close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Исследование халькоцианидных октаэдрических кластерных комплексов рения и выявление наиболее перспективного соединения для разработки новых люминесцентных и рентгеноконтрастных диагностических препаратов

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Красильникова Анна Анатольевна
ИССЛЕДОВАНИЕ ХАЛЬКОЦИАНИДНЫХ ОКТАЭДРИЧЕСКИХ
КЛАСТЕРНЫХ КОМПЛЕКСОВ РЕНИЯ И ВЫЯВЛЕНИЕ НАИБОЛЕЕ
ПЕРСПЕКТИВНОГО СОЕДИНЕНИЯ ДЛЯ РАЗРАБОТКИ НОВЫХ
ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ И РЕНТГЕНОКОНТРАСТНЫХ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ
ПРЕПАРАТОВ
14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология
Автореферат
на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Томск – 2018
Работа выполнена в Федеральном государственном автономном образовательном
учреждении высшего образования «Новосибирский национальный исследовательский
государственный университет» Министерства науки и высшего образования Российской
Федерации
Научный руководитель:
Шестопалова Лидия Владимировна, доктор
биологических наук, профессор
Официальные оппоненты:
Толстикова Татьяна Генриховна, доктор биологических наук, профессор,
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Новосибирский институт
органической химии им. Н.Н. Ворожцова Сибирского отделения Российской академии
наук, отдел медицинской химии, лаборатория фармакологических исследований,
заведующая лабораторией.
Мильто Иван Васильевич, доктор биологических наук, профессор, Федеральное
государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования
«Сибирский
государственный
медицинский
университет»
Министерства
здравоохранения Российской Федерации, кафедра морфологии и общей патологии,
профессор кафедры.
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное
учреждение высшего образования «Новосибирский государственный медицинский
университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Новосибирск.
Защита состоится «___» _____________201_ г. в ___ часов на заседании
диссертационного совета Д 002.279.03, созданного на базе Федерального
государственного бюджетного научного учреждения «Томский национальный
исследовательский медицинский центр Российской академии наук», по адресу: г. Томск,
пр. Ленина, 3, Научно-исследовательский институт фармакологии и регенеративной
медицины имени Е.Д. Гольдберга
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального
государственного бюджетного научного учреждения «Томский национальный
исследовательский медицинский центр Российской академии наук», адрес сайта
http://www.tnimc.ru.
Автореферат разослан «___» _____________201_ г.
Учёный секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук,
профессор РАН
Удут Елена Владимировна
1
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования
Несмотря
на
большое
количество
исследований,
посвященных
рентгеноконтрастным препаратам для функциональной диагностики [Caltagirone et al.,
2015; Cole et al., 2015; Taupin et al., 2015; Nakamura et al., 2016], до сих пор не удалось
синтезировать контрастное вещество, которое бы сочетало в себе только положительные
качества, то есть обладало высокой гидрофильностью и растворимостью, небольшой
вязкостью и низкой осмолярностью, при этом молекулы которого содержали бы
большое количество атомов тяжелого элемента, необходимых для получения высокого
качества изображения [Andreucci, Solomon, Tasanarong, 2014]. Октаэдрические
кластерные комплексы рения способны поглощать рентгеновские лучи за счет высокой
локальной концентрации атомов тяжелого элемента в составе кластерного ядра [Ivanov
et al., 2014]. Они характеризуются высокой химической и термической устойчивостью
[Mironov et al., 2006], демонстрируя тем самым потенциал для применения в медицине в
качестве рентгеноконтрастных препаратов. По количеству атомов тяжелого металла
кластерные комплексы рения оказываются безусловными лидерами среди всех
контрастных веществ, которые применяются в настоящее время, поскольку в их состав
входит 6 ковалентно связанных атомов тяжелого металла (Re). Тогда как йогексол
(коммерческий рентгеноконтрастный препарат на основе трийодбензола, который
широко применяется в сердечно-сосудистой хирургии и функциональной диагностике)
содержит всего лишь 3 атома йода, отвечающие за рентгеноконтрастные свойства.
Можно предположить, что при равной концентрации тяжелого элемента препарат на
основе кластерного комплекса будет значительно превосходить йодные аналоги по
качеству контрастного изображения, что позволит снизить концентрацию тяжелого
элемента в препарате и приведет к уменьшению частоты побочных эффектов при
применении рентгеноконтрастных соединений.
В современной ортопедической практике активно используют биодеградируемые
полимеры благодаря их гипоаллергентности и биосовместимости, а также возможности
изменять их физические свойства [Doppalapudi et al., 2014; Gavasane, Pawar, 2014].
Недостатком, затрудняющим работу с этими полимерами, является невозможность
отследить процесс деградации имплантата, поскольку с помощью рентгена полимеры не
выявляются. Решением этой проблемы может стать добавление в состав полимера
рентгеноконтрастных соединений. Для этой цели подходят кластерные комплексы
рения, поскольку они обладают высокой рентгеноконтрастностью и лабильностью
лигандного окружения, что может обеспечить их связывание с полимерной матрицей
имплантата.
Октаэдрические кластерные комплексы рения проявляют яркую долгоживущую
люминесценцию в области от ~500 до ~1000 нм. Соединения, проявляющие
фотолюминесценцию именно в данном диапазоне длин волн, очень привлекательны для
использования в биоимиджинге, поскольку в этой области наблюдается минимум
абсорбции и низкая интенсивность автофлуоресценции биологических тканей [Day,
2
Davidson, 2009; Wu et al., 2015]. Люминесцентные свойства кластерных комплексов
рения определяют возможность их использования в качестве биомаркера в
фундаментальных и прикладных исследованиях на культурах клеток с использованием
конфокальной микроскопии. Люминесцентные свойства кластерных комплексов могут
быть также использованы для диагностики опухолей, а также для визуализации их
регрессии во время лечения [Echeverría et al., 2012].
Еще одной областью применения кластерных комплексов рения может стать
противоопухолевая фотодинамическая терапия, поскольку кластерные комплексы рения
способны генерировать синглетный кислород под действием УФ-излучения [Brylev et al.,
2009; Kirakci et al., 2013; Shestopalov et al., 2007; Shestopalov et al., 2014].
Благодаря своим рентгеноконтрастным, люминесцентным свойствам, а также
способности генерировать синглетный кислород октаэдрические кластерные комплексы
рения могут найти применение в таких активно развивающихся и высокотехнологичных
областях медицины, как лучевая диагностика, фотодинамическая терапия, ортопедия и
травматология, а также в области фундаментальных биологических исследований
[Sokolov et al. 2011; Kirakci et al 2012; Gandubert et al. 2013; Cordier et al. 2014; Ledneva et
al. 2014]. Однако, в настоящее время практически не изучено их влияние на живые
организмы. Таким образом, исследование влияния кластерных комплексов рения на
клетки в культуре и на организм животных in vivo, сравнение степени их безопасности и
рентгеноконтрастных свойств является важной и актуальной задачей.
Степень разработанности темы исследования
Несмотря на то, что химические и физические свойства октаэдрических
кластерных комплексов рения достаточно хорошо изучены, на момент планирования
диссертационного исследования было опубликовано всего две работы, посвященные
изучению влияния кластерных комплексов рения на клетки в культуре [Choi et al. 2008;
Echeverrıґa et al. 2012], а публикации, описывающие влияние комплексов на живые
организмы in vivo, отсутствовали. Не было известно, влияет ли характер внутреннего
лиганда на биологические эффекты кластерных комплексов, и не было проведено
сравнения рентгеноконтрастных свойств комплексов как между собой, так и с
используемыми в настоящее время в клинической практике сосудистыми
рентгеноконтрастными препаратами. В связи с этим были сформулированы цель и
задачи исследования.
Цель исследования
Изучить рентгеноконтрастные свойства октаэдрических халькоцианидных
кластерных комплексов рения и выбрать наиболее эффективное и безопасное
соединение для разработки на его основе диагностических люминесцентных и
рентгеноконтрастных препаратов.
Задачи исследования
1.
Сравнить рентгеновскую контрастность октаэдрических кластерных
комплексов рения с различными внутренними лигандами (S, Se, Te) между собой и с
коммерческим рентгеноконтрастным препаратом на основе трийодбензола;
3
2.
Сравнить при помощи МТТ-теста цитотоксичность соединений
Na4[{Re6S8}(CN)6], Na4[{Re6Se8}(CN)6], Na4[{Re6Te8}(CN)6] на культурах опухолевых
(Hep-2) и диплоидных (MRC-5) клеток человека in vitro;
3.
На культуре клеток Hep-2 оценить способность данных кластерных
комплексов рения проникать внутрь клеток in vitro и установить их внутриклеточную
локализацию;
4.
Определить полулетальную дозу (ЛД50) и исследовать острую токсичность
in vivo при внутривенном введении наиболее рентгеноконтрастного и безопасного для
клеток в культуре кластерного комплекса;
5. Оценить возможность использования октаэдрических кластерных комплексов
рения в качестве сосудистого рентгеноконтрастного препарата.
Научная новизна
Впервые при сравнительном изучении октаэдрических кластерных комплексов
рения обнаружено, что по уровню рентгеновской контрастности данные соединения в
несколько раз превосходят коммерческий рентгеноконтрастный препарат на основе
трийодбензола. При исследовании цитотоксичности халькоцианидных комплексов рения
(Na4[{Re6S8}(CN)6], Na4[{Re6Se8}(CN)6] и Na4[{Re6Te8}(CN)6]) с помощью МТТ-теста и
оценке их способности проникать внутрь клеток in vitro показано, что комплекс
Na4[{Re6Te8}(CN)6] наиболее перспективен для биомедицинского применения. Для
данного соединения была определена полулетальная доза и исследована острая
токсичность на мышах линии Balb/C. Показана высокая степень безопасности при
однократном внутривенном введении в дозах до 300 мг(Re)/кг. При проведении
ангиографии с использованием Na4[{Re6Te8}(CN)6] в качестве сосудистого
рентгеноконтрастного препарата получены высоко контрастные снимки, на которых
хорошо визуализируются сосуды животного. Результаты проведенного исследования
свидетельствуют о перспективности использования октаэдрических кластерных
комплексов рения в качестве основы для разработки новых диагностических препаратов.
Теоретическая и практическая значимость
В результате проведенного исследования получены новые фундаментальные
знания о влиянии характера внутреннего лиганда на уровень безопасности
октаэдрических кластерных комплексов рения и степень их рентгеноконтрастности.
Выявлено, что кластерный комплекс на основе кластерного ядра {Re6Te8} не только
наиболее рентгеноконтрастен, но и наиболее безопасен для клеток в культуре. Все три
исследованных соединения рения способны проникать в клетки in vitro и диффузно
распределяться по цитоплазме клеток. При исследовании острой токсичности комплекса
Na4[{Re6Te8}(CN)6] in vivo показна высокая степень безопасности для животных при
внутривенном введении в дозах до 300 мг(Re)/кг, что делает данный комплекс наиболее
перспективным для дальнейшей разработки на его основе препаратов для
фотодинамической терапии, рентгеноконтрастных добавок в биодеградируемые
имплантаты, контрастирующих реагентов для просвечивающей электронной
микроскопии, а также биомаркеров.
4
Методология и методы исследования
В соответствии с поставленными задачами были выбраны современные
высокоинформативные методические подходы. Диссертационная работа представляет
собой экспериментальное исследование, выполненное на двух культурах клеток (Hep-2 и
MRC-5) и 82 животных (мышах линии Balb/C и самцах крыс породы Wistar). Для
сравнения рентгеноконтрастных свойств кластерных комплексов использовали
компьютерный томограф Brivo CT325 (GE Healthcare, Великобритания) и рентгеновский
аппарат типа С-дуга GE 9800-Cardio (General Electric, США). Клеточные линии были
получены из коллекции ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», цитотоксичность исследовали при
помощи МТТ-теста, значение оптической плотности измеряли при помощи
микропланшетного фотометра Multiskan FC (Thermo Scientific, США). Исследование
способности комплексов проникать в клетки в культуре проводили при помощи
лазерного сканирующего конфокального флуоресцентного микроскопа Zeiss LSM 510
(Zeiss, Германия) и просвечивающего электронного микроскопа Libra 120 (Zeiss,
Германия). Расчет значения ЛД50 в остром эксперименте in vivo при внутривенном
введении проводили при помощи пакета MS Excel. Биохимический анализ крови
осуществляли при помощи автоматического биохимического анализатора AU 480
(Becman Coulter, США), общий анализ крови – при помощи автоматического
гемоанализатора XT-4000i (Sysmex, Япония). Гистологические препараты исследовали с
использованием оптического микроскопа AxioStar plus (Zeiss, Германия).
Культивирование клеток и пробоподготовку клеточных культур и образцов внутренних
органов животных для микроскопических исследований проводили по стандартным
методикам. Полученные результаты были обработаны статистически при помощи пакета
программ Statistica 10 Enterprise (StatSoft).
Положения, выносимые на защиту
1. Уровень рентгеновской контрастности халькоцианидных октаэдрических
кластерных комплексов рения превосходит рентгеноконтрастность коммерческого
органического йодсодержащего препарата при сравнении в равных молярных
концентрациях;
2. Наиболее безопасным комплексом для клеток in vitro является
Na4[{Re6Te8}(CN)6];
3. Все три исследуемых кластерных комплекса способны проникать в клетки in
vitro и диффузно распределяться в цитоплазме;
4. Показана высокая степень безопасности внутривенного введения различных доз
Na4[{Re6Te8}(CN)6] in vivo;
5. Внутривенное введение октаэдрического кластерного комплекса рения
Na4[{Re6Te8}(CN)6] позволяет получить четкие изображения сосудистого русла
экспериментального животного при ангиографическом исследовании.
Степень достоверности и апробация результатов диссертации
Высокая степень достоверности полученных результатов подтверждается
достаточным объемом экспериментального материала и использованием современных
5
методов, соответствующих поставленным задачам. Выводы, сформулированные в
диссертации, подтверждены экспериментальным материалом, анализом литературы,
точностью статистической обработки полученных результатов.
Материалы диссертации были представлены на 2-м международном форуме
«Инновации в медицине: основные проблемы и пути их решения. Высокотехнологичная
медицина как элемент инновационной экономики» (Новосибирск, 2013), на 51-й и 53-й
международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический
прогресс» (Новосибирск, 2013 и 2015), на международной научно-практической
конференции «Наука в современном информационном обществе» (Москва, 2013), на
школе-конференции молодых ученых "Неорганические соединения и функциональные
материалы", посвященная памяти профессора С.В. Земского (Новосибирск, 2013), на 4-м
международном семинаре по кластерам переходных металлов (IWTMC–IV)
(Новосибирск, 2014), на 8-м международном симпозиуме по технецию и рению (Ла Боль,
Франция, 2014), на 24-й международной Чугаевской конференции по координационной
химии (Казань, 2014), на 16-м международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI
веке: Достижения и перспективы современной российской и мировой науки» (Москва,
2014), на 18-ой международной медико-биологической конференции молодых
исследователей, посвященная двадцатилетию медицинского факультета СПбГУ (СанктПетербург, 2015), на 9-й международной конференции молодых ученых по химии
«Менделеев 2015» (Санкт-Петербург, 2015), на 2-й международной конференции по
современному применению нанотехнологий (Минск, Беларусь, 2015), на городской
научно-практической конференции «Успешные проекты молодых ученых для города
Новосибирска» (Новосибирск, 2015), на русско-корейской конференции по медицинской
химии (МедХем-2015) (Новосибирск, 2015), на 45-м всемирном химическом конгрессе
(IUPAC-2015) (Пусан, Республика Корея, 2015), на XII международной конференции,
посвященной 25-летию Научно-исследовательского института клинической и
экспериментальной лимфологии «Лимфология: от фундаментальных исследований к
медицинским технологиям» (Новосибирск, 2016), на XIII Международной конференции
студентов, аспирантов и молодых ученых «Перспективы развития фундаментальных
наук» (Томск, 2016), на Международном семинаре «CLUSPOM-Алтай» по кластерам
металлов и полиоксометаллатам (Алтайский край, 2016), на Международной
конференции CLUSPOM-1 (Рейн, Франция), на 42-ой Международной конференции по
координационной химии (Брест, Франция, 2016) и на V молодежной конференции по
молекулярной и клеточной биологии Института цитологии (Санкт-Петербург, 2016).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 33 работы, из них 2 статьи в международных
изданиях, включенных в систему цитирования Web of Science, 1 статья в рецензируемом
журнале из перечня ВАК Минобрнауки России, рекомендованном для публикации
основных результатов кандидатских и докторских диссертаций, а также 30 тезисных
работ в материалах региональных, всероссийских и международных конференций.
6
Объем и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и
методов, результатов собственных исследований, обсуждения и заключения, а также
выводов и списка цитируемой литературы, в котором содержится 191 источник, из них 8
отечественных и 183 иностранных. Работа изложена на 120 страницах машинописного
текста, содержит 9 таблиц и 32 рисунка.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении обоснована актуальность темы диссертации, сформулированы цель и
задачи исследования, научная новизна, теоретическая и практическая значимость
работы.
В первой главе проведен анализ отечественной и зарубежной научной
литературы по теме исследования. Описана структура и физико-химические свойства
металлокластерных комплексов. Рассмотрены перспективы их применения в различных
областях медицины и биологии, таких как функциональная диагностика, ортопедия и
травматология, фотодинамическая терапия и онкология, просвечивающая электронная
микроскопия. В последнем разделе главы проведен анализ работ, посвященных
изучению биологических эффектов кластерных комплексов рения и опубликованных на
момент планирования диссертационного исследования.
Вторая глава диссертации посвящена описанию материалов и методов
исследования. Используемые в работе октаэдрические кластерные комплексы рения
были предоставлены сотрудниками лаборатории синтеза кластерных соединений и
материалов Института неорганической химии СО РАН к.х.н. Шестопаловым М.А. и
Ивановым А.А. Полученные соединения растворяли в дистиллированной воде и
стерилизовали, рН полученных растворов доводили до 7,4.
Для
оценки
рентгеновской
контрастности
кластерных
комплексов
(Na4[{Re6S8}(CN)6], Na4[{Re6Se8}(CN)6] и Na4[{Re6Te8}(CN)6]) в 96-луночный
культуральный планшет были раскапаны водные растворы данных соединений с
равными молярными концентрациями (0,131 М) и с последующим двукратным
разведением растворов вплоть до концентраций, равных 1/32 от исходных (0,004 М). Для
сравнения в равных молярных концентрациях был раскапан известный
рентгеноконтрастный органический препарат на основе 1,3,5-трийодбензола – йогексол
(Омнипак™, GE Healthcare, Великобритания), а также в отдельных лунках находились
дистиллированная вода и воздух для контроля точности проводимого эксперимента.
Снимки планшета были получены при помощи компьютерного томографа Brivo CT325
(GE Healthcare, Великобритания), параметры сканирования: 120 kVp и 80 mA, время
сканирования 70–74 сек, а также ангиографической установки GE 9800-Cardio (General
Electric, США) на базе ФГБУ «НМИЦ им. акад. Е.Н. Мешалкина» Минздрава РФ.
Значения рентеноконтрастности кластерных комплексов в единицах Хаунсфилда были
определены из массива данных, полученных на компьютерном томографе, с помощью
программы
eFilmWorkstation®
3.4.
Данные
получены
при
усреднении
2
рентгеноконтрастности в окружности площадью 2 см .
7
Линия клеток аденокарциномы гортани человека (Hep-2) и линия диплоидных
клеток легких эмбриона человека (MRC-5) получены из коллекции ФБУН ГНЦ ВБ
«Вектор». Клетки выращивали в ростовой питательной среде Игла МЕМ с содержанием
10% сыворотки крови плодов коровы, 200 мМ L-глютамина, 40 мкг/мл гентамицина в
CO2 инкубаторе при 37оС. Посевная концентрация составляла (0,5-1,0)х106 клеток в 1 мл,
кратность рассева 1:3, клетки пересевали каждые 3–4 суток. Для пересева культур клеток
в качестве диспергента применяли 0,25%-ный раствор трипсина (ФБУН ГНЦ ВБ
«Вектор», Россия) и 0,02%-ный раствор версена (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Россия) в
соотношении 1:2.
Цитотоксичность кластерных комплексов оценивали с помощью МТТ-теста,
позволяющего выявить количество жизнеспособных клеток по изменению оптической
плотности раствора. Клетки культур Hep-2 и MRC-5 рассевали в 96-луночные
культуральные планшеты в концентрации 5-7х103 клеток/лунку, инкубировали в течение
24 часов при 37оС в увлажненной атмосфере, содержащей 5% двуокиси углерода
(стандартные условия). Далее в планшеты вносили синтезированные вещества в
широком диапазоне концентраций (от 3,90 мкМ до 1000 мкМ, двойные разведения) и
совместно культивировали в течение 48 часов при стандартных условиях
культивирования. В качестве контроля использовались лунки с клетками Hep-2 и MRC-5
с питательной средой без добавления препарата. Затем в каждую лунку добавляли МТТреагент в конечной концентрации 250 мкг/мл, инкубировали клетки в течение 4 часов,
далее среду отбирали и добавляли по 100 мкл ДМСО в каждую лунку. После
растворения кристаллов формазана (через 5-10 мин) снимали значения оптической
плотности субстрата в лунках с помощью микропланшетного фотометра Multiskan FC
(Thermo Scientific, США) при длине волны 492 нм. Процент жизнеспособных
опухолевых клеток вычисляли по формуле: (оптическая плотность раствора опыта /
оптическая плотность раствора контроля) х 100%. В качестве критерия цитотоксичности
соединений использовали величину ИК50 (концентрация полумаксимального
ингибирования) для ее расчета строили кривую зависимости ингибирования
пролиферации от концентрации исследованного комплекса. Эксперимент повторяли
трижды в разные дни. Статистическая обработка данных проводилась c использованием
U-критерия Манна-Уитни, порог статистической значимости был установлен на уровне p
< 0,05.
Для исследования проникновения кластерных комплексов в клетки in vitro при
помощи лазерной сканирующей флуоресцентной конфокальной микроскопии клетки
Hep-2 культивировали на покровных стеклах в концентрации 1х10 5 клеток/стекло в
течение 24 часов при стандартных условиях культивирования. Затем питательную среду
заменяли культуральной средой, содержащей 100 мкМ Na4[{Re6S8}(CN)6], 100 мкМ
Na4[{Re6Se8}(CN)6] или 100 мкМ Na4[{Re6Te8}(CN)6], и инкубировали в течение 24
часов. После чего клетки промывали фосфатно-солевым буфером и фиксировали 4%
параформальдегидом рН = 7,3–7,4. Фиксированные клетки оценивали с помощью
лазерного сканирующего конфокального флуоресцентного микроскопа Zeiss LSM 510
(Zeiss, Германия) с использованием диодного лазера 405 нм.
Для исследования проникновения кластерных комплексов в клетки in vitro при
помощи просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) клетки культуры Hep-2
8
высевали на культуральные матрасы (площадью 25 см2) в концентрации 70 тыс. кл./мл в
10 мл среды и инкубировали в течение 24 ч. По истечении этого времени среду заменяли
и добавляли подготовленные растворы кластерных комплексов до концентрации в среде
100 мкМ, после чего клетки инкубировали 24 ч. Далее работу проводили согласно
протоколу пробоподготовки клеточных культур к исследованию на ПЭМ [Schrand et al.,
2010]. По окончании инкубации культуру клеток снимали с помощью трипсина, который
инактивировали 2 мл среды с 10% сыворотки, переносили в пластиковые капсулы
объемом 1 мл (при этом в каждой капсуле оказывалось примерно по 1*10 6 кл) и
центрифугировали (1000 об/мин, 5 мин). Полученные осадки клеток фиксировали
раствором 2,5% глутаральдегида в течение 2 ч. Фиксированные осадки трижды
промывали PBS (рН = 7,4) по 10 мин и дополнительно фиксировали 1% раствором OsO4
в течение 1 ч. Затем осадки промывали PBS 5 раз по 10 мин и дважды дистиллированной
водой 2 раза по 10 мин. Затем последовательно проводили по спиртам восходящей
концентрации (50, 70, 90 и 100%) по 5-15 мин в каждом (в 70% спирте образцы
находились в течение ночи). Затем образцы помещали в ацетон на 15 мин. Далее осадки
на 3 ч оставляли в пропиточной смеси (смесь ацетона с заливочной смесью, состоящей
из эпоксидных смол, в соотношении 1:1). Для приготовления заливочной смеси
смешивали 3 мл Araldite М (Fluka, Швейцария), 5 мл Epon 812 (Fluka, Швейцария) и 11
мл DDSA (Fluka, Швейцария). Далее образцы помещали в заливочную смесь с
добавлением катализатора (DMP 30 (Fluka, Швейцария), 100 мкл на 5 мл смолы). Для
полимеризации образцы выдерживали 3 ч при 30оС, 3 ч при 42оС и 2 суток при 60оС. На
ультрамикротоме EMUC 7 (Leica, Германия) делали ультратонкие срезы толщиной 70
нм. Ультратонкие срезы изучали при помощи ПЭМ Libra 120 (Zeiss, Германия),
документировали при помощи цифровой камеры и программного обеспечения iTEM
версия 5.2 (Jeol, Япония). Элементный анализ проводили при помощи омега-фильтра и
специального программного обеспечения по методике трех окон, описанных в
литературе [Egerton, 2009].
В экспериментах in vivo использовали 8-ми недельных самок и самцов мышей
линии Balb/C, с массой тела 20±2 г. Общее количество экспериментальных животных –
70 шт: 7 групп по 10 животных (5 самцов и 5 самок в каждой). Мыши были
предоставлены виварием ФГБНУ «Научно-исследовательского института клинической и
экспериментальной лимфологии (НИИКЭЛ)». Животных содержали в виварии ФГБУ
«НМИЦ им. акад. Е.Н. Мешалкина» Минздрава РФ, в стандартных условиях, со
свободным доступом к коммерческому корму и воде.
Все работы по исследованию острой токсичности проводили в соответствии с
этическими нормами обращения с лабораторными животными (директива 2010/63/eu
европейского парламента и совета по защите животных, используемых в научных целях
от 22 сентября 2010), в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией
о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных
научных целей [European Convention, 1986] и Приказом Минздравсоцразвития РФ
№708н от 23 августа 2010 г. «Об утверждении правил лабораторной практики».
Протоколы исследований с использованием животных были одобрены локальным
этическим комитетом ФГБУ «НМИЦ им. акад. Е.Н. Мешалкина» Минздрава РФ
(протокол № 46 от 6 марта 2015 года).
9
Для определения ЛД50 группам из 10 мышей внутривенно вводили 0,1 мл раствора
комплекса Na4[{Re6Te8}(CN)6] в различных дозах (50, 150, 300, 500, 650 и 750 мг(Re)/кг).
Контрольной группе внутривенно вводили 0,1 мл физиологического раствора. Все
вводимые растворы были стерильны, имели pH = 7,4 и вводились в боковую вену хвоста.
За мышами вели наблюдение в течение двух недель, фиксировали смертность,
отклонения в поведении, изменения веса тела. Для исследования острой токсичности
раствора комплекса Na4[{Re6Te8}(CN)6] в конечной точке эксперимента проводили забор
крови из ретроорбитального синуса под наркозом для биохимического анализа и общего
анализа крови, а также забор внутренних органов (печени, почек, сердца, легких,
селезенки, двенадцатиперстной кишки и мозга) для морфологического анализа. Расчет
значения ЛД50 проводили при помощи пакета MS Excel, в основе статистической
обработки – взвешенный метод наименьших квадратов с использованием пробитанализа.
Биохимический анализ крови проводили при помощи автоматического
биохимического анализатора AU 480 (Becman Coulter, США), общий анализ крови – при
помощи автоматического гемоанализатора XT-4000i (Sysmex, Япония) на базе
гематологической лаборатории ФГБУ «НМИЦ им. акад. Е.Н. Мешалкина» Минздрава
РФ. Статистическую обработку данных проводили c использованием однофакторного
дисперсионного анализа ANOVA и апостериорного сравнения по критериям подлинной
значимости LSD, Дункана, Тьюки и Шеффе (пакет Statistica 10 Enterprise, StatSoft). Для
всех тестов был установлен порог статистической значимости p < 0,05.
Материал для морфологического исследования (образцы печени, почек, сердца,
легких, селезенки, кишечника и мозга) фиксировали 4% формалином и заливали в
парафиновые блоки по стандартной методике. Для проводки материала использовали
автомат для проводки тканей STP-120 (Thermo Scientific, США). На ротационном
микротоме HM 340 E (Thermo Scientific, США) с подготовленных блоков делали срезы
толщиной 4 мкм. Затем срезы окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной
методике. Гистологические препараты исследовали с использованием оптического
микроскопа AxioStar plus (Zeiss, Германия) и документировали при помощи цифровой
камеры AxioCam ICC 1 (Zeiss, Германия) и программного обеспечения AxioVision
Rel.4.8 (Zeiss, Германия).
Ангиографию проводили на самцах крыс породы Wistar весом 300±30 г. В
качестве анестезии животным интраперитонеально вводили пентобарбитал натрия в дозе
50 мг/кг и буторфанол в дозе 2 мг/кг. Наркотизированным животным вводили 1 мл
водного раствора Na4[{Re6Te8}(CN)6] в различных концентрациях (40, 60 и 80 мг(Re)/мл)
или йогексол в концентрации 300 мг(I)/мл. Оценивали качество визуализации сосудов на
ангиограмме. Запись ангиограммы проводилась в течение 30 мин после введения
исследуемых соединений. Для получения ангиограммы была использована
рентгенографическая установка типа С-дуга GE 9800-Cardio (GeneralElectric, США).
В третьей главе диссертации представлены результаты собственных
исследований. Полученные данные представлены в виде таблиц, графиков, и
фотографий.
Четвертая глава диссертационной работы посвящена обсуждению полученных
результатов исследования с привлечением данных литературы.
10
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Оценка рентгеновской контрастности кластерных комплексов рения
Наличие в составе кластерных комплексов атомов тяжелых элементов (Re, Te)
предполагает способность этих соединений эффективно поглощать рентгеновское
излучение. Однако ранее не проводилось сравнение рентгеновской контрастности
кластерных комплексов рения между собой и с современными рентгеноконтрастными
препаратами на основе трийодбензола.
Для оценки рентгеновской контрастности полученных кластерных комплексов
Na4[{Re6S8}(CN)6], Na4[{Re6Se8}(CN)6] и Na4[{Re6Te8}(CN)6] в 96-луночный
культуральный планшет были раскапаны водные растворы данных кластерных
комплексов с равными молярными концентрациями (0,131 М) и с последующим
двукратным разведением растворов вплоть до концентраций равных 1/32 от исходных
(0,004 М). Для сравнения, в равных молярных концентрациях был раскапан известный
рентгеноконтрастных органический препарат на основе 1,3,5-трийодбензола – йогексол,
а также в отдельных лунках находились дистиллированная вода и воздух для контроля
точности проводимого эксперимента (Рисунок 1).
Рисунок 1. Компьютерная томограмма (слева) и рентгеновский снимок (справа)
планшета, содержащего водные растворы изучаемых кластерных комплексов и коммерческого
рентгеноконтрастного препарата (йогексол) в равных молярных концентрациях и их двукратных
разведениях; воду и воздух.
Значения рентеноконтрастности кластерных комплексов в единицах Хаунсфилда
были определены из массива данных, полученных на компьютерном томографе, с
помощью программы eFilmWorkstation® 3.4. Данные получены при усреднении
рентгеноконтрастности в окружности площадью 2 см2 (Таблица 1).
Для сравнения рентгеноконтрастности изучаемых кластерных комплексов с
коммерческим йодсодержащим препаратом значения рентгеноконтрастности 1,3,5трийодбензола были приняты за 1 и, соответственно, нормированы значения
рентгеноконтрастности кластерных комплексов на 1 моль 1,3,5-трийодбензола. В
результате было выявлено, что рентгеноконтрастность комплексов, содержащих в своем
составе
кластерные
ядра
{Re6Te8}2+,
{Re6Se8}2+,
{Re6S8}2+,
превосходит
рентгеноконтрастность известного органического йодсодержащего препарата в 4,4; 2,7 и
2,1 раза соответственно.
11
Таблица 1. Значения рентгеновской контрастности (со среднеквадратичным
отклонением) кластерных комплексов в сравнении с органическим йодсодержащим препаратом,
водой и воздухом
Рентгеноконтрастность, ед. Хаунсфильда
Исследуемое
соединение
0,131 M
0,066 M
0,033M
0,016 M 0,008 M 0,004 M
Na4[{Re6S8}(CN)6]
2859±239 1641±74
747±48
346±26
263±18
150±14
Na4[{Re6Se8}(CN)6]
3804±343 2027±183 1032±95
505±28
223±20
211±9
Na4[{Re6Te8}(CN)6] 6250±607 3386±194 1754±126 895±26
428±25
226±35
Йогексол {I3}
1374±76
657±38
267±15
215±9
140±14
83±9
Вода*
14±3
9±5
5±4
8±3
6±5
8±5
Воздух**
-963±78
-977±48
-984±34
-991±25
-988±27
-987±30
*Значение рентгеновской контрастности должно быть близко нулевому значению.
**Значение рентгеновской контрастности должно быть близко значению -1000.
мкПолученные данные свидетельствуют о том, что октаэдрические кластерные
комплексы рения могут стать более эффективной альтернативой для широко
применяющихся в настоящее время в клинике йодных рентгеноконтрастных веществ
(РКВ) при условии их низкой токсичности для живых организмов.
Сравнение цитотоксичности кластерных комплексов рения in vitro
На первом этапе исследования биологических эффектов октаэдрических
кластерных комплексов рения оценивали их влияние на жизнеспособность клеток в
культуре. Потенциальную цитотоксичность кластерных комплексов рения изучали на
культуре опухолевых клеток человека Hep-2 и на культуре диплоидных клеток легких
эмбриона человека MRC-5. Влияние веществ Na4[{Re6S8}(CN)6], Na4[{Re6Se8}(CN)6] и
Na4[{Re6Te8}(CN)6] на уровень метаболизма клеток оценивали при помощи МТТ-теста.
Результаты проведенных экспериментов показали, что растворы Na4[{Re6S8}(CN)6] и
Na4[{Re6Se8}(CN)6] не вызывали значительных изменений в уровне метаболизма клеток
обеих линий в концентрации до 100 мкM, а комплекс Na4[{Re6Te8}(CN)6] – до 250 мкM.
Значения половины ингибирующей концентрации (ИК50) для кластерных комплексов
при действии на культуру клеток Hep-2 соответствуют: 208,5±10,4 мкМ для
Na4[{Re6S8}(CN)6], 212,5±10,62 мкМ для Na4[{Re6Se8}(CN)6] и 720,7±36 мкМ для
Na4[{Re6Te8}(CN)6]. При действии на культуру MRC-5 значения ИК50 сходны и равны
254,75±13 мкМ для Na4[{Re6S8}(CN)6], 242,5±12 мкМ для Na4[{Re6Se8}(CN)6] и 815±40,7
мкМ для Na4[{Re6Te8}(CN)6].
Таким образом, ингибирующее действие исследуемых кластерных комплексов не
является селективным по отношению к опухолевым клеткам. Значения ИК50 для всех
соединений достаточно высоки. Это позволяет заключить, что лишь очень большие
концентрации (неприемлемые для диагностики) исследуемых соединений способны
существенно влиять на метаболизм клеток. Выявлено, что комплекс Na4[{Re6Te8}(CN)6]
не только наиболее рентгеноконтрастен, но и наиболее безопасен для клеток in vitro.
12
Исследование проникновения кластерных комплексов в клетки Hep-2 in vitro
Способность исследуемых кластерных комплексов к автофлюоресценции
позволила исследовать их проникновение в клетки in vitro при помощи лазерной
сканирующей флуоресцентной конфокальной микроскопии. Поглощение клетками
кластерных комплексов Na4[{Re6S8}(CN)6], Na4[{Re6Se8}(CN)6] и Na4[{Re6Te8}(CN)6]
изучали в нетоксичной для клеток концентрации (100 мкМ). Показано, что все
исследуемые кластерные комплексы способны проникать в клетки. Характерное для
данных кластерных комплексов красное свечение локализуется диффузно в цитоплазме
клеток. Для того чтобы убедиться, что исследуемые комплексы проникают внутрь
клетки, а не накапливаются на внешней поверхности мембраны, было проведено
послойное сканирование клеток при помощи лазерного сканирующего флуоресцентного
конфокального микроскопа. Показано, что комплексы действительно локализуются
внутри клеток.
Поскольку конфокальная микроскопия не позволяет точно определить
локализацию кластерных комплексов в клетке, было проведено исследование при
помощи просвечивающего электронного микроскопа, оснащенного омега-фильтром и
программным
обеспечением
для
элементного
анализа.
На
электронных
микрофотографиях видно, что рений диффузно распределен по цитоплазме и ядру
клетки и склонен к накоплению на мембранах некоторых органелл (преимущественно
митохондрий). При этом не обнаруживается накопления препарата внутри везикулярных
органелл (эндосом, лизосом). Таким образом, можно предположить, что кластерные
комплексы проникают в клетку путем диффузии, а не посредством эндоцитоза. Кроме
того, была выявлена интересная особенность: изображения клеток, которые были
инкубированы с препаратами Na4[{Re6Se8}(CN)6] и Na4[{Re6Te8}(CN)6], оказались
гораздо более контрастными, чем изображения контрольных клеток и клеток, которые
были инкубированы с препаратом Na4[{Re6S8}(CN)6]. Это согласуется с полученными
данными о различной рентгеноконтрастности исследуемых соединений (Таблица 1, 2).
Кроме того, на основании полученных микрофотографий можно предположить, что
исследуемые соединения каким-то образом взаимодействуют с мембранами различных
органелл, что и обеспечивает хорошее качество визуализации при электронномикроскопическом исследовании без дополнительного контрастирования солями урана и
свинца.
Тот факт, что исследуемые соединения проникают в клетку, существенно
ограничивает их возможное применение в качестве РКВ, поскольку для этого
применения необходимо минимизировать взаимодействие препарата и клеток организма.
Однако это ограничение можно преодолеть, заменив цианидный внешний лиганд на
какой-либо другой, с целью увеличения липофобности (например, нами было показано,
что
трис-2-карбоксиэтилфосфиновый
лиганд
не
позволяет
комплексу
10–
[{Re6Se8}(P(CH2CH2CONH2)(CH2CH2COO)2)6] проникать в клетки [Krasilnikova et al.,
2015]. В то же время, для применения в качестве фотосенсибилизатора способность
комплексов проникать в клетки является весьма значимой.
13
Определение полулетальной дозы (ЛД50) при внутривенном введении
раствора Na4[{Re6Te8}(CN)6] in vivo
Поскольку соединение Na4[{Re6Te8}(CN)6] из трех исследуемых комплексов
оказалось наиболее рентгеноконтрастным и безопасным для клеток в культуре, для него
было проведено исследование острой токсичности и определена полулетальная доза
(ЛД50). Определение острой токсичности проводилось в токсикологическом
эксперименте после однократного введения различных доз исследуемого вещества.
Внутривенный способ введения был выбран вследствие того, что именно он позволяет
напрямую ввести в организм высокую дозу исследуемого раствора и именно такой
способ используется в клинической практике для введения РКВ.
На протяжении двух недель эксперимента не наблюдалось признаков
интоксикации в группах мышей, которым ввели раствор кластерного комплекса в дозах
до 300 мг(Re)/кг включительно. Однако в группе мышей, которым препарат ввели в дозе
500 мг(Re)/кг, в первый день эксперимента погибло 5 животных, у остальных не
наблюдалось признаков интоксикации на протяжении всего эксперимента. В следующей
группе мышей (доза 650 мг(Re)/кг) в первый день погибло 8 мышей, и в последней
группе (доза 750 мг(Re)/кг) после инъекции погибли все животные
Расчет значения ЛД50, показал, что полулетальная доза для исследуемого вещества
равна 506±38 мг(Re)/кг. При этом следует отметить, что для удобства сравнения
токсичности различных кластерных комплексов рения в наших дальнейших
исследованиях мы выражали дозу вещества в массе именно этого элемента (Re) на
килограмм веса животного. В то же время, ЛД50 для всего исследуемого соединения
составляет 1082±83 мг (Na4[{Re6Te8}(CN)6])/кг.
Однако даже такого высокого значения ЛД50 не достаточно для потенциального
применения Na4[{Re6Te8}(CN)6] в качестве РКВ. Вследствие того, что в клинической
практике РКВ вводят в кровеносное русло пациента в очень высоких концентрациях (для
РКВ на основе трийодбензола концентрация йода равна 300-350 мг/мл) и объемах (на
одного пациента может потребоваться 40-100 мл препарата), к уровню безопасности
данных препаратов предъявляют очень высокие требования. Можно попытаться снизить
токсичность Na4[{Re6Te8}(CN)6] путем модификации внешнего лиганда, добавления к
раствору кластерного комплекса органических веществ, а также путем заключения
комплекса в полимерную матрицу. Тем не менее, предполагаемая доза для применения
Na4[{Re6Te8}(CN)6] в качестве фотосенсибилизатора или рентгеноконтрастной добавки в
биодеградируемые имплантаты будет в несколько сотен раз меньше, чем полученное
значение ЛД50. Таким образом, для данных применений исследуемый комплекс может
оказаться весьма перспективным, однако необходимы дальнейшие исследования в этом
направлении.
Общий и биохимический анализ крови животных через 2 недели после
внутривенной инъекции раствора Na4[{Re6Te8}(CN)6]
Анализ крови проводился на базе гематологической лаборатории ФГБУ «НМИЦ
им. акад. Е.Н. Мешалкина» Минздрава РФ при помощи автоматических анализаторов. В
общем анализе крови были определены следующие параметры: количество лейкоцитов
(WBC), количество эритроцитов (RBC), уровень гемоглобина (HGB), гематокрит (HCT),
14
средний объем эритроцита (MCV), среднее содержание гемоглобина в отдельном
эритроците (MCH), средняя концентрация гемоглобина в эритроцитарной массе (MCHC)
и количество тромбоцитов (PLT) (Таблицы 2, 3). Статистическая обработка результатов
анализа
свидетельствует
об
отсутствии
достоверных
различий
между
экспериментальными группами животных и контролем.
Таблица 2. Результаты общего анализа крови самцов мышей через 2 недели после
внутривенной инъекции Na4[{Re6Te8}(CN)6]
WBC, 103/мкл
RBC, 103/мкл
HGB, г/дл
HCT, г/дл
MCV, фл
MCH, пг
MCHC, г/дл
PLT, 103/мкл
Контроль
(NaCl)
8,80±1,50
10,39±0,48
166,5±4,9
51,25±2,52
48,50±0,13
16,72±0,16
344,6±3,6
429,4±23,7
50
мг(Re)/кг
8,60±0,34
8,85±0,54
149,5±8,2
44,60±2,06
49,40±0,33
16,92±0,18
335,0±5,7
496,0±29,8
150
мг(Re)/кг
9,60±1,73
9,76±0,70
163,5±11,0
47,75±3,27
49,00±0,50
16,78±0,23
342,6±3,8
406,0±52,0
300
мг(Re)/кг
8,50±0,57
9,43±0,74
136,88±17,0
46,25±3,32
49,15±0,43
16,28±0,37
331,3±9,8
393,3±17,5
500
мг(Re)/кг
7,25±0,38
9,55±0,46
156,7±6,0
45,92±2,05
48,10±0,21
16,40±0,38
341,7±6,5
379,0±61,1
650
мг(Re)/кг
8,75
10,03
165,0
48,75
48,60
16,50
338,0
423,0
ANOVA (Statistica 10 Enterprise, StatSoft), р<0.05, не выявлено статистически значимых
различий между группами. Приведены средние значения и ошибки средних (n= 5 для групп,
получавших дозу 50–300 мг(Re)/кг; n=3 для группы 500 мг(Re)/кг; n=1 для группы 650
мг(Re)/кг).
Таблица 3. Результаты общего анализа крови самок мышей через 2 недели после
внутривенной инъекции Na4[{Re6Te8}(CN)6]
WBC, 103/мкл
RBC, 103/мкл
HGB, г/дл
HCT, г/дл
MCV, фл
MCH, пг
MCHC, г/дл
PLT, 103/мкл
Контроль
(NaCl)
12,35±1,50
9,07±0,72
148,0±13,2
44,50±3,93
48,98±1,13
16,30±0,34
340,6±6,76
405,6±76,0
50
мг(Re)/кг
12,69±2,55
9,78±1,07
161,3±16,1
46,88±5,11
48,03±0,95
16,55±0,36
345,0±3,54
438,3±71,9
150
мг(Re)/кг
12,00±1,28
8,34±0,51
142,0±8,6
41,10±2,83
49,24±0,50
17,04±0,22
346,2±4,34
410,8±45,3
300
мг(Re)/кг
12,18±2,65
8,08±1,14
135,6±17,4
39,19±5,19
48,83±0,75
16,93±0,40
346,8±5,14
356,3±26,4
500
мг(Re)/кг
9,25
9,44±0,91
155,0±12,5
45,13±4,13
47,85±0,25
16,45±0,25
344,0±4,00
417,5±63,5
650
мг(Re)/кг
9,25
7,58
127,5
36,25
47,90
16,80
352,0
538,0
ANOVA (Statistica 10 Enterprise, StatSoft), р<0.05, не выявлено статистически значимых
различий между группами. Приведены средние значения и ошибки средних (n= 5 для групп,
получавших дозу 50–300 мг(Re)/кг; n=2 для группы 500 мг(Re)/кг; n=1 для группы 650
мг(Re)/кг).
В биохимическом анализе крови были определены следующие параметры: уровни
аланинаминотрансферазы (ALT), аспартатаминотрансферазы (AST) и билирубина (TBIL)
как показатели функции печени, уровни мочевины крови (BUN) и креатинина (Crea) как
показатели нефротоксичности, уровень белка (TP) как индикатор воспаления и
повреждения тканей (Таблицы 4, 5). Статистический анализ не выявил достоверных
различий между экспериментальными группами животных и контролем.
15
Таблица 4. Результаты биохимического анализа крови самцов мышей через 2 недели
после внутривенной инъекции Na4[{Re6Te8}(CN)6]
ALT, Ед/л
AST, Ед/л
TBIL,
мкмоль/л
TP, г/л
BUN, ммоль/л
Crea, мкмоль/л
Контроль
(NaCl)
38,00±1,47
126,3±13,0
1,38±0,06
50
мг(Re)/кг
48,06±0,81
130,1±15,2
1,42±0,11
150
мг(Re)/кг
37,82±4,40
147,4±32,9
1,50±0,16
300
мг(Re)/кг
34,50±3,50
133,6±15,4
1,50±0,18
500
мг(Re)/кг
41,70±4,59
167,2±45,0
1,43±0,23
650
мг(Re)/кг
31,80
129,5
1,60
49,36±0,72
9,68±0,84
28,20±1,02
47,96±0,57
10,48±0,63
27,20±0,58
49,38±1,48
9,94±0,94
25,80±0,49
48,15±0,78
10,05±0,40
24,50±0,96
49,37±1,06
10,40±0,21
26,67±0,67
48,70
9,50
24,00
ANOVA (Statistica 10 Enterprise, StatSoft), р<0.05, не выявлено статистически значимых
различий между группами. Приведены средние значения и ошибки средних (n= 5 для групп,
получавших дозу 50–300 мг(Re)/кг; n=3 для группы 500 мг(Re)/кг; n=1 для группы 650
мг(Re)/кг).
Таблица 5. Результаты биохимического анализа крови самок мышей через 2 недели после
внутривенной инъекции Na4[{Re6Te8}(CN)6]
ALT, Ед/л
AST, Ед/л
TBIL,
мкмоль/л
TP, г/л
BUN, ммоль/л
Crea, мкмоль/л
Контроль
(NaCl)
49,63±5,53
153,2±10,3
1,30±0,09
50
мг(Re)/кг
57,13±9,58
149,5±22,6
1,40±0,25
150
мг(Re)/кг
49,70±5,19
145,5±16,3
1,48±0,21
300
мг(Re)/кг
45,33±8,76
146,0±26,7
1,35±0,18
500
мг(Re)/кг
41,20±3,20
141,3±9,6
1,30±0,20
650
мг(Re)/кг
35,60
102,2
1,50
50,63±0,71
10,10±0,59
24,75±0,75
52,08±0,43
9,98±1,73
26,75±1,25
51,46±3,46
9,33±0,26
30,20±5,22
50,50±1,58
10,33±0,90
24,25±0,63
50,90±2,90
11,10±1,90
26,00±2,00
50,10
10,20
24,00
ANOVA (Statistica 10 Enterprise, StatSoft), р<0.05, не выявлено статистически значимых
различий между группами. Приведены средние значения и ошибки средних (n= 5 для групп,
получавших дозу 50–300 мг(Re)/кг; n=2 для группы 500 мг(Re)/кг; n=1 для группы 650
мг(Re)/кг).
Таким образом, внутривенное введение раствора Na4[{Re6Te8}(CN)6] не оказывает
существенного влияния на показатели крови животных, что свидетельствует о
достаточно высокой степени безопасности исследуемого соединения при однократном
внутривенном введении.
Морфологический анализ внутренних органов мышей после внутривенной
инъекции раствора Na4[{Re6Te8}(CN)6]
Следует отметить, что при некропсии видимых внешних отличий в состоянии
внутренних органов экспериментальных и контрольных животных не наблюдалось.
Морфологический анализ печени. У животных из групп с введением наибольших
доз препарата (500, 650 и 750 мг(Re)/кг), погибших в течение первых суток после
введения, наблюдались значительные патологические изменения печени. Данные
изменения отмечены во всех трех группах, степень их выраженности зависела от
времени, прошедшего с момента инъекции до гибели животного. У погибших животных
в печени наблюдались плазмо- и геморрагии как следствие разрушения стенок сосудов;
16
очаги повышенного кровенаполнения крупных вен и синусоидных капилляров;
диффузный некроз гепатоцитов, а также участки, в которых уцелевшие клетки
находились в состоянии выраженной баллонной дистрофии. Балочно-радиарное
строение долек было нарушено на фоне выраженных патологических изменений.
Однако у животных, выживших после введения препарата в течение двух недель
эксперимента, выраженных патологических изменений по сравнению с мышами
контрольной группы не выявлено. Во всех экспериментальных группах через 2 недели
после введения раствора Na4[{Re6Te8}(CN)6] в печени мышей сохраняется четкое
балочно-радиарное строение долек. Гепатоциты полигональной формы с зернистого
вида цитоплазмой не имели признаков дистрофии. Отмечено нормальное состояние
стенок сосудов и отсутствие инфильтрации тканей кровью. Кровенаполнение
синусоидных капилляров, центральных вен и вен портальных трактов оставалась в
пределах нормы.
Морфологический анализ почек. У животных из групп с введением наибольших
доз препарата (500, 650 и 750 мг(Re)/кг), погибших в течение первых суток после
введения, выявлено диффузное венозно-капиллярное полнокровие сосудов корковой
зоны и мозгового вещества почек. Данные изменения были характерны для всех трех
групп, степень их выраженности зависела от времени, прошедшего с момента инъекции
до гибели животного.
Однако у животных, выживших после введения препарата, к концу эксперимента,
выраженных патологических изменений по сравнению с мышами контрольной группы
не выявлено. Во всех экспериментальных группах через 2 недели после введения
раствора Na4[{Re6Te8}(CN)6] в почках мышей не было отмечено повышенного
кровенаполнения, сосудистые клубочки сохраняли свое строение, пространство
Боуменовой капсулы было хорошо представлено. Эпителий почечных канальцев
находился в норме, на апикальной поверхности клеток проксимальных канальцев была
отмечена хорошо выраженная щеточная каемка, на базальной – базальный лабиринт.
Признаков воспаления или отека интерстиция не наблюдалось.
Морфологический анализ сердца. Морфологический анализ сердца животных,
погибших в первые сутки после инъекции высоких доз раствора Na4[{Re6Te8}(CN)6],
выявил появление мелких вакуолей в цитоплазме кардиомиоцитов.
На препаратах сердца выживших животных к концу эксперимента, миокард имел
равномерную окраску, кровенаполнение сосудов миокарда было в пределах нормы. В
кардиомиоцитах отсутствовали признаки дистрофии, некроза или гипертрофии. Не
наблюдалась фрагментация или деформация мышечных волокон.
Морфологический анализ легких, мозга, селезенки и двенадцатиперстной
кишки. Анализ гистологических срезов легких, селезенки, мозга и двенадцатиперстной
кишки не выявил изменений в структуре органов всех экспериментальных групп по
сравнению с контролем.
На препаратах легких альвеолы имели нормальный вид, признаков эмфиземы не
обнаружено. Стенки легочных сосудов были в нормальном состоянии, не обнаружено
признаков дистонии или васкулита. Сосуды умеренно кровенаполнены. Состояние
межальвеолярных перегородок, альвеол и бронхов в норме. Просветы альвеол и бронхов
17
хорошо просматривались, заполненение экссудатом или отечной жидкостью не
отмечено.
Селезенка также не имела признаков структурных изменений. Кровенаполнение
красной пульпы было равномерным и умеренным. Лимфатические фолликулы среднего
размера не имели признаков атрофии, гиперплазии или делимфатизации. Стенки
центральных артерий фолликулов не изменены.
У животных из всех исследуемых групп мягкая мозговая оболочка хорошо
сохранена, признаков отека не выявлено, ее сосуды умеренно кровенаполнены.
Вещество мозга имело нормальный вид, отсутствовали признаки отека и кровоизлияний.
В структуре нейронов на светооптическом уровне изменений по сравнению с контролем
не обнаружено.
Стенка двенадцатиперстной кишки представлена всеми слоями: слизистая
оболочка с покровным эпителием, подслизистая основа, мышечная и серозная оболочка.
Состояние всех оболочек было нормальным и не отличалось от животных контрольной
группы. Отмечалось умеренное кровенаполнение сосудистого русла органа.
Таким образом, результаты морфологического анализа показали, что
внутривенное введение различных доз Na4[{Re6Te8}(CN)6] не оказывает существенного
влияния на морфологию исследованных внутренних органов через 2 недели после
инъекции. Однако после введения очень высоких доз препарата (500, 650 и 750
мг(Re)/кг) у животных, погибших в течение первых суток эксперимента, наблюдались
серьезные патологические изменения в печени, повышенное кровенаполнение сосудов
почек и появление мелких вакуолей в цитоплазме кардиомиоцитов.
Исследование возможности применения раствора Na4[{Re6Te8}(CN)6] в
качестве сосудистого РКВ
В завершение проведенной работы мы оценили насколько в действительности
осуществимо проведение ангиографии при использовании Na4[{Re6Te8}(CN)6] в
качестве сосудистого РКВ.
Исследование было проведено на самцах крыс породы Wistar, животным вводили
раствор комплекса Na4[{Re6Te8}(CN)6] в различных концентрациях (40, 60 и 80
мг(Re)/мл) в безопасной дозе. При использовании концентрации 80 мг(Re)/мл (0,43
ммоль(Re)/мл) получили изображение сравнимое по качеству с изображением,
полученным при помощи коммерческого препарата в концентрации 300 мг(I)/мл (2,38
ммоль(I)/мл). До введения рентгеноконтрастных соединений визуализировался только
скелет животного и были различимы тени внутренних органов. Через 0,05 сек после
начала введения препаратов хорошо визуализировались бедренная, подвздошная и
нижняя полая вена, через 2 сек после начала введения препарат достигал сердца
животного (Рисунок 2), после чего поступал в малый круг кровообращения. Через 4 сек
после начала введения препараты распространялись по организму животного,
вследствие чего сосуды переставали визуализироваться, и такую картину мы наблюдали
в течение последующих 30 мин.
Таким образом, впервые была показана возможность применения октаэдрического
кластерного комплекса рения (в частности, Na4[{Re6Te8}(CN)6]) в качестве сосудистого
РКВ.
18
Рисунок 2. Ангиограмма с использованием А) раствора Na4[{Re6Te8}(CN)6], 80
мг(Re)/мл; Б) йогексола, 300 мг(I)/мл, в качестве сосудистого рентгеноконтрастного
соединения. Снимки получены через 2 сек после начала введения соединений в
бедренную вену крысы. Визуализируются бедренная, подвздошная, нижняя полая вена и
сердце животного (стрелка указывает на нижнюю полую вену).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Физико-химические свойства октаэдрических кластерных комплексов рения
(рентгеновская контрастность, способность к люминесценции в дальней красной области
спектра и способность генерировать синглетный кислород) определяют огромный
потенциал их применения в таких областях как функциональная диагностика, ортопедия
и травматология, фотодинамическая терапия и фундаментальные исследования в
биологии. Однако, знания о биологических эффектах данных соединений, как на
культурах клеток, так и на живых организмах, в настоящее время весьма скудны и не
имеют системного характера. В представленной работе было проведено изучение
цитотоксичности, способности проникать внутрь клеток и внутриклеточной локализации
для соединений Na4[{Re6S8}(CN)6], Na4[{Re6Se8}(CN)6], Na4[{Re6Te8}(CN)6] in vitro,
определена полулетальная доза и исследована острая токсичность при внутривенном
введении раствора Na4[{Re6Te8}(CN)6] in vivo. Было проведено сравнение уровня
рентгеновской контрастности исследуемых кластерных комплексов и используемого в
настоящее время в клинической практике РКВ на основе йода, а также проведена
ангиография с использованием Na4[{Re6Te8}(CN)6] в качестве сосудистого РКВ.
Сведения о влиянии характера внутреннего лиганда на какие-либо свойства
кластерных комплексов рения в литературе отсутствовали. Полученные нами результаты
свидетельствуют о наличии такого влияния и о наибольшей безопасности для клеток in
vitro и для животных in vivo кластерного ядра состава {Re6Te8}. При этом все три
исследованных соединения оказались способны проникать в клетки in vitro и диффузно
распределяться по цитоплазме с тенденцией накопления на мембранах некоторых
внутриклеточных органелл. В эксперименте по изучению острой токсичности
соединения Na4[{Re6Te8}(CN)6] in vivo показана высокая степень безопасности для
животных при внутривенном введении в дозах до 300 мг(Re)/кг.
Таким образом, халькоцианидные кластерные комплексы рения являются
перспективными соединениями для разработки на их основе препаратов для
19
фотодинамической терапии, функциональной диагностики, рентгеноконтрастных
добавок в биодеградируемые имплантаты и контрастирующих реагентов для ПЭМ.
ВЫВОДЫ
1. Уровень рентгеновской контрастности комплексов, содержащих в своем составе
кластерные ядра {Re6Te8}2+, {Re6Se8}2+, {Re6S8}2+, превосходит рентгеноконтрастность
коммерческого органического йодсодержащего препарата в 4,4; 2,7 и 2,1 раза
соответственно при сравнении в равных молярных концентрациях.
2. Наиболее безопасным халькоцианидным комплексом рения для клеток в
культуре является Na4[{Re6Te8}(CN)6].
3. Исследуемые кластерные комплексы не проявляют селективного
цитотоксического действия на культуру опухолевых клеток (Hep-2) по сравнению с
действием на культуру диплоидных клеток (MRC-5).
4. Все три исследуемых кластерных комплекса способны проникать в клетки in
vitro и диффузно распределяться по цитоплазме клетки.
5. Оценка острой токсичности Na4[{Re6Te8}(CN)6] при однократном
внутривенном введении мышам (самцам и самкам) линии Balb/C показала, что ЛД50
составила 507±39 мг(Re)/кг в пересчете на массу Re, и 1082±83 мг/кг – на массу всего
комплекса.
6. Морфология внутренних органов, результаты общего и биохимического
анализов крови на 14 сутки наблюдения после инъекции Na4[{Re6Te8}(CN)6]
свидетельствовали о высокой степени безопасности комплекса в дозах 50–300 мг(Re)/кг.
У животных, погибших в первые сутки эксперимента после введения высоких доз (500–
750 мг(Re)/кг), обнаружены выраженные патологические изменения в печени,
полнокровие сосудов почек и структурные изменения кардиомиоцитов.
7. Внутривенное введение октаэдрического кластерного комплекса рения
Na4[{Re6Te8}(CN)6] в концентрации 80 мг(Re)/мл (в дозе 250 мг(Re)/кг) позволяет
получить четкие изображения сосудистого русла экспериментального животного при
ангиографическом исследовании.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи:
1. Krasilnikova, A.A. Prospects of molybdenum and rhenium octahedral cluster complexes as
X-ray contrast agents / A.A. Krasilnikova, M.A. Shestopalov, K.A. Brylev et al. // J. Inorg. Biochem. – 2015. – Vol. 144. – P. 13–17.
2.
Позмогова,
Т.Н.
Исследование
влияния
состава
кластерного
ядра
высокорентгеноконтрастных кластерных комплексов рения на их острую токсичность in vivo /
Т.Н. Позмогова, А.А. Красильникова, А.А. Иванов и др. // Бюлл. эксп. биол. мед. – 2016. – Т.
161, № 1. – стр. 75–79. Статья также переведена и опубликована на английском языке:
Pozmogova, T.N. Studing the effect of a composition of the cluster core in high-radiopacity cluster
complexes of rhenium on their acute toxicity in vivo / T.N. Pozmogova, A.A. Krasil’nikova, A.A.
Ivanov et al. // Bull. Exp. Biol. Med. – 2016. – Vol. 161, № 1. – P. 64–68.
3. Krasilnikova, A.A. Comprehensive study of hexarhenium cluster complex
Na4[{Re6Te8}(CN)6] – in terms of a new promising luminescent and X-ray contrast agent / A.A.
20
Krasilnikova, A.O. Solovieva, K.E. Trifonova et al. // Nanomedicine: NBM. – 2017. – Vol. 13, № 2. –
P. 755–763.
Тезисы докладов:
1. Красильникова, А.А. Новый класс рентгеноконтрастных соединений на основе
октаэдрических металлокластерных комплексов / А.А. Красильникова, М.А. Шестопалов, К.А.
Брылев и др. // Материалы II Международного Форума «Инновации в медицине: основные
проблемы и пути их решения. Высокотехнологичная медицина как элемент инновационной
экономики». – Новосибирск. – 2013. – С. 184–191.
2. Красильникова, А.А. Исследование токсичности нового рентгеноконтрастного агента
– октаэдрического рениевого кластера Nа16-XHX[{Re6Se8}(P(CH2CH2COO)3)6] in vivo / А.А.
Красильникова // Материалы 51-ймеждународной научной студенческой конференции
«Студент и научно-технический прогресс». – Новосибирск. – 2013. – С. 131.
3. Красильникова, А.А. Исследование трис-(2-карбоксиэтил)фосфинового кластерного
комплекса рения в качестве нового агента для рентгеноконтрастного усиления в лучевой
диагностике / А.А. Красильникова, М.А. Шестопалов, И.А. Кирилова и др. // Материалы
международной научно-практической конференции «Наука в современном информационном
обществе». – Москва. – 2013. – С. 77–80.
4. Красильникова, А.А. Рентгеноконтрастный препарат нового поколения на основе
октаэдрических кластерных комплексов рения / А.А. Красильникова, М.А. Шестопалов, К.А.
Брылев и др. // Материалы школы-конференции молодых ученых "Неорганические соединения
и функциональные материалы", посвященная памяти профессора С.В. Земского. –
Новосибирск. – 2013. – С. 76.
5. Krasilnikova, A.A. Acute intravenous toxicity of octahedral rhenium cluster complexes
Na4[{Re6Q8}(СN)6] (Q = Se/S/Te) / A.A. Krasilnikova, T.N. Pozmogova, L.V. Shestopalova et al. //
International Workshop on Transition Metal Clusters, IWTMC–IV. – Russia, Novosibirsk. – 2014. – P.
31.
6. Shestopalov, M.A. Prospects of octahedral rhenium cluster complexes in biology and
medicine / M.A. Shestopalov, A.A. Krasilnikova, K.E. Zubareva et al. //The 8th International
Symposium on Technetium and Rhenium. – France, La Baule, Pornichet. – 2014.
7. Шестопалов, М.А. Перспективы октаэдрических халькогенидных кластерных
комплексов рения в биологии и медицине / М.А. Шестопалов, А.А. Красильникова, К.Э.
Зубарева и др. // XXVI Международная Чугаевская конференция по координационной химии. –
Казань. – 2014. – С. 677.
8. Позмогова, Т.Н. Сравнение влияния состава кластерного ядра октаэдрических
кластерных комплексов рения на организм лабораторных животных при внутривенном
введении in vivo / Т.Н. Позмогова, А.А. Красильникова, М.А. Шестопалов и др. // Журнал
научных статей «Здоровье и образование в XXI веке», серия «Медицина». – 2014. – Т. 16, №4. –
С. 76–78.
9. Позмогова, Т.Н. Оценка безопасности октаэдрических кластерных комплексов рения –
новых рентгеноконтрастных агентов для компьютерной томографии и ангиографии / Т.Н.
Позмогова, А.А. Красильникова // XVIII Международная медико-биологическая конференция
молодых исследователей, посвященная двадцатилетию медицинского факультета СПбГУ. –
Санкт-Петербург. – 2015. – С. 424.
10. Позмогова, Т.Н. Исследование влияния состава кластерного ядра на биологические
эффекты октаэдрических кластерных комплексов рения / Т.Н. Позмогова, А.А. Красильникова
// Материалы 53-й Международной научной студенческой конференции МНСК-2015 –
Новосибирск. – 2015. – С. 101.
21
11. Ivanov, A.A. Towards new radiocontrast materials based on octahedral chalcogenide
rhenium cluster complexes / A.A. Ivanov, A.A. Krasilnikova, A.O. Solovieva et al. // IX International
conference of young scientists on chemistry «Mendeleev 2015». – Санкт-Петербург. – 2015. – С.
241.
12. Ivanov, A.A. Nanosized octahedral chalcogenide rhenium cluster complexes as new
radiocontrast materials / A.A. Ivanov, M.A. Shestopalov, A.A. Krasilnikova et al. // the 2nd
International Conference on Modern Applications of Nanotechnology. – Belarus, Minsk. – 2015. – P.
45.
13. Красильникова А.А. Разработка рентгеноконтрастных диагностических средств
нового поколения на основе октаэдрических кластерных комплексов рения / А.А.
Красильникова // Городская научно-практическая конференция «Успешные проекты молодых
ученых для города Новосибирска». – Новосибирск. – 2015.
14. Krasilnikiva, A.A. Cytotoxicity, intracellular internalization and acute intravenous toxicity
of cluster complexes Na4[{Re6Q8}(CN)6] (Q = S, Se or Te) – new promising photoactive and X-ray
contrast agents / A.A. Krasilnikiva, A.O. Solovieva, K.E. Zubareva et al. // MedChem-2015. – Russia,
Novosibirsk. – 2015. – P. 82.
15. Solovieva, A.O. The biological properties of the new agent for photodynamic therapy and
luminescent bioimaging based on molybdenum complexes / A.O. Solovieva, K.E. Zubareva, A.A.
Krasilnikiva et al. // MedChem-2015. – Russia, Novosibirsk. –2015. – P. 280.
16. Krasilnikiva, A.A. Potential biomedical applications of octahedral rhenium cluster
complexes [{Re6Q8}(CN)6]4- (Q = S, Se or Te) / A.A. Krasilnikiva, A.O. Solovieva, K.E. Zubareva et
al. // IUPAC-2015. – Korea, Busan. – 2015.
17. Solovieva, A.O. Molybdenum complexes with {Mo 6I8}4+-cluster core incorporated in silica
nanoparticles as potential agents for photodynamic therapy and luminescent bioimaging / A.O.
Solovieva, K.E. Zubareva, A.A.Krasilnikiva et al. // IUPAC-2015. – Korea, Busan. – 2015.
18. Shestopalov, M.A. Prospects of octahedral rhenium cluster complexes in biomedical fields /
M.A. Shestopalov, K.A. Brylev, A.A. Krasilnikova et al. // IUPAC-2015. – Korea, Busan. – 2015.
19. Соловьева, А.О. Новые перспективные агенты для фотодинамической терапии и
флуоресцентной диагностики на основе кластерных комплексов металлов / А.О. Соловьева, Т.Н.
Позмогова, А.А. Красильникова и др. // Российский биотерапевтический журнал. – 2016. – №1.
– С. 103.
20. Позмогова, Т.Н., Исследование влияния состава кластерного ядра на биологические
свойства октаэдрических кластерных комплексов рения / Т.Н. Позмогова, А.А. Красильникова,
А.О. Соловьева и др. // Материалы XII международной конференции, посвященной 25-летию
Научно-исследовательского института клинической и экспериментальной лимфологии
«Лимфология: от фундаментальных исследований к медицинским технологиям». –
Новосибирск. – 2016. – С. 208.
21. Ivanov, A.A. Towards new radiocontrast materials based on high X-ray contrast octahedral
cluster complexes / A.A. Ivanov, A.A. Krasilnikova, A.O. Solovieva et al. // Japan-Russia Joint
seminar “Advanced materials synthesis process and nanostructure”. – Japan, Sendai. – 2016. – P. 52.
22. Позмогова, Т.Н. Исследование острой токсичности октаэдрических кластерных
комплексов рения с различным составом кластерного ядра / Т.Н. Позмогова, А.А.
Красильникова, А.О. Соловьева и др. // Материалы XIII Международной конференции
студентов, аспирантов и молодых ученых «Перспективы развития фундаментальных наук». –
Томск. – 2016. – С. 102–104.
22
23. Ivanov, A.A. Towards water-soluble high X-ray contrast octahedral rhenium cluster
complexes / A.A. Ivanov, A.A. Krasilnikova, O.G. Kurskaya et al. // International workshop
“CLUSPOM-Altay” 2016 on metal clusters and polyoxometallates. – Altay, Katun. – 2016. – P. 12.
24. Shestopalov, M.A. Hexanuclear rhenium cluster complexes and their prospects as X-ray
contrast agents / M.A. Shestopalov, A.A. Ivanov, A.A. Krasilnikova et al. // International workshop
“CLUSPOM-Altay” 2016 on metal clusters and polyoxometallates. – Altay, Katun. – 2016. – P. 22.
25. Ivanov, A.A. Towards octahedral rhenium cluster complexes as X-ray contrast agents / A.A.
Ivanov, A.A. Krasilnikova, O.G. Kurskaya et al. // CLUSPOM-1. – France, Rennes. – 2016. – P. 97.
26. Ivanov, A.A. Octahedral metal cluster complexes as promissing X-ray contrast agents /
A.A. Ivanov, A.A. Krasilnikova, A.O. Solovieva et al. // CLUSPOM-1. – France, Rennes. – 2016. – P.
82.
27. Shestopalov, M.A. Prospects of octahedral rhenium cluster complexes as X-ray contrast
agents / M.A. Shestopalov, A.A. Ivanov, A.A. Krasilnikova et al. // 42nd International Conference on
Coordination Chemistry. – France, Brest. – 2016. – P. 427.
28. Шестопалов, М.А. Октаэдрические кластерные комплексы и их перспективы в
биологии и медицине / М.А. Шестопалов, А.О. Соловьева, А.А. Красильникова и др. // V
Молодежная конференция по молекулярной и клеточной биологии Института цитологии. –
Санкт-Петербург. – 2016. – С. 74.
29. Красильникова, А.А. Снижение токсичности октаэдрических кластерных
комплексов рения и молибдена путем их конъюгации с биополимерами / А.А. Красильникова,
А.А. Иванов, Ю.А. Воротников и др. // V Молодежная конференция по молекулярной и
клеточной биологии Института цитологии. – Санкт-Петербург. – 2016. –С. 34.
30. Соловьева, А.О. Внутриклеточное распределение, фототоксичность и селективность
накопления в опухолевых клетках кластерных комплексов молибдена, включенных в
кремниевые наночастицы и их конъюгатов с антителами / А.О. Соловьева, Т.Н. Позмогова, А.А.
Красильникова и др. // V Молодежная конференция по молекулярной и клеточной биологии
Института цитологии. – Санкт-Петербург. – 2016. – С. 58.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
ДМСО – диметилсульфоксид
ИК50 – концентрация полумаксимального ингибирования
ЛД50 – полулетальная доза
НМИЦ – национальный медицинский исследовательский центр
ПЭМ – просвечивающая электронная микроскопия
РКВ – рентгеноконтрастное вещество
СО РАН – Сибирское отделение Российской академии наук
ФБУН ГНЦ ВБ – Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный
научный центр вирусологии и биотехнологии
Hep-2 – линия клеток аденокарциномы гортани человека
MRC-5 – линия диплоидных клеток легких эмбриона человека
МТТ-тест – колориметрический тест для оценки метаболической активности
клеток
PBS – фосфатный буфер
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа