close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Прямая конверсия лигноцеллюлозного сырья в биоэтанол с использованием базидиальных грибов

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Кожевникова Елена Юрьевна
ПРЯМАЯ КОНВЕРСИЯ ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНОГО СЫРЬЯ В
БИОЭТАНОЛ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАЗИДИАЛЬНЫХ ГРИБОВ
05.17.07 – Химическая технология топлива и высокоэнергетических веществ
03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата химических наук
Москва – 2018
Работа выполнена на кафедре физической и коллоидной химии федерального
государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования
«Российский государственный университет
нефти
и
газа
(национальный
исследовательский университет) имени И.М. Губкина»
Научный руководитель:
Винокуров
Владимир
Арнольдович,
доктор
химических наук, профессор, заведующий кафедрой
физической и коллоидной химии
Официальные оппоненты:
Лисичкин Георгий Васильевич, доктор химических
наук, профессор, профессор кафедры химии нефти и
органического
катализа
химического
факультета
ФГБОУ ВО «МГУ имени М.В. Ломоносова»
Володин
Владимир
Витальевич,
доктор
биологических наук, кандидат химических наук,
профессор, Врио Председателя Коми научного центра
УрО РАН, заведующий лабораторией биохимии и
биотехнологии Института биологии Коми НЦ ЦрО
РАН
Ведущая организация:
Акционерное
общество
«Всероссийский
научно-
исследовательский институт по переработке нефти»
Защита диссертации состоится «19» апреля 2018 г. в 1600 часов в ауд. 541 на
заседании диссертационного совета Д 212.200.04 в ФГБОУ ВО «РГУ нефти и газа (НИУ)
имени И.М. Губкина» по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., 65.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВО «РГУ нефти и
газа (НИУ) имени И. М. Губкина» и на сайте http://gubkin.ru/.
Автореферат разослан «__» февраля 2018 года.
Ученый секретарь
диссертационного совета Д 212.200.04
доктор химических наук
Е.С. Бобкова
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Приоритетным направлением в топливно-энергетической
отрасли является разработка и применение реформулированных автомобильных топлив с
использованием кислородсодержащих добавок неуглеводородного происхождения.
Одной из таких кислородосодержащих добавок является биоэтанол. Объём его мирового
производства достигает 86 млрд литров в год. В качестве основного сырья для
производства биоэтанола топливного назначения используется лигноцеллюлоза, так как
она является наиболее доступным и дешевым сырьем. Использование непищевых
продуктов в процессах производства биоэтанола имеет ряд других преимуществ, в том
числе, не оказывает влияние на продовольственный рынок. Кроме этого, использование
отходов
деревообрабатывающей,
сельскохозяйственной
и
других
отраслей
промышленности способствует решению экологической проблемы, заключающейся в
эффективной утилизации отходов. Одной из задач развития биоэнергетической отрасли
является поиск новых экологически безопасных способов конверсии лигноцеллюлозного
сырья с использованием биологических объектов, в том числе поиск новых
производственных микроорганизмов, перерабатывающих растительное сырье в целевые
продукты. В связи с этим, крупнейшие нефтяные компании мира – Exxon Mobil, British
Petroleum, Royal Dutch Shell, Chevron Corporation, Petrobras, Total активно инвестируют
средства в разработку технологий производства биотоплив (биоэтанол, биодизельное
топливо). Начиная с 2006 года суммарные инвестиции этих компаний составили более
7 млрд $. Главным недостатком всех существующих в настоящее время технологий
получения биоэтанола с использованием живых организмов является необходимость
обязательной предобработки лигноцеллюлозного сырья для удаления лигнина. Давно
известно, что базидиальные грибы являются природными деструкторами
лигноцеллюлозы, имеющими мощные ферментные системы (комплексы целлюлаз и
лигниназ), однако исследования данных грибов в качестве продуцентов этанола активно
проводятся только в последние несколько лет.
В связи с этим актуальным является поиск новых штаммов базидиальных грибов,
способных утилизировать лигноцеллюлозное сырье и продуцировать биоэтанол.
Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки Российской
Федерации: соглашения № 14.577.21.0070 от 05.06.2014 г., а также в рамках проектной
части Государственного задания в сфере научной деятельности по Заданию
№ 10.14.2014/K от 17.07.2014 г.
Цель и основные задачи работы. Цель работы – разработка основ одностадийной
технологии производства топливного биоэтанола из лигноцеллюлозного сырья без стадии
делигнификации с использованием базидиальных грибов.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
- поиск и выделение новых штаммов базидиальных грибов;
- скрининг штаммов по способности к продуцированию биоэтанола и оценке степени
ферментативной активности;
- выявление температурной зависимости ферментативной активности штаммов
базидиальных грибов;
3
- исследование динамики накопления этанола штаммами базидиальных грибов на
модельных субстратах;
- исследование влияния концентрации исходного субстрата и целевого продукта на
жизнеспособность штаммов базидиальных грибов;
- исследование возможности осахаривания лигноцеллюлозных субстратов при
твердофазном культивировании;
- исследование возможности прямой конверсии лигноцеллюлозных субстратов в
топливный биоэтанол;
- разработка технологической схемы прямой конверсии лигноцеллюлозного сырья в
компонент автомобильных бензинов – биоэтанол с использованием базидиальных
грибов.
Научная новизна работы.
1. Выделены новые штаммы базидиальных грибов, являющиеся продуцентами биоэтанола
(впервые получено значение выхода спирта 0,5 г этанола/1 г глюкозы по сравнению с
описанными в литературе штаммами) и имеющие высокую степень ферментативной
активности (полученные при оценке ферментативной активности чашечным методом
данные превосходят описанные в литературе).
2. Предложен способ оценки количества продуцируемого этанола на единицу биомассы,
позволяющий сравнивать штаммы с отличающимися выходом биомассы и количеством
продуцируемого спирта.
3. Установлена температурная зависимость целлюлазной и фенолоксидазной активностей
выделенных штаммов базидиальных грибов.
4. Показана возможность прямой конверсии лигноцеллюлозного сырья в топливный
биоэтанол с использованием базидиальных грибов, минуя стадии химической и
биологической предобработки.
5. Предложена принципиальная схема безотходного производства топливного биоэтанола
из лигноцеллюлозного сырья, предполагающая использование штамма базидиального
гриба Trametes versicolor It-1.
Теоретическая ценность работы. Выявлена высокая целлюлазная активность для
штаммов Trametes versicolor It-1, Trametes hirsuta MT-24.24 и Trametes hirsuta
MT-17.24, являющихся грибами белой гнили. Разработан комплексный подход к изучению
базидиальных грибов – перспективных продуцентов биоэтанола.
Практическая значимость работы. Разработана технологическая схема
производства биоэтанола из лигноцеллюлозного сырья с использованием штамма Trametes
versicolor It-1, позволяющая получать биоэтанол из лигноцеллюлозного сырья напрямую
без стадии предобработки исходного субстрата. Создана коллекция штаммов
базидиальных грибов, являющихся продуцентами биоэтанола и имеющих высокую
степень ферментативной активности. Показана возможность получения редуцирующих
сахаров при использовании штаммов базидиальных грибов в процессе осахаривания
лигноцеллюлозного сырья.
Апробация результатов исследований. Основные положения и результаты
работы доложены на четырех конференциях: «Химические аспекты возобновляемой
энергетики» (РФ, Москва, 22 октября 2014 г.), «III Международный микологический
4
форум – 2015» (РФ, Москва, 14-15 апреля 2015 г.), Международный молодежный научный
форум «Ломоносов-2015» (РФ, Москва, 13-17 апреля 2015 г.), «Химические аспекты
возобновляемой энергетики» (РФ, Москва, 21 сентября 2016 г.).
Личное участие автора в получении результатов. Все исследования, описанные
в данной диссертации, были проведены при непосредственном участии автора, за
исключением определения концентрации биоэтанола хроматографическим методом и
секвенирования штаммов базидиальных грибов. Личный вклад автора состоит в
постановке цели, задач, выделению штаммов базидиальных грибов и создании коллекции,
проведении скрининга штаммов на способность продуцировать биоэтанол, целлюлазы и
фенолоксидазы, проведении ряда экспериментов по исследованию динамики накопления
целевого продукта и убыли исходного субстрата, изучению влияния концентрации
исходного субстрата и целевого продукта на жизнеспособность штамма, исследованию
возможности прямой конверсии лигноцеллюлозного сырья в биоэтанол и разработке
технологической схемы производства биоэтанола с использованием базидиальных грибов.
Достоверность и обоснованность полученных результатов подтверждается
учетом всех основных влияющих на результаты исследования факторов, реальностью
данных при расчетах, использованием традиционных современных методов измерения.
Публикации. Основное содержание работы изложено в 7 публикациях, из них
3 статьи (3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ,
1 статья, индексируемая в базах данных Scopus и Web of Science), 2 тезисов докладов на
конференциях, 2 патента на изобретение.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 115 страницах
машинописного текста, состоит из введения, 5 глав, заключения, списка литературы.
Библиографический список состоит из 152 наименований. Диссертация содержит
20 таблиц и 29 рисунков.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении обоснована актуальность темы диссертационной работы,
сформулированы цель и основные задачи исследований, научная новизна и практическая
значимость полученных результатов.
В первой главе приведен обзор существующих технологий производства
этилового спирта из лигноцеллюлозного сырья, описан современный рынок биоэтанола, а
также представлено описание теоретических и экспериментальных работ, посвященных
исследованию возможности использования базидиальных грибов на различных стадиях
производства биоэтанола.
Выделяют четыре основные технологии производства этилового спирта: SHF
(separate hydrolysis and fermentation – разделенный гидролиз и ферментация), SSF
(simultaneous saccharification and fermentation – одновременное осахаривание и
ферментация), SSCF (одновременное осахаривание и со-ферментация) и CBP (consolidate
bioprocessing – консолидированная биопереработка). Все эти технологии основаны на
процессах ферментативного гидролиза целлюлозы и гемицеллюлоз до моносахаров и
сбраживания полученных гидролизатов, которые можно осуществлять, как
5
последовательно, так и одновременно. SHF-технология предполагает, что
ферментативный гидролиз и процессы брожения протекают в двух различных реакторах.
Для каждого из процессов подбираются оптимальные условия, в частности, pH и
температура. Однако накапливающиеся на стадии ферментативного гидролиза глюкоза и
целлобиоза ингибируют активность целлюлаз. SSF-технология предполагает проведение
ферментативного гидролиза и брожения в одном реакторе, таким образом, глюкоза,
являющаяся продуктом ферментативного гидролиза, сразу преобразуется в этанол.
Накопление этанола в среде позволяет избежать контаминации культуральной жидкости
патогенной микрофлорой. SSCF-технология осуществляется путем объединения
ферментативного гидролиза целлюлозы до глюкозы и совместного брожения пентоз и
гексоз в одном реакторе. Объединение процессов позволяет сократить число реакторов в
технологической схеме. CBP-технология заключается в использовании живых организмов
на всех стадиях производства биоэтанола из лигноцеллюлозного сырья, что приводит к
сокращению числа стадий процесса. CBP-технология является наиболее перспективной,
так как использование живых организмов на всех стадиях производства позволяет снизить
стоимость затрат, исключая необходимость использования дорогостоящего оборудования
и реагентов. Главным недостатком всех описываемых технологий является необходимость
проведения предобработки сырья, содержащего лигнин.
Базидиальные грибы являются природными деструкторами лигноцеллюлозы,
имеющими мощные ферментные системы. Кроме этого, существует ряд публикаций,
посвященных использованию базидиальных грибов в качестве перспективных
продуцентов биоэтанола, однако нет единой схемы, позволяющей использовать
базидиомицеты на всех этапах производства биоэтанола.
Анализ литературных данных позволил сформулировать основные направления
исследования и получить достоверные и воспроизводимые результаты в ходе
исследований базидиальных грибов как перспективных продуцентов биоэтанола.
Во второй главе описаны объекты исследования, в качестве которых были
выбраны коллекционные штаммы базидиальных грибов, выделенные самостоятельно из
природных объектов в лаборатории биотехнологии РГУ нефти и газа (НИУ) имени
И.М. Губкина или полученные из коллекции базидиальных грибов «Базидиальные грибы
съедобные и биотехнологически значимые» кафедры альгологии и микологии МГУ имени
М.В. Ломоносова; также описаны методы исследования, использованные в настоящей
работе.
Третья глава посвящена описанию исследования возможности продуцирования
биоэтанола базидиальными грибами на различных субстратах, оценке ферментативной
активности базидиальных грибов и исследованию жизнеспособности штаммов при
повышении концентрации исходного субстрата и целевого продукта. Так же приведены
эксперименты, результаты которых позволили определить некоторые аспекты
разрабатываемой технологической схемы для повышения ее технико-экономических
показателей.
На первом этапе был проведен скрининг 66 штаммов базидиальных грибов для
исследования способности продуцировать этанол, в результате которого было показано,
что 14 из них обладают способностью конвертировать в спирт более 5 %, а 4 из них – более
6
50 % исходного субстрата, в качестве которого была выбрана глюкоза. Характеристика
данных штаммов приведена в таблице 1. В процессе проведения эксперимента отмечено
отсутствие прироста биомассы в стационарных анаэробных условиях в погруженной
культуре.
Важной характеристикой исследуемых штаммов является возможность
конвертировать лигноцеллюлозное сырье до простых сахаров, то есть высокая степень
ферментативной активности. Для оценки возможности штаммов преобразовывать
целлюлозу, проведен скрининг по степени целлюлазной активности чашечным методом
на плотной питательной среде с использованием Na-КМЦ в качестве единственного
источника углерода. При росте колонии штамма, гриб потреблял Na-КМЦ, и при
последующей окраске среды раствором Люголя, появлялась зона просветления вокруг
колонии в том месте, где гриб выделил ферменты.
Таблица 1 - Конверсия глюкозы выделенными штаммами и места выделения
базидиальных грибов
Конверсия
Штамм
Места выделения
глюкозы,
%
T. versicolor IT-1
Италия, г. Рим, Палатинский холм
92,3
T. hirsuta MT-17.24
Владимирская область, Гусь-Хрустальный район
96,8
T. hirsuta MT-24.24
Владимирская область, Гусь-Хрустальный район
71,8
F. pinicola MT-5.21
Владимирская область, Гусь-Хрустальный район
57,3
F. fomentarius MT-4.05
Московская область, Наро-Фоминский район
42,7
S. commune MT-33.01 Владимирская область, Гусь-Хрустальный район
37,5
F. velutipes MT-3.03
Московская область, Наро-Фоминский район
37,3
F. fomentarius MT-4.23 Владимирская область, Гусь-Хрустальный район
36,6
F. fomentarius MT-5.14
Московская область, Наро-Фоминский район
28,2
F. pinicola MT-5.09
Московская область, Наро-Фоминский район
27,6
F. pinicola MT-5.37
Владимирская область, Гусь-Хрустальный район
12,0
G. lucidum MT-6.09
Краснодарский край
9,4
L. sulphureus MT-11.01
Московская область, Можайский район
6,0
P. ostreatus MT-17.01 Владимирская область, Гусь-Хрустальный район
6,0
Наибольшие площади зоны просветления наблюдались у штаммов F. velutipes
MT-3.01, F. velutipes MT-3.03, T. hirsuta MT-24.24, T. versicolor B-08/06, T. versicolor It-1.
Однако способ оценки ферментативной активности штаммов по абсолютным значениям
площадей зоны просветления не учитывает количество образовавшегося мицелия, в связи
с этим необходимо оценивать относительную целлюлазную активность т.е. исследовать,
какова ферментативная активность на единицу биомассы, в связи с этим был использован
коэффициент относительной целлюлазной активности. В исследованиях, проводимых
рядом авторов, в результате скрининга отбирали штаммы с коэффициентом целлюлазной
активности больше 1 [Jagtap S. S., Dhiman S. S., Kim T. S. et al. Ensymatic hydrolysis of aspen biomass into fermentable sugars by
using lignocellulases from Armillaria gemina // Bioresource technology. 2013. V. 133. P. 307–314].
Было установлено, что 21 штамм имеет коэффициент целлюлазной активности
больше 5. Значение коэффициентов для этих штаммов приведены в таблице 2.
7
Таблица 2 – Оценка целлюлазной активности штаммов базидиомицетов
Штамм
Оценка целлюлазной активности
Диаметр зоны
Диаметр
Коэффициент
просветления,
колонии, мм
целлюлазной
мм
активности, безразм.
F. pinicola MT-5.31
F.velutipes MT-3.03
S. commune MT-33.01
P. ignarius MT-14.23
F. pinicola MT-5.09
F.fomentarius MT-4.05
F. pinicola MT-5.21
F. velutipes MT-3.02
T. versicolor It-1
G. lucidum MT-6.05
F. pinicola MT-5.10
G. lucidum MT-6.09
F. fomentarius MT-4.23
P. betulinus MT-30.04
T. hirsuta MT-17.24
G. applanatum MT-6.21
F. fomentarius MT-4.01
T. hirsuta MT-24.24
L. necator MT-10.01
H. ulmarius MT-9.01
F. pinicola MT-5.41
21,7±1,5
47,0±1,7
40,5±1,0
17,0±1,0
23,3±0,6
29±1,0
14,3±0,6
28,3±0,6
33,0±1,7
24,0±1,0
20,3±0,6
28,3±1,5
23±1,0
22,3±1,2
23,0±1,0
21,3±0,6
22,0±1,0
32,0±1,0
20,3±0,6
19,7±0,6
20,3±0,6
4,7±0,6
10,3±1,2
9,0±0,6
4,3±0,6
6,7±1,2
8,5±0,6
4,3±0,6
8,7±1,2
10,0±1,0
7,3±0,6
6,3±0,6
9,0±1,0
7,3±0,6
7,3±0,6
8,3±0,6
8,0±1,0
8,3±0,6
12,3±0,6
8,0±1,0
8,0±1,0
8,3±0,6
20,8±2,9
20,0±3,4
19,2±0,5
14,7±2,6
11,5±2,1
10,6±1,0
10,2±1,9
10,1±2,8
10,0±1,3
9,9±2,4
9,5±2,1
9,0±1,2
9,1±0,4
8,4±1,3
6,6±0,6
6,3±1,6
6,0±0,5
5,7±0,3
5,6±1,4
5,2±1,2
5,0±1,0
Одним из компонентов лигноцеллюлозного сырья, наряду с целлюлозой, является
лигнин, структурной единицей которого является фенилпропан. Для оценки активности
ферментов базидиальных грибов, деструктирующих лигнин, проведен скрининг на
наличие фенолоксидазной активности с использованием галловой кислоты в качестве
модельного субстрата. Поскольку сравнение коэффициентов относительной
ферментативной активности оказалась неэффективным в данных исследованиях, так как
различия в значениях коэффициента на модельных средах для разных штаммов были
статистически незначимы (уровень значимости p<0,05) и варьировались в пределах
погрешности измерения, фенолоксидазная активность оценивалась по интенсивности
окраски реверса и скорости роста путем измерения диаметра колонии на пятые сутки
эксперимента. Результаты исследований приведены в таблице 3.
Наибольшую интенсивность окраски реверса имел штамм S. commune MT-33.01, а
наибольшую скорость роста и, соответственно, наибольший диаметр колонии (больше
50 мм на пятые сутки эксперимента) – три штамма: T. hirsuta MT-24.24, T. versicolor It-1,
S. commune MT-33.01.
8
Таблица 3 – Оценка фенолоксидазной активности штаммов базидиальных грибов
Штамм
Диаметр колонии, мм
Степень окраски реверса*
F.velutipes MT-3.01
-**
G.lucidum MT-6.01
40,5±2,5
++
G.lucidum MT-6.02
T. hirsuta MT-17.24
47,3±2,5
++
T. hirsuta MT-24.24
59,5±0,7
++
T. versicolor It-1
54,5±2,8
++
S. commune MT-33.01
71±1,4
+++
F. pinicola MT-5.21
* +++ - интенсивная окраска реверса; ++ - умеренная окраска реверса; + - слабая окраска реверса; 0 – реверс не окрашен; – - отсутствие роста
на исследуемой среде.
** в таблице приведена только часть штаммов, у которых отсутствует рост на исследуемой среде.
Исходя из результатов проведенного скрининга для дальнейших исследований
были отобраны следующие штаммы: F. fomentarius MT-5.21 как продуцент спирта и
целлюлаз, T. hirsuta MT-24.24, T. hirsuta MT-17.24, T. versicolor It-1 – как продуценты
спирта, целлюлаз и фенолоксидазы и S. commune MT-33.01 – наиболее активный
продуцент фенолоксидазы с высокой скоростью роста (14,2 ± 0,4 мм за сутки) на плотной
диагностической среде. Видовая принадлежность выбранных штаммов была
подтверждена генетически в ФГУП ГосНИИгенетика, Минобнауки России (БРЦ ВКПМ).
Учитывая тот факт, что для каждого организма, обладающего ферментативной
активностью, существуют свои температурные оптимумы, на втором этапе было
необходимо определить температурную зависимость ферментативной активности
отобранных штаммов.
В экспериментах по исследованию влияния температуры на целлюлазную
активность, проводимых на той же диагностической среде, на который был проведен
скрининг, определены температурные оптимумы синтеза целлюлаз для пяти
вышеуказанных штаммов. Результаты исследований представлены на рисунке 1.
Коэффициент целлюлазной
активности, безразм.
35
30
25
24
26
28
32
34
36
30
20
15
10
5
0
T. versicolor It-1
F. pinicola MT-5.21 T. hirsuta MT-17.24 T. hirsuta MT-24.24 S. commune MT33.01
Рисунок 1 – Изменение коэффициента целлюлазной активности при изменении
температуры культивирования
9
Установлено, что оптимальной температурой для наибольшей активности целлюлаз
на неоптимизированной среде для штаммов T. versicolor It-1, F. fomentarius MT-5.21 и
T. hirsuta MT-24.24 является температура 26 °С. При повышении температуры до 36°С
наблюдается снижение коэффициента целлюлазной активности, что может быть
обусловлено белковой природой ферментов и его частичной инактивацией при
повышении температуры. Оптимумом целлюлазной активности для штаммов T. hirsuta
MT-17.24 и S. commune MT-33.01 является температура 30 °С. Можно сделать вывод о том,
что температурный оптимум целлюлазной активности не является видоспецифичным для
базидиомицетов.
Исследование температурной зависимости фенолоксидазной активности показало,
что штамм MT-33.01 имеет наибольшую активность в более широком диапазоне
температур (26-36 °С) по сравнению с другими штаммами, штамм MT-24.24 менее активен
на всем исследуемом диапазоне температур (таблица 4).
Таблица 4 – Температурная зависимость фенолоксидазной активности штаммов
базидиальных грибов
Штаммы
Температура, °С
24
26
28
30
32
34
36
T. versicolor It-1
++
++
+++
+++
+++
+++
+++
T. hirsuta MT-24.24
++
++
++
++
++
++
++
T. hirsuta MT-17.24
++
++
+++
+++
+++
+++
+++
S. commune MT-33.01
++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
Концентрация биомассы,
г/л
На третьем этапе исследований была проведена серия экспериментов по изучению
динамики накопления биомассы отобранными штаммами.
При исследовании динамики накопления биомассы установлено, что максимальное
количество биомассы накапливалось штаммами T. hirsuta MT-24.24 и T. versicolor It-1 на
4 сутки, F. pinicola MT-5.21 и T. hirsuta MT-17.24 на 6 сутки,
S. commune MT-33.01 – на 7-е сутки (рисунок 2).
16
14
12
10
8
6
4
2
0
T. versicolor IT-1
T. hirsuta MT-24.24
F. pinicola MT-5.21
T. hirsuta MT-17.24
0
1
2
3
4
5
Время культивирования, сутки
6
7
Рисунок 2 – Динамика накопления биомассы штаммами базидиальных грибов
10
Время, в течение которого накапливалось максимальное количество биомассы,
было использовано в качестве стандартного времени культивирования штаммов, а
биомасса, накопленная в течение этого времени, считалась исходной концентрацией
биомассы для последующей работы с ней.
В результате изучения зависимости концентрации образуемого спирта от
исходной концентрации биомассы установлено, что не наблюдалось прямой
зависимости концентрации целевого продукта от выхода биомассы для разных штаммов.
Для сравнения эффективности штаммов проводили оценку количества целевого
продукта, образуемого единицей биомассы. Результаты представлены в таблице 5.
Таблица 5 – Сравнение штаммов по эффективности образования этанола
Штамм
Время культи- Биомасса в конце
Количество
вирования, сут
культивиропродуцируемого
вания, г/л
спирта
г/л
г/г
биомассы
F. pinicola MT-5.21
6
7,0±0,1
6,7±0,3
0,96±0,01
T.hirsuta MT-17.24
6
9,1±0,2
12,3±0,3
1,35±0,02
T. hirsuta MT-24.24
4
12,0±0,2
8,4±0,4
0,70±0,02
T. versicolor IT-1
4
5,1±0,1
10,8±0,3
2,12±0,02
Установлено, что T. versicolor продуцирует наибольшее количество спирта на
единицу биомассы (2,12 г/г), однако, учитывая неодинаковое время накопления биомассы
для этих штаммов, в дальнейших исследованиях по сбраживанию субстратов были
отобраны два штамма: T. hirsuta MT-24.24 и T.versicolor IT-1, время культивирования
которых составило четверо суток и позволило проводить последующие эксперименты с
ними параллельно.
На четвертом этапе исследований проведено исследование динамики накопления
целевого продукта (этанола) и убыли исходного субстрата, в качестве которого были
выбраны шестиатомные моносахариды глюкоза, фруктоза, галактоза, дисахарид
целлобиоза и пятиатомные моносахариды арабиноза и ксилоза. Выбор пяти последних
сахаров обусловлен их присутствием в гемицеллюлозах, входящих в состав
лигноцеллюлозного сырья. Показано, что образование спирта из глюкозы штаммом T.
versicolor IT-1 начиналось на первые сутки (5,1 г/л спирта при 44 % конверсии исходного
субстрата) и концентрация достигала максимального значения на 9 сутки (11,3 г/л при
97,4 % конверсии исходного субстрата). Для штамма T. hirsuta MT-24.24 наблюдалось
равномерное накопление спирта в течение всего времени эксперимента, максимальное
значение достигалось на 10 сутки – 11.0 г/л при конверсии исходного субстрата 93.2 %.
Результаты исследований представлены на рисунке 3. Следует отметить, что в
стационарных анаэробных условиях глюкоза потреблялась грибами незначительно и
практически вся расходовалась на образование этанола.
11
25
Динамика накопления спирта
Динамика убыли глюкозы
Динамика изменения концентрации биомассы
Динамика накопления спирта
Динамика убыли глюкозы
Динамика изменения концентрации биомассы
20
20
Концентрация, г/л
Концентрация, г/л
25
15
15
10
10
5
5
0
0
0
1
2
3
4
5 6
Сутки
7
8
9
0
10 11
1
2
3
4
5 6
Сутки
7
8
9
10 11
Рисунок 3 – Динамика изменения концентрации биоэтанола, глюкозы и биомассы при
культивировании штаммов T. versicolor IT-1 (слева) и T. hirsuta MT-24.24 (справа).
При сравнении динамики накопления целевого продукта с использованием в
качестве исходного субстрата фруктозы и галактозы отмечено 77 % и 80 % потребление
фруктозы штаммом T. hirsuta MT-24.24 уже на первые сутки анаэробной стадии
соответственно. Максимум концентрации спирта для данного штамма был достигнут на
8-е сутки и составил 3,4 г/л при культивировании на фруктозе и 0,5 г/л на 5-е сутки при
использовании в качестве исходного субстрата галактозы. Для штамма It-1 при
культивировании на фруктозе максимум биоэтанола составил 8,9 г/л к 10 суткам
культивирования, на галактозе максимум был достигнут также на 10 сутки и составил
1,7 г/л (рисунки 4 и 5).
25
Динамика накопления спирта
Динамика убыли сахаров
Динамика изменения концентрации биомассы
20
Концентрация, г/л
Концентрация, г/л
25
15
10
5
Динамика накопления спирта
Динамика убыли сахаров
Динамика изменения концентрации биомассы
20
15
10
5
0
0
0
1
2
3
4 5 6 7
Время, сутки
8
9
0
10 11
1
2
3
4 5 6 7
Время, сутки
8
9
10 11
Рисунок 4 – Динамика изменения концентрации биоэтанола, фруктозы и биомассы
при культивировании штаммов T. versicolor IT-1 (слева) и T. hirsuta MT-24.24 (справа).
12
Динамика накопления спирта
Динамика убыли сахаров
Динамика изменения концентрации биомассы
20
15
10
25
Концентрация, г/л
Концентрация, г/л
25
Динамика накопления спирта
Динамика убыли сахаров
Динамика изменения концентрации биомассы
20
15
10
5
5
0
0
0
1
2
3
4 5 6 7
Время, сутки
8
9
0
10 11
1
2
3
4
5 6 7
Время, сутки
8
9
10 11
Рисунок 5 – Динамика изменения концентрации биоэтанола, галактозы и биомассы при
культивировании штаммов T. versicolor IT-1 (слева) и T. hirsuta MT-24.24 (справа).
При использовании в качестве исходного субстрата целлобиозы установлено, что
максимальный выход целевого продукта (8,3 г/л, что составляет 77,6 % от теоретически
возможного) штаммом It-1 достигается на 7 сутки, штамм MT-24.24 имеет сходные
показатели конверсии целлобиозы с большим периодом брожения: 8,2 г/л на 10-е сутки
культивирования (рисунок 6).
Динамика накопления спирта
Динамика убыли сахаров
Динамика изменения концентрации биомассы
20
15
10
5
25
Концентрация, г/л
Концентрация, г/л
25
Динамика накопления спирта
Динамика убыли сахаров
Динамика изменения концентрации биомассы
20
15
10
5
0
0
0
1
2
3
4 5 6 7
Время, сутки
8
9
0
10 11
1
2
3
4 5 6 7
Время, сутки
8
9
10 11
Рисунок 6 – Динамика изменения концентрации биоэтанола, целлобиозы и биомассы при
культивировании штаммов T. versicolor IT-1 (слева) и T. hirsuta MT-24.24 (справа).
При использовании в качестве исходных субстратов арабинозы и ксилозы,
максимум концентрации этанола был достигнут к 7 и 10 суткам культивирования для
ксилозы и арабинозы соответственно и составил по 1,2 г/л для обоих субстратов (рисунки
7 и 8) при сбраживании штаммом MT-24.24. Для штамма It-1 наблюдалась сходная
картина. Максимум концентрации спирта был достигнут к 7 суткам культивирования и
составил 1,5 г/л и 1,7 г/л для арабинозы и ксилозы соответственно (рисунки 7 и 8).
.
13
Динамика накопления спирта
Динамика убыли сахаров
Динамика изменения концентрации биомассы
20
15
10
5
Динамика накопления спирта
Динамика убыли сахаров
Динамика изменения концентрации биомассы
25
Концентрация, г/л
Концентрация, г/л
25
20
15
10
5
0
0
0
1
2
3
4 5 6 7
Время, сутки
8
9
0
10 11
1
2
3
4 5 6 7
Время, сутки
8
9
10 11
Рисунок 7 – Динамика изменения концентрации биоэтанола, ксилозы и биомассы при
культивировании штаммов T. versicolor IT-1 (слева) и T. hirsuta MT-24.24 (справа).
Динамика накопления спирта
Динамика убыли сахаров
Динамика изменения концентрации биомассы
20
15
10
5
25
Концентрация, г/л
Концентрация, г/л
25
Динамика накопления спирта
Динамика убыли сахаров
Динамика изменения концентрации биомассы
20
15
10
5
0
0
0
1
2
3
4 5 6 7
Время, сутки
8
9
0
10 11
1
2
3
4 5 6 7
Время, сутки
8
9
10 11
Рисунок 8 – Динамика изменения концентрации биоэтанола, арабинозы и биомассы при
культивировании штаммов T. versicolor IT-1 (слева) и T. hirsuta MT-24.24 (справа).
На пятом этапе работы был выбран
штамм T. versicolor It-1, для которого была
Потребленная глюкоза
120
Этанол
исследована зависимость выхода этанола
от начального содержания глюкозы в
100
среде. Результаты представлены на рисунке 9.
80
Установлено, что при повышении начальной
60
концентрации глюкозы до 200 г/л содержание
спирта в среде при сбраживании возрастало
40
до 33.4 г/л, однако при этом степень
20
конверсии исходного субстрата снижалась до
45 %. Биомасса, определенная после
0
20
60
100
160
200
окончания сбраживания, изменялась в
Исходная концентрация глюкозы, г/л
пределах от 3,5 до 3,9 г/л, независимо от
исходной концентрации глюкозы. Отмечено
Рисунок 9 – Зависимость
потребления глюкозы и синтеза
повышенное содержание экзополисахаридов
этанола штаммом T. versicolor IT-1
в колбах с концентрацией глюкозы более
от начального содержания глюкозы
100 г/л.
Сравнение двух исследуемых штаммов (T. versicolor It-1 и T. hirsuta
MT-24.24) с известными базидиомицетами, способными продуцировать этанол, показало,
что T. hirsuta MT-24.24 и T. versicolor IT-1 продуцируют этанол на сравнимом с другими
Концентрация, г/л
140
14
штаммами грибов уровне из расчета на грамм потребленного субстрата (таблица 6). Выход
этанола на единицу исходного субстрата при сбраживании глюкозы штаммом T. versicolor
It-1 составил 0,5 г/г, что превосходит описанные в литературе данные по базидиомицетам,
продуцирующим спирт.
Таблица 6 – Сравнение количества синтезируемого базидиальными грибами этанола при
культивировании на глюкозе
Штамм
Исходная
Выход этанола, г/г
Источник*
концентрация
глюкозы
глюкозы, г/л
F.velutipesFv-1
150
0.34
[1]
T.versicolorKT9427
20
0,46
[2]
P.cinerea
20
0,41
[3]
T.suaveolens
20
0,39
»
F.velutipes Fv-1
10
0,45
[4]
F.velutipes Fv-1
50
0,45
»
T.hirsuta
20
0,49
[5]
T.hirsutaMT-24.24
23.0
0,47
Настоящая
работа
T. versicolor IT-1
22.6
0,50
»
T. versicolor IT-1
200
0,23
»
* [1] Maehara T., Ichinose H., Furukawa T., Ogasawara W., Takabatake K., Kaneko S. Ethanol production from high cellulose concentration by the
basidiomycete fungus Flammulina velutipes // Fungal Biol. 2013. V. 117. № 3. P. 220-226; [2] Okamoto K., Uchii A., Yanase H., Yanase H.
Bioconversion of xylose, hexoses and biomass to ethanol by a new isolate of the white rot basidiomycete Trametes versicolor //SpringerPlus. 2014.
V. 3:121; [3] Okamoto K., Imashiro K., Akizawa Y., Onimura A., Yoneda M., Nitta Y., et al. Production of ethanol by the white-rot basidiomycetes
Peniophora cinerea and Trametes suaveolens // Biotech. Lett. 2010. V. 32. № 7. P. 909–913; [4] Mizuno R., Ichinose H., Maehara T., Takabatake K.,
Kaneko S. Properties of Ethanol Fermentation by Flammulina velutipes // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2009.V. 73.№ 10. P. 2240-2245; [5] Okamoto
K., Nitta Y., Maekawa N., Yanase H. Direct ethanol production from starch, wheat bran and rice straw by the white rot fungus Trametes hirsuta //
Enzyme Microb Technol. 2011. V. 48. № 3.P. 273–277.
Учитывая
важность
проведения
стерилизации
лигноцеллюлозных
6
субстратов при их конверсии в
4
биоэтанол базидиальными грибами,
на шестом этапе было проведено
2
исследование влияния концентрации
0
пероксида водорода как наиболее
0
0,5
1
1,5
Количество пероксида водорода, % масс. доступного реагента для подавления
роста
и
развития
патогенной
Рисунок 10 – Влияние концентрации
микрофлоры на жизнеспособность
пероксида водорода на выход биомассы
штаммов базидиальных грибов. В
базидиальных грибов
результате
эксперимента
установлено, что пероксид водорода подавляет рост исследуемого штамма при
концентрации выше 1,5% (рисунок 10, приведены результаты для концентраций пероксида
водорода до 1,5%, при повышении концентрации пероксида водорода отмечается не
только подавление роста биомассы, но и ее полный лизис). Отмечено достоверное
Концентрация
биомассы, г/л
8
15
повышение концентрации биомассы при концентрации пероксида водорода 1%, это может
быть связано с необходимостью повышенной продукции пероксидаз для утилизации
пероксида водорода. Таким образом, концентрация пероксида водорода при стерилизации
субстратов не должна превышать 1%.
Для
повышения
технико-экономических
показателей
разрабатываемой
принципиальной технологической схемы было предложено исследование возможности
многократного использования биомассы для продуцирования биоэтанола. Показано, что
концентрация биомассы изменяется в пределах погрешности измерения в течение трех
циклов сбраживания, обеспечивая стабильный выход этанола 9,6-9,9 г/л (выход по
субстрату 94-97%). Использование погруженной культуры в последующих циклах
приводит к частичному лизису биомассы и накоплению полисахаридов в культуральной
жидкости (рисунок 11).
Концентрация, г/л
12
биомасса
этанол
10
8
6
4
2
0
0
1
2
3
Номер цикла
4
5
Рисунок 11 – Исследование возможности многократного использования биомассы
штамма T. versicolor It-1 для производства биоэтанола
Количество сахаров, г/1000
г субстрата
Четвертая глава посвящена исследованию конверсии лигноцеллюлозного сырья в
промежуточные и целевые продукты напрямую и посредством различных способов
предобработки субстратов с использованием штамма T. versicolor IT-1.
Первый
вариант
исследований
60
заключался
в
твердофазном
50
культивировании
штамма
It-1
на
40
измельченной соломе с размером частиц
5-10 мм (то есть, в проведении осахаривания
30
субстрата). Результаты эксперимента по
20
изучению динамики накопления сахаров
10
представлены на рисунке 12. Установлено,
0
что
исследуемый
штамм
способен
0
1
2
3
4
5
6
7
эффективно осахаривать измельченную
Время, сутки
солому, достигая максимального количества
Рисунок 12 – Динамика
сахаров (48,4 г сахаров из 1000 г субстрата)
накопления сахаров штаммом
на
2-е
сутки.
Последующее
снижение
T. versicolor It-1
количества образующихся сахаров связано с
их потреблением грибом и расходованием на рост и развитие мицелия гриба.
Для оценки эффективности осахаривания лигноцеллюлозных субстратов с
16
использованием базидиальных грибов проведен теоретический расчет выхода биоэтанола
из образовавшихся сахаров согласно уравнению реакции:
С6Н12О6
сбраживание
2С2Н5ОН + 2СО2
Расчет показал, что из 1000 г измельченной соломы теоретически возможно получить
23,9 г биоэтанола. При проведении эксперимента по конверсии предобработанной в
течение двух суток соломы было показано, что выход этанола составил 12 г из 1000 г
соломы, то есть 50% от теоретически возможного.
Второй вариант исследований заключался в исследовании возможности прямой
конверсии модельных субстратов,
в качестве которых были выбраны
Na-КМЦ, МКЦ, измельченная солома ржи (размер частиц 5-10 мм), хвойные опилки
(размер частиц 10-15 мм), опилки (размер частиц 1-2 мм) в концентрациях 20, 20, 30 и 30
г/л соответственно. Результаты показали, что данный штамм наиболее эффективно
конвертировал в этанол натриевую соль КМЦ, концентрация этанола при этом достигала
2,1 г/л за 7 суток. По-видимому, КМЦ обладала большей биодоступностью по сравнению
с другими субстратами. При конверсии микрокристаллической целлюлозы и
измельченной соломы были достигнуты концентрации спирта 1,6 г/л и 1,7 г/л
соответственно. При пересчете исходного количества субстратов на 1000 г, концентрации
образующегося спирта соответствовали значениям 105, 80 и 56,7 г/л. При исследовании
конверсии опилок с размером частиц 10-15 мм, концентрация этанола была меньше
предела измерения, при уменьшении размера частиц до 1-2 мм, концентрация спирта
составила 0,97±0,01 г/л. При пересчете на 1000 г субстрата количество спирта составило
32,3 г. Таким образом, прямая конверсия лигноцеллюлозного сырья в биоэтанол имеет
преимущества перед последовательным осахариванием и сбраживанием субстратов.
Пятая глава посвящена оптимизации состава питательной среды для штамма
It-1. Описаны основные этапы оптимизации среды методом математического
планирования. Подобранная среда имеет следующий состав: соевая мука - 7,8 г/л, соевое
масло - 41,2 мл/л, MgSO4*7Н2O - 0,25 г/л, KH2PO4 - 2,5 г/л и обеспечивает стабильность
периодического процесса культивирования штамма It-1, что выражается в
морфологической однородности погруженного мицелия, которая отсутствовала при
использовании исходных сред, а также в воспроизводимости выходов биомассы и
варьировании ее концентрации при культивировании на оптимизированной среде в
пределах 38,5-39,7 г/л на 4-е сутки культивирования.
В шестой главе на основании результатов, полученных при проведении исследований по
выявлению штаммов, обладающих ферментативной (целлюлазной и лигниназной)
активностью и способных к прямой конверсии лигноцеллюлозы в этанол, предложена
принципиальная технологическая схема производства биоэтанола из лигноцеллюлозного
сырья без стадии делигнификации (рисунок 13).
17
Сырье, в качестве которого могут быть использованы солома, либо опилки,
поступает в блок подготовки сырья. В блоке подготовки осуществляется измельчение
сырья: для опилок рекомендуемый размер частиц составляет 1-2 мм, для соломы – 5-10
мм. Затем измельченное сырье поступает в блок стерилизации, где осуществляется
обработка сырья 1 % раствором пероксида водорода в течение одного часа. Стерильный
субстрат поступает в ферментеры блока сбраживания. Ферментеры представляют собой
емкости, внутренний объем которых разделен на две камеры фильтрующей перегородкой.
Одна камера предназначена для загрузки биомассой базидиальных грибов, другая для
загрузки стерильных субстратов. Биомасса для процесса ферментации производится
следующим образом. Питательная среда подается в блок культивирования биомассы
(ферментеры), в котором происходит ее стерилизация и осуществляется засев питательной
среды жидкой культурой базидиального гриба. Культивирование биомассы
осуществляется в течение 3-4 суток. Процесс сбраживания субстрата (соломы или опилок)
протекает в течение 5-7 дней при температуре 25 0С. Биомасса используется в течение не
менее трех циклов ферментации (с загрузкой свежего сырья для каждого цикла).
Культуральная жидкость направляется в блок ректификации. Кубовый остаток процесса
ректификации направляется в рецикл в блок культивирования биомассы. Отработанные
субстрат и биомасса поступают на осушку и прессование с целью производства
лигноцеллюлозных удобрений, либо кормов, обогащенных белком.
Рисунок 13 – Принципиальная схема производства биоэтанола из лигноцеллюлозного
сырья с использованием базидиальных грибов
Выход биоэтанола по отношению к сырью (соломе ржи) составляет
6 % масс. Преимуществом предлагаемой технологии является безотходность и отсутствие
воздействия на окружающую среду. Важным аспектом предложенной технологии
производства биоэтанола, основанной на применении базидиальных грибов для
сбраживания лигноцеллюлозных субстратов, является отсутствие примесей, таких как,
метанол и сивушные масла, в составе культуральной жидкости (данные были
18
подтверждены хромато-масс-спектрометрическими исследованиями, в результате
которых не было обнаружено вышеуказанных примесей).
Побочным продуктом производства этанола из лигноцеллюлозного сырья по
предложенной технологии является лигноцеллюлоза, обогащенная белком, которая
является ценным кормовым продуктом, а также может быть использована в качестве
удобрения, либо в качестве субстрата для проведения биоремедиации почв, в том числе,
нефтезагрязненных. Таким образом, затраты на реализацию технологии (сырье,
электроэнергия, пар), могут быть компенсированы за счет реализации побочных
продуктов. Можно сделать вывод, что предложенная технология является перспективной
для реализации в промышленности.
ВЫВОДЫ
Впервые предложена одностадийная принципиальная технологическая схема
безотходного производства топливного биоэтанола из лигноцеллюлозного сырья с
использованием базидиальных грибов. Данная технология позволяет получить
биоэтанол с выходом по субстрату от 2,3 % до 6,0 % при использовании в качестве
сырья хвойных опилок и соломы ржи соответственно. Качество получаемого
биоэтанола при этом соответствует техническим требованиям, предъявляемым к
топливному этанолу, используемому в качестве компонента автомобильных бензинов.
2. Проведен скрининг базидиомицетов – активных продуцентов ферментов,
гидролизирующих лигноцеллюлозный субстрат и продуцирующих биоэтанол, в
результате которого установлено, что 4 штамма базидиальных грибов (Trametes
versicolor It-1, T. hirsuta MT-24.24, T. hirsuta MT-17.24 и Fomitopsis pinicola MT-5.21)
имеют коэффициент целлюлазной активности больше 5, обладают фенолоксидазной
активностью и способны продуцировать не менее 8 г/л биоэтанола за 7 суток.
3. Введен новый показатель для оценки количества спирта, продуцируемого единицей
биомассы. Установлено, что наибольшее количество спирта на единицу биомассы (2,1
г/г) способен продуцировать штамм It-1 при использовании в качестве субстрата
глюкозы.
4. Исследована динамика накопления биоэтанола штаммами It-1 и MT-24.24 с
использованием в качестве субстратов дисахарида целлобиозы, шестиатомных
сахаров глюкозы, галактозы и фруктозы и пятиатомных сахаров арабинозы и ксилозы.
Установлено, что оба штамма накапливают максимальное количество биоэтанола
(11,3 и 11,1 г/л соответственно) к 9 и 10 суткам соответственно при использовании в
качестве исходного субстрата глюкозы. При использовании в качестве субстрата
целлобиозы максимальные значения биоэтанола (8,3 и 8,2 г/л) были достигнуты к 7 и
10 суткам соответственно. Сбраживание фруктозы оказалось более эффективным для
штамма It-1 (8,9 г/л к 10 суткам эксперимента) по сравнению со штаммом МT-24.24
(3,4 г/л к 8 суткам культивирования). Используемая в качестве субстрата галактоза
более эффективно подвергалась процессам брожения при участии штамма It-1 (1,7 г/л
за 10 суток культивирования); для штамма MT-24.24 данное значение не превышало
0,5 г/л за 5 суток культивирования. Показана возможность эффективного
1.
19
5.
6.
7.
8.
9.
использования пятиатомных сахаров арабинозы и ксилозы в качестве субстратов для
производства биоэтанола с выходом биоэтанола 1,2-1,7 г/л для обоих штаммов к 7
суткам культивирования.
Изучено влияние концентрации исходного субстрата и целевого продукта на
жизнедеятельность базидиальных грибов. Показано, что при возрастании
концентрации исходного субстрата (глюкозы) с 20 г/л до 200 г/л увеличивается
абсолютное количество биоэтанола и достигает 33 г/л на 7-е сутки, однако снижается
относительный выход целевого продукта по субстрату, что свидетельствует о
необходимости увеличения времени процесса брожения при высоких концентрациях
субстрата.
Показана температурная зависимость ферментативной активности для штаммов
базидиальных грибов. Установлено, что оптимальной температурой, при которой
наблюдается наибольшая активность целлюлаз для штаммов It-1, MT-5.21 и MT-24.24,
является температура 26 °С. При повышении температуры до 36 °С наблюдается
снижение коэффициента целлюлазной активности, что может быть обусловлено
белковой природой ферментов и его частичной инактивацией при повышении
температуры. Оптимум целлюлазной активности для штаммов MT-17.24 и MT-33.01
достигается при 30 °С. Исследование температурной зависимости фенолоксидазной
активности четырех штаммов (MT-24.24, MT-17.24, It-1, MT-33.01) показало, что
штамм MT-33.01 имеет наибольшую активность в более широком диапазоне
температур (26-36 °С) по сравнению с другими штаммами, штамм MT-24.24 менее
активен на всем исследуемом диапазоне температур.
Исследовано влияние пероксида водорода на выход биомассы штамма It-1.
Установлено, что 1 % раствор пероксида водорода повышает выход биомассы на
23,5% по сравнению с контролем. При повышении концентрации пероксида водорода
наблюдался лизис биомассы.
Показана возможность использования базидиальных грибов для прямой конверсии
лигноцеллюлозного субстрата в биоэтанол. Полученные концентрации биоэтанола
составляют 32,2 г / 1000 г хвойных опилок и 56,7 г / 1000 г соломы ржи.
Проведена оптимизация состава питательной среды методом математического
планирования. Разработанная среда (соевая мука – 7,8 г/л, соевое масло – 41,2 мл/л,
MgSO4*7Н2O – 0,25 г/л, KH2PO4 – 2,5 г/л) обеспечивает стабильный выход биомассы
(38,5-39,7 г/л) на 4-е сутки культивирования.
20
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате проведенной работы разработана одностадийная технологическая
схема консолидированной биопереработки лигноцеллюлозного сырья в топливный
биоэтанол с использованием базидиальных грибов, учитывающая морфофизиологические
и биохимические особенности базидиальных грибов. Перспективой дальнейшего
развития темы является отработка предлагаемой технологической схемы на пилотных
установках и в промышленном масштабе, в процессе которой возможно выявление
недочётов разработанной схемы и их дальнейшее устранение. Оптимизация параметров
культивирования, режимов перемешивания субстратов при осуществлении прямой
конверсии лигноцеллюлознго сырья в биореакторах позволят интенсифицировать
процессы биодеструкции и повысить выход биоэтанола с единицы исходного субстрата.
При внедрении разработанной технологической схемы предлагается располагать
промышленные площадки вблизи сырьевой базы, а также вблизи площадок, являющихся
перспективными потребителями не только биоэтанола, но и побочных продуктов, таких
как лигноцеллюлоза, обогащенная белками грибов.
Основные положения диссертации изложены в следующих работах:
1. Альмяшева, Н.Р. Получение биоэтанола из лигноцеллюлозного сырья с помощью
ксилотрофных
базидиомицетов
/
Н.Р.
Альмяшева,
А.А.
Новиков,
Е.Ю. Кожевникова, А.В. Голышкин, А.В. Барков, В.А. Винокуров // Химия и
технология топлив и масел. – 2015. – № 5. – С. 59-64.
2. Кожевникова, Е.Ю. Новые штаммы базидиальных грибов - продуценты этанола из
лигноцеллюлозного сырья / Е.Ю. Кожевникова, Д.А. Бескоровайная, А.А. Новиков,
А.В. Шнырева, А.В. Барков, В.А. Винокуров // Прикладная биохимия и
микробиология. – 2016. – T. 52. – № 6. – С.609-613.
3. Кожевникова, Е.Ю. Перспективы использования новых штаммов базидиальных
грибов для прямой конверсии лигноцеллюлозного сырья в биоэтанол /
Е.Ю. Кожевникова, Д.А. Петрова, А.А. Новиков, А.В. Шнырева, А.В. Барков,
В.А. Винокуров // Прикладная биохимия и микробиология. – 2017. – T. 53 – № 5 – С.
484–489.
4. Патент 2614263 Российская Федерация. Штамм базидиального гриба Trametes hirsuta
- продуцент этилового спирта [Текст] / Барков А.В., Кожевникова Е.Ю.,
Альмяшева Н.Р., Шарипова Д.А., Новиков А.А., Котелев М.С., Гущин П.А.,
Иванов Е.В., Винокуров В.А.; заявитель и патентообладатель: Федеральное
государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования
«Российский государственный университет нефти и газа (национальный
исследовательский университет) имени И.М. Губкина»; заявка № 2015156815, заявл.
29.12.2015; опубл. 24.03.2017; бюл. № 9.
5. Патент 2630997 Российская Федерация. Штамм базидиомицета Trametes hirsuta продуцент этилового спирта [Текст] / Кожевникова Е.Ю., Барков А.В., Спицына Е.А.,
Петрова Д.А., Новиков А.А., Котелев М.С., Гущин П.А., Иванов Е.В., Винокуров В.А.;
21
заявитель и патентообладатель: Федеральное государственное бюджетное
образовательное учреждение высшего образования «Российский государственный
университет нефти и газа (национальный исследовательский университет) имени
И.М. Губкина»; заявка № 2016150491, заявл. 21.12.2016, опубл. 15.09.2017; бюл. № 26.
22
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
3
Размер файла
517 Кб
Теги
лигноцеллюлозного, прямая, базидиальных, использование, грибов, биоэтанола, сырье, конверсия
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа