединения, синтеза белков, полисахаридов и рибофла­
вина.
Снабжение калием особенно важно для молодых, активно растущих органов
и тканей. При дефиците калия снижается функционирование камбия (образова­
тельной ткани, обуславливающей рост растения в толщину), нарушаются про­
цессы деления и растяжения клеток, развитие сосудистых тканей, уменьшается
толщина клеточной стенки эпидермиса (покровной ткани). В результате укора­
чивания междоузлий (участков стебля между местами прикрепления листьев)
могут образоваться розеточные формы растений. Недостаток калия снижает про­
дуктивность фотосинтеза, прежде всего за счет уменьшения оттока ассимилятов
из листьев.
Кальций (Са) входит в состав растений в количестве 0,2 % СВ. Поступает
в растение в виде иона Са2+, накапливается в старых органах и тканях. При сниже­
нии физиологической активности клеток кальций из цитоплазмы перемещается
в вакуоль и откладывается в виде нерастворимых соединений щавелевой, лимон­
ной и других кислот. Это значительно снижает подвижность кальция в растении.
В клетках большое количество кальция связано с пектиновыми веществами
клеточной стенки. При недостатке этого элемента клеточные стенки ослизняются.
Важная роль принадлежит ионам кальция в стабилизации структуры мембран,
регуляции ионных потоков и биоэлектрических явлениях/
Относительно много Са содержится в митохондриях, хлоропластах и ядрах,
а также в комплексах с биополимерами пограничных мембран клетки. Кальцием
занята большая часть катионообменной поверхности корня. Наряду с протоном
водорода кальций принимает активное участие в первичных механизмах поступ­
ления ионов в клетки корня. Ограничивая поступление других ионов в растения,
кальций способствует устранению токсичности избыточных концентраций ионов
аммония, алюминия, марганца, железа, повышает устойчивость к засолению, сни­
жает кислотность почвы.
В цитозоле концентрация кальция низкая (10^-Ю ^моль/г). Вместе с тем ло­
кальное изменение концентрации Са2+ в цитозоле приводит к структурной пере­
стройке актомиозиноподобных белков, участвующих в процессах движения ци­
топлазмы, обратимых изменениях ее вязкости,
в
пространственной
организации
*I
цитоплазматических ферментных систем, например гликолиза. Уровнем ионов
Са2+ регулируются процессы сборки-разборки микротрубочек, секреции компо­
нентов клеточной стенки с участием везикул (пузырьков) Гольджи.
Кальций активирует ряд ферментных систем клетки, например, дегидроге­
назы, амилазы, фосфатазы, киназы, липазы. Его действие основано на участии
в образовании четвертичной структуры белка, создании мостиков в фермент-субстратных комплексах, влиянии на состояние аллостерических центров.
Регуляторное действие кальция на метаболизм во многом связано с функцио­
нированием специфического белка — кальмодулина. Это кислый (рН в изоэлектрической точке (ИЭТ) равен 3,0—4,3) термостабильный низкомолекулярный белок,
состоящий из 148 аминокислотных остатков. Комплекс белка с кальцием активи­
рует многие ферментные системы: протеинкиназы, транспортную Са-АТФ-азу,
АТФ-азу актомиозина. Кальмодулин участвует в регулировании концентрации
внутриклеточного кальция. Комплекс Са-кальмодулин контролирует сборку мик­
ротрубочек веретена, образование цитоскелета клетки и формирование клеточной
стенки.
От недостатка кальция в первую очередь страдают меристематические (об­
разовательные) ткани и корневая система. У делящихся клеток не формируются
клеточные стенки (в результате возникают многоядерные клетки); прекращается
образование боковых корней и корневых волосков.
Магний (М§) содержится в растительных тканях в количестве около 0,2 % су­
хой массы. Особенно много магния в молодых растущих частях растения, а также
в генеративных органах и запасающих тканях. Магний поступает в растение в ви­
де иона М§2+ и, в отличие от кальция, обладает сравнительно высокой подвиж­
ностью. Легкая подвижность М§2+ объясняется тем, что почти 70 % этого катиона
в растениях связано с анионами органических и неорганических кислот. Около
10-12 % магния входит в состав хлорофилла.
Магний активирует ряд ферментных систем: РДФ-карбоксилазы, фосфокиназ, АТФ-аз, енолаз, ферментов цикла Кребса, пентозофосфатного пути, спирто­
вого и молочнокислого брожения. Магний также активирует процессы транспор­
та электронов при фотофосфорилировании. М§2+ необходим для формирования
рибосом и полисом, для активации аминокислот и синтеза белков. Он активирует
ДНК- и РНК-полимеразы, участвует в образовании определенной пространствен­
ной структуры нуклеиновых кислот.
Магний усиливает синтез эфирных масел, каучуков. Образуя комплексное со­
единение с аскорбиновой кислотой, М§ предотвращает ее окисление. Недостаток
магния приводит к нарушению фосфорного, белкового и углеводного обменов.
При магниевом голодании затруднено формирование пластид, просветляется мат­
рикс хлоропластов. Впоследствии развиваются хлороз и некроз листьев.
Железо (Ре) входит в состав растений в количестве 0,08 % сухой массы. По­
ступает в растение в виде Ее3+. Роль железа в большинстве случаев связана с его
способностью к обратимым окислительно-восстановительным превращениям
и участию в транспорте электронов:
Ре?+ <-тт7 ^ Ре2*
Железо участвует в электронно-транспортной цепи (ЭТЦ) фотосинтетического
и окислительного фосфорилирования (цитохромов, ферредоксина), является компо­
нентом ряда оксидаз (цитохромоксидазы, каталазы, пероксидазы). Поскольку желе­
зо является составной частью ферментов, катализирующих синтез предшественни­
ков хлорофилла (аминолевулиновой кислоты и протопорфиринов), его недостаток
вызывает глубокий хлороз (обесцвечивание) развивающихся листьев и тормозит
два важнейших процесса энергообмена растения — фотосинтез и дыхание.
Растения способны включать железо в запасные вещества. Так, белок ферритин содержит железо в негеминовой форме. На долю железа может приходиться
до 23 % сухой массы ферритина.
Микроэлементы относятся к группе незаменимых питательных элементов, со­
держание которых в растительных тканях измеряется тысячными и стотысяч­
ными долями процента. Несмотря на то, что микроэлементы требуются в очень
малых количествах, в их отсутствие нормальная жизнедеятельность становится
невозможной. Недостаток микроэлементов вызывает серьезные физиологические
расстройства и нередко приводит к гибели растений уже в раннем возрасте. Объ­
ясняется это тем, что микроэлементы главным образом функционируют в регуля­
торных системах клетки. Они выступают в качестве простетических групп или
кофакторов ферментов.
Медь (Си) поступает в растение в виде иона Си2+. В основе ее функциониро­
вания — способность к обратимым окислительно-восстановительным превраще­
ниям:
■шь
Си2+<=0~> Си+
'
т*о
V*
$
:
Медь входит непосредственно в состав ряда ферментных систем, относящих­
ся к группе оксидаз, таких как полифенолоксидаза, аскорбатоксидаза. Два атома
меди функционируют в цитохромоксидазном комплексе дыхательной цепи мито­
хондрий. Большая часть меди (75 % от общего содержания в листе) концентри­
руется в хлоропластах. Здесь сосредоточен медьсодержащий белок синего цве­
та — пластоцианин, осуществляющий перенос электронов между фотосистемой I
и фотосистемой II (пигментные системы с максимумами поглощения световой
энергии 700 и 689 нм соответственно).
Медь активирует ряд ферментов, в частности нитратредуктазу и протеазы,
то есть влияет на азотный обмен; участвует в гормональной регуляции растений.
Медьсодержащий фермент полифенолоксидаза регулирует содержание и актив­
ность в растениях ауксинов и ингибиторов роста фенольной природы, это объяс­
няет способность меди повышать устойчивость растений к полеганию и неблаго­
приятным условиям среды.
Недостаток меди вызывает задержку роста и цветения. У плодовых культур
при остром дефиците меди наблюдается суховершинность.
Марганец (Мп) поступает в растение в виде ионов Мп3+, активирует фер­
менты, катализирующие реакции цикла Кребса (дегидрогеназы яблочной и ли­
монной кислот), а также участвующие в окислении важнейшего фитогормона —
ауксина (индолилуксусной кислоты — ИУК). Известна роль марганца в про­
цессе восстановления нитратов до аммиака, поэтому растения, испытывающие
недостаток Мп, не могут использовать нитраты в качестве источника азотного
питания.
'
ч *,
Нормальное протекание фотосинтеза также требует присутствия Мп. Этот
микроэлемент участвует на этапе разложения воды и выделения кислорода (фо­
толиз воды), а также восстановления СОг. Марганец способствует оттоку сахаров
из листьев, играет специфическую роль в поддержании структуры хлоропластов.
В отсутствие марганца хлорофилл быстро разрушается на свету.
Очень важен марганец для ростовых процессов, поскольку Мп является ко­
фактором РНК-полимеразы, ответственной за синтез м-РНК в ядре, и ауксиноксидазы — ферментативного комплекса, разрушающего ИУК. Установлено также
влияние марганца на поступление веществ в растение. При исключении Мп из
питательной среды в тканях растений возрастает уровень основных элементов
минерального питания, нарушается их соотношение. Особенно чувствительны
к недостатку марганца злаковые, корнеплоды, картофель.
Цинк (2п) поступает в растение в виде иона 2п2+, входит в состав фермента
карбоангидразы, катализирующей гидратацию СО2 в Н2СО3:
с о 2+ Н20 -> Н2С 03
Этот фермент играет важную роль в поддержании запасов СОг для фотосинтеза.
В качестве кофактора 2п участвует в синтезе растительного гормона ауксина
(повышая активность триптофансинтетазы, влияет на синтез аминокислоты трип­
тофана — предшественника ауксина). Цинк также является активатором ряда фер­
ментов гликолиза (гексокиназы, альдолазы, триозофосфатдегидрогеназы) и пентозофосфатного пути (дегидрогеназ глюкозо-6-фосфата и фосфоглюконата).
При дефиците цинка в растениях накапливаются редуцирующие сахара,
уменьшается содержание сахарозы и крахмала, увеличивается количество ор­
ганических кислот и небелковых соединений азота — свободных аминокислот
и амидов. Недосток цинка в растениях нарушает также фосфорный обмен: вклю­
чение фосфора в органические соединения и замедление его транспорта из кор­
ней в надземную часть. К недостатку цинка особенно чувствительны плодовые
деревья. Наиболее характерный признак голодания — задержка роста междоуз­
лий и листьев, развитие розеточности и мелколистности.
Молибден (Мо) поступает в растение в составе аниона МоО.Г и концентриру­
ется в молодых растущих частях. Молибден играет особо важную роль в азотном
обмене растений. Это связало с тем, что он входит в активный центр нитратредуктазы — фермента, восстанавливающего нитраты, а также является компонентом
активного центра нитрогеназы бактероидов, фиксирующих атмосферный азот
в клубеньках бобовых. Как металл-активатор, молибден необходим в реакциях
аминирования и переаминирования, для включения аминокислот в пептидную
цепь, функционирования различных фосфатаз. Он оказывает влияние на уровень
накопления аскорбиновой кислоты.
При дефиците молибдена рост растений тормозится. Особенно чувствитель­
ны к недостатку молибдена бобовые и овощные культуры.
Бор (В) поступает в растение в виде аниона борной кислоты. Это один из
наиболее важных микроэлементов, особенно для двудольных растений. При его
недостатке нарушаются синтез, превращение и транспорт углеводов, формирова­
ние репродуктивных органов, гибнут меристематические клетки и деградирует
проводящая система растений.
Механизмы действия бора и ферментные системы, в деятельности которых
он участвует, не установлены. Бор имеет специфическое значение для растения
благодаря своей уникальной роли в фенольном обмене. Предполагается, что при
недостатке бора в клетках двудольных растений накапливаются фенолы и аукси­
ны, что нарушает синтез нуклеиновых кислот и белков; затем нарушаются ритм
деления клеток и структура клеточных стенок, появляются уродливые изменения
в формирующихся листьях конуса нарастания.
На заключительной стадии борного голодания под действием полифенолоксидаз в клетке накапливаются токсичные хиноны, которые приводят к отмиранию
конусов нарастания.
.л.
1.2.6. Витамины и витаминоподобные вещества
Витамины — сборная в химическом отношении группа веществ с разнообразны­
ми физическими свойствами, необходимая для человека и животных в качестве
дополнительной к белкам, жирам, углеводам и минеральным веществам состав­
ной части пищи. Потребность в витаминах организмы удовлетворяют по-разному:
растения способны синтезировать все необходимые им витамины, человек и жи­
вотные получают их с пищей в готовом виде или в виде провитаминов — пред­
шественников, из которых образуются соответствующие витамины.
Витамины тесно связаны с ферментами, многие из них принимают участие
в построении активных (небелковых) групп двухкомпонентных ферментов и тем
самым оказывают влияние на жизнедеятельность организма. Отсутствие или не­
достаток в пище витаминов нарушает обмен веществ животного организма и при­
водит к заболеваниям, получившим название гипо- и авитаминозов.
К настоящему времени известно более 20 витаминов, которые по раствори­
мости в жире и воде классифицируют на жиро- и водорастворимые. Жирорас­
творимые витамины: витамин А (ретинол, ретинилацетат, ретиналь, ретиноевая
кислота), Б (кальциферолы), Е (токоферолы), К (филлохинон, менахинон). Водо­
растворимые витамины: витамин В] (тиамин), Вг (рибофлавин), Вз (пантотеновая
кислота), Вб (пиридоксин, пиридоксаль, пиридоксамин), Щ.2 (цианкобаламин, оксикобаламин, метилкобаламин), РР (никотиновая кислота, никотинамид), Н (био­
тин), Вс (фолацин, фолиевая кислота, тетфагидрофолиевая кислота и ее производ­
ные), С (аскорбиновая кислота).
Ряд витаминов представлен не одним, а несколькими соединениями, имею­
щими сходную биологическую активность (витамерами). Например, группа ви­
тамина Вб включает пиридоксин, пиридоксаль и пиридоксамин. Для обозначения
подобных групп родственных соединений используют буквенные обозначения
без цифровых индексов (витамины А, Б , Е и т. п.). Индивидуальные соединения,
обладающие витаминной активностью, обозначают названиями, отражающими
их химическую сущность, например, ретиналь (альдегидная форма витамина А),
эргокальциферол и холекальциферол (формы витамина Е>).
Витамин А встречается в виде четырех индивидуальных представителей:
ретинола, ретиналя, ретиноевой кислоты, ретинилацетата. Витамины группы
А — производные каротина. Так же как и каротин, они нерастворимы в воде, но
растворяются в различных жировых растворителях и жирах.
Витамины группы А присутствуют
исключительно в тканях животных и
СН2ОН
продуктах животного происхождения.
Однако образуются они из каротиноидов, широко распространенных в рас­
тениях. Установлено, что витамин А
Рис. 1.16. Строение витамина А
синтезируется в животном организме
(ретинола)
из каротина под действием особых фер­
ментов. Это означает, что каротин представляет собой провитамин витамина А .
Витаминная промышленность изготовляет очищенные препараты каротина для
обогащения ими различных пищевых продуктов.
Ретинол в химическом отношении — непредельный одноатомный спирт, со­
стоящий из Р-ионового кольца и боковой цепи в виде двух остатков изопрена,
имеющих первичную спиртовую группу (рис. 1.16).
Ретинол имеет два витамера — А 1 и Аг. Витамин А\ представляет собой по­
ловину молекулы Р-каротина, содержащую спиртовую группу. Из одной моле­
кулы Р-каротина могут образоваться две молекулы витамина А 1, в то время как
а- и у-каротины способны образовать лишь по одной молекуле витамина А ь По­
этому р-каротин как провитамин витамина А вдвое активнее, чем а- и у-каро­
тины. [3-Каротина больше всего в моркови — 9,0 мкг%, красном перце — 2,0,
томатах — 1 мкг%.
Витамин Аг был обнаружен в печени пресноводных рыб сотрудниками
Всесоюзного научно-исследовательского витаминного института В. Розановой
и Э. Ледерером. Этот витамин отличается от витамина А] своей эмпирической
и структурной формулами. Эмпирическая формула витамина А 1 — С20Н 30О ; вита­
мина Аг — СгоНгвО. Витамин Аг содержит шесть двойных связей, в то время как
витамин А | — пять.
Витамин А задействован в окислительно-восстановительных процессах
(способен образовывать перекиси, ускоряющие окисление других соединений);
участвует в регуляции проницаемости биологических мембран, синтезе корти­
костероидных гормонов, мукополисахаридов, обмене серы. Окисленная форма
витамина А — ретинальальдегид — в виде цис-изомера входит в белок опсин, об­
разуя с последним зрительный пигмент родопсин (основное светочувствительное
вещество сетчатки глаза).
Дефицит в пище витаминов группы А сказывается в нарушении роста, пони­
жении иммунитета к заболеваниям и ослаблении сумеречного зрения («куриная
слепота»).
Наиболее богаты витаминами группы А рыбий жир, печень некоторых рыб
и морских животных (акулы, трески, палтуса, кита, моржа, тюленя, белухи). Ре­
комендуемая суточная норма потребления витамина А для взрослого человека со­
ставляет 800-1000 мкг.
Витамин й — под этим термином понимают несколько соединений, отно­
сящихся к стеринам (стеролам); наиболее активны эргокальциферол ф г ) и холекальциферол (Оз). Витамины этой группы встречаются только в животных орга-
Провитамин 0 2 (эргостерол)
Витамин 0 2 (эргокальциферол)
Рис. 1.17. Образование витамина 02 из эргостерола
ультрафиоле
(рис
Эргостерол — наиболее важный из стеролов растений — содержится в боль­
ших количествах в дрожжах и плесневых грибах, его используют в качестве ис­
ходного продукта при промышленном получении витамина Б.
Витамин Б регулирует содержание кальция и неорганического фосфата в крови,
участвует в минерализации костей. Хронический дефицит этого витамина приводит
рахита у детей и разрежению костей (остеопорозу) — у взрослых.
Наиболее богаты витаминами группы Б рыбий жир, печень млекопитающих
и птиц. Витамины Б содержатся также в молоке, сливочном масле, яичных желт­
ках. Летом молоко и полученное из него сливочное масло значительно богаче ви­
таминами О, чем зимой. Это объясняется более интенсивным образованием витаод воздействием ультрафиолета
суточная норма потребления ви
2,5-5,0 мкг.
(токоферол)
метальных
активностью а-токоферола (рис
Токоферолы представляют
отличаются высокой устойчивостью, выдерживают нагревание до 170 °С. Эфиры
токоферолов еще более устойчивы, чем свободные токоферолы. Физиологическое
действие токоферолов связано с их участием в окислительно-восстановительных
процессах в качестве непосредственного переносчика электронов. Тем самым они
регулируют интенсивность свободно-радикальных реакций в живых клетках, пре­
дотвращают окисление ненасыщенных жирных кислот в липидах мембран, влия­
ют на биосинтез ферментов»,
сн*
О
К1 (филлохинон)
О
К 2 (менахинон-п)
Рис. 1.19. Строение витаминов группы К
Витамин Е широко распространен в растительных и животных продуктах,
особенно много его в растительных маслах (подсолнечном, хлопковом, соевом,
конопляном и др.), его также содержат зародыши злаков и зеленые листья расте­
ний. Токоферолы предохраняют растительные масла от окисления и прогоркания
(как антиокислители). Рекомендуемая суточная норма потребления витамина Е
для взрослых — 10 мг.
Витамин К — группа так называемых антигеморрагических факторов, не­
обходимых для нормального свертывания крови. По своей химической природе
витамины группы К (филлохиноны и менахиноны) представляют собой произ­
водные нафтохинона (рис. 1.19).
Длинная боковая цепь витамина К] является остатком высокомолекулярно­
го алифатического спирта фитола, входящего в состав хлорофилла. Витамин К2
имеет периодически повторяющиеся двойные связи в боковой цепи и образует­
ся в животном организме в результате деятельности микрофлоры кишечника или
при метаболизме нафтохинонов в тканях организма.
В организме человека витамин К катализирует образование специфического
белка — протромбина, необходимого для свертывания крови при повреждении
тканей животных и человека. Лучшими источниками витаминов К служат зеле­
ные части растений (шпинат, капуста, тыква), а также печень животных. Рекомен­
дуемая суточная норма потребления витамина К для взрослых — 80 мкг.
Витамин В\ (аневрин, тиамин) — один из важнейших водорастворимых ви­
таминов — можно рассматривать как соединение, построенное из пиримидиново­
го и тиазолового колец и оксиэтильного радикала (рис. 1.20).
В чистом кристаллическом виде витамин В 1 имеет форму мелких бесцветных
кристалликов, обладающих горьким вкусом, легко растворяющихся в воде. В кис­
лой среде витамин В 1 существует в виде тиаминхлорида, стоек к нагреванию и ки­
пячению, но очень легко разрушается при нагревании в нейтральной и особенно
Тиаэоловый цикл
А.
он
)
Пиримидиновый
цикл
Оксиэтильный
радикал
С1
Рис. 1.20. Строение витамина В
в щелочной среде.
мало
или
хлеба; но В 1 быстро разрушается при выпечке кондитерских мучных изделий, из­
готовляемых на щелочных разрыхлителях (сода или карбонат аммония).
Витамин В 1 играет важную роль в процессах превращения углеводов в ор*й и микроорганизмов. В виде фосфорнокислого эфира
пирофосфата —
витамин В) входит в состав п
расщепляющей пировиноградную кислоту на уксусный альдегид и СОг, поэтому
недостаток этого витамина в пище человека приводит к накоплению пировиноградной кислоты в крови и тканях. Тиаминпирофосфат' входит также в состав
ферментов, катализирующих
токислот.
для человека служат
ггрубей и зародыша, а также хлебопекарные
суточная норма потребления витамина В] для
взрослого составляет 1,2-2,1 мг.
Вг (рибофлавин) представляет собой по химическому строению
рибитилизоаллоксазин. Основу молекулы рибофлавина составляет
изоаллоксазина Витамин Иг — оранжево-желтое кристаллическое вество, растворимое в воде, хуже растворимое в спиртах и нерастворимое в эфихлороформе, бензоле. Рибофлавин при облучении ультрафиолетовыми лучами
[ем биологически неактивных соединений. Молекула ри­
бофлавина
сн2он
СН2ОН
I
(СНОН)з
(СНОН)з
сн
о
Окисленная форма
о
Восстановленная форма
Присоединяя два атома водорода в 1-м
и 10-м положении, рибофлавин восстанавли­
СООН
вается в бесцветное лейкосоединение, кото­
рое, окисляясь, снова превращается в рибоо
флавин. При этом образуются семихинонорис у 22 Строение
вые формы рибофлавина, в виде которых он
пантотеновои кислоты
функционирует как переносчик электронов
в составе ФМН (флавинмононуклеотида) или ФАД (флавинадениндинуклеотид а)— активных групп окислительно-восстановительных ферментов (аэробных
дегидрогеназ), участвующих в переносе водорода.
Таким образом, нарушения обмена веществ, возникающие при недостатке
рибофлавина, объясняются замедленным синтезом тех окислительно-восстановительных ферментов, в состав которых он входит.
В растительных и животных организмах рибофлавин содержится как в сво­
бодном виде, так и в виде фосфатного эфира. Исключительной способностью
синтезировать витамин В2 обладает грибок Егето(Иесшт азИЪуи. Он образует
так много рибофлавина, что последний выделяется в мицелии в виде кристаллов.
Е. азИЪуи используют для промышленного производства рибофлавина.
Источниками витамина В2служат продукты животного (до 60 %) и раститель­
ного (около 40 %) происхождения. Удовлетворение суточной потребности в этом
витамине (для взрослого — 1,5-2,4 мг) осуществляется в основном за счет молоч­
ных продуктов, хлеба и яиц.
Пантотеновая кислота {витамин Вт) широко распространена в природе,
с чем связано ее название (греч. рап1Ьо1еп — вездесущий). В пантотеновую кисло­
ту в качестве составной ее части входит остаток р-аланина, связанный с диметилоксимасляной кислотой (рис. 1.22).
Пантотеновая кислота представляет собой светло-желтую вязкую жидкость
с температурой плавления 75—80 °С, хорошо растворимую в воде, этиловом спир­
те, плохо растворимую в высших спиртах и эфире и нерастворимую в хлороформе
и бензоле. Пантотеновая кислота малоустойчива, а соли ее более устойчивы. В ви­
де пантотеина пантотеновая кислота входит в состав кофермента А. При участии
кофермента А происходят активирование и перенос образующихся в организме ос­
татков уксусной кислоты и других кислотных остатков (ацилов), синтез лимонной
кислоты, жирных кислот, стеролов, глицеридов и многих других соединений.
Основные источники пантотеновой кислоты, мг/100 г: печень и почки — 2,59,0, гречиха — 2,8, рис — 1,7-2,1, овес — 2,5, яйца — 1,4—2,7. Рекомендуемая су­
точная норма потребления пантотеновой кислоты для взрослого человека — 6 мг.
Витамин Вв (пиридоксин) представляет собой по химической структуре
2-метил-3-окси-4,5-диоксиметилпиридин. Кроме пиридоксина витаминной ак­
тивностью обладают еще два производных 3-оксипиридина, имеющих в положе­
нии 4 пиридинового ядра альдегидную или аминную группу и называемых соот­
ветственно пиридоксалем и пиридоксамином. Все три вещества получили общее
название — витамин Вб (рис. 1.23).
Пиридоксин
Пиридоксаль
Пиридоксамин
Рис. 1.23. Строение витаминов группы Вб
Бесцветные кристаллы пиридоксина горьковато-кислые на вкус, хорошо рас­
творимы в воде, хуже — в спирте и нерастворимы в эфире и хлороформе. Рас­
творы пиридоксина устойчивы к нагреванию с кислотами и щелочами. Это один
из стабильных витаминов. Однако он быстро теряет активность под действием
света. Основной метаболически активной формой витамина Вб, в которую могут
переходить пиридоксин, пиридоксаль и пиридоксамин, является фосфорный эфир
пиридоксаля — плридоксаль-5-фосфат (см. рис. 1.23).
Роль витамина Вб в обмене веществ заключается в том, что он в виде фосфор­
ного эфира входит в состав ферментов, катализирующих различные превращения
аминокислот, в частности их декарбоксилирование (расщепление с выделением
СОг), а также реакцию переаминирования. Отсутствие или недостаток витамина
Вб в пище приводит к нарушениям белкового обмена и синтеза жиров в животном
организме. При авитаминозе Вб отмечают также глубокие нарушения в синтезе
и обмене аминокислоты триптофана.
Больше всего витамина Вб содержится в дрожжах сухих — 50 мкг/г, рисовых
отрубях — 20, пшеничных зародышах —-16 мкг/г. Рекомендуемая суточная норма
потребления витамина Вб для взрослого человека — 2 мг.
Витамин Вп объединяет группу веществ, которые относятся к комплексным
соединениям трехвалентного кобальта. Вследствие наличия в молекуле кобальта
кристаллы витамина В 12 имеют красный цвет. В 12 хорошо растворим в воде, спир­
тах, но нерастворим в бензоле, хлороформе, ацетоне. В темноте устойчив, а на
свету теряет активность.
Химическая структура витамина отличается большой сложностью (рис. 1.24).
Молекула витамина В 12 состоит из плоскостной группы, которая сложена восста­
новленными пиррольными кольцами с атомом кобальта в центре, и расположен­
ной перпендикулярно к ней нуклеотидной группы, содержащей диметилбензимидазол в качестве основания и а-О-рибофуранозу в качестве углевода. У производ­
ных витамина Вп цианогруппа замещена другим радикалом.
Для удобства номенклатуры витамин В 12 называют цианкобаламином. При
замене цианогруппы на гидроксил образуется оксикобаламин — природная фи­
зиологическая форма витамина В 12. У аналога витамина В 12 — метаболически ак­
тивного соединения метилкобаламина — цианогруппа замещена на метильный
радикал. В виде кофермента В 12 цианкобаламин участвует в ферментативных ре­
акциях. От цианкобаламина кофермент Вп отличается тем, что вместо циана в мо­
лекуле имеется 5'-дезоксиаденозин.
МН2ОССН
МН2ОССН2
СН2С0ГМН2
СН2СН2СОМН
СМ — цианкобаламин
МН2ОССН2
ОН — оксикобаламин
р =<
НоО — аквакобаламин
СН
метилкобаламин
5-дезоксиаденозил —
5-дезоксиаденозилкобаламин
НОСН, О
Рис. 1.24. Строение витамина В 12
В 12 способны синтезировать только некоторые микроорганизмы. Травоядные
животные снабжаются этим витамином за счет микрофлоры пищеварительного
тракта, особенно рубца. Человек также частично получает витамин В 12 за счет
микрофлоры кишечника.
Витамин В 12не содержится в продуктах растительного происхождения и в дрож­
жах. Главным его источником в пище человека являются животные продукты: пе­
чень —■50—160 мкг/100 г, почки — 20-30, рыба — 11, говядина — 2-6, сыр
1- 2 ,
молоко — 0,4 мкг/100 г. Суточная норма потребления витамина В 12 для взрослого
человека составляет 1-3 мкг.
Витамин РР объединяет два вещества, обладающих одинаковой витаминной
активностью: никотиновую кислоту и ее амид (никотинамид). По химическому
строению никотиновая кислота является р-пиридинкарбоновой кислотой, а нико­
тинамид — амидом р-пиридинкарбоновой кислоты (рис. 1.25).
Никотиновая кислота
Никотинамид
Никотиновая кислота представляет собой белое кристаллическое вещество
слабокислого вкуса, хорошо растворимое в воде, нерастворимое в эфире, устой­
чивое к действию химических и физических агентов. Аналогично ведет себя
и амид никотиновой кислоты. Физиологическая роль никотиновой кислоты за­
ключается в том, что в виде амида она входит в состав окислительно-восстано­
вительных ферментов дегидрогеназ, катализирующих отнятие водорода от окис­
ляющихся при этом органических веществ. Затем этот водород данные ферменты
передают окислительно-восстановительным ферментам, в состав которых вхо­
дит рибофлавин.
Некоторое количество никотиновой кислоты синтезируется в организме из
триптофана. Недостаточное потребление витамина РР нарушает синтез и обмен
триптофана, а также нормальное течение синтеза никотиновой кислоты. При глудефиците
- шершавая кожа) — тяжетракта, кожи, центральной
периферической
триптофана, например при преобладании в пище кукурузной муки, белки
триптофаном
распространена в следующих продуктах
вядине — 50-60 мг/100 г, дрожжах — 300-400, пшенице — 45-63, отрубях — 50,
картофеле
суточная норма потребления
на РР для организма взрослого человека — 16-28
является
гетероциклического строения (рис
Гетероциклическая часть молекулы состоит из имидазольного и тиофенового
циклов, а боковая цепь представлена остатком валериановой кислоты. Гетероцикл
рассматривать так же, как теофеновое
вины.
Бесцветные игольчатые кристаллы биотина хорошо растворимы в воде,
хуже — в спиртах и малорастворимы в серном эфире. Биотин устойчив к моле­
кулярному кислороду и серной кислоте, но разрушается под действием перекиси
водорода, бромной воды, соляной и азотной кислот, щелочей.
Бибтин входит в состав ферментов, катализирующих обратимые реакции карбоксилирования-декарбоксилирования, участвует в биосинтезе липидов, амино­
кислот, углеводов, нуклеиновых кислот. Он признан одним из самых активных
витаминов-катализаторов. В белке сырого яйца содержится
авидин — антивитамин биотина, препятствующий его вса­
сыванию в кровь.
для
служит бактериальная микрофлора
тракта. Основные проявления недо(СН2)4С02Н
статка биотина в диете человека
шелушение
Рис. 1.26. Строение
падение волос и поражение ногтей. Пищевые источники
биотина
биотина: печень и почки — 80-140 мкг/100 г, яйца — 28,
С02Н
СН2
И2Ы
гN
N
N
N
СН2
СН2— 1ЧН
(
со— ЫН—сн
со2н
он
Птеридин
кислота
кислота
Рис. 1.27. Строение фолиевой кислоты
овсяная крупа — 20, соя — 60, горох — 20 мкг/100 г. Рекомендуемая суточная
норма потребления для взрослого человека — 1-3 мкг.
Фолацин (фолиевая кислота, тетрагидрофолиевая кислота) включает в по­
строение своей молекулы остатки птеридина, парааминобензойной и глутамино­
вой кислот (рис. 1.27).
Фолацин представляет собой желтый мелкокристаллический порошок без за­
паха и вкуса, на свету разлагается, растворим в воде. Фолацин объединяет обшир­
ную группу соединений, в основе которой лежит птероилглутаминовая кислота.
Также имеются фолиевые кислоты, содержащие несколько (от 3 до 6) остатков
глутаминовой кислоты. Фолиевая кислота метаболически неактивна, но может
превращаться после восстановления птеридинового кольца в 5,6,7,8-тетрагидрофолиевую кислоту, обладающую коферментными свойствами.
Тетрагидрофолиевая кислота в виде кофермента входит в состав ряда фер­
ментов, катализирующих активирование и перенос групп, содержащих один уг­
леродный атом: остатков формальдегида (-СОН), муравьиной кислоты (-СООН),
метальных ( - С Н з ) и оксиметильных (—СНгОН) групп. Эти соединения служат ис­
ходным материалом для биосинтеза пуриновых оснований, некоторых пиримиди­
новых оснований и некоторых аминокислот (серина, гистидина и метионина).
Фолиевая кислота оказывает благоприятное терапевтическое действие при
лечении некоторых тяжелых форм анемии человека, поэтому ее еще называют антианемическим витамином. Основные источники фолиевой кислоты: различные
листовые овощи — 48-110 мкг/100 г, печень — 240, почки — 56, хлеб — 16-27,
творог — 35-40 мкг/100 г. Из всех плодов и овощей наиболее богата земляника
(250-500 мкг/100 г), и, вероятно, этим объясняется известное с давних пор ее бла­
гоприятное действие при малокровии. Рекомендуемая суточная норма потребле­
ния фолиевой киЪлоты для взрослого человека составляет 200 мкг.
Витамин С (аскорбиновая кислота) по своему строению является произ­
водным углеводов (гексоз). Витамин С синтезируется в растениях и существует
в двух формах — собственно аскорбиновой кислоты и легко образующейся из нее
при окислении дегидроаскорбиновой кислоты; последняя при восстановлении
снова дает аскорбиновую кислоту (рис. 1.28).
СН2ОН
он
СН2ОН
-2Н*
Н
♦2Н*
I.-аскорбиновая кислота
Дегидроаскорбиновая кислота
Рис. 1.28. Окислительно-восстановительные превращения витамина С
Аскорбиновая кислота представляет собой бесцветные кристаллики кисло­
го вкуса, хорошо растворяется в воде, легко разрушается в растворах, особенно
в присутствии воздуха, света и следов меди или железа. Аскорбиновая и дегидро­
аскорбиновая кислоты физиологически активны. Взаимопревращения аскорбино­
вой и дегидроаскорбиновой кислот в растительном организме теснейшим образом
ферментативными
осстановленного глютатиона.
В организме человека аскорбиновая кислота принимает участие в синтезе
коллагена соединительной ткани, участвует в обмене тирозина, в образовании
окисленных форм НАД (никотинамидадениндинуклеотид) и НАДФ (никотинамидадениндинуклеотидфосфат). Витамин С предохраняет адреналин от окисления,
участвует в гидроксилировании и окислении кортикостероидов, в обмене холес­
терина, активирует некоторые ферменты (аргиназу, эстеразу, катепсин и др.). Не­
достаточное содержание витамина в пище — причина цинги.
кислоту
плоды
шиповника — 300-20000 мг/100 г, черная смородина — 200-500
50картофель — 20-30 мг/100 г. Рекомендуемая суточная норма потреб
ления для взрослого человека
60-100 мг.
Витаминоподобные вещества. Наряду с витаминами, необходимость которых
активные
щества пищи, которые обладают витаминными свойствами, но отличаются от
дефицит у человека и животных не вызывает специфиче­
ской недостаточности (признаков заболевания), и потому они не являются строго
обязательными пищевыми факторами. Эти вещества называют витаминоподоб­
ными соединениями. К витаминоподобным веществам, встречающимся в расте­
ниях, относят инозит (витамин Нз), парааминобензойную кислоту (витамин Н 1),
липоевую кислоту, биофлавоноиды (витамин Р), метилметионинсульфоний (вита­
мин II), карнитин.
Инозит по химическому строению является шестиатомным циклическим
спиртом циклогексана. Среди ряда изомеров инозита биологической активностью
обладает лишь миоинозит. Он играет важную роль в качестве предшественника
уроновых кислот, входящих в состав клеточной стенки растений. Соединяясь с
шестью молекулами фосфорной кислоты, миоинозит образует инозитфосфорную
кислоту. Инозитфосфорная кислота в виде своей кальций-магниевой соли носит
название фитина. Последний чрезвычайно широко распространен в растениях.
Особенно много фитина содержится в отрубях и хлопчатниковом жмыхе, из кото­
рого фитин получают заводским путем.
В организме животных и человека инозит участвует в обмене фосфолипи­
дов, обладает липотропным действием, принимая участие в регуляции жирового
обмена.
Парааминобензойная кислота входит в состав фолиевой кислоты. Предполо­
жительно парааминобензойная кислота стимулирует синтез фолиевой кислоты,
способствует синтезу пуринов и пиримидинов, следовательно, участвует в син­
тезе нуклеиновых кислот, замедляет окисление адреналина, влияет на функцию
щитовидной железы. Парааминобензойная кислота
ажный фактор роста для
многих микроорганизмов, в том числе и для тех, которые населяют кишечник жи­
вотных и способны к синтезу ряда витаминов, усваиваемых в той или иной мере
организмом хозяина.
Липоевая кислота представляет собой циклический дисульфид. Играет весь­
ма важную роль в обмене веществ животных и микроорганизмов. В частности, она
входит в состав коферментов окислительного декарбоксилирования а-кетокислот
(например пировиноградной и а-кетоглютаровой). Высказываются также сообра­
жения о важной роли липоевой кислоты в процессе фотосинтеза у растений.
Витамин Р (биофлавоноиды) по химической природе не составляет общей
группы соединений, но все биофлавоноиды имеют дифенилпропановый углеродный
скелет и являются преимущественно производными хромона или флавана. Биофла­
воноиды по степени окисленности (или восстановленности) гетероциклического
фрагмента делят на шесть групп: катехины, лейкоантоцианы, флаваноны, антоциа­
ны, флавоны, флавонолы. В растениях флавоноидные соединения, кроме катехинов
и лейкоантоцианов, присутствуют в основном в форме гликозидов. В частности, та­
ким гпикозидом, обладающим Р-витаминной активностью, является рутин.
Биофлавоноиды участвуют в тканевом дыхании, воздействуют на некото­
рые ферменты, эндокринные железы, что, в конечном счете, оказывает влияние
на сосудистую стенку. Действие витамина Р связано с действием витамина С.
В присутствии друг друга усиливают терапевтический эффект. Много витамина Р
в плодах шиповника, черноплодной рябины, черной смородины, брусники и др.
Витамин V (8-метилметионин, противоязвенный фактор) синтезирован
в 1969 г. в виде метилметионинсульфония хлорида, к витаминоподобным вещест­
вам отнесен в связи с положительным его влиянием на рост некоторых микроор­
ганизмов. Суточная потребность в витамине неизвестна, как неизвестны и по­
следствия при его недостаточности. Благоприятный эффект оказывает витамин II
в дозе 200-300 мг/сут. на течение язвенной болезни желудка и двенадцатиперст­
ной кишки, при язвенном колите, гепатите, гастрите.
Глава 2
ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННОЕ
РАСТИТЕЛЬНОЕ СЫРЬЕ
2.1. СОЗДАНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ
ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ РАСТЕНИЙ
В XXI веке мировые продовольственные ресурсы не могут быть увеличены до
необходимых населению земного шара объемов без использования современных
методов биотехнологии, в частности генной инженерии, позволяющей создавать
генетически модифицированные источники пищи (ГМИ). Толчком для создания
генной инженерии как науки послужило открытие американскими учеными струк­
туры ДНК с последующей ее расшифровкой. Возникновение генной инженерии
в 1975 г. и внедрение ее методов в производство считают началом третьего этапа
развития биотехнологии.
Суть генной инженерии в самом широком смысле слова заключается в конс­
труировании организмов с заданными свойствами путем целенаправленных опе­
раций над молекулами или структурами, несущими генетическую информацию.
При этом видовая принадлежность организмов не меняется, но появляются не
свойственные им признаки. Достижения современной науки позволяют осущест­
вить перенос генов любого организма в клетку реципиента для получения расте­
ния, животного или микроорганизма с рекомбинантными генами и, соответствен­
но, новыми свойствами.
Используя классические методы скрещивания, ученые-селекционеры года­
ми добивались положительных результатов с очень низкой, а иногда и случайной
гарантией получения необходимой комбинации генов. При этом не исключалась
возможность передачи с желательными генами нежелательных, что затрудняло от­
деление положительных свойств от вредных. Приоритетность генной инженерии
заключается в быстроте и точности получения желаемых свойств, возможности
прослеживания и контроля генетических изменений и их последствий. Техника
рекомбинантных ДНК (генная инженерия) и ее применение к растениям помогает
преодолеть барьеры межвидового скрещивания, позволяет увеличить генетичес­
кое разнообразие культивируемых растений, создавая растения с новыми свойст­
вами, которые нельзя получить методами классической селекции.
Генетически модифицированные растения становятся более технологичными
и дешевыми и постепенно вытесняют сорта, полученные классической селекци­
ей. За последнее время значительно увеличились площади возделываемых куль­
тур трансгенных растений (сои, рапса, томатов, картофеля и др.), и эта тенденция
прогрессирует как в развитых, так и в развивающихся странах — США, Аргенти­
не, Китае, Канаде, ЮАР, Мексике, странах Европейского союза (ЕС).
В результате трансгенной модификации растения становятся устойчивыми
к гербицидам (средствам защиты растений от сорняков), насекомым, вирусам, при­
обретают новые полезные свойства. Это способствует решению широкого круга
проблем, обеспечивая большую экономическую выгоду: уменьшается количество
применяемых пестицидов, снижается их остаточное содержание в растениях, со­
кращается количество технологических операций при переработке сырья и т. д.
Классификация ГМИ. Термины и определения. Авторам книги представляет­
ся целесообразным все генетически модифицированные растения, используемые
в качестве сырья для пищевой промышленности, распределить на две большие
группы: растения, устойчивые к вредным факторам окружающей среды; растения
с улучшенными потребительскими свойствами (рис. 2.1).
Необходимо отметить, что рынок для продуктов с новыми полезными свой­
ствами (с улучшенными органолептическими показателями, повышенной пище­
вой ценностью, продленным сроком хранения) более значителен, чем рынок про­
дуктов с чисто сельскохозяйственными признаками (устойчивостью к различным
Рис. 2.1. Классификация генетически модифицированных растений
неблагоприятным факторам окружающей среды), хотя именно такие признаки,
как устойчивость к гербицидам и насекомым, обеспечили первый коммерческий
успех.
Для сферы создания генетически модифицированных организмов в настоя­
щее время основополагающими являются следующие термины:
Рекомбинация генов — появление новых сочетаний генов, ведущее к новым
комбинациям признаков у потомства; универсальный механизм, свойственный
всему живому.
)
Рекомбинантные ДНК — молекулы ДНК, полученные вне живой клетки,
в пробирке, путем соединения природных или синтетических фрагментов ДНК
с молекулами, способными реплицироваться (удваиваться) в клетке.
Рекомбинация ДНК т \Нго — метод, заключающийся в выделении ДНК из
разных видов организмов, получении гибридных молекул ДНК и введении реком­
бинантных молекул в живые клетки с целью проявления нового признака, напри­
мер, синтеза специфического белка.
Векторы — автономные молекулы ДНК, используемые в генной инженерии
для переноса генов от организма-донора в организм-реципиент.
Вставка — фрагмент ДНК, который вводится в векторную молекулу.
Геном — совокупность наследственных признаков, локализованных в ядре
клетки, полный набор генов организма.
ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) — единственный тип молекул, спо­
собный к кодированию генетической информации.
Клонирование — многократная репликация (размножение) ДНК.
Кодон (триплет) — последовательность трех нуклеотидов, кодирующая одну
из аминокислот.
Нуклеотид — мономер нуклеиновых кислот (ДНК или РНК).
Плазмида — внехромосомный генетический элемент, способный к длитель­
ному автономному существованию, обычно придающий селективные преиму­
щества клетке хозяина (например устойчивость к антибиотикам).
Промотор — последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК, иницииру­
ющая транскрипцию.
Терминатор — последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК, кодирую­
щая прекращение транскрипции.
Транскрипция — первый этап синтеза белка, когда генетическая информация
«переписывается» с ДНК на матричную РНК (м-РНК).
Трансформация растительных клеток — изменение наследственных свойств
клетки в результате проникновения в нее чужеродной ДНК
Целевой ген — ген, отвечающий за проявление заданного признака модифи­
цируемого организма, например устойчивости растения к гербицидам.
Экспрессия гена — реализация генетической информации, «работа» гена.
Генетически модифицированные организмы (ГМО) — организм или несколь­
ко организмов, любые неклеточные, одноклеточные или многоклеточные образо­
вания, способные к воспроизводству или передаче наследственного генетического
материала, отличные от природных организмов, полученные с применением ме­
тодов генной инженерии и содержащие генно-инженерный материал, в том числе
гены, их фрагменты или комбинацию генов.
Генетически модифицированные источники пищи (трансгенные пищевые
продукты) — используемые человеком в пищу в натуральном или переработан­
ном виде пищевые продукты (компоненты), полученные из генетически модифи­
цированных организмов.
Методы трансформации растительной клетки. Для создание трансгенных ор­
ганизмов генные инженеры прежде всего должны разобраться с «текстом про­
грамм», записанным в хромосомах. Прочитать геном — это только начало работы.
Следующая, наиболее трудная процедура генной инженерии — получение целе­
вых генов. На этом этапе из многих тысяч генов, имеющихся в геноме, нужно вы­
делить единственный конкретный ген, контролирующий развитие того или иного
признака (свойства) или кодирующий вполне определенный белок.
Ген может бьггь выделен из естественных источников (из подходящего гено­
ма), синтезирован химически по имеющейся последовательности нуклеотидов, по­
лучен с помощью ПЦР — полимеразной цепной реакции (см. форзац 1) или путем
копирования ДНК на РНК-матрице с использованием обратной транскриптазы.
Перенос генов в клетки других организмов осуществляется с помощью век­
торов, в качестве которых могут выступать ДНК плазмиды, ДНК вируса или ДНК
фага. В качестве реципиентов, в геном которых встраиваются чужеродные гены,
используют клетки культуры микроорганизмов, клетки млекопитающих, неко­
торых растений, дрозофилы, у растений — протопласты, изолированные клетки
и ткани, микроспоры и т. д. Технология создания генетически модифицирован­
ных растений представлена на рис. 2.2.
Известны многочисленные методы, с помощью которых можно осуществить
трансформацию растительной клетки.
Микроинъекции позволяют осуществить трансформацию растительных кле­
ток с эффективностью 10-20 % независимо от типа вектора. С помощью тон­
ких стеклянных микроигл (диаметром 2 мкм) можно ввести в ядро растительной
клетки векторную ДНК с включенным в нее трансгеном.
Электропорация — метод, основанный на том, что импульсы высокого на­
пряжения обратимо увеличивают проницаемость биомембран. На растительные
протопласты (или животные клетки) и находящуюся в окружающей среде ДНК
действуют высоковольтным импульсом (200-350 В, длительность 54 мс). Через
образующиеся на короткое время поры ДНК проникает в клетку.
Трансфекция.— встраивание чужеродной ДНК в культивируемые эукарио­
тические клетки в результате обработки их изолированной ДНК. Эффективного
поглощения ДНК удалось достичь при добавлении к ней ионов кальция. Предпо­
лагают, что клетки преимущественно поглощают частицы кальциевого преципи­
тата ДНК по механизму фагоцитоза, а затем небольшая часть проникших в клетку
молекул встраивается в хромосомную ДНК.
Рис. 2.2. Создание генетически модифицированных растений
Упаковка в липосомы — один из методов, используемых для защиты транс­
формируемого генетического материала от разрушительного действия нуклеаз,
присутствующих вне клеток. Липосомы — это сферические образования, оболоч­
ки которых состоят из фосфолипидов. Внутри липосом располагается трансфор­
мирующая ДНК. Липосомы захватываются клетками, и ДНК попадает внутрь.
Бомбардирование микрочастицами — один из самых эффективных мето­
дов трансформации однодольных растений. В качестве исходного материала для
трансформации берется суспензионная культура, каллусная ткань или 4-5-дневные культивируемые незрелые зародыши однодольных. Для бомбардирования
используют частицы золота или вольфрама размером 0,6-3 мкм, на которые нано­
сится ДНК вектора, содержащего необходимый для трансформирования трансген.
Этими частицами заряжают «генные пушки», после выстрелов из которых части­
цы, содержащие гены, проникают в клетки и ядра.
Клетки в направлении выстрела чаще всего гибнут, в то время как в зоне 0,61 см от центра находятся наиболее удачно трансформированные клетки. Частицы
могут проникать на глубину 2-3 клеточных слоев. Далее из трансформированных
растительных клеток выращивают и выделяют трансформированные растения, ко­
торые подвергают генетическим исследованиям, биологическому тестированию.
В результате получают генетически модифицированные растения, чьи признаки
или свойства изменились в нужном для человека направлении.
Полученные по данным направлениям генетически модифицированные рас­
тения уже используются при создании пищевых продуктов, за исключением гене­
тически модифицированных злаковых и бобовых растений со сбалансированным
аминокислотным составом, находящихся в стадии разработки.
Первый ГМИ — устойчивый при хранении томат марки Р1ауг 8ауг («Са1§епе
1пс.», США) — появился на продовольственном рынке США в 1994 г. после 10 лет
предварительных испытаний. В последующие годы ГМИ, разрешенных для ис­
пользования в США, Канаде, Японии и странах ЕС, стало значительно больше:
это кукуруза, картофель, соя, тыква, сахарная свекла, папайя и др. В 1999 г. в Рос­
сии была зарегистрирована первая генетически модифицированная соя линии
40-3-2 («Мопзап1о Со», США).
На настоящий момент созданы и разрешены для использования в питании
человека сотни ГМИ, число которых продолжает увеличиваться. Только в США
производится более 150 наименований ГМИ. Наиболее распространена соя, ко­
торая используется при производстве более чем 3000 пищевых продуктов: супов,
детских каш, картофельных чипсов, маргаринов, салатных соусов, рыбных кон­
сервов и многого другого. Выращиваемую в США сою не делят на генетически
измененную и неизмененную: в переработку идет та и другая совместно, поэтому
без специальных исследований трудно сказать, какое сырье было использовано
в производстве продуктов питания.
Из генетически модифицированных составляющих пищи, производимых
в США, можно привести и другие примеры: из В1-хлопка (устойчивого к насе­
комым) изготавливают хлопковое масло, из В1-картофеля — картофель фри, из
томатов медленного созревания — кетчуп, из В1-кукурузы — кукурузный сироп,
из Яг-рапса — рапсовое масло, и т. д.
В странах ЕС также создаются генетически модифицированные растения.
Бельгийской фирмой «Р1ап( СепеПс 8уз1етз» создан устойчивый к гербицидам
рапс. Швейцарскими предпринимателями разработана кукуруза, устойчивая
к инсектицидам. В этом же направлении работает и нидерландская фирма «Ве^р
2ас1еп». В Австралии получен виноград, из которого производят вино с улучшен­
ными органолептическими свойствами. Однако эти продукты используются на
внутренних рынках и не поставляются на мировой рынок, главным образом по
причине определенных требований к маркировке такой продукции.
В области генной инженерии микроорганизмов большая часть исследований
направлена на отбор продуцентов ферментов, витаминов, антибиотиков, орга­
нических кислот и других полезных веществ. Известны полученные с помощью
генетически измененных бактерий ферменты, которые применяют при выпечке
хлеба (мука при этом осветляется, а хлеб становится более пышным). В Германии
получены трансгенные пектиназы для производства соков, причем показано, что
в готовых соках и винах эти пектиназы отсутствуют.
Во многих странах, например, странах ЕС, Австралии, Новой Зеландии и др.,
регистрация продуктов, полученных с помощью таких «нетрадиционных» фер­
ментов, является обязательной.
2.2. ОБЕСПЕЧЕНИЕ БЕЗОПАСНОСТИ
ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ ИЗ ГМИ
Генетический контроль за пищевой продукцией из ГМИ. Широкое исполь­
зование продуктов или компонентов пищи, полученных из ГМИ, требует оценки
их качества и безопасности. Своевременный контроль позволит избежать неже­
лательных эффектов выражения генов: изменения пищевой ценности и техно­
логических параметров, непредсказуемых отдаленных последствий (эмбриотоксическое, гонадотоксическое и тератогенное действия), аллергических реакций,
мутагенности и токсичности.
В настоящее время беспокойство по поводу влияния новых продуктов на здо­
ровье населения в одних странах носит более выраженный характер, чем в других,
что обусловлено спецификой внутренней политики разных государств. В США
для широкого использования разрешена целая группа продуктов. В странах ЕС
существует разрешение на ввоз и продажу только некоторых генетически моди­
фицированных продуктов — соевых бобов, томатов, картофеля и маиса. На на­
стоящий момент в мире не известно ни одного факта отрицательного воздействия
генетически модифицированной пищи на здоровье человека.
Для проведения оценки качества и безопасности продуктов, полученных из
ГМИ, в Институте питания РАМН разработаны соответствующие методические
подходы и медико-биологические критерии оценки их качества и безопасности.
Ключевой момент — детальное изучение химического состава новой пищевой
продукции (как показателей пищевой ценности, так и санитарно-химических по­
казателей безопасности).
’
'
1 ,*
Поскольку продукты, полученные из новых нетрадиционных источников или
с использованием новых технологий, могут содержать неизвестные компоненты,
проводят токсикологические исследования на лабораторных животных, в рацион
которых новый продукт включают в максимально возможном количестве. Изуче­
нию подвергают интегральные показатели состояния животных, биохимические
показатели крови, мочи и внутренних органов, гематологические показатели пе­
риферической крови, проводят морфологические исследования органов, а также
изучают иммунный статус организма.
При необходимости проводят специальные исследования ГМИ, направленные
на изучение его аллергенных свойств, выявление возможных мутагенных и кан­
церогенных эффектов и оценку возможных отдаленных последствий для развития
будущих поколений (эмбриотоксическое, гонадотоксическое и тератогенное дей­
ствия). Завершающий этап — испытания новой продукции на добровольцах.
На основании результатов всех проведенных исследований рассматривается
вопрос о государственной регистрации и разрешении широкого применения ново­
го продукта или компонента пищи.
Во всех странах регистрация ГМИ преследует одну цель — достоверно оце­
нить безопасность и полноценность новых аналогов традиционных продуктов.
Начиная с 1991 г., ученые приступили к разработке специальных рекомендаций
для всесторонней и надежной оценки новой пищи. На первом этапе проводится
анализ композиционной эквивалентности, то есть сравниваются молекулярные
и фенотипические характеристики ГМИ и их традиционных аналогов, определя­
ется содержание ключевых нутриентов, антиалиментарных, токсических веществ
и аллергенов (характерных для данного вида продовольствия или определяемых
свойствами переносимых генов).
Если при изучении композиционной эквивалентности не обнаруживают от­
личий ГМИ от традиционных продуктов, то ГМИ причисляют к первому классу
безопасности, то есть считают его полностью безвредным для здоровья потре­
бителей. При обнаружении каких-либо отличий (второй класс безопасности) или
полного несоответствия (третий класс) сравниваемых продуктов (компонентов)
переходят к следующим этапам оценки, предусматривающим изучение пищевых
и токсикологических характеристик ГМИ.
В настоящее время большинство ГМИ пищи относят ко второму классу безо­
пасности, учитывая присутствие в их составе 1-2 белков, отвечающих за проявле­
ние желаемого признака, что отличает трансгенный продукт от традиционного.
Некоторые исследователи считают, что методика сравнения композицион­
ной эквивалентности и анализируемые характеристики не гарантируют надеж­
ности данных безопасности ГМИ, так как сложно (или даже невозможно) вы­
явить незаданное действие рекомбинантных генов или кодируемых ими белков
лишь аналитическими методами, без специальных лабораторных исследований.
Для оценки безопасности любого нового ГМИ необходимо проведение полного
комплекса исследований, знание которых подтверждено теоретически и экспе­
риментально.
В последние годы особое внимание исследователей привлекает проблема
идентификации ГМИ среди новых продуктов, полученных с использованием ме­
тодов генной биотехнологии.
Что же должен содержать пищевой продукт или компонент, чтобы было ос­
нование причислить его к ГМИ и подвергнуть соответствующим испытаниям на
безопасность? Ряд экспертов предлагают ориентироваться на содержание в новом
продукте рекомбинантной ДНК и (или) детерминированного ею белка. При от­
сутствии ДНК или протеина в силу особенностей композиционного состава либо
3-19739
разрушения этих веществ в технологическом процессе, а также при малых их ко­
личествах в конечном продукте, сравнимых с погрешностью используемых ме­
тодик, предлагается не подвергать ГМИ оценке на безопасность. К таким (не со­
держащим ДНК и белок) продуктам относят пищевые и ароматические добавки,
рафинированные масла, модифицированные крахмалы, мальтодекстрин, сиропы
глюкозы, декстрозы, изоглюкозы и др. Очевидно, что для оценки качества именно
этих продуктов может быть рекомендована методика композиционной эквивалент­
ности.
" '
фтмшруу-.V •
Аналитические и экспериментальные исследования указывают на возможные
нежелательные последствия генно-инженерной биотехнологии: аллергенные, ток­
сические и антиалиментарные проявления, а также влияние на технологические
и внешние потребительские свойства готового продукта на основе ГМИ. Перво­
причина таких последствий — рекомбинантная ДНК и возможность на ее осно­
ве экспрессии новых, не присущих данному виду растениеводческой продукции
белков. Именно новые белки могут самостоятельно проявлять или индуцировать
аллергенные свойства и токсичность ГМИ. Однако подавляющее большинство
новых ГМИ не обладают аллергенностью и токсичностью.
Нежелательным эффектом ГМИ является возможность трансформации пере­
носимого генетического материала. При этом могут отмечаться проявления не­
скольких генетических элементов: генов-промоторов, сигнальных пептидных ге­
нов, структурных генов и терминаторов, которые комплексно используются в ген­
но-инженерной практике.
Нет единого мнения о целесообразности и безопасности применения так
называемых маркерных генов. По замыслу биотехнологов, они необходимы для
точной идентификации переносимого структурного гена и представляют собой
бактериальные гены резистентности к известным антибиотикам (канамицин,
стрептомицин).
. ...а.. . . .
Большинство авторов едины в оценке безопасности маркерных генов для че­
ловека и считают, что их количества, высвобождаемые в желудочно-кишечном
тракте, ничтожно малы (0,33-1 пг) по сравнению с общей массой разнообразных
эукариотических ДНК (200-500 мг) в кишечнике и в силу этого они не способны
отрицательно повлиять на здоровье человека. Установлено, что маркерные гены
не обладают прямой токсичностью, не участвуют в горизонтальном переносе ге­
нетического материала, не оказывают многочисленных побочных эффектов, а ко­
дируемый ими белок не проявляет аллергенных и токсических свойств и не влия­
ет на клеточные обменные процессы.
С 1 июля 1999 г. на территории Российской Федерации введен в действие
особый комплексный порядок оценки и регистрации пищевой продукции, полу­
ченной из ГМИ, предусматривающий обязательную государственную регистра­
цию пищевых продуктов и продовольственного сырья, а также компонентов для
их производства, полученных из ГМИ. Отдельные направления экспертизы ГМИ
пищи распределяются между ведущими научными учреждениями страны.
Медико-биологическое направление закреплено за Институтом питания
РАМН. Проводимые здесь клинические испытания пищевой продукции, получен­
ной из ГМИ. оценивают:
ее химическии состав, показ;
биологическую ценность и ;
животных);
токсикологические характер
вотных — срок не менее 5-6
аллергенные свойства;
мутагенное действие;
иммуномоделирующие свойства.
к *
■генетическая
трансгенной
регуляторных
тей генов, оцениваются эффекты выражения других генов, стабильность ГМИ,
влияние ГМИ на окружающую среду.
Задача технологической экспертизы (проводится Московским государственприкладной
оценить потребительские
свойства (в том числе органолептические), а также функционально-технологические параметры продукции из ГМИ.
Предлагаемая методика комплексной оценки безопасности ГМИ испытана на
генетически модифицированной сое линии 40-3-2 («МопзагПо Со», США).
Объем и программа экспериментов по оценке безопасности ГМИ определя­
ются результатами экспертизы сопроводительных документов, включающих раз­
решение на торговый оборот и использование в питании населения в стране-производителе, официальные данные об отсутствии отрицательного воздействия на
здоровье человека и окружающую среду, результаты исследований химического
состава.
Метод композиционной эквивалентности необходимо использовать в качестве
первого этапа оценки безопасности ГМИ независимо от полученных результатов
включает
в качестве важнейшего анализируемого компонента неспецифические характе­
ристики основных обменных и защитно-адаптационных клеточных механизмов,
а также устанавливает сроки экспериментального наблюдения за животными не
менее 5-6 мес.
В число основных метаболических показателей, требующих обязательного
изучения в рамках гигиенической экспертизы, необходимо включать: активность
ряда ферментов, позволяющих оценить общее органоспецифическое действие
ГМИ; общую и неседиментируемую активность ферментов лизосом, отражаю­
щую состояние структур мембран клетки; активность ферментов микросомального окисления и других ферментов метаболизма ксенобиотиков и антиоксидантной
ферментной системы, определяющих функциональное состояние основных кле­
точных защитно-адаптационных механизмов.
При оценке ГМИ важны параметры, отражающие характер адаптации орга­
низма к внешним условиям. Важность обусловлена высокой неспецифической
чувствительностью анализируемых систем к любому ксенобиотическому воздей­
ствию. При этом индукция ферментов может служить критерием воздействия на
организм средового фактора (его роль в данном случае играет ГМИ). Отсутствие
достоверной динамики изученных систем может рассматриваться как косвенное
подтверждение полной эквивалентности генетически модифицированной пиши
ее традиционному аналогу.
В России вся пищевая продукция, полученная из ГМИ, проходит обязатель­
ную регистрацию и санитарно-эпидемиологическую экспертизу согласно МУК
2.3.2.970-00 «Медико-биологическая оценка пищевой продукции, полученной из
генетически модифицированных источников»; для идентификации ГМИ исполь­
зуется метод ПЦР, позволяющий определить количество ГМИ в пищевом продук­
те, даже если его содержание не превышает 0,9 % (рис. 2.3-2.4).
Метод полимеразной цепной реакции, за разработку которого в 1993 г. была
вручена Нобелевская премия, предложен в 1983 г. Кэри Мюллисом (фирма «СеШз»,
США). В настоящее время ПЦР-технологии широко используются как в научных
исследованиях, так и при проведении лабораторной диагностики в здравоохра­
нении, системах санитарно-эпидемиологического и ветеринарного надзора (гено-
типирование, диагностика инфекционных заболеваний, определение генетически
модифицированных организмов, идентификация видовой принадлежности мяса
и ингредиентов мясных продуктов и т. д.).
В основе метода ПЦР как инструмента лабораторной диагностики лежит об­
наружение небольшого фрагмента ДНК, специфичного для определяемого орга­
низма, с использованием полимеразной цепной реакции для накопления искомого
фрагмента.
Такой подход соответствует современным рекомендациям Всемирной орга­
низации здравоохранения (ВОЗ). В 2003 г. метод ПЦР утвержден и введен в дей­
ствие национальными стандартами России: ГОСТ Р 52173-2003 «Сырье и продук­
ты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников
(ГМИ) растительного происхождения»; ГОСТ Р 52174-2003 «Биологическая безо­
пасность. Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически моди­
фицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением
биологического микрочипа». Методы, приведенные в указанных ГОСТах, позво­
ляют проводить качественный анализ, то есть выявлять присутствие или отсутст­
вие в анализируемых продуктах компонентов из ГМИ.
Третьим нормативным документом, включающим описание методов контро­
ля за содержанием в продуктах компонентов из ГМИ, являются Методические
указания МУК 4.2.1913-04 «Методы количественного определения генетичес­
ки модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения в проОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК В ПИЩЕВОМ ПРОДУКТЕ
(регуляторные последовательности)
Рекомбинантная ДНК
не выявлена
Рекомбинантная ДНК
выявлена
ИДЕНТИФИКАЦИЯ КОНКРЕТНОГО ГМИ ПИЩИ
(трансформационное событие)
Рис. 2.4. Идентификация пищевого продукта, имеющего трансгенные аналоги
(ПЦР-анализ)
дуктах питания». Методы, описанные в МУК 4.2.1913-04, позволяют не только
проводить качественное определение ГМИ, но и при получении положительного
результата определять количество конкретного ГМИ (в процентах), который был
использован при производстве исследуемого продукта.
В настоящее время в мире уже создано и разрешено для реализации более
100 сортов генетически модифицированных сельскохозяйственных культур. Про­
изводимые с их использованием пищевые продукты широко представлены на
мировом продовольственном рынке, и эта положительная тенденция продолжает
увеличиваться, основываясь на фундаментальных и прикладных научных иссле­
дованиях в области биотехнологии и гигиены питания. По результатам комплекс­
ной экспертизы допущены к использованию в качестве продовольственного сырья
следующие генетически модифицированные сельскохозяйственные культуры:
■ соя линии 40-3-2, устойчивая к гербициду «глифосат» (торговое название
«Коипёир»), производства фирмы «МопзаШо Со» (США);
■ картофель сортов «Рассет Бурбанк Ньюлив» и «Супериор Ньюлив», устойчи­
вые к колорадскому жуку, производства фирмы «МопзапЮ Со»;
| кукуруза линии СА 21, устойчивая к гербициду «глифосат», производства
фирмы «Моп$ап1о Со», линии МОК 810, устойчивая к стеблевому мотыльку,
производства фирмы «МопзаШо Со» и др.
В России и странах ЕС введена обязательная маркировка пищевой продукции,
содержащей более 0,9 % компонентов из ГМИ, включая произведенную из ГМИ,
но не содержащую ДНК и белок. Согласно СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические
требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов» для пищевых
продуктов из ГМИ обязательна следующая информация: «генетически модифи­
цированная продукция», или «продукция, полученная из генетически модифици­
рованных источников», или «продукция содержит компоненты из генетически мо­
дифицированных источников» (для пищевых продуктов, содержащих более 0,9 %
компонентов ГМИ), — а также информация о государственной регистрации.
Пищевые продукты, полученные ив ГМИ и не содержащие ДНК и белок, в до­
полнительном этикетировании не нуждаются в случае полной эквивалентности пи­
щевой ценности продукта традиционному аналогу. Перечень трансгенных продук­
тов, подлежащих этикетированию на территории РФ, приведен в приложении 1.
Наряду с медицинскими проблемами, производство ГМИ пищи сопровожда­
ется и другими проблемами, в том числе этическими, которые успешно решаются
в рамках политики здорового питания.
Законодательное регулирование создания и применения ГМИ. Рассматривая
проблему контроля за обеспечением качества и безопасности генетически моди­
фицированной пищи, следует остановиться на формировании законодательных
и нормативных актов.
Вопросы создания, правовой охраны и использования селекционных до­
стижений отражены в Законе РФ «О селекционных достижениях» № 5605-1 от
06.08.1993 (закон действует до 31.12.2007). В целях государственного регули-
рования вопросов, связанных с охраной прав на селекционные достижения, По­
становлением Правительства РФ № 390 от 23.04.1994 образована Государствен­
ная комиссия РФ по испытанию и охране селекционных достижений. Комиссия
осуществляет прием заявок на селекционные достижения, проводит по ним экс­
пертизу и испытания, ведет Государственный реестр охраняемых селекционных
достижений и Государственный реестр селекционных достижений, допущенных
к использованию, а также выдает патенты и авторские свидетельства.
Федеральный закон «О государственном регулировании в области генно-ин­
женерной деятельности» № 86-ФЗ от 05.07.1996 регулирует отношения в сфере
природопользования, охраны окружающей среды и обеспечения экологической
безопасности, возникающие при осуществлении генно-инженерной деятельности.
Одной из основных задач государственного регулирования является определение
механизма, обеспечивающего безопасность граждан и окружающей среды в про­
цессе осуществления генно-инженерной деятельности и использования ее резуль­
татов. Закон обязывает предоставлять полную информацию о методах получения
и свойствах продукта, содержащего результаты генно-инженерной деятельности.
В соответствии со ст. 11 закона «продукция (услуга), полученная с применением
методов генно-инженерной деятельности, должна соответствовать требованиям
экологической безопасности, санитарных норм, фармакопейных статей, обяза­
тельным требованиям государственных стандартов Российской Федерации».
В 1997 г. в России создана Межведомственная комиссия по проблемам генноинженерной деятельности (МВКГИД), которая регулирует вопросы получения,
биологических испытаний, а также полевых испытаний трансгенных растений.
Полный цикл проведения испытаний новых сортов трансгенных сельскохозяйст­
венных культур предусматривает:
■ Контролируемый выпуск, в том числе испытания на безопасность. Данный
этап предусматривает подачу заявки в МВКГИД, проведение экспертизы
и оценку риска в комиссиях по генной инженерии предприятий, проведение
испытаний на опытных участках, сертификацию участков в МВКГИД.
■ Запланированный выпуск, в том числе сортоиспытания. Проводится после
завершения контролируемого выпуска, государственной экологической экс­
пертизы предполагаемых испытаний и временной регистрации трансгенной
культуры в МВКГИД.
■ Широкомасштабный выпуск или коммерческое выращивание трансгенных
культур. Осуществляется после проведения: гигиенической экспертизы и ре­
гистрации пищевой продукции, полученной из ГМИ, в соответствии с поло­
жением, утвержденным постановлением Главного государственного санитар­
ного врача РФ
4 от 08.11.2000, и внесения ее в Государственный реестр за­
регистрированной продукции, который ведется в Минздраве России; экологи­
ческой экспертизы материалов запланированного выпуска Государственным
комитетом по экологии России; экспертизы и положительного заключения
Государственной комиссии по охране и испытаниям селекционных достиже-
ний и внесения в Государственный реестр селекционных достижений, допу­
щенных к использованию в РФ.
■ Повторный (контролируемый, запланированный, широкомасштабный) вы­
пуск — выпуск при наличии выданных ранее соответствующих разрешений
и рекомендаций.
Постановлением Главного государственного санитарного врача РФ «О нанесении
информации на потребительскую упаковку пищевых продуктов, полученных на
основе генетически модифицированных источников» № 13 от 08.11.2000 создана
система проверки безопасности и установлен порядок государственной регистра­
ции пищевой продукции из ГМИ, предусматривающий проведение комплексных
исследований с медико-генетической, медико-биологической и технологической
оценкой. При ввозе из-за рубежа пищевой продукции, полученной из ГМИ, прово­
дится проверка товарно-сопроводительной документации, включая наличие сви­
детельства о государственной регистрации, выданного в установленном порядке
Минздравсоцразвития РФ. При отсутствии этого документа принимается решение
о запрещении ввоза продукции, а при его наличии изучается санитарное состояние
партии продукта и отбираются образцы для лабораторных исследований.
Постановлениями Главного государственного санитарного врача РФ «О по­
рядке проведения санитарно-эпидемиологической экспертизы пищевых продуктов,
полученных из генетически модифицированных источников» № 14 от 08.11.2000
и «О проведении микробиологической и молекулярно-генетической экс­
пертизы генетически модифицированных микроорганизмов, используемых
в производстве пищевых продуктов» № 149 от 16.09.2003 введены положения о
порядке проведения санитарно-эпидемиологической экспертизы пищевых продук­
тов, полученных из ГМО, и санитарно-эпидемиологической, микробиологической
и молекулярно-генетической экспертизы пищевой продукции, полученной с исполь­
зованием генетически модифицированных микроорганизмов. Постановлением № 14
от 08.11.2000 также предусмотрены организация и ведение Реестра Минздрава Рос­
сии, куда заносятся сведения о зарегистрированной пищевой продукции из ГМИ.
К настоящему времени Минздравом России подготовлена необходимая нормативно-методическая база по оценке качества и безопасности для здоровья на­
селения новых видов продовольственного сырья и пищевых продуктов из ГМИ,
а также идентификации специфических белков и ДНК. С этой целью утверждены
Методические указания «Медико-биологическая оценка пищевой продукции, по­
лученной из генетически модифицированных источников» (МУК 2.3.2.970-00).
На основании Постановления Правительства РФ «О государственной регис­
трации новых пищевых продуктов, материалов и изделий» № 988 от 21.12.2000
Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополу­
чия человека осуществляет государственную регистрацию пищевых продуктов,
содержащих ГМИ.
Особое место в рассматриваемой проблеме занимает маркировка генетически
модифицированной продукции. Подходы к данному вопросу Российской Федера­
ции базируются на национальном законодательстве и учитывают нормативную
базу ЕС и других стран. Вопросы маркировки и этикетирования пищевых продук­
тов отражены в ряде законодательных и нормативных актов России.
Федеральный закон «О государственном регулировании в области генно-инже­
нерной деятельности» № 86-ФЗ от 05.07.1996 среди основных принципов генно-ин­
женерной деятельности выделяет сертификацию продукции, которая должна содер­
жать результаты генно-инженерной деятельности, с указанием полной информации
о методах получения и свойствах продукта. Таким образом, с учетом действующего
законодательства в области защиты прав потребителей, впервые введены требова­
ния об обязательности информирования потребителя о методах получения и свой­
ствах пищевых продуктов из генетически модифицированных источников.
В соответствии с постановлением Главного государственного санитарного
врача Российской Федерации «О нанесении информации на потребительскую
упаковку пищевых продуктов, полученных на основе генетически модифици­
рованных источников» № 13 от 08.11.2000, юридическим и физическим лицам,
осуществляющим закупку, поставку, производство и реализацию пищевых про­
дуктов, полученных из ГМИ, рекомендовано обеспечить нанесение необходимой
информации на потребительскую упаковку пищевых продуктов.
Данным постановлением создана система проверки безопасности и установ­
лен порядок государственной регистрации пищевой продукции из ГМИ, преду­
сматривающий проведение комплексных исследований с медико-генетической,
медико-биологической и технологической оценкой. При ввозе из-за рубежа пи­
щевой продукции, полуденной из ГМИ, проводится проверка товарно-сопроводи­
тельной документации, включая наличие свидетельства о государственной регис­
трации, выданного в установленном порядке Минздравсоцразвития РФ. При от­
сутствии этого документа принимается решение о запрещении ввоза продукции,
а при его наличии изучается санитарное состояние партии продукта и отбираются
образцы для лабораторных исследований.
В приложении к СанПиН 2.3.2.1078-01 приведен перечень трансгенных про­
дуктов, разрешенных к применению на территории РФ.
Государственный стандарт РФ «Продукты пищевые. Информация для потре­
бителя. Общие требования» (ГОСТ Р 51074-03) устанавливает общие требования
к маркировке пищевых продуктов, а также отдельных их видов.
В связи с потребностью России в тестировании генетически модифициро­
ванных продуктов необходимо дальнейшее динамическое развитие нормативного
обеспечения в данной области, способного реагировать на меняющуюся ситуа­
цию. Приказом Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потреби­
телей и благополучия человека № 322 от 20.09.2006 создан научно-методический
Центр по изучению и идентификации генно-инженерно-модифицированных ор­
ганизмов на базе Государственного научного центра прикладной микробиологии
и биотехнологии Роспотребнадзора.
Центр создан с целью повышения эффективности надзора за безопасностью
и качеством продукции, полученной с использованием генно-инженерно-модифи­
цированных организмов животного, растительного и микробиологического про­
исхождения. Важнейшие функции Центра — разработка и совершенствование
нормативной и методической базы в сфере контроля за генно-инженерно-моди­
фицированными организмами, ее гармонизация с международными и националь­
ными нормативными документами в области оборота ГМИ; проведение заказных
исследований по выявлению генно-инженерно-модифицированных организмов
и оценке их влияния на организм животного и человека и т. д.
На 01.12.2006 в России прошли полный цикл всех необходимых исследований
и разрешены для использования в пищевой промышленности и реализации насе­
лению: 14 видов пищевой продукции растительного происхождения, полученных
с применением трансгенных технологий (3 сорта сои, 6 сортов кукурузы, 3 сорта
картофеля, 1 сорт сахарной свеклы и 1 сорт риса); 5 видов генетически модифици­
рованных микроорганизмов. Система оценки безопасности пищевых продуктов,
полученных из ГМО, включает проведение пострегистрационного мониторинга
за ее оборотом, для осуществления которого разработаны методы идентификации
ГМО в пищевых продуктах.
В системе Роспотребнадзора в субъектах РФ имеется лабораторная база по
исследованию пищевых продуктов на наличие ГМО. Постановлением Главного
государственного санитарного врача РФ «Об усилении надзора за пищевыми про­
дуктами, полученными из генетически модифицированных источников» № 13 от
31.12.2004 определены головные центры по количественному исследованию пи­
щевых продуктов на наличие ГМО в каждом Федеральном округе России.
Начиная с 2002 г. учреждениями Госсанэпиднадзора (с 2004 г. — Роспотребнадзор) проводится мониторинг за оборотом пищевой продукции, имеющей
генетически модифицированные аналоги. За 9 месяцев 2006 г. учреждениями
Роспотребнадзора на наличие компонентов, полученных с применением ГМО,
исследовано 19795 проб (2005 г. — 18872, 2004 г. — 12956, 2003 г. — 4300) про­
довольственного сырья и пищевых продуктов. Из них компоненты ГМО содер­
жали 1339 проб (2005 г. — 1443, 2004 г.— 1552, 2003 г. — 511), что составило
6,8 % (2005 г. — 7,6 %, 2004 г. — 12 %, 2003 г. — 11,9 %). Наиболее часто ГМО
встречаются в мясных продуктах — 14,4 % (2005 г. — 15,8 %, 2004 г. — 20,5 %,
2003 г. — 14,8 %), птицеводческих продуктах — 6,1 % (2005 г. — 9,1 %, 2004 г. —
15,4 %, 2003 г. — 29,5 %), группе продуктов «прочие» (в основном растительные
белки)^—8,2 % (2005 г. — 10,8 %, 2004 г. — 16,7 %, 2003 г. — 16,4 %).
При осуществлении надзора отмечается, что более 50 % исследованных пи­
щевых продуктов, содержащих ГМО, не имеют информации о наличии в них ком­
понентов, полученных с применением ГМО.
Постановлением Главного государственного санитарного врача РФ «Об усиле­
нии надзора за производством и оборотом пищевых продуктов» № 28 от 29.08.2006
определено, что надзор за продовольственным сырьем и пищевыми продуктами,
оснащение учреждений Роспотребнадзора аналитическим оборудованием в целях
использования современных методов анализа качественного и количественного
состава ГМО является одним из основных направлений деятельности.
С целью усиления госсанэпиднадзора за пищевыми продуктами и в соответ­
ствии с Федеральным законом «О санитарно-эпидемиологическом благополучии
населения» № 52-ФЗ от 30.03.1999 постановлением Главного государственного
санитарного врача РФ «О надзоре за пищевыми продуктами, содержащими ГМО»
№ 32 от 08.12.2006 определено, в частности:
«1. Юридическим лицам и индивидуальным предпринимателям, занимающимся
производством и оборотом пищевых продуктов, соблюдать требования зако­
нодательства Российской Федерации в части информирования населения о на­
личии в продуктах питания компонентов, полученных с применением ГМО.
2. Управлениям Роспотребнадзора по субъектам Российской Федерации и по же­
лезнодорожному транспорту:
2.1. Считать осуществление надзора за пищевыми продуктами, полученными
из ГМО, приоритетным направлением деятельности на 2007 год;
2.2. Пресекать факты нарушения законодательства Российской Федерации,
а также применять предусмотренные законодательством Российской Феде­
рации меры ограничительного, предупредительного и профилактического
характера, направленные на недопущение и (или) ликвидацию последствий
нарушений юридическими лицами и индивидуальными предпринимателя­
ми обязательных требований по информированию населения о наличии
в продуктах питания компонентов, полученных с применением ГМО;
2.3. Усилить надзор за ввозом на территорию Российской Федерации пищевых
продуктов, содержащих компоненты, полученные с применением ГМО;
2.4. Проводить разъяснительную работу среди населения, в том числе через
средства массовой информации, по вопросам безопасности пищевых про­
дуктов, полученных из ГМО, и прав потребителей на получение полной
и достоверной информации о технологии изготовления указанных пище­
вых продуктов.
3. Федеральному агентству по печати и массовым коммуникациям рекомендовать
оказывать содействие органам Роспотребнадзора в информировании населения
через средства массовой информации о безопасности пищевых продуктов, по­
лученных из ГМО, и прав потребителей на получение полной и достоверной
информации о технологии изготовления указанных пищевых продуктов.
4. ФГУЗ «Центры гигиены и эпидемиологии» в субъектах Российской Феде­
рации:
4.1. Принять меры по дооснащению лабораторных подразделений аналитичес­
ким оборудованием по исследованию количественного состава ГМО».
Таким образом, в России в настоящее время сформирована достаточная законо­
дательная база, на основе которой разработана и осуществляется система госу­
дарственного санитарно-эпидемиологического надзора за пищевыми продуктами
из ГМИ.
Часть II
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ
ПЕРЕРАБОТКИ РАСТИТЕЛЬНОГО
СЫРЬЯ
Биоконверсия с использованием ферментов
Ш
Микробная биоконверсия
Биоконверсия (от лат. сопуегзю — превращение) означает преобразование, транс­
формацию одних органических соединений в другие при помощи культур микро­
организмов, а также выделенных ферментов; один из важнейших биотехнологи­
ческих процессов переработки растительного сырья в корма и пищевые продук­
ты. Технологическое преимущество биоконверсии по сравнению с процессами
химических превращений веществ состоит в том, что необходимые катализаторы
синтезируются культурой микроорганизма либо используются выделенные фер­
менты и конверсия может быть осуществлена в одну стадию. Кроме того, фермен­
тативные процессы в живых системах энергетически более выгодны, чем хими­
ческие превращения веществ.
Существует множество процессов биопревращений растительного сырья,
в том числе гидролиз высокомолекулярных веществ и биополимеров, трансфор­
мация микроорганизмами органических субстратов в белковые продукты, деток­
сикация сырья и кормов, биологическая очистка сточных вод и др.
Ферментные препараты, как правило, используют в основном для биоконвер­
сии растительного сырья, на начальной, наиболее трудоемкой стадии его пере­
работки, когда необходимо расщепить структурные или запасные компоненты,
а также на заключительных стадиях переработки растительных субстратов —
с целью сохранения качества пищевых продуктов или улучшения органолепти­
ческих свойств. Биоконверсия с использованием микроорганизмов применяется
в основном для переработки растительного сырья в белковые продукты, корма
повышенной усвояемости, для получения растительных белковых гидролизатов
и пр. В основе микробной биоконверсии — процесс культивирования микроор­
ганизмов.
\
Глава 3
БИОКОНВЕРСИЯ
С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФЕРМЕНТОВ
3.1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И КЛАССИФИКАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ
Строение и принцип действия ферментов. Ферменты (энзимы) — высокоспециализировадшый класс белковых веществ, способных катализировать химические
реакции в живых организмах. Первые представления о ферментах были получены
при изучении брожения (лат. Гегтепйит — закваска, перебродивший сахар). На­
учное описание действия ферментов было дано русским ученым К. Кирхгофом,
которому удалось в 1814 г. выделить фермент амилазу из солодовой вытяжки
и осуществить ферментативный гидролиз крахмала. В настоящее время фермен­
ты широко применяются в различных областях науки и промышленности. Многие
отрасли пищевой и перерабатывающей промышленности основаны на использо­
вании различных ферментативных процессов.
Вопрос о белковой природе ферментов был окончательно решен после того,
как они были получены в кристаллическом виде. В 1926 г. американский биохи­
мик Дж. Б. Самнер получил в кристаллическом виде фермент — уреазу. В 1930 г.
другой биохимик — Дж. Г. Нортроп — выделил в кристаллическом состоянии
пепсин, а в 1931 г. — трипсин и доказал их биологическую природу.
Ферменты, как и белки, можно разделить на простые (однокомпонентные)
и сложные (двухкомпонентные). Установлено, что большинство гидролитичес­
ких ферментов относится к простым. Ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные процессы (оксидоредуктазы), синтез веществ (лигазы),
а также реакции переноса групп (трансферазы), обычно принадлежат к сложным
ферментам.
В состав двухкомпонентных ферментов входит простой белок и вещества не­
белковой природы. В качестве этих веществ могут выступать ионы металлов или
различные, сложные органические соединения. Фермент, состоящий из неактив­
ной белковой части (апофермента) и активирующей ее небелковой группы (кофак­
тора), называют холоферментом.
В зависимости от прочности связи кофактора с апоферментом кофакторы бы­
вают двух видов: простетическая группа — добавочная группа, прочно связанная
кофермент
отделяемый от
ферментов
стоятельному существованию. Примером простетической группы может служить
гемогруппа цитохрома С, ковалентно связанная с его полипептидной частью.
Роль коферментов играют большинство витаминов (В|, В2, В3, В5, Вп, Н и др.) или
соединения, построенные с участием витаминов (КоА, А, НАД, НАДФ, ФМН,
ФАД).
ферментов
ферментативную
I ферментов
ферментов
структуры
(папаин, а-амилаза ВасШш зиЫШз).
молекулы
онноспособными. Скорость химической реакции зависит от числа столкновений
активных молекул реагирующих
молекул
л запасом потенциальной энергии. Запас энергии необходим для
отталкивания между реагирующими молекулами — для преодоского барьера. Реакция произойдет только в том случае, если зафующих молекул будет достаточным для преодоления энергетического барьера.
х веществ недостаточен для преодоления
1мо активировать молекулы, то есть сообэнергии. Эта дополнительная энергия, не1 кции, называется энергией активации. Она
ического барьера. Для того чтобы повысить
скорость химической реакции, необходи­
Н
Е
мо понизить энергию активации (снизить
энергетический барьер). Это достигается
добавлением к реагирующей смеси ката­
лизаторов (рис. 3.1).
Снижение энергии активации реагиру­
ющих веществ в присутствии катализато­
ров осуществляется за счет того, что ката­
лизатор сам вступает в реакцию с исходным
веществом, образуя с ним промежуточный
продукт, который, проходя несколько эта­
Без участия фермента
При участии фермента
пов, распадается с образованием конечно­
го
продукта
и
первоначального
катализато­
Рис. 3.1. Энергия активации
ра.
Эти
промежуточные
реакции
требуют
химической реакции:
гораздо
меньше
энергии
активации,
чем
Н, Н'— энергетический барьер,
реакция, идущая без катализаторов.
Еа, Еа' — энергия активации
К *
Теория катализа, впервые выдвинутая М. В. Ненцким (1898 г.), а затем разви­
тая и обоснованная Л. Михаэлисом и М. Ментен (1913 г.), в полной мере приемле­
ма и для ферментативного катализа. Согласно этой теории, фермент (Е) реагирует
сначала с субстратом (8) — веществом, на которое действует фермент, в резуль­
тате чего образуется фермент-субстратный комплекс (Е8). Образующийся фермент-субстратный комплекс (Е8), до того как произойдет его распад на продукты
и фермент, превращается в нестабильный переходный комплекс (Е81), в котором
субстрат под действием присоединившегося к нему фермента становится более
доступным для соответствующей химической реакции в результате глубокой де­
формации разрываемой связи.
Суммируя сказанное, можно представить последовательность ферментатив­
ных реакций следующим образом:
8 + Е Г-К-1—>Е8 <"К? >Е8*----- »Е + Р, или 8 + Е < = ± Е 8< = = > Е + Р,
К2
где К], Кг, Кз — константы скоростей реакции.
В основе теории Михаэлиса —Ментен лежит представление о том, что кон­
станта скорости распада фермент-субстратного комплекса на фермент и продукт
реакции определяет скорость всех реакций. Поэтому общая скорость реакции рав­
на произведению этой константы на концентрацию фермент-субстратного комп­
лекса (V = Кз • [Е8]). Скорость реакции зависит от концентрации субстрата и про­
порциональна ей. С повышением концентрации субстрата пропорциональность
нарушается и скорость реакции перестает зависеть от концентрации субстрата,
а зависит только от концентрации фермента.
При взаимодействии фермента и субстрата было обращено внимание на то,
что молекула фермента по размеру во много раз больше молекулы субстрата. Это
дало основание полагать, что субстрат взаимодействует не со всей молекулой
фермента, а с каким-то небольшим участком, расположенным на его поверхнос­
ти. На поверхности белковой части фермента имеются активный, субстратный
и аллостерический центры. Под активным центром фермента подразумевают оп­
ределенный участок белковой части фермента, в котором остатки аминокислот
расположены в определенной комбинации.
Чаще всего активный центр состоит из ряда функциональных групп амино­
кислот, определенным образом ориентированных в пространстве. Например, ОНгруппы аминокислоты серина, 8Н-группы цистеина, остатки гистидина, тирозина
и др. У двухкомпонентных ферментов в состав активного центра входят и некото­
рые группировки небелковой части. Активный центр формируется на уровне тре­
тичной структуры белковой молекулы, что приводит к пространственному совме­
щению функциональных групп, необходимых для ферментативной реакции.
Субстратный центр — это участок молекулы фермента, ответственный за
присоединение субстрата, подвергающегося ферментативному превращению.
Присоединение субстрата к субстратному центру осуществляется также за счет
взаимодействия с остатками аминокислот. Этот центр называют также якорным.
Природа субстратного (якорного) центра у различных ферментов различна. В не­
которых ферментах субстратный центр может совпадать с активным центром.
Аллостерический центр — это участок молекулы фермента, находящийся на
поверхности белковой части и пространственно удаленный от активного центра,
присоединение к которому определенного низкомолекулярного вещества вызывает
изменение третичной структуры белковой части. Последнее, в свою очередь, ведет
к изменению конфигурации активного центра, сопровождающемуся увеличением
или уменьшением каталитической активности фермента. Это явление лежит в ос­
нове так называемой аллостерической регуляции ферментативной активности.
В каталитическом акте принимает участие по существу вся молекула фермен­
та при упорядоченном взаимодействии его субстратного, активного и аплостерического центров, что обеспечивает кооперативное осуществление многостадий­
ных процессов ферментативного катализа.
Основные свойства ферментов заключаются в их высокой каталитической ак­
тивности, специфичности, лабильности и обратимости действия. Ферменты про­
являют высокую активность (активность — это количество молей субстрата, пре­
вращаемое в продукт реакции одним молем фермента за I мин при оптимальных
значениях рН и температуры), катализируя превращения субстратов при очень ма­
лых концентрациях.
Для ферментов характерна лабильность — способность менять свою актив­
ность в зависимости от внешних факторов (температуры, рН среды, присутствия
в среде ряда химических соединений и др.).
Являясь белками, ферменты чувствительны к изменению действия темпера­
туры. Они легко инактивируются (теряют ферментативную активность) при на­
гревании в связи с начинающейся денатурацией белка. Температурный оптимум
для большинства ферментов — 37-40 °С. При нагревании выше 50-60 °С катали­
тическая активность многих ферментов снижается, выше 80 °С — большинство
ферментов инактивируется, а при 100 °С — инактивируются практически все
ферменты. Снижение температуры от оптимума ведет к обратимому снижению
активности ферментов вследствие замедления движения, а, следовательно, сни­
жения возможности столкновения молекул фермента и субстрата.
Каждый фермент наибольшую активность проявляет при определенном оп­
тимальном значении рН. Большинство ферментов имеет максимальную актив­
ность в зоне рН вблизи нейтральной точки, соответствующей изоэлектрической
точке фермента. В резко кислой или резко щелочной среде хорошо работают лишь
некоторые ферменты (оптимум рН для пепсина — 1,5-2, аргиназы — 9,5-9,9).
Ферменты, как и все белки, являются амфотерными соединениями, в молекуле ко­
торых содержится большое количество ионизирующихся групп. При изменении
рН среды от оптимума в щелочную или кислую стороны, меняется степень иони­
зации активного центра и как следствие снижается активность фермента.
На активность ферментов также влияет присутствие в растворе ряда хими­
ческих соединений, так называемых активаторов и ингибиторов. К числу акта-
ваторов относятся ионы магния, марганца, калия, цинка, молибдена и др. Ионы
хлора, например, активируют амилазу слюны и амилазу поджелудочной железы,
ионы водорода — пепсин, ионы цинка — карбангидразу. Желчные кислоты ак­
тивируют липазу. Многие ферменты активируются незначительным количеством
сульфгидрильных соединений, к которым относятся аминокислота цистеин и трипептид глютатион.
Многие простые химические соединения активируют ферменты по типу
аллостерической регуляции, то есть присоединяются к аллостерическому цент­
ру и изменяют конформацию молекулы фермента таким образом, что активный
центр приобретает наиболее выгодную структуру для соединения с субстратом.
Ферменты легко ингибируются различными ферментными ядами. Ингибиро­
вание ферментов может быть обратимым и необратимым. В случае необратимого
ингибирования происходит полное изменение структуры фермента. Необратимое
ингибирование можно вызвать белковыми осадителями (трихлоруксусной кисло­
той, солями свинца, ртути и др.). Кинетический анализ позволяет различать в чис­
ле обратимого ингибирования конкурентное и неконкурентное ингибирование.
При конкурентном ингибировании ингибитор, обладая химической структурой,
очень близкой к субстрату, может соединяться с ферментом, подменяя субстрат.
Конкурентные ингибиторы связаны обратимо с ферментом. Увеличив концентра­
цию субстрата, можно ослабить действие ингибитора.
Неконкурентное ингибирование ферментов бывает двух типов. Первое обу­
словлено взаимодействием ингибитора с белковой частью фермента (исключая
группы активного центра), второе — с простетической группой. К первому типу
неконкурентного торможения активности ферментов относится аллостерическое
торможение. При аллостерическом торможении ингибитор присоединяется к ал­
лостерическому центру и вызывает нарушение конформации активного центра,
в результате чего субстрат не может вступить в контакт с ферментом. Специфи­
ческие ингибиторы простетических групп окислительных ферментов — синиль­
ная кислота (НСЙ) и оксись углерода (СО).
Ферментативному катализу свойственна обратимость действия, то есть один
и тот же фермент в одних условиях способен ускорять реакцию синтеза, в дру­
гих — распада. Например, липаза в присутствии воды осуществляет гидролиз жи­
ров, а в отсутствии воды — их синтез.
К числу весьма характерных свойств ферментов относят их специфичность
действия. Специфичность заключается в том, что каждый фермент может катали­
зировать одну или несколько близких по природе химических реакций. Различают
абсолютную и групповую специфичность.
При абсолютной специфичности фермент катализирует превращение только
одного определенного вида субстрата, то есть действие фермента связано с хими­
ческой природой субстрата. Например, фермент уреаза ускоряет гидролитическое
расщепление мочевины на углекислый газ и аммиак, но совершенно не действует
на метилмочевину. Разновидностью абсолютной специфичности является стереохимическая специфичность.
Ферменты, отличающиеся стереохимической специфичностью, действуют
только на один изомер субстрата (О- или Ь-форму). К ферментам с групповой
специфичностью относят ферменты, субстратами для которых являются несколь­
ко химических соединений, построенных по одному типу, действие таких фер­
ментов адаптировано к типу химической реакции. Например, все дегидрогеназы
катализируют одну и ту же реакцию отщепления водорода, но в зависимости от
субстрата проявляется специфичность действия отдельных дегидрогеназ (лактатдегидрогеназа, малатдегидрогеназа, алкагольдегидрогеназа и т. д.).
Также к ферментам с групповой специфичностью относят ферменты, расщеп­
ляющие связи, с помощью которых соединены отдельные части молекулы (эфир­
ные, гликозидные и др.). Химическая структура субстрата для этих ферментов
роли не играет.
Международная классификация и номенклатура ферментов. Ферментология
очень долго не располагала строго научной номенклатурой ферментов. Наимено­
вания ферментам давали по случайным признакам (тривиальная номенклатура),
по названию субстрата (рациональная), по химическому составу фермента, нако­
нец, по типу катализируемой реакции и характеру субстрата.
Необходимость систематики номенклатуры диктовалась прежде всего стре­
мительным ростом числа вновь открываемых ферментов, которым разные ис­
следователи присваивали названия по своему усмотрению. Одному и тому же
ферменту часто давали два или несколько названий, что вносило путаницу в но­
менклатуру.
До 1961 г. не было и единой классификации ферментов. Трудности заключа­
лись в том, что разные исследователи за основу классификации ферментов брали
различные принципы. Современные классификация и номенклатура ферментов
были разработаны Комиссией по ферментам Международного биохимического
союза и утверждены на V Международном биохимическом конгрессе в 1961 г.
в Москве.
Комиссией были рассмотрены три принципа, которые могли служить основой
для классификации ферментов и их обозначения. Первый принцип — химическая
природа фермента, то есть принадлежность к флавопротеинам, пиридоксальфосфатпротеинам, гемопротеинам, металлопротеинам и т. д. Однако этот принцип не
мог служить общей основой для классификации, так как только для небольшого
числа ферментов известны простетические группы, доступные для идентифика­
ции и прямого определения.
Второй принцип — химическая природа субстрата, на который действует
фермент. По этому принципу трудно классифицировать фермент, так как в каче­
стве субстрата могут служить разнообразные соединения внутри определенного
класса веществ (белки, углеводы, липиды, нуклеиновые кислоты) и бесчисленное
множество промежуточных продуктов обмена. В основу принятой классифика­
ции положен третий принцип — тип катализируемой реакции, который является
специфичным для действия любого фермента. Этот принцип логично использо­
вать в качестве основы для классификации и номенклатуры ферментов.
Таким образом, тип катализируемой химической реакции в сочетании с на­
званием субстрата (субстратов) служит основой для систематизации ферментов
по шести главным классам, в каждом из которых выделяют несколько подклассов
(см. форзац 2, слева).
Класс оксидоредуктаз включает ферменты, катализирующие с участием двух
субстратов окислительно-восстановительные реакции, лежащие в основе биоло­
гического окисления. Систематические названия их составляют по форме «донор:
акцептор оксидоредуктаза». Например, лактат: НАД+ оксидоредуктаза для лактатдегидрогеназы. Различают следующие основные оксидоредуктазы: аэробные
дегидрогеназы или оксидазы, катализирующие перенос протонов (электронов)
непосредственно на кислород; анаэробные дегидрогеназы, ускоряющие перенос
протонов (электронов) на промежуточный субстрат, но не на кислород; цитохромы, катализирующие перенос только электронов. К этому классу относят так­
же гемсодержащие ферменты каталазу и пероксидазу, катализирующие реакции
с участием перекиси водорода.
Класс трансфераз охватывает ферменты, катализирующие реакции межмолек^тярного переноса различных атомов, групп атомов и радикалов. Наименова­
ние их составляется по форме «донор: транспортируемая группа-трансфераза».
Различают трансферазы, катализирующие перенос одноуглеродных остатков,
ацильных, гликозильных, альдегидных или кетонных, нуклеотидных остатков,
азотистых групп, остатков фосфорной и серной кислот и др. Например: метили формилтрансферазы, ацетилтрансферазы, аминотрансферазы, фосфотрансферазы и др.
Класс гидролаз объединяет большую группу ферментов, катализирующих
расщепление внутримолекулярных связей органических веществ при участии
молекулы воды. Наименование их составляют по форме «субстрат-гидролаза».
К ним относятся: эстеразы -— ферменты, катализирующие реакции гидролиза
и синтеза сложных эфиров; гликозидазы, ускоряющие разрыв гликозидных свя­
зей; фосфатазы и пептидгидролазы, катализирующие гидролиз фосфоангидридных и пептидных связей; амидазы, ускоряющие разрыв амидных связей, отлич­
ных от пептидных, и др.
Класс лиаз — ферменты, катализирующие разрыв связей С-О, С-С, С—
N
и др., а также обратимые реакции отщепления различных групп от субстратов
негидролитическим путем. Эти реакции сопровождаются образованием двойной
связи или присоединением групп к месту разрыва двойной связи. Ферменты обоз­
начают термином «субстрат-лиазы». Например, фумаратгидратаза (систематичес­
кое название «Ь-малатгидролаза») катализирует обратимое отщепление молекулы
воды от яблочной кислоты с образованием фумаровой кислоты. В эту же группу
входят декарбоксилазы (карбоксилиазы), амидинлиазы и др.
К классу изамераз относят ферменты, катализирующие взаимопревращения
оптических и геометрических изомеров. Систематическое название их составля-
ют с учетом типа реакции: «субстрат - цис-транс-изомераза». Если изомеризация
включает внутримолекулярный перенос группы, фермент получает название «мутаза». К этому же классу относят рацемазы и эпимеразы, действующие на аминои оксикислоты, углеводы и их производные; внутримолекулярные оксидоредуктазы, катализирующие взаимопревращения альдоз и кетоз; внутримолекулярные
трансферазы, переносящие ацильные, фосфорильные и другие группы, и т. д.
Класс лигазы (синтетазы) охватывает ферменты, катализирующие синтез ор­
ганических веществ из двух исходных молекул с использованием энергии распада
АТФ (или другого нуклеозидтрифосфата). Систематическое название их составля­
ют по форме «X : V лигаза», где X и V обозначают исходные вещества. В качестве
примера можно назвать Ь-глутамат: аммиак-лигазу (рекомендуемое сокращенное
название «глутаминсинтетаза»), при участии которой из глутаминовой кислоты
и аммиака в присутствии АТФ синтезируется глутамин.
Для стандартизации исследований особое значение имеет то, что согласно
принятой международной системе всем ферментам присвоен индивидуальный
классификационный номер (шифр). Каждый классификационный номер содержит
сокращение «КФ» (классификация ферментов) и последовательность из четырех
чисел, разделенных точкой, и составляется по определенному принципу. Каждое
последующее число представляет собой все более и более уточняющую класси­
фикацию фермента (класс, подкласс, подподкласс, порядковый номер в подподклассе).
Например, шифр уреазы — КФ 3.5.1.5. Это означает, что уреаза относится
к 3-му классу (первая цифра) ферментов, все представители которого катализиру­
ют реакции гидролиза. Вторая цифра (5) говорит о том, что уреаза принадлежит
к 5-му подклассу этого класса, куда зачислены все ферменты, ускоряющие гидро­
лиз С-Ы-связей, не являющихся пептидными. Третья цифра шифра (1) указывает
на принадлежность уреазы к 1-му подподклассу 5-го подкласса, члены которого
ускоряют гидролиз линейных амидов, а последняя цифра (5) — порядковый номер уреазы в этом подподклассе.
Так как база данных постоянно обновляется, коды ферментов могут меняться
и некоторые коды могут оставаться незаполненными.
3.2. ФЕРМЕНТАТИВНАЯ ПЕРЕРАБОТКА РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ
3.2.1. Ферменты, трансформирующие органическое сырье
При производстве пищевых продуктов и кормов используются различные виды
биологического сырья, что предопределяет важную роль ферментов в процессах
заготовки, хранения сырья и его переработки.
Ферменты, участвующие в трансформации органического сырья, можно ус­
ловно разделить на четыре группы:
■ ферменты, содержащиеся в сырье;
■ ферменты сопутствующей микрофлоры сырья;
■ ферментные системы культурных штаммов микроорганизмов — возбудите­
лей брожения, продуцентов органических кислот, аминокислот, витаминов,
ферментов, пищевого белка и пр.;
■ ферментные препараты (растительного, микробного и животного происхож­
дения).
Из группы ферментов, содержащихся в сырье, наиболее важными являются гид­
ролитические и окислительно-восстановительные ферменты. Гидролитические
ферменты — определяющие в начальной стадии производства продуктов глубо­
кой биоконверсии, таких как спирт, пиво, вино, различные виды продуктов микро­
биологического синтеза. При недостаточной активности гидролаз сырья применя­
ют обработку ферментными препаратами.
При заготовке и хранении сырья ферментативные процессы, как правило, яв­
ляются отрицательным фактором. Технологические приемы заготовки и хранения
пищевого сырья, а также многих видов кормов, направлены на ограничение ак­
тивности ферментов, прежде всего гидролитических и окислительно-восстано­
вительных, действие которых приводит к снижению качества большинства видов
растительного и животного сырья. Хорошо известна отрицательная роль оксидор<дуктаз при переработке свежего растительного сырья.
На качество сырья и продуктов переработки влияют ферменты сопутствую­
щей микрофлоры сырья, многие виды которой обладают высокой активностью
гидролитических ферментов. Такие виды вызывают быструю порчу сырья, а по­
лучаемые из поврежденного сырья продукты имеют низкое качество.
Ферментные системы окультуренных штаммов микроорганизмов с давних
времен используются в производстве разнообразных продуктов брожения, сыров,
хлеба, ферментированных соусов и др. Методы микробиологии и селекции повы­
сили ферментативную активность промышленных микроорганизмов. Разработка
способов иммобилизации микробных клеток существенно увеличила операцион­
ную стабильность ферментных систем, и расширила возможности их технологи­
ческого использования. Однако основной признак (условие функционирования)
ферментов этой группы остался неизменным — строгая локализация внутри кле­
ток. Поэтому такие ферментные системы не выделяют из клеток, а используют
клетки как носители ферментных систем.
Ферментные препараты, так же как и ферментные системы культурных штам­
мов микроорганизмов, введены в переработку органического сырья в результате
длительной практической деятельности человечества. Эту группу ферментов по­
лучают в виде препаратов, активная часть которых может быть растворимой или
находиться в связанной (иммобилизованной) форме. Используются также инди­
видуальные ферменты, локализованные в клетках. От ферментных систем куль­
турных штаммов микроорганизмов они отличаются тем, что не входят в системы
синтеза метаболитов и внутриклеточная локализация не является непременным
условием их функционирования.
3.2.2. Гидролитические процессы
Общая характеристика гидролитических ферментов. Гидролитические фер­
менты — важнейший класс ферментов, используемых при переработке органи­
ческого сырья. Основной продукцией ферментной промышленности являются
препараты гидролаз, таких как целлюлаза, амилаза, протеаза, пектиназа.
Гидролитические ферменты используются преимущественно в начальной,
наиболее трудоемкой стадии переработки органического сырья, когда необходи­
мо расщепить структурные или запасные полимеры, фрагменты которых далее
подвергаются трансформации под действием ферментов других классов. Такие
задачи решаются в технологии продуктов брожения, при получении сахаристых
продуктов из крахмала, различных видов кормов и пищевого белка. В ряде техно­
логий гидролазы применяют для расщепления относительно небольших молекул,
как это имеет место при инверсии сахарного сиропа, гидролизе лактозы, перера­
ботке жиров.
| »
■
■ V ЧК 1 ,
.
Практическая полезность гидролаз привлекла к ним внимание исследова­
телей, и класс гидролаз является наиболее изученным классом ферментов. Про­
мышленный выпуск ферментов начался во Франции в 1917 г. с производства бак­
териальной а-амилазы — одного из наиболее востребованных гидролитических
ферментов.
Субстраты гидролитических ферментов — полисахариды, белки, липиды,
нуклеиновые кислоты и другие природные соединения, содержащие «ангидрид­
ные» связи, составляют основную массу органической материи на планете. Гид­
ролиз — необходимая стадия круговорота этих соединений в природе. Поэтому
гидролитические реакции, как химические, так и ферментативные, происходят
в больших масштабах в естественных условиях. Они имеют первостепенное зна­
чение и в решении многих прикладных задач. Реакция гидролиза протекает по
следующему уравнению:
КК, + Н - ОН
КН + К.,ОН
В процессе ферментативного гидролиза происходит образование ферментсубстратного комплекса, который претерпевает внутримолекулярную перегруп­
пировку под влиянием активного центра фермента. Катализированный разрыв
ангидридной связи субстрата приводит к выделению из фермент-субстратного
комплекса одного из продуктов реакции. Второй продукт выделяется после пере­
группировок, связанных с присоединением молекулы воды.
Класс гидролаз — третий класс в номенклатуре ферментов (см. форзац 2,
слева) — включает 11 подклассов. Ферменты подкласса 3.1 расщепляют сложно­
эфирные связи; 3.2 — гликозидные связи; 3.3 — эфирные связи; 3.4 — пептидные
связи; 3.5 — связи С-К, отличные от пептидных; 3.6 — кислотно-ангидридные
связи; 3.7 — связи С-С; 3.8 — галоидалкильные связи; 3.9 — связи Р—М; 3.10 —
связи 5-Ы; 3.11 — связи С-Р. Наибольшее применение в процессах промышлен­
ного биокатализа нашли гидролазы подклассов 3.1, 3.2 и 3.4.
Эстеразам (КФ 3.1) присуща относительная групповая субстратная специфич­
ность, то есть способность гидролизовать сложноэфирные связи между радикала­
ми различного типа. Эстеразы расщепляют моно-, ди-, триглицеролы и другие
соединения, содержащие сложноэфирную связь. Скорость расщепления зависит
от структуры субстрата.
Липазы (КФ 3.1.1.3) при действии на триацилглицеролы проявляют позици­
онную специфичность. Большинство известных липаз предпочтительно гидроли­
зует сложноэфирную связь при С 1 и Сз глицерола. Липазы проявляют также изби­
рательность в отношении длины цепи отщепляемых жирнокислотных остатков.
Гликозидазы (КФ 3.2.1) стереоспецифичны. Они гидролизуют гликозидные
связи определенной пространственной конфигурации (а или Р), но не обеих од­
новременно. Примерами могут служить а-амилаза, а-гликозидаза, глюкоамилаза,
гидролизующие исключительно а-гликозидные связи, и Р-глюканаза, целлобиаза,
лизоцим, гидролизующие р-связи.
Менее строгая избирательность проявляется к различным видам а- или Р-гликозидных связей. Так, глюкоамилаза расщепляет а -1,4 и а-1,6-связи; глюканаза бацилл — Р-1,3 и Р-1,4-связи; дрожжевая автолитическая глюканаза — Р*1,3
и Р-1,6-связи. Кислая а-глюкозидаза из селезенки свиньи гидролизует а-1,2; а-1,3;
» 1 ,4 и а-1,6-гликозидные связи. Среди гидролизуемых связей различают «свои»
и «чужие», гидролизуемые с большей или меньшей скоростью.
Гликозидазы специфичны в отношении длины цепи гидролизуемых полимер­
ных субстратов. Так, глюкоамилаза плесневых грибов предпочтительно гидро­
лизует высокомолекулярные полимеры а -1,4-связанной глюкозы, а аналогичный
фермент — а-глюкозидаза дрожжей катализирует гидролиз той же связи в олиго­
сахаридах, но не в крахмале.
Скорость гидролиза углеводов или углеводных цепей смешанных полиме­
ров может зависеть от наличия определенных замещающих групп в углеводных
остатках. Так, многие микробные и растительные пектолитические ферменты
гидролизуют цепь полигалактуроновой кислоты только после отщепления метоксильных замещающих групп у Сб-атомов. При гидролизе лизоцимом гликановой
части бактериального пептидогликана, состоящей из чередующихся остатков двух
разновидностей ацетилированных сахаров, существенно наличие Ы-ацетильиых
заместителей. Деацетилирование 1Ч-ацетилглюкозамина и Ы-ацетилмурамовой
кислоты приводит к снижению скорости гидролиза субстрата.
Некоторые гликозидазы гидролизуют гликозидные связи только в линейных
полисахаридах. При наличии боковых цепей необходимо их предварительно от­
щепить с помощью соответствующего фермента. При гидролизе арабиноксилана
в прорастающих злаках первоначально с помощью арабинозидазы отщепляются
арабинозные остатки боковых цепочек, а затем образовавшийся линейный ксилан
гидролизуется эндоксиланазой, экзоксиланазой и ксилобиазой.
Известны гликозидазы, гидролизующие гликозидные связи в линейной части
разветвленного полисахарида в обход точек ветвления. Многие микробные р-1,3птюканазы гидролизуют р-1,3-1,6-глюкан клеточных стенок дрожжей в обход то-
чек ветвления в позиции 1,6. Считают, что способность р-1,3-глюканаз осуществ­
лять глубокий гидролиз смешанного 1,3-1,6-глюкана объясняет тот факт, что эти
ферменты встречаются в природе чаще, чем 0-1,6-глюканазы.
Специфичность действия гликозидаз может быть связана с наличием в по­
лисахариде заместителей неуглеводной природы. Некоторые ферменты гидро­
лизуют углеводную часть смешанного полимера лишь после отщепления неуглеводной части. Глюкозаминидазы бацилл и стафилококков гидролизуют гликановую часть пептидогликана только после отщепления боковых пептидных
субъединиц, катализируемого амидазами. Такие глюкозаминидазы называют
амидазозависимыми.
Пептидгидролазам (КФ 3.4) свойственна групповая специфичность, которая
выражается в избирательном расщеплении пептидных связей, образованных ха­
рактерными аминокислотами. Так, пепсин гидролизует связи, образованные ами­
ногруппами тирозина или фенилаланина, химотрипсин —- карбоксилами аромати­
ческих аминокислот, трипсин — карбоксилами аргинина или лизина.
По характеру протекания процесса расщепления субстрата гидролазы делят
на два типа: эндо- и экзоферменты. Эндоферменты катализируют неупорядочен­
ное расщепление внутримолекулярных связей полимерной молекулы с образова­
нием в начальной стадии гидролиза крупных фрагментов различной величины.
Каталитический акт может происходить в точках, удаленных от концов молекулы.
Возможна как единичная, так и множественная атака субстрата. Во втором случае
из некоего участка полимера последовательно вырезается несколько фрагментов,
близких или равных по величине.
Эндорасщепление приводит к быстрому снижению молекулярной массы суб­
страта и вязкости его растворов. В соответствии с законом Штаудингера вязкость
растворов линейных полимеров пропорциональна их молекулярной массе. При
длительном действии эндогидролаз накапливается смесь нескольких характерных
продуктов расщепления субстрата.
Экзоферменты катализируют последовательное отщепление фрагментов рав­
ной величины, чаще всего мономеров или димеров, от определенного конца поли­
мерной молекулы. При этом молекулярная масса субстрата и вязкость его раство­
ра снижаются относительно медленно. При действии экзогидролаз соотношение
скоростей прироста концентрации низкомолекулярных продуктов реакции и сни­
жения вязкости раствора субстрата значительно выше, чем при действии эндоферментов. Измерение этого соотношения позволяет сделать заключение о харак­
тере процесса гидролитического расщепления и отнести исследуемый фермент
к эндо- или экзотипу.
Гидролазы катализируют как расщепление субстрата, так и конденсацию про­
дуктов реакции между собой или с субстратом. Соотношение скоростей прямой
и обратной реакции зависит от концентрации продуктов реакции и воды. В сис­
темах с низкой концентрацией воды синтетические реакции могут преобладать
над гидролитическими. Так, в микроводных системах с концентрацией воды не
более 0,1 % липазы катализируют реакции синтеза триацилглицеролов из диацил-
глицеролов и жирных кислот, а при влажности выше 1 % преобладает гидролиз
триацилпшцеролов.
Скорость реакций синтеза возрастает по мере накопления продуктов гидро­
лиза. Образующиеся продукты конденсации, в свою очередь, могут подвергаться
ферментативному гидролизу, так что процессы, происходящие в заключительной
стадии расщепления субстрата, существенно отличаются от имеющих место в на­
чальный момент.
Многие гликозидазы обладают достаточно выраженной способностью син­
тезировать гликозиды путем трансгликозилирования. К числу таких гликозидаз
относятся а-шюкозидаза дрожжей, глюкоамилаза микромицетов, Р-галактозидаза, яичный лизоцим, различные целлюлолитические ферменты. У некоторых
целлюлаз трансгликозилирование является необходимым звеном в цепи реакций,
предшествующих гидролитическому расщеплению субстрата. В отличие от эстераз, гликозидазы катализируют реакции синтеза в системах с различной концен­
трацией воды.
Низкомолекулярные продукты гидролиза полимеров ингибируют гидролиз.
Степень ингибирования тем выше, чем выше сродство фермента к продуктам ре­
акции. Многие гликозидазы проявляют высокое сродство к отщепляемым моно­
сахаридам. Величина константы ингибирования для моносахаридов — продуктов
гидролиза — близка к величине константы Михаэлиса для субстрата.
Ингибирование низкомолекулярными продуктами гидролиза, а также проте­
кание обратных (синтетических) реакций в системах с ферментами, имеющими
высокое сродство к продуктам реакции, приводит к снижению скорости расщеп­
ления субстрата в поздних стадиях процесса. Этому способствует и исчерпание
наиболее реакционноспособных связей в субстрате по мере его расщепления.
Названные факторы ограничивают возможности ферментативного гидролиза суб­
стратов в закрытых системах, то есть в системах, где продукты реакции не удаля­
ются из ее сферы. Для достижения максимальной скорости и полноты гидролиза
используют открытые системы.
Примером открытых систем катализа могут служить проточные реакторы
с иммобилизованными ферментами, где субстрат гидролизуется по мере прохож­
дения через реактор, так что накопление продуктов гидролиза в конечной стадии
не лимитирует расщепление вновь поступающих порций субстрата. Более эффек­
тивны мембранные биореакторы, в которых производится постоянный отвод низ­
комолекулярных продуктов через мембраны с соответствующим размером пор.
Типы гидролитических процессов. В производстве пищи и кормов широко ис­
пользуется ферментативный гидролиз. При этом возникают задачи различной сте­
пени сложности, что определяется числом субстратов, сложностью их строения,
локализацией в сырье, агрегатным состоянием в гидролитической системе, необ­
ходимой степенью расщепления субстратов, заданным составом продуктов гид­
ролиза. Наиболее простыми являются процессы гидролитического расщепления
индивидуальных низкомолокулярных водорастворимых субстратов, например
олигосахаридов (сахарозы, мальтозы, лактозы, рафииозы и др.). Такие процессы
достаточно хорошо описываются в терминах ферментативной кинетики и регули­
руются .
Высокомолекулярные субстраты полисахаридной природы, дающие истин­
ные или коллоидные растворы в воде, такие как крахмал, гликоген, пектин, ину­
лин, гемицеллюлозы (глюканы, маннаны, ксиланы, галактаны и др.) не являются
индивидуальными соединениями. Они представлены смесями «штучных» моле­
кул различной молекулярной массы. В разветвленных полисахаридах молекулы
могут отличаться строением (степенью ветвления, характером чередования заме­
щенных и незамещенных гликозилов в основной цепи, соотношением различных
видов боковых цепочек).
Однако такие характерные черты, как состав мономеров, наличие определен­
ных типов гликозидных связей в основной и боковых цепях, позволяют рассмат­
ривать такие полимеры как единый субстрат. Так, крахмал представляет собой
смесь линейных,и ветвленных полимеров а -1,4-связанной глюкозы и является
субстратом ферментов, расщепляющих данный тип связи (а- и 0-амилазы, глю­
коамилазы и др.).
4
5к
л
[яша
Различия в величине и строении отдельных молекул таких субстратов, боль­
шое разнообразие промежуточных продуктов гидролиза осложняет течение ката­
литического процесса и описание его кинетики.
Гидролиз высокомолекулярных водорастворимых полисахаридов проводят
с помощью одного или более ферментов в зависимости от необходимого типа
и степени расщепления. Известны индивидуальные ферменты, способные полно­
стью гидролизовать высокомолекулярные полисахариды.
Глюкоамилаза мукоровых грибов гидролизует крахмал на 97-100 %, инулиназы различных микроорганизмов полностью расщепляют инулин. На практике
для частичного гидролиза полисахаридов обычно используют один фермент эндо­
типа, а полный гидролиз проводят комплексом эндо- и экзоферментов, исполь­
зуя их последовательно или совместно в зависимости от свойств ферментов. Так,
с помощью эндофермента а-амилазы из крахмала получают сахаристые продукты
низкой степени расщепления — мальтин (редуцирующих веществ 5-8 %) и мальтодекстрины (редуцирующих веществ до 25 %), эндофермент 0-1,3-1,4-глюканазу
используют для расщепления ячменного глюкана в кормах с целью снижения их
вязкости и набухаемости. Полный гидролиз крахмала при получении глюкозного
сиропа проводят последовательным действием эндо- и экзоферментов — а-ами­
лазы и глюкоамилазы.
V
..V
>
К (Г,. -,
Применение эндоферментов всегда оправдано при гидролизе вязких субстра­
тов, поскольку снижение вязкости существенно ускоряет диффузионные процес­
сы в среде и, соответственно, фермент-субстратные взаимодействия. Применение
двух или более ферментов необходимо в тех случаях, когда гидролиз основной
цепи гетерополисахарида возможен только после отщепления боковых ветвей.
Целлюлозу — нерастворимый в воде гидрофильный полисахарид — гидроли­
зуют в виде дисперсий твердой фазы. Скорость гидролиза зависит от степени дис­
персности субстрата, так как реальная концентрация субстрата пропорциональна
удельной поверхности его частиц. Существенна также прочность агрегации моле­
кул в частицах: кристаллический субстрат гидролизуется труднее аморфного.
При гидролизе нерастворимых диспергированных субстратов используют,
как правило, комплекс гидролитических ферментов эндо- и экзотипов. Наблюда­
ется кооперативность действия ферментов и синергизм, что объясняется различ­
ной способностью ферментов адсорбироваться на субстрате и проникать внутрь
частиц, вызывая дезагрегацию молекул. Гидролиз целлюлозы как индивидуально­
го субстрата проводят при получении глюкозы в цикле спиртового брожения.
Белки синтезируются в живых организмах как соединения строго определен­
ного состава и строения, но в процессе жизнедеятельности подвергаются протеолитической деградации, и, наряду с полноценными, возникают молекулы сходно­
го строения, но меньшей массы. При производстве пищи и кормов задача гидро­
лиза одного вида белка обычно не ставится. Белковые субстраты представляют
собой смесь белков: например, соевый белок, молочный белок, белок отходов пе­
реработки птицы и др. Белковые субстраты почти всегда могут быть переведены
в состояние гомогенного коллоидного раствора, поскольку все белки набухают
и растворяются в щелочной среде (достаточная концентрация щелочи 0,1-0,2 %).
Это снимает ограничения процесса гидролиза, имеющие место в гетерогенных
системах.
Для глубокого гидролиза белка обычно используют комплексы протеолитических ферментов, что связано с большим разнообразием типов пептидной связи
в белках (сочетаний аминокислотных остатков, образующих связь). Некоторые
протеазы, такие как трипсин, растительные и тиоловые протеиназы, сериновая
карбоксипептидаза фасоли, имеют очень широкую специфичность в отношении
типов пептидной связи и могут осуществлять глубокий гидролиз белка как инди­
видуальные ферменты.
Гидрофобные субстраты (жиры) гидролизуют в виде водных эмульсий. Ско­
рость гидролиза определяется степенью дисперсности жира, поскольку фермен­
тативная реакция проходит на поверхности раздела фаз. Для эмульгирования жи­
ров используют поверхностно-активные вещества. Глубокий гидролиз триглице­
ридов можно провести с помощью индивидуальной позиционно неспецифичной
липазы, если ее жирнокислотная специфичность соответствует составу субстрата.
Позиционно специфичные липазы находят применение в задачах трансформации
жиров.
В технологии пищевых продуктов и кормов распространены процессы гидро­
лиза смеси нескольких субстратов различной природы. Это процессы гидролиза
нефракционированного растительного сырья (зерна, солода, зеленой массы расте­
ний, плодов, овощей), различных видов мясных отходов, биомассы микроорганиз­
мов и др. Они используются при получении продуктов брожения, соков, пектина,
хлебобулочных изделий, сыров, пищевого и кормового белка, ферментированных
кормов, питательных сред для культивирования микроорганизмов. Некоторые из
этих процессов, такие как осветление напитков, проводятся в однородных средах
или в средах с небольшим содержанием взвешенной фазы. Другие, и их боль­
шинство, осуществляются в гетерофазных системах.
Гетерофазные системы высокой степени дисперсности в условиях постоян­
ного перемешивания, исключающего разделение фаз, в некоторых отношениях
подобны гомогенным системам. В высокодисперсных системах все субстраты
равнодоступны действию ферментов, архитектоника сырья не определяет поря­
док введения ферментов в реакционную среду. Равная доступность субстратов
позволяет осуществлять выборочный гидролиз одних, не затрагивая других, а при
необходимости гидролиза нескольких субстратов провести его в одну стадию, что
сокращает энергозатраты и уменьшает риск развития инфекции.
Раздельная (постадийная) обработка ферментами проводится в тех случаях,
когда наблюдается ингибирование действия одного фермента продуктами реак­
ции, катализируемой другим, или при существенных различиях оптимальных ус­
ловий действия отдельных ферментов. Ингибирование продуктами реакции на­
блюдается, например, при одностадийном гидролизе зернового сырья целлюлазой
и глюкоамилазой, поскольку целлюлаза ингибируется глюкозой.
При гидролизе смеси субстратов в гетерофазной системе низкой степени дис­
персности приобретает значение структура частиц, их архитектоника. В крупно­
дисперсном растительном сырье внутриклеточные компоненты можно гидролизо­
вать только после разрушения внешних структурных элементов тканей и клеток.
Применение соответствующих ферментов (целлюлаз, гемицеллюлаз, пектиназ)
становится необходимой предпосылкой эффективности гидролитического про­
цесса в целом. Целесообразность проведения гидролиза в одну или несколько ста­
дий диктуется теми же соображениями, что и при гидролизе высокодисперсного
материала.
Выбор ферментов для гидролиза сырья определяется поставленной задачей
(глубина гидролиза, состав продуктов реакции), свойствами сырья и возможными
параметрами процесса гидролиза в рамках конкретной технологии.
Гидролиз может осуществляться с помощью ферментов самого сырья или
ферментных препаратов. В первом случае задачей технолога является наиболее
полное использование ферментативной' активности сырья, что достигается соб­
людением оптимальных условий действия ферментов и введением активаторов,
допустимых в технологии получаемого продукта. Следует помнить, что фермен­
тативная активность свойственна биологическому сырью в состоянии жизнеде­
ятельности или законсервированному (высушенному, замороженному) в режиме,
при котором потери активности невелики. Активность основных ферментов сы­
рья нужно контролировать с целью определения параметров процесса гидролиза
(температуры, продолжительности) и необходимости использования дополни­
тельных источников ферментов. Ферменты сырья играют важную роль в произ­
водстве пива, вина, хлеба, чая, табака, белковых продуктов из биомассы микроор­
ганизмов, силоса. < •
’ **ШЧ Й|
3
Применение активаторов ферментов в пищевых производствах ограничено
требованиями к безопасности и органолептическим свойствам продуктов. Эти ог­
раничения снимаются в тех случаях, когда конечный продукт подвергается очист­
ке на заключительных этапах технологии и активаторы отделяются от продукта,
как, например, при производстве спирта, аминокислот из автолизатов дрожжей.
При использовании мультиферментных систем, таких как солод, нужно учи­
тывать, что условия активации и оптимумы действия отдельных ферментов раз­
личны, и выбирать режим гидролиза необходимо соответственно характеристикам
основного (или основных) ферментов, определяющих эффективность гидролиза.
К ферментным препаратам, применяемым при производстве пищевых про­
дуктов, предъявляются следующие требования. Фермент должен быть специ­
фичным по отношению к субстрату сырья, характер воздействия фермента на
субстрат и образующиеся продукты гидролиза должны обеспечивать заданные
свойства продукта гидролиза. Активность фермента должна полностью или в зна­
чительной степени проявляться при естественном рН водного раствора или дис­
персии субстрата, при температуре, имеющей место в технологическом процессе
(если гидролиз не выделяется как отдельная стадия). Если в условиях применения
активность фермента проявляется не полностью, нужно изменить дозировку пре­
парата.
Менее строгие требования предъявляются к ферментам для производства
уормов путем микробиологической биоконверсии, где гидролиз проводится на
стадии предобработки сырья; выбор режима гидролиза зависит только от свойств
сырья и не ограничен параметрами последующей ферментации. Это позволяет
использовать более широкий спектр ферментных препаратов. Ограничения в при­
менении активаторов гидролиза менее строги, чем при производстве пищи, соот­
ветственно менее строги требования к качеству конечных продуктов.
При использовании ферментных премиксов в составе кормосмесей нужно
принимать во внимание реальные условия функционирования ферментов премикса в организме животного, в частности, кислотность среды в отделах пищевари­
тельного тракта. Эффективность действия ферментов премикса зависит от актив­
ности пищеварительных ферментов животного, поскольку ферменты различной
специфичности при совместном действии на субстрат проявляют синергизм.
Ферментативная активность премиксов теряется в процессе хранения под
действием тяжелых металлов, входящих в состав двухкомпонентных ферментов.
Действие металлов тем более выражено, чем выше влажность и температура хра­
нения премиксов.
Гидролиз полисахаридов. В состав клеточных стенок растений входят целлюло­
за, гемицеллюлоза, пектиновые вещества, белок, низкомолекулярные органичес­
кие вещества, минеральные элементы. Основой структуры клеточной стенки, как
указывалось ранее, является комплекс структурных полисахаридов — целлюло­
зы, гемицеллюлозы и пектина.
Целлюлоза — один из наиболее трудно гидролизуемых природных полимеров.
Биодеградацию целлюлозы осуществляют ферменты микроорганизмов. В организ­
ме высших животных и человека не синтезируются ферменты, гидролизующие цел-
люлозу. Однако следует отметить, что микрофлора толстого кишечника человека
ферментирует целлюлозу овощей и фруктов полностью. Более грубая целлюлоза,
например входящая в препараты пищевых волокон, расщепляется до 70 %.
В гидролизе целлюлозы участвуют три основных вида ферментов. Эндо-Р1,4-глюканазы (КФ 3.2.1.4) катализируют неупорядоченное расщепление целлю­
лозных молекул на крупные фрагменты. При действии экзо-Р-1,4-глюканазы или
целлобиогидролазы (КФ 3.2.1.91) от нередуцирующего конца целлюлозных моле­
кул или их фрагментов отщепляется целлобиоза.
Целлобиазы, или Р-глюкозидазы (КФ 3.2.1.21), катализируют гидролиз целлобиозы и, с меньшей скоростью, небольших целлоолигосахаридов с образова­
нием глюкозы. Некоторые микроорганизмы синтезируют экзо-Р-1,4-глюкозидазу
(КФ 3.2.1.74), под действием которой от нередуцирующего конца целлюлозных
субстратов отщепляется глюкоза. Индивидуальные эндо- и экзоглюканазы способны расщеплять нативную целлюлозу, однако в природе этот процесс проис­
ходит обычно под действием комплекса ферментов. Целлюлазные комплексы
микроорганизмов и высших базидиальных грибов включают до 20 ферментных
белков, среди которых, как правило, есть и эндо-, и экзоферменты.
Высший базидиомицет 5рого1псИшт ри1\>еги1еп1ит синтезирует пять эндоглюканаз, одну экзоглюканазу и пять Р-глюкозидаз. В комплексе микроскопи­
ческого гриба Реп. уеггиси1о$ит обнаружено пять эндоглюканаз, две целлобио­
гидролазы и три неидентифицированных целлюлазы. В комплексе бактерии
С/. (ИегтосеИит — около 20 белков с целлюлазной активностью, в их числе не­
сколько эндоглюканаз, целлобиогидролазы, Р-ппокозидазы и целлобиофосфорилаза. Около 50 % целлюлазной активности связано с действием эндоглюканазы
молекулярной массой 56 кДа, 25 % — эндоглюканазы 90 кДа. Для бактерий ха­
рактерно преобладание эндоглюканаз в целлюлазном комплексе.
Целлюлазы грибов являются секретируемыми ферментами, гидролизующи­
ми целлюлозу вне клетки. Внутри клетки находят лишь целлобиазу. Ее субстрат
может свободно поступать из внешней среды и расщепляться в клетке, что повы­
шает экономичность его использования. Бактериальные целлюлазы, так же как и
целлюлазы грибов, являются секретируемыми ферментами, однако функциониру­
ют преимущественно не в виде отдельных молекул, а в виде сложно организован­
ных ассоциаций — целлюлосом и полицеллюлосом.
На поверхности бактериальных клеток, активно синтезирующих целлюла­
зы, обнаруживают протуберанцы — полицеллюлосомы. Их структура изучена
на примере С/. (ИегтосеИит. Полицеллюлосомы имеют размер в поперечнике
130-200 нм, высоту 60-100 нм. Они состоят из более мелких образований — цел­
люлосом, размером около 18 нм, в состав которых входит не менее 14 белковых
субъединиц.
Целлюлазные ансамбли лабильны. За час при температуре 50 °С и рН 6,8
целлюлолитические ферменты С/. /ИегтосеИит полностью переходят в раствор.
В процессе деструкции целлюлосомы некоторое время сохраняют кластерную
структуру. Индивидуальные целлюлазы комплекса бактерий достаточно стабиль-
|
I
I
]
|
\
I
ны: две изоформы эндоглюканазы молекулярной массой 41 и 42 кДа с оптимумом
при рН 6,5 полностью стабильны в течение 32 ч при температуре 75 °С, время их
полуинакгивации при 65 °С — около 100 сут.
Лабильность целлюлосом важна в процессе гидролиза целлюлозы. При кон­
такте с целлюлозной мицеллой происходит реорганизация полицеллюлосом, так
что они образуют волокнистую объемную сеть, заполняющую пространство меж­
ду стенкой бактериальной клетки и целлюлозной мицеллой. Сродство целлюлаз
к субстрату обеспечивает адгезию клеток на поверхности целлюлозы в процессе
ее гидролиза. Продукты гидролиза диффундируют в клетку по коридорам целлюлазной сети.
Очевидно, что гидролиз целлюлозы с помощью ферментных комплексов, ас­
социированных в целлюлосомы, происходит иначе, чем растворенными фермен­
тами. Последние, как правило, менее активны, чем ассоциированные.
Гидролиз целлюлозы ассоциированными бактериальными целлюлазами имеет
место в рубце жвачных животных. В рубцовой жидкости лишь около 5 % целлю­
лаз находится в свободном состоянии, остальная часть представлена ассоциатами. В гидролизе целлюлозы участвуют различные бактерии, населяющие рубец.
За 6-8 ч пребывания в этом отделе желудка целлюлоза расщепляется на 40-50 %.
Полнота гидролиза целлюлозы зависит от ряда факторов, в числе которых: степень
кристалличности субстрата, величина его удельной поверхности, состав фермен­
тативного комплекса, используемого для гидролиза, и свойства его компонентов.
Нативная целлюлоза имеет очень прочную структуру и трудно гидролизуется.
При исследовании гидролиза образцов целлюлозы различной степени кристал­
личности найдена обратная зависимость скорости гидролиза от процента крис­
талличности. Для увеличения доступности целлюлозы действию ферментов ее
подвергают измельчению. При этом снижается размер частиц, увеличивается
удельная поверхность субстрата и доля аморфной части. При сильном механичес­
ком воздействии может быть даже снижена степень полимеризации целлюлозы.
Скорость гидролиза целлюлозы прямо пропорциональна величине удельной по­
верхности, она увеличивается по мере снижения размера частиц и степени поли­
меризации целлюлозы.
Микроорганизмы синтезируют целлюлазные комплексы, различающиеся по
способности гидролизовать целлюлозу с высокой степенью кристалличности. Так
называемые «неполноценные» комплексы хорошо гидролизуют аморфную цел­
люлозу, а в кристаллической целлюлозе расщепляют лишь ее аморфную фракцию
(2-5 %). Резкое снижение активности «неполноценных» комплексов по отноше­
нию к «полноценным» наблюдается при возрастании степени кристалличности
субстрата до 60-70 %.
Полноценные целлюлазные комплексы обязательно содержат эндоглюкана­
зы, способные прочно сорбироваться на субстрате. Эндоглюканазы, гидролизу­
ющие нативную целлюлозу на 88-97 %, такие как из ТпсИос1егта геезег, Т. щгШе,
Т. 1оп%1ЪгасМа1ит, ОеоШсЬцт сапс!Шит, имеют коэффициент распределения меж­
ду поверхностью целлюлозы и раствором от 0,09 до 0,15 л/г, тогда как ферменты,
4 - 19739
гидролизующие субстрат на 8-27 % — соответственно 0,015-0,025 л/г. Чем боль­
ше коэффициент распределения, тем выше реальная концентрация фермента на
поверхности субстрата и скорость гидролиза.
Наблюдается прямо пропорциональная зависимость скорости гидролиза
кристаллического субстрата от количества эндоглюканазы, сорбированной на его
поверхности. В то же время скорость гидролиза растворимого производного цел­
люлозы — карбоксиметилцеллюлозы — зависит лишь от количества фермента
в реакционной среде, а не от его сорбционной способности. Это объясняется тем,
что в истинном растворе субстрата кинетика гидролиза подчиняется закону дей­
ствия масс: скорость реакции пропорциональна числу случайных столкновений
молекул фермента и субстрата, которое зависит только от их концентраций.
Ферменты с высокой способностью сорбироваться на субстрате участвуют не
только в гидролизе кристаллической целлюлозы, но и в процессе ее диспергиро­
вания. После исчерпания легкодоступной аморфной части субстрата дальнейший
гидролиз возможен только при условии расчленения целлюлозных мицелл.
На участках с дефектами структуры происходит сорбция и концентрирование
ферментных молекул, которые оказывают давление на стенки капилляров, пор и мик­
ротрещин целлюлозных мицелл, увеличивая расстояния между молекулами. В обра­
зовавшиеся пространства проникает вода, что приводит к разрыву водородных свя­
зей между молекулами целлюлозы, их сольватации и расслаиванию. На аморфизированные участки сорбируются молекулы фермента, тем самым закрепляя дефекты
кристаллической структуры и предотвращая слипание молекул целлюлозы.
При действии целлюлазнош комгшекса препарата «Целловиридина» на хлоп­
ковые волокна последние не теряют формы, но их диаметр увеличивается за счет
разрыхления, кончики волокон зазубриваются, отдельные волокна дефибриллируются, что отчетливо видно на микрофотографиях. В отличие от ферментативного
при кислотном гидролизе волокна расщепляются в поперечном направлении и уко­
рачиваются.
В процессе диспергирования целлюлозы могут участвовать как эндоглюка­
назы, так и целлобиогидролазы. В полноценном целлюлазном комплексе, где,
как правило, присутствует эндофермент с высокой сорбционной способностью,
целлобиогидролаза может и не обладать этим свойством. При этом наблюдается
синергизм действия целлобиогидролазы и эндоглюканазы: активность комплекса
ферментов выше суммы активностей его составляющих. Синергизм объясняет­
ся тем, что эндофермент путем механохимического воздействия подготавливает
субстрат для экзофермента, а также последовательностью реакций расщепления
целлюлозы, катализируемых эндо- и экзоглюканазами, по схеме:
Целлюлоза
Эндоглюканаза
Целлобиогидролаза
) ц еллодекс1рины _
Целлобиогидролаза
>
)целлобиоза^ л л о б иаза11Глюкоза
Синергизм действия может наблюдаться в различных комбинациях эндо- и эк­
зоферментов (эндо-эндо, эндо-экзо, экзо-экзо), но в любом случае одна из целлю-
лаз значительно отличается от другой по способности адсорбироваться на субстра
те. Ферменты, близкие по сорбционной способности, при соединении не проявля
ют синергизма. Синергический эффект целлюлаз значителен: степень расщеплена
субстрата увеличивается в 2,5-2,8 раза. Так, степень расщепления целлюлозы слаб<
адсорбирующейся эндоппоканазой Т. утс1е составляет 30-40 %. а ее комбинацией <
[сорбирующейся
более 75 %.
Большинство
бирующуюся эндоглюканазу
действие эндофермента за с
кристаллическом целлюлозы могут осуществлять не только комплек
дивидуальные эндоглюканазы, хорошо сорбирующиеся на субстрате
достаточно высокую осахариваюшую способность, то есть эндогл
направлении экзодействия
газы при расщеплении целл
екстринами
расщеплять
кристаллическую целлюлозу. Образование глюкозы идет по механизму трансгликозилирования, то есть в результате ее отщепления от продукта конденсации
фрагментов целлюлозы, образовавшихся при гидролизе. Полагают, что некоторые
*эндоглюканазы способны расщеплять целлобиозу по механизму транспгакозилирования.
Индивидуальные целлобиогидролазы, так же как эндоглюканазы, могут осу­
ществлять глубокий гидролиз кристаллической целлюлозы, если прочно сорби­
руются на субстрате. Скорость гидролиза целлюлозы целлобиогидролазой ли­
митируется накоплением продукта реакции
целлобиозы, являющейся силь­
ным ингибитором фермента. Константа ингибирования составляет 6 1 0-6 М, или
0,0021 г/л. Это означает, что при данной концентрации целлобиозы активность
целлобиогидролазы снижается вдвое, если фермент находится в растворе и не
связан на поверхности целлкшозы.
При гидролизе целлюлозы ферментными комплексами, включающими целлобиазу, ингибирование целлобиозой снимается за счет ее расщепления. Образу­
ющаяся глюкоза также является ингибитором процесса, но в меньшей мере. Ин­
гибирование продуктами реакции не позволяет достичь высокой концентрации
глюкозы в промышленных процессах ферментативного гидролиза целлюлозы,
если не предусмотрено выведение глюкозы из сферы реакции.
Для гидролиза целлюлозы используются комплексные ферментные препа­
раты, выделяемые из культур микроскопических грибов и актиномицетов, обла­
дающие эндоглюканазной, целлобиогидролазной и целлобиазной активностью.
Отдельные компоненты целлюлазных комплексов грибов и актиномицетов прояв­
ляют наибольшую активность при рН от 3,7 до 5,5, а комплексы в целом — при рН
4,5-5,5. Оптимальная температура действия отдельных компонентов — от 45 до
80 °С, комплексов — 50-60 °С. Некоторые высшие базидиомицеты синтезируют
целлюлазы с оптимумом при рН 3.
Многие целлюлазы являются углеводсодержащими белками, углеводная часть
может составлять до 90 % молекулярной массы. Углеводная часть выполняет якор­
ную функцию, способствуя сорбции фермента на субстрате. Сорбция по сродству
необходима, поскольку в рН-зоне активности целлюлазы имеют незначительный
заряд: рН-оптимумы близки к изоэлектрической точке (ИЭТ). Возможно, углевод­
ная часть обеспечивает скольжение фермента в фибриллярных структурах цел­
люлозы. Это существенно, поскольку целлюлазы осуществляют сотни и тысячи
каталитических актов, не покидая поверхности одной целлюлозной молекулы.
Углеводная часть целлюлаз защищает белок от действия денатурирующих
агентов и от протеолиза. При исследовании целлюлазного комплекса Реп. \еггиси1озит установлено, что компоненты, терявшие не более 30 % активности
за 72 ч при 50 °С (эндоглюканазы IV и V, целлобиогидролазы I и II), содержат
33—48 % углеводов, а наиболее термолабильная эндоглюканаза И, терявшая 76 %
активности в тех же условиях, содержит лишь 18 % углеводов. Прямая связь вели­
чины углеводной части и термостабильности продемонстрирована также на при­
мере целлюлаз Т. геезеи
Развитие промышленной биоконверсии целлюлозы в этанол побуждает к поис­
ку термостабильных целлюлаз. Проведение биоконверсии при повышенной темпе­
ратуре энергетически выгодно и снижает риск инфицирования реакционной среды.
Активные продуценты термостабильных целлюлаз найдены среди микромицетов родов Азрег§Шиз, Асгетопит, Нит1со1а, РИота, Та1аготусез, у видов
АИезсНепа 1еггез1г1з, Мугюсотит (ИегторИИит, ТИегтоазсиз аигапйасиз и др.
Время полуинактивации целлюлаз в гомогенатах глубинной культуры грибов при
60 °С составляет от нескольких часов до нескольких суток.
Для грибов-термофилов, продуцирующих термостабильные целлюлазы, ха­
рактерна низкая Р-глюкозидазная (целлобиазная) активность, следы или полное
отсутствие целлобиогидролазы. Основная активность и проявление термоста­
бильности связаны с эндоглюканазными компонентами. Из исследованных эндоглюканаз наиболее стабилен фермент А. 1еггез1пз, гомогенный препарат которого
в водном растворе, без субстрата, теряет лишь 20 % активности за 6 ч при 65 °С.
Р-Глюкозидазы — наиболее термолабильные компоненты комплексов тер­
мофильных грибов. Гомогенные препараты Р-глюкозидаз, выделенные из куль­
тур грибов Азр. 1еггеиз, Азр. м>епШ, Азр. уегз1со1ог и А. ШггёзШз, имеют оптимум
действия при рН 4,3-4,8 и температуре 55-60 °С, молекулярная масса ферментов
210-230 кДа, углеводная часть составляет 8-15 % массы.
Р-Глюкозидазы имеют высокоупорядоченную четвертичную структуру и сос­
тоят из 6 субъединиц молекулярной массой 35-40 кДа. Проявление активно­
сти связано с наличием этой структуры. При температуре 55 °С Р-глюкозидаза
Азр. и>епШдиссоциирует на тримеры с активностью около 40 % от исходной гексамерной формы. Диссоциация до мономеров приводит к снижению активности
до 10 % исходной, инкубация мономерной формы при 55 °С сопровождается де­
натурацией и инактивацией.
Конверсия целлюлозы в природных биоценозах сопряжена с деструкцией ге­
мицеллюлозы и лигнина. При культивировании грибов на древесных субстратах
в первую очередь разлагается гемицеллюлоза, после удаления ксилана увеличи­
вается скорость гидролиза целлюлозы. Ксиланазы и целлюлазы проявляют синер­
гизм, что объясняется последовательностью их действия при гидролизе смешан­
ного субстрата, где целлюлоза экранирована гемицеллюлозой.
Некоторые грибы синтезируют неспецифические эндоглюканазы, способные
расщеплять как целлюлозу, так и гемицеллюлозу, что дает очевидные преимущест­
ва в биоконверсии природных субстратов. Так, эндоглюканаза штамма Сео1псИит
сапсЛШит Зс (продуцент препарата «Целлокандина») гидролизует, наряду с цел­
люлозой, другие Р-глюканы (лихенан, глюкан ячменя), а также ксилан.
Среди высших базидиомицетов, разрушающих древесину, выделяют группы
грибов, вызывающих бурую и белую гниль. Грибы бурой гнили имеют незначи­
тельную способность к деструкции лигнина, для них характерна высокая эндоглюканазная активность, наличие ксиланазы; экзоглюканазную активность имеют
не все грибы этой группы.
У грибов белой гнили сравнительно низкая общая целлюлазная активность
компенсируется мощным комплексом лигнинразрушающих ферментов. В целлюлазном комплексе грибов белой гнили обязательно присутствуют экзоглюканазы.
Под действием экзоглюканаз образуется глюкоза, а при ее окислении глюкозооксидазой — глюконовая кислота и перекись водорода. Последняя используется
в реакциях окислительной деструкции лигнина.
При исследовании действия целлюлаз Т. утс/е и Азр. /ое(Шш на целлюлозу
и целлолигнин стеблей хлопчатника было установлено, что лигнин не связывает
целлюлазы путем адсорбции и не инактивирует их. Лигнин экранирует целлюло­
зу, препятствует доступу целлюлаз к субстрату, что приводит к снижению эффек­
тивности ферментативного гидролиза.
Ферментативный гидролиз — не единственный путь деградации целлюлозы
в природе. Считают, что грибы бурой гнили осуществляют окислительную деградацию углеводов с помощыб радикалов ОН , образующихся при распаде перекиси водорода в системе НгОг-Ре2*. В результате последовательного окисления глюкозных единиц по атомам Се, Сг и Сз до альдегидов и кислот происходит разрыв
глюкопиранозных колец и беспорядочное расщепление гликановой цепи.
Гемицеллюлозы. К числу наиболее распространенных видов гемицеллюлоз
высших растений, как отмечалось ранее, относятся ксилоглюканы, ксиланы, глю­
каны, галактаны, маннаны. Механизм деградации ксилоглюкана исследован недо­
статочно. Очевидно, что при наличии Ш1,4-глюканаз процесс деградации лимити­
руется наличием а -1,6-связей, с помощью которых к глюкановой цепи полимера
присоединены боковые цепочки.
Ферменты, гидролизующие а-1,6-связь между остатками глюкозы и ксилозы
(а-ксилозидазы, КФ 3.2.1), найдены у микроорганизмов и высших растений. Низко­
молекулярным субстратом а-ксилозидазы, соответствующим структуре ксилоглю­
кана, является дисахарид изопримевероза (ксилопиранозил-а-1,6-глюкопираноза).
Некоторые а-ксилозидазы способны расщеплять как изопримеверозу, так
и олигосахариды ксилоглюкана (ферменты из Вас Шиз зр., Азр. пщег и а-ксилоШ
зидаза-1 из Азр. $ауш ), другие гидролизуют только изопримеверозу (а-ксилозидаза-И Авр. /1сгшз) или только олигосахариды ксилоглюкана (ферменты гороха,
настурции). Микробные а-ксилозидазы обладают трансгликозилазной способнос­
тью, они переносят ксилозильные остатки изопримеверозы на мальтозу с образо­
ванием трисахарида с а-ксилозидной связью.
Бациллы, аспергиллы, пенициллы синтезируют а-ксилозидазу как внутри­
клеточный фермент, что предполагает его участие на заключительной стадии
деградации ксилоглюкана, после расщепления полимера на низкомолекулярные
фрагменты. Внутриклеточные а-ксилозидазы имеют субъединичную структуру
(тетрамеры с молекулярной массой 290—490 кДа), оптимум действия для ксилозидаз грибов — при рН от 2,5 до 6,5 и температуре 45 °С. Стабильны в слабокислой
и нейтральной среде.
При исследовании ферментов с а-глюкозидазной активностью а-глюкозидазы Азр. пщег, мальтазы пивных дрожжей и изомальтазы пекарских дрожжей
установили, что все данные ферменты могут гидролизовать изопримеверозу, но
дрожжевые — в малой степени. а-Глюкозидаза аспергилла имеет широкую спе­
цифичность и хорошо гидролизует изопримеверозу, мальтозу, изомальтозу и а-паранитрофенилглюкозид. Оптимальные параметры гидролиза и действие ингиби­
торов при использовании в качестве субстратов изомальтозы и изопримеверозы
одинаковы, что предполагает наличие единого каталитического центра для гидро­
лиза обоих субстратов.
Данный фермент классифицирован как занимающий промежуточную пози­
цию между а-глюкозидазой и а-ксилозидазой. Это очень важный факт, который
свидетельствует о возможном участии широко распространенного в микробном
мире фермента а-глюкозидазы в биодеградации ксилоглюкана. Этому способству­
ет и локализация фермента в поверхностном слое клеточной стенки, что облегча­
ет взаимодействие с полимерным субстратом.
У высших растений широко распространен фермент ксилогаюканэндотрансгликозилаза (КТГ), которая катализирует деградацию ксилоглюкана через трансгликозилирование путем переноса частей полимера на низкомолекулярные олиго­
сахариды ксилоглюкана (акцепторы). Процесс подробно исследован на примере
КТГ тополя.
Полагают, что КТГ имеет два центра связывания, так что в одном из них про­
исходит связывание неконцевого (внутреннего) глюкозила ксилоглюкана с не­
редуцирующим глюкозилом акцептора, с образованием Р-1,4-гликозидной связи,
а в другом центре связывания — присоединение той части ксилоглюкана, где име­
ется редуцирующий остаток глюкозы. Затем эта часть освобождается из комплекса
с ферментом. Поскольку это фермент эндодействия и трансгликозилирование про­
исходит во внутренних частях полимера, то деградация идет быстро. В частности,
молекулярная масса ксилоглюкана гороха снизилась с 50 кДа до величины, близкой
к массе мономера-акцептора. Считают, что в растениях деградация ксилоглюкана
идет по двухступенчатому механизму, причем на первой ступени происходит гид­
ролиз с образованием олигосахаридов, а затем — трансгликозилирование.
Трансформация ксилоглюкана с участием гидролаз и трансгликозилаз тесно
связана с ростом и морфогенезом растений. Рост за счет растяжения и измене­
ние формы клеток возможен лишь при способности микрофибрилл целлюлозы
к скольжению, которое ограничено нековалентной, но тесной связью с ксилоглюканом. При частичном расщеплении ксилоглюкана увеличивается подвижность
целлюлозных микрофибрилл. По окончании формообразовательного процесса
в клетке новая структура стенки фиксируется молекулярной «сшивкой» с участи­
ем трансформированного ксилоглюкана.
В ферментативном гидролизе ксиланов участвуют следующие ферменты:
■ эндоксиланаза (КФ 3.2.1.8) катализирует неупорядоченное расщепление Р-1,4ксилозидных связей в ксиланах, ксилоолигосахаридах;
■ экзо-Р-1,4-ксилозидаза, или Р-ксилозидаза (КФ 3.2.1.37), катализирует от­
щепление единичных остатков ксилозы от нередуцирующего конца ксиланов,
ксилоолигосахаридов, гидролизует ксилобиозу;
■ арабинофуранозидаза, или арабинозидаза (КФ 3.2.1.55), катализирует отщеп­
ление нередуцирующих остатков арабинофуранозы, присоединенных а -1,3
или а-1,5-связью, в таких субстратах, как арабинаны, арабиноксиланы, арабиногалактаны;
ш ■ а-глюкуронидаза катализирует отщепление остатков глюкуроновой кислоты
от олигосахаридов, образующихся под действием эндоксиланазы.
Кроме того, в ксиланолитических комплексах находят фермент экзодействия, отщеп­
ляющий от ксиланов ксилобиозу, а также фермент ксилобиазу, гидролизующий кси­
лобиозу (аналоги целлобиогидролазы и целлобиазы в целлюлазных комплексах).
Ферменты гидролиза ксиланов обнаружены у высших растений, бактерий, ак­
тиномицетов, микромицетов, высших грибов, беспозвоночных. В организме чело­
века ксиланы, как и другие геммицеллюлозы, ферментируются в основном микро­
флорой толстого кишечника. Степень перевариваемости ксиланов составляет от
30 до 100 %, другие гемицеллюлозы также могут быть расщеплены практически
полностью. В прорастающих семенах злаков найдены: арабинозидаза, эндокси­
ланаза, экзоксиланаза (отщепляющая ксилобиозу) и ксилобиаза, что позволило
представить основной путь гидролиза арабиноксилана так:
Арабиноксилан
ФАрабинозидаза
Ксилан
* Эндоксиланаза
Ксилоолигосахариды
>1*Экзоксиланаза
'Ксилобиоза
" ’■
™ '^4' Ксилобиаза
Ксилоза
—бР^.Чн.Рзидаза > Арабиноза
Многие микроорганизмы синтезируют эндоксиланазу, ксилозидазу и арабинозидазу. Из ксиланаз у бактерий и актиномицетов могут быть только эндоксиланаза
или эндоксиланаза и ксилозидаза. Грибы, как правило, имеют оба типа ксиланаз,
представленных множественными формами. В ксиланазных комплексах грибов
насчитывают до 15 ферментов. Так, у Т. у Ш ё найдено 7 форм эндоксиланазы
и 3 формы ксилозидазы, у Азр. пщёг — 2 эндоксиланазы и 3 ксилозидазы. Эндок­
силаназы — внеклеточные ферменты (как все ферменты гидролиза высокомоле­
кулярных полисахаридов). В молодых культурах грибов и у бактерий ксилозидазы
локализуются в клетках, старые культуры грибов секретируют фермент в культу­
ральную среду.
Эндоксиланазы и ксилозидазы грибов при действии на полимерные субстраты
проявляют выраженный синергизм. Так, эндоксиланазы I и II Азр. пщег гидроли­
зуют арабиноглюкуроноксилан пшеничной соломы на 22 %, глюкуроноксилан из
стеблей донника белого — на 12—22 %, ксилозидазы расщепляют те же субстраты
на 0,2-3 %, а при совместном действии эндоксиланаз и ксйлозидаз степень гидро­
лиза субстратов составляет 70-80 %. Синергизм можно объяснить тем, что при
частичном расщеплении ксиланов эндоксиланазой увеличивается число концевых
нередуцирующих остатков ксилозы, на которые действует ксилозидаза, а также повышенным сродством этого фермента к низкомолекулярным субстратам.
Эндоксиланаза — типичный эндофермент, расщепляющий высокополимерные субстраты, с заметной скоростью гидролизует цепь из 4 и более остатков
ксилозы, минимальная длина гидролизуемого олигосахарида — 3 ксилозных еди­
ницы. Некоторые эндоксиланазы катализируют глубокое расщепление ксиланов,
что связано с проявлением трансгликозилазной способности. Такие эндоксиланазы иногда классифицируют как ферменты эндо-экзотипа. Эндо-экзоксиланазы
(32 и 33 кДа), с оптимумом действия при рН 4,9~и температуре соответственно 65
и 52 °С, выделены из культуральной жидкости Азр. ]аротсиз, где присутствуют
также типичные формы эндо- и экзоксиланазы.
Эндоксиланазы микроскопических и высших базидиальных грибов имеют
оптимум действия при рН 3,5-5,5 (редко 6-8) и температуре 30-60 °С, стабильны
при рН 2-9 и температуре не выше 65 °С. Ингибиторы — ионы тяжелых металлов
и агенты, окисляющие сульфгидрильные группы.
Эндоксиланазы бактерий и актиномицетов наиболее активны при рН 5-7,3
(рН для В. зиЫШз — 7-9,5) и температуре около 50 °С, у некоторых бацилл 6580 °С. Уникальна эндоксиланаза термофильной бактерии ТНегтоЮф пеароШапа,
имеющая оптимум при температуре 90 °С. Время полуинактивации фермента со­
ставляет при 90 °С — 162 Мин, при 100 °С — 30 мин. Оптимальный рН действия
фермента-— 5,5.
Среди ксилозидаз найдены ферменты с высокой молекулярной массой
(200 кДа и более), имеющие субъединичную структуру. Многие экзоксилозидазы — гликопротеины, содержание углеводов от 4 до 23 %. Грибные экзоксилозидазы проявляют общую для р-гликозидаз широкую специфичность в отношении
дисахаридов, в частности, расщепляют дисахариды глюкозы с различными типа-
I
|
‘
I
I
* — ярмк
~
!
Ц]
Я
|
|
ми (З-гликозидной связи. Ксилозидаза Ахр. огугае — фермент с молекулярной мас­
сой 82 кДа, с оптимумом при рН 5 и температуре 70 °С, стабильный при рН 5-8,
в отсутствие субстрата — при температуре не выше 60 °С. Наряду с ксиланами
гидролизует целлобиозу.
Комплекс ферментов, гидролизующих ксиланы, входит в различные фермент­
ные препараты грибного происхождения, такие как «Вильзим», «Ксилаком», «Поликанесцин», «Ультразим», «Целловиридин», «Целлокандин» и др. Ферментатив­
ное расщепление ксиланов не может непосредственно повысить пищевую цен­
ность растительных продуктов для человека, поскольку продукты гидролиза не
усваиваются в организме. Эти сахара сбраживает микрофлора пищеварительного
тракта жвачных животных, синтезируя биомассу, которая служит для животных
источником белка.
Ферментативный гидролиз гемицеллюлоз является важной стадией биоконверсин многих видов растительных отходов в пищевые и кормовые белковые про­
дукты.
В гидролизе глюкана участвуют: эндо-р-1,3, эндо-(М,4, эндо-р-1.3-1,4, экзоР~1,3, экзо-р-1,4-глюканазы, целлобиаза и ламинарибназа. Эти ферменты проду­
цируются высшими растениями, микроорганизмами, низшими животными. Про­
мышленное применение имеют глюканазы солода, бактерий и микроскопических
грибов.
Специфические (то есть расщепляющие только один тип связи) эндо* 1,3 и эн­
до- 1,4-глюканазы солода и грибов гидролизуют по неупорядоченному механизму
соответственно р-1,3 и Р-1,4-глнкозндные связи, а неспецифические эндо-Р-1,31,4-глюканазы бактерий и грибов — оба типа связей. Действие эндоглюканаз при­
водит к быстрому снижению вязкости растворов глюкана, наиболее выраженному
в случае неспецифической эндоглюканазы. В начальной стадии гидролиза образу­
ется растворимый полисахарид с пониженной молекулярной массой — так назы­
ваемый гумми-глюкан. а также глюканодекстрнны. При действии экзоглюканаз на
продукты частичного гидролиза глюкана отшеплястся глюкоза. Предпоследними
продуктами гидролиза являются 1.4- и 1,3-связанные днезхариды глюкозы целлобиоза н ламинарибиоза. которые превращаются в глюкозу при участии целлобиазы и ламинарибиазы.
Глубокий гидролиз глюкана осуществляют комплексы эндо- и экзогяюкана з
солода и микроскопических грибов. Солодовые ферменты способны полностью
расщеплять глюкан ячменя. Бактерии, для которых характерно наличие нсспеинфнческой эндоглюканазы. гидролизуют глюкан неполностью.
Для гидролиза растительных глюканов исполмуют препараты глюканаз, вы­
деляемые из культур В. хиЫШя, грибов ролов Ахрегу/Иш. СеоШскшн, Тгн'Ьнк'гта
и др. В состав препарата глюкана ш из культуры штамма В. хиМШз 103 входит
фермент с молекулярной массой 30-33 кДа. оптимум действия при рН 6,0- 6.5
и температуре 50-55 °С. Фермент расщепляет глюканы смешанного типа (ячмен­
ный глюкан, лихеннн) по знломечанизму. Накопление редушфующих сахаров на­
чинается после снижения вязкости раствора субстрата на 80 %.
Активным продуцентом глюканазы является штамм гриба Аар. /оеНс1из ГП10-20. Ферменте молекулярной массой 19 кДа проявляет максимум (3-1,3-1,4-пиоканазной активности при рН 5-6 и температуре 37 °С. Стабилен при температуре
до 55 °С, стабилизаторы фермента — соли цинка. Высокая активность фермен­
тов, гидролизующих Р-1,3-1,4-глюкан, присутствует в препаратах «Амилоризин»,
«Глюканекс», «Вильзим», «Целловиридин», «Целлокандин».
'
Пектиновые вещества. Организмы высших животных и человека не проду­
цируют пектолитических ферментов. Гидролиз пектиновых веществ происходит
у человека в нижнем отделе кишечника под действием ферментов микрофлоры,
I
степень расщепления пектина может достигать 100 %. В природных биоценозах
расщепление пектинов осуществляют микроорганизмы и высшие базидиальные
грибы, в процессе участвуют пектингидролазы и пектинлиазы.
Гидролиз пектиновых веществ катализируют эндо- и экзополигалактуроназа,
]
пектинметилэстераза, а также ферменты, расщепляющие нейтральные пектино!
вые полисахариды. Эндополигалактуроназа, или эндо-ПГ (КФ 3.2.1.15), катали­
зирует гидролиз а-1,4-гликозидных связей между неэтерифицированными остат­
ками галактуроновой кислоты в различных пектиновых полисахаридах. Гидролиз
происходит неупорядоченным способом, предпочтительно расщепляются внут­
ренние связи полимеров:
'.у
^ 1 .-.» л
Полигалактуроновая кислота + НгО
1
I
Олигогалактуроновые кислоты + Моногалактуроновая кислота
При гидролизе 1-10 % связей вязкость растворов галактуронанов снижается
не менее чем на 50 %.
. щ
Фермент расщепляет в пектинах фрагменты полигалактуроновой кислоты
с различной молекулярной массой и степенью этерификации. С наибольшей ско­
ростью гидролизуются низкоэтерифицированные субстраты, такие как пектовая
кислота, полипектат натрия, свекловичный пектин. Более медленно — лимон­
ный и яблочный пектин, а пектин Линка (степень этерификации 99 %) совсем не
гидролизуется. При действии на олигоурониды предпочтительно расщепляются
субстраты большей степени полимеризации. Основным конечным продуктом гид­
ролиза пектинов, в зависимости от источника фермента, может быть моно-, ди-,
три- или тетрагалактуроновая кислота.
|
Действие эндо-ПГ на растительные ткани вызывает их мацерацию в резуль­
тате расщепления пектиновых веществ срединных пластинок. В комплексе полигалактуроназ гриба Азр. аШасеиз только эндо-ПГ практически полностью мацерировала до состояния изолированных клеток ткани картофеля, кабачка, тыквы,
яблока, сливы, груши, персика.
I
Большинство исследованных эндополигалактуроназ — ферменты с молеку­
лярной массой 3-80 кДа, оптимумом действия при рН от 3,5 до 6,5 и температуре
около 50 °С. Эндополигалактуроназа некоторых микроскопических и высших
грибов ингибирует ионы щелочноземельных и тяжелых металлов. У грибов и бак­
терий эндо-ПГ обычно входит в комплекс внеклеточных пектинрасщепляющих
ферментов.
I
Дрожжи 8асскаготусе$ ра&дггапш , 8. тт, 2у§о/аЪозрога тагхгапа синтези­
руют внеклеточную эндо-ПГ в качестве единственного пектинрасщепляющего
фермента. Эндо-ПГ 8. раз1опапш выделяется в среду в виде высокомолекуляр­
ного комплекса, содержащего 79 % углеводов. В процессе очистки фермента до
гомогенного состояния углеводная часть уменьшилась до 3,2 %. Величина угле­
водной части не влияет на субстратную специфичность и характер действия фер­
мента, но удаление углеводов снижает термостабильность эндо-ПГ.
Экзополигалактуроназа, экзо-ПГ (КФ 3.2.1.67), катализирует расщепление
конечных а -1,4-гликозидных связей между остатками неэтерифицированной га[ лактуроновой кислоты в различных пектиновых полисахаридах (полигалактуроновой кислоте, пектатах, пектинах) с образованием моногалактуроновой кислоты.
Гидролиз сопровождается незначительным снижением вязкости растворов суб­
стратов. Фермент расщепляет пектаты неполностью, примерно на 50 %.
Частично деградированные субстраты, как правило, гидролизуются экзо-ПГ
| щбыстрее высокополимерных. Предпочтительна низкая степень метоксилирования
галактуронанов. Так, относительная скорость гидролиза субстратов разной сте­
пени этерификации двумя формами экзо-ПГ Ахр. аШасеш составила: пектовой
кислоты — 98-100 %, свекловичного пектина — 92-100, лимонного — 20-24,
яблочного — 1,3-7,5, сливового — 0,3-2,0 %.
Экзополигалакгуроназы имеют оптимум действия при рН от 3,4 до 6,0 и тем­
пературе 30-50 °С. Некоторые грибные экзо-ПГ активируются кобальтом, ингиби­
руются щелочноземельными, тяжелыми металлами и ЭДТА. Экзополигалактуроназы входят в состав пектолитических и цитолитических ферментных препаратов
из культур микроорганизмов («Пектаваморина», «Пектофоетидина», «Целлюла­
зы-100», «Поликанесцина», «Ультразима», «Винфлоу» и др.).
Пектинметилэстеразы (КФ 3.1.1.11) катализируют отщепление метальных
групп от полиметилгалактуроновой кислоты с образованием метанола и частично
деметоксилированной полигалактуроновой кислоты. Пектинметилэстеразы (ПЭ)
деэтерифицирует пектины на 60-70 %. По мере снижения степени этерификации
субстратов уменьшается сродство фермента к ним и процесс гидролиза не прохо­
дит до конца. ПЭ предпочтительно действует на крупные молекулы, метоксилированные олигоурониды расщепляются медленнее.
При совместном действии полигалактуроназы и пектинэстеразы на высокометоксилированный пектин первая стадия гидролиза проходит под действием
пектинэстеразы. После частичного деметоксилирования субстрата начинается
гидролиз полигалактуроновой кислоты. Снижение молекулярной массы пекти­
на приводит к замедлению реакции деметоксилирования. В результате действия
двух ферментов образуются продукты реакции, несвободные от метоксильных
групп.
Основные превращения пектина при гидролизе комплексом эндо-ПГ, экзо-ПГ
и ПЭ могут быть представлены так:
Пектин
Деметоксилированный пектин
ФЭкзо-ПГ
Олигоурониды
Моногалактуроновая кислота
Пектинэстеразы проявляют максимальную активность в интервале рН 4,4-8,
у некоторых микроскопических грибов — при рН 2,5. Оптимальная температура
действия 30—40 °С. Пектинэстераза входит в комплексы пектолитических фермент­
ных препаратов микробного происхождения.
При действии комплексных ферментных препаратов «Пектаваморина», «Пектофоетидина» и «Пектогирзутина» (последний — из культуры высшего базидиомицета Сопо1и$ Ыг$и1ш) на подсолнечный, свекловичный, яблочный и цитру­
совый пектин были найдены конечные продукты гидролиза полигалактуроновой
кислоты в следующем соотношении: моногалактуроновая кислота — 23-40 %,
сумма ди- и тригалактуроновой кислот — 20-28, тетрагалакгуроновая кислота —
20-26, полигалактуроновая — 16-26 %. Наибольшее количество моногалактуроновой кислоты — при действии «Пектаваморина» (30-40 %).
Полное расщепление пектиновых веществ возможно при деградации не толь­
ко полигалактуроновой кислоты, но и нейтральных полисахаридов. Гидролиз
арабинанов и арабинозидов арабиногалактана катализируют ферменты экзоарабинаназа и арабинофуранозидаза. Они расщепляют оба типа связей (а-1,3 и а -1,5)
в арабинанах и арабиноолигосахаридах. При действии на арабинан первоначаль­
но отщепляются боковые ветви, а затем медленно гидролизуется линейная часть
путем отщепления концевых остатков арабинозы с нередуцирующего конца по­
лимера.
Гидролиз галактанов и галактановой части арабиногалактанов катализируют
р-1,4- и Р-1,3-галактаназы (соответственно структуре субстрата). Среди галактаназ находят ферменты эндо- и экзодействия. Галактаназы встречаются как у мик­
роорганизмов, так и у высших растений.
Гидролиз пектиновых веществ в растениях регулируют белковые ингибито­
ры. Они не только снижают активность собственных пектолитических ферментов
растения, но и действуют на пектиназы фитопатогенных микроорганизмов — не­
обходимый инструмент для внедрения последних в клетки инфицируемого рас­
тения. Белковые ингибиторы полигалактуроназы — белки-гликопротеины с мо­
лекулярной массой 37-54 кДа, богатые лейцином, содержание углеводов — око­
ло 2 0 %.
ШШШШШ
*' Ш# 1им
В клеточных стенках картофеля обнаружены две формы ингибитора, одна из
которых прочно связана с пектинэстеразой. Эта форма, предотвращая деметоксилирование пектина, опосредованно влияет на активность полигалактуроназы.
Существует прямая зависимость устойчивости растений к патогенным микроор­
ганизмам от содержания ингибитора в их тканях. Содержание ингибитора в пло­
дах зависит от сорта и снижается по мере созревания плодов.
Крахмал является важнейшим запасным полисахаридом растений. Ферменты
могут воздействовать как на клейстеризованный, так и на нативный крахмал, од­
нако во втором случае реакция протекает значительно медленнее. Поэтому в боль­
шинстве технологических процессов переработки крахмалосодержащего сырья
предусмотрена клейстеризация крахмала.
Группа ферментов, гидролизующих крахмал (амилолитических), включает:
а-амилазу, Р-амилазу, глюкоамилазу, а-глюкозидазу, изоамилазу, пуллуланазу.
Для расщепления крахмала с образованием циклизованных продуктов реакции
используют фермент циклодекстринглюканотрансферазу, относящуюся к классу
трансфераз. а-Амилаза (а-1,4-глюкан-4-глюканогидролаза, КФ 3.2.1.1) является
ферментом эндотипа, гидролизующим а -1,4-гликозидные связи в крахмальных
полисахаридах и гликогене. Некоторые а-амилазы расщепляют а -1,4-связи в пуллулане, а в частично гидролизованном пуллулане — также и а-1,6-связи. Приме­
ром является амилаза, выделенная из термофильного актиномицета.
Действие а-амилазы на крахмал характеризуется быстрым снижением вяз­
кости раствора и молекулярной массы олигосахаридов. Фермент имеет выражен­
ное сродство к гликозидным связям, удаленным от конца молекулы. Расщепление
гликозидной связи происходит между атомом кислорода и С 1-атомом глюкозного
остатка. Атака субстрата носит случайный характер и может быть как единич­
ной, так и множественной — когда от субстрата последовательно отщепляется
несколько фрагментов. Гидролизу подвергаются олиго сахариды, содержащие не
менее трех глюкозных единиц. При гидролизе амилопектина в продуктах гидро­
лиза, наряду с олигосахаридами линейного строения, присутствуют а-декстрины,
представляющие собой не затронутые реакцией разветвленные участки амило­
пектиновых молекул.
Процесс расщепления крахмала хорошо прослеживается по реакции про­
дуктов с йодом. Синяя окраска характерна для амилодекстринов, содержащих
не менее 45 глюкозных единиц (Г«), пурпурная — для декстринов Г35- Г к р а с ­
ная — для эритродекстринов Г20-Гзо» коричневая — для декстринов Г 12—Г и. Ахродекстрины, не окрашивающиеся йодом, имеют не более 1 2 глюкозных единиц.
Образование ахродекстринов завершает первую стадию гидролиза крахмала. На­
копление низкомолекулярных сахаров происходит во второй — стационарной,
медленно текущей стадии.
Различные а-амилазы при длительном воздействии на крахмал расщепляют
его на смесь олигосахаридов с преобладанием характерных сахаров. Конечный
продукт расщепления крахмала — глюкоза — образуется в незначительном ко­
личестве.
а-Амил азы условно делят на две группы: разжижающие и осахаривающие.
К первым относят ферменты, расщепляющие в растворимом крахмале или ами­
лозе не более 40 % гликозидных связей, ко вторым расщепляющие до 60 %. Так,
осахаривающая амилаза термофильного актиномицета гидролизует амилозу с об­
разованием 77 % мальтозы, 17 % мальтотриозы, 3,5 % мальтопентаозы и 2,5 %
глюкозы, что соответствует степени расщепления около 47 % гликозидных связей.
При действии бактериальных амилаз разжижающего типа на растворимый
крахмал предельная степень расщепления гликозидных связей составляет от 16 до
30 %, при этом в качестве основного продукта гидролиза может обнаруживаться
мальтогексаоза, мальтопентаоза или мальтоза. Бактериальные амилазы осахаривающего типа гидролизуют крахмал с образованием до 70 % мальтозы и глюкозы.
Амилаза микроскопических грибов относится к осахаривающему типу, при гид­
ролизе крахмала образуется до 87 % мальтозы и глюкозы.
Образование продуктов расщепления крахмала под действием а-амилазы
идет как по механизму гидролитической реакции, так и по механизму трансгликозилирования. Способность к трансгликозилированию более выражена у амилаз
осахаривающего типа.
В процессе трансгликозилирования образуются олигосахариды, являющиеся
хорошим субстратом для реакции гидролиза, что способствует более глубокому
расщеплению крахмала, повышению концентрации глюкозы и мальтозы в про­
дуктах реакции.
а-Амилазы очень широко распространены в органическом мире. Их находят
у низших и высших животных, растений, микроорганизмов. Наибольшее практи­
ческое применение имеют а-амилазы бактерий и микромицетов. Микроорганиз­
мы продуцируют а-амилазы с различными физико-химическими свойствами. Мо­
лекулярная масса фермента из различных источников составляет от 16 до 76 кДа.
Многие амилазы содержат кальций, в количестве от 1 до 30 грамм-атомов
на моль белка. Кальций существенен для проявления активности и стабильности
амилаз. Наличие кальция более характерно для амилаз разжижающего типа. Не­
которые грибные амилазы включают углеводный компонент.
Большинство исследованных амилаз проявляет активность в слабокислой
и нейтральной среде, в частности, производимая в крупном масштабе бактери­
альная а-амилаза из культуры В. зиЫШз имеет оптимум при рН около 6 (с неболь­
шими вариациями в зависимости от штамма-продуцента). Известны продуценты
кислой а-амилазы, относящиеся к родам ВасШиз, С1оз(гШит. Кислые амилазы
имеют оптимум при рН 2—4. Некоторые штаммы В. ИсИет/огтгз синтезируют
фермент, активный в щелочной зоне — при рН 9,5. Амилазы микроскопических
грибов имеют оптимум при рН 4—5.
Зона рН-стабильности исследованных а-амилаз широка. Так, фермент из
ВасШиз зр. АК-2 стабилен в зоне рН 5-12, из В. з(еаго1кегторкНиз — при рН 511, из С1оз(псИит зр. — при рН 2-6. Оптимальная температура для действия
а-амилазы мезофильных штаммов микроорганизмов обычно не превышает 70 °С.
Амилазы грибов имеют оптимум при 45-60 °С. Термофильные бактерии могут
синтезировать фермент с оптимумом 85—91 °С. Такие ферменты особенно ценят­
ся в промышленном биокэтализе.
а-Амилаза принадлежит к числу ферментов с достаточно высокой термо­
стабильностью. Мезофильные бактерии продуцируют фермент, стабильный при
температуре до 80 °С, чаще не выше 70 °С. Так а-амилаза В. ИсНепг/огтгя, вы­
пускаемая в виде коммерческого препарата «Термамил», в присутствии 1 ммоль
СаСЬ и 31,5 % крахмала не теряет активности при 90 °С, а при 100 °С время полуинактивации составляет более 3 ч. Амилаза термофильной бактерии штамма У-2
в растворе, содержащем 10 ммоль СаСЬ, сохраняет половину активности после
инкубации в течение 15 мин при температуре 93 °С.
В обоих примерах присутствие соли кальция существенно для термостабиль­
ности, в первом стабилизатором является также крахмал. В отсутствие стабили­
зирующих добавок время полуинактивации амилазы В. НсЬепг/огтгз составляет
не более 1 ч при температуре 70 °С, амилазы штамма У-2 — 15 мин при 74 °С.
Амилазы кальций-независимые (так называемые «истинные»), как правило, ме­
нее термостабильны, чем кальций-зависимые.
Совершенствование технологии микробных а-амилаз идет по двум основным
направлениям: создания препаратов высокой термостабильности для гидролиза
клейстеризованного крахмала и препаратов, пригодных для гидролиза сырого,
неклейстеризованного крахмала. Второй путь обещает в будущем переход к низ­
котемпературному расщеплению крахмала, что существенно сократит энергоза­
траты и упростит аппаратурное оформление процесса гидролиза.
Продуценты амилазы, гидролизующей сырой крахмал, найдены среди мик­
роорганизмов различных таксономических групп, в том числе бактерий вида
В. зиЫШз. Этот вид синтезирует фермент, не сорбирующийся на сыром крахмале,
в отличие от аналогичных грибных амилаз. Различные виды крахмала расщеп­
ляются на 28-39 %, в зависимости от источника крахмала. При сочетании бак­
териальной а-амилазы с грибной глюкоамилазой неклейстеризованный крахмал
гидролизуется на 95 % до ппокозы.
Р-Амилаза (а-1,4-глюкан-мальтогидролаза, КФ 3.2.1.2) — фермент экзотипа,
катализирующий последовательное отщепление мальтозы от нередуцирующего
конца молекул амилозы, амилопектина, амилодекстринов. Фермент расщепляет
в крахмале только а -1,4-гпикозидные связи. Сырой крахмал не гидролизует. Ами­
лоза гидролизуется полностью. Минимальный расщепляемый фрагмент — Г4
(четыре шюкозных остатка). От ветвей амилопектина отщепляется по 10-12 мальтозных остатков. Гидролиз амилопектина может идти до предпоследней связи,
граничащей с точкой ветвления. Нерасщепленные фрагменты амилопектина но­
сят название Р-предельных декстринов. В результате гидролиза крахмала Р-амилазой образуется 54—58 % мальтозы и 42-46 % предельных декстринов. Мальтоза
при отщеплении переходит в р-форму, что объясняет название фермента.
Р-Амилазу продуцируют высшие растения, микроорганизмы. Фермент содер­
жится в непроросшем зерне и солоде злаковых культур. Солод злаков долгое вре­
мя был единственным источником Р-амилазы, используемым в практике. Зерно-
вые р-амилазы наиболее активны при рН 4-6, стабильны при рН 4-8. Оптималь­
ная температура действия 40-50 °С, температура стабильности — не выше 60 °С.
Зерновые Р-амилазы — сульфгйдрильные ферменты, их активность подавляют
тяжелые металлы и окислительные агенты.
В зерне Р-амилаза присутствует в активной и латентной формах. При прорас­
тании латентная форма активируется под действием протеаз, осуществляющих
процессинг фермента.
Многие бактерии, в частности, бациллы синтезируют р-амилазу в значитель­
ных количествах. Фермент бацилл активен при рН 6-7,5, оптимальная темпера­
тура действия фермента из разных культур колеблется в пределах от 30 до 60 °С.
Бактериальная Р-амилаза стабильна при рН 5—9 и температуре не выше 55 °С.
Р-Амилаза редко используется как индивидуальный фермент. Ее осахаривающая способность существенно увеличивается при сочетании с а-амилазой. Ком­
плекс этих ферментов позволяет расщеплять крахмал на 94-96 % до мальтозы,
помимо которой в гидролизате присутствуют в небольшом количестве глюкоза
и низкомолекулярные а-1,6-декстрины.
Глюкоамилаза (а-1,4-глюкан-глюкогидролаза, КФ 3.2.1.3) — экзофермент,
катализирующий отщепление Р-глюкозы от нередуцирующего конца амилозы
и амилопектина. Глюкоамилаза расщепляет а -1,4, а -1,6 и а-1,3-гликозидные свя­
зи, с наибольшей скоростью — а -1,4. Механизм гидролиза — множественная ата­
ка, то есть последовательный гидролиз нескольких гликозидных связей в одной
молекуле субстрата. Возможен одноцепочечный механизм, когда фермент рас­
щепляет все связи в одной молекуле. Глюкоамилаза гидролизует предпочтительно
высокомолекулярный субстрат. Низкомолекулярные олигосахариды расщепляют­
ся медленно.
Фермент имеет выраженную трансферазную способность, которая проявля­
ется тем больше, чем выше степень гидролиза субстрата и концентрация глюкозы
в реакционной среде. В результате трансферазных реакций накапливаются такие
сахара, как изомальтоза, паноза, нигероза, измальтотриоза и др. Появление этих
продуктов снижает выход глюкозы. Поэтому в закрытой гидролитической систе­
ме, где глюкоза не удаляется из сферы реакции, теоретически невозможно достичь
полного превращения крахмала в глюкозу под действием глюкоамилазы.
В открытой системе, при удалении глюкозы, снижается интенсивность транс­
феразных реакций, повышается скорость гидролиза за счет снятия ингибирова­
ния продуктом реакции. В таких условиях можно достичь практически полного
гидролиза крахмала до глюкозы с помощью одного фермента. На практике пред­
почитают использовать глюкоамилазу для осахаривания частично декстринизированного крахмала. Глюкоамилазы широко распространены у животных и мик­
роорганизмов. Большинство глюкоамилаз — гликопротеины, содержание углево­
дов — до 35 %.
В промышленном биокатализе используют глюкоамилазы, продуцируемые
микроскопическими грибами. Грибные глюкоамилазы — белки с молекулярной
массой от 48 до 112 кДа. Максимальная активность проявляется при рН 4,3-5,9
и температуре 40—70 °С. Фермент из Авр. (еггеш активен в зоне рН 2—8. Глюко­
амилазы имеют низкую термостабильность, что не препятствует их применению
для осахаривания декстринизированного крахмала. Глюкоамилазы мукоровых
грибов способны гидролизовать крахмал на 95—100 %, фермент из пенициллов
и аспергиллов —- на 88-95 %.
а-Глюкозидаза (а-Б-глюкозид-глюкогидролаза, КФ 3.2.1.20), часто называе­
мая мальтазой, является экзоферментом. Глюкозидаза гидролизует а-1,4-связи на
нередуцирующем конце а -1,4-глюканов, отщепляя глюкозу в а-форме. Субстра­
тами а-глюкозидазы могут служить мальтоза, мальтоолигосахариды, сахароза,
амилодекстрины, амилоза, амилопектин, гликоген. В отличие от глюкоамилазы
мальтаза предпочтительно гидролизует низкомолекулярные субстраты. Крахмал
и гликоген расщепляют не все а-глюкозидазы.
а-Глюкозидаза имеет высокую глюкозилтрансферазную способность. В про­
цессе трансгликозилирования происходит разрыв и замыкание а-1,3; 1,4; 1,6; 2,1
и 2,6-гликозидных связей, так что наряду с линейными образуются разветвленные
сахара. а-Глюкозидаза из различных источников имеет разное соотношение гид­
ролитической и трансферазной способности.
Ферменты животного происхождения, а также выделенные из некоторых
штаммов пекарских дрожжей имеют очень низкую трансферазную способность.
Глюкозидаза большинства аспергиллов, дрожжеподобных грибов родов СапсНс1а
и ЕпАотусорш характеризуется высокой глюкозилтрансферазной способностью.
Реакции переноса проходят с разной интенсивностью в зависимости от концент­
рации субстрата. Так, мальтаза штамма Епс1отусор$1$ $р. 20-9 проявляет гидроли­
тическое действие при концентрации мальтозы от 1 до 10 %, а в 20-30%-ных рас­
творах наряду с гидролизом мальтозы осуществляется синтез продуктов с а -1,4
и а -1,6-гликозидными связями, в результате чего образуются изомальтоза и изомальтотриоза. При концентрации мальтозы 40-50 % отмечается высокая скорость
трансферазных реакций. Аналогичная закономерность имеет место при действии
мальтазы на крахмал.
а-Глюкозидазу активно^-синтезируют многие микроорганизмы, в том числе
различные виды бацилл, дрожжи сахаромицеты, микроскопические грибы — аспергиллы, пенициллы, мукоры. Фермент имеет молекулярную массу 35-85 кДа,
максимальная активность проявляется у бактериальных глюкозидаз при рН 6-7,
у большинства грибных — при рН 3-6. Оптимальная температура для действия
фермента 35-55 °С.
Пуллуланаза (пуллулан-6-глюканогидролаза, КФ 3.2.1.41) гидролизует а -1,6гликозидные связи в пуллулане, гликогене, амилопектине и предельных декстри­
нах, образующихся при действии на амилопектин а и р-амилаз. Гидролиз проис­
ходит по эндотипу, основной продукт расщепления пуллулана — мальтотриоза.
Пуллуланаза выделена из различных видов бактерий, преимущественно из
бацилл, и из актиномицетов. Фермент проявляет максимальную активность при
рН 5-7, некоторые штаммы бацилл продуцируют щелочную пуллуланазу с опти­
мумом действия при рН 8,5-9. Оптимальная температура — 45-60 °С. Стабиль-
ность пуллуланаз повышается в присутствии ионов кальция. Пуллуланаза наряду
с другими амилолитическими ферментами применяется в технологии сахаристых
продуктов, получаемых из крахмала.
Изоамилаза (гликоген-6-глюканогидролаза, КФ 3.2.1.68) гидролизует а -1,6гликозидные связи в ветвящихся субстратах, за исключением пуллулана. Слабо
гидролизует а-предельные декстрины. Полностью расщепляет гликозидные связи
в точках ветвления гликогена. Изоамилаза выделена из дрожжей, грибов, бактерий.
Фермент наиболее активен при рН 3-6 и температуре 25-50 °С. Используется в со­
четании с другими амилазами при получении сахаристых продуктов из крахмала.
Инулин представляет собой полимер 0-1,2-связанной фруктозы, у которого на
нередуцирующем конце имеется один остаток глюкопиранозы, присоединенный
1,1-гликозидной связью. Среднее число фруктозных остатков 30-40, молекуляр­
ная масса 5-6,5 кДа.
Ферментативный гидролиз инулина катализируют инулиназы (КФ 3.2.1.7).
Деградация происходит путем последовательного отщепления фруктозных ос­
татков со стороны фруктозного конца полимера, глюкоза появляется в продуктах
реакции только при степени гидролиза около 90 %. Механизм реакции — много­
цепочечная или множественная атака. Помимо инулина, инулиназы гидролизуют
сахарозу, инуло- и фруктоолигосахариды. Сродство к инулоолигосахаридам воз­
растает с увеличением степени полимеризации. В растворах с высокой концент­
рацией сахарозы и фруктоолигосахаридов инулиназы проявляют фруктозилтрансферазную способность, катализируя образование новых фруктозанов. Поэтому
в концентрированных растворах субстратов гидролиз не достигает полноты.
Биосинтез инулиназ широко распространен у микроорганизмов различных
таксономических групп. Исследованы инулиназы бактерий, микроскопичес­
ких грибов (аспергиллов, пенициллов), различных видов дрожжей. Пенициллы и аспергиллы синтезируют инулиназу как внеклеточный фермент, бактерии
В. НсИет/огтьз и дрожжи рода К1иууеготусез — как внутриклеточный.
Большинство инулиназ проявляет максимальную активность и стабильность
в слабокислой и нейтральной среде (рН 4-7), фермент из Аг1кгоЪас1ег игеа/аЫепз
стабилен в интервале рН 4—11. Оптимальная температура действия инулиназ
45-60 °С. Инулиназы — ферменты относительно невысокой термостабильности, лишь немногие выдерживают 1 ч при 50-60 °С без потери активности (это
ферменты из культур Реп. суЫортт, Реп. раШапз, дрожжей рода К1иу\>еготусез).
Стабилизаторы инулиназ — ионы калия, натрия, кальция, магния, марганца, ко­
бальта. Ингибиторы — ионы свинца, серебра, ртути.
Инулиназы внутриклеточной локализации, продуцируемые дрожжами К1иу\>еготусез тагххапиз, используются для получения фруктозо-глюкозного сиропа.
Клетки дрожжей иммобилизуют путем химической сшивки. Фермент иммобили­
зованных клеток имеет более высокий температурный оптимум и стабильность,
чем его растворимая форма, извлеченная из автолизированных клеток.
Для получения сахаров из инулина наряду с ферментативным используют
кислотный гидролиз, который может быть осуществлен в растворах минеральных
• |
кислот при рН 1-2 и температуре 80-100 °С. Полное расщепление достигается за
0,5-1 ч. Скорость гидролиза зависит только от величины активной кислотности
(рН), но не от природы аниона кислоты. Недостатком кислотного гидролиза явля­
ется деградация фруктозы.
Более удовлетворительные результаты дает применение электрохимически
активированной (ЭХА) воды. Гидролиз ЭХА-водой при рН 1,5 и температуре
100 °С в течение 40 мин позволяет получить из топинамбура сироп, в котором
после обычных процедур очистки находят сахара в следующем соотношении:
фруктоза — 85-91 %, глюкоза — 1,8-4,5 %, остальное — маннит, сорбит, инозит,
глюконовая кислота.
Из числа дисахаридов, подвергающихся гидролизу в процессах переработ­
ки растительного сырья, важнейшими являются целлобиоза, мальтоза, сахароза,
лактоза. Гидролиз целлобиозы не ставится как отдельная задача, а осуществля­
ется в ходе ферментации растительного сырья комплексом целлюлолитических
ферментов, например при получении глюкозы из целлюлозосодержащего сырья.
Полнота гидролиза целлобиозы в глюкозу достигается за счет оптимизации соста­
ва ферментативного комплекса и технических параметров проведения процесса
гидролиза.
Гидролиз мальтозы до глюкозы может быть осуществлен с помощью амилолитических ферментов (глюкоамилазы, а-глюкозидазы), как это имеет место при
получении сахаристых продуктов из крахмала. Примером процесса, где мальтоза
гидролизуется как основной углеводный компонент, является сбраживание пив­
ного сусла. Гидролиз катализирует а-глюкозидаза, локализованная в клеточных
стенках пивных дрожжей.
Необходимость гидролиза (инверсии) сахарозы возникает при приготовлении
концентрированных сахарных сиропов, мороженого, начинок для конфет. Пре­
вращение сахарозы в смесь сахаров различной пространственной конфигурации
предотвращает кристаллизацию сахара. Кроме того, инвертный сахар слаще са­
харозы.
Для гидролиза сахарозы используют фермент (З-фруктофуранозидазу (КФ
3.2.1.26), называемую также инвертазой, сахаразой, фруктозидазой. Гидролиз са­
харозы происходит по схеме:
Глюкозил-О-Фруктозил + НгО —| Глюкоза + Фруктоза
Инвертаза отщепляет концевой невосстанавливающий (3-1,2-связанный оста­
ток фруктозы не только от сахарозы, но и от других олигосахаридов, частично
гидролизует инулин. При гидролизе рафинозы из одной ее молекулы образуется
по одной молекуле лактозы и фруктозы.
Инвертаза имеет трансгликозилазную способность и может переносить фруктозил с сахарозы на другие олигосахариды. Единичная реакция переноса приво­
дит к образованию нового сахарида с фруктозильным остатком на конце и одной
молекулы глюкозы, освобождающейся из сахарозы при отделении фруктозила.
Из сахарозы по механизму трансгликозилирования могут синтезироваться полифруктозиды, например, леван.
Инвертазу выделяют из культур дрожжей и микроскопических грибов.
У дрожжей инвертаза локализована в клеточной стенке, где связана с маннаном.
Фермент освобождается из клетки в процессе автолиза. Грибы продуцируют вне­
клеточную инвертазу. Активными продуцентами инвертазы являются грибы ро­
дов Азрег^Шш, РетсШшт, Ригагшт, Нит1со1а, Ма1ЪгапсИеа, Ткегтотусез. Не­
которые штаммы этих грибов осмофильны и сахарозотолерантны, они способны
расти и развиваться на средах с концентрацией сахарозы 20-40 %.
Инвертаза — гликопротеин, молекулярная масса 47-270 кДа. Углеводная
часть молекулы у инвертазы дрожжей составляет 30-80 %, у мицелиальных гри­
бов — 10-12 %. Некоторые инвертазы имеют четвертичную структуру и состоят
из двух или четырех субъединиц с молекулярной массой около 50 кДа.
Инвертаза дрожжей сахаромицетов, грибов аспергиллов и пенициллов прояв­
ляет максимальную активность при рН 4-4,5 и температуре 45-55 °С, стабильна
при температуре до 60 °С. Дрожжевая инвертаза требует для стабилизации при­
сутствия сахарозы или глицерина. Необходимость в стабилизаторах объясняется
тем, что внутриклеточные ферменты при переходе в свободное состояние утрачи­
вают стабильность, которая внутри клетки обеспечивалась естественной иммо­
билизацией на соответствующих структурах. Отмечено повышение стабильности
инвертазы микроскопических грибов в растворах сахарозы, что связывают со ста­
билизирующим действием олигосахаридов, образующихся в растворах сахарозы
за счет трансгликозилазной активности инвертазы.
Гидролиз лактозы проводят при переработке продуктов растительного про­
исхождения совместно с молочным сырьем, как это имеет место в хлебопечении,
кондитерской и безалкогольной промышленности. Для гидролиза лактозы исполь­
зуется фермент Р-галактозидаза.
Р-Галактозидаза, или лактаза (КФ 3.2.1.23), отщепляет остаток галактозы от
нередуцирующего конца галактозидов — олигосахаридов, полисахаридов, глико­
липидов, гликопептидов, мукополисахаридов. Расщепляется связь между Сгатомом остатка галактозы и гликозидным атомом кислорода:
К-ОГалактозил + Н20 —> К-ОН + Галактоза
Гидролиз протекает с сохранением конфигурации субстрата. Фермент высо­
коспецифичен к конфигурации расщепляемой связи в структуре агликона. Агликон
в фуранозной форме не отщепляется. В структуре агликона допустимы вариации,
что позволяет использовать орто- или паранитрофенилгалактозид как субстраты
для определения активности Р-галактозидазы. При гидролизе таких субстратов
выделяется нитрофенол — соединение желтой окраски, по интенсивности кото­
рой судят об активности фермента. ’ ’
;
р-Галактозидаза относится к числу ферментов с выраженной трансгликози­
лазной способностью. Фермент катализирует перенос остатка галактозы с со­
хранением конфигурации на различные сахара и спирты. Р-Галактозидазу про­
дуцируют растения, животные, микроорганизмы разных таксономических групп.
Способность синтезировать фермент присуща многим, но не всем молочнокис­
лым бактериям. Микроорганизмы, лишенные этой способности, не сбраживают
лактозу.
Многие люди страдают лактазной недостаточностью, в том числе негроиды
и монголоиды на 75-100 %.
Препараты Р-галактозидазы выделяют из культур микроорганизмов. Дрож­
жи и бактерии синтезируют внутриклеточный фермент с высокой молекулярной
массой (200-600 кДа), имеющий субъединичную структуру. Оптимальный рН
6,9-7,2. Фермент теряет активность при температуре 40 °С. Активаторы фермен­
та — ионы магния и марганца.
Грибы синтезируют как внутриклеточную, так и внеклеточную форму р-галактозидазы. Вторая преобладает, что облегчает выделение ферментных препа­
ратов. Внеклеточная Р-галактозидаза грибов — гликопротеин с молекулярной
массой 115—176 кДа, субъединичной структуры не имеет. Не активируется метал­
лами. Оптимальный рН 3,6-5,3. Грибная Р-галактозидаза более стабильна, чем
внутриклеточный фермент дрожжей и бактерий: за час при 50 °С потери актив­
ности составляют около 30 %.
В качестве промышленных продуцентов Р-галактозидазы используют дрож­
жи, микроскопические грибы и бактерии. Фермент дрожжей и бактерий в сво­
бодном состоянии недостаточно стабилен, в качестве препаратов целесообразно
использовать высушенные или иммобилизованные клетки продуцентов. За рубе­
жом выделяют препараты Р-галактозидазы из культуры дрожжей К1иууеготусез
/га&Из.
Грибная Р-галактозидаза не только более стабильна, чем дрожжевая и бакте­
риальная, но имеет также более широкую субстратную специфичность, что объ­
ясняется значительной долей фракции внеклеточного фермента у грибов. Отечест­
венные препараты растворимой и иммобилизованной Р-галактозидазы получают
из культуры РетсННит сапезсет.
Гидролиз белков. Белки и пептиды расщепляют ферменты, объединяемые в под­
класс пептидгидролаз (КФ 3.4). Их называют также протеазами, протеолитическими ферментами. Пептидгидролазы расщепляют пептидную связь, которая явля­
ется одной из разновидностей амидной связи. Гидролиз идет по схеме:
... [Ш СН(К,)СО-Ш СН(Я2)СО]...
[ и 2о
... [ЫНСЩК, )СООН + ЫН2СН(К2)СО]...
Расщепление пептидной связи в точках, удаленных от конца молекулы, ката­
лизируют эндопептидазы. Их делят на четыре группы: сериновые (КФ 3.4.21), тиоловые (КФ 3.4.22), карбоксильные (КФ 3.4.23), металлосодержащие (КФ 3.4.24).
Отщепление концевых аминокислот и дипептидов, а также гидролиз ди­
пептидов катализируют экзопептидазы, которые разделяют на пять групп: аминопептидазы (КФ 3.4.11) — катализируют отщепление единичных аминокислот
от Т^-конца полипептиДной цепи; карбоксипептидазы (КФ 3.4.16, 3.4.17) — ка-
тализируют отщепление единичных аминокислот от С-конца; дипептидазы (КФ
3.4.13) — гидролизуют дипептиды; дипептидилпептидазы (КФ 3.4.14) — катали­
зируют отщепление дипептидов от Ы-конца; пептидилдипептидазы (КФ 3.4.15) —
катализируют отщепление дипептидов от С-конца полипептидной цепи.
Существующая классификация пептидгидролаз несовершенна, поскольку
в ней используются в качестве разграничительных различные признаки: деление
пептидаз на группы проведено по характеру действия на субстрат, а протеиназ —
по структуре каталитического центра.
В настоящее время описано несколько сот пептидгидролаз различного проис­
хождения. На основании этого обширного материала предлагаются новые вариан­
ты классификации, в частности, только по структуре каталитического центра.
Скорость ферментативного гидролиза белковых соединений определяется на­
личием в них пептидных связей, специфичных для действия фермента, а также
пространственной структурой субстрата. Последняя не является ограничиваю­
щим фактором при гидролизе коротких пептидов, где все пептидные связи до­
ступны расщеплению. В белках на ранних стадиях гидролиза часть специфичных
для действия фермента связей остается недоступной из-за особенностей конфи­
гурации молекулы.
На доступность пептидных связей гидролизу влияют вторичная, третичная
и четвертичная структура белков. Белки могут иметь один или два типа упоря­
доченных вторичных структур (а-спиральной и Р-складчатой), представленных
в различных сочетаниях и охватывающих более или менее значительную часть
полипептидной цепи. Для многих белков характерно наличие структурированных
участков — доменов, соединенных между собой участками с неупорядоченной
структурой цепи. В упорядоченных структурах полипептидные цепи экраниро­
ваны и недоступны действию ферментов. Чем выше степень упорядоченности
структуры, тем менее белок подвержен протеолизу.
Третичная структура белка, его геометрическая форма определяет соотно­
шение экспонированной и экранированной частей молекулы (то есть доступной
и недоступной протеолизу), а также колебания этого соотношения в пределах до­
пустимого изменения конформации нативного белка. Наименее доступны проте­
олизу молекулы с наименьшей удельной поверхностью, то есть приближающиеся
по форме к шару.
Четвертичную структуру имеют белковые молекулы, состоящие из субъеди­
ниц. Последние могут быть ассоциированы за счет ковалентных, ионных и водо­
родных связей. Ассоциация субъединиц снижает относительную величину экс­
понированной части молекулы, увеличивает ее конформационную стабильность
за счет внутримолекулярных взаимодействий. Ассоциированные молекулы менее
доступны действию ферментов, чем диссоциированные. Равновесие ассоциациидиссоциации сдвигается под влиянием внешних факторов, таких как реакция сре­
ды, ионная сила, присутствие хелатов, детергентов, восстановительных агентов
и пр. Эти факторы могут использоваться для регуляции ферментативного гидро­
лиза белков, имеющих четвертичную структуру.
Денатурация белков под действием различных физико-химических факторов
(высокой температуры, экстремальных значений рН, высокой концентрации мо­
чевины и др.) приводит к конформационным изменениям, которые в определен­
ных условиях могут быть необратимыми. Денатурация сопровождается разверты­
ванием полипептидной цепи, демаскированием прежде экранированных групп.
Снимаются ограничения доступности субстрата, обусловленные вторичной, тре­
тичной и четвертичной структурой.
Денатурированные белки гидролизуются в целом быстрее и полнее нативных.
В то же время в процессе денатурации могут происходить внутримолекулярные
химические реакции, в результате которых вторично экранируются какие-либо
участки полипептидной цепи или претерпевают превращения реакционные груп­
пы, существенные для катализа, что препятствует гидролитическому расщепле­
нию белка.
Различия в пространственной структуре белков, их конформационной подвиж­
ности, доступности тех или иных аминокислотных остатков внешним воздействи­
ям определяют разнообразие субстратной специфичности протеаз. Физиологичес­
кая роль протеаз определяется их участием в белковом обмене. Эту роль выполня­
ют как внутриклеточные, так и внеклеточные (секретируемые) протеазы.
Промышленные препараты протеолитических ферментов выделяют из сырья,
содержащего секретируемые ферменты. Среди них встречаются представители
всех групп эндопептидаз, а также аминопептидазы и карбоксипептидазы.
Сериновые протеиназы объединяют группу эндопептидаз, имеющих в ката­
литическом центре остаток серина. У большинства сериновых протеиназ в ката­
литическом центре находят аминокислотные остатки Асп 102, Гис 57 и Сер 195
(аспарагина, гистидина и серина соответственно). Сериновые протеазы ингиби­
руются агентами, взаимодействующими с остатком серина, такими как диизопропилфторфосфат (ОРР), фенилметилсульфонилфторид (РМ8Р), сульфогалогениды,
а также природными протеолитическими ингибиторами животного, растительного
и микробного происхождения.
Все сериновые протеиназы проявляют максимальную активность в нейтраль­
ной или щелочной среде. Молекулярная масса варьирует от 12-15 кДа у фермен­
тов с единственной полипептидной цепью до 200-300 кДа — у ферментов с субъединичной структурой. К группе сериновых протеиназ относятся ферменты жи­
вотного, растительного и микробного происхождения, многие из которых хорошо
изучены и выпускаются в виде промышленных препаратов.
В поджелудочной железе человека и млекопитающих животных синтезиру­
ются сериновые протеиназы — трипсин (КФ 3.4.21.4), химотрипсины А и В (КФ
3.4.21.1), химотрипсин С (КФ 3.4.21.2). Эти ферменты образуются первоначально
в виде предшественников (трипсиногена и химотрипсиногенов), которые превра­
щаются в активные формы под действием трипсина. При протеолитическом про­
цессинге трипсиногена от его молекулы отщепляется М-концевой гексапептид,
реакция активируется кальцием.
Активная форма трипсина — однокомпонентный белок, состоящий из един­
ственной полипептидной цепи. Фермент, выделенный из поджелудочной железы
человека и различных млекопитающих, имеет молекулярную массу 22,9-25,5 кДа,
рН-оптимум около 7-8. В организме трипсин стабилизируется с помощью инги­
битора, с которым образует неактивный комплекс, устойчивый к протеолизу. Ин­
гибитор синтезируется в поджелудочной железе.
Трипсин гидролизует пептидные связи, образованные карбоксилами аргини­
на или лизина. Существенно наличие свободной аминогруппы диаминокислот по
соседству с расщепляемой связью. Фермент гидролизует не только амидные, но
также сложноэфирные и лактонные связи. Он расщепляет различные животные
и растительные белки, проявляет высокую активность в отношении белковых
компонентов клеточных стенок микроорганизмов. Комплекс трипсина и логи­
ческой мурамидазы — лизоцима, секретируемого слизистой оболочкой кишечни­
ка, — является важнейшим фактором регуляции состава микрофлоры пищевари­
тельного тракта животных и человека.
Продукты триптического расщепления белков, в особенности казеина, также
влияют на состав кишечной микрофлоры, действуя на уровне регуляции автолиза
микроорганизмов.
Химотрипсины образуются из химотрипсиногенов после отщепления пепти­
да, состоящего из 15 аминокислотных остатков. Молекулярная масса химотрипсинов составляет 24-25,8 кДа, оптимальный рН 7—8. Химотрипсины предпоч­
тительно катализируют расщепление в белках пептидных связей, в образовании
которых участвуют карбоксилы ароматических аминокислот. Гидролизуют также
связи, образованные карбоксилами лейцина, метионина, триптофана. Химотрип­
сины, как и трипсин, расщепляют сложные эфиры и лактоны. Разнообразие типов
гидролизуемых связей определяет широкую специфичность действия химотрипсинов.
К семейству химотрипсина, помимо его разновидностей и трипсина, относят­
ся также сериновые протеиназы животного происхождения — эластаза, тромбин,
плазмин, тканевые сериновые протеиназы.
В группу сериновых входят многие внеклеточные и внутриклеточные про­
теиназы микроорганизмов. Классическими представителями секретируемых се­
риновых протеиназ бактерий являются субтилизины А, В и ВРЫ' из культуры
В. зиЫШз — белки с молекулярной массой 26,3-27,5 кДа, оптимумом действия
при рН 8-11. Многие бациллы продуцируют субтилизиноподобные сериновые
протеиназы. Для внеклеточных сериновых протеиназ бактерий характерен опти­
мум действия в щелочной зоне (рН 8-12,5), при температуре 50-70 °С. Ферменты
стабильны в зоне рН от 6 до 13, при температуре не выше 50 °С. В качестве стаби­
лизатора могут использоваться соли кальция.
К числу сериновых принадлежат внеклеточные бактериальные протеазы, об­
ладающие мощным литическим действием в отношении клеток микроорганизмов.
Это ферменты из АсИготоЪас1ег 1уИсиз, В. зиЫШз, МухоЪас1ег зр. — белки с моле­
кулярной массой 20-28 кДа, оптимумом литического действия при рН 7,8-9.
Внутриклеточные сериновые протеиназы бактерий по структуре сходны с вне­
клеточными, но в отличие от последних не являются их предшественниками. Ци-
топлазматические сериновые протеиназы бацилл в нативном виде являются диме­
рами с молекулярной массой 55 кДа, оптимумом действия при рН 7-10, стабильны
в нейтральной среде. Эти ферменты малоактивны по отношению к животным бел­
кам и смеси внутриклеточных белков В. зиЫШз. Считается, что они имеют моди­
фицирующие функции, но не участвуют в общей деградации белков клетки.
К сериновым относятся протеиназы А, В, С, О и Е актиномицета 8(гер(отусез
^ггзеиз — белки молекулярной массы 16-27 кДа с оптимумом действия при рН
8-10, входящие в комплекс ферментного препарата «Проназы», а также сходные
с ними трипсиноподобные сериновые протеиназы Ас1./гасИае и Ас1. птозиз. Сериновая протеиназа актиномицета 81герЮтусез зр. У8А-130 имеет оптимум рН 11,5,
стабильна при рН 4-12. Оптимальная температура 60 °С, стабильна при 50 °С.
ТИегтоасПпотусез зр. Н8 682 выделяет сериновую протеиназу с оптимумом при
рН 11,5—13 и температуре 70 °С, устойчивую в зоне рН 6-12, а в присутствии со­
лей кальция — при рН 4—14.
Многие виды микроскопических грибов (родов Асгетопшт, АНетапа,
Азрег§Шиз, СерИа1озропит, Ризапит, РетсИИит, ТпсИос1егта, УеШсИИит и др.)
синтезируют внеклеточные сериновые протеиназы. Большинство исследованных
ферментов этой группы имеют молекулярную массу 18-35 кДа, оптимум дей­
ствия — при рН от 5 до 12 и температуре 55-60 °С. Многие сериновые протеина­
зы грибов стабилизируются ионами кальция.
Сериновые протеиназы грибов могут проявлять эстеразную активность. Не­
которые способны расщеплять коллаген и эластин.
Сериновые протеиназы входят в состав комплексных ферментных препара­
тов, выделяемых из грибов аспергиллов. У Азр. огугае найдены разновидности
сериновых протеиназ, которые при действии на казеин проявляют максимальную
активность при рН 7—8,5 и 9—11,5. В соке растений присутствуют растворимые
формы субтилизиноподобных сериновых протеиназ. Их выделили из плодов
дыни, различных видов тыквы, томатов, плодов маклюры (семейство тутовых),
листьев подсолнечника, корней одуванчика, клубеньков ольхи.
Все исследованные растительные субтилизины — гликопротеины, фермент
из маклюры содержит 25,6 % углеводов. Они синтезируются в виде неактивных
предшественников ферментов, которые после протеолитического процессинга
превращаются в активные формы. Молекулярная масса активных форм — 5070 кДа, у подсолнечника 175 кДа. Оптимальный рН действия — в интервале 7,311 при температуре 55—70 °С. Стабильны при температуре не выше 50-60 °С.
Растительные субтилизины имеют широкую зону рН-стабильности: фермент
из тыквы — 5-10, дыни — 4-12, подсолнечника — 4—10. Гидролизуют казеин,
азоказеин, азоколлаген, гемоглобин и другие белки, преимущественно расщепляя
связи, образованные гидрофобными аминокислотами (лейцином, фенилалани­
ном, тирозином), с меньшей скоростью —- образованные цистеином, дикарбоновыми аминокислотами и их амидами.
Растения синтезируют различные ингибиторы ферментов, среди которых на­
иболее широко представлены ингибиторы сериновых протеиназ, в частности, ин­
гибиторы трипсина. Они найдены в семенах бобовых (сои, фасоли, гороха), злаков
(пшеницы, ржи, кукурузы), гречихи, клубнях картофеля, корнеплодах моркови,
яблоках, листьях капусты и других источниках. Ингибиторы трипсина предотвра­
щают инфицирование растений микроорганизмами и повреждение насекомыми,
поскольку большая часть патогенных микроорганизмов и насекомых-вредителей
синтезирует трипсиноподобные ферменты.
В семенах гречихи найден медленно взаимодействующий и прочно связываю­
щийся ингибитор трипсина, подавляющий прорастание спор и рост мицелия пато­
генного гриба АИетапа аНетаШ. В клубнях картофеля присутствуют две разно­
видности ингибиторов сериновых протеиназ с молекулярной массой 21 и 22 кДа.
Первый подавляет активность трипсина, химотрипсина и эластазы, второй — толь­
ко двух первых ферментов. Среди ингибиторов химотрипсина, синтезирующихся
в тканях картофеля, нашли высокоэффективный пептид массой всего 5 кДа.
Расшифровка структуры низкомолекулярного ингибитора перспективна в це­
лях создания синтетических аналогов для применения в качестве средств защиты
растений и медицинских препаратов.
В семенах сои содержится две разновидности ингибиторов трипсина: инги­
битор Кунитца и ингибитор Баумана - Бирк (ББИ). Второй способен одновремен­
но и независимо связывать на одном центре трипсин, а на другом — эластазу
лейкоцитов человека и химотрипсиноподобные ферменты, за что получил назва­
ние «двухголового». Показано, что ББИ обладает антиканцерогенным действием,
препятствуя метастазированию и росту злокачественных опухолей, происходяще­
му при участии лейкоцитарных ферментов химотрипсинового типа. Содержание
ББИ в разных сортах сои составляет от 0,5 до 1,5 мг/г семян, в некоторых видах
коммерческой соевой муки — до 1,9 мг/г. В семенах сои ББИ представлен не­
сколькими изоформами, число которых, в зависимости от сорта сои, составляет от
2 до 7. Высокая биологическая активность ББИ побудила пересмотреть выводы об
антипитательных свойствах соевых ингибиторов. Считают, что антипитательные
свойства связаны с присутствием в сое большого количества неспецифических
ферментных ингибиторов широкого спектра, а также гемагглютининов.
Помимо ингибиторов собственно сериновых протеиназ, растения синтезиру­
ют бифункциональные ингибиторы, подавляющие активность а-амилазы и сери­
новых протеиназ. Такие ингибиторы характерны для семян злаков. В процессах
гидролиза растительных белков необходимо принимать во внимание присутствие
ингибиторов в растительном сырье.
Сериновые протеиназы животного и микробного происхождения прочно
вошли в номенклатуру промышленных ферментных препаратов. Из животного
сырья производят трипсин, химотрипсин и комплексный препарат панкреатин
с активностью обоих этих ферментов. Из микробного сырья получают «Проназу», «Римопротелин», «Протосубтилин щелочной», «Амилопроторизин», «Лизосубтилин» и другие препараты.
Многие гидролитические ферментные препараты содержат внутриклеточ­
ные сериновые протеиназы в качестве сопутствующих ферментов. Присутствие
щелочных сериновых протеиназ в неочищенных ферментных препаратах может
приводить к потере активности различных ферментов за счет протеолитической
инактивации. Сериновые протеиназы могут долго сохранять активность в препа­
ратах других белков, будучи защищены субстратами.
Тиоловые (цистеиновые) протеиназы. В эту группу входят эндопептидазы,
для проявления каталитической активности которых необходима сульфгидрильная группа цистеина. Тиоловые протеиназы ингибируются парахлормеркурибензоатом (РСМВ), монойодуксусной кислотой (М1А) и другими окислителями,
а также ионами тяжелых металлов. Активируются восстановителями (2 -меркаптоэтанолом, дитиотреитолом, цистеином, бисульфитом натрия и пр.). Большинст­
во тиоловых протеиназ имеют рН-оптимум в слабокислой или нейтральной зоне.
К тиоловым принадлежат широко применяемые в практике протеиназы расти­
тельного происхождения — пап айн, химопапаины А и В, бромелаин, фицин.
Папаин (КФ 3.4.22.2) и химопапаины А и В (КФ 3.4.22.6) получают из млеч­
ного сока дынного дерева. Это ферменты с молекулярной массой 24,3-28 кДа,
оптимумом рН 6—7. Папаин стабилен в зоне рН 3—11, наибольшая стабильность
наблюдается при рН 5. В присутствии окислителей папаин быстро теряет актив­
ность, поэтому при работе с ним необходимо следить за окислительным потенци­
алом среды.
Бромелаин (КФ 3.4.22.4) выделяют из сока зрелых стеблей ананаса, фермент
имеет массу 35 кДа, оптимальный рН 5-6. Фицин (КФ 3.4.22.3), получаемый из
латекса тропического инжира, имеет молекулярную массу 23,8 кДа и оптималь­
ный рН 6 ,5-9,5.
Папаин, бромелаин, фицин — протеиназы широкой субстратной специфич­
ности. Они гидролизуют в белках пептидные связи, образованные лейцином или
глицином. Другие типы связей, в том числе характерные для специфичности пеп­
сина, трипсина, химотрипсина, карбоксипептидазы, также могут расщепляться,
хотя и с меньшей скоростью, благодаря этому растительные тиоловые протеиназы
гидролизуют белки более глубоко, чем сериновые и карбоксильные протеиназы
животного происхождения.
В растениях найдены ингибиторы цистеиновых протеиназ. Из клубней кар­
тофеля выделен белок с молекулярной массой 23 кДа, подавляющий активность
папаина, бромелаина и фицина. В семенах тыквы — ингибитор молекулярной
массой 7,5 кДа, эффективно подавляющий фицин и папаин, менее — химопапаин, на бромелаин не действует. В семенах сои содержатся две формы ингибито­
ра цистеиновых протеиназ — основная с молекулярной массой 14 кДа и минор­
ная — 8,2 кДа. Основной компонент ингибирует папаин, бромелаин, фицин, химопапаин. В его молекуле три дисульфидных моста, разрыв которых под действи­
ем восстановителей (цистеина, цистамина) приводит к обратимой инактивации.
Окислители реактивируют ингибитор.
Тиоловые протеиназы продуцируют эубактерии (клостридии, стрептококки,
стафилококки) и архебактерии. У грибов их находят редко. Микробные тиоловые
протеиназы наиболее активны при рН 7-8,8. Из культуры архебактерии Ругосос-
сиз $р. выделена уникальная тиоловая протеиназа. Фермент имеет оптимум при
рН 7 и температуре 110 °С, стабилен при 90 °С. Активируется цистеином.
Карбоксильные, или кислые, протеиназы широко распространены у животных
и эукариотических микроорганизмов. В каталитическом центре карбоксильных
протеиназ — две карбоксильные группы. Активность подавляют эпоксисоедине­
ния, диазокетоны, природные ингибиторы типа пепстатина. Карбоксильные про­
теиназы, за малым исключением, проявляют активность в кислой среде. К числу
кислых протеиназ относятся пепсины млекопитающих: пепсин А (КФ 3.4.23.1),
пепсин В (КФ 3.4.23.2) и пепсин С (КФ 3.4.23.3). Это белки молекулярной массой
31—40 кДа с оптимумом действия при рН 2—4.
В слизистой желудка человека синтезируется предшественник пепсина— пепсиноген (42 кДа), который превращается в пепсин (34-35 кДа) в присутствии кис­
лоты или автокаталитически, в результате гидролиза активным пепсином. Один
из пептидов, отщепляемых от пепсиногена, является ингибитором активного фер­
мента. Ингибитор имеет молекулярную массу 3,2 кДа, он соединяется с пепсином
при рН не ниже 5. В комплексе с ингибитором пепсин стабилен. В кислой сре­
де, при рН 2, происходит самопереваривание фермента, что защищает слизистую
оболочку желудка от разрушения.
Пепсин проявляет специфичность в отношении связей, образованных ами­
ногруппами тирозина или фенилаланина. Наличие свободной аминогруппы вбли­
зи пептидной связи препятствует гидролизу белка, а карбоксильной — увеличива­
ет скорость гидролиза. Пепсин расщепляет различные животные и растительные
белки, в том числе казеин, коллаген, плотин, эластин, кератин, гистон.
Способностью синтезировать кислые протеиназы обладают микроскопичес­
кие грибы — аспергиллы, пенициллы, мукоры, КЫгорт, ТпскоЛегта и др. Вне­
клеточные кислые протеиназы грибов — ферменты молекулярной массой от 30
до 100 кДа (чаще 32-39 кДа), с оптимумом действия при рН 2-4,6. Стабильны
в кислой среде (рН 2,5-6), в нейтральной среде быстро и необратимо инакти­
вируются. Оптимальная температура действия 55-75 °С, большинство исследо­
ванных кислых протеиназ устойчивы при температуре до 55 °С, некоторые при
60-65 ° С .
По специфичности действия кислые протеиназы грибов сходны с пепсином.
Они расщепляют пептидные связи, образованные ароматическими и другими гид­
рофобными аминокислотами с объемными боковыми цепями. Кислые протеиназы
грибов имеют широкую специфичность в отношении белковых субстратов. Фер­
мент из Азр. огугае расщепляет казеин, гемоглобин, белки сои, цитохром; фермент
из Мисо'г гепптиз — гемоглобин, казеин, бычий сывороточный альбумин.
Внеклеточные кислые протеиназы грибов, наряду с другими видами протеолитических ферментов, входят в состав комплексных ферментных препаратов,
таких как «Амилоризин», «Амилопроторизин», «Пектаваморин», «Пектофоетидин», «Целловиридин», «Целлюлаза-100» и др. Из аспергиллов выделяют очи­
щенные препараты кислой протеиназы, предназначенные для пищевой промыш­
ленности и медицины.
Металлосодержащие протеиназы — это ферменты, в каталитический центр
которых входит ион или ионы металлов, необходимые для проявления каталити­
ческой активности. Такими металлами чаще всего являются цинк, кобальт или
марганец. Некоторые металлопротеиназы содержат как единственный металл
кальций или магний. Кальций может входить в молекулу фермента также в качест­
ве ион-стабилизатора. Так, в металлопротеиназе В. зиЫШз цинк является катали­
тически активным металлом, а кальций — стабилизатором.
Металлы играют важную роль в каталитическом акте. С их помощью образу­
ется тройной координационный комплекс: фермент - металл - субстрат. При этом
стабилизируется высшее валентное состояние металла. Ионы металлов могут об­
разовывать координационные связи с атомами азота, серы, кислорода, имеющими
неподеленные пары электронов.
Все металлопротеиназы ингибируются хелатными агентами (ЕБТА, ЕОТА,
ортофенантролином и др.). Инактивация чаще всего носит обратимый характер.
При введении в среду избыточного количества соответствующего иона металла
или после удаления хелата диализом либо ультрафильтрацией активность восста­
навливается.
Металлопротеиназы широко распространены у бактерий, встречаются также
у микроскопических грибов. Бактериальные металлопротеиназы — белки с мо­
лекулярной массой 28-48 кДа, проявляющие максимальную активность при рН
6,5-9 и температуре 50-75 °С.
ВасШш зиЫШз — продуцент протеолитического ферментного препарата
«Протосубтилина», выделяет в среду две металлопротеиназы — А и Б — с мо­
лекулярной массой 44 и 40 кДа. Первая имеет оптимум при рН 7, вторая — при
рН 7,5 и 11. Основная активность связана с протеиназой А, которая менее термо­
стабильна, чем Б: за час при 60 °С протеиназа А подавляется полностью, а — на
22 %. Смесь очищенных протеиназ А и Б быстро инактивируется, при этом мо­
лекулярная масса каждого фермента снижается вдвое. Полагают, что протеиназа
Б разрушает А и автокаталитически расщепляется. Интересно отметить, что пре­
параты «Протосубтилина ГЗх» и «Протосубтилина Г10х» не имеют тенденции
к быстрой автокаталитической инактивации.
Нейтральная бактериальная металлопротеиназа из штамма В. аиЬШз 103 —
белок молекулярной массой 30,5-34 кДа с оптимумом действия при рН 7-7,5
и температуре 50 °С. Фермент стабилен при рН 7-8 и комнатной температуре.
Расщепляет преимущественно пептидные связи, образованные аминогруппами
гидрофобных аминокислот (фенилаланина, валина, норвалина). Не обладает ни
амидазной, ни эстеразной активностью. Гидролизует казеин, гемоглобин, жела­
тин, яичный и сывороточный альбумин, белки зерновых культур и клеточных сте­
нок микроорганизмов.
Из культуры термофильного штамма В. Ьгешз выделено три протеиназы, одна
из которых — нейтральная металлопротеиназа молекулярной массой 37-40 кДа
с оптимумом действия при рН 6,5-7 и температуре 70 °С.
Нейтральная металлопротеиназа препарата «Термолизин» из культуры тер­
мофильной бактерии В. (Иегторго(ео1уИсиз содержит ионы цинка и кальция, име­
ет молекулярную массу 37,5 кДа и оптимум при рН 8 .
Микроскопические грибы синтезируют металлопротеиназы молекулярной
массой 20-45 кДа. Среди них выделяют группу кислых ферментов, с оптимальным
рН 5-6, и нейтральных, с оптимумом рН около 7. Температурный оптимум лежит
обычно в пределах 45-55 °С, у металлопротеиназы Азр. зо/ае — при 65 °С.
Некоторые грибные металлопротеиназы имеют широкую рН-зону стабиль­
ности (Азр. зсуае — 3—11, Азр. огугае — 5,5-12). Среди металлопротеиназ аспер­
гиллов и пенициллов находят цинксодержащие ферменты (1 ион цинка на мо­
лекулу). Металлопротеиназы грибов различаются по широте субстратной специ­
фичности. Фермент из Реп.
гидролизует казеин, гемоглобин, протамин,
гистоны, слабо расщепляет эластин, желатин, фибрин.
Из амилолитического ферментного препарата «Амилоризина П 1Ох» выделена
металлопротеиназа гриба Азр. огугае. Фермент представляет собой кислый белок
с изоэлектрической точкой при рН 4,5 и молекулярной массой 41 кДа. Оптималь­
ный рН 5,6. Фермент активируется ионами кобальта, полностью ингибируется
хелатами.
'
- ..
]
*"
Аминопептидазы. Большинство аминопептидаз относится к числу металлоферментов. Для проявления их активности необходимы ионы цинка, кобальта,
марганца, магния, кальция. В каталитическом центре могут быть один или два
вида металлов. Ионы металлов прочно связаны в активном центре (каталитичес­
ки активные ионы) или выступают как активаторы, лабильно связанные с фер­
ментом. Хелаты и тяжелые металлы подавляют активность металлосодержащих
аминопептидаз.
Важной аминокислотой активного центра аминопептидаз является тирозин
и, возможно, гистидин. У некоторых аминопептидаз каталитически активной яв­
ляется сульфгидрильная группа цистеина, на что указывает ингибирование соля­
ми ртути и N-этилмалеинимидом.
Некоторые аминопептидазы относятся к числу сериновых. Аминопептидазы
выполняют важную роль в белковом обмене. Они входят в комплекс внутрикле­
точных ферментов, присутствующих в рибосомальной и мембранной фракциях.
Внутриклеточные аминопептидазы — крупные белки с молекулярной массой до
400 кДа, большинство их проявляет активность при рН 7-9.
Микроорганизмы, активно продуцирующие протеолитические ферменты,
синтезируют как внутриклеточные, так и внеклеточные аминопептидазы. Это ха­
рактерно для бактерий и актиномицетов. В состав препарата «Проназы» из куль­
туры актиномицета 81г. §пзеиз К-1 входит пять внеклеточных лейцинаминопептидаз. Два фермента с молекулярной массой 23 и 25 кДа имеют оптимум при рН
7,5-10, стабильны в зоне рН 6-11. Ингибируются ЕБТА. Стабилизатором актив­
ного состояния является кальций, в присутствии которого ферменты стабильны
при температуре до 70 °С.
Аминопептидазной активностью обладают препараты «Протелин» (проду­
цент — один из штаммов 8(г. %пзеиз) и «Римопротелин» (продуцент — 81г. /гасИае).
Металлозависимые аминопептидазы обнаружены в комплексных протеолиг тических препаратах из В. зиЫШз — бактерии, широко используемой в качестве
промышленного продуцента гидролитических ферментов. Аминопептидаза этой
бактерии, имеющая в классификации ферментов номер 3 .4 . 1 1 . 10 , содержит цинк
как каталитически активный металл и кобальт — как активатор. Молекулярная
масса фермента — 46,5 кДа.
Карбоксипептидазы широко представлены у животных, растений и микро­
организмов, они играют важную роль в белковом обмене. Среди карбоксипептидаз встречаются сериновые и металлоферменты, редко — тиоловые. В поджелу­
дочной железе синтезируются карбоксипептидазы А и В. Предшественники этих
ферментов активируются под действием трипсина. Карбоксипептидаза А — металлофермент, содержит один атом цинка на молекулу. В качестве активаторов
могут выступать и другие дивалентные металлы.
Молекулярная масса фермента 34,3 кДа, оптимальный рН 7,5, зона стабиль­
ности рН 6-10,2. Карбоксипептидаза В идентична по массе и содержанию цинка,
стабильна при рН 7-9. Оба фермента имеют как пептидазную, так и эстеразную
активность, соотношение которых можно регулировать введением в среду различ­
ных дивалентных ионов.
Карбоксипептидазы есть у многих покрытосеменных (томата, арбуза, фасо­
ли, шпината и др.). В клетках растений присутствуют как связанные, так и раст­
воримые формы карбоксипептидаз. Максимальную активность находят во фрак­
ции митохондрий. Все растительные карбоксипептидазы — кислые белки с изоэлектрической точкой при рН 4,3-5,4. Молекулярная масса 90-175 кДа. Опти­
мальный рН 5-5,6, стабильны в зоне рН 4—6. Оптимальная температура действия
40-50 °С.
Большинство растительных карбоксипептидаз относится к сериновым фер­
ментам. Из их числа — уникальная карбоксипептидаза фасоли, способная отщеп­
лять с С-концов белков все аминокислоты, за исключением аспарагиновой. Пред­
почтительно наличие на С-конце аминокислоты с длинной алифатической цепью,
а по соседству с ней — ароматической аминокислоты.
Карбоксипептидаза из кожуры апельсина является металлоферментом, содер­
жащим 3 ,6 атома цинка на молекулу. Фермент отщепляет с С-конца белков арома­
тические, кислые аминокислоты и пролин. Приведенные примеры свидетельству­
ют о широкой субстратной специфичности растительных карбоксипептидаз.
Из культур микроорганизмов выделено несколько десятков различных кар­
боксипептидаз, шесть из них включены в номенклатуру ферментов. Карбоксипеп­
тидазы входят в состав комплекса внутриклеточных протеолитических ферментов
микроорганизмов, они локализуются в мембранах, у дрожжей— также в вакуолях.
Многие микроорганизмы продуцируют как внутриклеточные, так и внеклеточные
карбоксипептидазы. Это свойственно микроскопическим грибам (аспергиллам,
пенициллам, мукорам и др.), а также актиномицетам. Микроорганизмы могут
синтезировать по несколько карбоксипептидаз, из культуры Аар. огугае выделено
четыре разновидности фермента.
Микробные карбоксипептидазы — белки молекулярной массы от 30 до
160 кДа. Оптимальный рН действия для грибных карбоксипептидаз 3,0-6,8 , для
бактериальных — 8 ,0-9,8 . Оптимальная температура действия карбоксипептидаз
Азр. огугае 40-50 °С, В. з{еаго(ИегторИНиз 55 °С. Ферменты аспергилла стабиль­
ны при температуре до 50 °С.
Карбоксипептидазы микроорганизмов могут иметь различную структуру ак­
тивного центра. У некоторых грибов и актиномицетов они являются металпоферментами, для проявления активности которых необходимы ионы цинка, марган­
ца, магния, кальция. Цинк и кальций присутствуют в каталитическом центре кар­
боксипептидазы стрептомицета (продуцента препарата «Проназы»), цинк найден
в составе карбоксипептидаз СогупеЬас1. еды/ и Рзеидотопаз. Известны микробные
карбоксипептидазы, не содержащие прочно связанных металлов, но активирую­
щиеся в присутствии ионов металлов.
Карбоксипептидаза пекарских дрожжей с оптимумом при рН 4—6 принадлежит
к группе сериновых, так же как нейтральная О-аланинкарбоксипептидаза некото­
рых стрептомицетов и бацилл. Нейтральная Б-аланинкарбоксипептидаза кишеч­
ной палочки — тиоловый фермент. Среди микроскопическихгрибов (аспергиллов,
пенициллов и др.) широко распространена способность секретировать в среду се­
риновые карбоксипептидазы с оптимумом действия в слабокислой среде.
Карбоксипептидазы микроскопических грибов характеризуются широкой
субстратной специфичностью, что в значительной мере определяет способность
грибных ферментных препаратов катализировать глубокое расщепление расти­
тельных и животных белков. Карбоксипептидазы пенициллов отщепляют от пеп­
тидов остатки пролина, лизина, аргинина, глицина, дикарбоновых аминокислот.
Кислая карбоксипептидаза Азр. заИо '1 последовательно отщепляет все аминокис­
лоты от нативного инсулина и некоторых других пептидов. Аналогичный фер­
мент Азр. зо)ае глубоко расщепляет соевый белок.
Правила использования протеолитических ферментов. При практическом ис­
пользовании протеолитических ферментов для гидролиза белков следует прини­
мать во внимание следующие соображения:
1. Большинство индивидуальных протеолитических ферментов гидролизуют
белки и пептиды не полностью. Поэтому для глубокого гидролиза предпоч­
тительно применять ферментные комплексы, состоящие из пептидгидролаз
различной специфичности.
2. Полнота гидролиза белков зависит не только от специфичности применяе­
мых ферментов, но и от конформационного состояния белков. Нативные, и в
особенности ассоциированные, белки гидролизуются труднее денатуриро­
ванных. Степень гидролиза нативных белков зависит от их растворимости,
для белков низкой растворимости — от степени измельчения субстрата (чем
выше степень измельчения, тем больше площадь контакта белка с фермен­
том).
3. Для глубокого гидролиза белков наиболее целесообразно использовать ком­
плексные ферментные препараты из культур микроорганизмов. В комплек-
сы микробных пептидгидролаз входят внеклеточные и внутриклеточные
ферменты различной специфичности. В составе ферментных препаратов
преобладают внеклеточные ферменты.
4. При выборе ферментного препарата нужно руководствоваться примерным
составом протеолитического комплекса продуцента, физико-химическими
и каталитическими характеристиками компонентов комплекса. Наиболее
употребительными являются препараты внеклеточных протеолитических
ферментов бацилл, аспергиллов, актиномицетов.
5. В протеолитический комплекс бацилл входят нейтральные металлопроте­
иназы, щелочные сериновые протеиназы, металлосодержащие аминопепти­
дазы, нейтральные сериновые карбоксипептидазы. Для бактериальных пре­
паратов характерно преобладание активности одного фермента эндотипа (из
группы протеиназ).
6 . Комплекс аспергиллов включает кислые карбоксильные, щелочные серино­
вые и кислые металлопротеиназы, а также карбоксипептидазы. Общая протеолитическая активность проявляется в кислой среде. В комплексе выраже­
ны активности как эндо-, так и экзоферментов, что обеспечивает глубокий
гидролиз белка.
7. В комплексах актиномицетов содержится обычно не менее 7 ферментов
с протеолэтической активностью. Из препарата «Проназы» выделяют 11-13
протеолитических компонентов. Для актиномицетных комплексов в целом
характерна максимальная активность в зоне рН 8-9,5, при температуре 3050 °С, в большинстве случаев ионы кальция стабилизируют активность.
Актиномицеты продуцируют следующие виды внеклеточных протеолитических
ферментов: нейтральные металлопротеиназы, щелочные сериновые протеиназы
трипсинового и химотрипсинового типов, карбоксипептидазы и металлосодержа­
щие лейцинаминопептидазы. Комплексы актиномицетов катализируют глубокий
гидролиз белков, в том числе труднорастворимых.
Гидролиз липидов. Липазы (триацилглицеролацилгидролазы, КФ 3.1.1.3) явля­
ются универсальными ферментами, используемыми для преобразования липидов.
Субстратами липаз являются глицериды и другие сложные эфиры. Липазы более
других представителей класса гидролаз обладают способностью катализировать
различные типы реакций:
гидролиз эфиров: Я-СОО-Я| + НгО —+ Я-СООН + К.1-ОН;
синтез эфиров: Я-СООН + НО-Я| —* Я-СОО-Я 1 + Н,0;
трансэтерификация (ацидолиз): Я-СОО—Я) + Кг-ООН —| Я2-ОО-К .1 + Я-СООН;
трансэтерификация (алкоголиз): Я-СОО-Я 1 + НО-Яг —* Я-СОО-Яг + НО-Яь
интерэтерификация: Я-СОО-Я| + Яг-СОО—Яз —►Я-СОО-Ял + Яг—СОО—Яг;
аминолиз: Я-СОО-Я, + Н2Ы-Я2 -♦ Я -С О -Ш -Я 2 + НО-Я,.
5-19739
Гидролитическое расщепление жиров липазами протекает с заметной скоро­
стью в средах с концентрацией воды не менее 1 %. Реакция происходит в гетеро­
генной среде на границе раздела фаз липиды-вода, скорость ее зависит от степени
дисперсности субстрата.
Липазы проявляют специфичность в отношении оптических изомеров эфи­
ров (стереоспецифичность), позиционную, глицеридную и жирнокислотную спе­
цифичность. По позиционной специфичности липазы делят на две группы: пози­
ционно неспецифичные, освобождающие при гидролизе триглицеридов жирные
кислоты из всех трех позиций, и 1,3-специфичные.
Примерами позиционно неспецифичных служат липазы Сапс/Иа суНпЛгасеа,
Сео1псИит сапдМит, Рзеидотопаз зр. 1,3-Специфичны липазы грибов Азр. т%ег,
СапсЛс/а Нр1уПса, рода Ш ю риз, а также панкреатическая липаза. У большинства
исследованных липаз не отмечено стереоспецифичности, различающей позиции
1 и 3 в глицеридах. Лишь относительно липазы золотистого стафилококка извест­
но, что она гидролизует эфирные связи позиции 3 в 10 раз медленнее, чем пози­
ции 1 .
" Я *|
При длительном гидролизе глицеридов 1,3-специфичные липазы способны
отщеплять жирные кислоты из всех положений, поскольку 2 -моноглицериды
и 1 ,2 -диглицериды, как менее конформационностабильные, самопроизвольно изомеризуются в 1-моноглицериды и 1,3-диглицериды. Липазы со специфичностью
к позиции 2, по-видимому, менее распространены, чем иные. Такая липаза найде­
на у С. суНпс/гасеа.
Жирнокислотная специфичность липаз выражается в предпочтении к жир­
ным кислотам определенной длины цепи. В целом липазы легко отделяют жирные
кислоты средней длины. Это характерно для липаз микроскопических грибов, за
исключением пенициллов. Липаза Реп. гофлё^огИ предпочитает жирные кислоты
с короткой цепочкой и практически не катализирует отщепление длинноцепочеч­
ных жирных кислот. Липазы Авр. пщег и С. Иро1уйса не ограничены в специфич­
ности к длине цепи жирных кислот, а липаза С. сапсНс/ит специфична по отно­
шению к длинноцепочечным жирным кислотам, содержащим цис-двойные связи
в омега-9-позиции, таким как олеиновая, линолевая, линоленовая и т. п.
Глицеридная специфичность выражена не у всех липаз. Фермент из Реп. сус1оршт гидролизует моноглицериды и диглицериды и практически не действует
на триглицериды.
Микробные липазы — ферменты с молекулярной массой 30-55 кДа, опти­
мальная температура действия не превышает 65 °С, оптимальный рН большин­
ства исследованных липаз лежит в слабокислой и нейтральной зоне. Бактерии
рода Рзеидотопаз продуцируют щелочные липазы и липазы с широкой зоной рНоптимума.
Липазы микроорганизмов имеют умеренную термостабильность. Потери ак­
тивности за полчаса составляют для липазы Ш гориз туеиз — 40 % при 50 °С, Рз
Пиогезсепз - 40 % при 60 °С, К. ]аротсиз — 50 % при 55 °С. Термостабильность
липаз снижается в микроводных средах. Для проведения длительных процессов
микроводных средах используют липазы, иммобилизованные на твердых и ге
юбразных носителях (хитине, цеолите, церамиде, смоле Дауэкс, в фотопопереч
альгината кальция). Иммобилизация
стабильность липаз. Липаза Ра.}1иогезсепз
МША-1», сохраняла 73 % активности поел
С в концентрированном субстрате.
3.2.3. Негидролитические реакции
В процессах переработки растительного сырья наряду с гидролитическими ис­
пользуются реакции, катализируемые оксидоредуктазами, трансферазами, лиазами и изомеразами. Негидролитические ферменты используются на различных
стадиях технологии пищевых продуктов. Трансферазы и лиазы применяются
на стадиях первичного преобразования исходных субстратов, например, циклодекстринглюканотрансфераза
получении циклодекстринов из крахмала
пектинтрансэлнминаза — для
катализируемые
ферментами
;оредуктаз и изомераз применяются преимущественно
заключительных
нения пищевых и вкусовых достоинств пищевых продуктов или модификации
органолептических свойств.
Следует помнить, что представители всех классов ферментов в тех или иных
количествах присутствуют в перерабатываемом растительном сырье и фермен­
тативная активность самого сырья неизбежно влияет на ход технологических
процессов переработки. Это влияние может быть как полезным, так и вредным.
Во втором случае необходимо регулировать ферментативную активность в сырье
путем его предварительной обработки или введения технологически допустимых
компонентов. Примерами нежелательных реакций являются окислительные пре­
вращения органических соединений в растительном сырье, такие как потемнение
измельченных овощей и фруктов под действием тирозиназы и дифенолоксидазы,
а также прогоркание жиров, провоцируемое липоксигеназой.
Окислительно-восстановительные реакции. Каталаза (КФ 1.11.1.6) — универ­
сальный фермент органического мира, участвующий в заключительных стадиях
процессов окисления. Под действием каталазы происходит расщепление перекиси
водорода на воду и кислород. Фермент способен также катализировать окисление
спиртов в альдегиды, сопряженное с окислением перекиси водорода (тип реакции
характерен для средч; низким содержанием перекиси водорода):
Каталаза + Н20
Каталаза • Н20
Каталаза + Н20 2 + С2Н5ОН ?=* Каталаза + Н20 + СН3СНО
Каталаза — геминовый фермент, содержащий тетрапиррольное кольцо. В мо­
лекулу входит четыре атома трехвалентного железа. Молекулярная масса фермен­
та 240-300 кДа, в зависимости от источника выделения. Для каталазы характерна
субъединичная структура, фермент может существовать в виде тетрамера и гек­
самера.
В пищевой промышленности используются препараты каталазы микробного
происхождения, выделяемые из грибов пенициллов. Каталаза Р уг(а1е имеет ши­
рокий рН-оптимум — от 4 до 9, стабильна при температуре до 65 °С.
Глюкозооксидаза (КФ 1.1.3.4) катализирует окисление глюкозы в глюконовую
кислоту:
;^
Глюкоза + Ог + НгО —* Глюконовая кислота + Н2О2
Выделяют две стадии реакции. Первая является ферментативной, а вторая
протекает самопроизвольно:
ГлЮКОЗа +
02
Глюкозооксидаза ) &.ГлЮКОНОЛаКТОН +
Н 20 2
5-Глюконолактон + Н2О —* Глюконовая кислота
Окисление молекулярным кислородом происходит при участии ФАД, две мо­
лекулы которого входят в состав глюкозооксидазы.
В пищевой технологии ппокозооксидазу используют совместно с каталазой,
поскольку необходимо разлагать перекись водорода, образующуюся на первой
стадии окисления глюкозы глюкозооксидазой:
2 Глюкоза + 2 0 2 + 2Н20
Глюкозооксидаза ) 2 Г л ю к о н о в а я киСЛОТЗ +
2Н 20 2
2Н 20 2
Каталаза >2Н20 + С
Общий баланс процессов, протекающих под действием двух ферментов, вы­
глядит так:
1
2 Глюкоза + Ог —*■2 Глюконовая кислота
______________
•
4
______________
Промышленные препараты глюкозооксидазы выделяют из культур микроско­
пических грибов. Активные продуценты внеклеточной глюкозооксидазы — грибы
РетсШит и Та1аготусез, наиболее перспективны виды Р. уИа1е, Р. ата^азаИепзе
и Р. /ипгсиЬзит. Фермент из Р. \Иа1е имеет молекулярную массу 150 кДа, опти­
мальный рН 5,6-5,8 , стабилен в зоне рН 3-7 при температуре до 50 °С. Ингибито­
ры — ионы ртути и меди, стабилизаторы — ионы кальция и аммония.
Учитывая сопряженность действия глюкозооксидазы и каталазы, эти фермен­
ты выделяют не только как индивидуальные, но и в виде комплексных препара­
тов. Грибы пенициллы и аспергиллы обладают способностью продуцировать зна­
чительные количества обоих ферментов. Пероксидаза (КФ 1.11.1.7) катализирует
окисление органических соединений с помощью перекиси водорода и органичес­
ких перекисей, например, образующихся из ненасыщенных жирных кислот, каро­
тиноидов. Фермент переносит водород от молекулы субстрата к перекиси.
Субстратами пероксидазы служат различные соединения — фенолы (пиро­
катехин, пирогаллол, гидрохинон, резорцин, гваякол), ароматические кислоты
(бензойная, салициловая, галловая), аскорбиновая кислота, анилин, толуидин,
нитриты и другие соединения. Фермент обладает не только пероксидазными, но
и оксидазными свойствами, то есть окисляет органические соединения за счет
неактивированного молекулярного кислорода. Большинство субстратов перокси­
дазы — фенолы. Под действием фермента они окисляются до хинонов, которые
сами по себе являются сильными окислителями. Хиноны склонны к полимериза­
ции, в результате образуются темноокрашенные соединения.
Пероксидаза присутствует в каждой растительной клетке. Этот фермент
участвует в циклах фотосинтеза и дыхания, играет существенную роль в защите
растений от инфекционных поражений. Наблюдается положительная корреляция
между степенью повреждения растения, концентрацией фенолов и активностью
пероксидазы. Поэтому при переработке инфицированного растительного сырья
уровень окислительных процессов в целом выше, чем при переработке интактного, неповрежденного материала.
Пероксидаза — двухкомпонентный фермент, состоящий из белка гликопро­
теина и геминового компонента, который включает протопорфирин IX и ион
трехвалентного железа. Геми но вый компонент выполняет роль активного центра.
Фермент из различных источников имеет молекулярную массу от 22 до 44 кДя;
белковая часть на 43 % спирализована.
Пероксидаза представлена в растениях набором изоферментов, число их у од­
ного вида может составлять от 3 до 42. Из разных видов табака выделили 33 изо­
фермента пероксидазы. Наличие изоферментов расширяет границы функциони­
рования пероксидазы, она проявляет активность в зоне рН 3-14. При изменении
внешних условий и гомеостаза растения изменяется изоферментный состав пе­
роксидазы, что является приспособительным механизмом.
Регуляция действия пероксидазы осуществляется с помощью ионов метал­
лов — марганца, цинка, меди, кальция и др. Их присутствие влияет на соотноше­
ние собственно пероксидазной, оксидазной и оксигеназной активности. Ингиби­
торами пероксидазы являются цианиды и хелаты. С помощью хелатов, таких как
ЭДТА, лимонная кислота и ее соли, можно предотвратить окислительные реак­
ции, происходящие в растительном сырье под действием пероксидазы.
о-Дифенолоксидаза относится к фенолоксидазам, имеющим в номенклатуре
ферментов (1979 г.) лишь один номер — КФ 1.14.18.1 (прежнее название — поли­
фенолоксидаза), катализирует окисление дифенолов, полифенолов, монофенолов,
дубильных веществ с помощью кислорода воздуха. Наименее устойчивы к окис­
лению о-дифенолы, у которых гидроксильные группы расположены при соседних
углеродных атомах (рис. 3.2).
Дифенолоксидаза —| универсальный растительный фермент, присутствую­
щий во всех органах и тканях. Субстратная специфичность дифенолоксидазы за­
висит от источника выделения фермента. Она различна у изоформ, выделеных из
одного растения. о-Дифенолоксидаза относится к медьсодержащим ферментам.
+
Оо
Фермент
2
2Н20
V
Пирокатехин
1
1,2-Бензохинон
Рис. 3.2. Окисление пирокатехина дифенолоксидазой
фермента
натрия
активности оптимален
рН 5-7.
дифенолоксидазы растительные фенолы окисляются
ны, которые, конденсируясь, превращаются в меланины. Конденсация хинонов
протекает по свободнорадикальному механизму. Цвет меланинов зависит от их
молекулярной массы. Чем крупнее молекула, тем темнее окраска, по мере уве­
личения молекулярной массы цвет меняется от розового до черного. Окисление
фенолов под действием дифенолоксидазы и тирозиназы (тирозин-3-монооксигефруктов при чистк
ферментации также
присутствии дифенолокси
практике для
а и фруктов и<
тивация дифенолоксидазы или разобщение фермента с кислородом. Для инакти­
вации используют обработку паром или горячей водой (бланширование), а также
подкисление: при рН ниже 3 фермент нестабилен. Применение восстанавливаю­
щих агентов, таких как аскорбиновая кислота, сернистый газ и бисульфит натрия,
приостанавливает потемнение продуктов: в присутствии этих агентов происходит
восстановление о-хинонов в фенолы и подавляется процесс конденсации хино­
нов. Введение восстановительных агентов в начальный момент контакта расти­
тельного сырья с кислородом можно-рассматривать как разобщение фермента
с кислородом, который связывают восстановители.
материала
кую обработку (очистку, резку)
кислота обладает хелатным действием, она связывает каталитически активные
ионы меди, что приводит к подавлению активности дифенолоксидазы. Своевре­
менное погружение растительного материала в воду (а еще лучше — в слегка под­
соленную воду) также достаточно эффективно. Процессы окисления развиваются
во времени, и если материал тотчас залить водой, разобщив тем самым с кислоро­
дом воздуха, можно предотвратить потемнение.
Липоксигеназа (КФ 1.13.11.12) катализирует окисление полиненасыщенных
жирных кислот, содержащих цис-цис-1,4-пентадиеновую группу (линолевой, линоленовой, арахидоновой), и их эфиров. Окисление происходит за счет молеку­
лярного кислорода. Ненасыщенные жирные кислоты превращаются в гидрооксикислоты, при этом изменяется положение двойной связи.
Гидроперекиси жирных кислот — активные окислительные агенты, способ­
ные окислять ненасыщенные жирные кислоты, каротиноиды, хлорофилл, амино­
кислоты, аскорбиновую кислоту. Таким образом, действие липоксигеназы иници­
ирует целый ряд различных окислительных реакций в растительном сырье. Вы­
сокая липоксигеназная активность выявлена у покоящихся семян бобовых и льна,
в зародышах злаков. В семенах подсолнечника, рапса, конопли, ореха активность
фермента невелика, она возрастает при прорастании семян.
Липоксигеназа — железосодержащий глобулин. Молекулярная масса расти­
тельных липоксигеназ лежит в пределах 67-108 кДа, оптимальный рН 6 ,2-7,5,
температура 20—40 °С. Изоформа соевой липоксигеназы, катализирующая окис­
ление свободной линолевой кислоты, активируется ионами кальция.
Наличие липоксигеназы в зерне злаков положительно влияет на качество
муки: гидроперекиси жирных кислот окисляют сульфгидрильные связи в зерно­
вом белке, образующиеся дисульфидные связи упрочняют его структуру и делают
белок менее чувствительным к протеолитическим ферментам. Окислительная де­
градация каротиноидов приводит к отбеливанию муки.
Образование гидроперекисей жирных кислот — начальная стадия их деграда­
ции, в процессе которой образуются летучие вещества, создающие характерный
запах прогоркающих масел, муки, круп при их длительном хранении.
Для предотвращения отрицательных последствий действия липоксигеназы
в хранящихся продуктах предпринимают различные меры. Во избежание прогоркания муки при помоле зерна отделяют фракцию зародышей — наиболее богатую
липоксигеназой часть зерна. При расфасовке растительных масел и жиросодержа­
щих продуктов по возможности исключают попадание кислорода или используют
специальные упаковочные материалы, на которые нанесен фермент глюкозоок­
сидаза, ее субстрат глюкоза и буферные соли (система, поглощающая кислород
в реакции окисления глюкозы в глюконовую кислоту).
Широкое применение нашли различные антиоксиданты — токоферолы, каро­
тиноиды, янтарная и фумаровая кислоты, флавоноиды (морин, кемпферол, мирицетин, кверцетин, дигидрокверцетин и др.), аскорбиновая кислота, растительные
экстракты, содержащие комплекс различных антиоксидантов.
Механизм действия антиоксидантов различен. В модельных опытах по изуче­
нию влияния а-токоферола на окисление линолевой кислоты липоксигеназой из
клубней картофеля было установлено, что характер действия токоферола зависит
от его концентрации в реакционной среде.
При концентрации ниже 5 мкмоль реализуется в основном механизм взаи­
модействия а-токоферола и липоксигеназы, что приводит к необратимому инги­
бированию фермента. При более высокой концентрации а-токоферол образует
ассоциаты, структурно не способные взаимодействовать с липоксигеназой, но
в них наиболее эффективно реализуется способность а-токоферола нейтрализовывать высокоэнергетические и радикальные частицы, то есть его стабили­
зирующее действие. Оно наиболее выражено при концентрации а-токоферола
10-25 мкмоль, когда фермент наилучшим образом защищен от деструкции и ин­
гибирования продуктами окисления и потому наиболее активен. При концентра­
ции выше 25 мкмоль токоферол существует в высокоагрегированном состоянии,
затрудняющем проявление им биологических свойств.
Найденные пределы концентрации характерного поведения токоферола не
могут быть непосредственно перенесены на реальные объекты сложного состава,
полученные данные свидетельствуют о необходимости детального исследования
поведения стабилизатора при его использовании в практике.
Из числа изомеров токоферола наибольшей антиоксидантной способностью
обладают у- и 8 -токоферолы, но в качестве пищевой антиоксидантной добавки ис­
пользуют а-форму с наиболее высокой витаминной активностью. Антиоксидантные свойства токоферола повышаются в присутствии аскорбиновой кислоты и ее
жирорастворимой формы — аскорбилпальмитата. Для стабилизации раститель­
ных масел рекомендуют концентрацию а-токоферола 50-80 мг/100 г продукта.
Фумаровая кислота, имеющая двойную связь, может участвовать в образова­
нии фермент-субстратного комплекса с липоксигеназой (вместо истинного суб­
страта — линолевой кислоты) и является типичным конкурентным ингибитором
липоксигеназы, как это показано на примере фермента, выделенного из пшенич­
ных зародышей.
(
Антиоксидантные свойства янтарной кислоты связывают с ее хорошей окисляемостью, что предотвращает перекисное окисление липидов (окислительная
способность гидроперекисей реализуется в окислении янтарной кислоты, а не
следующих порций липидов). Янтарная кислота рекомендуется как средство по­
вышения иммунитета, предотвращения заболевания атеросклерозом и другими
болезнями, в основе развития которых лежит перекисное окисление липидов.
Норма потребления янтарной кислоты — 0,3-0,5 г/сут.
Флавоноиды используют как индивидуальные соединения (сильный антиок­
сидант — кверцетин), а также в составе растительных экстрактов, где присутству­
ют также токоферолы, каротиноиды и аскорбиновая кислота.
Лигнин является самым распространенным ароматическим полимером. Его со­
держание в наземных растениях составляет до 30 % сухой массы. Предшественни­
ками в синтезе лигнина являются производные фенилпропана — конифериловый,
синаповый и кумаровый спирты, образующиеся, в свою очередь, из фенилаланина
и тирозина. Фенилпропановые блоки соединяются в молекулы лигнина на основе
окислительной конденсации, катализируемой пероксидазами. Фенилпропановые
блоки связаны различными типами связей, которых насчитывают не менее десяти;
среди них преобладают эфирные р-О-4-связи и С-С-связи типа Р-1.
В процессе окислительной конденсации фенилпропановых блоков возникают
химические связи между лигнином, целлюлозой и гемицеллюлозой. Полимеры
образуют прочный композитный материал — лигноцеллюлозу, которая опреде­
ляет структурно-механические и химические свойства целлюлозосодержащего
сырья.
Переработка целлюлозы неизбежно связана с разделением полимеров лигноцеллюлозы, с делигнификацией сырья. Для этого используют химические мето­
ды, что приводит к масштабному загрязнению окружающей среды. Утилизация
отходов производства возможна на основе использования микроорганизмов, раз­
рушающих лигнин. Проблема биодеградации лигнина возникает также при полу­
чении кормов из лигнифицированных растительных материалов, прежде всего из
соломы злаков.
В природе процесс делигнификации осуществляют бактерии, микроскопи­
ческие и высшие базидиальные грибы. Бактерии не разлагают полимерный лиг­
нин и, вероятно, участвуют на заключительных стадиях деструкции полимера
в природных биоценозах. Лишь актиномицеты способны расщеплять лигнин,
превращая его в СОг. Из числа грибов наиболее активными деструкторами лиг­
нина являются возбудители белой гнили древесины, такие как представители ро­
дов Сопо/из, Рошез, Рапиз, РИапегосИае(е, РЫеЫа, Р1еиго(из, Ро1урогиз, ТгатеГез.
Исследование лигнолиза в культурах этих грибов позволило создать примерную
картину процесса.
Структура лигнина такова, что он не может служить объектом непосредствен­
ной гидролитической атаки. Лигнин расщепляется с помощью оксидаз, окисление
происходит за счет кислорода воздуха и перекиси водорода. Комплекс ферментов,
участвующих в деструкции лигнина грибами белой гнили древесины, включает
фенолоксидазы, Мп2+-независимые и Мп2+-зависимые пероксидазы, а также фер­
менты, генерирующие перекись водорода (глюкозооксидаза и др.).
Лигнин не может быть единственным источником углерода и энергии для
лигнинразрушающих грибов. Необходимо присутствие полисахаридов или низко­
молекулярных легкорасщепляемых источников углерода, которые используются
в конструктивном и энергетическом метаболизме и в процессах генерации пере­
киси водорода.
Фермент лакказа относится к фенолоксидазам, которым, как отмечалось ра­
нее, присвоен один номер — КФ 1.14.18.1. Лакказа — медьсодержащий гликопро­
теин, обладающий широкой Специфичностью в отношении фенольных субстра­
тов. Под действием лакказы происходит образование феноксильных радикалов,
которые могут далее подвергаться различным преобразованиям, в частности,
деметилированию, которое считают ключевым этапом биодеградации лигнина.
Грибы могут синтезировать несколько изоформ лакказы, отличающихся по спе­
цифичности действия.
Лакказы грибов рода Сопо1из имеют молекулярную массу 60-69 кДа, опти­
мум действия при рН 4,4-5 и температуре 50-55 °С. Фермент из С. \>ешсо1ог со­
держит 4 атома меди на молекулу. Содержание углеводного компонента в лакказе
С. гопаЩз составляет около 10 %.
Фермент лигниназа — Мп-независимая пероксидаза, катализирующая окис­
лительную деполимеризацию лигнина с участием перекиси водорода. К числу
разновидностей катализируемых реакций относят расщепление С-С-связей в ди­
мерных моделях лигнина, окисление бензиловых спиртов и метильных заместите­
лей в бензильных соединениях, гидроксилирование бензильных метильных групп
и олефиновых связей, декарбоксилирование фенилуксусной кислоты, расщепле-
эфирных связей, раскрытие ароматического кольца, полимеризацию фенолов.
характерной для фермента, считают окисление вератрового
альдегид
Лигниназы
молекулярной массой 40кДа, оптимум действия при рН 2,7-3,4 и температуре 28—34 °С, стабильны
3-6 и температуре
грибов находят до 15 гемсодержащих
пероксидаз, среди которых может быть несколько Мп-независимых.
Мп-зависимые пероксидазы, участвующие в деструкции лигнина,
фер
42—49 кДа
кислои среде.
окислять субстраты
Относительная скорость реакции в присутствии и отсутствии марганца зависит от
природы субстрата.
Функционирование пероксидаз возможно лишь при наличии перекиси во­
дорода (именно перекись делает гниль древесины белой, так как обесцвечивает
субстрат). Считают, что генерацию перекиси могут осуществлять различные фер­
менты, окисляющие углеродные субстраты: глюкозооксидаза, пиранозооксидаза,
метанолоксидаза (окисляет метанол, этанол, н-пропанол, н-бутанол и другие спир­
ты), глиоксальоксидаза (окисляет глиоксаль, метилглиоксаль и другие субстраты),
оксидаза жирных кислот. Эти ферменты найдены в культурах грибов белой гнили
древесины. При отсутствии перекиси водорода Мп-зависимые пероксидазы могут
ее генерировать, используя в качестве доноров протонов восстановленный глутатион, НАГ) • Н и другие субстраты.
В комплексе внеклеточных ферментов грибов белой гнили, помимо лигнинразрушающих, присутствуют целлюлолитические ферменты. Активность целлюдеструкция
текущии
освобождающейся
позволяет
глюкозооксидазу важнейшим ферментом — генератором перекиси водорода, со­
пряженным с процессом делигнификации природных субстратов.
•
I
Реакции переноса широко представлены в процесса? деструкции
ферментами, классифицируемыми как гидролазы. При получении циклодекстри­
нов из крахмала используют фермент, относящийся к классу трансфераз, — циклодекстринглюканотрансферазу (ЦДГТ).
Циклодекстрины имеют общую формулу (СбНю05 )п. Они представляют собой
замкнутые макроциклы. Конформационно стабильными являются циклодекстри­
ны а, Р и у, со степенью полимеризации соответственно 6 ,7 и 8 . Циклодекстрины
хорошо кристаллизуются из воды и водно-спиртовых растворов, присоединяя от
8 до 18 % кристаллизационной воды. Циклодекстрины более стабильны, чем лиглюкозы, в частности, из-за отсутствия редуцирующих групп.
Р
слабо.
Циклодекстрины имеют конформацию полого усеченного конуса. Гидрок­
силы глюкозы ориентированы наружу, за счет чего внешняя поверхность конуса
более гидрофильна, чем внутренняя. Относительная гидрофобность полости спо­
собствует образованию комплексов включения гидрофобных органических соеди­
нений. В циклодекстрины могут быть включены и неорганические соединения.
Комплексы включения имеют четкий химический состав, легко кристаллизуются.
Их применяют как лекарственные средства, пищевые добавки, химреактивы.
Образование циклодекстринов из крахмала катализирует фермент циклодекстринглюканотрансфераза (КФ 2.4.1.19). Отделение фрагмента а -1,4-глюкана
и замыкание его концов в циклодекстрин происходит со стороны нередуцирующе­
го конца линейного участка субстрата. Образование циклодекстринов приводит
к деполимеризации крахмала, сопровождающейся изменением окраски с йодом.
Соотношение а-, Ц и у-циклодекстринов в продуктах реакции зависит от
источника фермента и может различаться у штаммов одного вида. Для ЦДГТ
В. тасегат, В. НсИет/огтгз, Шсгососсш уапапз и К1еЪз1е11а рпеитотае харак­
терно преобладание а-циклодекстринов, В. с\гси1апз, В. те§а1егшт, М. 1и1еиз — (3циклодекстринов, В. зиЫШз — у-циклодекстринов. На соотношение форм цикло­
декстринов влияют видовые особенности крахмалов, как это показано для ЦДГТ
ТНегтоасйпотусез зр. Введение в реакционную среду некоторых добавок позво­
ляет изменить выход продуктов циклизации. При действии ЦДГТ В. На1орИИиз на
10%-ный крахмал образовывалось 27 % циклодекстринов, а при введении в среду
5 % толуола или 1 % трихлорэтилена — 52 %. Увеличение выхода объясняется
тем, что добавки образуют комплексы включения в циклодекстрины, тем самым
предотвращая их трансформацию.
ЦДГТ предпочтительно катализирует образование циклодекстринов из высо­
комолекулярных субстратов, степень полимеризации 30-100 глюкозных единиц.
Наибольший выход получают из кукурузного и картофельного крахмала. В при­
сутствии амилолитических ферментов, прежде всего а-амилазы, быстро понижа­
ющей среднюю молекулярную массу декстринов, степень конверсии крахмала
в циклодекстрины снижается. Из глюкозы циклодекстрины не образуются.
Помимо крахмала и амилодекстринов, ЦДГТ использует в качестве субстра­
тов образовавшиеся циклодекстрины, катализируя их взаимные превращения,
а также образование глюкозы, мальтозы и мальтотриозы. С этим связано изме­
нение соотношения форм циклодекстринов в ходе реакции. Наиболее лабильны
у-циклодекстрины.
ЦДГТ катализирует перенос остатков глюкозы и мальтоолигосахаридов на
акцепторы, такие как сорбоза, глюкоза, сахароза, мальтоза, мальтоолигосахариды,
ксилоза, галактоза, глюкуроновая кислота, инозит. Образуются линейные олиго­
сахариды, в структуре которых акцептор расположен на редуцирующем конце.
Так, при переносе остатка глюкозы на сорбозу или сахарозу образуются соот­
ветственно ппокозйлсорбоза и мальтозилфрукгоза. Введение акцепторов в среду
с крахмалом ускоряет его деградацию.
ЦДГТ синтезируют в качестве внеклеточного фермента различные виды ба­
цилл, микрококков, актиномицетов, микроскопических грибов. ЦДГТ бактерий
и актиномицетов — белки молекулярной массой от 36 до 120 кДа с оптимумом
действия в зоне рН 5-8 при температуре 45-70 °С (у большинства 50-60 °С). Фер­
мент из двух штаммов ТИегтоасНпотусез $р. имеет оптимум при 70 и 80 °С, что
ценно при проведении конверсии крахмала в циклодекстрины в промышленном
масштабе. ЦДГТ стабильна в слабокислой и нейтральной среде. Большинство ис­
следованных ЦДГТ стабилизируются ионами кальция, магния, цинка.
К настоящему времени в нашей стране успешно апробировано несколько ва­
риантов технологии ЦДГТ из культур различных видов бацилл, но промышлен­
ный выпуск фермента не производится.
Расщеплению через циклизацию с помощью трансфераз в природе подвер­
гается не только крахмал, но и инулин. Из В. с1гси1ат выделен в гомогенном
состоянии фермент циклоинулоолигосахаридфруктотрансфераза, катализирую­
щий образование циклоинулогексаозы, циклоинулогептаозы и циклоинулооктаозы из инулина.,Реакция осуществляется по механизму трансфруктозилирования. Фермент катализирует также реакции гидролиза и диспропорционирования, в результате которых инулин подвергается глубокому расщеплению с обра­
зованием разнообразных продуктов реакции, как циклической, так и линейной
структуры.
Реакции, катализируемые лиазами. Для деградации пектиновых веществ на­
ряду с пектингидролазами применяют ферменты, относящиеся к классу лиаз, —
пектинтрансэлиминазы. Эти ферменты расщепляют а -1,4-гликозидную связь
между остатками галактуроновой кислоты в полигалактуронидах, с образованием
двойной связи между атомами С4 и С5 одного из остатков (рис. 3.3).
Различают пектатлиазы, деградирующие деметоксилированный и низкоэтерифицированный пектин, и пектинлиазы, расщепляющие метоксилированный пек­
тин. Эндопектатлиазы (КФ 4.2.2.2) катализируют неупорядоченное расщепление
пектатов с образованием в качестве конечных продуктов реакции ненасыщенной
дигалактуроновой кислоты и небольших количеств ненасыщенной тригалактуроновой кислоты, насыщенных ди- и моногалактуроновой кислот.
Фермент
ОН
Н3СО — С = 0
ОН
►
Н3СО — С = 0
Эндопектатлиазу синтезируют бактерии, микроскопические грибы и расте­
ния. Фермент имеет молекулярную массу в пределах 30—100 кДа, представлен
одной полипептидной цепью. Оптимум действия при рН 7—9. Активаторы эндопектатлиазы — ионы кальция и других двухвалентных металлов, хелат ЭДТА пол­
ностью ингибирует фермент. В комплексах некоторых бактерий обнаружено по
несколько представителей эндопектатлиаз.
Экзопектатлиазы (КФ 4.2.2.9) катализируют расщепление предпоследней
гликозидной связи от восстанавливающего конца пектатов, с образованием един­
ственного продукта реакции — ненасыщенной дигалактуроновой кислоты. Эти
ферменты присутствуют в комплексах пектинрасщепляющих ферментов бакте­
рий. Некоторые бактерии синтезируют экзопектатлиазы, деградирующие пектаты
с образованием ненасыщенной тригалактуроновой кислоты.
Из бактериальных культур выделен фермент заключительного этапа расщеп­
ления полигалакгуроновой кислоты — олигогалактуронидлиаза (КФ 4.2.2.6), кото­
рая катализирует расщепление олигогалактуронидов, образующихся под действи­
ем эндопектатлиазы и эндополигалактуроназы. Расщепляется первая гликозидная
связь от восстанавливающего конца субстратов, то есть продуктами реакции яв­
ляются мономеры. Олигогалактуронидлиазы из различных бактериальных куль­
тур отличаются по специфичности в отношении насыщенных и ненасыщенных
субстратов.
Пектинлиазы (КФ 4.2.2.10) предпочтительно расщепляют высокоэтерифицированный пектин. Эти ферменты широко распространены у грибов. Важная роль
пектинлиаз определяется их способностью непосредственно воздействовать на
высокоэтерифицированный субстрат без его предварительной деэтерификации,
которая обычно предшествует гидролитическому расщеплению пектина. Нали­
чие пектинлиазы обеспечивает грибам быстрое проникновение в ткани фруктов
и овощей, сопровождающееся их мацерацией и порчей.
Активность пектинлиазы наиболее выражена у микроорганизмов, не синте­
зирующих пектинэстеразы, поскольку при действии пектинэстеразы образуется
низкометоксилированный субстрат, к которому пектинлиаза имеет малое срод­
ство.
В комплексных ферментных препаратах из культур грибов пенициллов
(Р. айатеЫи Р сИгтит и Р. ]ап1Ите11ит) найдены пектинлиазы с оптимумами
действия в интервалах рН 6-8,5 и температуры 35-60 °С (субстрат — яблочный
пектин со степенью этерификации 84 %). Конечные продукты гидролиза субстра­
та — моно- и дигалактуроновые кислоты. Препараты не содержат полигалактуроназы, целлюлазы, ксиланазы и протеазы. Они вызывают мацерацию тканей клуб­
ней картофеля предпочтительно в кислой среде (рН 5).
В отечественном препарате «Пектоклостридине», выделяемом из культуры
анаэробной бактерии С1о$(гШшт рес 1то/егтеп1ап$ пектинтрансэлиминаза при­
сутствует в комплексе с пектингидролазами — экзополигалактуроназой и пектинэстеразой. Комплекс проявляет максимальную активность при температуре
40-45 °С, для действия пектинтрансэлиминазы оптимален рН 8 .
Реакции изомеризации. При получении сахаристых продуктов используют
препараты изомеризующих ферментов, катализирующих превращение глюкозы
во фруктозу. Этой способностью обладают четыре разновидности изомеризу­
ющих ферментов, из которых в практике нашла применение ксилозоизомераза
(КФ 5.3.1.5).
Ксилозоизомераза катализирует, как основную, реакцию превращения кси­
лозы в ксилулозу. Неосновными являются реакции изомеризации глюкозы во
фруктозу и рибозы в рибулозу. Применение ксилозоизомеразы для изомеризации
глюкозы обосновано каталитическими преимуществами фермента — его термо­
стабильностью, способностью катализировать реакцию в отсутствие кофакторов.
Промышленные препараты ксилозоизомеразы выпускают под названием глюко­
зоизомеразы, по целевому назначению фермента.
Процесс изомеризации глюкозы во фруктозу имеет сложный характер. Он
включает внутримолекулярные превращения, катализируемые ферментом, и про­
цессы мутаротации, вызванные неравновесным соотношением таутомерных форм
сахаров. Изомеризация заканчивается неполным превращением одного изомера
в другой. В условиях промышленного процесса изомеризации глюкозы во фрук­
тозу степень конверсии составляет 40-43 %.
Микроорганизмы различных таксономических групп обладают способнос­
тью синтезировать глюкозоизомеразу. Наиболее активные продуценты найдены
среди актиномицетов. Актиномицеты синтезируют преимущественно внутрикле­
точный фермент, во внешнюю среду выделяется незначительная его часть. Для
получения препаратов глюкозоизомеразы используют как свободные формы фер­
мента, извлеченного из клеток, так и клетки продуцентов с высокой активностью
внутриклеточного фермента.
Глюкозоизомеразы проявляют максимальную активность при рН 7-9 и тем­
пературе 60-90 °С, стабильны в зоне рН 4,5-11. Активируются ионами магния
и кобальта. Ингибиторы — ионы меди, цинка, ртути, серебра, бария и кальция,
а также многоатомные спирты — ксилит, сорбит, маннит.
Промышленные препараты глюкозоизомеразы получают из культуры
А с 1. а1Ъо%пзео1ш. Фермент имеет субъединичную структуру, он состоит из четы­
рех субъединиц молекулярной массой 46 кДа. Содержит прочно связанные ионы
кобальта. Оптимальный рН 8 , температура 80 °С. Стабилен при рН 6- 8 . Активи­
руется ионами магния, кобальта, марганца.
3.3. ФЕРМЕНТНЫЕ ПРЕПАРАТЫ
3.3.1. Технология получения
Промышленная технология ферментных препаратов начала развиваться в первой
четверти XX века. К настоящему времени ферментные препараты стали мощным
средством трансформации практически любого вида биологического сырья, фор­
мирования качества продуктов. Применение ферментных препаратов позволило
существенно увеличить глубину переработки пищевого сырья и кормов, улучшить
органолептические свойства и создать новые виды пищевых продуктов, повысить
усвояемость кормов и расширить сырьевую базу кормопроизводства.
При переработке различных видов органического сырья используются фер­
менты растительного, микробного и животного происхождения. Растительные
ферменты специфичны в отношении своих естественных субстратов, что опреде­
ляет высокую эффективность их действия на растительное сырье. Специфичность
микробных ферментов совершенствовалась в процессе эволюции сапрофитных
и фитопатогенных форм микроорганизмов. В микробном мире можно найти про­
дуцентов всевозможных ферментов, участвующих в круговороте органического
вещества. Это объясняет широкое применение микробных ферментов в пищевой
промышленности и кормопроизводстве. Из животного сырья получают ограни­
ченный ассортимент ферментных препаратов, которые, как более дорогостоящие,
применяются реже микробных.
Основная масса ферментных препаратов производится на основе культивиро­
вания промышленных штаммов микроорганизмов, преимущественно продуцен­
тов секретируемых (внеклеточных) ферментов.
Ферменты зерновых культур в практической деятельности человека приме­
няются с древних времен. Зерно злаков богато запасными веществами, которые
используются в энергетическом и конструктивном метаболизме при прорастании
зерна.
Превращение крахмала, крахмальных полисахаридов, белка, липидов начина­
ется с их гидролитического расщепления. Продукты расщепления используются
в циклах дыхания и биосинтеза структурных элементов растения. В покоящемся
зерне имеются ферменты, необходимые для гидролиза всех видов полимеров. Зна­
чительная часть гидролитических ферментов находится в связанном, неактивном
состоянии. Активность свободных форм гидролаз не проявляется из-за отсутст­
вия свободной воды, необходимой для протекания реакций гидролиза.
В зерне имеются ингибиторы протеолитических ферментов и а-амилазы.
Ингибиторы протеаз предотвращают протеолитический процессинг связанных
ферментов и их переход в свободные, активные формы. При соответствующей
температуре и влажности зерно набухает и прорастает. Процесс прорастания со­
провождается увеличением активности большинства ферментов. Ингибиторы
протеаз — белки с низкой молекулярной массой — диффундируют во внешнюю
среду, что создает условия для проявления активности протеаз. Под действием
протеаз активируются связанные формы ферментов. Параллельно осуществляет­
ся биосинтез новых ферментов.
Проросшее зерно (солод) — богатейший источник ферментов. Ферментатив­
ный комплекс содода включает: амилолитические ферменты (а- и Р-амилазу, аглюкозидазу, пуллуЛаназу, предельную декстриназу), р-фруктофуранозидазу, целлюлолитические ферменты (эндо- и экзоглюканазы, целлобиазу), гемицеллюлазы
(эндо-Р-1,3-глюканазу, ламинарибиазу, эндо- и экзоксиланазы, ксилобиазу, арабинозидазу), протеазы эндо- и экзотипов, липазы, фосфатазы, окислительно-восста­
новительные ферменты (каталазу, пероксидазу, о-дифенолоксидазу).
Таблица 3 .1 . Оптимальные режимы солодоращения для разных культур
Культура
Температура, ‘С
Продолжительность
Влажность зерна, % |
проращивания, сут.
Ячмень двухрядный
13-15
46
7
Ячмень шестирядный
17-19
47-48
6
Рожь
18-20
48-50
3
Пшеница
16-18
46-48
3-4
Овес
15-18
42-43
5-6
Кукуруза
18-20
46-48
5
Рациональная технология солода обеспечивает получение максимальной ак­
тивности гидролитических ферментов при минимальных затратах массы зерна на
дыхание. Активность ферментов в процессе прорастания изменяется в зависи­
мости от влажности зерна, температуры среды, продолжительности выращива­
ния, способа аэрации (табл. 3.1). При получении сухого солода его ферментатив­
ная активность зависит от способа сушки.
I
Наибольшее применение находят ячменный и ржаной солод, первый — в пи­
воварении, второй — в хлебопечении и при приготовлении квасного сусла. Вы­
сокой ферментативной активностью обладает солод из шестирядного озимого
ячменя: амилолитическая и протеолитическая активность соответственно в 1 ,5 - 2
и 3-5 раз выше, чем в солоде из двухрядного пивоваренного ячменя.
Амилометические ферменты солода имеют сходные свойства. а-Амилаза при­
сутствует в покоящемся зерне в незначительных количествах. Фермент активно син­
тезируется в процессе прорастания. Синтез индуцируют гиббереллины, образующи­
еся в ростке. Максимальная активность а-амилазы найдена в алейроновом слое.
Оптимальные условия действия фермента: рН 5,6-5,8 , температура 60-65 °С.
В заторах температурный оптимум повышается до 70-75 °С, а предел термоста­
бильности — до 80 °С, что связано со стабилизирующим действием высоких кон­
центраций крахмала в заторах. а-Амилаза солода активируется ионами кальция
и хлора, ингибируется ионами железа, хрома, меди. В солоде присутствуют два
изофермента а-амилазы. При длительном гидролизе крахмала солодовой а-амилазой получают смесь сахаров, состоящую на 87 % из мальтозы и на 13 % — из
ГЛЮКОЗЫ.
:
•
), .
Р-Амилаза находится в зерне в свободной и связанной формах. Связанная
форма локализуется только в эндосперме. Активация ее происходит под дейс­
твием протеаз и тиоловых агентов. Р-Амилаза накапливается в зерне в интервале
от 2 до 5 сут. проращивания, основная активность сосредоточена в алейроновом
слое. Фермент имеет оптимум действия в разбавленных растворах крахмала при
рН 4,6-5 ,6 и температуре 40-50 °С, в заторах крахмалистого сырья — при 6065 °С. Стабилен при рН 4-8 и температуре до 60 °С, в заторах — до 70 °С. Инги­
биторы — ионы тяжелых металлов, галогены, озон.
р-Амилаза расщепляет амилозу на 100 % с образованием мальтозы. Гидроли­
зу амилопектина препятствуют точки ветвления, вокруг которых долго сохраня­
ются негидролизованные фрагменты полиглюкозидных цепочек. Крахмал в це­
лом расщепляется с образованием около 50 % мальтозы и такого же количества
предельного Р-декстрина, дальнейшее расщепление которого может происходить
при добавлении а-амилазы.
Полный комплекс амилолитических ферментов солода гидролизует зерновой
крахмал на 100 %.
При прорастании зерна существенно увеличивается активность Р-фруктофуранозидазы, эндо- и экзоглюканаз (в 10 раз), эндоксиланазы (в 3 раза), экзоксиланазы (в 2 раза), эндопептидазы (в 5-6 раз), экзопептидаз (в 1,5-10 раз), фосфатаз
(в 5-10 раз), липазы (в 2 раза). Целлобиазная активность, высокая в покоящемся
зерне, при прорастании снижается. Это коррелирует с повышением активности
других целлюлолитических ферментов, комплекс которых может расщеплять цел­
люлозу до глюкозы без участия целлобиазы.
Протеолитический комплекс солода включает эндо- и экзопептидазы. Эндо­
пептидазы в зерне представлены свободной и связанной формой. Переход в сво­
бодную форму происходит за счет удаления ингибиторов (их протеолиза, диффу­
зии во внешнюю среду). В комплексе экзопептидаз идентифицированы карбокси­
пептидаза, магнийсодержащая лейцинаминопептидаза и дипептидаза.
Протеолитические ферменты солода гидролизуют белок в зоне рН 4—9. Этот
диапазон соответствует изменению величины рН в различных участках прораста­
ющего зерна, что связано с гидролизом белка, превращениями аминокислот, син­
тезом органических кислот. Эти изменения отражаются в возрастании титруемой
кислотности в процессе проращивания в 4-5 раз при незначительном увеличении
средней величины рН (с 6 до 6,3). Компенсация активной кислотности происходит
за счет буферного действия белков, фосфорорганических соединений, свободного
фосфата, ионов органических кислот и металлов.
Сушка солода приводит к изменению абсолютной активности ферментов и со­
отношения ферментативных активностей, что объясняется ограниченной и раз­
личной термостабильностью компонентов ферментативного комплекса. В резуль­
тате сушки амилолитическая активность светлого солода снижается на 30—40 %,
темного — на 70 %. Потери происходят в основном за счет термоинактивации
р-амилазы, а-амилаза более стабильна. Снижение пептидазной активности при
сушке светлого солода (температура 95-100 °С) незначительно. В темном солоде,
который сушат в интервале температуры 112-120 °С, наблюдается существенное
снижение пептидазной и фосфатазной активности. Высокоферментативный со­
лод из шестирядного ячменя рекомендуют сушить при температуре 72-80 °С.
Тиоловые растительные протеазы — папаин, химопапаины А и В, бромелаин и фицин — являются ферментами широкой субстратной специфичности. Они
гидролизуют пептидные связи, образованные лейцином или глицином, которые
часто встречаются в белках.
Папаин выделяют из сока дынного дерева путем фракционированного осаж­
дения органическими растворителями. Аналогично получают бромелаин из сока
зрелых стеблей ананаса и фицин из сока стеблей тропического инжира. Промыш­
ленный выпуск тиоловых протеаз растений производится в тропических странах,
где произрастает сырье.
В пищевых отраслях широко применяется папаин, который изготовляют
в различных товарных формах. В последние годы в нашей стране освоен вы­
пуск препаратов папаина из незрелых плодов дынного дерева, которые ввозят из
Эквадора. В выделяемом ферментном препарате протеолитическая активность
составляет 750-1000 ед./г (по методу Ансона, субстрат — казеинат натрия). Фер­
ментный комплекс включает: папаин, химопапаин, пептидазу А, незначительное
количество лизоцима. Производится также иммобилизованная форма препарата
(носитель — нейлоновое полотно) с высокой термо- и операционной стабиль­
ностью.
Микробные ферменты. В качестве продуцентов ферментов используются
культуры представителей различных таксономических групп — бактерий, акти­
номицетов, микроскопических и высших базидиальных грибов. Последние в ла­
бораторной и промышленной культуре ведут себя аналогично микроскопическим
грибам.
г
К микроорганизмам — продуцентам ферментов предъявляются следующие
требования: наличие высокой ферментативной активности; преимущественный
синтез фермента или группы ферментов, превращающих определенный субстрат;
генетическая стабильность по признаку синтеза фермента или ферментов; доста­
точно высокая скорость роста; способность расти на средах с доступными и недо­
рогими источниками питания.
Среди микроорганизмов, обладающих высокой активностью определенного
фермента, предпочтение отдается тем, которые в оптимальных физиологических
условиях способны синтезировать преимущественно один фермент или группу
родственных ферментов (например, только а-амилазу или только комплекс целлюлаз). Такое предпочтение связано с тем, что, во-первых, при направленном син­
тезе достигается наиболее высокая ферментативная активность; во-вторых, пре­
параты с выраженной активностью определенных ферментов и отсутствием или
следовыми количествами других ферментов могут применяться для воздействия
на индивидуальные компоненты сложных субстратов; в-третьих, такие фермент­
ные препараты удобны для составления мультиэнзимных композиций с заданной
активностью нескольких ферментов.
Способность к активному синтезу одного или группы близких ферментов
свойственна тем микроорганизмам, у которых биосинтез этих ферментов носит
не конструктивный, а индуцированный характер, то есть резко усиливается в при­
сутствии индукторов, в качестве которых чаще всего выступают субстраты фер­
ментов или продукты их неполного расщепления.
Важнейшим качеством продуцента фермента является его генетическая ста­
бильность, которая выражается в способности сохранять на протяжении многих
поколений определенный уровень биосинтеза фермента в соответствующих усло­
виях. Генетическая стабильность присуща природным штаммам микроорганиз­
мов, прошедшим длительный путь естественного отбора. Однако в практике час­
то используют штаммы, полученные искусственной селекцией, с применением
мутагенов. Такие штаммы обладают высокой изменчивостью, нестабильностью
признаков.
Необходима постоянная селекционная работа по поддержанию полезных
признаков штаммов на определенном уровне. При этом опираются на известную
корреляцию внешних (морфологических) и физиолого-биохимических признаков
микроорганизмов. Контроль за появлением нежелательных форм ведут как путем
их визуального обнаружения при рассевах штаммов, так и с помощью серологи­
ческих методов, выявляя неактивные варианты по их реакции со специфическими
сыворотками.
Неустойчивость генетических признаков — причина частой смены продуцен­
тов ферментов в условиях промышленного производства. Смена штамма влечет
за собой изменение ферментативного комплекса препаратов, физико-химических и каталитических свойств отдельных компонентов. Это может выражаться
в изменении оптимальных условий действия ферментов (рН, температуры), термо- и рН-стабильности, устойчивости к действию ингибиторов и к протеолизу,
способности атаковать нативный или модифицированный субстрат, соотношения
продуктов реакции, предельной степени превращения субстрата.
Изменение таких характеристик, как гидрофобность фермента, величина моле­
кулярной массы, изоэлектрическая точка, поверхностный заряд молекулы при оп­
ределенном рН, отражается на технологических свойствах фермента, его поведении
в процессах очистки и выделения, что влияет на состав и свойства ферментативно­
го комплекса препарата. Изменение состава и свойств ферментативных комплексов
наблюдается не только при смене штаммов-продуцентов, но и при появлении неха­
рактерных морфологических вариантов, образующихся в процессе естественной
изменчивости культур микроорганизмов. Учитывая названные факторы, целесооб­
разно периодически уточнять Характеристики ферментных препаратов.
К чисто технологическим характеристикам продуцентов ферментов следует
отнести их скорость роста, устойчивость к инфекции, отношение к источникам
питания и другим внешним факторам. Культивирование продуцентов ферментов
проводят в условиях стерильности (глубинный процесс) или максимально воз­
можного приближения к ним (поверхностный твердофазный процесс). Очевидно,
что сохранение чистоты культуры не менее важно, чем генетическая стабильность
продуцента. Обеспечение стерильности облегчено при непродолжительном куль­
тивировании продуцента и наличии у него естественных механизмов защиты от
инфекции. Стабильность уровня биосинтеза ферментов выше у микроорганизмов,
способных развиваться в широком диапазоне изменения внешних факторов, та­
ких как концентрация источников питания, реакция среды, уровень аэрации и пр.
Исходя из экономических соображений, предпочитают использовать доступные
и недорогие источники питания.
Ферментная промышленность выпускает широкий ассортимент препаратов
микробного происхождения, продуцентами которых являются представители раз-
личных таксономических групп. Большую часть валового количества ферментов,
особенно гидролитических, производят на основе культивирования бацилл (пре­
жде всего, В. зиЫгШУ, микроскопических грибов родов Азрег%Шиз, РепгсПИит,
ТпсИоЛегта, а также актиномицетов родов АсИпотусез, §1гер1отусез. Чаще всего
используют мезофильные штаммы аэробных микроорганизмов.
Преобладающим способом культивирования микроорганизмов является глу­
бинный, основанный на выращивании продуцентов в стерильных жидких средах
с принудительной аэрацией (для аэробных форм) и перемешиванием среды, при
автоматическом регулировании параметров процесса, таких как температура, рН
среды, ее окислительно-восстановительный потенциал, концентрация растворен­
ного кислорода и пр.
Наряду с глубинным применяется поверхностный способ культивирования,
когда культуры продуцентов выращивают на поверхности жидких и сыпучих
(твердофазное культивирование) питательных сред (отруби, свекловичный жом,
измельченное целлюлозосодержащее сырье, солодовые ростки и др.). Последние
увлажняют и стерилизуют.
Приоритет отдают твердофазному процессу, так как условия культивирова­
ния продуцентов максимально приближены к естественным, в которых полно­
стью реализуется биопотенциал микроорганизмов. Клетки микроорганизмов
непосредственно контактируют с питательными субстратами и не подвергаются
неблагоприятным механическим воздействиям, неизбежным при глубинном куль­
тивировании. Твердофазная культура хорошо аэрируется. В конце ферментации
получают культуру в форме, удобной для выделения ферментных препаратов.
Глубинное культивирование используется как для аэробных, так и для анаэ­
робных продуцентов, твердофазное — только для аэробных, а именно для микро­
скопических и высших базидиальных грибов.
Различают ферментные препараты растворимые и иммобилизованные. У рас­
творимых препаратов активная часть растворяется в водной среде. По окончании
ферментативной обработки субстрата растворимый препарат остается в реак­
ционной среде и вторично не используется. Наряду с растворимыми выпускают
также иммобилизованные ферменты. Иммобилизация — это включение объекта
в изолированную фазу, которая отделена от фазы свободного раствора, но способ­
на с ней обмениваться молекулами (субстратов, эффекторов).
Иммобилизованные ферменты получают путем связывания с носителями рас­
творимых ферментов или клеток микроорганизмов, обладающих ферментативной
активностью. Наиболее распространенные способы связывания — это сорбция на
носителе, ковалентное связывание и включение в структуру гелей-носителей. Им­
мобилизация приближает условия функционирования ферментов к природным.
В природе большая часть ферментов ассоциирована со структурами живых орга­
низмов или элементами окружающей среды, что важно для проявления активнос­
ти ферментов и их стабильности.
М
Иммобилизованные ферменты имеют ряд преимуществ перед растворимы­
ми при проведении процессов промышленного биокатализа. Иммобилизованные
ферменты можно изъять из реакционной среды, что позволяет контролировать ход
ферментативной реакции и многократно использовать ферментные препараты.
Каталитический процесс можно проводить непрерывно, пропуская растворы суб­
стратов через реакторы с иммобилизованными ферментами. Продукты реакции не
загрязняются примесями ферментных препаратов. Иммобилизованные ферменты
имеют высокую операционную стабильность, а их каталитические свойства мож­
но модифицировать, изменяя способ связывания и вид носителя.
Применение иммобилизованных ферментов позволило решить задачу созда­
ния крупных промышленных биокаталитических производств, с помощью кото­
рых производят аминокислоты, органические кислоты, сахара, органические рас­
творители, метан, антибиотики, гормональные препараты, осуществляют очистку
сточных вод и водоемов, биоконверсию органических отходов.
3.3.2. Характеристика основных отечественных
ферментных препаратов
Многие виды отечественных ферментных препаратов имеют названия и индексы,
несущие информацию о продуценте фермента, основной активности и способе
выделения препарата. Название таких препаратов состоит из двух частей: пер­
вая соответствует виду основной активности, вторая — видовому названию про­
дуцента. Например, «Амилосубтилин» — это препарат а-амилазы из культуры
В. зиЫШз, «Глюкаваморин» — препарат глюкоамилазы из Азр. статоп, «Целловиридин» — препарат целлюлазы из Т. у/га/е.
Препараты, выделенные из глубинной культуры, имеют в индексе букву «Г»
(глубинный), из поверхностной — «П» (поверхностный). Далее следует цифро­
вой индекс, который характеризует степень концентрирования фермента в препа­
рате по отношению к культуральной жидкости или твердофазной культуре. Так,
препараты с индексом «ГЗх» должны иметь активность в ед./г в 3 раза выше, чем
средняя активность культуральной жидкости в ед./мл. Устанавливается стандарт­
ная активность препарата, соответствующая этому соотношению.
Стандартная активность, как правило, не изменяется в течение многих лет.
В то же время активность продуцентов изменяется в процессе селекции, совер­
шенствуется технология культивирования. В результате индекс концентрирования
снижается по сравнению с исходным. Часто выпускают несколько сортов препа­
рата с одним индексом и разной активностью. Цены на препараты устанавливают
пропорционально величине основной активности. Каждая партия ферментного
препарата сопровождается сертификатом, где указана активность.
Препараты, содержащие комплекс ферментов, где важно соотношение ком­
понентов комплекса, характеризуются по двум или более видам активности. При
этом цена устанавливается в соответствии с основной активностью, обычно явля­
ющейся интегральной. Для препаратов целлюлаз — это активность, определяемая
по действию на фильтровальную бумагу (так называемая активность АФБ), для
пектиназ — общая пектолитическая.
Наряду с препаратами, имеющими буквенно-цифровую индексацию, распро­
странены препараты с тривиальными названиями, в которых отражены: основной
вид активности, величина активности, название фирмы и т. д.
Индексом «Гх» обозначается неочищенная культуральная жидкость проду­
цента фермента. Препараты «Гх» используются преимущественно на месте вы­
работки. Так, в спиртовом производстве применяют культуральную жидкость
продуцентов амилолитических и целлюлолитических ферментов, получаемую
в ферментных цехах спиртозаводов. При добавлении консервантов препараты
«Гх» можно транспортировать на значительные расстояния даже в летний пери­
од. В пищевых производствах препараты «Гх» пригодны лишь в технологических
процессах, где исключено попадание препарата в готовый продукт, например при
производстве спирта, где ферментные препараты удаляются из продукта в процес­
сах отгонки и ректификации.
•.
Препараты с индексом «ГЗх» получают путем распылительной сушки концен­
трированной культуральной жидкости. Концентрирование проводится методом
вакуум-выпаривания при температуре, не вызывающей инактивации ферментов
(обычно не выше 30 °С). При необходимости перед упариванием в культураль­
ную жидкость добавляют стабилизаторы и регулируют величину рН, поскольку
в процессе концентрирования стабилизирующие компоненты могут переходить
в нерастворимое состояние, а рН сдвигается из-за изменения концентрации и со­
отношения растворенных электролитов.
По окончании концентрирования в концентрат культуральной жидкости вно­
сят соли-наполнители в количестве не менее 100 % к массе СВ концентрата, с це­
лью снижения механических потерь при сушке. Сушку проводят при температуре
на входе в сушилку до 140 °С, на выходе — до 70 °С. Распыляемый продукт под­
вергается воздействию высокой температуры в течение долей секунды, но этого
достаточно для частичной термоинактивации ферментов. Для снижения величи­
ны потерь ферментативной активности в концентрат добавляют агенты, повыша­
ющие термостабильность ферментов.
В качестве соли-наполнителя обычно используют поваренную соль. Количе­
ство соли рассчитывают исходя из активности фермента в культуральной жидкос­
ти, стандартной активности препарата и средней величины потери активности по
термоинактивации при сушке. Высушенный препарат при необходимости стан­
дартизуют той же солью или иными наполнителями.
Препараты с индексом «ГЗх» являются неочищенными. Они имеют высокую
степень микробной обсемененности, порядка 1010 спор или клеток в 1 г. Это ог­
раничивает сферу применения. В пищевой промышленности препараты «ГЗх»
используются в тех же технологиях, что и «Гх». В сельском хозяйстве препараты
«ГЗх» широко применяются для обработки кормов с целью повышения их усво­
яемости. В микробиологической промышленности препараты «ГЗх» используют
для гидролиза компонентов питательных сред, а также при получении белковых
препаратов из биомассы микроорганизмов.
Индекс «ГЗх-Ф» присвоен препаратам, которые получают путем распыли­
тельной сушки концентрированного фильтрата культуральной жидкости. Препа-
рвты «ГЗх-Ф» являются частично очищенными, так как при фильтрации из куль­
туральной жидкости удаляется биомасса и часть балластных веществ. Активность
препаратов «ГЗх-Ф» выше, чем «I Зх». В пищевой промышленности препараты
«ГЗх-Ф» используют наряду с более чистыми — «ПОх».
Индекс «ПОх» имеют препараты, полученные путем осаждения органичес-
Ф
Ф
т минеральными
фа
бодить фильтрат от биомассы микроорганизмов, балластных белков, пс
гхаридов, нуклеиновых кислот.
Фильтрат концентрируют вакуум-выпариванием, добавляя при необходи­
мости стабилизирующие агенты. Из концентрированного фильтрата ферменты
осаждают каким-либо органическим растворителем или смесью растворителей
(этанолом, изопропанолом, их смесью, ацетоном и др.). Выбор растворителя зави­
сит от физико-химических свойств фермента, определяющих полноту осаждения
ферментного белка и сохранение его активности в осадке. В процессе осаждения
фракционирование
гидрофильности
В осадок не переходят низкомолекулярные органические вещества (олигоса­
хариды, аминокислоты и низшие пептиды, низкомолекулярные фракции пигмен­
тов). Ферментный осадок отделяют от жидкой фазы и высушивают в вакуумной
или распылительной сушилке. В первом случае высушенный продукт измельча­
ют. Сухие препараты стандартизуют, добавляя наполнители (соли, крахмал, муку
и пр.). Вид наполнителя определяется целевым назначением препарата.
Препараты «Г10х» имеют значительно более высокую чистоту, чем «Гх»,
«ГЗх», «ГЗх-Ф». Это выражается как в активности ферментов на 1 г препарата,
так и в удельной активности на 1 мг белка. Микробная обсемененность препаратов
«ПОх» регламентируется на уровне 104- 105 спор или клеток в 1 г. Этот показатель
зависит в основном от качества фильтрации и выдерживается далеко не всегда.
По составу ферментативного комплекса препараты «ПОх» существенно от­
личаются от культуральной жидкости. Технологический процесс выделения пре­
паратов «ПОх» оптимизируется по величине выхода и степени очистки основного
фермента (или ферментов), тогда как сопутствующие ферменты в различной сте­
пени отделяются от основного на стадиях предварительной очистки культураль­
ной жидкости, ее фильтрации и осаждения ферментов органическими раствори­
телями. Некоторые технологии препаратов «ПОх» включают стадии инактивации
сопутствующих ферментов, например путем изменения рН среды.
Область применения препаратов «ПОх» охватывает различные пищевые про­
изводства, отрасли члегкой и химической промышленности, кормопроизводство,
ветеринарию. При использовании препаратов для переработки растительного сы­
рья в пищевые продукты и напитки следует придерживаться дозировок, разрешен­
ных органами санитарного надзора, во избежание нежелательных последствий
воздействия повышенных концентрации препаратов на человеческий организм.
Препараты с индексом «Г20х» получают с применением ультрафильтра­
ции — способа концентрирования, основанного на разделении веществ различ­
ной молекулярной массы с помощью полупроницаемых мембран с определенным
размером пор. Ультрафильтрации подвергают предварительно очищенные фер­
ментные растворы, свободные от клеток микроорганизмов и взвешенных частиц.
Культуральную жидкость очищают и фильтруют так же, как при получении пре­
паратов «Г 1Ох».
Фильтрат дополнительно очищают с помощью стерилизующей фильтрации,
после чего направляют на ультрафильтрацию. На стадии ультрафильтрации из
ферментного раствора удаляются низкомолекулярные компоненты (соли, сахара,
пигменты) и белки с эффективным радиусом молекул меньше радиуса пор мем­
браны. На стадии ультрафильтрации контролируют концентрацию компонентов,
стабилизирующих ферменты, и при необходимости дополнительно вводят в кон­
центрируемый раствор стабилизаторы. Из ультраконцентратов получают жидкие
и сухие формы ферментных препаратов. Жидкие формы стабилизируют консер­
вантами, например бензойной кислотой. Сухие формы получают путем распыли­
тельной сушки. Перед сушкой в концентрат вносят стабилизаторы и наполнители.
Препараты «Г20х» применяют при производстве пищевых продуктов и на­
питков, в кормопроизводстве, в составе лекарственных средств для лечения забо­
леваний, связанных с ферментной недостаточностью.
Препараты с индексом «Пх» представляют собой высушенные культуры гри­
бов — продуцентов ферментов, полученные при поверхностном (чаще твердо­
фазном) культивировании. Препараты «Пх» сохраняют полный ферментативный
комплекс продуцентов. Они неочищены и имеют высокую микробную обсемененность. Применяются аналогично препаратам «ГЗх».
Препараты с индексами «П1Ох» получают из свежих или высушенных твер­
дофазных культур грибов по следующей схеме: водная экстракция ферментов из
культуры гриба, отделение экстракта, осаждение ферментов из экстракта этило­
вым или изопропиловым спиртом, отделение ферментного осадка, суспендирова­
ние осадка в воде, добавление к суспензии стабилизаторов и наполнителей, сушка
суспензии распылением. Препараты «ШОх» применяются аналогично «Г10х».
Препараты с индексом «П20х» получают по схеме: экстракция ферментов из
твердофазной культуры, стерилизующая фильтрация экстракта, ультрафильтра­
ция, стандартизация и стабилизация ультраконцентрата, сушка его распылением.
Препараты применяют аналогично «Г20х».
Препараты цитолитического действия. «Целловиридин Г20х» (ТУ 9291008-05800805-93) — комплексный препарат целлюлолитических ферментов и гемицеллюлаз из культуры Т. геезег. В состав комплекса входят: эндо-(3-1,4-глюканаза, целлобиогидролаза, целлобиаза, эндо-0-1,3-1,4-глюканаза, (3-1,3-глюканаза,
ксиланаза. Препарат стандартизуется по целлюлазной активности, которая состав­
ляет по группам: 1 — 2000 ед./г, 2 — 1500, 3 — 1000,4 — 500 и 5 — 200 ед./г. За
единицу активности целлюлазы принята способность фермента образовывать 1 мг
восстанавливающих сахаров (в пересчете на глюкозу) при действии на целлюлозу
мг хроматографической бумаги, при температуре 50 °С, рН 4,7, в течение 1 ч.
Данная единица принята также для выражения активности «Целловиридина ГЗх»,
«Целлоконингина», «Целлолигнорина», «Целлобранина», «Вильзима».
Оптимальные условия действия препарата: рН 4,5—5,5, температура 50 °С.
В качестве наполнителей используются поваренная соль, крахмал картофельный
или кукурузный, мука кукурузная. Влажность препарата 8-15 %. Партии препара­
та, предназначенные для применения в пивоварении, не должны содержать спор
гриба-продуцента, клеток кишечной палочки, сальмонелл, других патогенных
форм. Обсемененность мезофильными аэробными и факультативно анаэробными
микроорганизмами — не более 105 колоний/г.
’
«Целловиридин ГЗх» — комплексный препарат целлюлолитических ферментов
и гемицеллюлаз из культур Т. геезёг или Т. щтф: Целлюлолитическая активность
составляет по группам: 1 — 100 ед./г, 2 — 75, 3 — 50 ед./г. Оптимальные условия
действия: рН 4,5-5,5, температура 45-50 °С. Наполнитель — поваренная соль.
«Целлоконингин П10х», «Целлолигнорин ШОх» — препараты целлюлазы из
культур грибов Т. котщп, Т. 1щпогит. В ферментном комплексе присутствуют
эндо- и экзо-|3-1,4-глюканазы, целлобиогидролаза, целлобиаза, ксиланаза. Стан­
дартная активность целлюлазы — 50 ед/г. Оптимальные условия действия: рН
4,5-5,5, температура 50-60 °С.
«Целлобранин ГЗх» — препарат целлюлазы из культуры Т. Ьп^гЬгасШаШт.
В комплекс ферментов входят: эндоШ 1,4-ппоканаза, целлобиогидролаза, целло­
биаза, ксиланаза. Стандартная активность целлюлазы — 50 ед./г.
«Целлюлаза-100» — комплексный цитолитический ферментный препарат,
выделяемый из смешанной культуры грибов Аар. /оеИдиз и Т. щгте:. Обладает
активностью эндо-Р-1,4-глюканазы, целлобиогидролазы, целлобиазы, эндо-р-1,31,4-ппоканазы, Р-1,3-глюканазы, ксиланазы, полигалактуроназы, пектинэстеразы. Сопутствующие ферменты — хитиназа, кислая протеаза. Препарат стандар­
тизуется по целлюлазной, Цёллобиазной и общей пектолитической активности
(табл. 3.2).
За единицу целлюлазной активности принято такое количество фермента, ко­
торое, действуя на субстрат (хроматографическую бумагу) при температуре 50 °С
и рН 4,8 в течение 1 мин, образует 1 мкмоль восстанавливающих сахаров в пере­
счете на глюкозу. Данная единица активности в 10,8 раза больше единицы, приня­
той для выражения активности «Целловиридина».
50
Таблица 3.2. Активность препарата «Целлюлаза-100» по группам, ед./г
Группа
Вид активности
1
2
3
4
Целлюлазная
100
50
20
10
Целлобиазная
100
50
10
5
Пектолитическая
100
50
10
5
Ци
*Ч кь
*■
ММЙММДО
За единицу целлобиазной активности принимают активность такого количе­
ства фермента, которое приводит к гидролизу 1 микромоля целлобиозы или к об­
разованию 2 микромолей глюкозы за 1 мин при инкубации с раствором целлоби­
озы концентрации 0,002 М в ацетатном буфере концентрации 0,05 М и рН 4,5 при
температуре 40 °С.
«
,
•■
'’
За единицу пектолитической активности принято количество фермента, ко­
торое катализирует гидролиз 1 г пектина до продуктов, не осаждаемых серно­
кислым цинком, при проведении гидролиза в стандартных условиях (температура
30 °С, рН 4, длительность гидролиза 1 ч) и степени расщепления субстрата 30 %
(ГОСТ 20264.3-81).
. « . •
«
: ц
Оптимальные условия действия «Целлюлазы-100»: рН 4,8, температура
50 °С. Рабочая зона: рН 3,5-6,5, температура 40-50 °С. Препарат стандартизуют
поваренной солью, кукурузной мукой. Влажность препарата с солью — не более
8 %, с мукой — н&более 15 %.
.
Препараты гемицеллюлазного действия. «Ксилаком» («Ксилоглюканофоетидин ШОх») — препарат цитолитических ферментов из твердофазной культуры
гриба Азр. /оеИ<Зиз. Препарат обладает активностью ксиданазы, полигалактуроназы, пектинэстеразы, эндо-Р-1,4-глюканазы, целлобиазы, кислой протеазы, хитиназы, р-глюкозидазы. Стандартизуется по ксиланазной активности, которая со­
ставляет по группам, ед./г: 1 — 2000,2 — 3000, 3 — 5000.
За единицу ксиланазной активности принимается такое количество фермен­
та, при действии которого на субстрат (ячменный ксилан) за 1 ч в условиях опыта
образуется 1 мг редуцирующих углеводов в пересчете на ксилозу. Оптимальные
условия действия «Ксилакома»: рН 4,5-5, температура 45-50 °С. Препарат стан­
дартизуется поваренной солью, кукурузной мукой. Влажность препарата 13-15 %.
Обсемененность спорами гриба — не более 102 спор/г, бактериальная обсемененность — не более 105 колоний/г.
«Р-Глюканаза Г10х» — препарат Р-1,3-1,4-глюканазы из культуры В. зиЫШз
Т-86. Сопутствующий фермент — а-амилаза. Стандартная активность Р-глюканазы — 600 ед./г. За единицу Р-глюканазной активности принято количество фер­
мента, способное образовывать из Р-глюкана (лихенина) за 1 мин при 30 °С такое
количество олигосахаридов, которое по восстанавливающей способности соот­
ветствует 1 мкмоль глюкозы. Препарат проявляет максимальную активность при
рН 6,5 и температуре 50 °С, стабилен при рН 3,5-8.
«р-Маннаназа Г10х» — препарат эндо-1,4-Р-маннаназы из культуры В. зиЫШз
С-78. Стандартная активность маннаназы в препарате 300 ед./г. За единицу Р-маннаназной активности принято такое количество фермента, которое за 1 мин при
30 °С и рН 5,8, воздействуя на субстрат — окрашенный галактоманнан из семян
акации (карабан), приводит к увеличению оптической плотности фильтрата ре­
акционной смеси на 0,1 ед. оптической плотности при длине волны 490 нм. Пре­
парат проявляет максимальную активность при рН 5,6-6 и температуре 50 °С,
стабилен при рН 4-8.
«Вильзим АК Г20х» («Ксиланаза Г20х») — комплексный ферментный препа­
рат из культуры Т. геезеи обладающий активностью ксиланазы, Р-1,3-1,4-глюкана-
■
И
I
I
I
I
В
I
I
I
К
в
I
I
I
I
I
I
I
I
|
[
I ■
I
зы, целлюлазы, эндополигалактуроназы, кислой протеазы. Активность ксиланазы
составляет 10 ООО ед./г, Р-1,3-1,4-глюканазы — 5 ООО ед./г, целлюлазы — 650 ед./г.
За единицу ксиланазной активности принято количество фермента, катализирующее образование 1 микромоль ксилозы за 1 мин при рН 5 и температуре 50 °С
при использовании в качестве субстрата ксилана березы, р. 1,3-1,4-Глюканазная
активность выражается так же, как у препарата «Р-Глюканаза Г10х», а целлюлазнал активность — как у «Целловиридина Г20х».
«Поликанесцин Г20х» — комплексный препарат гидролитических ферментов из культуры Реп. сапезсепз, обладающий активностью ксиланазы, Р-1,3-1,4глюканазы, эндо-Р-1,4-глюканазы, эндо-Р-1,4-маннаназы, эндо- и экзополигалактуроназы, кислой протеазы, р-галактозидазы. Активность ксиланазы составляет 1940 ед./г и выражается так же, как для препарата «Вильзим АК Г20х» (при
рН 5,5); активность Р-1,3-1,4-глюканазы — 280 ед./г, выражается как для препарата «Р-Глюканаза ПОх» (при рН 5); активность кислой протеазы — 36 ед./г, выражается в единицах, характерных для препарата «Пектаваморин П 1Ох» и «Г 1Ох»
(при рН 5,5); активность Р-галактозидазы — 1950 ед./г и выражается в тех же единицах, что и для препарата «Лактоканесцин Г20х».
Препараты пектинрасщепляющего действия. «Пектаваморин П1Ох» и «Пектаваморин ПОх» (ГОСТ 18920-73) — препараты пектолитических ферментов
и кислой протеазы из культуры гриба Азрег§ИНз амгатоп. Ферментный комплекс
включает: эндо- и экзополигалактуроназу, пектинэстеразу, ксиланазу, кислую протеазу, Р-глюканазу. Общая пектолитическая активность (ПкС) выражена в тех же
единицах, что и для препарата «Целлюлаза-100». За единицу пектинэстеразной
активности принято количество фермента, которое катализирует гидролиз 1 микроэквивалента сложноэфирных связей в молекуле пектина за 1 мин при 30 °С.
За единицу полигалактуроназной активности принято количество фермента,
которое в условиях определения, при 30 °С, катализирует гидролиз 1 микроэквивалента гликозидных связей в молекуле пектовой кислоты за 1 мин. За единицу
протеолитической активности принята способность фермента превращать за 1
мин при температуре 30 °С казеинат натрия в неосаждаемые трихлоруксусной
кислотой продукты в количестве, соответствующем 1 микромоль тирозина. В пре­
парате «Пектаваморине ПОх» активность пектолитических ферментов по группам соответствует табл. 3.3, активность кислой протеазы не регламентируется.
Оптимальные условия действия препаратов: рН 2,5-5, температура 45-52 °С.
Влажность препаратов не более 13 %, конидии (споры) грибов не должны при­
сутствовать.
«Пектофоетидин ПЮх» (ТУ 64-13-04-87) имеет ферментативный комплекс,
сходный с «Пектаваморином» (см. табл. 3.3). Продуцент — Азр. /ое(Шиз. Опти­
мальные условия действия для пектолитических ферментов рН 3,5—4,5, тем­
пература 35-45 °С; для кислой протеазы — рН 2,5-4. В качестве наполнителей
используются: кизельгур, перлит — в партиях, предназначенных для виноделия
и консервной промышленности; поваренная соль, мука кукурузная или иная —
в препаратах для животноводства. Влажность препарата — не более 15%. Бакте-
Таблица 3 .3 . Активность препаратов пектинрасщепляющего действия
по группам, ед./г
Группа
Вид активности
«Пектаваморин ПЮх» (группы 1-4)
Пектолитическая
36
27
18
9
40
20
8
450
330
240
12
9
6
120
3
Пектинэстеразная
7
Полигалактуроназная
Протеолитическая (при рН 2,5)
к
_
#■
■’ * , •
0
«К ММ
. М. _
Я—
_ _
яПектофоетидин ПЮх» (фуппы 1-3)
Пектолитическая
100
36
9
Пектинэстеразная
80
60
7
1500
570
160
10
3
1
Полигалактуроназная
Протеолитическая (при рН 2,5)
^
риальная обсемененность — не более 105 колоний/г, споры гриба-продуцента не
должны обнаруживаться.
«Пектофоетидин Г20х» (ТУ 9291-007-05800805-93) — препарат из глубинной
культуры Азр.
Стандартизуется по общей пектолитической активности,
которая составляет по группам, ед./г: 1 — 200, 2 — 150, 3 — 100, 4 — 18. Опти­
мальные условия действия: рН 3,8—4, температура 35-37 °С. Препарат стандарти­
зуют добавлением кизельгура, поваренной соли, кукурузной муки, в зависимости
от целевого назначения. Споры продуцента в препарате должны отсутствовать.
«Мацеробациллин ГЗх», «Мацерин Г10х» (ТУ 59.01.003.84-85) — препараты
из культуры В. с1гси1апз, обладающие активностью пектаттрансэлиминазы (ПТЭ)
и экзополигалактуроназы. Стандартная активность ПТЭ составляет 1000 ед./г. За
единицу ПТЭ-активности принято такое количество фермента, которое за 1 ч при
температуре 40 °С вызывает образование ненасыщенных продуктов расщепления
пектина, увеличивающих оптическую плотность реакционной смеси на 0,1 ед.
при длине волны 230-235 нм, в стандартных условиях реакции. Оптимальные ус­
ловия действия препаратов: рН 6,5-7,5, температура 35^40 °С. Стабилизатор —
кальций. Препараты стандартизуются поваренной солью.
«Эндополигалактуроназа Г10х» — препарат из культуры дрожжей 2у§о/аЪозрога тагхгапа ВКМ У-848. Стандартная активность — 100 000 ед./г. За еди­
ницу эндополигалактуроназной активности принято такое количество фермента,
которое катализирует гидролиз 1 г свекловичного пектина со снижением вязкости
раствора на 30 % за 1 мин при 30 °С. Оптимальные условия действия: рН 5-5,2,
температура 45-50 °С, зона стабильности — рН 3-6.
Таблица 3 .4. Активность амилолитических ферментных препаратов
по группам, ед./г
Группа
Вид активности
|
1
2
100
5
600
4,6
2500
2000
45
30
«Амилосубтилин ГЗх»
Амилолитическая
Протеолитическая (при рН 7,2), не менее
[
«Амилоризин П10х»
Амилолитическая (при рН 4,7)
Протеолитическая (при рН 5,5), не менее
[
«Глкжаваморин Г20х» (порошок)
< Глкжоамилазная
2000
1000
Амилолитическая, не менее
30
15
Протеолитическая, не более
15
10
2000
1000
Глюкоамилаза очищенная
Глкжоамилазная
Амилолитическая (при рН 4,7)
|
30
15
Протеолитическая (при рН 5,5), не более
|
15
10
Амщо- и протеолитические ферментные препараты. «Амилосубтилин ГЗх»,
«Амилосубтилин Г 1Ох» — препараты а-амилазы из культуры В. зиЪйШ. Сопут­
ствующие ферменты: эндо-Р-Л-,3-1,4-глюканаза, нейтральная металлопротеиназа.
«Амилосубтилин ГЗх» (ГОСТ 23635-90) стандартизуется по амилолитической
и протеолитической активности (табл. 3.4). В качестве наполнителя используется
поваренная соль.
«Амилосубтилин Г10х» имеет стандартную амилолитическую активность
3000 ед./г. За единицу амилолитической активности принята способность фер­
мента катализировать в стандартных условиях расщепление до декстринов раз­
личной молекулярной массы 1 г крахмала, что составляет 30 % крахмала, вве­
денного в реакцию. Оптимальные условия действия: рН 5,4-6,2, температура 5570 °С. Стабилизаторы — ионы кальция и других щелочноземельных металлов,
ингибиторы — хелаты, тяжелые металлы. В качестве наполнителей используют
поваренную соль, кукурузную муку, мел. Влажность препарата ГЗх — не более
8 %, Г10х — не болееТ З %.
«Амиполихетерм Г18х» — препарат термостабильной а-амилазы из культуры
В. ИсИем/огти. Сопутствующие ферменты: пуллуланаза, р-глюканаза, протеаза,
ксиланаза, эстераза. Выпускается в жидкой форме. Стандартная активность а-ами-
лазы — 1000 ед./мл. Оптимальные условия действия: рН 8, температура 90 °С.
Активаторы а-амилазы — ионы кальция, магния и натрия.
«Амилоризин ШОх» — препарат а-амилазы из культуры гриба Азр. огугае.
Обладает также активностью протеазы, р-глюканазы, ксиланазы. Стандартизу­
ется по трем видам активности (см. табл. 3.4). Оптимальные условия действия
препарата: рН 4,7, температура 45-55 °С. Стабилизаторы — соли кальция, инги­
биторы — хелаты, тяжелые металлы. Обсемененность препарата ограничивает­
ся величиной 105 колоний/г. Осахаривающая активность препарата по группам
составляет, ед./г, не менее: 1 — 12 500, 2 — 10 000. За единицу осахаривающей
активности принята способность фермента катализировать за 1 мин при опреде­
ленной температуре и рН расщепление 1 мкмоль гликозидных связей в раствори­
мом крахмале с образованием восстанавливающих сахаров.
Помимо «Амилоризина», выпускаются аналогичные препараты под названи­
ями «Амилопроторизин Г10х» и «ШОх» из различных штаммов А. огугае. «Амилопроторизин» обладает повышенной, по сравнению с «Амилоризином», протеолитической активностью, составляющей при рН 4 — 540-806, при рН 5,5 —
590-950 ед/г. «Амилопроторизин» имеет оптимум действия при рН 4,0-6,5 и тем­
пературе 50 °С, стабилен при температуре не выше 60 °С. В протеолитический
комплекс препарата входят сериновая протеиназа, карбоксильная протеиназа, ме­
таллопротеиназа, лейцинаминопептидаза, карбоксипептидаза (выделены основ­
ные компоненты). Амилолитическая активность «Амилопроторизина» составляет
1200-1700 ед./г, ксиланазная — 3100-3800, экзо-Р-глюканазная — 150-360 ед./г.
«Глюкаваморин Г20х» — препарат глюкоамилазы из культуры Азр. аматоп.
Выпускается в жидком виде и в виде порошка (см. табл. 3.4). Активность глюко­
амилазы, а-амилазы и протеазы для жидкой формы препарата составляет соот­
ветственно 1000,15,10 ед./г. Оптимальные условия действия препарата: рН 4,5-5,
температура 55-60 °С.
«Глюкоамилаза очищенная» (ТУ 59.01.003.65-83) — препарат глюкоамилазы
из культуры гриба Азр. аыатоп. Сопутствующие ферменты: Р-глюканаза, а-амилаза, протеаза, ксиланаза (см. табл. 3.4). За единицу глюкоамилазной активности
принята способность фермента катализировать гидролиз растворимого крахмала,
высвобождая за 1 мин 1 мкмоль глюкозы в стандартных условиях (температура
30 °С„рН оптимальный, продолжительность реакции 10 мин). В препарате огра­
ничивается глюкозилтрансферазная активность: доля побочных продуктов реак­
ции — олигосахаридов — не должна превышать 6 %, что гарантирует превраще­
ние крахмала в глюкозу на 94 %. Оптимальные условия действия для фермента
глюкоамилазы: рН 4, температура 65 °С. Препарат стабилен при рН 3-5, темпе­
ратуре не выше 60 °С.
Выпускается также жидкая форма глюкоамилазы с индексом «ЖГ20х», име­
ющая стандартную активность 1000 ед./г. Препарат содержит в качестве стабили­
затора бензойную кислоту (0,01 %), что предотвращает развитие инфекции.
«Протосубтилин ГЗх», «Протосубтилин ПОх» — препараты нейтральной бак­
териальной металлопротеиназы из культуры В. зиЫШз. Сопутствующие фермен­
ты: эндо-р-1,3* 1,4-гл ю к ан аза, ксиланаза, а-амилаза. Препарат «Протосубтилин
ГЗх» выпускают с активностью 70 и 100 ед./г. Стандартная активность протеазы
в препарате «Протосубтилин Г10х» по группам, ед./г: 1 — 230, 2 — 180, 3 — 90,
4 — 70. Оптимальные условия действия: рН 7—7,5, температура 50 °С. Стабилиза­
торы — ионы цинка и кальция, ингибиторы — хелаты, тяжелые металлы.
«Кислая протеаза ПОх» — препарат кислой протеазы из культуры гриба
Азр. /оеИс/из. Стандартная протеолитическая активность — 30 ед./г. Оптимальные
условия действия: рН 2,5-3, температура 50 °С. Зона стабильности рН 2,5-6.
Препараты гидролаз олигосахаридов. «Лактоканесцин Г20х» — препа­
рат р-галактозидазы из культуры гриба Реп. сапезсепз. Сопутствующий фер­
мент — Р-фруктофуранозидаза. Стандартная активность препарата — 1000 ед./г.
За единицу активности Р-галактозидазы принимается такое количество фермента,
которое за 1 мин при температуре 30 °С гидролизует 1 мкмоль субстрата (о-нитрофенилгалактопиранозида) при оптимальном рН. Оптимальные условия действия
препарата: рН 4-5, температура 50-60 °С.
«Галактосил» — иммобилизованный препарат Р-галактозидазы из той же
культуры (гриба Реп. сапезсепз). Препарат получают сорбцией фермента на силохроме С-80 с последующей сшивкой глутаровым альдегидом. Стандартная
активность по группам, ед./г: 1 — 350, 2 — 250. При длительной эксплуатации
препарата для гидролиза лактозы в фильтрате подсырной и творожной сыворот­
ки оптимальны рН 3,9—4,1, температура 38-42 °С. Санация «Галактосила» 0,5 М
раствором уксусной кислоты обеспечивает эксплуатационную стабильность в те­
чение 1000-1200 ч.
Препараты изомераз сахаров. «Имфрузим» — препарат ппокозоизомеразы
из глубинной культуры актиномицета Ас(. а1Ъо^ггзео1из, получаемый путем иммо­
билизации клеток продуцента в желатине, с последующей сшивкой глутаровым
альдегидом. Стандартная активность ппокозоизомеразы — 200 ед./г. За едини­
цу активности принято количество фермента, которое за 1 мин при температуре
70 °С, рН 7 и концентрации ионов магния 0,05 М превращает 1 мкмоль глюкозы
во фруктозу. Оптимальные условия действия: рН 6,5-10, температура 85-90 °С.
При длительной эксплуатации препарата рекомендуется рН 7,2-8, температура
63-67 °С, концентрация ионов магния в субстрате не менее 0,004 М, ионов каль­
ция — не более 10 8 М.
Ферментные препараты липалитического и литического действия. «Липоризин ГЗх» — препарат липазы из глубинной культуры гриба Азр. огугае. Стан­
дартная активность липазы — 250 000 ед./г. За единицу активности липазы при­
нимается такое количество фермента, которое способно высвободить 1 мкмоль
олеиновой кислоты из 40%-ной эмульсии оливкового масла при рН 7 и темпе­
ратуре 37 °С в течение 1 ч. Оптимальные условия действия препарата: рН 6-7,
температура 37 °С. 4
«Липоаэрузин ГЗх», «Липоаэрузин Г20х» — препараты липазы из культуры
бактерии Рзеис1отопаз аегидтоза. Стандартная активность препарата с индексом
«ГЗх» — 75 000, «Г20х» — 100 000 ед./г. Оптимальные условия действия: рН 7-
9,5, температура 45-50 °С. Зона рН-стабильности: «Липоаэрузин ГЗх» — 6-12;
«Липоаэрузин Г20х» — 7—10. Стабилизаторы — соли кальция, ингибиторы —
соли цинка и марганца.
«Лизоцим ГЗх» — препарат с активностью литического фермента мурамидазы, выделяемый из культуры В. зиЫШз. Стандартная лизоцимная активность —
300 ед./г. За единицу активности принято количество фермента, которое вызывает
в стандартной суспензии клеток М1сгососсш 1узос1е1кНст в 0,001 М фосфатном
буфере рН 6,2, при температуре 37 °С снижение оптической плотности со ско­
ростью 0,1 ед./мин (измерение при длине волны 520 нм). Оптимальные условия
действия препарата: рН 6,2, температура 40 °С. Наполнитель препарата — пова­
ренная соль.
V
«Лизосубтилин Г 1Ох» — препарат литических ферментов широкого спектра
действия, выделяемый из культуры В. зиЫШз. В ферментном комплексе препарата
присутствуют литические пептидазы, сопутствующий фермент — а-амилаза (не­
значительная активность). Стандартная литическая активность — 1 000 000 ед./г.
За единицу активности принято количество фермента, вызывающее в 1 мл стан­
дартной суспензии клеток штамма К -12 при рН 7,2 и температуре 30 °С снижение
оптической плотности со скоростью 0,001 ед./мин при измерении в области спект­
ра с длиной волны 520-540 нм.
Оптимальные условия действия препарата: рН 7,2 и температура 37-50 °С.
Водные растворы препарата стабильны при рН 5-9 и температуре не выше
50 °С. Наполнитель препарата — поваренная соль. Влажность препарата — не
выше 13 %.
*
I. К'г' -1
«Фермосор» — иммобилизованная форма «Лизосубтилина», получаемая пу­
тем сорбции литических ферментов из водного раствора «Лизосубтилина Г10х»
на карбоксильном катионите СГ-1М. Стандартная активность — 50 000 ед./г.
Стандартизуется добавлением сорбента. В водных средах «Фермосорб» набухает.
Оптимальные условия действия те же, что у «Лизосубтилина». Препарат облада­
ет повышенной кислотостабильностью, сохраняя значительную часть активности
при рН до 2,6.
<
Мулътиэнзимные композиции и премиксы. «МЭК ПП-1 для пивоварения»
(ТУ 59.01.003.43-81) получается путем смешения препаратов «Амилосубтилина
Г10х», «Протосубтилина Г10х» и «Амилоризина ШОх» в количествах, необхо­
димых для получения стандартной активности. Стандартная амилолитическая
активность «МЭК ПП-1» (при рН 6) составляет по группам: 1 — 2650 ед./г, 2 —
2100 ед./г; протеолитическая активность препарата (при рН 5,5-5,7): 1 — 30 ед./г,
2 — 70 ед./г,
; ‘
,• м
«Амилопротосубтилин» предназначается для использования в пивоварении
при осахаривании заторов, содержащих 30-40 % несоложеного ячменя. Препарат
составляют из «Амилосубтилина ГЗх-Ф» и «Протосубтилина ГЗх-Ф». Стандарти­
зуется по трем видам активности. В стандартном препарате активность а-амила­
зы — 600 ед./г, нейтральной протеазы — 50 ед./г, Р-глюканазы — 300-400 ед./г.
Оптимальные условия действия: рН 5,5-6,5, температура 50-70 °С.
Таблица 3.5 . Технологические режимы ферментного препарата
«МЭК-1 для виноделия»
Фермент
;
Оптимум действия
Зона стабильности,
рН
рН
\температура, 'С
р-Глюканаза
6,5
|
50
3,5-8,0
Р-Маннаназа
5,6-6,0
|
50
4,0-8,0
Кислая протеаза
2,5-3,0
1
50
2,5-6,0
Эндополигалактуроназа
5,0-5,2
|
45-50
3,0-6,0
«МЭК-1 для виноделия» (ТУ 565/10.18.08-87) включает в свой состав фер­
ментные препараты в следующих процентных долях: «Р-Глюканаза Г 1Ох» с актив­
ностью 600 ед./г — 50 %, «Р-Маннаназа ГЮх» с активностью 300 ед./г — 3,4 %;
«Кислая протеаза ГЮх» с активностью 30 ед./г — 3,4 %; «Эндополигалактуроназа ГЮх» с активностью 100 000 ед./г — 0,9 %. Остальные 43 % массы препара­
та составляет наполнитель — поваренная соль. Оптимум действия представлен
в табл. 3.5.
3.4. ПРОДУКТЫ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ
б и о к о н в ер с и и
Технологии биоконверсии растительного сырья широко применяются в пищевой
и перерабатывающей промышленности с целью получения высококачественной
и конкурентноспособной продукции, а также организации малоотходных произ­
водств. Методами биоконверсии с использованием ферментов получают биологи­
чески ценные продукты, которые находят все большее распространение в техно­
логиях пищевых производств.
Пектин. Благодаря прекрасным желирующим свойствам пектин широко приме­
няется в производстве пищевых продуктов — кондитерских изделий, фруктовых
желе, джемов. Пектин вместе с другими некрахмалистыми полисахаридами об­
разует группу пищевых волокон, положительно влияющих на процесс пищеваре­
ния (стимулирует моторную функцию кишечника, препятствует всасыванию холе­
стерина, нормализует состав микрофлоры кишечника, участвует в ингибировании
гнилостных процессов, адсорбирует желчные кислоты).
Кроме того, пектин обладает детоксицирующими свойствами, связывая ток­
сичные элементы и радионуклиды и выводя их из организма. Это делает пектин
и пектиносодержащие продукты ценной добавкой при производстве продуктов
лечебно-профилактического назначения.
Для производства пектиновых веществ можно использовать любое раститель­
ное сырье с высоким содержанием пектина. Основными источниками получения
пектинов являются четыре вида растительного сырья: яблочные выжимки, жом
сахарной свеклы, корзинки подсолнечника и корочки цитрусовых. В настоящее
6 -19739
время ведутся исследования по использованию и другого фруктово-ягодного сы­
рья для производства пектинов.
Существует традиционная технология получения пектина, основанная на кис­
лотно-термическом гидролизе и спиртовом коагулировании пектина из экстракта.
Условно процессы получения пектина можно разделить на три основные группы.
Первая группа технологических процессов включает подготовку сырья, кис­
лотный гидролиз протопектина, экстрагирование пектина из тканей сырья в вод­
ную фазу (экстракт), очистку и концентрирование пектинового экстракта; вто­
рая — спиртовое выделение пектина из экстракта, его сушку и стандартизацию;
третья — процесс регенерации отработанных спиртов и утилизацию или обезво­
живание твердых отходов и стоков пектинового производства. Такая технология
производства пектина энергоемка и требует огромных затрат на производство,
утилизацию кислых сред и амортизационные отчисления на восстановление тех­
нологического оборудования, работающего в агрессивных средах, а также содер­
жание очистных сооружений и пр.
Кислотный гидролиз растительного сырья с целью высвобождения раствори­
мого пектина может быть заменен на ферментативный с использованием целлюлаз, гемицеллюлаз и пектолитических ферментов. Ферментативный гидролиз сы­
рья взамен кислотного существенно упрощает технологию производства пектина.
Снижается количество неорганических примесей в пектине, расход этанола на его
осаждение и промывание, сокращаются энергозатраты.
Гидролиз целлюлозы облегчает переход комплекса полигалактуроновой кис­
лоты и гемицеллюлоз в свободное состояние. Выделение собственно растворимо­
го пектина (метоксилированной полигалактуроновой кислоты) возможно двумя
путями: гидролитическим отщеплением гемицеллюлозной составляющей комп­
лекса с помощью гемицеллюлаз или ограниченным гидролизом полигалактуро­
новой кислоты с помощью пектинрасщепляющих эндоферментов, с вычленением
достаточно крупных ее фрагментов, сохраняющих основные физико-химические
свойства пектина.
Методы, основанные на применении препаратов целлюлаз без существенной
примеси пектиназ, не позволяют получать достаточно чистого пектина, посколь­
ку не отделяется гемицеллюлозная составляющая комплекса. При использовании
пектиназ этот недостаток устраняется, но важно ограничить степень гидролиза
пектина в процессе его выделения и получить продукт достаточно высокой моле­
кулярной массы.
Предложенный более двух десятилетий назад способ получения пектина из
выжимок (яблок, груш, айвы и других видов сырья) основан на гидролизе сырья
«Целловиридином ГЗх». В данном ферментном препарате практически отсутству­
ет пектиназная активность. Гидролиз свежего сырья проводят в течение 2-3 ч при
температуре 45-50 °С, гидромодуле 1 : 3 и дозе препарата 0,1-0,3 % к массе сы­
рья. При гидролизе в экстракт переходит 85-90 % пектина, который представлен
как в виде пектиновой кислоты, так и в виде протопектина (то есть в комплексе с
гемицеллюлозой). Из экстрактов получают концентрированные жидкие или спир­
тоосажденные сухие препараты пектина.
Более чистые препараты пектина получаются при гидролизе сырья пектинрасщепляющими ферментами. Для выделения пектина из цитрусовых выжимок
используют препараты «Пектомацерин ГЮх» и «Пектациллиацин ГЮх». Опти­
мальная доза первого препарата составляет 0,0025-0,0062 %, второго — 0,050,07 % к массе сырья. Гидролиз проводят при рН 3,5—
4,5 и температуре 40-45 °С
в течение 30—60 мин. При осаждении пектина из экстракта выход составляет 14 %
к массе сырья. Повышение дозы ферментных препаратов приводит к деградации
пектина, что выражается в уменьшении желирующей способности.
Имеется практический опыт получения пектина из тыквенного жома, кото­
рый является отходом производства тыквенного сока. При этом использовали
6 отечественных ферментных препаратов в качестве гидролизующих агентов.
Наибольший выход пектина получен при использовании ферментного препарата
Азр. (жатоп (14 % от массы воздушно-сухого жома против 7 % при кислотной
экстракции). Ферментный препарат обладает целлюлазной, {3-гликозидазной, эндополигалактуроназной и пектинэстеразной активностями. Полученный тыквен­
ный пектин обладает способностью эффективного комплексообразователя с тяже­
лыми металлами и может быть использован как функциональная добавка в произ­
водстве продуктов лечебно-профилактического назначения.
Используя новые технологии выделения пектина из растительного сырья,
получены его высокоочищенные препараты. Охарактеризуем лишь некоторые из
них. Препараты «Зостерин» и «Ронколейкин» зарекомендовали себя как средст­
ва для улучшения общего состояния больных в послеоперационный период. Они
снижают симптомы интоксикации, успешно применяются при лечении онкозабо­
леваний, в частности рака толстой кишки.
Препарат «Бромелайн», содержащий клетчатку и пектин ананаса, сжигает
жиры, снижает риск тромбофлебита, повышенной свертываемости крови, раз­
жижает слизь, увеличивает силу действия антибиотиков. Энтеросорбент «Пекто»
обладает выраженным бактерицидным действием в отношении возбудителей ос­
трых кишечных инфекций. Препарат яблочного пектина выводит из организма
токсины, накапливаемые им в процессе жизнедеятельности, обладает активной
комплексообразующей способностью по отношению к радиоактивному кобаль­
ту, стронцию, цезию, цирконию и другим металлам, связывает желчные кислоты
в кишечнике и этим препятствует накоплению холестерина в организме.
Натуральные пищевые красители. Приятный цвет — важнейший органолеп­
тический показатель, который в совокупности со вкусовыми и ароматическими
свойствами определяет потребительские свойства продукта и привлекает внима­
ние покупателя. Натуральные пищевые красители получают из овощей, фруктов,
ягод, насекомых, а также листьев, содержащих пигменты (хлорофиллы, антоци­
аны, ксантофиллы>каротиноиды). Способы получения натуральных пищевых
красителеи различны и зависят от свойств основного окрашивающего пигмента,
характера сопутствующих веществ, а также от вида используемого сырья. Обыч­
но красящие вещества извлекают из соков растений путем экстракции их соот­
ветствующими растворителями.
Так, для экстракции водорастворимых красителей — антоцианов — применя­
ют воду и этанол. С помощью неполярных растворителей и растительных масел
выделяют липофильные красители — хлорофиллы и каротиноиды. Содержание
красящих веществ в исходном сырье достаточно низкое, поэтому для их очистки
и последующей концентрации применяют различные технологические приемы.
Технология производства натурального красителя из фруктово-ягодного сы­
рья сводится к следующему. Ягоды дробят, сок из мезги отделяют прессованием.
После грубой фильтрации сок сульфитируют (из расчета 1,5-2 г/л сернистого ан­
гидрида) и отстаивают в герметичном резервуаре в течение 15 мин. Осветленный
сок фильтруют на рамном фильтр-прессе и сгущают под вакуумом. Концентрация
красящих веществ в таких красителях невелика — около 30 г/л, что, несомненно,
ограничивает их широкое применение.
' ’
:1
Выход красящих веществ можно увеличить путем замораживания плодовоягодного сырья. При замораживании в выжимках ягод инактивируются ферменты
и в значительной мере замедляются биохимические и окислительные процессы.
Это способствует стабилизации пигментов.
Кроме того, глубокое замораживание растительных тканей при температуре
—40 °С обуславливает повышение проницаемости и диффузионной способности
тканей из-за разрушения их кристалликами льда. Посредством замораживания
был увеличен выход антоциановых красителей из выжимок черной смородины
и черноплодной рябины и составлял в среднем 30-35 %. Полученные таким спо­
собом черносмородиновые и черноплодно-рябиновые натуральные пищевые кра­
сители следует хранить при температуре от 0 °С и не выше 20 °С при относитель­
ной влажности воздуха не более 75 % в течение 1 года с момента изготовления.
Разработана технология получения красного свекольного красителя либо из
сброженного свежеотжатого сока, либо из сока, доведенного до величины рН, оп­
тимальной с точки зрения стабильности окраски. Далее проводят его высушивание
в распылительной сушилке методом пневмоцентробежного распыления, позволя­
ющего получать тонкодисперсные порошки за счет совокупного воздействия на
распыляемый продукт центробежных сил инерции и давления сжатого воздуха.
При производстве пищевых красителей для полного извлечения красящих ве­
ществ из сырья применяются прессование, экстрагирование в системе больших
соотношений: твердое тело - экстрагент; прямоточные и противоточные способы.
Из них основной способ — процесс экстрагирования красящих веществ из расти­
тельной ткани. Он имеет две сопряженные стадии: проникновение растворителя
внутрь клетки и диффузию растворенного красителя во внеклеточное пространство. ,
.
Энокраситель получают из выжимок красных темных сортов винограда,
содержащих 4-7 % антоцианов — энина и энидина. Энокраситель используют
вместо красителя амаранта для подкрашивания пищевых продуктов в кондитер­
ской, винодельческой, безалкогольной отраслях пищевой промышленности. Он не
только придает цвет продукту, но и обладает пищевой ценностью, так как содер­
жит сахара, кислоты, пектин, дубильные и минеральные вещества.
9
Предложенные способы получения сухого энокрасителя основаны на осажде­
нии антоцианов в виде комплексов с двухвалентными металлами. Солянокислый
экстракт красящих веществ нейтрализуют до рН 7 (ТЧаОН или № 2С 0 3) и обра­
батывают СаСЬ. Затем после 3—4-часового отстоя нерастворимый в воде осадок
отделяют, сушат и измельчают. В отдельных партиях энокрасителя содержание
красящих веществ изменяется в сравнительно больших пределах — 31,6-75 г/кг.
Количество сухих веществ (СВ) в образцах красителя составляет 26-27 %. Титру­
емая его кислотность довольно высока. Концентрированный энокраситель хоро­
шо растворим в воде.
Красящие вещества извлекают из виноградных выжимок и путем их обра­
ботки растворами кислот — сернистой, соляной, винной и лимонной. Сернистую
кислоту используют в виде 0,2—2%-ного водного раствора, которым заливают вы­
жимки в соотношении 1 : 1 . Выжимки перемешивают с раствором, выдержива­
ют 4 сут. и прессуют, получая раствор энокрасителя. Благодаря бактерицидным
свойствам сернистой кислоты раствор хорошо сохраняется. Перед использовани­
ем его десульфитируют путем нагревания. Соляную кислоту применяют в виде
1%-ного водного раствора, которым заливают выжимки. После перемешивания
его настаивают в течение 1—2 сут. Отжатый экстракт, имеющий концентрацию СВ
5-7 %, уваривают до их концентрации 40-50 %.
Иногда конечный продукт в производстве красителя закрепляют этанолом до
16 об%. Такой краситель представляет собой водно-спиртовый концентрат. За­
крепление красителя этиловым спиртом обеспечивает его надежную микробиоло­
гическую и противоокислительную защиту. Краситель демонстрирует устойчивое
окрашивание пищевых продуктов при рН 2,8-4,5.
Этап концентрирования антоцианового экстракта является важным в произ­
водстве энокрасителя: от него в значительной степени зависит качество готового
концентрата. Использование теплового способа концентрирования антоциано­
вого экстракта вызывает усиление процессов свободнорадикального окисления
фенольных соединений, их полимеризацию, поликонденсацию и, как результат,
появление нежелательных изменений в цветовой характеристике продукта. Нега­
тивное действие на качество энокрасителя оказывает и повышение норм кислот­
ности в процессе концентрирования, что сопровождается гидролизом красящего
вещества — энина.
Всероссийским научно-исследовательским институтом комбикормовой про­
мышленности (ВНИИКП) разработана технология получения желтого красителя
из лепестков календулы для подкрашивания пищевых жиров. Этот краситель яв­
ляется полноценным заменителем желтого импортного красителя аннато, а так­
же отечественного, получаемого из моркови, тыквы и томатов. Преимуществом
нового красителя является то, что для его изготовления используется непищевое
сырье.
Два способа извлечения пигмента из цветков календулы позволяют получать,
соответственно, два вида красителей: масляный экстракт и спиртовый раствор
красящих веществ календулы. Это дает возможность окрашивать красителем из
календулы разнообразные продукты питания. Масляный экстракт используют
для окраски жиросодержащих пищевых продуктов: маргарина, масла, сыра и др.
Спиртовые же растворы позволяют получать желтые тона различной интенсивнос­
ти в кондитерских изделиях, концентратах, сиропах, фруктовых напитках и др.
Во ВНИИКП исследована также возможность извлечения красящих веществ
из шалфея (стебли, листья, побеги), полученного в виде отходов после экстрак­
ции из растения эфирного масла. Предварительно отходы шалфея измельчали.
Экстракцию проводили тремя способами: настаиванием в спирте без подогрева,
настаиванием в спирте в колбе с обратным холодильником при подогреве на ки­
пящей водяной бане и непрерывным экстрагированием в аппарате Сокслета. Во
всех случаях получался прозрачный спиртовый экстракт яркого изумрудно-зеле­
ного цвета. Однако при извлечении красящих веществ из отходов шалфея выход
высушенных экстрактивных веществ составлял всего 3 %.
Остаток экстрактивных веществ, полученный при концентрировании спир­
товых экстрактов выпариванием растворителя досуха, окрашен в темно-зеленый
цвет. Он хорошо растворяется в спирте и нерастворим в воде. Хорошая раствори­
мость концентрированного спиртового экстракта в спирте указывает на возмож­
ность получения красящих веществ из шалфея в концентрированном виде.
Разработан способ получения красителя из зелени петрушки, который заклю­
чается в следующем: 500 г высушенной и измельченной зелени петрушки сме­
шивают с 2,5 г М §0 и экстрагируют в противоточном шнековом экстракторе при
15 °С с 1500 г 96%-ного этилового спирта в течение 200 мин при среднем времени
нахождения сырья в экстракторе 40 мин. Полученный экстракт фильтруют, от­
гоняют растворитель и концентрируют продукт в роторно-пленочном испарите­
ле при температуре 35 °С и остаточном давлении 1330 Па в течение 1 ч. Таким
образом получают черно-зеленую пасту с содержанием сухого вещества 78 % в
количестве 4 % от массы экстракта, взятой за 100 %.
В России в качестве источника черного красителя используют кожуру незре­
лого грецкого ореха, которую высушивают до влажности не более 20 %, измельча­
ют в два этапа: грубый помол и ультрадисперсное измельчение. На первом этапе
достигается размер частиц не более 0,5-1 мм. Последующее измельчение прово­
дят с одновременной досушкой продукта в вихревой мельнице при температу­
ре потока газа не более 80-95 °С. Полученные частицы имеют размеры не более
50 мкм и влажность 2-3 %.
Полученный по данной технологии дисперсный порошок черного красите­
ля дополнительно подвергают повторной экстракции водой в течение не менее
30 мин при температуре кипения. Экстракт отстаивают и фильтруют. В получен­
ный жидкий экстракт вводят консервант. В процессе экстракции на смесь ультрадисперсного порошка можно дополнительно воздействовать виброакустическим
полем, а жидкий экстракт подвергнуть распылительной сушке. Полученный чер­
ный краситель годен для использования в пищевой промышленности.
Разработан еще один способ получения черного красителя из незрелого грец­
кого ореха или из его кожуры, заключающийся в измельчении сырья до частиц
размером не более 0,2 мм и прессовании массы с получением сока и жмыха. Сухой
жмых (влажностью 3—5 %) измельчают в вихревой мельнице до порошка с разме­
ром частиц не более 60 мкм.
Порошок смешивают с полученным соком ореха в соотношении не более
3,5 : 1, нагревают и выдерживают при 100-120 °С до образования желеобразной
массы, которую охлаждают до комнатной температуры и смешивают со спиртом
в соотношении не менее 10: 1. Смесь выдерживают в течение 60 мин и подверга­
ют фильтрации на электрофильтре.
Массу, осажденную на фильтре, собирают и центрифугируют при скорости
не менее 5000 об/мин в течение 30 мин. Осадок из центрифуги вначале нагревают
при температуре не более 150 °С в течение 10-15 мин, а затем помещают в му­
фельную печь при 350 °С на 5-10 мин.
Полученный продукт смешивают со спиртом в соотношении не более 10:1,
выдерживают в течение 20-30 мин и фильтруют. Полученный на фильтре осадок
и является красителем. Приведенный способ позволяет получить из природного
сырья экологически чистый черный краситель, обладающий высокими красящи­
ми свойствами.
Технология получения красителя из какаовеллы предусматривает ее измель­
чение до частиц размером менее 120 мкм и удаление жира из измельченной массы.
Обезжиренный остаток нагревают со щелочью при температуре 20-21 °С в тече­
ние от 5 мин до 36 ч до получения требуемой окраски. Для экстракции добавляют
воду. После отгонки экстракта остаток высушивают распылительной сушкой до
получения порошка красно-коричневого цвета.
Представляет интерес и технология получения красителя из гречишной луз­
ги. Ценность его обусловлена химическим составом лузги, отличающимся от обо­
лочек других зерновых культур высоким содержанием полифенолов.
В гречишной лузге содержатся рутин, кемпферол, кверцетин и его производ­
ные — гиперозид, кверцитрин, катехины, фенолкарбоновые кислоты (галловая,
кофейная, протокатехиновая, хлорогеновая). Суммарное содержание полифено­
лов в ней — 1,5-2,5 %. Из них таннинов — не менее 1 %, флавоноидов — 0,5 %
(в том числе рутина — 0,05 %, кверцетина — 0,015 %). В составе основных крася­
щих веществ красителя — полифенолов — присутствует значительное количест­
во веществ с лечебно-профилактическими свойствами, в том числе с Р-витаминной активностью.
Растительные фенолы обладают биоцидными свойствами, предохраняющи­
ми лузгу от гниения, и придают ей темно-коричневый цвет. В лузге присутствуют
также витамины и антиоксиданты, минеральные вещества, в том числе железо,
марганец, кобальт, медь, фосфор и др.
В настоящее время предлагаются принципиально новые способы выделения
красителей из гречишной лузги, предусматривающие высокую электроимпульсную технологию экстремального воздействия на сырье (ударная волна, ультра­
звук, магнитное поле, электронный удар). Такие технологии позволят создавать
технологические линии для производства биофлавоноидных и других красящих
веществ из различных видов растительного сырья.
В литературе имеются данные о способах получения высококачественного
красителя из нетрадиционного вида сырья — антоциансодержащих мужских со­
цветий кукурузы (метелок). Данный вид сырья отличается высокой концентра­
цией содержания пигмента, а также возможностью длительного хранения, что
позволяет обеспечить круглогодичное производство натурального антоцианового
красителя.
,■
Способы выделения натуральных пищевых красителей все более совершен­
ствуются. Особое место при выделении натуральных красителей занимают
гидролитические ферменты — целлюлазы, гемицеллюлазы, пектиназы. При их
действии уменьшается количество и прочность связей пигмента с лигнин-углеводным комплексом клетки, тем самым облегчается доступ к нему экстрагента и
увеличивается выход.
Для увеличения выхода натуральных, в частности антоциановых красителей
из сырья используют комплексные ферментные препараты, обладающие пектолитическим и целлюлолитическим действием, такие как «Пектинес Ультра 8р-Ь»,
«Пектинес 8Х-Ь» и «Пектофоетидин П10х». Например, при получении антоциа­
нового красителя из аронии (черноплодной рябины) предварительная фермента­
ция ягод с «Целлюлазой-100» (гидромодуль 1 : 5, температура 50 °С, экспозиция
2 ч, доза препарата 0,4 % к массе сырья) повысила выход антоцианов при после­
дующей водно-спиртовой экстракции на 25 %.
^ т‘
Стабилизируют красители с помощью консервантов. Обычно для этого при­
меняют сульфитацию с использованием 80г.
Продукты гидролиза крахмала. Мировая потребность в сахаре в настоящее вре­
мя в значительной мере удовлетворяется за счет сахаристых изделий из крахмала,
производство которых в развитых странах существенно превышает производство
сахарозы. Различные виды сахаристых продуктов получают из крахмала, зерен
злаков, молочной сыворотки, инулинсодержащего сырья.
Ведущее место занимают гидролизаты крахмала (различные виды патоки
и глюкозо-фруктозный сироп). Гидролизаты крахмала — продукты частичного
гидролиза кукурузного, пшеничного или картофельного крахмала разбавленными
кислотами, ферментами или и теми, и другими. При гидролизе (осахаривании)
происходит деструкция крахмала и образование продуктов с различной молеку­
лярной массой (декстрины, мальтоза, глюкоза):
(СбН,0О5)п —>
Крахмал
(СбНю05)п
Ряд декстринов
—►С 12Н 22О 11 —* СвНпОб
Мальтоза
Глюкоза
Управляя процессом гидролиза, можно получить нужные для пищевой про­
мышленности и питания продукты. Технология сахаристых продуктов из крах­
мала имеет единую принципиальную схему, включающую три последователь­
ные стадии: клейстеризация-разжижение крахмала, осахаривание, изомеризация
глюкозы. Отдельные продукты получают, используя только первую, или первую
и вторую, или все три стадии.
При кислотной конверсии не достигается полное осахаривание крахмала, вы­
ход глюкозы не превышает 70 %, в гидролизатах образуются продукты реверсии
и термического разложения углеводов, снижающие качество и выход сахаристых
продуктов. Кислотный гидролиз иногда используется в биоконверсии крахмала на
стадии разжижения.
В середине 1960-х гг. на смену кислотному и кислотно-ферментативному про­
цессам пришел ферментативный способ переработки крахмала, основанный на
последовательном применении а-амилазы В. виЪпПв («Амилосубтилин») и амилоглюкозидазы Авр. опгае («Амилоризин») или Авр. пщег («Амилонигерин»).
Главное преимущество ферментативного гидролиза крахмала перед кислотным
связано с увеличением скорости процесса, уменьшением уровня загрязнения про­
дуктами реверсии, получением продукта с высоким декстрозным эквивалентом
(ДЭ). Величина ДЭ гидролизата (в используемой шкале глюкоза —декстроза со­
ответствует 100 ед.) отражает глубину гидролиза крахмала, для которого ДЭ счи­
тается равным нулю.
Важным шагом совершенствования ферментативного гидролиза было внед­
рение в производство термостабильных а-амилаз, главным образом из В. ПсИет/огтгв, позволяющих после обработки амилоглюкозидазой получать продукцию
с ДЭ, близким к 100.
Высокотемпературное ожижение крахмала сегодня стало обычным промыш­
ленным процессом, но следующий этап — осахаривание — до сих пор осуществ­
ляется при участии «обычной» глюкоамилазы Авр. пщег путем одноразовой об­
работки. Степень расщепления крахмала на стадии клейстеризации-разжижения
зависит от продолжительности процесса. Изменяя продолжительность процесса,
можно регулировать степень расщепления крахмала. Технология ферментативно­
го разжижения крахмала в различных модификациях используется для получения
мальтодекстринов с содержанием редуцирующих веществ (РВ) 5-27 %.
Мальтин — продукт с РВ 5-8 %, получаемый путем декстринизации карто­
фельного или кукурузного крахмала в одну стадию с использованием «Амилосубтилина Г10х». Процесс проводят при 85 °С с последующей термообработкой
при температуре 110-115 °С. В новом варианте технологии мальтина использу­
ется «Амилолихетерм» (0,45 ед./г крахмала), суспензию крахмала нагревают до
105 °С, затем охлаждают до 95 °С. Достаточная степень гидролиза достигается за
5-7 мин. Гелеобразующая способность мальтина, полученного по данной техно­
логии, на 30 % выше, чем при использовании «Амилосубтилина».
Мальтин обладает свойством образовывать прочные гели, которые обратимо
разрушаются при повышении температуры, что позволяет применять его взамен
жиров в составе майонезов, кремов для тортов, как замутнитель при производстве
безалкогольных напитков.
Мальтодекстрины — продукты с РВ до 25 %, получают по двухстадийной схе­
ме разжижения крахмала, с промежуточной термообработкой, используя препарат
«Амилосубтилин ПОх». Мальтодекстрины степени полимеризации 150-200, что
соответствует степени расщепления крахмала 13-18 %, используют как углевод-
ныи компонент питания детей грудного возраста. Мальтодекстрины применяют
в составе майонезов, маргаринов, кремов для тортов, суповых концентратов, кон­
дитерских изделий.
Продуктами неполного осахаривания крахмала глюкоамилазой являются раз­
личные виды патоки. Осахаривание глюкоамилазой можно проводить в разных
режимах, получая продукты с РВ от 28 % и выше.
Состав олигосахаридов зависит от степени конверсии крахмала. В продуктах
с РВ 30—40 % присутствует значительное количество олигосахаридов со степе­
нью полимеризации 3-7. При РВ более 40 % заметно снижается концентрация
мальтотриозы, достигая минимума при РВ около 70 %. Снижение концентрации
мальтозы происходит в интервале РВ 66-95 %. Содержание олигосахаридов со
степенью полимеризации 4-6 наблюдается при РВ менее 50 %, а при РВ около
50 % содержание олигосахаридов со степенью полимеризации более 7 достигает
минимума.
. 1/.ц .^<;д
.
. '_ ..
Патоки применяют в качестве антикристаллизатора при производстве кара­
мели, повидла, в хлебопечении, консервном производстве, производстве безалкагольных напитков, мороженого. Основные операции при получении крахмальной
патоки: подготовка крахмала, ферментативный гидролиз крахмала, инактивация
ферментов, очистка полученных сиропов и их уваривание.
Низкоосахаренная патока с РВ 28-32 % содержит около 10 % глюкозы, 40 %
олигосахаридов со степенью полимеризации 4—6, по 20 % мальтозы и мальтотри­
озы, а также олигосахариды со степенью полимеризации 7 и более. Применяется
при производстве карамели, а также как углеводный компонент лечебных чаев.
Карамельная патока с РВ 38-44 % содержит 19-23 % глюкозы, около 24 %
мальтозы, 20 % мальтотриозы, не более 20 % олигосахаридов со степенью поли­
меризации 4-6. Применяется при производстве леденцовой карамели.
Высокоосахаренная патока может содержать от 44 до 70 % РВ. При РВ 5560 % в ней содержится 34-40 % глюкозы, 24 % мальтозы, не более 13 % маль­
тотриозы, незначительные количества олигосахаридов с более высокой степенью
полимеризации. Используется при прфизводстве хлебобулочных, кондитерских
изделий, молочных и фруктовых консервов, столовых сиропов, пива.
Высокомальтозная патока— продукт Р-амилолизаразжиженного 30-35%-ного
крахмала с использованием бактериальной Р-амилазы, например, из В. ро1утуха.
Содержание РВ 48-49 %, общее содержание сбраживаемых сахаров 70-75 %. Вы­
сокомальтозная патока используется взамен сахарозы при производстве леденцо­
вой карамели и мороженого.
Глюкозно-мальтозная патока характеризуется примерно равным содержани­
ем глюкозы и мальтозы при РВ 66,8-70 %. Повышение содержания мальтозы, по
сравнению с высокоосахаренной патокой, достигается за счет действия грибной
а-амилазы «Амилоризина». Фермент расщепляет крахмал с образованием маль­
тозы в качестве основного продукта реакции. Патока характеризуется высокой
сбраживаемостью, некристаллизуемостью и стабильностью к микробиологичес­
кой порче. Она может применяться в составе различных пищевых продуктов.
I
I
I
В
Ц
В
■
I
■
■
■
■
В
I
I
I
■
■
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
!
Конечным продуктом гидролиза крахмала является глюкоза, она широко применяется в пищевой промышленности в виде кристаллической глюкозы, а также используется в качестве источника получения глюкозо-фрукгозных сиропов
(ГФС). Предполагается, что в ближайшее время 30—50 % потребности в сахаристых веществах в мире будет удовлетворяться за счет производства ГФС, и это
связано с тем, что один из его компонентов — фруктоза — является более сладким природным сахаром, чем сахароза. Следовательно, ГФС может потребляться
в меньшем количестве, чем сахароза.
Глюкозный сироп, очищенный фильтрацией через кизельгур, активированный уголь и ионообменные смолы, концентрируют упариванием при 60 °С до
содержания СВ 45 %. Концентрированный продукт является субстратом для изомеризации.
Изомеризацию глюкозы во фруктозу проводят с помощью иммобилизованных препаратов глюкоизомеразы, которые помещают в колонны. Степень конверсии глюкозы зависит от скорости пропускания ее через колонный реактор, от рН
и температуры, концентрации солей магния и кобальта. Используют препараты
с достаточно высокой термостабильностью, поскольку процесс изомеризации
проводится при 58-60 °С во избежание инфицирования продукта. Увеличение
температуры более 60 °С, особенно в щелочной среде, приводит к увеличению
количества кетосахаров за счет химической изомеризации и продуктов деградации сахаров.
Отечественная технология ГФС основана на применении препарата «Имфрузим». Процесс изомеризации проводят при рН 7,8 и температуре 58-60 °С. В продукте конверсии содержится 42-43 % фруктозы, 51-52 % глюкозы. После очистки
на ионообменниках и активированном угле продукт уваривают до концентрации
сухих веществ 71 %. В ГФС с содержанием фруктозы 42 % в процессе хранения
кристаллизуется глюкоза, поэтому предпочтительно вырабатывать ГФС с содержанием фруктозы 55 %. ГФС является универсальным заменителем сахарозы. Он
применяется при производстве соков, безалкогольных напитков, вина, ликеров,
хлебобулочных изделий, фруктовых и молочных консервов, мороженого.
Полуфабрикаты для алкогольных и безалкогольных напитков. Частичная
переработка плодового и другого растительного сырья в полуфабрикаты для алкогольных и безалкогольных напитков (сиропы, экстракты, концентрированные
основы и др.) может осуществляться на заготовительных пунктах. Получение некоторых полуфабрикатов для безалкогольных напитков из плодового и другого
растительного сырья (соков, концентрированных основ, экстрактов, сиропов) от­
ражено на рис. 3.4.
Как видно из схемы, при производстве полуфабрикатов безалкогольных,
а также алкогольный напитков применяется ферментация растительного материа­
ла. Мезгу плодов и овощей необходимо обрабатывать ферментными препаратами
пекголитического и целлюлолитического действия, предварительно подогрев ее
до 80-85 °С для инактивации окислительных ферментов.
СУХОЕ
РАСТИТЕЛЬНОЕ СЫРЬЕ
ПРЕССОВАННАЯ
МЕЗГА ЯГОД, ПЛ0Д01
СУХОЕ
ОВОЩНОЕ СЫРЬЕ
Ферментативный
гидролиз
Ферментативный
гидролиз
Разваривание
Протирание
Смешивание
1
Сгущение
соков
Стерилизация
Сахар
Гомогенизация
Вода,
ферменты,
лимонная
кислота
Нагревание
и кипячение 30 мин
Дозирование соков и пюре
1
КОНЦЕНТРИРОВАННЫЙ
ПОЛУФАБРИКАТ
Агломерирование
Досушивание
Измельчение
Спиртование экстракта
Дозирование
Купажирование
РАСТИТЕЛЬНЫЕ
ЭКСТРАКТЫ
СИРОПЫ НА ПЛОДОВОМ
И РАСТИТЕЛЬНОМ СЫРЬЕ
ПОРОШКООБРАЗНЫЕ
КОНЦЕНТРАТЫ
Рис. 3.4. Получение некоторых полуфабрикатов из растительного сырья
для алкогольных и безалкогольных напитков
При получении экстрактов для каждого вида сырья подбирают оптимальные
условия: соотношение жидкой и твердой фазы, температурный режим, рН среды,
комплексы ферментных препаратов. Последние выбирают в зависимости от структурно-механических и физико-химических свойств сырья: для корневищ это цитопекто-протоамилолитический комплекс, для трав — цитопектопротеолитический.
Для обработки пряно-ароматических трав (зизифоры, мяты, душицы, бази­
лика) используют препарат «Цитороземин Пх» в количестве 2 % к массе сырья,
гидролиз проводят в течение 4 ч при 45—55 °С. С целью повышения степени экс­
тракции в среду вводят 3 % сахара-сырца. Сочетание ферментативной обработки
с применением сахара увеличивает выход экстрактивных веществ (по оптической
плотности) на 30-70 %.
Новая технология переработки сырья разработана для получения морсов
в ликероводочной промышленности. Так, для приготовления морса из чернослива
в дробленое сырье вносят водный раствор мультиэнуимной композиции, состоя­
щий из 0,5 % «Пектофоетидина ШОх» (активность 9 ед./г) и 0,005 % «Целловиридина Г1Ох».
Для приготовления морса первого слива в смесь добавляется водно-спиртовый раствор крепостью 10 % с учетом сохранения необходимого соотношения сы­
рье : экстрагент. Ферментативная обработка длится 4 ч при 20 °С, смесь спиртуют
до крепости 50 %, настаивают в течение 2-3 сут. с периодическим перемешивани­
ем. Морс второго слива готовят путем вторичного внесения в сырье водно-спир­
тового раствора крепостью 45 % в количестве 70 % от внесенного в первый раз
и выдержки в течение 2—3 сут. Морсы первого и второго слива объединяют.
Технология приготовления рябинового морса включает дробление сырья,
смешивание с водно-спиртовым раствором, внесение препарата «Пектофоетидин
П10х» в количестве 0,1 % и настаивание при температуре 20 °С в течение 6 ч. Да­
лее смесь спиртуют до крепости 50 % при соотношении сырье : экстрагент 1 : 4
и настаивают 3-4 сут. Получают морс первого слива. Сырье вторично заливают
водно-спиртовым раствором крепостью 45 % в количестве 70 % от внесенного
в первый раз и выдерживают в течение 3-4 сут. Морсы первого и второго слива
объединяют. По разработанной технологии продолжительность настаивания со­
кращается в 3—4 раза, а содержание извлекаемых экстрактивных веществ возрас­
тает на 3 %.
Ферменты также используются и на других стадиях производства полуфаб­
рикатов для напитков. Разработана технология получения виноградного сиропа
как основы безалкогольных напитков и мороженого с использованием фермента
сырья — Р-фруктофуранозидазы. С помощью фермента гидролизуется сахароза,
которую вносят в виноградное сусло при приготовлении сиропа.
Фермент имеет оптимум действия при рН 4-5 и температуре 45-65 °С. Мак­
симальная активность Р-фруктофуранозидазы накапливается в винограде различ­
ных сортов при концентрации сахаров в ягоде 16-18 %. Фермент наиболее акти­
вен в среде с концентрацией сахарозы не более 40 %. Для достижения конечной
массовой концентрации сухих веществ в сиропе, равной 70 %, необходимо внести
50-55 % сахарозы (с учетом содержания сухих веществ в сусле).
С целью сохранения высокой каталитической активности фермента сахар
вносят дробно. Инверсию проводят при 65 °С. По окончании процесса, который
контролируют по степени инверсии сахарозы, сироп нагревают до 85 °С и выдер­
живают 3 мин для инактивации ферментов. Рекомендуют проводить инверсию не
менее чем на 60 %, так как при этом сиропы неограниченно стабильны без внесе­
ния консерванта.
Важное преимущество ферментативной инверсии состоит в существенном
снижении концентрации продуктов меланоидинообразования по сравнению с про­
цессом кислотно-термической инверсии (инверсии за счет кислот сусла при кипя­
чении в течение 30 мин). При степени ферментативной инверсии 25-100 % кон­
центрация окисметилфурфурола (один из продуктов меланоидинообразования)
составила 0,95-1,65 мг/л, тогда как при 45%-ной кислотно-термической инвер­
сии— 58,8 мг/л.
Щ
л ш Ка
Разработана технология повышения коллоидной стойкости полуфабрика­
тов— плодово-ягодных экстрактов, концентрированного мандаринового сока
и рябинового морса, применяемых для выработки напитков. Оптимальное соот­
ношение ферментных препаратов, применяемых для осветления полуфабрикатов
следующее:
» •'
■
-Н
Наименование полуфабриката
Композиция ферментных препаратов*
Рябиновый морс (деалкоголизированный)
«Ксилоглюканофоетидин П10х»,
«Целловиридин Г10х» (0,5)
•*
■
Вишневый экстракт
«Ксилоглюканофоетидин П10х» (0,5),
«Целловиридин Г10х» (0,5)
г
Яблочный экстракт
«Ксилоглюканофоетидин П10х» (0,5)
*г
Мандариновый сок (концентрированный)
«Пектофоетидин П10х» (0,5)
* В скобках указана концентрация препаратов, %.
Примечание. Продолжительность температурной обработки для всех композиций — 2 ч, обработка
препаратов проводится при 40 °С, кроме «Пектофоетидина ПТОх» — 20 °С.
Технологический эффект обработки полуфабрикатов связан в значительной
степени со снижением содержания высокомолекулярных веществ коллоидной
природы. При обработке рябинового морса, вишневого экстракта, мандаринового
концентрированного сока, яблочного экстракта разрушаются пектиновые вещест­
ва и полисахариды. Отмечено также значительное снижение концентрации полифенольных соединений.
Витаминные препараты. Многие виды растительного сырья являются основны­
ми источниками биологически активных липидов — полиненасыщенных жирных
кислот, токоферолов, каротиноидов. Масла из зародышей пшеницы, ржи и прося­
ных мучелей содержат до 11 % линоленовой кислоты — предшественника арахидоновой кислоты в цикле биосинтеза. Для масел из зародышей зерновых и из об­
лепихи характерно высокое содержание токоферолов, достигающее в пшеничном
масле более 1 %. Плоды шиповника, аронии, красной рябины, кизильника, барба­
риса, жимолости, облепихи, томатные выжимки и семена богаты каротиноидами.
Масло из семян томатов содержит до 1 % каротиноидов.
Разнообразие растительного витаминного сырья, его технологических свойств
предполагает возможность различных путей его переработки. Основным элемен­
том технологии препаратов растительных жирорастворимых витаминов (ЖРВ)
является способ их извлечения из сырья. Выбор способа извлечения определяет
и процедуры подготовки сырья к основному технологическому этапу, и характер
заключительных операций при получении продукта.
Способы извлечения ЖРВ из растительного сырья можно разделить на две
группы — прессовые и экстракционные. Прессовые технологии эффективны
в тех случаях, когда в сырье имеется достаточное количество естественного рас­
творителя ЖРВ — растительного масла. При этом получают высокий выход масла
и ЖРВ. Прессование низкомасличного сырья дает невысокий выход конечного
продукта.
Экстракционная технология наиболее приемлема для получения препаратов
ЖРВ из низкомасличного растительного сырья. При экстракции достигается бо­
лее высокая степень извлечения витаминов за счет перехода прочносвязанных
ЖРВ в свободную форму под действием экстрагента.
Существуют различные варианты экстракционных способов извлечения ЖРВ:
экстракции углеводородными растворителями, спиртами, ацетоном, эфиром, мас­
лами и их смесями с другими органическими растворителями, сжиженными га­
зами и пр. Для каждого вида сырья можно использовать множество видов экс­
тракционной технологии, обеспечивающих высокий выход целевых продуктов.
Окончательный выбор определяется заданным качеством получаемого препарата
(составом, консистенцией), уровнем безопасности производства, сложностью ап­
паратурного оформления процесса, экономическими соображениями.
Этанольные экстракты витаминного сырья могут использоваться как полу­
продукты в технологии водорастворимых препаратов каротиноидов и токоферо­
лов, последние сорбируются из этанольного раствора на водорастворимые поли­
меры, нерастворимые в этаноле.
Путем эмульгирования растительных масел в спиртовых экстрактах токо­
феролов с последующим разделением фаз получают витаминные масла, обо­
гащенные токоферолами. Экстракционные технологии получения витаминных
препаратов из растительного сырья основаны на использовании ферментных
препаратов.
Этанолъная экстракция имеет преимущество перед прессованием при выде­
лении витаминизированных масел из низкомасличного сырья. Экстракция этано­
лом используется при получении витаминизированных масел из индивидуальных
видов и смешанного сырья, липидных витаминных продуктов (ЛВП), а также экс­
трактов растительного сырья как источников каротиноидов и токоферолов при
выделении их водорастворимых препаратов.
Являясь веществом промежуточной полярности, этанол хорошо контактирует
как с гидрофильными, так и с гидрофобными участками клеточных структур, что
обеспечивает быстрое проникновение в сырье и высокую интенсивность массообмена в процессе экстракции.
Концентрированный этанол при температуре кипения хорошо экстрагирует
триглицериды, каротиноиды и токоферолы. Различная полярность этих веществ
и, соответственно, растворимость в этаноле позволяет проводить избирательную
экстракцию, изменяя концентрацию этанола. Так, триглицериды и гидрофобные
углеводородные каротиноиды (ликопин, (3-каротин) заметно растворяются и экс­
трагируются этанолом концентрации выше 80 %, ксантофиллы — уже при 60 %,
а для экстракции токоферолов достаточно 40-50 % концентрации этанола. По­
следняя влияет и на степень экстракции нежелательных сопутствующих веществ,
прежде всего белков. Глиадины — основная фракция белков зерна злаков — рас­
творяется в 80%-ном этаноле. Флавоноиды, в том числе антоцианы, извлекаются
40-70%-ным этанолом.
В присутствии этанола ослабляются белково-липидные взаимодействия,
и прочносвязанные ЖРВ переходят в свободную форму, доступную экстракции.
Схема получения витаминных препаратов с помощью этанольной экстракции
представлена на рис. 3.5.
При получении витаминизированных масел из низкомасличного сырья, тако­
го как зародыши зерновых культур или иные отходы зерна, богатые витаминами,
сырье целесообразно предварительно обогатить путем ферментации гидролити­
ческими ферментами. При ферментации происходит гидролиз нелипидных ком­
понентов сырья, повышается его масличность, доля свободных липидов, степень
их экстрагируемости и чистота конечного продукта.
Комплекс гидролитических ферментов для обогащения сырья подбирают
в соответствии с составом нелипидных компонентов. В сырье, богатом белком,
основным препятствием для экстракции липидов являются белково-липидные
взаимодействия. Для расщепления белка используют препараты протеолитичес­
ких ферментов. Для обеспечения доступа протеиназ к белку и повышения ско­
рости массообмена при гидролизе необходимо разрушить структуры клеточных
стенок сырья. Соответственно в комплекс ферментов вводят целлюлазы и гемицеллюлазы.
Оптимум действия ферментов доджен находиться в слабокислой или ней­
тральной среде в соответствии с естественной реакцией водных взвесей сырья.
Выбирают ферменты с оптимальной температурой действия 40-50 °С, поскольку
гидролиз сырья необходимо проводить при температуре ниже порога клейстеризации крахмала (для пшеничного крахмала 50 °С).
При ферментации зародышей пшеницы наилучшие результаты получены при
сочетании «Протосубтилина» (0,72 ед. протеазы /г сырья) с «Целлюлазой-100»
(3,68 ед. целлюлазы и 0,82 ед. пектиназы/г сырья) или «Целловиридином» (1,92 ед.
целлюлазы/г сырья). В этих вариантах не наблюдается потерь липидов за счет пе­
рехода в жидкую фазу гидролизата, масличность сырья повышается в 2 раза (до
20,9-21,9 %), выход масла составляет 72 % к масличности исходного сырья.
Экстракцию масел и витаминов из обогащенного сырья производят концен­
трированным этанолом при температуре кипения экстракционной смеси. После
отделения экстракта фильтрацией к нему добавляют воду с целью понижения рас-
Ферментативный гидролиз в водной среде
ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗАТ
Разделение фаз
ТВЕРДАЯ ФАЗА
Сушка, измельчение
ОБОГАЩЕННОЕ СЫРЬЕ
Экстракция этанолом
ЭКСТРАКТ
Добавление воды, разделение фаз эмульсии
Вымораживание
Фильтрация
Отсушка
ВИТАМИНИЗИРОВАННОЕ МАСЛО
творимости липидов и из образовавшейся эмульсии выделяют сырое масло. Пер­
вую фильтрацию масла проводят сразу после его отделения от водно-спиртового
раствора, при этом удаляется белково-липидная фаза. Вторая фильтрация, для от­
деления фракции восков, проводится после вымораживания продукта.
Этанол как пищевой растворитель имеет то преимущество, что не требуется
его полное удаление из продукта.
Из сырья достаточно высокой масличности с низким содержанием белка масла
и витамины могут быть экстрагированы без предварительного обогащения сырья.
Классический пример такого сырья — ягоды бересклета с масличностью 32-45 %
и пористой, хорошо проницаемой структурой, представленной преимуществен­
но полисахаридными компонентами. Прямая экстракция позволяет получать из
ягод бересклета витаминизированное масло с высоким содержанием каротинои­
дов и токоферолов. Выделение масла из экстракта и его очистка производится по
той же схеме, что при получении масла из обогащенного сырья зерновых культур
(см. рис. 3.5).
. ....... 1.^. ,. -.-—г "
•
Из некоторых видов низкомасличного сырья, таких как плоды жимолости,
бузины, жом плодов облепихи, также можно достаточно полно экстрагировать
масло, каротиноиды и токоферолы без предварительного обогащения сырья. Но
в этих случаях выделяемые из экстрактов конечные продукты имеют при комнат­
ной температуре не жидкую, а пастообразную консистенцию.
Витаминные препараты содержат водно-спиртовую фазу, количество которой
может сильно варьировать. В составе нелетучих компонентов вещества, экстра­
гируемые хлороформом, составляют более 90 %, что свидетельствует о липидной
природе препаратов. Пастообразная консистенция может быть связана как с жир­
нокислотным составом глицеридов, так и с присутствием восков, белков и пекти­
новых веществ.
Я \т
Пастообразные препараты, названные липидными витаминными продуктами
(ЛВП), обладают высокой стабильностью витаминных компонентов, чему спо­
собствует присутствие спиртовой фазы, поэтому фракционирование ЛВП неце­
лесообразно.
При получении витаминизированных масел и ЛВП методом спиртовой экс­
тракции, как правило, достигается высокий выход масла — не менее 70 % к мас­
личности сырья. Выход витаминных компонентов определяется двумя фактора­
ми: степенью их экстракции из сырья и фазовым распределением на стадии вы­
деления конечного продукта, которое, в свою очередь, зависит от коэффициентов
распределения витаминов в системе масло - водно-спиртовый раствор и соотно­
шения объемов этих фаз.
Выход каротиноидов составляет 17-53 %, токоферолов — 2,7-31,1 % к содер­
жанию в сырье. Концентрация витаминных компонентов в конечных продуктах
достигает очень высоких величин: в маслах каротиноидов — до 279, токоферо­
лов— до 1277 мг в 100 г масла, в ЛВП — соответственно до 1597 и 8798 мг
в 100 г нелетучих веществ. Витаминные компоненты стабильны в процессе хра­
нения масел и ЛВП.
Концентрацию и соотношение каротиноидов и токоферолов в препаратах
можно регулировать, используя смешанное растительное сырье различного соста­
ва, а также изменяя параметры процесса на стадии выделения конечного продук­
та. Эти возможности в сочетании с высоким выходом суммарных липидов харак­
теризуют процесс этанольной экстракции как технологически перспективный.
Спирто-масляная и масляная экстракция используется при получении вита­
минизированных масел из низкомасличного сырья. Она может быть рекомендова­
на в двух случаях. Во-первых, для извлечения витаминов из сырья с очень низкой
масличностью, когда с помощью спиртовой экстракции нельзя получить витами­
низированное масло или ЛВП с технологически значимым выходом по массе и со­
держанию витаминов. Во-вторых, когда из сырья можно извлечь этанолом масло
и витамины с достаточной полнотой, но витаминный препарат имеет форму ли­
пидного продукта, что неудобно при его использовании.
Примером первой категории является получение масляных растворов каро­
тиноидов из томатного сырья. К числу разновидностей сырья с очень низкой мас­
личностью, к которым целесообразно применять спирто-масляную экстракцию,
относятся также плоды шиповника, рябины, калины.
Пример второй категории — получение облепихового масла из жома плодов.
При необходимости иметь масляную форму препарата спирто-масляная экстра­
кция применима также к плодам жимолости, бузины.
Спирто-масляная экстракция имеет свои преимущества и недостатки. Соче­
тание двух экстрагентов, из которых один (этанол) легко проникает в сырье, а дру­
гой имеет высокое сродство к жирорастворимым витаминам, дает возможность
быстро и достаточно полно извлекать последние из сырья. За счет использования
гидрофобного экстрагента повышается доля Р-каротина в сумме каротиноидов
масляной фазы, а выход суммарных каротиноидов в масле достигает 80 % к содер­
жанию в сырье. Препараты получают в виде масляных растворов, а концентрацию
витаминов в них можно регулировать, изменяя массово-объемное соотношение
сырье : этанол : масло.
Недостаток метода — изменение жирнокислотного состава витаминного пре­
парата, который соответствует уже не сырью, а маслу-экстрагенту (вклад жир­
нокислотного состава сырья невелик). Однако этот недостаток значителен лишь
в тех случаях, когда сырье содержит особо ценные жирные кислоты, отсутствую­
щие в масле-экстрагенте.
Для спирто-масляной экстракции используют измельченное сухое или обез­
воженное влажное сырье. С целью повышения степени экстракции витаминов
и чистоты препаратов сырье может быть предварительно обогащено путем фер­
ментации. Состав ферментных комплексов подбирают в соответствии с характе­
ром локализации целевого компонента, его связи с полимерами сырья. Например,
для ферментации томатов и продуктов его переработки используют препараты
с пектолитической активностью — «Целлюлазу-100» и «Пектофоетидин». В ре­
зультате ферментации и отделения жидкой фазы содержание каротиноидов в пе­
ресчете на СВ значительно возрастает — в 7,5-11 раз в свежем сырье и томатной
пасте соответственно.
Измельченное сухое сырье смачивают расчетным количеством этанола и вы­
держивают несколько минут для полного проникновения экстрагента в структуру
сырья. Обезвоженное влажное сырье размешивают в этаноле до получения одно­
родной массы. В обоих случаях расход этанола составляет 1-3 мг/г сырья. Затем
добавляют расчетное количество масла (1-3 г/г сырья) и проводят экстракцию
в течение 20-30 мин при температуре кипения экстракционной смеси и ее непре­
рывном перемешивании. После отделения экстракта его охлаждают до 10-15 °С
и проводят разделение фаз. Схема получения масляных препаратов каротиноидов
из томатного сырья представлена на рис. 3.6.
Выход витаминов из одной порции сырья можно повысить повторной экс­
тракцией их из шрота. Для получения высококонцентрированных масляных рас­
творов витаминов проводят многократное насыщение масла путем экстракции
свежих порций сырья. В этом случае шрот повторно не экстрагируют, а масляную
фазу экстракта первой стадии используют как экстрагент в новом цикле, который
проводят при том же соотношении сырье : этанол : масло, и т. д.
Применительно к этому сырью метод спирто-масляной экстракции дает вы­
сокие технологические показатели. Выход каротиноидов в масляных экстрактах,
полученных по двухстадийной схеме (с экстракцией шрота), составляет не менее
80 % к содержанию в сырье, концентрация каротиноидов — до 136 мг/100 мл. При
многократном насыщении масла-экстрагента концентрация каротиноидов соста­
вила бол ее 400 мг/100 мл:
II
1
^. Ц
Сорбция на гидрофильных носителях используется в технологии водораство­
римых препаратов каротиноидов и токоферолов. Водорастворимые препараты ка­
ротиноидов и токоферолов (ВПК и ВПТ) получают по общей схеме, включающей
спиртовую экстракцию каротиноидов или токоферолов из сырья, соединение экс­
тракта с водным раствором гидрофильного носителя, выдержку смеси в условиях,
необходимых для сорбции витаминов, отделение продукта сорбции и перевод его
в конечную форму — сухого препарата или водного раствора (рис. 3.7).
Варианты технологии различаются способом подготовки сырья к экстракции
витаминов и конкретными технологическими параметрами. При растворении
в воде ВПК и ВПТ должны давать однородные коллоидные растворы типа золя,
не содержащие свободных липидов. Прочносвязанные липиды, экранирован­
ные в составе препаратов и не влияющие на их гидрофильный характер, должны
быть йредставлены каротиноидами и/или токоферолами. Соответственно из них
и должна преимущественно состоять липидная фракция экстракта. Другие липи­
ды, даже если они прочно связываются с носителем и не изменяют общего гидро­
фильного характера продукта сорбции, снижают сорбционную емкость носителя
в отношении витаминов и чистоту препарата.
Для уменьшения примеси посторонних липидов предпочтительно получать
витаминные экстракты из низкомасличного сырья (калины, рябины, шиповника,
томатного сырья). Удаление посторонних липидов достигается также оптимиза­
цией параметров экстракции. Так, полная экстракция токоферолов возможна при
концентрации этанола 50-80 %, что значительно снижает степень перехода в экс-
СЫРЬЕ
Ферментативный гидролиз
ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗАТ
Разделение фаз
ТВЕРДАЯ ФАЗА
Обезвоживание этанолом
ОБОГАЩЕННОЕ СЫРЬЕ
Экстракция смесью этанол - масло
Экстракция маслом
ЭКСТРАКТ 1
ЭКСТРАКТ 2
Разделение фаз
Разделение фаз
МАСЛЯНЫЙ ЭКСТРАКТ 1
МАСЛЯНЫЙ ЭКСТРАКТ 2
ОБЪЕДИНЕННЫЙ МАСЛЯНЫЙ ЭКСТРАКТ
Фильтрация
Отсушка
ГОТОВЫЙ ПРОДУКТ
СЫ РЬЕ
Ферментация
Сушка, измельчение
ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ
ГИДРОЛИЗАТ
Экстракция антоцианов
Экстракция этанолом
Разделение фаз
ЭКСТРАКТ
ТВЕРДАЯ ФАЗА
Вымораживание,
фильтрация
Обезвоживание этанолом
Обезвоживание этанолом
ОБОГАЩЕННОЕ СЫ РЬЕ
ОБОГАЩЕННОЕ СЫ РЬЕ
ОЧИЩЕННЫЙ ЭКСТРАКТ
Экстракция этанолом
1
ЭКСТРАКТ
Добавление водного раствора сорбента
Выдержка
Фильтрация
ПРОДУКТ СОРБЦИИ
Сушка
Растворение в воде
ГОТОВЫЙ ПРОДУКТ
(водный раствор)
ГОТОВЫЙ ПРОДУКТ*
(сухая форма)
-
'
V
а
н
а
а
в
и
»
■
1
тракт фракций глицеридов и восков. Для очистки экстрактов от белково-липидной
фракции их вымораживают и фильтруют до прозрачности.
Экстрагент витаминов должен неограниченно смешиваться с водой, что необ­
ходимо для образования однородной среды при соединении экстракта и водного
раствора гидрофильного носителя на стадии сорбции. Этому требованию удов­
летворяет этанол и некоторые другие спирты. Известные преимущества этанольной экстракции витаминов объясняют выбор этанола в качестве экстрагента.
Способ подготовки сырья к экстракции зависит от вида сырья. Так, при по­
лучении экстракта каротиноидов из томатной пасты эффективна ферментативная
обработка, повышающая концентрацию каротиноидов в сырье. При извлечении
каротиноидов из свежего томатного сырья проводится предварительное извле­
чение фракции антоцианов и других веществ, растворимых в 40%-ном этаноле.
Экстракция токоферолов из сочных плодов (калина, рябина, шиповник) проходит
с высокой полнотой без предобработки.
Влажное сырье перед экстракцией каротиноидов должно быть обезвожено
промыванием этанолом, поскольку экстракция каротиноидов проводится концент­
рированным этанолом.
Экстракты, передаваемые на стадию сорбции, не должны содержать взвешен­
ных частиц. При получении экстрактов каротиноидов томата это достигается за
счет обработки сырья перед экстракцией, а при получении экстрактов токоферо­
лов из плодового сырья — вымораживанием экстракта с последующей фильтра­
цией.
Процесс сорбции оптимизируется для конкретного продукта. Величина
удельной сорбции зависит от вида сорбента, концентраций витамина, сорбента
и этанола в среде, температуры и продолжительности экспозиции. В качестве
универсальных носителей для каротиноидов и токоферолов могут быть названы
пектины и белки. Сорбция каротиноидов происходит очень быстро — даже при
комнатной температуре не бодее чем за 20 мин, а для сорбции токоферолов требу­
ется выдержка на холоде в течение 2 ч.
Выбор концентрации этанола на стадии сорбции определяется влиянием на
величину удельной сорбции и формирование осадка продукта сорбции. Очевид­
но, что в водно-этанольной среде полнота сорбции гидрофобных веществ на гид­
рофильные носители тем выше, чем ниже концентрация этанола. Окончательный
выбор зависит от способа выделения продукта сорбции.
Если продукт отделяют фильтрацией, то концентрация этанола должна быть
достаточной для полного осаждения продукта. Такие носители, как пектины, цел­
люлоза, гемицеллюлозы, хорошо осаждаются при концентрации этанола 50 %.
Полнота осаждения белков достигается при различных концентрациях этанола,
в зависимости от их молекулярной массы и величины рН изоэлектрической точки.
При использовании мембранной технологии продукты сорбции можно отделять
и при низкой концентрации этанола.
Рациональная концентрация витаминов в конечном продукте определяется
практическими соображениями. В одностадийном процессе сорбции токоферо-
лов достигается их концентрация 100-250 мг/г препарата. Этого вполне доста­
точно для использования ВПТ в пищевой промышленности, косметике, медицине
и ветеринарии.
При сорбции каротиноидов из экстрактов свежего томатного сырья удельная
сорбция составляет 20-30 мг/г сорбента (пектина). Ее можно повысить путем по­
вторной сорбции каротиноидов из экстракта до 100 мг/г и более. В одностадийной
сорбции сходные показатели достигаются при использовании концентрированных
экстрактов каротиноидов, получаемых многократной экстракцией свежих порций
сырья одной порцией экстрагента. Насыщенные ВПК (более 80 мг/г) плохо рас­
творяются в воде, что ограничивает предел концентрирования каротина.
Водорастворимые препараты каротиноидов и токоферолов могут храниться
и использоваться в двух формах — сухой и в виде водного раствора. Обе формы
достаточно стабильны при хранении.
Глава 4
МИКРОБНАЯ БИОКОНВЕРСИЯ
4.1. СЫРЬЕ ДЛЯ МИКРОБНОЙ БИОКОНВЕРСИИ
Микроорганизмы способны к трансформации природных соединений в ценные
для человека вещества. Микробным синтезом получают ферменты, белки, вита­
мины, органические кислоты, антибиотики и другие полезные вещества.
Среди продуктов микробной биоконверсии растительного сырья можно вы­
делить несколько групп: корма с повышенным содержанием легкоусвояемых
веществ, протеинизированные корма (с повышенным содержанием белка), бел­
ковые пищевые продукты, растительные белковые гидролизаты, обезвреженные
продукты и корма. Питательным субстратом для микроорганизмов может слу­
жить доступное, дешевое сырье, в том числе отходы перерабатывающих отраслей
агропромышленного комплекса.
В процессах микробной биоконверсии используют необработанное расти­
тельное сырье (прямая биокойверсия) или сырье, подвергнутое предварительной
обработке механическими, химическими, электрохимическими, радиационными
методами, а также с помощью ферментных препаратов (рис. 4.1).
Прямая биоконверсия целесообразна при переработке жидких субстратов с до­
статочно высоким содержанием легкоусвояемых соединений углерода и азота. При
переработке твердых субстратов прямую биоконверсию применяют при наличии
микроорганизмов с мощными ферментными системами, способными воздейство­
вать на биополимеры сырья, прежде всего на структурные биополимеры.
Основными источниками сырья для микробной биоконверсии служат отхо­
ды пищевой промышленности и сельскохозяйственного производства. Отходы
сельскохозяйственного производства (солома злаков, початки, стебли и листья
кукурузы, стебли и корзинки подсолнечника, ботва различных корнеплодов, отхо­
ды виноградной лозы, чайных плантаций, стебли табака и пр.) обладают низкой
кормовой ценностью из-за наличия трудногидролизуемых полисахаридов и невы­
сокого содержания белка. В некоторых видах сельскохозяйственных отходов при­
сутствуют компоненты, затрудняющие использование на корм скоту.
РАСТИТЕЛЬНОЕ СЫРЬЕ
Предварительная обработка
Ферментативная 1
Механическая 1
Химическая
1
Электрохимическая
1
1
Радиационная
Культивирование микроорганизмов
Глубинная
ферментация
Твердофазная
ферментация
Ферментация
смешанного типа
ГОТОВЫЕ ПРОДУКТЫ
Корма
повышенной
усвояемости
Протеинизированные
корма
Белковые
пищевые
продукты
Обезвреженные
продукты
и корма
Растительные
белковые
гидролизаты
Рис. 4.1. Микробная биоконверсия растительного сырья
Отходы пищевой промышленности более богаты питательными веществами,
безвредны, легче поддаются ферментативной и микробной биоконверсии, раз­
личным видам предобработки. Это сырье — наиболее перспективное для биокон­
версии. Количество вторичных ресурсов в пищевой промышленности составляет
60-80 % от перерабатываемого сырья, в некоторых случаях достигает 95 %.
Зерноперерабатывающая промышленность дает ценные для биоконверсии
отходы, образующиеся при помоле зерна. Так, при помоле пшеницы и ржи об­
разуются отруби и кормовые мучки. Их средний суммарный выход при помоле
пшеницы составляет не менее 12 %. Пшеничные отруби содержат в среднем, %:
крахмала — 22,8, белка — 18, клетчатки — 10,7, гемицеллюлозы — 23,2, пек­
тина — 5,3, лигнина — 9,9, жиров — 4,7, золы — 5,5. В ржаных отрубях крах­
мала — 21,5 %, сахарозы — 1,7, белка — 13,5, клетчатки — 26,3, жиров — 4,1,
золы -г- 3,9 %. При выработке круп из гречихи, овса, проса, ячменя, риса, гороха
суммарное количество отходов составляет в среднем 35 % от перерабатываемого
зерна.
Отруби и зерновые отходы можно рассматривать и как субстраты для биоконверсии, поскольку их кормовую ценность в результате биоконверсии можно
повысить в 2-2,5 раза.
При получении спирта из крахмалистого сырья общее количество отходов
составляет 30-35 % к массе сырья. Основной вид вторичного сырья — зернокар­
тофельная послеспиртовая барда. В сухом веществе барды содержится, %: сырого
протеина — 39,3, клетчатки — 12,5, безазотистых экстрактивных веществ — 35,
сырого жира
4,9, золы
2. Основная масса зернокартофельной барды скарм­
ливается животным в натуральном виде. Более рациональным способом утилиза­
ции барды является производство на ее основе кормовых дрожжей.
В производстве пива образуются следующие виды отходов: пивная солодовая
дробина, солодовые ростки, зерновые отходы, сплав зерна, остаточные пивные
дрожжи. В отходы переходит около 25 % сырья.
Солодовая дробина, образующаяся на стадии фильтрации затора, содержит
около 25 % СВ. Состав СВ, %: водорастворимые вещества — 7,5, крахмал — 1,6,
другие углеводы — 51,1, легкогидролизуемые полисахариды — 21,3, трудногид­
ролизуемые полисахариды — 24,7, уроновые кислоты — 3,8, лигнин — 10, сырой
протеин — 27, зола — 5,5.
Солодовые ростки представляют собой корешки свежепроросшего солода,
отделяемые при сушке, они богаты витаминами, аминокислотами, сахарами, но
из-за присутствия горького алкалоида горденина и высокого содержания аспара­
гина и зольных элементов применяются в кормах лишь в небольшой пропорции.
Находят применение в микробиологической промышленности как стимуляторы
синтеза целевых продуктов.
Виноделие дает такие виды вторичного сырья, как виноградные выжимки,
гребни, дрожжевые и гущевые осадки, виноградные семена. Выход виноградных
выжимок составляет в среднем 14 % от переработанного винограда при содержа­
нии СВ в выжимках 45-50 %. Вторичное сырье виноделия в основном исполь­
зуют при получении этилового спирта и виннокаменной кислоты. Виноградные
семена, отделенные от сладких или простых выжимок, являются сырьем для вы­
деления виноградного масла и таннина.
Из отходов консервной промышленности и плодоовощного хозяйства на­
ибольшее значение имеют томатные и яблочные выжимки, а также отходы пло­
доовощных баз (отходы капусты, моркови, картофеля, свеклы). При производстве
томатного сока выжимки образуются в количестве около 30 % при содержании
СВ 25-30 %. Из выжимок могут быть отмыты семена томата — ценное сырье для
получения масла, богатого каротиноидом ликопином.
Яблочные выжимки составляют в среднем 35 % к массе сырья, перерабаты­
ваемого на сок. Экстракты выжимок, полученные с помощью холодной воды, со­
держат 2-4 % сахара и 0,1-0,2 % органических кислот и могут использоваться для
производства напитков, уксуса, спирта. Из выжимок получают яблочный пектин.
На перечисленные цели расходуется незначительная часть получаемых выжимок,
использование в кормах ограничено структурой выжимок.
Отходы плодоовощных баз представляют значительный интерес как сырье
для биоконверсии. Количество таких отходов очень велико. Плотные и жидкие от­
ходы резко ухудшают санитарное состояние баз. На очистные сооружения с жид­
кими стоками поступает большое количество органических остатков. Вывоз плот­
ных отходов, их продажа на корм нерентабельны.
Сахарные заводы дают следующие виды отходов: свекловичный жом, мелассу,
рафинадную патоку, фильтрационный осадок, свекловичный «бой». Наибольший
интерес представляет жом, составляющий 83 % к массе переработанной свеклы.
В жоме содержится 6-8 % СВ, в составе которых присутствуют, %: клетчатка —
17.2-26,3, пектиновые вещества — 20-29, полисахариды (общее количество) —
61,7-66,1, белки — 8,3-8,9, нуклеиновые кислоты — 0,1-0,2, зольные элементы —
4.2-5,7. Жом включают в состав кормов, из жома получают пектин. Сухой жом при­
меняют в микробиологической промышленности как компонент питательных сред.
Основными отходами крахмало-паточной промышленности, используемыми
для микробной биоконверсии, являются картофельная мезга и клеточный сок —
отходы получения крахмала. В мезгу переходит от 3 до 7 % СВ картофеля, количе­
ство связанного крахмала в мезге составляет 40-60 % ее сухой массы. Выход мез­
ги в сыром виде колеблется в пределах 11-45 % к массе картофеля в зависимости
от применяемой технологии переработки. Клеточный сок, содержащий в среднем
6 % СВ, образуется в количестве 50 % к массе перерабатываемого сырья.
Из отходов масложировой промышленности для биоконверсии может быть
использована подсолнечная лузга, образующаяся в количестве до 30 % к массе
семян подсолнечника. Лузга содержит, %: клетчатки 52-66, лигнина 24,8-29,6,
жиров 1,5-3,5. Основная масса лузги утилизируется на маслозаводах как топливо.
Препятствием к использованию лузги в кормах является то, что при ее измель­
чении образуются частицы игольчатой формы, повреждающие пищеварительный
тракт животных.
4.2. ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОБНОЙ БИОКОНВЕРСИИ
Способы переработки растительного сырья определяются его составом. Основу
растительной биомассы составляют полимеры углеводной природы — целлюлоза,
гемицеллюлоза, пектин, а также лигнин и белок. Последний — наиболее ценный
питательный компонент, однако количество белка даже в наиболее богатых им ви­
дах сырья не превышает 26 %. Исключение составляют семена бобовых культур,
где содержание белка достигает 50 %..Очень бедны белком солома злаков, лузга
подсолнечника, отходы хлопчатника, чая, для их превращения в ценные корма
и белковые продукты требуется глубокая биоконверсия.
В процессе биоконверсии из продуктов расщепления углеводов и из мине­
ральных солей азота и других элементов синтезируется микробный белок. Уве­
личение содержания белка г~ основной показатель эффективности биоконверсии
растительного сырья в пищевые продукты и корма.
Из числа углеводов сравнительно легко гидролизуются ферментами микроор­
ганизмов крахмал и пектиновые вещества, гемицеллюлоза занимает промежуточ­
ное положение, а наиболее трудногидролизуемы целлюлоза и лигнин. Соответст­
венно труднее всего поддаются прямой биоконверсии субстраты с высоким со­
держанием целлюлозы и лигнина, такие как древесина, солома, ботва, одревес­
невшие части растений. В результате прямой биоконверсии эти виды сырья лишь
незначительно обогащаются белком. Для повышения степени конверсии в белок
трудногидролизуемые виды сырья подвергают предварительной обработке раз­
личными способами.
Предварительная обработка сырья применяется для увеличения его доступнос­
ти действию микробных ферментов, частичной или полной деструкции комплек­
сов биополимеров и их компонентов. Основной задачей предобработки является
воздействие на структурные полимеры растений — целлюлозу, гемицеллюлозу,
пектиновые вещества — и матриксный компонент лигнин. Эти полимеры обспечивают прочность и жесткость клеточных стенок растений, что является основ­
ным препятствием для ферментативной деструкции.
Ферментативная обработка применяется в технологии биоконверсии низко­
ценного и трудногидролизуемого сырья — плодоовощных отходов, некондицион­
ного фуражного зерна, лигноцеллюлозных материалов (соломы, отходов хлопчат­
ника, подсолнечника и др.).
Ферментные препараты выбирают в соответствии с составом сырья. Так,
для гидролиза плодоовощных отходов, содержащих значительные количества
пектиновых веществ и целлюлозы, используют комплекс пектиназ и целлюлаз,
для отходов хлопчатника — комплекс гемицеллюлаз и целлюлаз. Для обработки
фуражного зерна, главные компоненты которого крахмал, белок, глюкан, арабиноксилан, необходим комплекс амилазы, протеазы, глюканазы и ксиланазы. Такой
комплекс можно получить, например, сочетанием препаратов «Амилосубтилина»,
«Протосубтилина» и «Целловиридина» или «Вильзима АК».
В тех случаях, когда микробную биоконверсию осуществляют в асептичес­
ких условиях, ферментативную обработку проводят на стадии приготовления пи­
тательной среды. При выращивании микроорганизмов на нестерильных средах
обработку сырья ферментами можно совместить с процессом культивирования,
однако необходимо учитывать уровень и характер обсемененности ферментных
препаратов.
Механическое измельчение представляет собой наиболее простой способ пре­
добработки растительного сырья. Измельчение позволяет увеличить удельную
поверхность материала, то есть площадь его контакта с химическими агентами
или биокатализаторами. Это адекватно повышению реальной концентрации суб­
стратов в реакционной среде и приводит к пропорциональному возрастанию ско­
рости их превращений, в соответствии с законом действующих масс, которому
подчиняются как химические, так и ферментативные реакции.
Сильное механическое измельчение изменяет структуру сырья на молекуляр­
ном уровне. Так, при измельчении целлюлозы на вибромельнице степень поли­
меризации снижается с 1200 до 900 глюкозных ед. Очень важно контролировать
температурный режим процесса измельчения, поскольку сильный нагрев вызыва­
ет побочные химические реакции в сырье.
При биоконверсии зернового сырья в продукты брожения используют взо­
рванные структуры, имеющие очень высокую пористость — от 200 до 600 % к су­
хой массе сырья, что позволяет резко увеличить скорость диффузионных процес-
сов внутри частиц и тем самым активизировать ферментативные реакции, лими­
тируемые оттоком их продуктов.
I
Механические методы предобработки часто сочетают с химическими и фер­
ментативными.
•
^1
;^ ' г
Химическая предобработка растительного сырья применяется для разделения
комплексов структурных полимеров растений путем преимущественной экстра­
кции какого-либо компонента, а также для расщепления растительных полимеров
на низкомолекулярные продукты, которые могут быть использованы микроорга­
низмами как источники питания.
'|-Й
В качестве химических агентов чаще всего применяют кислоту и щелочи.
Мягкая обработка этими агентами (в течение 1-4 ч при температуре не выше
100 °С и атмосферном давлении) применяется для перевода в растворимое состо­
яние гемицеллюлозы, пектиновых веществ, лигнина. Более жесткий режим обра­
ботки дает возможность расщепить биополимеры на блоки различной величины,
вплоть до мономеров.
Недостаток химической обработки в том, что она дает побочные продукты ре­
акции, обладающие токсическим действием на организм. При кислотном гидро­
лизе растительного материала образуются такие токсины, как метанол, формаль­
дегид, ацетон, летучие фенолы, фурфурол и его производные, муравьиная кисло­
та. Как кислотный, так и щелочной гидролиз приводит к деградации аминокислот,
образованию продуктов их конденсации с углеводами и другими соединениями.
Поэтому использование химических агентов для предобработки растительного
сырья требует тщательных исследований механизма и кинетики процессов с це­
лью получения продуктов гидролиза заданного состава и качества.
Жесткий кислотный гидролиз целлюлозосодержащего сырья лежит в основе
технологии так называемых гидролизных дрожжей (то есть дрожжей, выращи­
ваемых на гидролизатах древесины). Изучение механизма кислотного гидролиза
различных групп полисахаридов растительного сырья позволило разработать ра­
циональную технологию раздельного получения пентозных и гексозных смесей
моносахаров с минимальными примесями нежелательных продуктов.
Пентозы входят в состав гемицеллюлоз, которые гидролизуются легче цел­
люлозы и лигнина. Отделение продуктов гидролиза гемицеллюлоз, обогащенных
пентозными сахарами, дает в качестве второго продукта целлолигнин, из которого
далее получают гексозный гидролизат с преимущественным содержанием глю­
козы. Такое разделение очень важно, поскольку на гексозном гидролизате можно
выращивать экологически безопасные дрожжи-сахаромицеты, тогда как на сме­
си пентоз и гексоз, так же как на чистых пентозах, можно культивировать только
дрожжи рода Сапс1Ша, вызывающие аллергические реакции у людей и животных.
При получении гидролизатов древесины успешно используют сочетание тер­
мических, механических и химических воздействий на целлюлозу. В модельных
опытах на обеззоленной древесной целлюлозе показано, что ее термический гид­
ролиз при 400 °С с наложением напряжения сдвига (угол поворота наковальни
Бриджмена от 0 до 800°) дает выход легкогидролизуемой фракции целлюлозы
12 %, то же при давлении 2 кПа — 22,5 %, а при дополнительной пропитке мате­
риала
оптимальном
!Iварианте степень полимеризации целлюлозы снизилась со 170 до 15 глюкозных
единиц.
I
Термохимическая обработка в слабых растворах сернистой или серной кис| тоты под давлением применяется для разделения древесины на фракции, обогаМетод, получившии назва
ревесине быстрорастущих
получения спирта путем (
также
лузги
Исследование конверсии древесины березы с помощью парового взрыва
л ферментативной обработки показало, что при увеличении температуры пара со
170 до 230 °С выход растворимых веществ повышается с 30 до 40 %. Оптимален
эежим обработки в течение 4 мин при 230 °С, после чего с помощью целлюлогщтических ферментов можно перевести в растворимое состояние 84 % сахаров,
содержащихся в древесине, причем пентозные сахара полностью переходят в мономерные формы, а выход глюкозы составляет 66 % от теоретического (фермен­
тативный гидролиз проводили в течение суток при рН 4,5 и температуре 40 °С).
Гидролизаты использовали для получения высокобелковой биомассы дрожжей
рода СапДШа.
Электрохимическая обработка {ЭХО) — экологически чистый, дешевый
и эффективный способ деструкции растительного сырья. По своей сути ЭХО
близка к химической обработке кислотами и щелочами, однако имеет свои осо­
бенности. При ЭХО воду или слабые водные солевые растворы (как таковые или
в смеси с растительным сырьем) подвергают электролизу. В катодной зоне полу­
чается кислыи раствор, содержащий положительно заряженные ионы водорода
и металлов, в анодной — щелочной, содержащий гидроксилы и анионы солеи.
аналогичные
ют
фигураци
вокруг ионов в момент диссоциации воды и солей в процессе электролиза. БлагоI даря высокой химической активности ЭХО-воды и растворов с их помощью можI но в мягких условиях гидролиза достигать тех же результатов, что при жесткой
обработке. Это
мости
концентрации
буферную емкость. При соединении с растительным материалом реакция среды
становится близкой к нейтральной. После обработки сырья не требуется нейтрали­
зации среды и последующего выведения из нее солей, то есть отпадает необходи­
мость очистки сточных вод на стадии получения гидролизатов растительного сы­
рья. При обработке ЭХО-растворами или ЭХО-водой их можно брать в количестве
не более половины объема реакционной среды, не снижая эффекта действия.
сов внутри частиц и тем самым активизировать ферментативные реакции, лими­
тируемые оттоком их продуктов.
Механические методы предобработки часто сочетают с химическими и фер­
ментативными.
•
5! 1{
Химическая предобработка растительного сырья применяется для разделения
комплексов структурных полимеров растений путем преимущественной экстра­
кции какого-либо компонента, а также для расщепления растительных полимеров
на низкомолекулярные продукты, которые могут быть использованы микроорга­
низмами как источники питания.
В качестве химических агентов чаще всего применяют кислоту и щелочи.
Мягкая обработка этими агентами (в течение 1—4 ч при температуре не выше
100 °С и атмосферном давлении) применяется для перевода в растворимое состо­
яние гемицеллюлозы, пектиновых веществ, лигнина. Более жесткий режим обра­
ботки дает возможность расщепить биополимеры на блоки различной величины,
вплоть до мономеров.
Недостаток химической обработки в том, что она дает побочные продукты ре­
акции, обладающие токсическим действием на организм. При кислотном гидро­
лизе растительного материала образуются такие токсины, как метанол, формаль­
дегид, ацетон, летучие фенолы, фурфурол и его производные, муравьиная кисло­
та. Как кислотный, так и щелочной гидролиз приводит к деградации аминокислот,
образованию продуктов их конденсации с углеводами и другими соединениями.
Поэтому использование химических агентов для предобработки растительного
сырья требует тщательных исследований механизма и кинетики процессов с це­
лью получения продуктов гидролиза заданного состава и качества.
Жесткий кислотный гидролиз целлюлозосодержащего сырья лежит в основе
технологии так называемых гидролизных дрожжей (то есть дрожжей, выращи­
ваемых на гидролизатах древесины). Изучение механизма кислотного гидролиза
различных групп полисахаридов растительного сырья позволило разработать ра­
циональную технологию раздельного получения пентозных и гексозных смесей
моносахаров с минимальными примесями нежелательных продуктов.
Пентозы входят в состав гемицеллюлоз, которые гидролизуются легче цел­
люлозы и лигнина. Отделение продуктов гидролиза гемицеллюлоз, обогащенных
пентозными сахарами, дает в качестве второго продукта целлолигнин, из которого
далее получают гексозный гидролизат с преимущественным содержанием глю­
козы. Такое разделение очень важно, поскольку на гексозном гидролизате можно
выращивать экологически безопасные дрожжи-сахаромицеты, тоща как на сме­
си пентоз и гексоз, так же как на чистых пентозах, можно культивировать только
дрожжи рода СапсИс1а, вызывающие аллергические реакции у людей и животных.
При получении гидролизатов древесины успешно используют сочетание тер­
мических, механических и химических воздействий на целлюлозу. В модельных
опытах на обеззоленной древесной целлюлозе показано, что ее термический гид­
ролиз при 400 °С с наложением напряжения сдвига (угол поворота наковальни
Бриджмена от 0 до 800°) дает выход легкогидролизуемой фракции целлюлозы
12 %, то же при давлении 2 кПа — 22,5 %, а при дополнительной пропитке мате­
риала 1—5%-ными растворами различных кислот — от 43 до 80 %. В оптимальном
варианте степень полимеризации целлюлозы снизилась со 170 до 15 глюкозных
единиц.
Термохимическая обработка в слабых растворах сернистой или серной кис­
лоты под давлением применяется для разделения древесины на фракции, обога­
щенные целлюлозой, гемицеллюлозой и лигнином. Метод, получивший название
«парового взрыва», разработан применительно к древесине быстрорастущих по­
род деревьев, которую используют как сырье для получения спирта путем био­
конверсии. Паровой взрыв применяют также для повышения пищевой ценности
древесины, подсолнечной лузги и других грубых кормов.
Исследование конверсии древесины березы с помощью парового взрыва
и ферментативной обработки показало, что при увеличении температуры пара со
170 до 230 °С выход растворимых веществ повышается с 30 до 40 %. Оптимален
режим обработки в течение 4 мин при 230 °С, после чего с помощью целлюлолитических ферментов можно перевести в растворимое состояние 84 % сахаров,
содержащихся в древесине, причем пентозные сахара полностью переходят в мо­
номерные формы, а выход глюкозы составляет 66 % от теоретического (фермен­
тативный гидролиз проводили в течение суток при рН 4,5 и температуре 40 °С).
Гидролизаты использовали для получения высокобелковой биомассы дрожжей
рода Сапс11с1а.
Электрохимическая обработка (ЭХО) — экологически чистый, дешевый
и эффективный способ деструкции растительного сырья. По своей сути ЭХО
близка к химической обработке кислотами и щелочами, однако имеет свои осо­
бенности. При ЭХО воду или слабые водные солевые растворы (как таковые или
в смеси с растительным сырьем) подвергают электролизу. В катодной зоне полу­
чается кислый раствор, содержащий положительно заряженные ионы водорода
и металлов, в анодной — щелочной, содержащий гидроксилы и анионы солей.
Полученные растворы, аналогичные растворам кислот и щелочей, облада­
ют гораздо более высокой химической активностью при равных концентрациях
ионов, что связано с конфигурацией водных сольватных оболочек, образующихся
вокруг ионов в момент диссоциации воды и солей в процессе электролиза. Благо­
даря высокой химической активности ЭХО-воды и растворов с их помощью мож­
но в мягких условиях гидролиза достигать тех же результатов, что при жесткой
химической обработке. Это очень существенно, так как избавляет от необходи­
мости конструировать оборудование, устойчивое к агрессивным средам.
ЭХО-растворы содержат низкие концентрации ионов и потому имеют малую
буферную емкость. При соединении с растительным материалом реакция среды
становится близкой к нейтральной. После обработки сырья не требуется нейтрали­
зации среды и последующего выведения из нее солей, то есть отпадает необходи­
мость очистки сточных вод на стадии получения гидролизатов растительного сы­
рья. При обработке ЭХО-растворами или ЭХО-водой их можно брать в количестве
не более половины объема реакционной среды, не снижая эффекта действия.
ЭХО используют для предварительной подготовки к биоконверсии лигноцеллюлозного сырья (соломы, кукурузной кочерыжки, цитрусовой муки и др.).
В производстве пива ЭХО может заменить обработку несоложеных материалов
ферментными препаратами.
;$
Радиационная обработка применяется для повышения степени конверсии
целлюлозосодержащих субстратов. Облучение целлюлозы кобальтом-60 приво­
дит к снижению степени полимеризации с 1200 до 20 глюкозных единиц, что со­
поставимо с гидролизом целлюлазами эндотипа. Этот метод очень эффективен
при биоконверсии соломы. Радиационная обработка мало используется из-за до­
роговизны и сложности установок.
Культивирование микроорганизмов. Микробную биоконверсию растительного
сырья осуществляют путем глубинной, твердофазной или ферментации смешан­
ного типа. Выбор способа культивирования зависит от вида сырья и физиологи­
ческих особенностей микроорганизмов, используемых при биоконверсии.
Двухступенчатую ферментацию смешанного типа применяют при необходи­
мости двухстадийной биоконверсии сырья различными штаммами микроорганиз­
мов. Такая ферментация проводится, например, при биологической детоксикации
кормов с высоким содержанием афлатоксинов.
'
Разработка технологии культивирования включает обязательные стадии: вы­
бор штамма микроорганизма, выбор способа культивирования и определение оп­
тимальных параметров технологического процесса.
Выбор культуры микроорганизмов определяется, прежде всего, их способ­
ностью продуцировать целевой продукт на сырье, подлежащем биоконверсии.
Для прямой биоконверсии растительного субстрата в белковый кормовой продукт
можно использовать один штамм микроорганизмов, обладающий комплексом
ферментов для гидролиза субстрата и синтеза белка на основе продуктов гидро­
лиза, или ассоциацию из двух и более штаммов, среди которых есть микроорга­
низмы с высокой активностью гидролитических ферментов и микроорганизмы,
активно синтезирующие белок (принцип «разделения труда»).
Например, получение белковых кормов на основе мелассы проводят с помо­
щью одного вида микроорганизма —1 пекарских дрожжей, а при биоконверсии
соломы дрожжи необходимо сочетать с другими микроорганизмами, поскольку
дрожжи не обладают цитолитической активностью. В качестве микроорганизмов,
гидролизующих солому, можно использовать грибы пенициллы, а в продукты
гидролиза соломы вносить культуру дрожжей.
Выбор микроорганизма — продуцента белка облегчается, если есть возмож­
ности для предобработки сырья, которая частично заменяет действие гидролити­
ческих ферментов микроорганизмов. При выборе микроорганизмов принимают
во внимание ограничения, связанные с имеющимся арсеналом технологическо­
го оборудования. Аппаратурное оформление процесса культивирования должно
обеспечивать соблюдение оптимальных технологических параметров.
Выбранный штамм микроорганизмов, помимо способности синтезировать
целевой продукт на определенном виде сырья, должен обладать генетической
стабильностью (способностью сохранять биосинтетический потенциал длитель­
ное время в условиях промышленного производства); высокой скоростью роста;
устойчивостью к инфекции; способностью к выживанию в достаточно широком
диапазоне параметров внешней среды (рН, температуры, концентрации кислорода
и элементов питания). Предпочтительно использовать спорообразующие формы
микроорганизмов, так как они имеют более высокую генетическую стабильность,
чем вегетативные формы, и более удобны для размножения в чистой культуре.
Подготовка посевного материала. Качество и количество посевного матери­
ала в значительной мере определяют результат культивирования микроорганиз­
мов на субстрате биоконверсии. Посевного материала должно быть достаточно,
чтобы обеспечить быстрое развитие микроорганизмов в питательной среде. Это
особенно важно при выращивании микроорганизмов на нестерильных средах,
когда продолжительная лаг-фаза микроорганизма-продуцента может способство­
вать развитию инфицирующих форм, содержащихся в среде или поступающих из
воздуха.
При выращивании грибов, обладающих способностью к спороношению (конидиеобразованию), в качестве посевного материала используют поверхностные
культуры, которые получают выращиванием на твердых средах — отрубях, свек­
ловичном жоме, крупах, ломтях моркови и пр. Культуры должны обильно спороносить, количество спор — 0,5—3 млрд/г сухой культуры. Расход посевной культу­
ры грибов на единицу массы среды составляет при глубинном культивировании
около 0,005 %, при твердофазном — около 0,01 %.
Перед использованием посевного материала его активируют. Культуру зали­
вают стерильным раствором минеральных солей, иногда с добавлением биости­
муляторов (экстракта солодовых ростков, кукурузного экстракта, триптического
гидролизата казеина, отдельных сахаров, аминокислот), получают суспензию
спор, которую переносят в колбу и ставят в термостатируемую качалку на 6-12 ч.
Споры набухают и прорастают, что сокращает лаг-фазу роста в основной фермен­
тации.
Спороносящие бактерии выращивают в виде пленок на твердых или жидких
питательных средах в течение времени, необходимого для перехода культуры
в стадию спороношения (1-3 сут.). Расход посевного материала (по массе сре­
ды, на которой он выращен) — 0,002-0,03 %. Активация посевного материала не
требуется. Пленки на жидких средах используются непосредственно, пленки на
твердых средах (отрубях, ломтях картофеля, крупах) заливают стерильной водой,
взбалтывают и полученной суспензией засевают производственную питательную
среду.
Посевной материал спороносящих культур грибов и бактерий, выращенный
на отрубях и крупяных твердых средах, может храниться при комнатной темпера­
туре в течение месяца и более без потери биологического потенциала. Посевной
материал неспороносящих форм микроорганизмов расходуется в больших коли­
чествах — от 3 до 10 % к объему засеваемой среды. При малых дозах посевного
материала вегетативные формы микроорганизмов развиваются очень медленно.
7-10739
Выращивание вегетативных форм микроорганизмов ведут ступенчато. Клас­
сическим примером является получение пекарских дрожжей на мелассе. Дрожжи
из пробирки с чистой культурой пересевают несколько раз в последовательно воз­
растающие объемы питательной среды, сохраняя дозировку посевного материала
10%. Аналогично поступают при получении культуральной жидкости продуцен­
тов белка, аминокислот, ферментов и пр.
При периодическом культивировании микроорганизмов такая технология до­
ставляет много хлопот. Поэтому культивирование вегетативных форм стараются
проводить в непрерывном режиме, если позволяют технологические характерис­
тики процесса. Примерами непрерывных процессов, основанных на культивиро­
вании вегетативных форм микроорганизмов, являются получение пищевых и кор­
мовых дрожжей, производство этанола, уксусной кислоты.
Выбор способа культивирования определяется физиологическими особен­
ностями микроорганизмов и свойствами сырья для биоконверсии. Как отмечалось
ранее, существуют два основных способа культивирования — поверхностный (на
поверхности жидких и сыпучих питательных сред) и глубинный (осуществля­
ющийся в толще жидкой питательной среды). Поверхностный способ (чаще —
твердофазный) осуществляется в периодическом режиме, глубинный — в перио­
дическом и различных вариантах непрерывного культивирования.
Исторически первой сложилась технология твердофазного культивирования,
возникшая в Юго-Восточной Азии в условиях кустарного производства фермент­
ных препаратов. Твердофазное культивирование — это выращивание микроорга­
низмов на увлажненных, хорошо аэрируемых твердых (сыпучих) средах.
Основой сред могут служить отруби зерновых культур, крупы, лигноцеллюлозные субстраты, свекловичный жом и пр. Эти компоненты при необходимости
дополняют минеральными солями, растворы которых используют для увлажне­
ния субстратов. Влажность питательных сред, в зависимости от вида культивиру­
емого микроорганизма, составляет 55-75 %.
Питательные среды стерилизуют, засевают культурами микроорганизмов,
перемешивают для равномерного распределения посевного материала, а затем
раскладывают в кюветы тонким слоем. .(3—5 см). Кюветы помещают в растильные камеры с регулируемой температурой и влажностью. Современный вариант
твердофазного культивирования - это выращивание микроорганизмов в механи­
зированных растильных камерах вертикального или горизонтального типа при
толщин^ слоя культуры 30-50 см.
По окончании твердофазного процесса получают культуру в виде плотной,
подсохшей массы с содержанием сухих веществ 50-65 %. До 30 % СВ состав­
ляют водорастворимые компоненты — ферменты, неактивные белки, пептиды,
аминокислоты, олиго- и полисахариды, нуклеиновые соединения, минеральные
вещества.
Преимуществами твердофазного культивирования являются: возможность ис­
пользования крупнодисперсных субстратов, хорошие физические свойства среды,
обеспечивающие высокий уровень тепло- и массообменных процессов в культуре.
Микроорганизмы растут в условиях, близких к естественным, при фиксации на суб­
страте, который при этом быстро и полно используется. Микроскопические грибы
при твердофазном культивировании имеют истинно мицелиальный, а не пеллетный
рост и, соответственно, высокую скорость синтеза белка. Мицелий не повреждается
механически, как это имеет место в глубинной культуре. Наконец, готовая культура
имеет низкую влажность, что облегчает получение товарной формы.
Твердофазное культивирование применяют почти исключительно для выра­
щивания мицелиальных грибов. Одноклеточные микроорганизмы в твердой фазе
выращивают в тех случаях, когда они имеют тенденцию к образованию нитевид­
ных, мицелиальных форм, то есть обладают диморфизмом. Это относится к родам
СапсИс/а, ЕгкЗотусорзгз, в глубинной культуре эти организмы ведут себя как одно­
клеточные, а в поверхностной растут по типу мицелиальных грибов.
Для выращивания бактерий, одноклеточных дрожжей и актиномицетов при­
меняют глубинный способ культивирования. Он успешно используется и для ми­
целиальных грибов. Глубинное культивирование проводят в ферментерах, снаб­
женных перемешивающими устройствами, системами аэрации, термо- и рН-регуляции. Питательные среды стерилизуют в ферментерах или установках непре­
рывной стерилизации. В технологии биоконверсии растительного сырья часто ис­
пользуют нестерильные среды. Концентрация питательных компонентов в средах
не превышает 25 %, обычно составляя 5-10 %. В состав питательных сред входят
минеральные соли, стимуляторы роста, источники органических соединений уг­
лерода и азота, последние — в водорастворимой или мелкодисперсной форме.
Преимущества глубинного способа выращивания: высокий уровень меха­
низации и автоматизации процесса; возможность ведения процесса в условиях
стерильности, регулируемого рН и состава среды, а также в непрерывном режи­
ме, при котором значительно повышаются экономические показатели и обеспечи­
вается генетическая стабильность микроорганизмов-продуцентов. Непрерывное
культивирование используется в тех процессах биоконверсии, где образование
целевого продукта связано с накоплением биомассы и достигает максимума в кон­
це экспоненциальной - начале стационарной фазы. Это имеет место, например,
в процессах микробного синтеза белка.
Переход к непрерывному процессу осуществляют следующим образом. В экс­
поненциальной фазе роста культуры включают проток свежей среды со скоростью,
равной удельной скорости роста микроорганизмов, что обеспечивает сохранение
уровня концентрации биомассы в ферментере. Поступление свежей питательной
среды снимает ингибирование роста микроорганизмов продуктами обмена.
Как правило, при непрерывном культивировании удельная скорость роста
и биосинтеза целевых продуктов выше, чем при периодическом. Снижается рас­
ход компонентов питательной среды, поскольку для притока используются более
бедные среды, чем для периодического культивирования. Повышается коэффици­
ент использования оборудования, уменьшается расход энергии и количество сточ­
ных вод. В длительных непрерывных процессах за счет автоселекции стабилизи­
руется генотип микроорганизмов, что приводит к повышению продуктивности.
Упрощенный вариант непрерывного процесса — это отьемно-доливной спо­
соб культивирования. Он имеет более низкие технологические характеристики,
поскольку периодический отъем и долив среды вызывает физиологический шок
культуры микроорганизмов и временное снижение скорости роста после долива.
Наиболее примитивный вариант непрерывного способа — доливной, когда
к небольшому объему культуральной жидкости постепенно добавляют свежие
порции среды до заполнения резервного объема ферментера. Доливной способ
позволяет лишь частично корректировать состав среды, что дает незначительные
преимущества перед периодическим способом культивирования.
Режимы культивирования. Выбор оптимального режима культивирования
включает определение следующих параметров: состава среды, рН, температуры,
уровня аэрации среды, влажности среды и подаваемого воздуха (для твердофазно­
го процесса), вида пеногасителя (для глубинного процесса), продолжительности
культивирования:
,
При получении обогащенных или обезвреженных кормов основой среды явля­
ется обогащаемый или обезвреживаемый корм, к которому добавляются минераль­
ные элементы, в небольших количествах и тех видов, которые допустимы в составе
корма (соли аммония, сульфат магния, сульфат или хлорид калия, фосфаты, суль­
фат или хлорид кальция, микроэлементы). При твердофазном культивировании,
где в ходе роста рН среды не регулируется, солевой состав подбирают так, чтобы
обеспечить наименьшие отклонения рН среды от оптимальной величины.
Кислотность среды должна соответствовать оптимуму для роста микроор­
ганизмов. Обычно рН устанавливают в интервале 5-7. В условиях глубинного
культивирования рН регулируют подачей водного аммиака или растворов слабых
кислот (ортофосфорной, уксусной).
В период активного роста микроорганизмов температуру среды поддержи­
вают на оптимальном для роста уровне. Оптимальная температура роста для мезофильных бактерий составляет 30-37 °С, для дрожжей и грибов 26-30 °С. Тер­
мофильные формы микроорганизмов имеют оптимальную температуру роста до
65 °С, в зависимости от температуры естественной среды обитания. В начальной
стадии культивирования спорообразующих форм микроорганизмов устанавлива­
ют температуру несколько выше оптимальной для вегетативного роста, с целью
активировать прорастание спор. Так, культивирование спороносных бактерий
с оптикумом роста 37 °С начинают при температуре 43-45 °С.
Заключительные стадии процессов биоконверсии, связанных с образовани­
ем вторичных метаболитов или детоксикацией растительных материалов, прово­
дят при температуре, оптимальной для биоконверсии, которая обычно несколько
ниже оптимальной для роста.
При твердофазном культивировании температуру среды поддерживают пода­
чей воздуха или воды с соответствующей температурой в рубашку установки. При
глубинном культивировании терморегуляцию осуществляют подачей горячей или
холодной воды в рубашку ферментера.
Аэрацию жидких питательных сред увеличивают по мере ускорения роста
и накопления биомассы микроорганизмов. Аэрация усиливается за счет барботажа
продуваемого воздуха
поскольку
твердофазном
воздух находится в сфере
статочном количестве. Расход воздуха в зависимости от возрасте культуры
растильной установки колеблется в пределах 3—30 м3/ч • кг абсолютно сухих векультуры. Влажность подаваемого воздуха должна быть 98- 100 %, что
димо для предотвращения высыхания твердофазной культуры
культивирования является
наличием
мал
культуральной жидкости в результате уноса с газообразной фа
ЗОИ.
Для предотвращения вспенивания применяют природные и синтетические
пеногасители, чаще вторые (адеканоль, пропинол и др.). Наиболее сильное вспе­
нивание происходит в фазе активного роста, что связано с выделением белков из
клеток активно размножающейся культуры, а также с высоким уровнем аэрации
среды в этот период.
Для пеногашения используют разбавленные стерильные растворы пеногасителей, которые вносят в культуральную жидкость небольшими порциями. Пекультуры
частичному торможению. Современные ферментеры
автоматической подачи пеногасителя, а также механическими устройствами для
пеногашения.
При культивировании анаэробных микроорганизмов (клостридий, некоторых
видов молочнокислых бактерий и др.) среды не аэрируют, но производят постоян­
ное или периодическое перемешивание для активизации массообмена. Анаэробы
выращивают только глубинным способом.
Продолжительность культивирования микроорганизмов определяется кине­
тикой роста, накопления целевых продуктов, потребления компонентов среды.
В периодическом процессе кривая роста имеет типичный вид (рис. 4.2).
В латентной фазе (лаг-фазе) (1) происходит
адаптация микроорганизмов к новой среде, био­
масса не увеличивается. Длительность лаг-фазы
зависит от наличия в среде легкоусвояемых пи­
тательных веществ, количества и качества по­
севного материала.
Рис. 4.2. Рост клеточной популяции при культивиро­
вании в накопительном режиме:
1 — латентная фаза; 2 — экспоненциальная фаза;
3 — линейная фаза роста; 4 — фаза замедления
роста; 5 — стационарная фаза
Основной прирост биомассы происходит в логарифмической, или экспоненци­
альной, фазе (2), когда рост не лимитирован накоплением в среде продуктов обмена
и идет пропорционально количеству клеток в культуре. В фазе замедления роста (4)
рост тормозится накоплением микробных метаболитов и исчерпанием питательных
элементов в среде. В стационарной фазе (5) устанавливается равновесие процессов
роста и автолитического отмирания клеток. После стационарной фазы происходит
отмирание культуры — деструктивные процессы становятся преобладающими, ве­
личина биомассы снижается (в пределе — до полного исчезновения).
При получении белковых продуктов целесообразно вести процесс до нача­
ла стационарной фазы, то есть до момента накопления максимальной биомассы
и белка. Дальнейшее культивирование приводит к ненужному расходу питатель­
ных веществ среды и снижению количества белка в корме. Поэтому важно уметь
определить, прямо или косвенно, динамику накопления биомассы.
При выращивании микроорганизмов глубинным способом на питательных
средах, не содержащих взвешенных частиц, прирост биомассы определяют турбидометрически — по величине оптической плотности культуральной жидкости
при соответствующем разбавлении, с учетом оптической плотности незасеянной
питательной среды. На практике часто используют питательные среды с диспер­
гированными частицами различной величины, часть которых сохраняется в куль­
туральной жидкости до конца процесса культивирования, так что определение
биомассы турбидиметрическим способом неприменимо.
Очевидно, что оптические методы неприложимы и к твердофазному про­
цессу. Поэтому широко используются косвенные методы, основанные на опре­
делении динамики сопряженных с ростом показателей, таких как выделение теп­
ла и поглощение кислорода. Активно растущие культуры интенсивно выделяют
тепло и поглощают кислород, снижение и последующая стабилизация этих пока­
зателей соответствуют переходу в фазу замедления роста и стационарную фазу.
У большинства микроорганизмов при выращивании на средах, содержащих лег­
коусвояемые соединения углерода и азота, максимум накопления биомассы и бел­
ка достигается не позднее суток. На средах с трудногидролизуемыми субстратами
процесс идет 3-10 сут.
Необходимая продолжительность ферментации может быть определена по ди­
намике накопления целевых продуктов или утилизации компонентов среды (в част­
ности, токсинов — в процессах детоксикации). При этом используются соответст­
вующие аналитические методы, предпочтительно в экспресс-модификациях.
4.3. ПРОДУКТЫ МИКРОБНОЙ КОНВЕРСИИ
Микробную биоконверсию растительного сырья в основном проводят с целью
получения кормов, обогащенных белком и ферментами, белковых пищевых про­
дуктов, а также для детоксикации пищевых продуктов и кормов.
Микробный синтез белка позволит расширить и качественно улучшить пище­
вую базу, получить высококачественные продукты, затрачивая минимум труда и
не нанося ущерба окружающей среде. Микробному белку по сравнению с живот­
ным и растительным белком присущи следующие преимущества:
■ большая скорость роста микроорганизмов (микроорганизмы растут в 500 раз
быстрее, чем сельскохозяйственные культуры и в 1000-5000 раз быстрее, чем
самые быстрорастущие породы животных);
■ высокое содержание белка в биомассе — дрожжи способны накапливать до
40—50 % белка от своей массы, а некоторые бактерии до 60—70 % белка;
■ удовлетворительная биологическая ценность белков — по содержанию боль­
шинства незаменимых аминокислот (лизин, треанин, триптофан и др.) белок
многих дрожжей и бактерий соответствует эталону (табл. 4.1);
■ независимость производства от погодных условий — биомассу микроорга­
низмов можно получать круглогодично;
* способность выращивания биомассы на различных непищевых субстратах
и на отходах ряда производств;
■ возможность организации крупнотоннажного производства.
Сырьем для получения белковой массы традиционно служат различные виды
дрожжей. Эти микроорганизмы устойчивы к инфекциям, легко отделяются от
среды благодаря крупным размерам клеток, способны усваивать различные ис­
точники углерода, азота, могут расти на простых средах. Дрожжи продуцируют
биомассу с высокими питательными свойствами и приятным запахом.
Бактерии также используются для получения белковых веществ. Преимущест­
во бактерий — высокая скорость роста, больше чем у других микроорганизмов.
По составу аминокислот бактериальный белок близок к животному, поэтому предТаблица 4 .1 . Соотношение незаменимых аминокислот в микробном
и стандартном (идеальном) белке, г/1 0 0 г белка
«Идеальный» п
белок*
1
Дрожжи
Бактерии
Водоросли
Грибы
6-8
6-7
5-10
3-7
4,2
1-1,5
1-1,4
0,3-2,1
1,4-2,0
1,4
1 Метионин
1-3
2-3
1,4-2,5
2-3
2,Э
^ Треонин
4-6
4-5
3-6
3-6
2,8
1; Валин
5-7
4-6
5-7
5-7
4,2
6-9
5-11
6-10
6-9
4.8
4-6
5-7
3,5-7,0
3-6
4,2
3-5
3-4
3-5
3-6
2,8
| Аминокислота
1 Лизин
Триптофан
| Лейцин
1 Изолейцин
Фенилаланин
V
* По стандартной шкале ФА0/В03.
|
1
|
ставляет ценность в качестве кормового препарата. Вместе с тем диаметр клеток
бактерий в 3-5 раз меньше, чем у дрожжей, а плотность их близка к плотности
воды, что осложняет стадию выделения. По сравнению с дрожжами бактерии ме­
нее устойчивы к инфекциям.
Общий недостаток дрожжей и бактерий — высокое содержание нуклеиновых
кислот: у дрожжей до 12 %, бактерий — до 16 %, что выше допустимого уровня.
Для получения кормового и пищевого белка можно использовать промышлен­
ное выращивание различных видов низших и высших грибов. В мицелии несо­
вершенных грибов содержится, %: сырого протеина до 55-57, истинного белка —
41—43, нуклеиновых кислот —5-6. Состав мицелия базидиомицетов, %: сырой
протеин — 42,5-48,5, истинный белок — 24,3-30, нуклеиновые кислоты — 2—4.
Эти данные получены при культивировании грибов как продуцентов белка. В при­
родных условиях ^доля углеводного компонента в мицелии выше, в особенности
в почвах с бедным минеральным составом.
Грибной белок хорошо усваивается. Степень усвояемости белка Ршагшт си1тогит составляет 84 %, а биологическая ценность по отношению к казеину —
50—70 %. Грибной белок обладает хорошими структурными свойствами, что важ­
но для использования в пищевых продуктах, кулинарных изделиях.
Белковые концентраты из биомассы несовершенных грибов имеют высокую
жироудерживающую способность (около 400 %), и могут давать при соединении
с жирами однородные продукты. Водоуцерживающая способность белковых кон­
центратов в отсутствие солей составляет около 100 %, она возрастает до 200223 % при увеличении ионной силы до 0,3-1,0. Ионная сила 0,3 соответствует
0,3 М поваренной соли, или концентрации ее раствора 1,75 %.
Водоросли являются перспективными источниками белка. Они легко отде­
ляются от субстрата, медленнее растут, чем дрожжи, поэтому содержат меньше
нуклеиновых кислот в биомассе. Общее содержание белка в водорослях может
достигать до 70 % от массы. В производстве пищевых продуктов рассматривают
три основные формы использования микробного белка:
•
§
■ цельная биомасса — без специального разрушения клеточных стенок;
■ дезинтеграт — частично очищенная биомасса, полученная путем разрушения
клеточных стенок и удаления нежелательных компонентов;
■ изо&яты — выделенные из биомассы белки.
Белковые дезинтеграты и изоляты называют белковыми препаратами. Дезинтеграты и изоляты отличаются по содержанию белка. Цельные клетки микроорга­
низмов в среднем содержат около 50 %..белка, дезинтеграты клеток — около 70 %,
изоляты — до 90 % и выше. Общие требования, предъявляемые к биомассе: от­
сутствие токсинов, тяжелых металлов и патогенных микроорганизмов, допусти­
мое содержание канцерогенов.
К белковым препаратам микробного происхождения предъявляют ряд спе­
цифических требований. Прежде всего, в их составе ограничивают содержание
нуклеиновых кислот, так как пуриновые основания в организме животных транс­
формируются в мочевую кислоту, что создает риск заболеваний почек и моче­
выводящих путей. Суточная норма составляет 2 г нуклеиновых
ответствует 20-30 г высушенной биомассы дрожжей или 10-20 I
снижения содержания нуклеиновых кислот в клетках микроорган
ют воздействию высоких температур в течение нескольких секунд
живают несколько часов при 50-55 °С; обрабатывают экзогенной рибонуклеазой
или кислотами, щелочами, метанолом.
Для белковых препаратов ограничивают также содержание Р-оксимасляной
кислоты в липидах; циклопропанов; разветвленных жирных кислот; жирных
кислот с нечетным содержанием атомов углерода (для дрожжевого белка), что
регулируется условиями культивирования. Контроль содержания остаточных уг­
леводородов осуществляют путем регулирования условий и режима сушки. Мик­
роорганизмы-продуценты не должны вызывать аллергических реакций, обладать
патогенными свойствами. По всем перечисленным параметрам анализируют как
сам белковый препарат, так и белок биомассы.
Микробный синтез белка. Промышленное получение белка с использовани­
ем микроорганизмов обычно осуществляется в ферментаторах, работающих по
принципу хемостата. В среду с размножающимся микроорганизмом непрерывно
подают водный раствор минеральных солей и органический субстрат, конкретный
для осуществляемого процесса. Культуру перемешивают, аэрируют и охлаждают.
Целесообразно использовать термотолерантные штаммы, что позволяет вес­
ти выращивание при максимально возможной температуре. С одной стороны, это
снижает вероятность инфицирования, с другой — уменьшает затраты на охлаж­
дение, так как расходы на эти цели тем ниже, чем больше разность температур
между охлаждающим агентом и средой. Схема получения микробного белка при­
ведена на рис. 4.3.
В качестве продуцентов микробного белка используют культуры дрожжей
( СапАШа, ЕпйотусорзЫ), несовершенных грибов (Ризапит, РемсИНит, ТпсИо(1егта) и базидиомицетов (А%апсиз, Сорппиз, ЬепИпиз, Рапиз, РИоПо1а, Р1еиго1из,
Киззи1а). Выбор продуцента определяется общим содержанием белка в биомассе,
аминокислотным составом и усвояемостью белка, содержанием нежелательных
компонентов (нуклеиновых кислот, некоторых разновидностей жирных кислот,
неусвояемых форм полисахаридов с аллергенными свойствами).
Так, например, выращенные клетки дрожжей отделяют от водной среды сепа­
рированием, а клетки грибов — фильтрацией. Термическую обработку проводят,
как правило, при 80-90 °С. Сметанообразную массу после отмирания клеток вы­
сушивают в распылительной сушилке, полученные хлопья или порошок гранули­
руют и упаковывают. Для технолога важно, чтобы ферментатор работал с высокой
производительностью, то есть его массообменная характеристика использовалась
максимально. В то же время избыток субстрата нежелателен, так как создают­
ся условия для неполной его утилизации, что соответственно затрудняет очистку
сточных вод, и повышается вероятность попадания его в готовый продукт
Специфика того или иного этапа производства зависит от особенностей куль­
тивируемого микроорганизма.
Рис. 4.3. Производство микробного белка (сухой биомассы)
Белковые препараты. Материал клеточных стенок дрожжей содержит ал­
лергены, антигенные факторы и ряд других нежелательных веществ, поэтому
предпочтительно выделять белок из клеток. Это позволяет повысить усвояемость
белка и?расширить сферу его применения в пищевых производствах. Для полу­
чения дезинтегратов с различным фракционным составом и белковых изолятов
из биомассы дрожжей используют автолиз и ферментативный лизис с помощью
дрожжелитических ферментных препаратов и протеаз обычного типа.
Технологический автолиз пекарских дрожжей (разрушение клеточных стенок
дрожжей под действием собственных ферментов) проводят при температуре 4553 °С в присутствии плазмолизирующих агентов: толуола, хлороформа, этанола,
поваренной соли и других. В суспензии биомассы создают рН 5,5-6,5. В ходе ав­
толиза чаще всего рН не регулируют: при естественном изменении рН чередуют­
ся оптимальные условия для действия различных деполимеризующих ферментов,
что повышает эффективность процесса в целом.
Содержание СВ в суспензии варьирует в пределах от 1 до 20 %, снижение
концентрации биомассы в этих пределах приводит к интенсификации автолиза.
Рациональной считают концентрацию около 10 %. Продолжительность автолиза
составляет 15—30 ч, а при предварительной механической дезинтеграции заморо­
женной биомассы — 5-6 ч.
Способ комплексной переработки биомассы пекарских дрожжей, разрабо­
танный отечественными учеными, предполагает проведение автолиза 20%-ной
суспензии дрожжей в присутствии 1 % толуола в течение 15-20 ч при 45-50 °С.
Последующее фракционирование автолизата включает: отделение клеточных
стенок дрожжей центрифугированием, обесцвечивание жидкой фазы автолиза­
та, удаление нуклеиновых соединений и пептидов сорбцией на ионите «ИА-1р»
в ОН -форме, сорбцию аминокислот из очищенного раствора предыдущей стадии
на катионите «КУ-2х8» и их последующую элюацию раствором аммиака.
Получаемая смесь аминокислот содержит все незаменимые и заменимые
аминокислоты в пропорциях, характерных для высокопитательных белковых про­
дуктов. Содержание свободных аминокислот составляет около 70 % от белка автолизированной биомассы, около 25 % белка гидролизовано до низших пептидов
(500-700 Да).
По данной схеме из 50 кг дрожжей с влажностью 75 % получают 2-3 кг смеси
аминокислот, 0,3-0,5 кг нуклеиновых компонентов и около 6 кг клеточных стенок,
из которых можно дополнительно выделить 35-45 г эргостерина. Аминокислотная
смесь используется в препаратах для парентерального и энтерального лечебного
питания, а также в качестве добавок (2-3 %) в макаронные и мучные кулинарные
изделия, что увеличивает их биологическую ценность на 20-40 %.
Аминокислотная смесь рекомендуется как заменитель цветочной пыльцы
в период расплода пчел. Неочищенный дрожжевой автолизат, приготовленный
с использованием нетоксичных плазмолитиков, может применяться как кормовая
добавка в птицеводстве, рыбоводстве и звероводстве.
Перспективным источником белка являются избыточные пивные дрожжи, ко­
торые могут бьггь автолизированы также по описанной схеме.
Ферментативный лизис клеточных стенок дрожжей проводят с помощью раз­
личных ферментов и мультиэнзимных композиций. Для разрушения клеточных
стенок свежих дрожжей родов [УеЬагуотусез, НапзепЫа, Р1сИга, ЗассЬаготусез,
Тоги1азрога рекомендуют комплекс внеклеточных ферментов гриба Тк уггШе, об­
ладающий Р-1,3-глюканазной активностью, в сочетании с протеазой растительно­
го происхождения (папаином, бромелаином, фицином).
При лизисе суспензии прессованных пивных дрожжей ферментами Аг1НгоЬас1ег
/шеиз в жидкую фазу лизата переходит около 80 % клеточных включений, ббльшая
часть белков лизата имеет молекулярную массу выше 50 кДа, что свидетельствует
о незначительной степени расщепления. Процесс выделения белковых изолятов
из клеток дрожжей под действием литических ферментов показан на рис. 4.4.
Препарат изолятов содержит в своем составе около 80 % нативного белка,
7-8 % углеводов и 2-3 % нуклеиновых кислот.
Литические
ферменты
Раствор МаОН
(рН 10)
Рис. 4.4. Получение белковых изолятов из клеток дрожжей
Способы получения продуктов глубокого расщепления основываются на со­
четании автолиза дрожжей и их лизиса препаратами литического или протеолитического действия. Для активации протеолиза дрожжей используют раститель­
ные, животные и микробные протеазы. Протеазы могут быть неспецифичными по
отношению к дрожжевому белку, но в сочетании с автолитическими протеазами
дрожжей дают хороший эффект. Например, «Проназа Е», папаин, пепсин, «Протосубтилин ГЮх» нейтральный в соотношении с изолированным белком пекарских
дрожжей 1 : 1000 гидролизуют его не более чем на 4 %, а добавление этих пре­
паратов в том же соотношении к белку автолизирующихся дрожжей через 5 ч по­
сле начала автолиза позволяет, спустя еще час, получить глубину гидролиза белка
95 %. В контроле этот уровень достигается лишь после 20 ч автолиза.
С применением препарата «Лизосубтилина ГЮх» разработан способ полу­
чения белково-витаминного обогатителя пищи из гидролизных дрожжей рода
СапсИс1а. Процесс включает следующие операции: кормовые дрожжи с влаж­
ностью 75-90 % нагревают до температуры 46-50 °С, вносят «Лизосубтилин»
в количестве 0,2-0,5 % к СВ дрожжей, проводят гидролиз в течение 20-30 ч при
постоянной температуре и перемешивании. Затем непрогидролизованные остатки
клеток отделяют сепарацией,' а жидкую фазу высушивают.
Сухой продукт представляет собой порошок соломенно-желтого цвета с при­
ятным пищевым запахом. Содержание аминного азота составляет 4,3 %, около по­
ловины определяемых аминогрупп принадлежат свободным аминокислотам, среди
которых преобладают аланин, лизин, лейцин (соответственно 16, 15,7 и 12,4 %).
«Лизосубтилин» может использоваться для получения белковых продуктов
из дрожжей спиртового производства. Эти дрожжи обладают заметной автолитической активностью, причем оптимальные условия автолиза и лизиса «Лизосубтилином» совпадают, что позволяет вести процесс при постоянных значениях
рН и температуры (рН 6,3-6,8, температура 50-55 °С). При дозе препарата 0,1 %
к СВ биомассы дрожжей выход растворимых форм азота и углеводов возрастает
в 2-2,5 раза (по сравнению с автолизом), через 6 ч в жидкую фазу ферментолизата
переходит около половины азотистых соединений и треть углеводов. Выход аминного азота составляет около 3 % к сухой массе дрожжей.
Растительные белковые гидролизаты. Белковыми гидролизатами называют
продукты гидролитического расщепления белков — аминокислоты, их натриевые
соли, пептиды. Натриевые соли аминокислот, особенно глутаминовой кислоты
(глутамат натрия), обладают способностью усиливать естественный вкус таких
продуктов, как мясо, рыба, овощи, при добавлении к блюду в небольших количе­
ствах. Входящие в состав гидролизатов аминокислоты и их натриевые соли, а так­
же продукты вторичного синтеза (меланоидины и др.) обусловливают определен­
ный вкус, например, вкус грибов, мяса, куриного бульона. Поэтому, используя
направленный гидролиз белков и строго подбирая сырье, можно получить гидро­
лизаты определенного вкуса.
Белковые гидролизаты из растительного сырья получают путем культивиро­
вания гриба Авр. огугае, а также с использованием ферментных препаратов. Тех­
нология получения растительных белковых гидролизатов путем культивирования
гриба Авр. огугае включает следующие этапы: подготовка соевого шрота для куль­
тивирования плесневого гриба, получение массы, проросшей плесневым грибом,
ферментация, дозревание, осветление полученного гидролизата, фильтрование,
сгущение, расфасовка в стеклянную тару.
Подготовка соевого шрота проводится в несколько этапов: просеивание на
вибросите для отделения случайных примесей и пропускание через магниты для
улавливания ферропримесей; стерилизация острым паром при давлении 0,2 МПа
в течение 30 мин; охлаждение стерилизованной массы; гранулирование; смешива­
ние со стерильной пшеничной мукой и маточной культурой Авр. огугае.
Подготовленную смесь культивируют в специальных аппаратах в течение 24 ч
для выращивания гриба. Через 10-12 ч после загрузки смесь продувают кондицио­
нированным и очищенным от пыли воздухом температурой 28-30 °С с относитель­
ной влажностью 80-85 %. В течение культивирования на поверхности гранул раз­
растается мицелий гриба, покрывая их белым налетом. После окончания процесса
спороношения (через 24 ч) масса покрывается зеленым напетом. Дальнейшая вы­
держка ее в аппаратах приводит к снижению протеолитической активности накоп­
ленных ферментов. Влажность гранул, проросших грибом, не должна превышать
32 %. Массу, проросшую плесневым грибом, называют коджи.
Ферментацию коджи можно осуществить методами мокрой и сухой фермен­
тации. Метод мокрой ферментации, или чаново-прессовый метод, очень длитель­
ный — до 45 сут.» поэтому предпочтение отдается сухой ферментации.
По методу сухой ферментации массу коджи измельчают и выдерживают 48 ч
в специальных ферментаторах при температуре 40 °С. В результате повышения
температуры в массе значительно ускоряются ферментативные процессы, а также
процессы вторичного синтеза с образованием меланоидинов. Ферментированную
массу промывают раствором поваренной соли, извлекая экстрактивные вещества
(аминный азот, пептиды, безазотистые соединения, меланоидины и др.). При не­
обходимости получения бессолевого гидролизата экстракцию ферментированной
массы осуществляют кипяченой, слегка подсоленной для смягчения жесткости
ВОДОЙ.
■ " I I... .
■
■ I
'■
!
Полученный гидролизат подвергают дозреванию, для чего его выдерживают
в чанах при температуре 40-45 °С в течение 5 сут., периодически насыщая возду­
хом. При дозревании в гидролизате продолжаются реакции образования аминного
азота и разрушения пептидных связей в белках, также идут реакции гидролиза
углеводов и, как следствие, реакция меланоидинообразования. В результате гид­
ролизат темнеет, вкус и запах его улучшаются, становятся более полными.
После дозревания гидролизат для осветления обрабатывают активирован­
ным углем при нагревании до 70-90 °С и постоянном перемешивании в течение
1-2 ч. Горячий гидролизат фильтруют на нутч-фильтре. Активированный уголь
промывают на фильтре горячей водой, промывные воды добавляют к гидролизату.
Вместо активированного угля можно использовать древесный уголь, норит или
карбораффин.
I
Осветленный гидролизат сгущают в вакуум-аппарате при остаточном давле­
нии 2,6-8 кПа и температуре 55-60 °С до содержания СВ 75-80 %. По окончании
выпаривания получают однородную пастообразную массу с острым, соленым
мясо-грибным вкусом, коричневого цвета.
Сгущеный гидролизат расфасовывают в стеклянную тару, герметически уку­
поривают и хранят до использования. Срок хранения такого гидролизата 12 мес.
Из сгущеного гидролизата готовят бульонную пасту, смешивая его с ароматизиро­
ванным жиром, солью и глутаматом натрия и используют в производстве пищеконцентратов первых и вторых обеденных блюд.
Обезвреженные продукты и корма. Методы биоконверсии применяются так­
же для снижения токсичности пищевых продуктов и кормов. Токсичность может
быть вызвана присутствием токсгенных микроорганизмов или продуктов их жиз­
недеятельности, пестицидов, а также природных растительных токсинов, содер­
жащихся в сырье.
■:
>.
Для обезвреживания продуктов используют способность микроорганизмов
конкурентно подавлять развитие инородных форм, сорбировать и деградиро­
вать токсические соединения. В качестве микроорганизмов-детоксикантов часто
используют дрожжи. Различные виды сахаромицетов (пекарские, пивные, вин­
ные дрожжи-киллеры) полностью обезвреживают среды, содержащие токсины
СИгоЬас(ег и На/та а1уег. Эффективны как живые, так и автолизированные и мерт­
вые дрожжевые клетки, что свидетельствует о сорбционном характере связыва­
ния токсинов.
Среды с комбикормами, зараженными токсигенными бактериями (Аеготопаз
зр., Сес1асеазр., Еп1егоЪас1ег с1оасае), практически полно обезвреживаются при фер­
ментации различных видов дрожжей в течение 48 ч. Лишь культуры Рз. аеги&поза
не теряют токсигенности при совместном культивировании с дрожжами. Детокси­
кация зараженных сред сопровождается снижением антиоксидантной активности
липидов токсигенных микроорганизмов. Роль окислителей играют поверхност­
ные структуры дрожжей. Детоксикация кормов проходит более успешно в глу­
бинной культуре, что объясняется повышенной интенсивностью массообмена по
сравнению с твердофазным процессом.
Дрожжи способны связывать токсины различной природы. Клеточные стенки
дрожжей активно сорбируют пестициды фосфор- и хлорорганической природы
(фосфамид, фозалон, кельтан). Препарат дрожжевых оболочек шампанской расы
5. у/л/10 С, внесенный в виноградный сок в количестве 0,5 г/л, связывал 100 %
фосфамида, 97—98 % фозалона, 98 % кельтана. Для обработки виноградного сус­
ла из винограда машинного сбора рекомендуется доза дрожжевого сорбента 0,10,3 г/л.
Дрожжи — продуценты каротиноидных пигментов, которые способны де­
градировать афлатоксины. Активный деструктор афлатоксинов Шю(1о1оги1а тисг1а%тоза при выращивании на модельной среде разрушал афлатоксины
В2, С|
и Сг2 соответственно на 98,6; 68,6; 76,8 и 16,2 %. Наиболее опасные токсины В]
и Сп превращались в значительно менее токсичные производные Вга и СЬ».
Для снижения содержания природного растительного токсина госсипола
в хлопковом шроте его ферментируют культурами микромицетов — мукоров и пе­
нициллов. При этом достигается снижение концентрации свободного госсипола
до 65 раз, связанного — до 88 раз. Микробная детоксикация позволяет использо­
вать на корм скоту шрот после прямой экстракции масла, содержащий изначально
свободный госсипол в концентрации выше допустимой (0,02 %).
Часть III
БИОТЕХНОЛОГИЯ ОТДЕЛЬНЫХ
ПИЩЕВЫХ ПРОИЗВОДСТВ
Хлебопекарное производство
Кондитерское производство
Получение спиртопродуктов
Пивоваренное производство
Виноделие
Производство соков
Получение кваш еных (соленых, моченых)
плодов и овощ ей
Производство кваса
Производство чая
Глава 5
ХЛЕБОПЕКАРНОЕ ПРОИЗВОДСТВО
Основным биотехнологическим процессом, лежащим в основе технологии про­
изводства хлебобулочных изделий, является спиртовое (в некоторых случаях мо­
лочнокислое) брожение. Знание биохимических процессов, происходящих при
производстве хлеба, позволяет управлять технологическим процессом и выпекать
хлеб высокого качества. Совершенствование технологии хлебопечения также свя­
зано с использованием ферментных препаратов, позволяющих интенсифициро­
вать процесс брожения, а обогащение муки витаминами, микроэлементами, вве­
дение в рецептуру отрубей и других полезных компонентов позволяет получать
продукты функционального назначения, к которым в последнее время возрастает
интерес потребителей.
5.1. СЫ РЬЕ ДЛЯ ХЛЕБОПЕЧЕНИЯ
Основным сырьем для хлебопечения являются мука, вода, соль и дрожжи. При
приготовлении улучшенных и сдобных изделий используют сахар, патоку, моло­
ко, яйца и яйцепродукты, жиры, солод, изюм, мак, пряности.
Мука — основной компонент хлебопекарной промышленности, качество муки
во многом влияет на свойства готовых изделий. В хлебопекарной промышленнос­
ти в настоящее время применяют следующие основные виды муки: пшеничная
хлебопекарная; ржаная хлебопекарная — обойная, обдирная, сеяная; соевая; куку­
рузная; овсяная; ржано-пшеничная обойная и другая мука, предусмотренная соот­
ветствующим документом для выработки хлебобулочных изделий. Кроме того, ис­
пользуют крупку пшеничную дробленую и другие продукты переработки зерна.
В соответствии с ГОСТ Р 52189-2003 «Мука пшеничная. Общие технические
условия», пшеничную муку по целевому использованию подразделяют на пше­
ничную хлебопекарную и пшеничную общего назначения. Пшеничную хлебопе­
карную муку в зависимости от белизны или массовой доли золы, массовой доли
сырой клейковины, а также крупности помола подразделяют на сорта: экстра, выс­
ший, крупчатка, первый, второй и обойная.
В хлебопекарном производстве предъявляются определенные требования
к количеству и качеству клейковины, отмываемой из пшеничной муки. Клейко­
вина хорошего качества должна быть упругая, нелипкая, эластичная, белого или
белого с желтым оттенком цвета. В зависимости от эластичности и растяжимости
по качеству клейковину делят на три группы. Мука с клейковиной третьей группы
в хлебопекарном производстве применяться не должна.
Вода должна отвечать требованиям, содержащимся в ГОСТ Р 51355-99
и СанПиН 2.1.4.1074-01 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству
воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества».
Соль поваренную пищевую применяют следующих сортов: экстра, высший,
первый и второй (сорта различаются содержанием хлорида натрия и примесей).
Для лечебных и профилактических сортов хлебобулочных изделий применяют
йодированную соль с добавкой йода в виде йодистого калия со сроком хранения
2-3 мес., а также разработанную Институтом питания РАМН йодированную соль
с добавлением йодноватокислого калия со сроком хранения 12 мес. По истечении
срока хранения поваренной пищевой соли с добавкой йода ее реализуют как соль
поваренную пищевую без добавок.
:
Дрожжи для производства хлеба в основном применяют вида ЗассИаготусез
сегеутае, реже — СапсИс/а тШеп. В хлебопечении используют следующие разно­
видности хлебопекарных дрожжей: прессованные, сушеные, молоко дрожжевое.
Дрожжи хлебопекарные прессованные (с содержанием СВ 30-31 %) посту­
пают в пачках массой 0,05; 0,1; 0,5 и 1,0 кг. При наличии дрожжевого завода в од­
ном городе с хлебозаводом допускается доставка прессованных нерасфасованных дрожжей в специальной таре. Дрожжи хранятся в холодильной камере при
температуре 0—4 °С. Допускается хранить дрожжи в замороженном состоянии.
Продолжительность хранения — до 12 сут. со дня выработки. По истечении срока
хранения необходимо определить подъемную силу дрожжей. Если величина по­
казателя выше нормы, указанной в нормативном документе (НД), целесообразно
провести их активацию.
Из прессованных дрожжей вырабатывают сушеные, которые характеризуются повышенным содержанием сухих веществ (32-34 %), в том числе инстантные
(быстроразводимые), выпускаются под разными торговыми названиями. Дрожжи
поступают в крафт-пакетах или в пачках, упакованных под вакуумом. Длитель­
ное хранение таких дрожжей обеспечивается за счет высушивания до содержания
влаги 8-9 %. Срок хранения — до 24 мес. со дня выработки при температуре
18-22 °С. Вскрытые крафт-пакеты или пачки с сушеными дрожжами необходимо
хранить при температуре 0-6 °С не более 7 сут.
Дрожжевое молоко представляет собой водную суспензию клеток ЗассИаготусез сетущае, полученную в результате размножения их в в культуральной сре­
де, сгущения на сепараторах, выделения на вакуум-фильтрах или фильтр-прессах.
Влажность дрожжевого молока не более 75 %, срок хранения — не более 1 сут.
Сахар при выработке хлебобулочных изделий применяют в виде сахара-песка и сахара-рафинада (прессованного, колотого или быстрорастворимого, рафи­
нированного сахара-песка или рафинадной пудры размером кристаллов не более
0,2 мм). Упакованный сахар-песок должен храниться при температуре не выше
• I
40 °С и относительной влажности воздуха не выше 70 %. Помимо сахара исполь­
зуют сахаристые продукты — жидкий сахар, патоку, мед (натуральный и искус­
ственный) и др.
Фруктозу и подсластители (сорбит, ксилит, интенсивные подсластители) ис­
пользуют вместо сахара (сахарозы) для производства диетических сортов изделий.
Сладость интенсивных подсластителей в сотни раз больше сладости сахарозы.
В России органами Минздрава для применения в производстве хлебобулочных
изделий разрешены в качестве интенсивных подсластителей следующие пищевые
добавки: сахарин и его натриевая, калиевая и кальциевая соли, ацесульфам калия,
аспартам, сукралоза, кристаллоза (30%-ный водный раствор) и др.
Интенсивные подсластители поступают в порошкообразном, гранулирован­
ном, жидком виде или в таблетках в таре, пригодной для хранения пищевых про­
дуктов. Кристаллозу доставляют в жидком виде в полиэтиленовых канистрах. Рас­
твор кристаллозы хранят в плотно закрытой таре, срок годности I—6 мес. Водный
раствор аспартама хранят в течение 3-4 мес. Водные растворы других подслас­
тителей следует использовать в течение года. Срок годности сухих подсластите­
лей — 5 и более лет.
Продукты масложировые используются в хлебопечении следующих видов:
различные жиры растительного и животного происхождения, маргарины, специ­
альные виды жировых продуктов и др.
5.2. ТЕХНОЛОГИЯ ПРОИЗВОДСТВА
ХЛЕБА И ХЛЕБОБУЛОЧНЫХ ИЗДЕЛИЙ
Биохимические процессы. В производстве хлеба из пшеничной высокосортной
муки для проведения процессов брожения и кислотообразования применяют как
чистые культуры микроорганизмов— дрожжевые клетки ЗассИаготусев сегеу!В1ае
(дрожжи хлебопекарные прессованные), так и дикие формы молочнокислых бак­
терий. Последние в значительном количестве содержатся в муке, дрожжах и дру­
гом сырье и начинают размножаться при создании благоприятных условий. Мо­
лочнокислые бактерии также могут быть специально размножены в процессе при­
готовления концентрированных молочнокислых заквасок или жидких дрожжей.
В пшеничном тесте, приготовленном на прессованных дрожжах, преимуще­
ственно происходит процесс спиртового брожения.
Газообразующая способность муки и теста определяется способностью дан­
ной муки, данного теста образовывать определенное количество углекислого газа
(СО2), разрыхляющего тесто и придающего пористость мякишу хлеба. Газообразу­
ющая способность зависит, прежде всего, от активности дрожжей (от их качества).
Если дрожжи активные, интенсивность брожения — скорость, с которой
в тесте образуется СОг, -^- определяется количеством доступного для брожения
сахара, имеющегося в муке и тесте. В зерне пшеницы и пшеничной муке содер­
жится от 1 до 2,5 % сахара, главным образом сахарозы, которая очень легко рас­
щепляется под действием сахарозы дрожжей и сбраживается на первых этапах
брожения теста. Однако данного количества доступных для сбраживания сахаров
в тесте недостаточно.
. *
Под действием амилаз, содержащихся в муке, крахмал расщепляется с обра­
зованием мальтозы и, в конечном счете, глюкозы, которая сбраживается дрожжа­
ми. Если мука имеет низкую амилолитическую активность, то в тесте не будет
образовываться достаточного количества мальтозы и глюкозы, брожение не будет
происходить достаточно интенсивно, в результате получится хлеб плохого каче­
ства, с недостаточно пористым и разрыхленным, плотным мякишем. Общее урав­
нение спиртового брожения имеет следующий вид:
СбН120б -*■ 2СНзСН2ОН 1 2 С 0 2 + 2АТФ
Процесс спиртового брожения пшеничного теста, приготовленного на прес­
сованных дрожжах, проходит в три стадии. На первой стадии сложные углеводы
предварительно гидролизуются до простых сахаров под действием амилаз:
(СбНю05)п —*
Крахмал
(СбНю05)п
—► С 12Н22О 11
Ряд декстринов
Мальтоза
—► СбН|20б
•
Глюкоза
Вторая стадия протекает по типу гликолиза до образования пировиноградной
кислоты (рис. 5.1).
Третья стадия спиртового брожения состоит из двух реакций:
1. Декарбоксилирование пировиноградной кислоты под действием пируватдекарбоксилазы с образованием уксусного альдегида:
2СНзСОСООН -► 2СН3СОН + 2С 02
2. Восстановление уксусного альдегида в этиловый спирт под действием алкогольдегидрогеназы:
2СН3СОН + 2НАДН2 - » 2СН3СН2ОН + 2НАД+
•)
Пшеничное тесто можно готовить не только на прессованных дрожжах, но и на
закваске или на так называемых жидких дрожжах. Закваска и жидкие дрожжи
применяются и для приготовления ржаного теста. В тесте, приготовленном на
закваске или на жидких дрожжах, помимо процессов спиртового брожения идет
процесс гетероферментативнош молочнокислого брожения, в результате чего на­
ряду с этиловым спиртом и углекислым газом накапливаются молочная кислота
и незначительное количество уксусной кислоты.
Газоудерживающая способность теста (пшеничного и ржаного) зависит,
прежде всего, от свойств содержащихся в тесте белков. В пшеничном тесте они
образуют растяжимый, эластичный белковый каркас, в котором накапливаются
пузырьки газа С 0 2, поднимающие тесто во время брожения. Когда тесто ставят
в печь, то под влиянием высокой температуры, достигающей внутри мякиша
97-99 °С, происходит коагуляция, свертывание белков. В результате образуется
белковый каркас готового хлеба, достигнутый в результате брожения объем теста
при этом фиксируется, закрепляется.
Гексокиназа
Глюкозофосфатизомераза
Фруктозо-6-фосфат
Фосфофруктокиназа
Фруктозодифосфатальдолаза
Диоксиацетонфосфат
Глицеральдегидфосфатдеаидрогеназа
Фосфоглицераткиназа
2АДФ
(2) З-Фосфоглицерат
Фосфоглицеромутаза
Рис. 5.1. Фруктозо-1,6-бифосфатный путь расщепления глюкозы (гликолиз)
Вкусовые и ароматические вещества хлеба. Сложный комплекс различных ве­
ществ, образующихся в процессе брожения теста и при выпечке хлеба, определяет
его аромат. Этот комплекс включает в себя различные альдегиды, органические
кислоты, сложные эфиры и другие вещества. Особенно важную роль в качестве
ароматобразующих веществ играют фурфурол и окисметилфурфурол.
Фурфурол имеет запах яблок, он образуется в процессе выпечки хлеба из пентоз, подвергающихся дегидратации в соответствии с уравнением:
с , н „а
~зн*° >с , н 4о ,
Оксиметилфурфурол образуется при выпечке хлеба аналогичным образом
(путем дегидратации гексоз) и придает приятный запах меда. Кроме фурфурола
и оксиметилфурфурола большое значение имеют и другие альдегиды, например
изовалериановый, с типичным запахом ржаной хлебной корки.
Многие альдегиды, подобные изовалериановому, образуются при выпечке
в результате реакции меланоидинообразования (реакция Майяра) — взаимодей­
ствия сахаров, фурфурола и оксиметилфурфурола с аминокислотами и белками.
В результате реакции Майяра образуется сложный комплекс веществ: из сахаров
образуются фурфурол и оксиметилфурфурол, из аминокислот — другие альдеги­
ды, например изовалериановый. При взаимодействии сахаров, белков и амино­
кислот образуются меланоидины, придающие темную окраску корочке хлеба.
В создании вкуса и аромата хлеба большое значение имеют также органичес­
кие кислоты: молочная, уксусная, яблочная и лимонная. В ржаном хлебе кроме
молочной и уксусной кислот содержится также заметное количество муравьиной,
которая образуется в результате разложения окисметилфурфурола под действием
высокой температуры.
Технологические этапы. Производство хлеба включает пять тесно связанных
между собой технологических этапов: подготовка сырья, приготовление теста,
разделка теста, выпечка, охлаждение и хранение хлеба.
Подготовка сырья. Муку, дрожжи и другое сырье анализируют в лаборато­
рии хлебозавода, определяют соответствие его стандартам, устанавливают хле­
бопекарные свойства муки. Партии муки после проверки хлебопекарных свойств
смешивают в определенных пропорциях (валка муки), просеивают для удаления
посторонних примесей и равномерного насыщения воздухом, затем пропускают
через магнитоуловители.
'
'
Вода подогревается с таким расчетом, чтобы тесто после замеса имело тем­
пературу 27-30 °С. Требуемое количество воды для замеса теста определяют по
его рецептуре, влажности и водопоглотительной способности муки. Поваренную
соль и сахар используют в виде профильтрованных растворов определенной кон­
центрации. Жиры добавляют в жидком состоянии после фильтрации.
Прессованные дрожжи размешивают в теплой воде (подготавливают их вод­
ную суспензию). Замороженные дрожжи оттаивают при температуре 4-6 °С по­
степенно в течение 18-24 ч, так как быстрое оттаивание, например при комнат­
ной температуре, снижает подъемную силу. При транспортировании и хранении
прессованных дрожжей происходит естественная усушка дрожжевой массы, но
количество дрожжевых клеток остается постоянным. В этом случае при расчете
количества дрожжей, предусмотренных рецептурой, необходимо уменьшить их
расход в соответствии с размером усушки.
Сушеные инстантные дрожжи обычно применяют в сухом виде в соотноше­
нии (1 : 3)-(1 : 6) к прессованным в зависимости от их подъемной силы и в со­
ответствии с рекомендациями фирмы-производителя. Для выработки ржаного
и ржано-пшеничного хлеба готовят закваски. Закваски и жидкие дрожжи необхо­
димо периодически обновлять. Режим обновления устанавливают в зависимости
от ритма работы предприятия, уровня показателей полуфабрикатов: влажности,
температуры, кислотности, подъемной силы, органолептической оценки и др.
Замес пшеничного и ржаного теста производится разными способами, что
объясняется различиями химического состава муки и активности ферментов.
Пшеничное тесто замешивают на дрожжах, способствующих развитию спиртово­
го брожения. Присутствующий в тесте клейковины белковый каркас удерживает
образующийся углекислый газ, обеспечивая пористую структуру мякиша хлеба
и увеличение объема тестовой заготовки.
Пшеничное тесто готовят по установленной рецептуре — перечню и соотно­
шению отдельных видов сырья, употребляемых для производства определенно­
го сорта хлеба. Для основных сортов пшеничного хлеба используют следующую
примерную рецептуру: мука — 100 частей; вода — 50-70; прессованные дрож­
жи — 0,5-2,5; соль — 1,3-2,5; сахар — 0-20; жир — 0-13. В рецептуру некоторых
сортов хлеба и хлебных изделий, кроме того, входят яйца, солод, изюм, молоко,
ванилин и другое сырье.
Из пшеничной муки тесто готовят опарным и безопарным способами. На
большинстве предприятий предпочтение отдано опарному способу как более эко­
номичному и дающему изделия хорошего качества. Опарный способ двухфазный:
сначала готовят жидкое тесто (опару), а затем на нем замешивают густое тесто.
Для приготовления опары берут в среднем 1/3-1/2 части муки, 2/3 части воды
и предусмотренное рецептурой количество дрожжей. Опара получается более
жидкая, чем тесто. Опаре дают бродить 2—4 ч при температуре 27-30 °С , затем
добавляют все оставшиеся по рецептуре компоненты, замешивают тесто и остав­
ляют на 1-1,5 ч для созревания.
За время созревания теста размножаются дрожжи, молочнокислые бактерии.
Происходит спиртовое (преимущественно) и молочнокислое брожение, частично
осахаривается крахмал и гидролизуется небольшая доля белков и жиров. Углекис­
лый газ и пузырьки воздуха участвуют в формировании пористой структуры тес­
та. Другие вещества (спирты, кислоты, альдегиды, кетоны, моносахара) служат
материалом, из которого образуются вкусовые и ароматические вещества хлеба.
За время брожения тесто из сортовой муки подвергают одной или двум об­
минкам — кратковременным (1,5-2,5 мин) повторным промесам, улучшающим
структуру, физические свойства теста и, следовательно, качество хлеба.
При безопарном Способе замеса теста все сырье, предусмотренное рецепту­
рой, замешивают в один прием, после чего следует брожение в течение 3-4 ч. На­
чальная температура теста 28-30 °С, обминок — одна или несколько. Безопарный
способ применяют при выработке изделий с низкой кислотностью (чаще — сдоб­
ных булочных изделий, реже — хлеба). Этот способ более быстрый, но получае­
мые изделия по объему, пористости и вкусу уступают изделиям из теста, приго­
товленного опарным способом.
В хлебопекарной промышленности применяют также другие способы приго­
товления теста из пшеничной муки: на жидком сброженном полуфабрикате с со­
кращенным периодом брожения, на больших густых опарах с интенсивным заме­
сом теста и др. С целью интенсификации процесса созревания теста в рецептуру
добавляют небольшие дозы ферментных препаратов, модифицированного крах­
мала, окислителей или восстановителей клейковины; вместо части воды вводят
молочную сыворотку.
Качество теста обычно контролируют по следующим показателям: кислот­
ность, массовая доля влаги, газообразование, температура.
Ржаное тесто характеризуется высокой кислотностью, которая достигается
тем, что тесто замешивают на густых и жидких заквасках из муки, воды и старой
порции закваски или теста. Они содержат дрожжи и молочнокислые бактерии, ко­
торые вызывают брожение теста, а также образуют молочную и уксусную кисло­
ты. Соотношение количества дрожжей и молочнокислых бактерий в ржаном тесте
(1 : 6 0 Н 1 : 100).
|
Й р И
Щ
Кислая среда благоприятно влияет на физические свойства теста. В ржаном
тесте отсутствует клейковинный белковый каркас. Его основу составляет вязкая
жидкая фаза, в состав которой входят неограниченно набухающие пептизированные белки и слизи, растворимые декстрины, сахара, соли и другие водораство­
римые вещества муки. В жидкой фазе распределены набухшие зерна крахмала,
нерастворимые белки и отрубистые части муки.
Структурно-механические свойства теста в основном определяются свойст­
вами вязкой жидкой фазы, особенно соотношением в ней пептизированных и ог­
раниченно набухших белковых веществ. В кислой среде ускоряется образование
вязкого коллоидного раствора белков и слизей и, кроме того, инактивируется фер­
мент а-амилаза, расщепляющий клейстеризованный крахмал до декстринов. Это
предотвращает повышенную липкость и заминаемость мякиша готового хлеба.
После замеса ржаное тесто оставляют для брожения, конец которого опреде­
ляется достижением кислотности 12-14 град.
Заварное тесто идет на изготовление некоторых сортов ржаного и ржано-пше­
ничного хлеба. Для заварного теста часть муки (около 10%) заваривают крутым
кипятком при слабом помешивании и выдерживают до 4 ч. В некоторых случаях к
муке добавляют солод. На заварке ставят опару или тесто. Заварной хлеб обладает
выраженным ароматом, сладким вкусом, долго не черствеет и образует особо ру­
мяные корочки из-за наличия в нем повышенного количества декстринов и маль­
тозы. Оклейстеризованный при заварке крахмал легче поддается осахариванию,
а затем брожению.
Поточно-непрерывное и ускоренное приготовление теста достигается за счет
усиления механической обработки теста, увеличения количества прессованных
или жидких дрожжей, повышения температуры опары и теста и другими спосо­
бами.
Известны химические пути ускорения созревания теста. В одном случае ис­
пользуют окислители в сочетании с восстановительно действующими агентами.
Например, добавление цистеина, сыворотки ускоряет образование и созревание
теста, и вместе с тем значительно снижает энергию (работу) на механическую об­
работку теста. Эффект подобных добавок усиливается в сочетании с небольшим
количеством жира, имеющим повышенную температуру плавления.
Для ускорения образования и созревания теста, а также для улучшения ка­
чества хлеба в тесто вносят поверхностно-активные вещества (ПАВ) — пищ евые
эмульгаторы: фосфатиды и их препараты — фосфатидные концентраты, лецитин
и др., эфиры сорбита, эфиры пропиленгликоля и т. д. Наилучших результатов до­
стигают при совместном внесении эмульгаторов и жиров в виде тонкодисперсных
жиро-водных эмульсий.
Разделка теста. Выбродившее тесто с помощью машины делят на куски оп­
ределенной массы. Куски теста для формового хлеба укладывают в формы, а для
хлеба, выпекаемого на поду печи (подового), — закатывают машинами в батоны
или круглые булки. Перед посадкой в печь куски теста оставляют для оконча­
тельной расстойки при температуре 30-32 °С и относительной влажности воздуха
75-80 % в течение 25-120 мин.
Время расстойки зависит от массы тестовой заготовки, рецептуры хлеба, ка­
чества муки и специфики технологического процесса. При расстойке происходят
те же процессы, что и при брожении: образуется углекислый газ, который раз­
рыхляет тесто, увеличивая его объем, что обеспечивает высокое качество хлеба.
Конец расстойки определяют по увеличению объема тестовых заготовок и приоб­
ретению ими правильной формы.
Перед посадкой в печь многие заготовки обрабатывают: делают на пбверхности надрезы или наколы, смазывают поверхность крахмальным клейстером,
мучной болтушкой и т. д. Корочка изделий, прошедших такую обработку, приоб­
ретает более привлекательный внешний вид.
Выпечка происходит в хлебопекарных печах при температуре 180-280 °С.
Мелкоштучные изделия выпекают в течение 8-12 мин, а хлеб крупного развеса
(2,5 кг и более) — 80 мин и более. В зависимости от вида и сорта хлеба его выпе­
кают на поду или в формах.
Превращение теста в хлеб при выпечке происходит в результате большого
комплекса процессов: физических, микробиологических, коллоидно-химических
и биохимических. Так, при выпечке температура внутри теста быстро повышает­
ся и жизнедеятельность дрожжей прекращается. Пузырьки углекислого газа при
нагревании расширяются и поднимают тесто.
При 60 °С начинается клейстеризация крахмала, а при 75 °С свертываются бел­
ки, придавая хлебному мякишу прочность. Крахмал, клейстеризуясь, поглощает
воду, отнимая ее от денатурированных белков. Клейстеризация крахмала происхо­
дит при недостатке в тесте воды, что придает мякишу сухую нелипкую структуру.
Внутри мякиша температура не поднимается выше 100 °С, но на его поверх­
ности достигает 140 °С и выше. При этой температуре белки наружной поверхно­
сти хлеба быстро затвердевают, образуя корку, и крахмал переходит в декстрины
(они обеспечивают корке глянец). Сахар, вступая в реакцию с азотистыми вещест­
вами (аминокислотами), образует темно-коричневые соединения, придающие пе­
ченому хлебу специфические окраску и вкус. Реакцией меланоидинообразования
обусловлено и потемнение мякиша.
Приятный вкус и аромат у свежеиспеченного хлеба связан с наличием диаце­
тила, ацетилметилкарбинола, фурфурола, оксиметилфурфурола, сложных эфиров
и альдегидов (валерианового, изовалерианового и др.).
Охлаждение и хранение хлеба. Выпеченный хлеб укладывают в лотки, кото­
рые помещают на вагонетки, при этом отбраковывают изделия с внешними де­
фектами. Вагонетки с хлебом поступают в экспедицию для охлаждения и реали­
зации.
..
ЦК о
; к
Совокупность физико-химических изменений хлеба при хранении называют
черствением. Первые признаки черствения появляются при обычных температурах
(15—25 °С) через 10-12 ч после выпечки. При дальнейшем хранении хлеба они уси­
ливаются. Утрату свежести (черствость хлеба) оценивают изменением физических
свойств мякиша и корки, а также ухудшением аромата и вкуса. Мякиш при черствении утрачивает эластичность, становится жестким, менее сжимающимся, более
крошащимся. Несвежий хлеб приобретает специфический неприятный запах и вкус
черствого (лежалого) хлеба. Главную роль в черствении отводят крахмалу. При на­
гревании крахмал вновь поглощает воду, происходит освежение черствого хлеба.
Черствение замедляют герметической упаковкой (в целлофан, полимерную
пленку), хранением на холоде (при температуре -10 °С и ниже), добавлением ряда
веществ-стабилизаторов (патоки, мальтозы, молочной кислоты, поверхностно-активных веществ и других), изменением режима выпечки (в герметически закры­
тых банках).
Сроки реализации после выпечки устанавливают в зависимости от вида изде­
лий, ч, не более: для ржаного и ржано-пшеничного хлеба из обойной муки и ржа­
ного обдирного — 36, пшеничного, ржано-пшеничного хлеба из сортовой муки,
ржаного сеяного — 24, мелкоштучных изделий — 16. По истечении этих сроков
хлеб считается черствым и не может быть реализован ни в торговле, ни в пред­
приятиях общественного питания. Упаковка хлеба в полиэтиленовый материал
продляет срок хранения до трех сут.
Биологическая активация дрожжей. Факторами, влияющими на рациональный
ход технологического процесса и качество продукции, являются исходная биотех­
нологическая активность дрожжей и способность их адаптироваться к анаэроб­
ным условиям жизнедеятельности в полуфабрикатах. От этих факторов зависят
бродильная активность дрожжей, углеводный и азотный обмен, образование фер­
ментов.
Прессованные и сушеные хлебопекарные дрожжи находятся в состоянии ана­
биоза, когда обмен веществ временно прекращается или настолько замедлен, что
отсутствуют видимые признаки проявления жизни.
Для активации дрожжей применяют биологическую стимуляцию метаболиз­
ма в питательных смесях и стимуляцию с помощью химических, физических,
магнитных, термических и других способов. Наиболее эффективным приемом
является биологическая стимуляция метаболизма дрожжей с использованием
жидких питательных смесей, содержащих органические вещества, в частности
углеводы, органические кислоты, витамины и минеральные соли. В результате
диссимиляции питательных веществ, происходит освобождение энергии, и обра­
зуются химически активные метаболиты, которые используются в жизнедеятель­
ности дрожжей.
Для обогащения жидких питательных смесей используют продукты перера­
ботки мукомольной, молочной, мясной, хлебопекарной и консервной отраслей
промышленности, а также нетрадиционное сыре — ферментативные гидролиза­
ты, плодовоовощные порошки, концентрат квасного сусла, соевую муку и другие,
являющиеся источниками питательных и биологически активных веществ.
Биологическая активация прессованных дрожжей. Использование высокоосахаренных ферментативных гидролизатов позволяет значительно обогатить со­
став питательной смеси. Для получения гидролизатов применяют спиртоосажден­
ные ферментные препараты разжижающего действия («Амилосубтилин ГЮх»)
и осахаривающего действия («Глюкаваморин ГЮх», «Глюкоделеморин П10х»).
Ферментативный гидролизат получают путем смешивания муки (пшеничной,
кукурузной или картофельной — крахмала) и воды в соотношении 1 : 1,5 при
температуре 40-50 °С с последующей клейстеризацией крахмала и его разжиже­
нием. Для разжижения крахмала в смесь вводят термостабильную бактериальную
а-амилазу (0,001-0,0013 % к массе муки в тесте) и нагревают до 85-90 °С при пе­
ремешивании. Клейстеризованный крахмал муки осахаривают глюкоамилазными
ферментными препаратами, для чего в смесь вносят 0,001-0,002 % глюкоамилазы
и выдерживают в течение 10-12 ч.
Наиболее эффективна активация при следующем расходе ингредиентов, %
к массе муки в тесте: дрожжи — 0,5-1,0, мука — 0,5, высокоосахаренный фер­
ментативный гидролизат — 2,5. При таких пропорциях ингредиентов для акти­
вации дрожжей интенсифицируется процесс приготовления теста и сокращается
цикл его созревания на 25 %, качество хлебобулочных изделий улучшается.
Для активации прессованных дрожжей, помимо ферментативных гидролиза­
тов, используют также плодовоовощные порошки и нетрадиционное раститель­
ное сырье. Преимущество использования плодовоовощных порошков перед фер­
ментными гидролизатами заключается в том, что исключается стадия гидролиза
высокомолекулярных органических соединений, поскольку порошки содержат
около 80 % легко экстрагируемых водой биологически активных веществ (глюко­
зу, фруктозу, микроэлементы и др.).
Яблочный порошок, полученный из выжимок, содержит: 40-70 % сахара
в виде фруктозы и глюкозы (в соотношении 1:1), 7-15 % пектина, 0,2-0,4 % на­
туральных органических кислот; 1,5-3 % минеральных веществ; от 1 до 40 мг%
витаминов (В|, В2, А, С, Р, Е, К и др.); аминокислоты и другие ценные вещества.
В производственных условиях биологическую активность прессованных
дрожжей и дрожжевого молока повышают путем выдержки их в питательной
смеси, содержащей порошок из яблочных выжимок и воду. Порошок в количе­
стве 0,35-0,375 % к массе муки в тесте заливают водой (8-10 %) температурой
34—35 °С и интенсивно перемешивают в течение 3-5 мин. В полученную смесь
вносят прессованные хлебопекарные дрожжи, размешивают до образования од­
нородной суспензии и выдерживают в течение 30-60 мин при 33-34 °С.
При использовании дрожжевого молока расход порошка и воды составляет
соответственно 0,3-0,325 % и 6,5-7,0 % к массе муки в тесте, а продолжитель­
ность выдержки — 20-30 мин. Бродильная активность дрожжевых клеток возрас­
тает в 1,5-1,8 раза, уменьшается расход муки и улучшаются показатели качества
хлебобулочных изделий.
Кроме яблочных выжимок для активации дрожжей используют побочные про­
дукты производства гранатового сока в виде сухого порошка, его экстракта или
суспензии с водой в соотношении (1 :10)—(1 : 8) при дозировке порошка 0,1-2,0 %
от массы муки в тесте. Продолжительность выдержки составляет 40-60 мин при
30-32 °С. Эффект активации дрожжей выражается в интенсификации биохими­
ческих и микробиологических процессов, в улучшении качества хлеба по физико­
химическим показателям: объему, пористости и общей деформации мякиша.
При изготовлении хлеба из смеси ржаной и пшеничной муки может быть
использован свекольный порошок. Прессованные дрожжи в количестве 0,3 кг
и 4,5 кг сахаросодержащего свекловичного порошка смешивают с 13,5 л воды
и выдерживают в течение 30-60 мин при температуре 33 °С для частичной инвер­
сии сахарозы и активации дрожжей. Полученную суспензию с активированными
дрожжами (18,3 кг) смешивают с 30 кг ржаной обдирной муки, 50 кг пшеничной
муки второго сорта, 33,5 кг сухой закваски, 1,5 кг соли и 47,5 кг воды. Тесто сбра­
живается в течение 90 мин.
Для активации дрожжей применяются также экстракты некоторого расти­
тельного сырья, например листьев крапивы. Для приготовления этого экстракта
листья крапивы смешивают с водой или молочной сывороткой в соотношении (1 :
20)—(1 : 25) при 20—40 °С. Полученную смесь выдерживают 60-120 мин и подвер­
гают центрифугированию в течение 5-10 мин при частоте вращения 50-83,3 с-1.
Полученный экстракт является богатым носителем ряда минеральных веществ
(К, Са, Ре, Иа, М§, 2п, Мп), витаминов (С, К, В), каротина, аминного азота, са­
харов и других ингредиентов, необходимых для жизнедеятельности дрожжевых
клеток и молочнокислых бактерий.
Экстракт крапивы применяют для активации прессованных дрожжей в дози­
ровке 6-7,5 % к массе муки в тесте. Дрожжи в количестве 2,5 кг смешивают с 6 7,5 кг экстракта, смесь выдерживают в течение 40-50 мин при 30 °С и используют
для получения хлеба из пшеничной муки безопарным способом. На 100 кг муки
требуется 8,5-10 кг активированной смеси, поваренной соли и воды по рецептуре
изделия.
Еще один способ активации прессованных дрожжей — применение концен­
трата квасного сусла (ККС). ККС — это полуфабрикат, обогащенный сахарами
(мальтоза, глюкоза), аминным азотом, микроэлементами и витаминами. Этот ком­
понент питательной смеси ускоряет перестройку дрожжевых клеток с дыхатель­
ного на бродильный тип жизнедеятельности.
Для активации дрожжевых клеток рационально вносить в питательную смесь
0,02-0,025 % КН 2РО4 и 0,5 % ККС и выдерживать их в этой смеси в течение 45—
60 мин. Использование квасного концентрата для активации дрожжей улучшает
пористость мякиша на 15 %, увеличивает объем готовых изделий на 40 %, улуч­
шает аромат хлеба.
Биологическая активация сушеных дрожжей. Сушеные дрожжи по своему
физическому состоянию и биохимической активности значительно отличаются от
прессованных. Так, прессованные дрожжи — это биомасса дрожжевых грибов,
находящаяся в состоянии тургора, со значительным содержанием внутрикл