close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Аутоиммунный лимфопролиферативный синдром у детей стратегия диагностики и лечения на основе клинико-генетической характеристики

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Швец Оксана Анатольевна
Аутоиммунный лимфопролиферативный синдром у детей: стратегия диагностики и лечения на
основе клинико-генетической характеристики
14.01.08 - педиатрия
14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Москва 2018
Работа выполнена в ФГБУ «Научный медицинский исследовательский центр детской
гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева» МЗ РФ
Научные руководители:
Щербина Анна Юрьевна - доктор медицинских наук, профессор РАН
Кузьменко Наталья Борисовна - кандидат медицинских наук
Официальные оппоненты:
Латышева Татьяна Васильевна - доктор медицинских наук, профессор, руководитель
отделений иммунопатологии и интенсивной терапии клиники
ФГБУ «ГНЦ «Институт
иммунологии» ФМБА России, профессор кафедры клинической аллергологии и иммунологии
ФПДО МГМСУ им. А. И. Евдокимова Минздрава России
Кондратенко Ирина Вадимовна - доктор медицинских наук, профессор, заведующая
отделения клинической иммунологии и ревматологии РДКБ ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И.
Пирогова Минздрава России, профессор кафедры иммунологии МБФ ФГБОУ ВО РНИМУ
им. Н.И. Пирогова Минздрава России
Ведущая организация:
Федеральное государственное автономное учреждение «Национальный медицинский
исследовательский центр здоровья детей» МЗ РФ
Защита состоится «__» __________ 2018 г. в «__» часов
на заседании диссертационного совета при ФГБУ «НМИЦ детской гематологии, онкологии и
иммунологии имени Дмитрия Рогачева» Минздрава России по адресу:
117997, Москва, ул Саморы-Машела, д. 1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НМИЦ ДГОИ имени Дмитрия
Рогачева» МЗ РФ (117997, Москва, ул. Саморы-Машела, д. 1) и на сайте www.fnkc.ru
Автореферат разослан «__»__________ 2018 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, д.м.н.
2
Д.Ю. Качанов
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования
История наблюдения за пациентами с аутоиммунным лимфопролиферативным
синдромом (АЛПС) началась еще в прошлом столетии, когда Canale и Smith в 1967 году
[Canale и соавт., 1967] описали детский синдром лимфоаденопатии и спленомегалии в
сочетании с аутоиммунной гемолитической анемией и тромбоцитопенией. В настоящее время
АЛПС
определяется
как
заболевание,
характеризующееся
иммунной
дисрегуляцией
вследствие потери контроля над лимфоцитарным гомеостазом из-за нарушения апоптоза,
приводящего
к
лимфопролиферативному
синдрому
и
аутоиммунным
заболеваниям,
преимущественно иммунным цитопениям. Описано более 500 пациентов более чем из 300
семей с диагностированным АЛПС; однако истинная заболеваемость и распространённость
синдрома остается неизвестной. Заболевание описано у людей разных рас и этнических
принадлежностей. Генетической основой заболевания являются патологические изменения в
генах FAS, FASL, CASP8, CASP10, FADD, вовлеченных в лимфоцитарный апоптоз.
Для постановки диагноза АЛПС используют критерии диагностики, разработанные
Европейским обществом иммунодефицитных состояний (ESID)
[http://esid.org/Working­Parties/Registry/Diagnosis­criteria], включающие один обязательный
симптом из больших признаков:

спленомегалия;

лимфаденопатия (увеличение 3 лимфатических узлов в течение более 3 месяцев при
отсутствии инфекции и злокачественного новообразования;

аутоиммунная цитопения

лимфома в анамнезе;

положительный семейный анамнез

и один из малых признаков:

дубль-негативные Т-клетки (ДНТ) с фенотипом TCRα/ß+CD3+CD4–CD8– составляют
более 6% от CD3+ T-клеток;

повышенные биологические маркеры: растворимый FASL (sFASL) более 200 пг/мл,
общий витамин B12 более 1500 нг/л, интерлейкин-10 (IL-10) более 20 пг/мл,
нарушенный FAS - опосредованный апоптоз.
Тем не менее, даже пациенты с генетически подтвержденным АЛПС не всегда
удовлетворяют этим критериям [Bi и соавт., 2007, Teachey, 2012, Wilson и соавт., 1996].
3
Дифференциальная диагностика проводится с широким спектром патологий, в том
числе с первичными иммунодефицитными состояниями, имеющими в числе своих проявлений
лимфопролиферативный синдром. Правильная постановка диагноза важна для адекватного и
своевременного назначения лечения.
В плане терапии АЛПС в настоящее время перспективным препаратом является
сиролимус - ингибитор mTOR киназы [Teachey и соавт., 2009], в то же время, нет достаточного
опыта его применения у детей с АЛПС, а также у пациентов с фенотипом АЛПС.
Цель исследования: оптимизировать дифференциальную диагностику АЛПС и АЛПСподобных заболеваний и определить факторы ответа на терапию на основании клинических и
молекулярно-генетических характеристик.
Задачи исследования
1.
Изучение распределения молекулярно-генетических дефектов, лежащих в основе
АЛПС и АЛПС-подобных ПИДС, с применением методов секвенирования по Сэнгеру и
секвенирования нового поколения.
2.
Описание особенностей клинической картины, включая лабораторные и
морфологические данные, наблюдаемые при АЛПС и фенотипически схожих с ним
ПИДС.
3.
Изучение зависимости тяжести течения заболевания от локализации мутации в
группе пациентов с дефектами в гене FAS, а также пенетрантность генетического
дефекта для генов с аутосомно-доминантным типом наследования: FAS и CASP10.
4.
Оценка возможности использования биологических маркеров (общий витамин В
12, ДНТ-клетки) при АЛПС в качестве критериев активности заболевания и
эффективности терапии.
5.
Оценка эффективности и безопасности терапии различными дозами сиролимуса
при АЛПС и АЛПС-подобных заболеваниях.
Научная новизна исследования
1.
Впервые в российской популяции охарактеризованы клинико-лабораторные
особенности пациентов с АЛПС и АЛПС - подобным фенотипом.
2.
Впервые в российской популяции выявлен и описан спектр генетических
дефектов, лежащих в основе АЛПС-фенотипа, с использованием современных
молекулярно-генетических методов исследования.
4
3.
Впервые в российской популяции доказана эффективность и безопасность
применения терапии сиролимусом у пациентов с АЛПС, отработаны минимально
эффективные дозы препарата.
Теоретическая и практическая значимость работы
1.
Подробно описаны симптомы заболевания у пациентов с АЛПС и АЛПС -
подобным фенотипом.
2.
Выделен круг нозологий ПИДС для проведения дифференциальной диагностики
с АЛПС.
3.
Показана корреляция содержания общего витамина В 12 и выраженности
лимфопролиферации у пациентов с АЛПС.
4.
Показана возможность ведения пациентов на более низких дозах сиролимуса.
Положения, выносимые на защиту
1.
АЛПС
характеризуется
различной
пенетрантностью
и
разнообразием
симптомов, которые не всегда отвечают диагностическим критериям ESID.
2.
Содержание общего витамина В12 в сыворотке крови является наиболее
информативным и простым в определении лабораторным маркером активности
заболевания
при
АЛПС,
и,
в
первую
очередь,
отражает
выраженность
лимфопролиферации. Он может использоваться для оценки эффективности терапии
этих пациентов.
3.
Монотерапия сиролимусом эффективна и безопасна у педиатрических пациентов
с АЛПС, однако ее отмена ведет к быстрому рецидиву заболевания. Поддерживающие
дозы сиролимуса 1 – 1,5 мг/м2 позволяют контролировать активность АЛПС.
4.
Учитывая недостаточную эффективность сиролимуса при АЛПС-подобных
заболеваниях, необходима их тщательная дифференциальная диагностика с выявлением
генетического дефекта, что позволит выбирать адекватную тактику ведения пациентов.
Внедрение в практику: работа выполнена и внедрена в практику отделения
иммунологии, стационара кратковременного лечения и консультативного отделения ФГБУ
НМИЦ ДГОИ имени Дмитрия Рогачева Минздрава России. Основные положения диссертации
включены в учебный процесс сертификационного цикла врачей аллергологов-иммунологов,
гематологов ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России.
Апробация работы: результаты представлены и обсуждены на международных
конференциях: 17th Biennial Meeting of the European Society for Immunodeficiencies – 2016, the
5
2017 Meeting of the European Society for Immunodeficiencies –2017, на научно-клиническом
совете ФГБУ НМИЦ ДГОИ имени Дмитрия Рогачева Министерства здравоохранения
Российской Федерации (г. Москва, 2107 год).
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 103 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора
литературы,
5
глав
собственных
материалов,
обсуждения,
выводов,
практических
рекомендаций, указателя использованной литературы. Работа иллюстрирована 21 таблицами и
23 рисунками. Библиография представлена 75 источниками литературы, иностранных ссылок
— 75.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Характеристика клинических наблюдений и методы исследования
В исследование включено 57 детей с ПИДС, для которых рассматривался диагноз
АЛПС, наблюдавшихся в период с декабря 2011 года по декабрь 2017 года, на базе ФГБУ
НМИЦ ДГОИ имени Дмитрия Рогачева Министерства Здравоохранения Российской
Федерации (генеральный директор центра – академик РАН, д.м.н., профессор А.Г. Румянцев).
Для постановки диагноза АЛПС были использованы критерии диагностики ESID
[http://esid.org/Working­Parties/Registry/Diagnosis­criteria] (смотри выше). Поскольку не все
пациенты с АЛПС удовлетворяют малым диагностическим критериям, а также для
определения группы дифференциальной диагностики,
в исследование были включены
пациенты с ПИДС, имевшие только большие диагностические критерии, для которых были
исключены другие четко очерченные формы ПИДС. Для верификации генетического дефекта
проводилась молекулярно-генетическая диагностика. В результате получились две группы
пациентов:
1. Группа пациентов с АЛПС (n=28): с мутациями гена FAS (n=18), с мутациями
CASP10 (n=3), без известных мутаций, но удовлетворяющие большим и малым
критериям диагностики АЛПС (n=7). Распределение по полу: 19 мальчиков, 9
девочек. Возраст пациентов от 4 месяцев до 18 лет. Возраст дебюта заболевания от 0
месяцев до 10 лет.
2. Группа дифференциальной диагностики пациентов, имеющих АЛПС-фенотип, с
подтвержденными генетическими дефектами (n=29). Распределение по полу: 14
мальчиков, 15 девочек. Возраст пациентов от 6 месяцев до 18 лет. Возраст дебюта
заболевания от 0 месяцев до 7 лет.
Были проанализированы анамнестические данные, выраженность клинических проявлений,
определявшихся как сумма баллов за каждый признак (таблица 1), режим лечения.
6
Таблица 1. Бальная оценка клинических проявлений
СИНДРОМ
СИМПТОМ/
БАЛЛЫ
ПОКАЗАТЕЛЬ
ЛИМФОПРОЛИФЕРАЦИЯ
0
1
2
3
4
ГЕПАТОМЕГАЛИЯ, см из-под края
реберной дуги
нет
≤3
3-5
5-10
≥10
СПЛЕНОМЕГАЛИЯ, см из-под края
реберной дуги
нет
≤3
3-5
5-10
≥10
ЛИМФОАДЕНОПАТИЯ, см
нет
(1 – 2]
(2-3]
[3-4)
≥4
от 3 групп
ГЕМОПАТИЯ
≥2 групп
ГЕМОГЛОБИН, г/л
N
[90-110)
[70-90)
[50-70)
<50
РЕТИКУЛОЦИТЫ, ‰
N
[13-30)
[30-50)
[50-100)
≥100
ТРОМБОЦИТЫ, тыс/мкл
N
[100-150)
[50-100)
[20-50)
<20
НЕЙТРОФИЛЫ, тыс/мкл
N
[1,0-1,5)
[0,5-1,0)
<0,5
7
В случае подтвержденного генетического дефекта у пациентов с АЛПС, включенных в
исследование, были обследованы родственники первой линии
для
определения
характера
наследования и пенетрантности гена.
Законные
представители/родители
всех
участников
исследования
подписывали
информированные согласия.
Лабораторные и генетические исследования выполнены в клинико-диагностической
лаборатории и лаборатории молекулярной генетики ФГБУ НМИЦ ДГОИ им.Д.Рогачева. Для
каждого возраста определена норма показателей гемограммы, иммунограммы, содержания
общего витамина В12 в соответствии с данными клинической лаборатории ФГБУ НМИЦ
ДГОИ
им.Д.Рогачева.
Лабораторная
диагностика
проводилась
с
использованием
общепринятых методик согласно инструкциям производителя.
Концентрацию сиролимуса определяли хемилюминесцентным иммуноанализом на
микрочастицах (CMIA) на системе ARCHITECT i System (Abbott, США).
При проведении молекулярно-генетического обследования пациентов поиск мутаций в
генах FAS, FASL, CASP8, CASP10, KRAS, NRAS, PI3KD, CTLA4 проводился методом прямого
секвенирования по Сэнгеру на приборе Genetic Analyzer 3130xl (Applied Biosystems, США),
согласно протоколу производителя. При отсутствии мутаций в данных генах у 25 пациентов c
АЛПС-фенотипом и у трех пациентов с АЛПС было проведено исследование методом NGS
(секвенирование следующего поколения) на платформе
MiSeq
(Illumina, США), с
использованием кастомной гибридизационной панели «Приобретенный иммунитет и
цитопении» (Agilent, США), которая включает в себя 252 гена; 4 пациентам с АЛПС
фенотипом
выполнено
панельное
секвенирование
с
использованием
кастомной
гибридизационной панели «Врожденный иммунитет» (Agilent, США), согласно протоколу
производителя.
Одной пациентке с минимальной аномалией развития сердца (правосторонняя дуга
аорты) проведен метод флуоресцентной гибридизацией in situ (FISH) с ДНК-зондом TUPLE 1
(HIRA), согласно инструкции производителя, для выявления делеции 22 хромосомы.
Нескольким пациентам (n=21) была выполнена биопсия ткани лимфатического узла.
Патогистологическое
исследование
проводилось
с
использованием
рутинных
гистохимических окрасок гематоксилином и эозином. Во всех случаях проведено
иммуногистохимическое исследование с антителами против CD20, Pax5, CD3, CD4, CD8, TdT,
Ki67, LMO2, CD10, CD79a, CD34, EBV, in situ гибридизация методом FISH с зондом EBER.
Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием
программного обеспечения XLSTAT, Addinsoft, 2015 и R 3.4.1, R Foundation, 2018. Показатели
приведены в виде среднее ± среднеквадратическое отклонение (если не сказано иное) или
8
медиана [1-й квартиль, 3-й квартиль]. Использованы столбиковые диаграммы для среднего ±
среднеквадратическое отклонение, ящечковые диаграммы с квартилями (поверх также
нанесено среднее).
Для проверки гипотез о различии средних значений использован t-критерий Стьюдента.
Для анализа эффективности терапии использован t-критерий для связанных наблюдений с
поправкой Бонферрони. Для обработки данных в группе пациентов и проверки статистических
гипотез о связи клинических признаков с содержанием В12 в сыворотке крови был
использован коэффициент корреляции Пирсона; проверка гипотез для коэффициента
корреляции производилась с помощью t- распределения. Выводы считались достоверными при
значении р <0.05.
Общая и молекулярно-генетическая характеристика группы пациентов с АЛПСфенотипом из группы дифференциальной диагностики
Пациенты (n=29) данной группы имели большие диагностические признаки из
критериев диагностики АЛПС. Впоследствии у них были определены отличные от АЛПС
генетические
дефекты.
Все
мутации
за
исключением
пациентов
с
семейным
гемофагоцитарным лимфогистиоцитозом (FHL) выявлены в гетерозиготном состоянии. В
генах UNC13D, STXBP2 – мутации в компаунд-гетерозиготном состоянии. Наиболее
представленными оказались пациенты с синдромом активированной PI3K (дефекты гена
PIK3CD – 5, PIK3R1 –2),
RAS-ассоциированным лейкопролиферативным заболеванием
(RALD) - 4, дефектом CTLA4 - 3, с наследственным гемафагоцитарным лимфогистиоцитозом
(мутации генов UNC13D - 1, STXBP2 - 1), с дефектом гена STAT3 с приобретением новой
функции белка -2, с изменениями в гене PSTPIP1 – 2. Остальные генетические дефекты (9)
встречались в единичном варианте. К моменту завершения исследования: один пациент умер,
6 пациентам проведена аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток.
Общая и молекулярно-генетическая характеристика пациентов из группы АЛПС
Из 28 пациентов данной группы 2 пациента с мутациями гена FAS и 3 пациента с
мутациями в CASP10 не имели малых диагностических критериев ESID. На момент
завершения исследования в данной группе живы все пациенты. У 21 пациента были
обнаружены характерные для АЛПС герминальные генетические дефекты, в гетерозиготном
состоянии, большую часть (n=18) составили дети с мутацией в гене FAS, что соответствует
литературным данным [Teachy, 2012]. Среди них преобладали мутации, приводящие к
изменению внутриклеточной части белка FAS (15 человек), преимущественно домена смерти
(11 человек) (рисунок 1).
9
Внеклеточная часть
1
2
3
Внутриклеточная часть
4
5
6
7
8
9 DD
c.676+1G>C
с.28Del(C)
с.63+ATAAGCCCTG
c.334G>C
c. 580delG (2)
с. 653-2 A>C
с.722 С > Т
c. 748 С >Т (2)
с.749 G > A
c 778 G > C
с.779 A > G (3)
c.784 A > C
c.874_880del
с.950 A > T
Рисунок 1. Локализация мутаций в гене FAS у наших пациентов
Три пациента имели мутации в гене CASP10: один ребенок с CASP10: c.305 T>G
p.V102G, два других пациента, из разных семей, имели одинаковую мутацию в гене CASP10
(с.1216А>T, Ile406Leu), одна из них также имела гетерозиготную герминальную мутацию в
гене CBL (c.1259G>A, p.Arg420Gln).
Семь пациентов соответствовали диагностическим критериям АЛПС, но не имели
герминальных изменений в генах FAS, FASL, CASP8, CASP10.
Характеристика носителей мутаций
При молекулярно-генетическом обследовании родителей пациентов, которые на
момент исследования не имели клинических проявлений заболевания, у девяти человек
выявлены нуклеотидные замены в генах FAS (n=7) и CASP10 (n=2) (Таблица 2). Большинство
из них, с их слов, никогда не имели симптомов АЛПС, только у троих отцов в детстве
отмечалась лимфопролиферация и цитопении, потребовавшие проведения ГКС терапии.
У всех в настоящее время бессимптомных носителей (кроме одного) не отмечено значимого
повышение биомаркеров АЛПС: среднее содержание ДНТ составило 3,12 ± 3,3%, общий
витамина B12 - 467 ± 173 пг/мл.
10
Таблица 2. Сводные данные по пациентам и носителям мутаций
ГЕНЫ/МУТАЦИИ
КОЛИЧЕСТВО
КОЛИЧЕСТВО
ПАЦИЕНТОВ
НОСИТЕЛЕЙ
с проявлениями
без проявлений
FAS: c. 580 delG
2
2
FAS: с.722 С > Т
1
1
FAS: c. 748 С >Т
2
1
FAS: с.779 A > G
3
1
FAS: с.874_880del
1
FAS: с.950 A > T
1
1
CASP10: с.1216 А > T
2
2
1
Характеристика клинических проявлений у пациентов с АЛПС
У большинства пациентов, начиная с дебюта заболевания, первым и основным
клиническим
проявлением
являлось
сочетание
гемопатий и лимфопролиферативного синдрома (n=22), сводные данные приведены в таблице
3. Онкогематологической патологии в данной группе не было.
Таблица 3. Клиническая характеристика пациентов с АЛПС
Показатель
пациенты (n=28)
Изолированный лимфопролиферативный синдром
4
Изолированные гемопатии
2
Комбинация лимфопролиферация + гемопатии
22
Аутоиммунный гепатит
2
Васкулит
1
Рецидивирующие инфекционные эпизоды
4
Балл по ЛПС, медиана [Q1;Q3]
5 [3;6]
Балл по гемопатиям, медиана [Q1;Q3]
5 [1,75;7]
11
При анализе тяжести клинических проявлений, выраженных как сумма баллов степени
выраженности лимфопролиферативного синдрома и цитопений,
не было обнаружено
достоверных различий в зависимости от локализации мутации (таблица 4).
Таблица 4. Тяжесть клинических проявлений в зависимости от локализации изменений
белка FAS
Локализация изменений
Средний балл клинических проявлений
Внеклеточная часть
p
12 ± 13
0,8
Внутриклеточная часть
11 ± 6
Клиническая характеристика пациентов с АЛПС-фенотипом
Среди
дебюта пациентов с АЛПС-фенотипом из
группы
дифференциальной
диагностики стоит отметить наличие дополнительной симптоматики, которая практически не
встречалась у наших пациентов с АЛПС (рисунок 2), например, рецидивирующие, тяжелые
инфекционные проявления до развития или в сочетании с лимфопролиферативным синдром и
гемопатиями, лихорадка, энтероколиты, кожные проявления (специфические поражение на
фоне основного заболевания).
Лимфома Ходжкина
ЮММЛ
ВПР
ХКСК
Кожные проявления
Лихорадка
Аутоиммунные проявления
Энтероколит
Инфекции
Цитопении
ЛПС
АЛПС-фенотип
АЛПС
0
5
10
15
20
25
30
35
Рисунок 2. Сравнительная характеристика дебюта заболевания пациентов с АЛПС и
АЛПС-фенотипом. Сокращения: ЮММЛ – ювенильный миеломоноцитарный лейкоз, ВПР –
врожденные пороки развития, ХКСК – хронический кожно-слизистый кандидоз, ЛПС –
лимфопролиферативный синдром.
12
Лабораторная характеристика пациентов
При исследовании показателей общего анализ крови, иммуноглобулинов сыворотки
крови, основных субпопуляций лимфоцитов
не выявлено значимых различий между
пациентами двух групп.
Оценка биологических маркеров
В группе пациентов с АЛПС ДНТ-клетки были повышены у 22 пациентов из 27 (об
одном пациенте нет данных) и варьировали от 6,6% до 45% (M 9,2 [6,8; 15,8]%). Нормальные
показатели ДНТ (0,4 - 1,4%) отмечены у трех пациентов с мутациями в CASP10. Пограничное
повышение ДНТ (3,4 - 5,78 %) наблюдалось у двух пациентов с мутациями в гене FAS.
Среди пациентов с АЛПС-фенотипом оценка числа ДНТ проводилась у 27
человек из 29. Повышения более 6% не было отмечено ни в одном случае, показатель
варьировал с 0,01 до 4,24 % (M 1,56 [0,73; 2,04] %) (рисунок 3). Различия между группами
ДНТ, %
статистически значимые p<0,05.
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
АЛПС
АЛПС-фенотип
Рисунок 3. Различия в относительном содержании ДНТ-клеток в периферической крови
в группах пациентов с АЛПС и АЛПС- подобным фенотипом
Содержание общего витамина В12 в группе пациентов с АЛПС определялся у 23
человек
и
варьировал
пг/мл). Содержание общего
тяжестью
от
500
витамина
до
10174
B12
при
течения заболевания,
балов цитопений и лимфопролиферации,
пг/мл
(Мe 2208
постановке
4999]
диагноза коррелировало с
выраженной
коэффициент
[1665,5;
как
сумма
корреляции составил 0,58,
p=
0,003 (Рисунок 4: А). При раздельном анализе мы обнаружили очень слабую корреляцию со
степенью
выраженности цитопений (r=0,3)
и
высокую
корреляцию
выраженности лимфопролиферативного синдрома (r=0,86), p < 0,001
13
со
степенью
(Рисунок 4: В, С).
12000
10000
10000
В12, пг/мл
В12, пг/мл
12000
8000
6000
4000
8000
6000
4000
2000
2000
0
0
0
5
10
15
20
25
0
баллы
А
5
В
10
15
20
25
баллы
12000
В12, пг/мл
10000
Рисунок 4. Корреляция содержания витамина B12 с тяжестью
8000
заболевания.
6000
4000
А. Соотношение концентрации общего витамина B12 и тяжести
2000
заболевания (сумма баллов лимфопролиферации и гемопатии) у
0
0
С
2
4
6
8
отдельных пациентов. Линией представлен тренд корреляции этих
10
баллы
показателей. r= 0.54.
В. Соотношение концентрации общего витамина В12 и
выраженности гемопатий, r= 0,3 %.
С. Соотношение концентрации общего витамина В12 и
выраженности лимфопролиферации, r= 0,86.
14
Общий витамин В12 в группе пациентов с АЛПС-фенотипом определялся у 12 человек
и варьировал от 191 до 1527 пг/мл (M 471,5 [305; 893,5] пг/мл). Различия между группами в
содержании витамина В12 статистически достоверны (p<0,001) (рисунок 5).
12000
10500
В12, пг/мл
9000
7500
6000
4500
3000
1500
0
АЛПС
АЛПС-фенотип
Рисунок 5. Различия в содержании общего витамина В12 сыворотки крови в группах
пациентов с АЛПС и АЛПС- подобным фенотипом
Лечение пациентов с АЛПС
Оценивалась терапия сиролимусом (SRL) у 22 пациентов с АЛПС, поделенных на две
группы в зависимости от дозы препарата. 12 пациентам ранее проводили разнообразную
неэффективную иммуносупрессию, в том числе у одного пациента выполнена спленэктомия.
Четырнадцать пациентов получили SRL в качестве монотерапии. Остальным проводилась
комбинированная иммуносупрессивная терапия, которую отменили в течение первых месяцев
приема SRL: ГКС у пяти пациентов, ритуксимаб - у двоих, микофенолат мофетил - у одного
ребенка.
Эффективность терапии сиролимусом
Группы один и два достоверно не отличались по средней степени выраженности
лимфопролиферации и гемопатий у пациентов на момент начала терапии (таблица 5, рисунок
6) (p>0.05). В первой группе, состоявшей из 14 человек, средняя доза сиролимуса составила
2,48±0,36 мг/м2, средняя концентрация препарата в крови 9,67±3,59 нг/мл. У двух пациентов
терапия расценена как неэффективная.
Во второй группе, состоявшей из 8 человек, средняя доза сиролимуса составила
1,44±0,26 мг/м2, средняя концентрация препарата в крови 5,01±2,65 нг/мл. У 7 из 8 пациентов
данной группы терапия была оценена как эффективная.
Через 6 месяцев терапии у пациентов обоих групп отмечено значительное, достоверное
(p<0,05) сокращение клинических проявлений, которые практически разрешились к 12 месяцу
15
терапии (таблица 5, рисунок 6). Через 12 месяцев терапии показатели активности заболевания
не отличались в первой и второй группе (р>0.05).
Таблица 5. Временная динамика основных клинических проявлений в двух группах
до SRL
1 группа
(n=14)
2 группа
через 6 месяцев
ГП,
ЛПС,
ГП,
ЛПС,
ГП,
баллы
баллы
баллы
баллы
баллы
баллы
4,69 ±
3,54 ±
2,23 ±
0,31 ±
1,08 ±
0,15±0,38
<0,05
1,89
3,73
1,09
0,48
0,76
4 ± 2,45
6,43 ± 2,7
1,15 ±
0.71 ±
1 ± 1,26
0,33 ±
<0,05
0,45
0,49
В
10
6
8
4
2
0,52
SRL 1-2 мг/м2
8
баллы
баллы
SRL 2-3 мг/м2
6
4
2
0
0
-2
p
ЛПС,
(n=8)
А
через 12 месяцев
0 мес
6 мес SRL 12 мес
SRL
ЛПС
-2
ГП
0 мес
6 мес SRL 12 мес
SRL
ЛПС
ГП
Рисунок 6. Динамика основных симптомов АЛПС, выраженных в условных баллах, на
фоне терапии сиролимусом. А – терапия сиролимусом в дозе 2-3 мг/м2, В – терапия
сиролимусом в дозе 1-2 мг/м2
Изменение режима дозирования SRL
По достижении ремиссии семь пациентов из первой группы переведены на
поддерживающую дозу SRL, средняя доза препарата у них составила 1,06 ± 0,29 мг/м2,
средняя концентрация сиролимуса в крови 4,35±2,26 нг/мл, максимальное время наблюдения в
этой группе составило 15,57 ± 4,47 мес. При оценке проявлений заболевания в максимальный
срок 12 месяцев в данной группе не отмечено нарастания клинической симптоматики (рисунок
7).
16
2,5
баллы
2
1,5
1
0,5
0
0 месяцев
3 месяца
6 месяцев
12 месяцев
Рисунок 7. Суммарная характеристика выраженности проявлений заболевания у семи
пациентов с АЛПС, переведенных с терапии стандартной дозой на терапию SRL в
поддерживающей дозе
По достижении ремиссии восьми пациентам терапия была отменена. Средний период
наблюдения составил 6,5±1,04 месяцев. У всех пациентов отмечалось нарастание симптомов
АЛПС (как лимфопролиферации, так и цитопений) с 0,68±0,69 баллов в момент отмены
(суммарно) до 3,59±4,02 баллов через 6 месяцев (суммарно) (рисунок 8) пяти пациентам
терапия SRL к настоящему времени была возобновлена.
14
12
баллы
10
8
6
4
2
0
0 месяцев
3 месяца
6 месяцев
Рисунок 8. Характеристика выраженности проявлений заболевания у 8 пациентов с
АЛПС после отмены терапии SRL.
17
Оценка биомаркеров
На фоне терапии отмечалось достоверное снижение относительного количества ДНТ-
ДНТ, %
клеток (рисунок 9) с 11,55 ± 9,54% до 3,27 ± 2,01 % (p<0,001).
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
до SRL
на SRL
Рисунок 9. Динамика содержания ДНТ в периферической крови у пациентов с АЛПС до
и через 12 месяцев терапии сиролимусом, p<0,001.
Концентрация общего витамина В12 оценена у 19 пациентов до начала терапии SRL и у
15 - через 1 год терапии. На фоне лечения отмечалось достоверное снижение концентрации
общего витамина В12 с 2815 ±1906 пг/мл до 747±444 пг/мл (p<0,001) (рисунок 10).
7000
6000
В12, пг/мл
5000
4000
3000
2000
1000
0
До SRL
На SRL
Рисунок 10. Концентрация общего витамина В12 у пациентов с АЛПС до (n=19) и через
12 месяцев терапии SRL (n=15) (p <0,001)
18
Оценка безопасности терапии
Пациенты с АЛПС переносили терапию SRL хорошо, без выраженных лабораторных и
других изменений. У семи пациентов отмечены преходящие проявления афтозного стоматита,
не потребовавшие снижения дозы SRL или отмены препарата. Эритематозная сыпь
наблюдалась у двух пациентов, она также носила преходящий характер. У одного пациента на
фоне терапии отмечалось учащение инфекций верхних дыхательных путей. У одного пациента
на фоне применения рапамуна развилась ветряная оспа, которая осложнилась течением
менингита, вызванного Herpes zoster. Нельзя точно сказать, были ли эти события
взаимосвязаны. На время лечения менингита SRL был отменен, без ухудшения статуса по
АЛПС, далее возобновлен в полной дозе. Менингит у пациента разрешился без
неврологических осложнений. Из значимых сопутствующих патологий у одного пациента
диагностирован хронический гепатит В в стадии минимальной активности. На фоне терапии
сиролимусом не отмечено отрицательной динамики в течение гепатита В у этого больного.
Сиролимус в терапии пациентов из группы дифференциальной диагностики
В данной группе попытка терапии сиролимусом предпринималась всего у 20 человек.
17 человек получало ранее разнообразную иммуносупрессивную терапию, без достаточного
ответа и контроля заболевания, только у троих пациентов SRL явился иммуносупрессивным
препаратом первой линии. Сводные данные по возрасту начала и режиму дозирования SRL
приведены в таблице 6.
Таблица 6. Сводная информация о терапии сиролимусом в группе пациентов с АЛПСфенотипом
Возраст начала SRL, мес
84,25 ± 52,4
Доза, мг/м2
2,1 ± 0,6
Min концентрация препарата в крови, нг/мл
8,6 ± 4,4
Длительность SRL, месяцы
13,4±13,7
Из 20 пациентов, которым инициировали терапию SRL, двое находятся на ранних
сроках (<3 месяцев и не включены в оценку), 10 человек получили лечение SRL более 12
месяцев, но только 5 из них продолжают его в настоящее время, остальным пациентам на
разных (ранних) временных этапах терапия была отменена по причине недостаточной
19
эффективности и в ряде случае токсичности. Из 10 человек, которым проводилась терапия
SRL более 12 месяцев, 7 пациентов получали комбинированную иммуносупрессию (в 4
случаях с использованием ритуксимаба) и 3 человека - монотерапию SRL. На фоне терапии
наблюдалась неоднозначная динамика со стороны основных клинических проявлений
(таблица 7, рисунок 11).
Таблица 7. Временная динамика основных клинических проявлений в двух группах
до SRL
Комбинация
SRL
(n=3)
ГП,
ЛПС,
ГП,
ЛПС,
ГП,
баллы
баллы
баллы
баллы
баллы
баллы
5 ± 1,73
3,43 ±
3,14 ±
3,9
1,07
5,67 ±
7 ± 3,5
2,33 ±
1,53
А
1 ± 0,58
1±1
моно SRL (n=3)
В
8
6
баллы
8
6
1,6
1,8
2,67 ±
1,67 ±
2,1
0,57
2
2
0
0
-2
6 месяцев 12 месяцев
терапии
терапии
0 мес
>0,05
6 месяцев 12 месяцев
терапии
терапии
ЛПС
ГП
>0,05
4
4
ЛПС
2,29 ±
p
SRL + дополнительная
иммуносупрессивная терапия (n=7)
10
0 мес
2,29 ±
0,57
12
баллы
через 12 месяцев
ЛПС,
(n=7)
Моно
через 6 месяцев
ГП
Рисунок 11. Пациенты с АЛПС-подобным фенотипом, получившие терапию SRL в
течение ≥ 12 месяцев, в виде моно- и комбинированной терапии сиролимусом: А.
Монотерапия сиролимусом (p>0,05). В. Терапия сиролимусом в составе комбинированной
иммуносупрессии: наблюдаются значимые различия в динамике лимфопролиферативного
синдрома p<0,05, по цитопениям значимых различий не получено p>0,05.
20
Переносимость терапии сиролимусом в группе пациентов с АЛПС-фенотипом
В группе пациентов с АЛПС-фенотипом наблюдались разнообразные побочные
эффекты, преимущественно инфекционные осложнения (у 20% пациентов).
Сравнительный анализ терапии сиролимусом в двух группах АЛПС и
дифференциальной диагностики
Терапия в группе пациентов с АЛПС-фенотипом оказалась малоэффективной (таблица 8)
Таблица 8. Сравнение эффективности и переносимости терапии SRL
терапия сиролимусом
пациенты
полная
частичная
отсутствие
побочные
эффективность
эффективность
эффективности
эффекты
АЛПС, %
91
4,5
4,5
32
АЛПС-
17
72
11
50
фенотип, %
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
У большинства детей данного исследования из группы пациентов с аутоиммунным
лимфопролиферативным синдромом и группы дифференциальной диагностики отмечалось
типичное для АЛПС сочетание лимфопролиферации и иммунных цитопений. Возраст дебюта
заболевания, а также степень выраженности основных клинических проявлений
–
лимфопролиферации и цитопении – в двух группах не отличались. Тем не менее, практически
у половины пациентов с АЛПС – подобным фенотипом наблюдалась дополнительная
клиническая симптоматика, преимущественно инфекционного генеза. При исследовании
показателей
общего
анализ
крови,
иммуноглобулинов
сыворотки
крови,
основных
субпопуляций лимфоцитов не выявлено значимых различий между пациентами двух групп,
что говорит о невозможности использования данных показателей в качестве маркеров
дифференциальной диагностики. При сравнении показателей относительного содержания
ДНТ-клеток и общего витамина В 12 сыворотки у пациентов с АЛПС и АЛПС – фенотипом
были получены достоверные различия: в большинстве случае пациенты с АЛПС
21
удовлетворяли диагностическим критериям ESID, в то время как пациенты из группы
дифференциальной диагностики – нет. Тем не менее, при проведении лабораторных
обследований пациентов с подозрением на АЛПС необходимо помнить: несмотря на высокую
диагностическую значимость повышения ДНТ - клеток (выявлено у 22 из 27 обследованных
пациентов с АЛПС), их содержание может быть нормальным у пациентов с мутациями,
отличными от дефектов гена FAS: при мутациях в гене CASP10 по нашим данным и в гене
FASL по данным предшествующих публикаций [Bi и соавт., 2007, Wu и соавт.,
1996].
Повышение концентрации общего витамина В12 сыворотки крови считается
биомаркером АЛПС и дополнительным критерием диагноза [Oliveira и соавт., 2010, Price и
соавт., 2014]. Наши данные говорят о том, что повышение В12 является не столько
диагностическим критерием, сколько маркером выраженности проявлений заболевания, в
большей
степени
лимфопролиферации.
Он
может
использоваться
не
только
для
подтверждения диагноза АЛПС, но и для оценки тяжести состояния пациента и контроля
эффективности терапии.
Как и для многих аутосомно-доминантных заболеваний, для АЛПС характерна
вариабельная пенетрантность у различных членов семьи, несущих одинаковый генетический
дефект, а самая высокая пенетрантность, до 90%, для клинического фенотипа с изменениями
нуклеотидных последовательностей гена FAS, наблюдается при поражении внутриклеточного
домена, в частности домена смерти [Infante и соавт.,1998, Jackson и соавт., 1999]. Наше
исследование косвенно подтверждает это наблюдение: большинство пациентов
имели
дефекты именно внутриклеточного домена FAS. При сопоставлении тяжести клинических
проявлений и локализации мутаций среди наших пациентов не было получено корреляции.
В нашем исследовании мы
показали эффективность и безопасность лечения
сиролимусом в группе детей с АЛПС. Помимо клинической эффективности, терапия
сиролимусом в нашей группе способствовала практически полной нормализации таких
биомаркеров АЛПС, как ДНТ-клеток и сывороточной концентрации общего витамина В12.
Терапия сопровождалась хорошей переносимостью препарата и минимальной токсичностью.
К сожалению, отмена SRL после достижения пациентами ремиссии приводит к постепенному
рецидиву заболевания, как показывает наш опыт, в большинстве случаев, в течение полугода.
Предшествующие публикации [Teachey и соавт., 2009, Bride и соавт., 2016] в основном
описывают эффективность стандартных доз сиролимуса в лечении АЛПС. Наше исследование
продемонстрировало как эффективность перехода на поддерживающую дозу сиролимуса
после курса терапии в стандартной дозе, так и эффективность изначально низких (1-2 мг/м2)
доз препарата в группе педиатрических пациентов. Подбор минимально достаточной дозы
препарата требует дальнейших исследований.
22
Среди пациентов с АЛПС - подобным фенотипом терапия сиролимусом была признана
полностью эффективной только в 17 % случаев (3 пациента из 18), а в 72 % случаях терапия
расценена,
как
частично
эффективная
и
требовавшая
назначения
дополнительной
иммуносупрессии. По сравнению с пациентами с АЛПС, у пациентов из группы
дифференциальной
диагностики
в
большем
проценте
случаев
наблюдалась
плохая
переносимость лечения (те или иные побочные эффекты отмечены у 50 % пациентов, в том
числе в 15 % случаев произошла отмена препарата по причине выраженной токсичности), чего
не наблюдалось у пациентов с АЛПС. Полученные данные свидетельствуют, что сиролимус не
является препаратом выбора в лечении пациентов с ПИДС с АЛПС-подобными клиническими
проявлениями. Данные пациенты нуждаются в тщательной дифференциальной диагностике, с
проведением молекулярно-генетического исследования, с целью выбора адекватной тактики
лечения, в том числе таргетной терапии.
ВЫВОДЫ
1.
В исследуемой группе пациентов с АЛПС наиболее частым генетическим
дефектом являлась мутация гена FAS, редко - CASP10, не были выявлены мутации в
генах FASL, FADD, CASP8. Пациенты, имеющие АЛПС – фенотип, были представлены
гетерогенной группой генетических дефектов, среди которых преобладали пациенты с
синдромом активации PI3K.
2.
При
сопоставлении
основных
клинических
проявлений
(лимфопролиферативный синдром и цитопении), лабораторных показателей (общий
анализ крови, иммуноглобулины сыворотки, основные субпопуляции лимфоцитов
CD3+, CD4+, CD8+, CD19+) не было выявлено значимых различий между пациентами с
АЛПС и АЛПС-подобным фенотипом, однако биомаркеры (общий витамина В 12
сыворотки и относительное содержание ДНТ-клеток) достоверно различались в двух
группах и, следовательно, могут
являться маркерами для дифференциальной
диагностики.
3.
Аутоиммунный
лимфопролиферативный
синдром
характеризуется
разнообразием клинических проявлений и их вариабельной пенетрантностью. При
анализе тяжести клинических проявлений в зависимости от локализации мутации в
гене FAS не было выявлено достоверной корреляции генотип-фенотип.
23
4.
Концентрация общего витамина В12 при АЛПС
коррелирует со степенью
выраженности лимфопролиферативного синдрома и может быть использована для
контроля эффективности терапии АЛПС.
5.
Терапия Сиролимусом у пациентов с АЛПС является эффективной и безопасной
в том числе в поддерживающей дозе, 1 – 1,5 мг/м2. Сиролимус мало эффективен у
пациентов, фенотипически схожих с АЛПС, в связи с чем, генетическое подтверждение
диагноза является ключевым аспектом выбора патогенетической терапии при синдроме
аутоиммунной цитопении и лимфопролиферации.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1.
При фенотипе аутоиммунного лимфопролиферативного синдрома с отсутствием
мутаций в генах – FAS, CASP10, учитывая их преимущественную встречаемость у
пациентов с АЛПС, а также чрезвычайно гетерогенный спектр генетических дефектов,
лечащих
в
основе
АЛПС-подобных
заболеваний,
рекомендовано
проведение
панельного секвенирования.
2.
У пациентов с АЛПС-фенотипом рекомендовано определение содержания
общего витамина В 12 сыворотки крови, которое более, чем относительное содержание
ДНТ, коррелирует с выраженностью симптомов заболевания.
3.
Рекомендовано проведение терапии сиролимусом для пациентов с АЛПС в дозе
1-3 мг/м2, под контролем минимальной концентрации препарата в крови
24
СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1.
Эффективность сиролимуса в терапии аутоиммунного лимфопролиферативного
синдрома / О. А. Швец, Е. В. Дерипапа, И. Н. Абрамова, Е. А. Викторова и др. //
Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии. - 2018. - Том 17,
№1. – с.17‒25.
2.
Клинико-лабораторные
особенности
пациентов
с
аутоиммунным
лим-
фопролиферативным синдромом / О. А. Швец, Е. В. Дерипапа, В. В. Захарова, Д. С.
Абрамов и др. // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии. 2017. - Том 16, №4. – с.27–34.
3.
Швец О. А. Аутоиммунный лимфопролиферативный синдром / О. А. Швец, А.
Ю. Щербина // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии. 2016. - Том 15, №1. – с.34–40.
25
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ESID - Европейское общество иммунодефицитных состояний (European Society for
Immunodeficiencies)
SRL – сиролимус (sirolimus)
АЛПС – аутоиммунный лимфопролиферативный синдром
ДНТ – дубль-негативные Т-лимфоциты
ПИДС - первичное иммунодефицитное состояние
26
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа