close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Регионарное применение мезенхимных стромальных клеток в геле гиалуроновой кислоты при компрессионной травме мягких тканей (экспериментальное исследование)

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
ШУЛЕПОВ
Александр Васильевич
РЕГИОНАРНОЕ ПРИМЕНЕНИЕ МЕЗЕНХИМНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ
КЛЕТОК В ГЕЛЕ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ ПРИ КОМПРЕССИОННОЙ
ТРАВМЕ МЯГКИХ ТКАНЕЙ
(экспериментальное исследование)
14.03.03 – патологическая физиология
14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Санкт-Петербург
2018
Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Синдром длительного сдавления остается
опасным для жизни осложнением компрессионной травмы [Gonzalez D., 2005]. В
условиях чрезвычайных ситуаций, производственных аварий и природных стихийных бедствий вероятность развития компрессионного синдрома у пострадавших с тяжелыми травмами превышает 40% [Reis N.D. et al. 2005]. Частота летальных исходов при этом может достигать 80−90%, что обусловливает необходимость дальнейшего изучения данной патологии [Кричевский А.Л., 1995; Гаркави
А.В., 2000]. При длительном сдавлении большой массы мягких тканей развиваются опасные для жизни постишемические патологические изменения, в основе которых лежит, обусловленный реперфузией, цитолиз, мембраногенный отёк, выброс в кровоток токсических продуктов [Кипиани В.А., 2003; Шугаева К.Я. и соавт., 2012]. Оказание медицинской помощи пациентам с компрессионными повреждениями мягких тканей основывается на проведении комплекса мероприятий,
направленных на детоксикацию организма, устранение метаболических расстройств и восстановление трофики тканей [Самохвалов И.М. и соавт., 2004; Godier A. et al., 2013]. Тем не менее, высокая частота осложнений, неудовлетворительных анатомических и особенно функциональных результатов ставит в центр внимания вопросы кардинального совершенствования способов раннего лечения поврежденных механическим сдавлением мягких тканей [Рудаев В.И. и соавт., 1999].
Для снижения тяжести реперфузионных последствий компрессионной травмы
предложены различные патогенетические подходы, улучшающие кровообращение, нормализующие микроциркуляцию и метаболизм поврежденных тканей [Баянов В.В., 1999; Шевцов А.Р., 2008; Османова А.А., 2010]. Перспективным направлением саногенеза компрессионных травм представляется регионарная активация
клеточных систем репарации, позволяющих снизить степень постишемического
разрушения мягких тканей, обеспечить ускоренное восстановление кровотока в
зоне компрессии, а также функции скелетных мышц [Гаин Ю.М. и соавт., 2010].
Одним из вариантов решения проблемы реконструкции поврежденной ткани может оказаться пересадка в места анатомических дефектов биомедицинских препаратов на основе клеточных технологий, компенсаторно опосредующих восстановительные процессы [Winkler T. et al., 2012; Roth P. et al., 2012].
Степень разработанности темы исследования. Исследования последних лет
показывают, что перспективными кандидатами на роль клеток с высоким регенеративным потенциалом являются мультипотентные мезенхимные стромальные
клетки (ММСК) [Liang X. et al., 2014]. Трафик ММСК в место повреждения может
значительно усилить участие эндогенного пула стволовых клеток, обеспечить широкие дифференцировочные потенции, а также регенеративное микроокружение
за счет паракринной секреции биоактивных факторов [Домарацкая Е.И. и соавт.,
2015]. Современные биомедицинские технологии позволяют выделить ММСК из
различных тканей, в том числе жировой [Gronthos S. et. al., 2001; Zuk P.A. et. al.,
4
2002; Kern S. et al., 2006]. Для регенерации поврежденных скелетных мышц апробированы суспензии культивированных ММСК в изотоническом солевом растворе
[Nakabayashi A. et al., 2013]. Однако прогресс тканеинженерного направления биотехнологий связан с применением клеточных культур в составе носителей на основе биополимерных гелей [Шишацкая Е.И. и соавт., 2013; Калмыкова Н.В. и соавт., 2014]. Большинству требований, предъявляемых к клеточным носителям, соответствуют препараты низкомолекулярной гиалуроновой кислоты (ГК), широко
используемой в эстетической медицине в качестве биоревитализанта [Камелина
Л.И. и соавт., 2010; Хабаров В.Н., 2012]. Имеются ряд доказательств положительного регенеративного эффекта при локальном применении гидрогеля ГК, в том
числе совместно с культивированными ММСК [Хлусов И.А. и соавт., 2013; Jang
C.H. et al., 2008]. В тоже время закономерности формирования структурноклеточных преобразований в области обширной компрессии мягких тканей с позиций приспособительных механизмов компенсации в условиях регионарного введения геля низкомолекулярной ГК и ММСК в геле ГК остаются недостаточно изученными, что не позволяет оценить перспективы применения этого вида регенеративной терапии в практике обширных посттравматических повреждений мягких
тканей.
Цель исследования – оценить патогенетические механизмы повреждений
скелетных мышц при экспериментальной компрессионной травме мягких тканей и
обосновать возможность их коррекции регионарным применением в область сдавления культивированных мультипотентных мезенхимных стромальных клеток человека в геле низкомолекулярной гиалуроновой кислоты.
Задачи исследования
1. Провести моделирование тяжелой компрессионной травмы мягких тканей
на экспериментальных животных (крысы) и выявить основные проявления и механизмы формирования морфо-функциональных и структурно-метаболических
нарушений в области компрессии.
2. Оценить сократимость скелетных мышц поврежденной конечности у крыс
после введения в область сдавления геля гиалуроновой кислоты и препарата на ее
основе с мультипотентными мезенхимными стромальными клетками человека.
3. Определить состояние микроциркуляции, утилизации кислорода и метаболического статуса скелетных мышц области компрессии после регионарного
введения геля гиалуроновой кислоты и препарата на ее основе с мультипотентными мезенхимными стромальными клетками человека.
4. Изучить морфологические изменения, регенераторную активность и ангиогенез скелетных мышц области сдавления после регионарного введения геля
гиалуроновой кислоты и препарата на ее основе с мультипотентными мезенхимными стромальными клетками человека.
5. Выявить особенности влияния локальной внутримышечной пересадки геля гиалуроновой кислоты и мультипотентных мезенхимных стромальных клеток
5
человека в область компрессионного повреждения на миогенез и посттравматическую регенерацию мягких тканей.
Научная новизна исследования. Впервые в результате комплексных патофизиологических исследований обосновано регионарное применение геля ГК и
ММСК человека в геле ГК для коррекции постишемических повреждений скелетных мышц в ранний период тяжелой компрессионной травмы в рамках компенсаторного усиления восстановительных процессов при тяжелой компрессионной
травме мягких тканей. Установлено, что регионарная внутримышечная пересадка
в ранний посткомпрессионный период геля ГК и препарата на ее основе с ММСК
человека уменьшает выраженность морфо-функциональных и деструктивновоспалительных изменений травмированных тканей, предупреждает развитие вторичного некроза мягких тканей, вызванного компрессионной ишемией, стимулирует восстановление микроциркуляции и регенеративный миогенез за счет пролиферативной активности Ki-67-экспрессирующих клеток и продукции ангиогенных
трофических факторов, повышает метаболическую активность в области регенерации. Выявлено, что указанные механизмы влияния ГК и ММСК лежат в основе
восстановления полноценной мышечной ткани и ее сократительной функции.
Впервые доказано, что низкомолекулярная ГК, используемая в биомедицинском
препарате в качестве клеточного носителя, при самостоятельном применении обладает регенеративным потенциалом, реализующимся по механизму активации
ангиогенеза, пролиферации и метаболических процессов в области компрессионного повреждения, что обусловливает сохранность миоцитов.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследования
расширяют знания о саногенезе при тяжелой компрессионной травме мягких тканей в результате регионарного применения геля низкомолекулярной ГК и культивированных ММСК в геле ГК в раннем периоде тяжелой компрессионной травмы
мягких тканей с учетом стадийности посттравматического регенераторного процесса мышечной ткани. Данные об эффективности геля ГК и препарата на ее основе с культивированными ММСК человека позволяют оптимизировать методические подходы к разработке схем применения продуктов клеточных биотехнологий
в рамках прикладных аспектов применения современных программ по оказанию
специализированной медицинской помощи пострадавшим с компрессионной
травмой.
Методология и методы исследования. Методический подход, применяемый
в настоящей работе, базируется на представлениях об особенностях патогенеза
ишемического повреждения мышечной ткани при тяжелой экспериментальной
компрессионной травме, механизмах регенерации мышечной ткани, современных
знаниях о механизмах действия продуктов клеточных технологий и включает:
анализ данных научной литературы, построение научной гипотезы, разработку целевой установки и подбор методов исследования для решения поставленных задач,
6
сравнительно-сопоставительный анализ данных, полученных в ходе эксперимента
для формирования репрезентативных результатов и формулирования выводов, положений, выносимых на защиту, практических рекомендаций.
В работе использованы диагностические алгоритмы прижизненной и аутопсийной лабораторной и инструментальной диагностики. Материалом исследования служили данные, полученные в результате применения геля ГК и биомедицинского клеточного продукта на основе культивированных мультипотентных мезенхимных стромальных клеток в геле ГК для регенеративной терапии экспериментальных животных с компрессионной травмой тяжелой степени.
В работе соблюдены принципы доказательной медицины и использованы
современные высокотехнологичные методы исследования и обработки данных.
Основные научные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. При тяжелой компрессионной травме мягких тканей конечности регионарное введение в область сдавления геля гиалуроновой кислоты и препарата на ее
основе с культивированными ММСК человека снижает выраженность посттравматических изменений скелетных мышц;
2. Регионарная внутримышечная имплантация в область компрессии культивированных мезенхимных мультипотентных стромальных клеток человека в геле гиалуроновой кислоты при тяжелой экспериментальной компрессионной травме мягких тканей способствует ускоренному восстановлению сократительной активности скелетных мышц, формированию мышечно-соединительнотканного регенерата с высоким содержанием миогенных элементов;
3. В основе саногенеза тяжелого компрессионного повреждения мягких тканей при раннем регионарном введении в область сдавления культивированных мезенхимных мультипотентных стромальных клеток человека в геле гиалуроновой
кислоты лежит усиление пролиферативной активности клеточных компонентов
мышечной ткани, стимуляция ангиогенеза, нарастающее улучшение перфузионных и метаболических характеристик микроциркуляции, стабилизация структурного состояния миосимпласта;
4. Гиалуроновая кислота в условиях внутримышечной пересадки в область
посткомпрессионного повреждения мягких тканей включается в систему репарации поврежденных скелетных мышц, проявляя синергизм с регенераторными эффектами имплантированных культивированных мезенхимных мультипотентных
стромальных клеток.
Степень достоверности и апробация результатов исследования. Достоверность и обоснованность результатов исследования обеспечены достаточным количеством экспериментальных животных (n=464) и проведенных исследований с использованием актуальных показателей лабораторных, инструментальных и гистоморфологических методов исследования. Результаты исследования подтверждены
методами статистического анализа.
7
Основные результаты диссертационного исследования доложены на научнопрактической конференции «Актуальные проблемы медицинского обеспечения
войск (сил)» (Санкт-Петербург, 2014), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 60-летию кафедры военно-полевой терапии (СанктПетербург, 2015), Юбилейной Всеармейской научно-практической конференции
«Актуальные проблемы развития технических средств медицинской службы»
(Санкт-Петербург, 2015), III Международном медицинском форуме «Медицина
будущего – Арктике» (Архангельск, 2016), Юбилейной научно-практической конференции «Современные проблемы охраны здоровья военнослужащих» (СанктПетербург, 2016), Всероссийской конференции с международным участием
«StemCellBio-2016: фундаментальная наука как основа клеточных технологий»
(Санкт-Петербург, 2016), IХ Архангельской международной медицинской научной
конференции (Архангельск, 2016), III Национальном Конгрессе по регенеративной
медицине (Москва, 2017).
По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 4 – в журналах, включенных в перечень рецензируемых научных изданий, рекомендованных
Высшей аттестационной комиссией (ВАК РФ) для опубликования основных результатов диссертационных исследований на соискание ученой степени кандидата
наук.
Личный вклад автора в исследование. Автором лично проведено обоснование актуальности темы, планирование исследования, проведение экспериментов,
получение данных с использованием инструментального и лабораторного оборудования. Автор лично осуществлял учет, систематизацию и оценку полученных
данных, их статистическую обработку, анализ и обобщение.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 160 листах машинописного текста и состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Библиографический указатель
включает 260 источников литературы, в том числе 111 отечественных и 149 зарубежных авторов. В диссертации представлено 14 таблиц, 16 рисунков.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы исследования. Материалом исследования служили данные, полученные в результате экспериментов на половозрелых белых беспородных крысах-самцах, у которых моделировали компрессионную травму мягких тканей тяжелой степени, с последующим региональным введением в раннем посткомпрессионном периоде геля ГК и биомедицинского клеточного продукта на основе
культивированных ММСК человека в геле ГК.
Исследования выполнены на половозрелых белых беспородных крысах самцах, массой 300–340 гр, полученных из питомника РАМН Рапполово (Ленинградская область, Россия). Возраст крыс составлял 3,5–4 мес.
8
Эксперименты выполнены в ФГБУ «Государственный научноисследовательский испытательный институт военной медицины» МО РФ в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медикобиологических исследований с использованием животных» (1989), требованиями
локального комитета по этике.
Дизайн исследования. Дизайн исследования включал последовательные этапы (Рисунок 1):
1. Моделирование компрессионной травмы мягких тканей тяжелой степени;
2. Распределение животных по группам исследования;
3. Регионарное введение геля ГК и культивированных ММСК человека в геле ГК в область повреждения мягких тканей голени тазовой конечности экспериментальных животных;
4. Проведение функциональных и морфологических исследований в ходе
динамического наблюдения за животными через 7, 14, 28 сут после регионарного
введения геля ГК и культивированных ММСК человека в геле ГК.
Экспериментальные животные (крысы) (n = 464)
Моделирование компрессионной травмы мягких тканей тяжелой степени
Группа I
(ММСК в геле ГК)
(n=102)
Группа II
(гель ГК)
(n=100)
Контрольная группа
(0,9% р-р
натрия хлорида)
(n=175)
Группа
интактных животных
(n=87)
Регионарное введение препаратов в область повреждения мягких
тканей тазовой конечности
Лабораторные исследования в ходе динамического наблюдения за животными
через 7, 14, 28 сут после регионарного введения препаратов
Регистрация и анализ результатов, формулировка выводов и практических рекомендаций
Рисунок 1. Дизайн исследования по оценке эффективности регионарного применения геля
ГК и культивированных ММСК в геле ГК при тяжелой компрессионной травме мягких
тканей. n – количество экспериментальных животных в группе.
Сроки исследования обусловлены ранним, промежуточным и поздним этапами регенерации мышечной ткани [Одинцова И.А., 2004; Лебедева А.И., 2014].
В основу моделирования тяжелой компрессионной травмы мягких тканей
конечности положена экспериментальная модель [Кулагин В.К., 1978; Ефремов
А.В., 1992; Ардашева Е.И., 2002].
9
Перед проведением эксперимента животных наркотизировали внутримышечным введением смеси кетамина и ксилазина из расчета 60 мг/кг и 10 мг/кг массы тела [Shi M. et al., 2009]. Механической компрессии подвергалась правая тазовая конечность на уровне голени в течение 7 ч с силой давления 10−12 кг/см².
Воспроизводимость модели достигалась использованием металлических тисков и
измерением силы давления электронным измерительным устройством с датчиком
давления типа FSR и блоком преобразователя с цифровым регистратором. Для сохранения постоянной величины компрессии мышц голени через каждые 2 мин в
течение первых 20 мин механического воздействия тиски подвинчивали [Кулагин
В.К., 1978]. Левая тазовая конечность компрессии не подвергалась.
На этапе оценки летальности компрессионную травму моделировали у 41
животного с локальным введением 0,9% раствора натрия хлорида и 40 животном
без введения препарата.
Для выполнения задач основного этапа исследования животные после моделирования компрессионной травмы, были разделены на 3 группы: животным 1-й
основной группы применяли культивированные ММСК человека в геле низкомолекулярной ГК; животным 2-й основной группы применяли гель ГК без клеточного компонента; животным в контрольной группе применяли 0,9% раствор натрия
хлорида.
Гель ГК, ММСК в геле ГК, 0,9% раствор натрия хлорида вводили в область
компрессии веерным обкалыванием (инфильтрацией) стерильным одноразовым
шприцем через 3 ч после декомпрессии. Прокол мягких тканей голени осуществляли в 5−6 точках на глубину 0,5-0,8 см, нагнетая препараты в объеме до 0,1 мл в
одну точку прокола. Объем вводимых препаратов составлял в среднем 0,5 мл (1,5–
1,7 мл/кг веса животного), что соответствует объему препаратов, вводимых в камбаловидную мышцу крыс на моделях механических повреждений тазовой конечности [Shimazaki J. et al., 2012; Stratos I. et al., 2013].
ГК применяли в форме препарата «Гиалифт 3,5» (Aestetic Dermal S.L., Испания), предназначенного для использования в косметологической практике (регистрационное удостоверение на технологию «Мезотерапия в дерматокосметологии» № ФС-2006/057-04 от 27.04.2006). Форма выпуска: флакон 3,5% - 5 мл. Состав: не сшитая, не стабилизированная (не сетчатая) ГК, полученная биотехнологическим путем, гликозамингликан (мукополисахарид), состоящий из дисахаридных звеньев. Препарат «Гиалифт» представляет смесь высоко-, средне-, низкомолекулярных фрагментов ГК. Содержит преимущественно низкомолекулярную ГК
(до 30 кДа).
В качестве клеточного компонента использовали культивированные ММСК
жировой ткани человека. Биотехнологические работы выполнены в ООО «Покровский банк стволовых клеток». Биомедицинский клеточный продукт в составе
ММСК и клеточного носителя готовили в день использования. Для этого в исходный гелевый препарат «Гиалифт 3,5» вносили клеточную суспензию ММСК в
0,9% растворе натрия хлорида в соотношении 1:1. Концентрация геля ГК в био-
10
препарате составила 1,75%, что согласуется с данными [Riley G.P. et al., 1994;
Yamada T et al., 2007; Petrella R.J. et al., 2010]. Концентрация ММСК в 1 мл 1,75%
геля ГК составляла 3×106 клеток/мл. Конечная концентрация ММСК в геле ГК
объемом 1,5–1,7 мл/кг веса животного составляла 1,5-1,6×106 клеток, что соответствует данным ряда авторов [Winkler T. et al., 2008; Roth P. et al., 2012; Nakabayashi
A. et al., 2013].
Методы исследования. Оценку эффективности геля ГК и культивированных
ММСК человека в геле ГК проводили через 7, 14 и 28 сут после их регионарного
введения. Сроки исследования обусловлены ранним, промежуточным и поздним
этапами регенерации мышечной ткани [Одинцова И.А., 2005; Данилов Р.К. и соавт., 2011; Лебедева А.И., 2014]. В ходе динамического наблюдения использовали
лабораторные, инструментальные, гистоморфологический, иммуногистохимический и электронно-микроскопический методы исследования.
Содержание миоглобина в сыворотке крови (нг/мл) определяли экспресс методом с помощью набора реагентов (Myoglobin (STAT) Elecsys, cobase; Roche
Diagnostics, Германия).
Сократительную функцию мышечной ткани оценивали по показателям силы
одиночного мышечного сокращения и силы мышечного сокращения в режиме тетанус по результатам измерения изометрической силы напряжения мышцы, вызванной стимуляцией седалищного нерва [Natsu K. et al., 2004; Shi M. et al., 2009].
Функцию микроциркуляторного звена в области сдавления оценивали по показателям лазерной допплеровской флоуметрии, оптической тканевой оксиметрии,
пульсоксиметрии и лазерной флуоресцентной диагностики метаболизма.
Для выявления особенностей регенерационного гистогенеза мышечной ткани использовали световую и электронную микроскопию, иммуногистохимический
метод. Для светооптического исследования биоматериал окрашивали гематоксилин-эозином, по Маллори, Массону. Ультратонкие срезы исследовали в электронном микроскопе JEM-100 СХ в лаборатории электронной микроскопии Ботанического института им. В.Л. Комарова Российской академии наук. Иммуногистохимическим методом оценивали показатель VEGF (фактор роста эндотелия сосудов)
и Ki-67 (маркер клеточной пролиферации). Подготовку материала, его фиксацию и
окраску, оценку проводили по методике С.В. Петрова и соавт. [2012].
Для оценки полученных данных были использованы методы статистического описания [Славин М.Б., 1989; Леонов В.П. и соавт., 1997].
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Продолжительное (в течение 7 ч) сдавление мягких тканей тазовой конечности крыс с силой компрессии 10-12 кг/см2 приводило к гибели 33% животных, что
позволяет квалифицировать травму как тяжелую. Средняя продолжительность
жизни погибших животных составляла 7,31,5 сут. Локальное внутримышечное
введение в область сдавления 0,9% раствора натрия хлорида не сопровождалось
существенными отличиями летальности и продолжительности жизни погибших
11
животных. Тяжелая компрессионная травма мягких тканей конечности у крыс
вызывала развитие выраженного рабдомиолиза. Уровень миоглобина в крови в
12,2-8,2 раза (р < 0,05) был выше значений у нетравмированных животных. Регионарное введение изотонического солевого раствора в область повреждения
на уровень миоглобинемии значимого влияния не оказывало. Данная группа
экспериментальных животных может служить базисным контролем в процессе
оценки регенеративных эффектов препаратов при их локальном применении в
аналогичном объеме.
Анализ экспериментов показал однонаправленность структурнофункциональных и морфогенетических процессов с различной динамикой и
степенью их выраженности в зависимости от применяемых компонентов клеточного продукта (Таблица 1).
Таблица 1 – Эффекты ГК и ММСК в геле ГК (относительно 0,9% раствора натрия
хлорида) при регионарном введении в ранний посткомпрессионный период
Критерии эффективности
1
Макроскопическая характеристика
повреждённых скелетных мышц
Индекс силы одиночного мышечного
сокращения (%) поврежденных мышц
Индекс силы мышечного сокращения в
режиме тетанус (%)
Перфузионные характеристики
микроциркуляции мышц области
компрессии
Состояние кислородного снабжения
мышц области компрессии
Уровень окислительновосстановительного метаболизма
в зоне компрессионного повреждения
мягких тканей
Относительная площадь мышечных
волокон (%) в области повреждения
Относительная площадь межмышечных
пространств (%) в области
повреждения
Индекс стромально-мышечных
отношений (Kt, %) в области
повреждения
Исследуемый препарат
ГК
ГК+ММСК
(7/14/28 сут)
(7/14/28 сут)
2
3
р<0,05
4
↑/↑/↑
↑ / ↑↑ / ↑↑
-
↑/↑/↑
↑ / ↑↑ / ↑↑
-/+/+
↑/-/-
↑↑ / ↑↑ / ↑↑
+/+/+
ПМ: ↑ / - / σ:
↑/↑/Vr:
-/-/SО2, %
↓/↓/↓
Sm, усл.ед.
↓/↓/U, усл.ед.
↑/↑/АНАДН, усл.ед.
-/-/АФАД, усл.ед.
-/-/ФПК, усл.ед.
-/↑/↑
ПМ: ↑ / - / ↑↑
σ:
- / - / ↑↑
Vr: - / ↓↓ / ↓↓
SО2, %
↓ / ↓ / ↓↓
Sm, усл.ед.
↓ / ↓ / ↓↓
U, усл.ед.
↑ / ↑↑ / ↑↑
АНАДН, усл.ед.
- / ↑ / ↑↑
АФАД, усл. ед.
↓↓ / ↓↓ / ↓↓
ФПК, усл.ед.
↑↑ / ↑↑ / ↑↑
ПМ: - / - / +
σ: - / - / +
Vr: - / + / +
SО2, %
-/-/+
Sm, усл.ед.
-/-/+
U, усл.ед.
-/+/+
АНАДН, усл.ед.
-/-/+
АФАД, усл.ед.
+/+/+
ФПК, усл.ед.
+/+/+
↑/↑/↑
↑ / ↑↑ / ↑↑
-/+/+
-/↓/↓
↓ / ↓↓ / ↓↓
-/+/+
↓/↓/↓
↓ / ↓↓ / ↓↓
-/+/+
12
1
Светомикроскопическая и ультраструктурная характеристика скелетных мышц
области компрессионной травмы
Экспрессия VEGF-позитивных клеток
(в баллах) в скелетных мышцах области
компрессионного повреждения
Индекс Ki-67- позитивных ядер (Iki-67, %)
в скелетных мышцах области
компрессионного повреждения
2
Продолжение таблицы 1
3
4
↑/↑/↑
↑↑ / ↑↑ / ↑↑
-
-/↑/-
↑↑ / ↑↑ / ↑↑
-/+/+
↑/↑/↑
↑↑ / ↑↑ / ↑↑
+/+/+
Примечания: - /+ - отсутствие/наличие достоверных различий; ↑/↓ - статистически значимое
(р < 0,05) повышение/понижение выраженности показателя относительно значений в контрольной группе (после введения 0,9% раствора натрия хлорида); ↑↑/↓↓ - статистически значимое (р < 0,05) повышение/понижение выраженности показателя относительно значений в
группе после введения ГК без ММСК.
Клеточный препарат и его биополимерный компонент в виде геля ГК модифицировали макроскопическую картину посткомпрессионных нарушений в скелетных мышцах. Применение геля ГК способствовало уменьшению атрофии поврежденных мышц и диффузных рубцовых изменений к окончанию периода
наблюдения. Наибольшее снижение выраженности травматического отека,
уменьшение образования очагов некроза и обширных рубцовых изменений в мышечной ткани определялись при совместном локальном введении ММСК и геля
гиалуроновой кислоты.
Повышенная сохранность мышечной ткани после регионарного введения
геля ГК и ММСК в геле ГК подтверждалась результатами оценки сократительной
способности мышц. Продолжительная компрессия мягких тканей тазовой конечности крыс контрольной группы приводила в ранний посттравматический
период к снижению силы одиночного мышечного сокращения до 8,2% относительно силы сокращения мышц неповрежденной конечности. Введение в область повреждения геля ГК обеспечивало в ранний период после травмы повышение силы одиночного мышечного сокращения до 16% (р < 0,05). В последующие
сроки наблюдения (14-28 сут) индекс силы одиночного мышечного сокращения
при использовании геля ГК достигал 22–33%, что на 8,5–9,2% (р < 0,05) выше значений индекса силы в контрольной группе. У животных, которым в область сдавления вводили культивированные ММСК человека в геле ГК, индекс силы одиночного мышечного сокращения в промежуточный и поздний периоды после компрессии мягких тканей достигал 36,7–47,5%, что значимо (на 13-14%, р < 0,05)
выше, чем при использовании геля ГК без клеточной суспензии. В ранний посткомпрессионный период (первые 7 сут после травмы) повышение силы одиночного мышечного сокращения определялось главным образом эффектами ГК, что
подтверждает целесообразность использования клеточного носителя с миопротективным и регенеративным действием (Рисунок 2).
13
Регионарная внутримышечная пересадка ММСК в геле ГК способствовала
восстановлению сократительной функции травмированных мышц, оцениваемой по
ответу на групповые стимулы. Во все сроки посткомпрессионного периода индекс
силы мышечного сокращения в режиме тетанус достигал 44-67%, на 11-28% (р <
0,05) превышая средние результаты оценки силы мышечного сокращения у животных, которым в область повреждения вводили гель ГК без клеточного компонента.
0,9% раствор натрия хлорида
(контрольная группа)
Гель гиалуроновой
кислоты
Суспензия ММСК в геле гиалуроновой кислоты
60
50
%
40
30
20
10
0
7 сут
14 сут
Сроки исследования
28 сут
Рисунок 2. Индекс силы (%) одиночного сокращения скелетных мышц области компрессионного повреждения мягких тканей голени крыс при региональном введении геля гиалуроновой кислоты и препарата на его основе с ММСК человека
Состояние скелетных мышц в посткомпрессионный период характеризовалось существенным угнетением микроциркуляции в зоне сдавления. Имплантация
в область повреждения геля низкомолекулярной ГК позволяла уже в ранние сроки
после декомпрессии мягких тканей улучшить перфузионные характеристики микроциркуляции, положительно влиять на трофику и окислительный метаболизм поврежденных скелетных мышц. Степень снижения постоянной и переменной составляющей перфузии в микроциркуляторном русле травмированных животных
была менее выраженной и составляла 30-44% (р ≤ 0,05) от исходного уровня, на
24-37% (р ≤ 0,05) превышая показатель перфузии по сравнению с контрольной
группой животных, которым в ранний посттравматический период локально вводили изотонический солевой раствор (Рисунок 3).
0,9% раствор натрия хлорида
(контрольная группа)
Гель гиалуроновой
кислоты
Супензия ММСК в геле гиалуроновой кислоты
18
16
14
ПМ, пф.ед.
12
10
8
6
4
2
0
Исходно
7 сут
14 сут
Сроки исследования
28 сут
Рисунок 3. Показатель постоянной составляющей перфузии (ПМ, пф. ед.) скелетных мышц
области компрессионного повреждения мягких тканей голени крыс при региональном введении геля гиалуроновой кислоты и препарата на его основе с ММСК человека
14
Достоверно ниже контрольных значений (на 14%, р ≤ 0,05) отмечалось превышение уровня сатурации кислородом микрокровотока. Более выраженным по
отношению к контролю оказался сдвиг ослабления перфузионной сатурации (на
30%, р ≤ 0,05), отражающий усиление насыщенности кислородом тканей. Таким
образом, есть все основания полагать, что внутримышечное введение в зону компрессионного повреждения мягких тканей геля ГК в качестве клеточного носителя
позволяет одновременно улучшить in situ показатели микроциркуляции, кислородного обмена и окислительных процессов.
Изучение экспрессии молекулярно-биологического маркера, контролирующего ангиогенез, подтвердило данное положение. Введение в область компрессионной травмы геля ГК выявило усиление экспрессии VEGF-позитивных клеток по
сравнению с аналогичным показателем иммуногистохимической плотности в
группе животных, которым вводили изотонический раствор натрия хлорида. При
этом уровень экспрессии VEGF-позитивных клеток квалифицировался как умеренный (Рисунок 4).
0,9% раствор натрия хлорида
(контрольная группа)
Гель гиалуроновой
кислоты
Суспензия ММСК в геле гиалуроновой кислоты
6
5
Баллы
4
3
2
1
0
Исходно
7 сут
14 сут
Сроки исследования
28 сут
Рисунок 4. Экспрессия VEGF-позитивных клеток (баллы) в скелетных мышцах области компрессионного повреждения мягких тканей голени крыс при региональном введении геля гиалуроновой кислоты и препарата на его основе с ММСК человека
Следовательно, ГК, используемая в качестве клеточного носителя, обладает
умеренным проангиогенным действием и способна участвовать в регуляции неоангиогенеза.
Регионарная внутримышечная пересадка травмированным животным в зону
повреждения мягких тканей культивированных ММСК человека в геле ГК сопровождалась нарастающим восстановлением микроциркуляции, повышала эффективность кислородного обмена в ишемизированной мышечной ткани, препятствовала прогрессированию окислительных процессов в условиях реперфузии. К исходу 28 сут после окончания компрессии средние значения постоянной и переменной составляющей перфузии в поврежденной мышечной ткани на 24-32% (р ≤
15
0,05) были выше, чем у животных, которым вводили гель ГК без клеточного компонента (Рисунок 2). Перфузионные характеристики микроциркуляции коррелировали с изменением относительного объема фракции эритроцитов. Различия
между группами животных достигали 22% (р ≤ 0,05), свидетельствуя о достоверном вкладе ММСК в развитие восстановительных процессов в микроциркуляторном русле на уровне кровотока. Реакция системы микроциркуляции на пересадку
ММСК в геле ГК отчетливо проявлялась при анализе состояния кислородного
снабжения поврежденных тканей. Степень сатурации кислородом микрокровотока
в области повреждения мягких тканей при регионарной пересадке ММСК в геле
ГК была на 15% (р ≤ 0,05) ниже, чем при использовании одного клеточного носителя. Наиболее выраженные сдвиги также выявлялись при оценке перфузионной
сатурации кислорода в микрокровотоке, а также удельного потребления кислорода
тканью. Совокупным отражением наблюдаемых изменений явилась оценка флуоресцентного показателя потребления кислорода ферментов дыхательной цепи в
области компрессионной травмы, свидетельствующая о способности культивированных ММСК обеспечивать в составе геля ГК динамическое восстановление потребления кислорода поврежденными механическим сдавлением тканями.
В условиях регионарного введения ММСК в геле ГК во все периоды наблюдения отмечалась преимущественно высокая плотность VEGF-позитивных клеток.
Следовательно, локальная пересадка в зону компрессионного повреждения мягких
тканей ММСК в составе геля ГК позволяла достигать выраженной и продолжительной экспрессии VEGF–позитивных клеток по сравнению с травмированными
животными, которым в область повреждения вводили гель ГК без клеточного
компонента (Рисунок 4).
Установленные закономерности саногенеза тяжелой экспериментальной
компрессионной травмы после введения в поврежденные ткани геля ГК и ММСК
человека в геле ГК прослеживались на уровне морфофункциональных характеристик. Формирование мышечно-соединительнотканного регенерата области повреждения мягких тканей у травмированных животных сопровождалось преимущественным развитием соединительнотканного компонента с выраженной фибробластической реакцией и усиленным коллагенообразованием. Деструктивнодегенеративные процессы в мышечной ткани усугублялись развитием микрососудистых нарушений. Морфометрический анализ также позволил выявить структурные перестройки, свидетельствующие о массивной посттравматической дегенерации мышечной ткани с существенным увеличением доли межмышечных интерстициальных пространств и их замещением соединительной тканью.
При регионарной имплантации в поврежденные компрессией мягкие ткани
геля ГК наблюдалось уменьшение зон некроза, менее выраженная лейкоцитарная
инфильтрация. В толще мышц подвергшихся компрессии, преобладали мышечные
волокна сохранившие часть миофибриллярного аппарата, а также мышечные
волокна с частично поврежденной или неповрежденной базальной мембраной.
Интенсивность регенерации мышц, в основном, возрастала за счет сателлитно-
16
клеточной регенерации путем миобластной трансформации и последующей
дифференцировки миосателлитоцитов. В полной степени восстановлению
мышечных волокон препятствовали процессы активации фибробластического
дифферона, при которых увеличивалась выработка фибробластами фибриллярного
и аморфного компонента рыхлой соединительной ткани. Доля мышечного
компонента по сравнению с контрольной группой животных, которым вводили
локально изотонический солевой раствор, повышалась в пределах 12−18% (р <
0,05), оставаясь, однако, на уровне 64−68% (Рисунок 5).
0,9% раствор натрия хлорида
(контрольная группа)
Гель гиалуроновой кислоты
Суспензия ММСК в геле гиалуроновой кислоты
180
160
140
Kt, ед.
120
100
80
60
40
20
0
Исходно
7 сут
14 сут
Сроки исследования
28 сут
Рисунок 5. Индекс стромально-мышечных отношений (Kt, %) области компрессионного повреждения мягких тканей голени крыс при региональном введении геля гиалуроновой кислоты и препарата на его основе с ММСК человека
Результаты световой микроскопии подтверждались данными электронной
микроскопи. При регионарном использовании геля ГК сохранялись промежутки
между мышечными волокнами с отдельными пучками коллагеновых волокон. У
части мышечных волокон визуализировалась поперечная исчерченность, что
свидетельствовало о сохранении их целостности. Фрагментация мышечных
пучков была не выраженной. Отмечались миосателлитоциты без признаков
дистрофических изменений. Визуализировались сосуды как с капилляростазом,
так и свободным просветом. Фибробласты находилась в активном
функциональном состоянии. Встречались участки пролиферации фибробластов.
Выявленные морфологические изменения скелетных мышц при
экспериментальной компрессионной травме свидетельствуют о возможности
активации комплекса регенераторных процессов в модулях микроциркуляции и
посттравматического миогистогенеза имплантацией в поврежденные ткани геля
ГК.
Таким образом, ГК является достаточно активным стимулятором репаративных процессов в ракурсе фармакотерапии и может оказаться перспективным компонентом биомедицинских клеточных продуктов в локальной коррекции обширных травматических повреждений.
Имплантация в поврежденные ткани культивированных ММСК в геле ГК
отличалась наиболее выраженной динамикой восстановления морфофункциональ-
17
ной организации скелетных мышц, подвергнутых продолжительной механической
компрессии. Уже в ранний посттравматический период при использовании геля
ГК совместно ММСК воспалительный отек и признаки колликвационного некроза
в мышцах, подвергнутых сдавлению, были менее выраженными, чем у травмированных животных, которым вводили гель ГК без клеточного компонента. Количество некротизированных мышечных волокон было снижено, наблюдалась большая
сохранность миосимпласта. Плотность коллагеновых волокон в рыхлой соединительной ткани была значительно меньше. Морфологические изменения поврежденных мышц характеризовались активной дифференцировкой миогенных элементов. Отмечались обширные участки роста новых мышечных структур, отражающих пролиферативную фазу регенерационного гистогенеза. Одновременно
происходила трансформация мышечно-соединительнотканного регенерата с преобладанием мышечного компонента.
Отличительные особенности также установлены при оценке ультраструктурной организации поврежденных скелетных мышц. У животных, которым вводили в область повреждения суспензию культивированных ММСК в составе геля
ГК, ядра миосимпластов имели типичное строение кариоплазмы, располагались в
большинстве случаев вблизи сарколеммы, что приближает к нормальному строению мышечного волокна.
Следовательно, результаты морфологических исследований показывают, что
имплантация в поврежденные механической компрессией мягкие ткани культивированных ММСК человека в геле ГК обеспечивает уменьшение зоны перитравматических нарушений, способствует ускоренному восстановлению микроциркуляции и репаративной регенерации поврежденных мышечных волокон с активным
новообразованием мышечной ткани.
При регионарном введении геля ГК и ММСК в его составе выявлена однонаправленность экспрессии маркера пролиферации Ki-67 в поврежденных компрессией скелетных мышцах. Установлена более активная пролиферация клеточных структур в условиях локальной инфильтрации скелетных мышц гелем ГК без
клеточного компонента по сравнению с иммуногистохимической плотностью Ki67-позитивных ядер в скелетных мышцах животных, которым внутримышечно
изотонический солевой раствор. Во все сроки посткомпрессионного периода индекс Ki-67 пролиферации скелетных мышц в 1,6-1,9 раза (р ≤ 0,05) превышал контрольные значения и соответствовал умеренной степени экспрессии иммунопозитивных клеток. Наибольшая численность Ki-67-позитивных клеток была выявлена
в поврежденных скелетных мышцах животных, которым выполнялась регионарная пересадка в геле ГК культивированных ММСК. Индекс пролиферации Ki67-иммунопозитивных клеток в этом случае достигал 58-69%, в 2,1-2,2 раза (р <
0,05) превышая значения, установленные при введении геля ГК без клеток (Рисунок 6).
18
0,9% раствор натрия хлорида
(контрольная группа)
Гель гиалуроновой
кислоты
Суспензия ММСК в геле гиалуроновой кислоты
80
70
60
Iki-67, %
50
40
30
20
10
0
Исходно
7 сут
14 сут
Сроки исследования
28 сут
Рисунок 6. Индекс Ki-67- позитивных ядер (Iki-67, %) в скелетных мышцах области компрессионного повреждения мягких тканей голени крыс при региональном введении геля гиалуроновой кислоты и препарата на его основе с ММСК человека
Таким образом, тяжелая компрессионная травма скелетных мышц сопровождается развитием деструктивных изменений с развитием грануляционной ткани и последующим формированием мышечно-соединительнотканного регенерата
с выраженной фибробластической реакцией и усиленным коллагенообразованием.
Прямая пересадка в область компрессионного повреждения ММСК в составе геля
ГК способствовала уменьшению проницаемости сосудистой стенки и выраженности интерстициального отека, оказывала защитное и стимулирующее действие на
миосимпласт и активность клеток, формирующих лейкоцитарный вал вокруг зоны
некроза, регулируя состояние водного баланса межклеточного пространства в
мышечной ткани. Внутримышечное регионарное введение геля ГК на всех этапах
посткомпрессионных нарушений приводило к преимущественному снижению доли рыхлой волокнистой соединительной ткани без существенного увеличения
мышечного компонента мышечно-соединительнотканного регенерата. При регионарном применении гелевой формы ГК, содержащей ММСК, в области компрессии формируется мышечно-соединительнотканный регенерат с преобладанием
мышечной ткани и снижением избыточного синтеза коллагена, что свидетельствует о регенеративной эффективности ММСК в геле ГК. Стимулирующее влияние
ММСК в геле ГК на восстановление мышечной ткани после травмирующего воздействия формирует структурно-функциональную основу ремоделирования полноценного мышечно-соединительнотканного регенерата с преимущественным содержанием мышечного компонента.
В рассматриваемой нами ксеногенной системе клеточной трансплантации
механизмы саногенеза тяжелой компрессионной травмы могут быть обусловлены
как паракринными эффектами ММСК и биологически активными свойствами низкомолекулярной ГК, опосредующими восстановление микроциркуляции, уменьшение зон вторичного некроза, усиление гистогенеза скелетной мышечной ткани
(Рисунок 7).
19
ММСК
ГК
Стимуляция пролиферации миосателлитоцитов через Ki-76 и др. механизмы
Мобилизация резидентных
стволовых клеток в зону
повреждения
Активация ангиогенеза,
реваскуляризация.
Экспрессия VEGF и др. факторов
Поддержание гидробаланса
тканей
Стимуляция роста нервных окончаний.
Экспрессия нейротрофических факторов
(NGF--β, NT-3, -4 и др.)
Антифибротическое действие. Экспрессия MMP-2, -9 и др.
Цитопротективное действие
Антиоксидантная активность (захват Fe+2)
Активация клеточных рецепторов (CD44, RHAMM,
ICAM-1 и др.)
Стимуляция антиапоптоза. Экспрессия
IGF-1, HGF, IL-6 и др. факторов
Противовоспалительное и иммуномодулирующее действие
Снижение продукции
провоспалительных
факторов (IL-1, -2,
IFN-y, TNF- α, MCP-1,
TGF- β)
Стимуляция
посттравматического
миоангиогенеза
Ограничение
нейтрофильной реакции
Ограничение
миграции клеток
фибробластического
ряда
Усиление перфузионной
функции микроциркуляции
Усиление сократительной способности мышечной ткани
Рисунок
7. Саногенез
тяжелой
введении ММСК человека в геле ГК
Стимуляция дифференцировки макрофагов. Поляризация
М2-макрофагов
Ремоделирование
перинекротических зон
Формирование мышечносоединительнотканного регенерата с преобладанием миогенных элементов
компрессионной
травмы
при
регионарном
В целом, результаты проведенного исследования позволяют заключить, что
регионарная пересадка в область повреждения культивированных ММСК в геле
низкомолекулярной ГК может рассматриваться в качестве перспективного подхо-
20
да к созданию эффективной концентрации внутритканевых факторов роста и цитокинов, регулирующих выраженность воспалительной реакции, ангиогенез и репаративные процессы при массивной механической компрессии мягких тканей.
ВЫВОДЫ
1. Продолжительное (в течение 7 часов) сдавление мягких тканей тазовой
конечности у крыс в течение 28 сут посткомпрессионного периода сопровождается развитием тяжелых посткомпрессионных расстройств с летальностью 33%, повышением уровня миоглобина в крови (в 9-12 раз), снижением сократительной
способности поврежденных скелетных мышц в ответ на одиночные (на 92%) и последовательные (на 77%) стимулы.
2. В посткомпрессионный период ключевыми патологическими процессами
в мягких тканях являются ишемический некроз скелетных мышц с прогрессированием миодистрофического процесса, ухудшение микроциркуляции (синхронное
снижение перфузии, ослабление флакса тонусформирующих звеньев модуляции
микрокровотока), нарушение метаболического статуса тканей (уменьшение утилизации кислорода тканями и снижение интенсивности окислительновосстановительных процессов). Деструктивные изменения поврежденных скелетных мышц в дальнейшем приводят к развитию грануляционной ткани и формированию регенерата с усиленным коллагенообразованием при слабовыраженной позитивной динамике параметров микроциркуляции и метаболизма.
3. Внутримышечная имплантация низкомолекулярной гиалуроновой кислоты в область компрессионного повреждения мягких тканей обеспечивает умеренный прирост сократительной способности травмированных скелетных мышц в
ранний посткомпрессионный период (7 сут после декомпрессии): по сравнению с
результатами введения физиологического раствора индекс силы мышечного сокращения в ответ на одиночный и последовательный стимулы повышается на
8-10%, достигая 16-33%.
4. Саногенетический эффект гиалуроновой кислоты при регионарном применении в область компрессионного повреждения мягких тканей связан с активацией регенераторных процессов в модулях микроциркуляции, ангиогенеза и посттравматического миогистогенеза. Топическое введение геля гиалуроновой кислоты обеспечивает уменьшение зон перитравматических нарушений, повышение
плотности Ki-67 – экспрессирующих (в 1,6−1,9 раза) и VEGF-позитивных (в
1,3-1,8 раза) клеток скелетных мышц, нарастание постоянной (на 18−24%) и переменной (на 16−37%) составляющих перфузии, удельного потребления кислорода
тканями (в 1,6 раза), стабилизацию окислительно-восстановительных процессов в
течение раннего и промежуточного периодов после декомпрессии (7−14 сут).
5. Регионарная пересадка в область сдавления мягких тканей конечности
клеточного продукта с культивированными мезенхимными мультипотентными
стромальными клетками человека в геле гиалуроновой кислоты способствует бо-
21
лее выраженному и продолжительному, по сравнению с корригирующим эффектом гиалуроновой кислоты, восстановлению силы одиночных (на 14−15%) и последовательных (на 22−28%) мышечных сокращений, достигая 47−67% относительно сократительной способности скелетных мышц неповрежденной конечности.
6. Внутримышечное введение в область компрессии мезенхимных мультипотентных стромальных клеток человека в геле гиалуроновой кислоты характеризуется усиленным динамическим ростом перфузии (на 32%), флакса тонусформирующих звеньев модуляции микрокровотока (на 24%), удельного потребления
кислорода тканями (на 40-76%), активацией окислительно-восстановительных
процессов в поврежденной мышечной ткани в промежуточный и поздний периоды
декомпрессии (14-28 сут).
7. Регионарное применение ММСК человека в геле гиалуроновой кислоты
позволяет достичь выраженной и продолжительной экспрессии Ki-67– и VEGF–
позитивных клеток в поврежденных скелетных мышцах, количество которых в
1,7−2,2 раза превышает значения у травмированных животных, которым вводили
только клеточный носитель. Активация ангиогенеза, дифференцировки миогенных
элементов под влиянием клеточного препарата сопровождается образованием
мышечных структур области механического сдавления с преимущественным формированием мышечного компонента в составе мышечно-соединительнотканного
регенерата.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Для восстановительной терапии тяжелой компрессионной травмы мягких
тканей конечности показано регионарное применение геля ГК и культивированных ММСК человека в геле ГК в ранний посттравматический период (через 3 ч
после декомпрессии).
2. Результаты исследования могут быть использованы в рамках доклинических испытаний безопасности и эффективности биомедицинских клеточных продуктов и их компонентов на основе ММСК для стимуляции посттравматической
регенерации мягких тканей.
3. В качестве экспериментальных критериев морфофункционального состояния мягких тканей при тяжелой компрессионной травме конечности целесообразно использовать показатели, характеризующие сократимость скелетных мышц,
микроциркуляторные нарушения области повреждения, состояние регенерационного гистогенеза.
ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Результаты исследования дают основу для совершенствования методологии изучения механизмов саногенеза тяжелых посткомпрессионных поврежде-
22
ний мягких тканей с целью поиска перспективных средств репаративной регенерации, включая использование продуктов клеточных технологий.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1.
Венгерович, Н.Г. К вопросу о применении средств регенеративной терапии в
военной медицине / Н.Г. Венгерович, А.В. Шулепов, С.Г. Щипанов [и др.] // Актуальные проблемы медицинского обеспечения войск (сил) в повседневной деятельности и военное время: Материалы Всеармейской науч.-практ. конференции.
Санкт-Петербург (21 ноября 2014 г.) - СПб.: ВМедА, 2014. - С. 72-73.
2.
Шперлинг, И.А. Перспективные направления медицинской реабилитации
боевых повреждений на основе клеточных технологий / И.А. Шперлинг, Ю.В.
Юркевич, А.В. Шулепов [и др.] // XI Всероссийская научно-практическая конференция (25−26 ноября 2015 г.) «Боевой стресс, медико-психологическая реабилитация лиц опасных профессий». - М.: Изд-во «Граница», 2015. - С. 681-686.
3.
Чепур, С.В. Направления исследований в области применения клеточных технологий в военной медицине / С.В. Чепур, А.Б. Юдин, А.В. Шулепов
[и др.] // Военно-медицинский журнал. - 2015. - Т. 336, № 2. - С. 4-10.
4.
Венгерович, Н.Г. Обоснование использования тензометрии в комплексной
оценке регенерации мышечной ткани после компрессионной травмы / Н.Г. Венгерович, А.В. Шулепов, С.Г. Щипанов [и др.] // Актуальные проблемы развития технических средств медицинской службы. Материалы Юбилейной Всеармейской
научно-практической конференции (26 ноября 2015 г.) Санкт-Петербург. - Том 2. СПб.: Изд-во «СК-Вектор», 2015. - С. 274-276.
5.
Шперлинг, И.А. Перспективы применения клеточных продуктов в хирургии
повреждений / И.А. Шперлинг, Ю.В. Юркевич, А.В. Шулепов [и др.] // Материалы
Всероссийской научно-практической конференции с международным участием
«Система медицинского обеспечения в локальных войнах» в 2-х т. - Ростов-наДону (14-15 апреля 2016 г.) / ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России. - Ростовна-Дону: Издательство РостГМУ, 2016. - Т.1. - С. 157-159.
6.
Шулепов, А.В. Клеточные технологии в хирургии повреждений / А.В. Шулепов, И.А. Шперлинг, Ю.В. Юркевич [и др.] // Материалы III Международного
молодежного медицинского форума «Медицина будущего - Арктике», Архангельск (26-29 апреля 2016 г.) - Архангельск, 2016. - С. 68-69.
7.
Шулепов, А.В. Эффективность регионарного применения мезенхимных
стромальных клеток при экспериментальной компрессионной травме / А.В. Шулепов, Н.В. Шперлинг, Ю.В. Юркевич [и др.] // Материалы III Международного молодежного медицинского форума «Медицина будущего - Арктике», Архангельск
(26-29 апреля 2016 г.) - Архангельск, 2016. - С. 21-22.
8.
Шулепов, А.В. Микроциркуляция в тканях, подвергшихся компрессионной
травме, после регионарной пересадки клеточного трансплантата на основе мезен-
23
химных стромальных клеток (экспериментальное исследование) / А.В. Шулепов,
Ю.В. Юркевич, Н.В. Шперлинг [и др.] // Материалы Всероссийской конференции
с международным участием «StemCellBio-2016: Фундаментальная наука как основа клеточных технологий», Санкт-Петербург (9-11 ноября 2016 г.) - СПб., 2016. С. 164-165.
9.
Шперлинг, И.А. Прикладные аспекты применения клеточных продуктов в
клинической медицине / И.А. Шперлинг, Ю.В. Юркевич, А.В. Шулепов [и др.] //
Материалы Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 15летию образования научно-исследовательского центра Военно-медицинской академии имени С. М. Кирова, Санкт-Петербург (1 декабря 2016 г.) - СПб., 2016. - С.
12-16.
10. Шулепов, А.В. Состояние микроциркуляции при экспериментальной
компрессионной травме после имплантации в поврежденные ткани препарата на основе мезенхимных стромальных клеток человека / А.В. Шулепов,
Ю.В. Юркевич, И.А. Шперлинг [и др.] // Крымский журнал экспериментальной и клинической медицины. - 2016. - Т. 6, № 4. - С. 64-74.
11. Галака А.А. К вопросу об изучении морфологических особенностей регенерации скелетных мышц при минно-взрывной травме / А.А. Галака, Р.В. Титов,
А.В. Шулепов [и др.] // Военно-морская медицина: вчера, сегодня, завтра: Материалы научно-практической конференции, посвященной 300-летию 1-го Военноморского клинического госпиталя. Санкт-Петербург (14-15 июня 2017 г.) - СПб.,
2017. - С. 31-32.
12. Шперлинг, И.А. Регионарное применение мультипотентных мезенхимных стромальных клеток человека при тяжелой компрессионной травме в
эксперименте / И.А. Шперлинг, Ю.В. Юркевич, А.В. Шулепов [и др.] // Гены
и клетки. - 2017. - Т. 12, № 3. - С. 272-273.
13. Шулепов, А.В. Восстановление сократительной способности скелетных
мышц после компрессионной травмы мягких тканей в результате локальной имплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток / А.В. Шулепов, Н.В. Шперлинг, Ю.В. Юркевич [и др.] // Материалы научно-практической
конференции «Актуальные направления развития медицинских средств защиты от
экстремальных факторов». - Москва (22 ноября 2017 г.) - М., 2017. - С. 241-242.
14. Шулепов, А.В. Регенеративные эффекты регионарного применения мезенхимных стромальных клеток человека в геле ГК при экспериментальной
компрессионной травме мягких тканей / А.В. Шулепов, Н.В. Шперлинг, Ю.В.
Юркевич, И.А. Шперлинг // Медико-биологические и социальнопсихологические проблемы безопасности в чрезвычайных ситуациях. – 2018.
– № 1. – С.75–83.
24
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
АКТГ – аденокортикотропный гормон
ГК – гиалуроновая кислота
ДВС – диссеминированное внутрисосудистое свертывание
ИЛ – интерлейкин
ЛДФ – лазерная допплеровская флоуметрия
ЛФД – лазерная флуоресцентная диагностика
ММСК – мультипотентные мезенхимные стромальные клетки
НАД+ – накотинамидадениндинуклеотид окисленный
НАДН – накотинамидадениндинуклеотид восстановленный
ОПН – острая почечная недостаточность
ОТО – оптическая тканевая оксиметрия
ПМ – показатель микроциркуляции
Пф. ед. – перфузионная единица
СКК - скорость капиллярного кровотока
СКО – среднее колебание перфузии
ФАД+ – флавинадениндинуклеотид окисленный
ФАД – флавинадениндинуклеотид восстановленный
ФНО-α – фактор некроза опухоли альфа
ФПК - флуоресцентный показатель потребления кислорода
CD44 – основной рецептор ГК на клетках
ICAM-1 – молекула клеточной адгезии – 1
FGF – фактор роста фибробластов
HGF – фактор роста гепатоцитов
HIF – фактор, индуцируемый гипоксией
Ki-67 – фактор пролиферации клеток
Kv – коэффициент вариации микроциркуляции
PAI-1 – ингибитор активации плазминогена - 1
RHAMM – рецептор, опосредованной гиалуронатом подвижности
Sm – индекс перфузионной сатурации крови в микрокровотоке
SO2 – показатель сатурации крови в микроциркуляторном русле
SpO2 – показатель сатурации кислородом артериальной крови
TGF – трансформирующий фактор роста
U – индекс удельного потребления кислорода в ткани
VEGF – эндотелиальный сосудистый фактор роста
Vr – показатель относительного объема фракции эритроцитов
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа