close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Биологические свойства изолятов вируса африканской чумы свиней и особенности течения болезни при экспериментальном заражении

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Жуков Иван Юрьевич
БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ
ЧУМЫ СВИНЕЙ И ОСОБЕННОСТИ ТЕЧЕНИЯ БОЛЕЗНИ ПРИ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ЗАРАЖЕНИИ
03.02.02 «Вирусология»
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Владимир  2018
2
Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении
«Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»).
Власова
Наталья
Никифоровна,
доктор
биологических наук.
Александр
Алексеевич,
доктор
Официальные оппоненты: Шевченко
ветеринарных наук, профессор, заведующий кафедрой
микробиологии,
эпизоотологии
и
вирусологии
Федерального
государственного
бюджетного
образовательного учреждения высшего образования
«Кубанский государственный аграрный университет
им. И.Т. Трубилина» (ФГБОУ ВО Кубанский ГАУ).
Научный руководитель:
Титов Илья Андреевич, кандидат биологических
наук, научный сотрудник лаборатории молекулярной
вирусологии
Федерального
государственного
бюджетного научного учреждения «Федеральный
исследовательский
центр
вирусологии
и
микробиологии» (ФГБНУ ФИЦВиМ);
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное научное
учреждение Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической
безопасности (ФГБНУ "ФЦТРБ-ВНИВИ"), г. Казань.
Защита состоится 22 мая 2018 года в 12.00 часов на заседании
диссертационного совета Д 220.015.01 при ФГБУ «Федеральный центр охраны
здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), г. Владимир, мкр. Юрьевец.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ВНИИЗЖ» (г.
Владимир). Полный текст диссертации, автореферата и отзыв научного
руководителя размещены на официальном сайте ФГБУ «ВНИИЗЖ» www.arriah.ru
Автореферат разослан 27 марта 2018 г.
Ученый секретарь
диссертационного cовета,
кандидат биологических наук
Жбанова Татьяна Валентиновна
3
1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1.1 Актуальность темы. Свиноводство в РФ и странах Европы является одной
из наиболее развивающихся отраслей сельского хозяйства, позволяющих обеспечить
население высококачественной мясной продукцией. Однако существенное влияние на
эффективность отрасли оказывает эпизоотия африканской чумы свиней, вызванная
вирусом II генотипа и которая продолжается с 2007 года по настоящий момент [9].
АЧС – трансграничная экономически значимая болезнь, ущерб от которой в РФ
исчисляется миллиардами рублей.
Средства и методы борьбы с такими особо
опасными болезнями свиней как ящур, КЧС, ВБА, разработаны и имеют свое
применение в повседневной практике. В то же время эпизоотия АЧС, вызванная
вирусом II генотипа, на территории Евразии 2007 – 2017 гг. принимает угрожающие
масштабы. За последние 10 лет болезнь отмечена в популяциях домашних и диких
свиней 14 стран: Грузия, Армения, РФ, Азербайджан, Иран, Украина, Беларусь, Литва,
Латвия, Польша, Эстония, Молдова, Румыния, Чехия [9].
На настоящий момент одновременно отмечается как значительное изменение
вирулентности циркулирующего среди диких кабанов вируса и появление животных
вирусоносителей, в крови которых выявляется и антитела, и вирусный геном, так и
распространение среди домашнего поголовья свиней в ряде областей Сибирского
региона
высоковирулентного
варианта
вируса
АЧС,
близкого
по
своим
характеристикам к изоляту Georgia 2007/1 [9].
Ввиду отсутствия эффективных и безопасных вакцин для профилактики АЧС,
максимально раннее обнаружение антигена, генома и/или присутствующих в
сыворотке
крови
животного
специфических
антител,
определяющих
наличие
возбудителя в организме, является первоочередным этапом в борьбе с болезнью.
Создание диагностической базы для раннего и эффективного выявления наличия
возбудителя, как у больных, так и у латентно инфицированных животных является
одним из основных компонентов стратегии искоренения болезни. Скринирующие
серологические методы являются необходимым этапом лабораторной диагностики
АЧС и, благодаря их высокой чувствительности и специфичности, успешно
используются в программах контроля распространения болезни. Эти методы
основываются
на
всестороннем
изучении
биологии
вызываемой им болезни и характеристик развития эпизоотии.
возбудителя,
патогенеза
4
Следовательно, решение вопроса об искоренении АЧС базируется на детальном
изучении возбудителя болезни, характера ее протекания и особенностей репродукции
вируса в культурах клеток и в организме восприимчивого животного.
1.2
Степень
разработанности
проблемы.
В
последние
годы
угроза
распространения вируса АЧС II генотипа в странах Евросоюза возросла в связи с
появлением ее в странах восточной Европы и в Украине. Подавляющее большинство
вспышек имело место у диких кабанов, но в Эстонии регистрировали и случаи среди
домашних свиней, также они были зарегистрированы в Латвии и Литве. В Польше же
случаи среди диких кабанов регулярны, но у домашних свиней АЧС отмечаются
единичные случаи. Ситуация с АЧС на Украине остается до конца неясной, однако
происходит диффузное распространение эпизоотии [13,14].
За последние десятилетия в области изучения развития инфекционного процесса
и иммунного ответа при АЧС произошли существенные сдвиги. Были определены
основные причины стремительного развития геморрагического синдрома, отсутствия
эффективной вируснейтрализующей активности антител и необходимость участия
эффекторов клеточного иммунитета в противодействии вирусной диссеминации [12,4].
Однако, все указанные показатели нестабильны и могут изменяться в
зависимости от дозы, пути введения вируса и свойств самого изолята. Основываясь на
анализе данных, приведенных в работах Hоwey, Salas по изучению биологического
воздействия вируса при различных способах заражения отмечалось, что при
интраназальном, и пероральном введении вируса, а также при отличающихся дозах
заражения длительность болезни, некоторые ее симптомы, а также и сроки гибели
могут варьировать [16,17].
Кроме того, в работах Dixon, Nezerton et al, доказано, что вирус АЧС обладает
активным механизмом, позволяющим ему успешно ускользать от воздействия
факторов иммунного ответа макроорганизма.
Первые исследования в СССР по изучению патогенеза при АЧС изолятов вируса,
циркулирующих на территории Африканского континента и эпизоотии в странах
Европы в 1960-х годах были выполнены в двух институтах: ВИЭВ и ВНИИВВиМ,
причем основной упор был сделан на африканские изоляты I, V-VI, VIII-XX, XVIIXVIII, XX-XXII генотипов. Они позволили определить ключевые моменты, влияющие
на патогенность, репликацию вируса и характер течения болезни, разработать методы
культивирования вируса, его серотиповая классификация и разработка средств
специфической профилактики при АЧС [8,7,1].
5
Работы Балышева В.М., Куриннова В.В., Белянина С.А. заложили основы по
описанию биологических свойств современных российских изолятов [3]. Однако, для
более точной характеристики изолятов необходимо проведение как балльной оценки
изменений в организме свиньи, вызываемых вирусом АЧС, так и детальное изучение
биологических свойств изолятов.
В 2015 году отмечен существенный рост выявления серопозитивных кабанов 49,3% (более, чем в 2 раза), в 17,5 % случаев - одновременно обнаруживали ДНК и
антитела, т.е. животные являлись вирусоносителями. При анализе изолятов вируса АЧС
из стран Балтии испанскими исследователями зарегистрированы случаи выживания
животных при заражении вирусом АЧС, причем, летальность составила ~ 66% [13].
Необходимостью изучения особенностей биологического воздействия вируса
АЧС различных изолятов на организм восприимчивого животного, мониторинга
ситуации по АЧС и разработки инструментов для него, а также для адекватной и
обоснованной выработки мер борьбы с АЧС на территории РФ, обусловлено
направление данной диссертационной работы.
В связи с вышеизложенным, определение биологических свойств изолятов
вируса
африканской
чумы
свиней
и
особенностей
течения
болезни
при
экспериментальном заражении является актуальным.
1.3 Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение в
лабораторных условиях биологических свойств вируса АЧС российских изолятов 20142015гг., а также особенностей течения вызываемой им болезни.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
1. оптимизировать условия выделения и накопления вируса АЧС для изучения
особенностей репродукции вируса в первичных культурах клеток;
2. выделить полевые изоляты для проведения их сравнительного анализа;
3. провести сравнительный анализ биологического действия вируса АЧС
изолятов при постановке биопроб;
4. определить локализацию вируса в органах зараженных животных методом
иммуногистохимического анализа;
5. сравнить особенности репродукции вируса на культурах клеток от
переболевших и интактных животных;
6. определить динамику антителообразования к иммунологически значимым
белкам р30, р54 и р72 у зараженных животных методом непрямого варианта
твердофазного иммуноферментного анализа;
6
7. разработать тест-систему ТФ ИФА на основе использования комплексного
антигена для изучения характера антителообразования у животных, инфицированных
вирусом АЧС.
1.4 Научная новизна исследований: По результатам изучения особенностей
развития инфекционного процесса на клеточном уровне установлено, что клетки
моноцитарного/макрофагального ряда, полученные из разных органов, отличаются по
уровню репродукционной способности в отношении вируса АЧС, так в спленоцитах
селезенки наблюдали минимальные сроки репродукции (96-120 часов) и максимально
выявленный в наших экспериментах титр накопления – 7,85 lg ГАдЕ50 /см3. На основе
разработки технологии получения культуры клеток СС, которая позволяет установить
наличие в пробе вируса АЧС на 12-24 часа раньше, чем на культурах клеток ЛС и КМС,
повышена чувствительность реакции гемадсорбции, как основного теста при
проведении вирусовыделения.
В результате проведения вырусовыделения из образцов патологического
материала диких кабанов и домашних свиней получены 7 изолятов вируса АЧС:
Лазаревское 01/14, Антоново 07/14, Грибово 06/14, Воронеж-Агро12/14, Лысогорье
07/15, Собинка 07/15 и Одинцово-02/14, а также определены их основные
репродукционные характеристики в первичных и перевиваемых культурах клеток.
Впервые в РФ при проведении биопробы были охарактеризованы 6 изолятов,
причем, изолят Собинка 07/15 и штамм АЧС 8 №2/Одинцово-02/14, были
паспортизированы и депонированы в коллекции штаммов микроорганизмов ФГБУ
«ВНИИЗЖ».
Установлены
особенности
протекания
болезни:
длительность
инкубационного периода, сроки проявления признаков болезни и наступления гибели
свиней, патологоанатомические признаки, рассчитана летальность в опыте для каждого
изолята: от 85,7% для штамма АЧС 8 №2/Одинцово-02/14 до 100% для изолятов
Лазаревское 01/14, Грибово 06/14, Воронеж-Агро12/14, Собинка 07/15.
Установлено соответствие между уровнем антителообразования и длительностью
течения болезни для выбранных изолятов, выявлены различия в динамике
антителообразования к основным иммунологически значимым белкам (р30, р54 и р72)
вируса при разных формах АЧС.
При проведении сравнительного анализа уровня репродукции вируса АЧС в
культуре клеток от
выживших
после опыта поросят наблюдали появление
гемадсорбции на 24 часа ранее, чем в культуре клеток от интактного животного, а титр
7
вируса в культуре клеток от выживших поросят через 60 часов после заражения в 10
раз и более превышал таковой в культуре клеток от интактного животного.
1.5 Теоретическая и практическая значимость исследования. Доказано, что в
лабораторных условиях изоляты, выделенные в 2014-2015гг., отличаются по уровню
накопления в культуре клеток, а также по характеру гемадсорбции, летальности и
форме протекания АЧС при экспериментальном заражении, что свидетельствует о
различии их биологических свойств.
Изучены биологические свойства изолятов, и охарактеризованные штаммы 8
№2/Одинцово-02/14 и АЧС/Собинка 07/15 депонированы в коллекции штаммов
микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ».
Сравнительный анализ биологических свойств изолята Одинцово-02/14 и штамма
8 №2/Одинцово-02/14 позволил установить неоднородность состава популяции, что
привело к снижению его летальности до 85,6%. Этот показатель для изолятов вируса
АЧС Антоново 07/14 и Лысогорье 07/14 составил, соответственно 91,7% и 93,8%. В
опыте с изолятами Лазаревское 01/14, Грибово 06/14, Воронеж-Агро 12/14 и Собинка
07/15 летальность достигала 100%.
При заражении вирусом АЧС выявлен эффект усиления репродукции,
проявляющийся в культуре клеток от переболевших животных, что является одним из
основных моментов, который объясняет развитие тяжелого патологического процесса
при протекании АЧС и является причиной снижении эффективности иммунного ответа.
Определены сроки появления антител в сыворотках крови выживших животных
к белкам вируса АЧС: к р30 – 9-11 день, к р54 -7-9 день и к р72- 7-9 день и установлена
взаимосвязь динамики появления антител к белкам р54, р30 и р72 вируса АЧС и
длительности течения болезни.
Апробирован метод ИГХ анализа для определения локализации вирусного
антигена
в
гистосрезах
органов
и
тканей
с
применением
окрашивания
иммунофлуоресцентным и иммунопероксидазными препаратами.
Разработаны «Методические рекомендации по выявлению антител к вирусу
африканской чумы свиней методом иммуноферментного анализа с использованием
комплексного антигена» (утверждены в ФГБУ «ВНИИЗЖ» 30 сентября 2016 года).
Разработаны и апробированы методические рекомендации по выделению и
титрованию вируса АЧС в культуре клеток КМС, ЛС; по выявлению вируса АЧС в
реакции РПИФ; по оценке клинических признаков, и патологоанатомических
изменений при экспериментальном заражении вирусом АЧС.
8
Результаты проведенных исследований могут быть использованы в РФ при
проведении
мониторинговых
исследований,
при
разработке
мероприятий
по
профилактике и борьбе с АЧС.
1.6
Методология
и
методы
исследований.
В
работе
использовали
вирусологические (вирусовыделение, культивирование вируса, титрование вируса,
постановка биопроб), препаративные методы (очистка вируса в градиенте сахарозы с
целью получения вирусного антигена, электорофорез в ПААГ), серологические
(реакция
прямой
иммунофлуоресценции,
иммуногистохимический
анализ,
твердофазный иммуноферментный анализ), а также молекулярно-биологические (ПЦР
в реальном времени). Исследования по диссертационной работе выполнены на базе
референтной
лаборатории
по
африканской
чуме
свиней
Федерального
государственного бюджетного учреждения ФГБУ «ВНИИЗЖ».
1.7 Положения, выносимые на защиту:
-
изоляты 2014-2015гг. вируса АЧС, циркулирующего на территории РФ
отличаются по биологическим свойствам и динамике образования антител к различным
белкам вируса АЧС;
- контрольное заражение всех выживших животных позволило определить, что
они приобрели стойкий протективный иммунитет;
- в культурах клеток КМС и СС, полученных от выживших после заражения
вирусом АЧС животных наблюдается проявление усиления репродукции вируса.
1.8 Личный вклад соискателя. Представленные в диссертационной работе
экспериментальные исследования, теоретический и практический анализ полученных
результатов проведены автором самостоятельно. Автор выражает благодарность за
содействие в выполнении работы заведующему референтной лабораторией по АЧС
к.в.н. Иголкину А.С., за консультативную помощь д.б.н., профессору Груздеву К.Н., а
также за практическую помощь в выполнении отдельных этапов работы сотрудникам
ФГБУ «ВНИИЗЖ» к.б.н. Егорову А.А., к.в.н. Шевцову А.А., к.б.н. Елсуковой А.А.,
к.в.н. Першину А.С., к.б.н. Ремыге С.Г., к.б.н. Варенцовой А.А., к.б.н. Шевченко И.В.
1.9 Степень достоверности и апробации результатов. Материалы
диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета и
методической комиссии ФГБУ «ВНИИЗЖ» (2013-2015 гг.), на заседаниях НТС
(Научно-технического совета) Россельхознадзора (2014-2015 гг.), на IV
Международной научно-практической конференции «Молодежь и наука XXI века» (г.
Ульяновск, 2014 г.), на III Международной научно-практической конференции
9
«Актуальные вопросы и перспективы развития сельскохозяйственных наук» (г. Омск,
2016 г.), на IV Международной научной конференции «Достижения молодых ученых в
ветеринарную практику» (г. Владимир, 2016 г.). Достоверность проведенных
исследований подтверждена результатами комиссионных испытаний.
1.10 Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 8
научных работ, в том числе 5 статей - в изданиях по перечню ВАК Министерства
образования и науки РФ для докторских и кандидатских диссертаций.
1.11 Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 145 страницах
компьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы,
результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, приложения;
иллюстрирована 19 таблицами и 16 рисунками. Список использованной литературы
включает 151 источников, из них 99 иностранных. В приложении представлены копии
титульных листов документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее
научную новизну и практическую значимость.
2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Материалы
Вирусы. В работе использовали изоляты вируса африканской чумы свиней,
выделенные на территории Российской Федерации в 2014-2015 гг. и представленные в
таблице 1.
Таблица 1 – Изоляты вируса АЧС, использованные в работе:
Координаты выделения
№
Изолят
1
Лазоревское 01/14
2
Одинцово 02/14
3
Грибово 06/14
4
Антоново 07/14
5
Воронеж-Агро
12/14
6
Собинка 07/15
7
Лысогорье 07/15
дата
январь
2014
место
Тульская обл., Щекинский р-н,
ООО Лазоревское
Московская обл.,
февраль
Одинцовский район,
2014
Таракановское лесничество
Белгородская обл., Алексеевский
июнь
район, станица Алексеевская,
2014
Графское урочище.
июль
Псковская обл., д.Лобок,
2014
Невельский р-н, Антонов В.И.
Воронежская обл., Аннинский р-н,
декабрь
с. Николаевка,
2014
п. Круглоподпольное, ЗАО
«Агрокомбинат Николевский»
июль
Владимирская обл., Собинский р2015
он, охотхозяйство «Устье»
июль
Саратовская обл.,
2015
Лысогорский р-он
источник
Титр вируса в
патматериале
(lg ГАдЕ50/см3)
домашняя
свинья
4,51 ± 0,18
отстрелянный
кабан
4,11 ± 0,27
павший кабан
4,02 ± 0,25
домашняя
свинья
5,02 ± 0,25
домашняя
свинья
6,57 ± 0,18
павший кабан
6,51 ± 0,17
отстрелянный
кабан
5,35 ± 0,32
Культуры клеток. Применяли первичные культуры клеток (КК) КМС, ЛС, СС,
альвеолярных макрофагов свиньи (АМС) и почки свиньи (СП).
Животные. Использовали свиней крупной белой породы, живой массой 15-20 кг,
10
серонегативных к вирусу АЧС, в опыте использовали от 4 до 14 голов.
Эритроциты свиней. В работе использовали 10% суспензию эритроцитов в
физиологическом растворе.
Сыворотки крови свиней. В качестве контрольных сывороток использовали:
гипериммунную
сыворотку,
полученную
от
поросенка,
выжившего
после
экспериментального заражения (положительный контроль). Сыворотка крови свиней к
IV серотипу, (CISA-INIA, Испания) и нормальная сыворотка крови свиньи из хозяйства
благополучного по АЧС - отрицательный контроль. В работе были использованы
сыворотки, полученные при постановке биопроб.
Питательные среды, сыворотки, растворы и реактивы. Использовали
химические реактивы фирм «Sigma», «AppliChem», «Life Technologies», «Thermo
Scientific», реактивы российского производства марки “ч.д.а.” и “х.ч.”, питательные
среды, антибиотики; фетальную сыворотку КРС (Sigma, HуClon и PAN BIOTECH,
США и PAA, Австрия); а также FS FetalClon II (НуClone, США); конъюгат протеина А
с флуоресцентной меткой «Protein A – FITC» (Sigma).
Наборы реактивов. «Тест-система "АЧС" для диагностики африканской чумы
свиней методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной
детекцией
в
режиме
конкурентного
ТФ
"реального
ИФА
времени"»
INGEZIM
PPA
(ИнтерЛабСервис);
COMPAC
(Испания);
набор
для
ИФА-набор
«ВНИИВВиМ АЧС-ИФА Ат/Аг» (г. Покров).
Рекомбинантные белки вируса АЧС. Рекомбинантный р30 (ген CP204L);
рекомбинантный р72 (ген В646L); рекомбинантный р54 (ген Е183L), полученные в
референтной
лаборатории
по
АЧС
ФГБУ
«ВНИИЗЖ».
Исследования
с
рекомбинантным белком pK205R, полученным в референтной лаборатории по особо
опасных болезням ФГБУ «ВНИИЗЖ», проводились Якуповым М.Р. на базе данной
лаборатории.
2.2 Методы
Приготовление культур клеток. Первичные культуры клеток свиней получали
согласно ГОСТ 28573-90 и методическим рекомендациям [2,7].
Определение титра вируса. Титрование материала проводили с использованием
культур
клеток
на
96-луночных
планшетах
по
стандартной
методике
[16].
Инфекционный титр вируса вычисляли по методу Кербера (в модификации Ошмарина)
и выражали в lg ГАдЕ50/см3.
Определение серотиповой принадлежности вируса. Определение серотиповой
11
принадлежности выполняли в реакции задержки гемадсорбции (РЗГАд). Получение
задерживающих гемадсорбцию сывороток и постановку реакции проводили в
соответствии с методом, разработанным В. М. Балышевым и др. [7,8].
Обнаружение
вируса
АЧС
в
патматериале.
В
полученных
пробах
патматериала обнаруживали наличие генома возбудителя АЧС методом ПЦР-РВ;
антигена вируса АЧС в реакции прямой иммунофлуоресценции (РПИФ), наличие
вируса определяли в реакции гемадсорбции (РГАд) [4,7].
Определение гемадсорбирующей активности вируса и оценка характера
гемадсорбции выполняли в реакции гемадсорбции согласно методике Вишнякова И.Ф.
с
соавт.
[7].
Определение
наличия
и
количественную
характеристику
гемадсорбирующей активности проводили согласно разработкам В.В. Макарова и др.
(1991), подсчитывая количество эритроцитов, прикрепившихся на отдельных клетках
при увеличении х400 [6].
Постановка РПИФ. Проводили с применением ФИТЦ- конъюгатов различных
производителей (специфические ФИТЦ-иммуноглобулины для иммунофлуоресцентной
диагностики
АЧС
(ВНИИВВиМ,
г.
Покров);
ФИТЦ-конъюгат
на
основе
моноклональных антител к р72 (АНО НИИ ДПБ г.Москва); конъюгат протеина А с
флуоресцентной меткой «Protein A – FITC» (Sigma); ФБР и глицерин [15].
Постановка биопроб на свиньях. Проводили путем заражения естественно
восприимчивых животных. Постановку биопробы проводили на основе «Методических
рекомендаций…» [5].
Контрольное заражение проводили путем внутримышечного введения вируса
изолята АЧС Грибово 06/14 в дозе 1000 ГАдЕ/голову.
Оценка патологических изменений и клинических признаков у животных.
Клинические проявления и патологические изменения у свиней оценивались на основе
«Методических рекомендаций…» [5].
Иммуногистохимический анализ выполняли путем приготовления гистосрезов
с последующим окрашиванием ФИТЦ-конъюгатом и пероксидазным конъюгатом
моноклональных антител с красителем [15].
Постановка ТФ ИФА. Данный метод использовали для выявления антител,
специфичных к белкам вируса АЧС, согласно инструкции к набору.
Статистическая обработка результатов проводилась по разностному методу
Стьюдента-Фишера, построение графиков и диаграмм выполнены с использованием
прикладных программ Statistica 10.0 (Stat Soft. Inc., США) и Microsoft Excel 2013.
12
2.2 Результаты собственных исследований
Изучение репродукционных особенностей первичных культур клеток при
заражении вирусом АЧС. Изучение патогенеза на клеточном уровне проводится по
оценке репродукции вируса АЧС в различных линиях клеточных культур.
При подобранных условиях культивирования вирус АЧС: (концентрация клеток
5-6 млн/см3 для КМС и 6-7 млн/см3 для СС, и применение сыворотки FetalClon II для
КМС и фетальной сыворотки КРС для СС в поддерживающей среде) вирус
размножался в культурах клеток КМС и СС с проявлением гемадсорбции.
Гемадсорбирующая активность вируса изолята Одинцово 02/14 регистрировалась и в
культуре клеток СП, где он репродуцировался без предварительной адаптации, причем,
гемадсорбция
имела
«полуплотный»
характер
прикрепления
эритроцитов
к
зараженным клеткам [5].
Изучение особенностей репродукции вируса семи отобранных изолятов показало
их значительное сходство при сравнении титров накопления в культуре клеток КМС.
Таблица 2 – Результат накопления вируса АЧС в культуре клеток КМС
n=3
Изолят
№ пассажа
Лазоревское 01/14
Одинцово 02/14
Грибово 06/14
Антоново 07/14
Воронеж-Агро 12/14
Собинка 07/15
Лысогорье 07/15
Титр вируса в пассажах, lg ГАдЕ50/см3
1
2
3
5,07 ± 0,12 (>40)
6,45 ± 0,18 (>40)
7,03 ± 0,11 (>40)
5,21 ± 0,36 (>40)
6,66 ± 0,14 (20-40)
7,02 ± 0,12 (20-40)
4,02 ± 0,25(>40)
5,31 ± 0,36 (>40)
6,15 ±0,51 (>40)
5,35 ± 0,32 (>40)
6,58 ± 0,24 (>40)
7,55 ± 0,14 (>40)
6,57 ± 0,18 (>40)
7,02 ± 0,51 (>40)
7,56 ± 0,41 (>40)
5,06 ± 0,23 (>40)
6,51 ± 0,17 (20-40)
7,64 ± 0,22 (20-40)
5,02 ± 0,65 (>40)
6,06 ± 0,18 (>40)
7,02± 0,34 (>40)
Примечание: в скобках указано количество эритроцитов прикрепившихся к одной клетке.
Таким образом, для пяти исследуемых изолятов (таблица 2) во всех проведенных
опытах гемадсорбция имела «плотный» характер, то есть количество эритроцитов на
одну клетку превышало 40. Гемадсорбция для изолята Одинцово 02/14 и Собинка 07/15
во 2 и 3 пассажах снизилась до 20 - 40 эритроцитов на клетку и имела
«промежуточный» характер, a титр накопления к 3 пассажу для изолята Собинка 07/15
превышал значение 7,6 lg ГАдЕ50/ см3.
Биопробы. На основании анализа культуральных свойств изолятов для
дальнейших исследований нами были выбраны 6 изолятов вируса АЧС: Лазаревское
01/14, Грибово 06/14, Антоново 07/14, Воронеж-Агро 12/14, Лысогорье 07/15, Собинка
07/15 и штамм 8 №2/Одинцово-02/14.
В биопробе с изолятом Лазаревское 01/14 были отмечены характерные для
13
АЧС клинические признаки, такие как слабость, угнетѐнное состояние животных, отказ
от корма, гнойный конъюнктивит, у двух подсвинков отмечены признаки поражения
ЦНС - парезы и судороги конечностей.
По результатам вскрытия было отмечено: скопление жидкости в грудной и
сердечной полостях, дряблое, мягкое на ощупь сердце с многочисленными точечными
кровоизлияниями на эпикарде, проникающими на всю его глубину, выраженная
гиперплазия лимфоузлов, спленомегалия, на верхушечных и главных долях легких –
крупные очаги пневмонии, у 6 из 8 животных – цианоз. У поросят, зараженных
интрназально, и поросят контактной группы наблюдали выраженный гастрит и
энтерит. Так же для животных контактной группы был характерен кровавый понос
(срок наблюдения составил 19 дней).
Максимальный титр вируса достиг 7,5 lgГАдЕ50/см3 для поросят зараженных
изолятом Лазаревское 01/14 на 7 сутки после заражения. На 3 сутки регистрировали
наличие вируса в крови животных, зараженных в дозе 50 ГАдЕ/голову, и только на 5
сутки – у контактной группы.
100
% живых животных
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
1
3
5
7
9
11
13
15
17
19
21
Дни после инфицирования
1 группа
2 группа
3 группа
контактная группа
Рисунок 1. Динамика гибели животных после их заражения изолятом
Лазаревское 01/14
Примечание: 1 группа – заражающая доза 5000 ГАдЕ/гол, внутримышечно; 2 группа - 5000 ГАдЕ/гол,
интраназально; 3 группа - 50 ГАдЕ/гол, интраназально; 4 группа - контактная группа.
Первое животное пало на 8 сутки после начала опыта. Болезнь протекала с
признаками острой формы АЧС и последнее животное в опыте пало на 19 сутки ПИ.
Таким образом, для изолята Лазаревское сроки наступления гибели достигали 8-14
суток, а летальность в опыте составила 100%.
При постановке биопробы с изолятом Антоново 07/14 также отмечали
появление и развитие клинических признаков, характерных для АЧС: развитие болезни
с повышением температуры тела свыше 40,5ºС, угнетением и последующей гибелью на
14
7-11 сутки ПИ. Однако, у одного поросенка, зараженного в дозе 50 ГАдЕ/голову
внутримышечно (индивидуальный №0995), после повышения температуры и
первоначального проявления клинических признаков болезни состояние животного к
15 дню после инфицирования вернулось к значениям физиологической нормы.
% живых животных
Поросенок оставался жив в течение 92 суток последующего наблюдения.
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
1
3
5
7
9
11
13
15
17
19
21
Дни после инфицирования
1 группа
2 группа
3 группа
контактная группа
Рисунок 2. Динамика гибели животных после их заражения изолятом
Антоново 07/14
Примечание: 1 группа – заражающая доза 5000 ГАдЕ/гол. внутримышечно; 2 группа - 50 ГАдЕ/гол.,
интраназально; 3 группа - 50 ГАдЕ/гол., внутримышечно.
Наибольший показатель титра вируса в крови свиней регистрировали на 9 день
после заражения (6,37-7,5 lgГАдЕ50/см3). У выжившего животного максимальный титр
вируса зафиксирован также на 9 день ПИ и составил 7,2 lgГАдЕ50/см3. В дальнейшем
значения титра вируса уменьшались, и к 25 суткам после заражения не удалось выявить
наличие вируса в крови выжившего поросенка в РГАд.
Таким
образом,
изолят
Антоново
07/14
также
обладал
свойствами,
проявляющимися в способности вызывать болезнь с характерными для АЧС
клиническими признаками, сроки развития болезни достигали 15 суток. Однако, один
поросенок выжил после переболевания АЧС, поэтому летальность не превысила
значения 91,7%.
Был проведен сравнительный анализ биологических свойств 4 изолятов 2014 –
2015 гг. при разных дозах заражения. Для этого подопытные животные были
инфицированы вирусом изолятов Грибово 06/14, Воронеж-Агро 12/14, Лысогорье 07/15
и Собинка 07/15 при использовании доз 10, 1 и 0,1 ГАдЕ/голову. Все эксперименты по
изучению биологических свойств изолятов были разделены по времени проведения.
На рисунке 3 представлена динамика гибели поросят: при введении животным
более высокой дозы (10 ГАдЕ относительно 1 ГАдЕ) для изолятов Лысогорье 07/15,
Воронеж-Агро 12/14, не установлено значительных сдвигов в сроках развития болезни
15
и наступлении летального исхода. Однако, при заражении вирусом АЧС изолята
Лысогорье 07/15 в дозе 0,1 ГАдЕ/гол один из шести зараженных поросят выжил.
Динамика
гибели
поросят
зараженных изолятами ВАЧС
внутримышечно в дозе 10
ГАдЕ
Динамика
гибели
поросят
зараженных изолятами ВАЧС
внутримышечно
в
дозе
1
ГАдЕ
Динамика
гибели
поросят,
зараженных изолятами ВАЧС
внутримышечно в дозе 0,1
ГАдЕ
Рисунок 3. Динамика гибели поросят, зараженных разными изолятами
вируса АЧС в разных дозах.
Летальность для изолята Лысогорье 07/15 при заражении дозой 0,1 ГАдЕ
составила 93,8%. Для изолятов Грибово 06/14, Воронеж-Агро 12/14 и Собинка 07/15 во
всех экспериментах летальность составила 100%.
Постановку биопробы с вирусом штамма 8 №2/Одинцово-02/14 проводили в
рамках программы депонирования. Было использовано 14 голов свиней. В первой
группе животные пять голов были заражены внутримышечно в дозе 10 ГАдЕ/гол. Во
второй группе животные пять голов были заражены интраназально в дозе 50 ГАдЕ/гол.
% живых животных
Четыре поросенка находились на прямом контакте (рисунок 4):
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
1 группа
2 группа
контактная
группа
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37
Дни после инфицирования
16
Рисунок 4. Динамика гибели животных после их заражения штаммом 8
№2/Одинцово-02/14
Максимальное значение температуры отмечали на 7-8 день после инфицирования
(41,5ºС и выше), а животное 4 пало уже на 9 сутки. На 10 сутки при зафиксированной
гипертермии падеж произошел еще двух поросят.
У зараженных и контактных поросят течение болезни с выраженными
клиническими признаками АЧС отмечали у 12 из 14 голов. Поросята 3 и 8 выжили,
причем признаки заболевания не наблюдали до конца срока наблюдения (45 суток).
Таким образом, для штамма 8 №2/Одинцово-02/14 при заражающей дозе 10
ГАдЕ/гол и 50 ГАдЕ/гол наблюдались признаки, характерные для острой формы
течения болезни, у 2 животных, зараженных в дозе 10 и 50 ГАдЕ/гол, отсутствовали
клинические проявления, а летальность в данном эксперименте составила 85,6%.
Контрольное заражение. При постановке биопроб четыре подопытных
животных выжили: поросенок №0995, зараженный вирусом изолята Антоново 07/14 в
дозе 50 ГАдЕ на голову, подсвинок 15 (изолят Лысогорье 07/15) - 0,1ГАдЕ/гол, и 2
поросенка 3 и 8, зараженных вирусом штамма 8 №2/Одинцово-02/14. Контрольное
заражение провели путем внутримышечного введения вируса АЧС изолята Грибово
06/14 в дозе 1000 ГАдЕ/голову.
Так как гипертермии и других клинических проявлений не выявили, очевидно,
что у всех выживших животных выработался протективный иммунный ответ.
Иммуногистохимия. Локализация антигена возбудителя в тканях животных
выявлялась при окрашивании гистосрезов флуоресцентным или пероксидазным
конъюгатами с моноклональных антителами к белку р72 вируса АЧС.
А
Б
Рисунок 5. Иммуногистохимическое окрашевание гистосрезов.
Примечание: А – иммуфлуоресцентное окрашивание гистосреза подглоточного лимфоузла; Б - окрашивание
иммунопероксидазными препаратами гистосреза селезенки.
По результатам анализа срезов органов с использованием моноклональных
антител удалось выявить различие в локализации вируса АЧС в органах животных,
инфицированных вирусом АЧС изолята Лысогорье 07/15 и штамма 8 №2/Одинцово-
17
02/14: для изолята Лысогорье 07/15 максимальное скопление антигена выявлено в
подглоточных лифоузлах, а для штамма 8 №2/Одинцово-02/14 в корковом слое почек.
Таким
образом,
использование
иммуногистохимического
метода
для
исследования проб на наличие антигена вируса АЧС, наряду с ПЦР, благодаря высокой
чувствительности анализа, является подтверждающим тестом при постановке диагноза
в
сложных
случаях
и
позволяет
выявить
локализацию
вируса
в
органах
инфицированных животных.
Репродукция вируса АЧС в культуре клеток от переболевших и интактных
животных. Для выявления особенностей репродукции вируса использовали культуру
клеток КМС от поросенка №0995 из опыта с изолятом Антоново 07/14, культуру клеток
СС и КМС от поросят №№ 3 и 8 из опыта с штаммом 8 №2/Одинцово-02/14.
В результате проведенного эксперимента наблюдали появление гемадсорбции в
культуре клеток от поросенка №0995 на 12-24 часа ранее, чем в культуре клеток от
интактного животного. В культуре клеток СС от выживших свиней №3 и 8 (штамм 8
№2/Одинцово-02/14) гемадсорбирующая активность вируса проявилась через 16-24
часа ПИ. Через 48-72 часа ПИ наблюдали гемадсорбцию во флаконах с культурой
клеток от интактных животных.
Таким образом, наличие усиления репродукции вируса АЧС в культуре клеток
нашло свое подтверждение. Данный феномен объясняет еще одну причину тяжести
развития патогенеза при АЧС на клеточном уровне: антитела не только маскируют
вирус от воздействия эффекторов иммунитета, возможно, экспонированные на
мембране иммунокомпетентных клеток, поддерживающих репликацию
вируса,
способствуют ее ускорению и усилению.
Изучение динамики антителообразования при АЧС. При изучении динамики
антителообразования у поросенка № 0995 (изолят Антоново 07/14) использовали тестсистему ТФ ИФА производства ГНУ ВНИИВВиМ (Покров) и тест-систему ТФ ИФА с
использованием рекомбинантных белков (ФГБУ «ВНИИЗЖ»). Для сравнения приведен
анализ уровня антител у подсвинка № 0523, который имел самую длительную
продолжительность болезни для данного изолята - 14 суток (таблица 3).
18
Таблица 3 - Результаты выявления антител у животных, зараженных вирусом
АЧС изолята Антоново 07/14
n=3
Результаты
Тест-системы ТФ ИФА с рекомбинантными белками
Описание
Животное
(ФГБУ «ВНИИЗЖ»)
сыворотки
Смесь рекомбинантных
р30
pK205R
белков (p30+pK205R)
4 дн.п.з.
11,62
-3,15
-9,34
9 дн.п.з.
62,12
65,19
53,66
Подсвинок
12 дн.п.з.
69,23
74,59
67,43
№ 0995
16 дн.п.з.
78,47
74,80
69,14
21 дн.п.з.
85,50
92,53
70,42
24 дн.п.з.
94,31
95,73
72,88
–2,16
–3,27
12,64
Подсвинок 9 дн.п.з.
№ 0523
12 дн.п.з.
54,34
64,12
48,69
Примечание:
=
– проба положительная,
=
Набор ИФА
ГНУ
ВНИИВВиМ
(Покров)
0,106 о.е.
0,270 о.е.
0,300 о.е.
0,328 о.е.
0,453 о.е.
н.и.
0,04 о.е.
0,19 о.е
– проба отрицательная, «н.и.» - пробы не исследовались.
Из результатов, приведенных в таблице 3 видно, что антитела к вирусу АЧС
выявляются на 9 сутки после заражения у поросенка № 0995 и на 12 сутки у № 0523 в
тест-системе
ТФ
ИФА
с
использованием
набора
рекомбинантных
белков.
Исследование пробы сыворотки крови от подсвинка № 0523 на 12 день после
заражения с использованием набора ИФА ГНУ ВНИИВВиМ не дало положительного
результата.
Выявление специфических антител к трем белкам вируса АЧС производили
методом ТФ ИФА на 96 луночных планшетах, с сорбированными в лунках планшета
белками р30, р54 и р72.
Установлено, что в организме переболевших животных с характерными
симптомами и реже при признаках хронической и инаппарантной формы болезни,
антитела к р72 появляются раньше у животного с ярко выраженными симптомами АЧС
(опыт Антоново, №0995), чем антитела к р30. Максимальный уровень антител в
испытуемых сыворотках наблюдается, начиная с 12 суток для р72, и начинает
снижаться к 36 суткам (р54). При всех формах течения болезни выявляли высокий
уровень антител к белку р72 в длительные сроки наблюдения (до 72 дней). Кроме того,
высокий уровень антител к белку р54 регистрировали в течение всего периода
наблюдения при болезни с хроническими признаками (изолят Лысогорье 07/15).
Разработка тест-системы ИФА. Для выявления антител методом ТФ ИФА
необходимо подобрать многокомпонентный антиген, позволяющий выявлять антитела
в сыворотках крови больных и подозреваемых в инфицировании животных на ранних
стадиях заболевания. Для этого был подобран комплексный антиген, состоящий из
19
очищенного вируса АЧС и рекомбинантных белков.
В качестве вирусной составляющей был выбран изолят Одинцово 02/14, который
обладал способностью к репродукции в первичной культуре клеток СП, прошел 16
последовательных пассажей в этой культуре и получил название Одинцово-16.
В качестве рекомбинантной составляющей использовали рекомбинантные белки
р30, р54 и р72, накапливаемые в клетках E.coli BL21(DE3) pLysS (Promega). Данные
белки являются основными иммунологически значимыми белками вируса АЧС [P.
Gomez-Puertas, 1998].
В результате исследований подобрали рабочее соотношение компонентов ¼
часть очищенного вирусного антигена и ¾ части рекомбинантного белка. Для
определения оптимального разведения сывороток крови исследовали 80 проб
сывороток крови с разным уровнем антител. Зависимость lgT, выявленного методом
последовательных двукратных разведений, от lg S/P для каждой исследуемой
сыворотки в разведениях 1:40, 1:80 и 1:160 определили с помощью компьютерной
программы STATISTICA. В результате работы было определено оптимальное
разведение 1:80 (коэффициент корреляции R= 0,81627 со стандартной ошибкой 0,037).
Для определения позитивно-негативного порога исследовали 92 отрицательных
сыворотки крови (отрицательный результат в наборе Ingezim PPA COMPAC). Верхний
порог реакции составил 0,30 о.е., нижний порог реакции 0,20 о.е.
Специфичность и чувствительность разработанного метода сравнивали с
коммерческим набором Ingenasa, Ingezim PPA COMPAC (Испания). Исследовали 95
сывороток крови свиней, серонегативных по АЧС, и 17 сывороток крови от
экспериментально зараженных животных, содержащих антитела к вирусу АЧС.
Установили, что специфичность и чувствительность разрабатываемого метода
относительно коммерческого набора Ingezim PPA COMPAC (Испания) составила,
соответственно 97,89% и 100%.
Для наиболее полного изучения особенностей антителообразования при АЧС
провели
сравнительное
исследование
сывороток
крови
свиней,
зараженных
тестируемыми изолятами. Пробы сывороток исследовали в ТФ ИФА с использованием
комплексного антигена. Результаты постановки ИФА приведены в таблице:
20
Таблица 4 - Результаты ТФ ИФА с комплексным антигеном
n=3
Название изолята
Антоново 07/14
Лысогорье 07/14
8 №2/Одинцово02/14 (№3)
8 №2/Одинцово02/14 (№8)
4
7
0,07 0,12
0,09 0,08
9
0,34
0,11
11
0,41
0,52
Дни после заражения
14
15 17-18 21;22 24;28
0,87 н.и. 1,02
1,23
1,21
н.и. н.и. 0,83
1,45
1,51
32
н.и.
1,35
42;44
0,79
1,16
0,05 0,10
0,13
0,37
н.и.
1,05
1,34
1,40
0,66
0,57
п.о.
0,08 0,06
0,18
0,42
н.и.
0,98
1,04
1,42
0,81
0,63
п.о.
Примечание: «+» - результат положительный; «-» - результат отрицательный; «н.и.» - пробы не
исследовались; п.о. – пробы отсутствуют.
Как видно из данных, приведенных в таблице 5, применение комплексного
антигена в ТФ ИФА позволило выявить вирусспецифические антитела на 9 день после
заражения изолятом Антоново 07/14. В сыворотках от животных из опытов с другими
изолятами антитела регистрировались с 11 дня после заражения и далее при
последующих отборах проб.
Таким образом, для изучения патогенеза при АЧС интерес представляет
выявления антител с использованием отдельных рекомбинантных белков, а так же с
применением
комплексного
антигена.
Применение
комплексного
антигена
в
диагностических и мониторинговых целях позволяет выявлять антитела на ранних
стадиях болезни (начиная с 9 суток ПИ), как при остром, так и при инаппарантном
течении инфекции, поскольку в его состав входит более 10 мажорных белков вируса
АЧС.
3 ЗАКЛЮЧЕНИЕ
3.1 Выводы
1. Для повышения чувствительности реакции гемадсорбции отобрана первичная
культура клеток селезенки свиньи, использование которой позволяет выявить
наличие в пробе вируса АЧС на 12-24 часа ранее, чем в культуре клеток КМС.
2. Проведено выделение 7 изолятов вируса АЧС: Лазаревское 01/14, Антоново 07/14,
Грибово 06/14, Воронеж-Агро12/14, Лысогорье 07/15, Собинка 07/15 и Одинцово02/14 и определены их основные репродукционные характеристики в первичных
культурах клеток. Установлено, что максимальный уровень накопления в культуре
клеток КМС 7,56 и 7,64 lg ГАдЕ50/см3 отмечен для изолятов Воронеж-Агро 12/14 и
Собинка 07/15, соответственно.
3. Сравнительный анализ биологических свойств вируса АЧС при постановке
биопробы на свиньях показал, что при экспериментальном заражении изоляты
21
отличались по летальности: для изолятов Лазоревское 01/14, Грибово 06/14,
ВоронежАгро 12/14 и Собинка 07/15 – летальность составила 100%, Антоново 07/14
– 91,7%; Лысогорье 07/15 – 93,8%, а для штамма АЧС 8 №2/Одинцово-02/14 - 85,6%.
4. При заражении в дозах от 0,1 до 50 ГАдЕ/гол наблюдается четкая разница в
характере течения болезни. Для изолята Собинка 07/15 сроки наступления
летального исхода у поросят при их заражении в дозе 1 ГАдЕ/гол зафиксированы на
10-11 суток позднее, чем при заражении в дозе 10 ГАдЕ/гол. Для изолята Антоново
07/14 у выжившего после заражения в дозе 50 ГАдЕ/гол поросенка установлено
проявление признаков острой формы болезни; для изолята Лысогорье 07/14 у
выжившего поросенка (0,1 ГАдЕ/гол) отмечались признаки, характерные для
хронической формы АЧС, а для штамма АЧС 8 №2/Одинцово-02/14 у выживших
животных (10-50 ГАдЕ/гол) установлено отсутствие проявления клинических
признаков болезни.
5. Методом ИГХ установлено различие в локализации скоплений вируса АЧС в органах
и тканях экспериментально зараженных животных. Для изолята Лысогорье 07/15
наблюдалось максимальное скопление вирусного антигена в паракортикальной ткани
лимфоузлов, а также в паренхиме селезенки, для штамма АЧС 8 №2/Одинцово-02/14
- в паренхиме селезенки и в корковом слое почек.
6. При изучении репродукции вируса на первичных культурах клеток от выживших
поросят был выявлен феномен усиления инфекционного процесса, причем
гемадсорбция проявлялась на 24-48 часа раньше по сравнению с культурой клеток от
интактных животных.
7. Определены сроки появления антител в сыворотках крови выживших животных к
основным иммунологически значимым белкам вируса АЧС: к р30 – 9-11 день, к р54 7-9 день и к р72- 7-9 день, а также установлена взаимосвязь динамики появления
антител к белкам р54, р30 и р72 вируса АЧС и длительности течения болезни.
8. На основе комплексного антигена, состоящего из рекомбинантных белков и
очищенного культурального вируса АЧС, разработана тест-система обнаружения
антител к вирусу АЧС в сыворотках крови свиней методом непрямого ТФ ИФА.
Метод
позволяет
экспериментального
выявлять
антитела
заражения.
к
вирусу
Чувствительность
АЧС
и
на
9
день
специфичность
после
метода
относительно коммерческого набора INGEZIM PPA COMPAC (Испания) составила,
100% и 97,89%, соответственно.
3.2 Практические предложения.
22
Разработанные методические рекомендации могут быть использованы в
лабораторной практике при диагностических исследованиях на АЧС.
Разработанную тест-систему ТФ ИФА для обнаружения антител к вирусу АЧС в
сыворотках
крови
свиней
рекомендуется
использовать
для
мониторинговых
исследований при анализе сывороток и при проведении биопроб.
Депонированные в КШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» штамм 8 №2/Одинцово-02/14 и
штамм
АЧС/Собинка
07/15
предлагается
использовать
в
рамках
научно-
исследовательских работ по изучению иммунного ответа при АЧС, а также для
разработки диагностических и защитных препаратов.
3.3 Перспективы дальнейшей разработки темы. Одним из основных
направлений данной темы являлось изучение особенностей репродукции на клеточном
и организменном уровне, а также изучение некоторых аспектов иммуногенеза при
АЧС. Полученные результаты могут служить отправной точкой для изучения
изменчивости вируса АЧС, в частности, снижения вирулентности и особенностей
антителообразования, что необходимо при разработке подходов к созданию средств
специфической профилактики и эрадикации АЧС на территории РФ.
4 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Бурба, Л.Г. Патоморфология экспериментальной африканской чумы свиней / Л.Г. Бурба // Тез.
докл. Научно-произв. конф. «Болезни свиней». – Киев, 1967. – С. 22-24.
2. ГОСТ 28573-90. Свиньи. Методы лабораторной диагностики африканской чумы. – М.:
Стандартинформ, 2005. – 10 с.
3. Клинические признаки и патоморфологические изменения у домашних свиней при подостром
течении африканской чумы свиней на территории российской федерации / С.А. Белянин [и др.] //
Ветеринарная патология. – 2011. - № 4.
4. Макаров, В.В. Иммунологическая концепция африканской чумы // В.В. Макаров //
Ветеринарная практика. – 2013. - №3. – С. 7-22.
5. Методические рекомендации по оценке клинических признаков и патологоанатомических
изменений при экспериментальном заражении вирусом африканской чумы свиней / А.С. Першин
[и др.] // ФГБУ «ВНИИЗЖ». – Владимир, 2015. – 21 с.
6. Популяционная структура вируса африканской чумы свиней по признаку количественной
гемадсорбции / В.В. Макаров [и др.] // Вопросы вирусологии. – 1991. – Т. 4. – С. 321-324.
7. Реакция гемадсорбции и задержки гемадсорбции при АЧС / И.Ф. Вишняков [и др.], // Вопросы
ветиринарной вирусологии и эпизоотологии. Диагностика АЧС: материалы научной конференции
ВНИИВиМ. – Покров, 1995. -Часть 1. - С. 57 – 62.
8. Сероиммунологическая классификация природных изолятов вируса африканской чумы свиней /
И.Ф. Вишняков [и др.] // Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии: материалы научнопракт, конф. ВНИИВВиМ «Классическая чума свиней – неотложные проблемы науки и
практики». – Покров, 1995. – С.141-143.
9. Эпизоотическая ситуация по АЧС в РФ и странах восточной Европы (по данным МЭБ на
27.10.2017 г.) [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.fsvps.ru/fsvpsdocs/ru/iac/asf/2017/10-27/05.pdf (проверено 30.10.2017)
10. 20. OIE Terrestrial Manual. African swine fever. – 2012. - Section 2.8. - Chapter 2.8.1. - P. 3.
11. African swine fever virus serodiagnosis: a general review with a focus on the analyses of African
serum samples / Cubillos C., [et al.] // Virus Res. – 2013. - №.173 (1). –Р.159-67.
12. African swine fever. Ed. Becker Y., 1989.
23
13. Gallardo C. [at all]. Experimental Infection of Domestic Pigs with African Swine Fever Virus
Lithuania 2014 Genotype II Field Isolate // Transboundary and Emerging Diseases.
14. Genetic variation among African swine fever genotype II Viruses, Eastern and Central Europe / C.
Gallardo [et al] // Emerging Infectious Dis. – 2014. – Vol. 20, № 9. – P. 1544-1547.
15. Immunofluorescence Plaque Assay for African Swine Fever Virus / Tessler, J. [et al.] // Can. J.
comp. Med. – 1974. - Vol. 38, - P. 443 – 447.
16. Pathogenesis of highly virulent African swine fever virus in domestic pigs exposed via
intraoropharyngeal, intranasopharyngeal, andintramuscular inoculation, and by direct contact with
infected pigs / E.B. Howey [et al.] // Virus Research. – 2013. – Vol.178. – P.328-339.
17. Trautman R., Pan I.C., Hess W.R. Sedimentation coefficient of African swine fever virus // American
journal of veterinary research. – 1980. – V. 41. – №. 11. – P. 1874-1878.
5 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ АВТОРОМ
ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Выявление клинико-анатомических, гистологических изменений при АЧС и локализации вируса
в органах инфицированных животных / И.Ю. Жуков, И.В. Шевченко, А.С. Иголкин, А.В. Борисова,
А.А. Егоров, В.В. Цибезов, О.А. Верховский, Н.Н. Власова // Рос. вет. журн. С.-х. животные. –
2015. – № 3. – С. 36-39.
2. Изучение репродукции вируса африканской чумы свиней на первичной культуре клеток
костного мозга свиней до и после криоконсервирования / И.Ю. Жуков, И.В. Шевченко, Н.Н.
Власова, А.А. Варенцова, Б.Л. Манин, О.С. Пузанкова, В.Л. Гаврилова, А.С. Иголкин //
Ветеринария сегодня. – 2016. – № 1. – С. 7-15.
3. О реализации плана мероприятий по предупреждению распространения и ликвидации вируса
африканской чумы свиней на территории Российской Федерации в 2013 году / И.В. Шевченко,
И.Ю. Жуков, А.С. Иголкин, К.Н. Груздев // Ветеринария Кубани. – 2014. – № 5. – С. 21-23.
4. Репродукция изолята Антоново 07/14 вируса африканской чумы свиней in vivo и in vitro / О. С.
Пузанкова, А. А. Варенцова, И. Ю. Жуков [и др.] // Ветеринария. - 2016. - № 5. - С. 18-24.
5. Сравнительный анализ репродукционных свойств вируса африканской чумы свиней изолята
Одинцово 02/14 в первичных культурах клеток / Д. В. Шарыпова [и др.] // Ветеринария сегодня. 2017. - № 1. - С. 5-12.
6. Comparative analysis of molecular and biological properties of African swine fever virus isolates
collected in 2013 from Russian Federation / N. Vlasova, A. Varentsova, I. Shevchenko, I. Zhukov, S.
Remyga, V. Gavrilova, O. Puzankova, A. Shevtsov, N. Zinyakov, K. Gruzdev, A. Igolkin, V. Drygin //
EPIZONE: Abstr. 8th Annu. EPIZONE Meet. "Primed for tomorrow". – Frideriksberg, 2014. – P. 85.
7. Detection of African Swine Fever Antibodies in Experimental and Field Samples from the Russian
Federation: Implications for Control / L. Mur, A. Igolkin, A. Varentsova, A. Pershin, S. Remyga, I.
Shevchenko, I. Zhukov, J. M. Sanchez-Vizcaino // Transboundary and Emerging Diseases. – 2016. – Vol.
63, № 5. – P. 436-440.
8. Comparative analysis of clinical and biological characteristics of African swine fever virus isolates from
2013 year Russian Federation / N.N. Vlasova, A.A. Varentsova, I.V. Shevchenko, I.Yu. Zhukov, S.G.
Remyga, V.L. Gavrilova, O.S. Puzankova, A.A. Shevtsov, N.G. Zinyakov, K.N. Gruzdev // British
Microbiology Research J. – 2015. – Vol. 5, № 3. – P. 203-215.
_____________________________________________________________________________________
Подписано в печать 16 марта 2018 г.
Формат 60×90 1/16. Усл. печ. л.1.
Тираж 80 экз
Отпечатано на полиграфической базе
ФГБУ«Федеральный центр охраны здоровья животных».
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа