close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Некоторые клинико-морфологические и молекулярно-генетические аспекты у пациенток с клиническими признаками наследственного рака молочной железы

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
ЧЕБОТАРЁВА Елизавета Александровна
НЕКОТОРЫЕ КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ У
ПАЦИЕНТОК С КЛИНИЧЕСКИМИ ПРИЗНАКАМИ
НАСЛЕДСТВЕННОГО РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
14.01.12-онкология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Ростов-на-Дону – 2018 г.
2
РАБОТА ВЫПОЛНЕНА В ФЕДЕРАЛЬНОМ ГОСУДАРСТВЕННОМ БЮДЖЕТНОМ
УЧРЕЖДЕНИИ «РОСТОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ
ИНСТИТУТ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
(Генеральный директор – член-корр. РАН, доктор медицинских наук, профессор О.И. КИТ)
Научный руководитель:
доктор медицинских наук
Шатова Юлиана Сергеевна
Официальные оппоненты:
Родионов Валерий Витальевич – доктор медицинских
наук, профессор, Федеральное государственное
бюджетное учреждение «Национальный медицинский
исследовательский центр акушерства, гинекологии и
перинатологии имени академика В.И. Кулакова»
Министерства здравоохранения Российской Федерации,
заведующий отделением патологии молочной железы
Криворотько Петр Владимирович – доктор
медицинских наук, Федеральное государственное
бюджетное учреждение «Национальный медицинский
исследовательский центр онкологии имени Н.Н.
Петрова» Министерства здравоохранения Российской
Федерации, заведующий отделением опухолей
молочной железы
Ведущая организация:
Научно-исследовательский институт онкологии
Федерального государственного бюджетного научного
учреждения «Томский национальный
исследовательский медицинский центр Российской
академии наук»
Защита диссертации состоится "___" _________ 2018 г. в ____ часов на заседании
совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д.208.083.02 на базе федерального
государственного бюджетного учреждения «Ростовский научно-исследовательский
онкологический институт» Министерства здравоохранения Российской Федерации (344037,
г. Ростов-на-Дону, 14 линия, 63).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте www.rnioi.ru
федерального государственного бюджетного
учреждения
«Ростовский
научноисследовательский онкологический институт» Министерства здравоохранения Российской
Федерации.
Автореферат разослан "_____"_______________ 2018 г.
Ученый секретарь совета
по защите докторских и кандидатских диссертаций
доктор биологических наук, доцент
Дженкова Е.А.
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования
Рак молочной железы (РМЖ) является наиважнейшей проблемой из-за
высочайшей заболеваемости и смертности от него. Контролировать рост этой
патологии достаточно сложно по причине отсутствия эффективных путей
первичной
профилактики
(Коновалова
В.Н.,
Сметник
В.П.,
2011;
Семиглазов В.Ф., 2011; 2013). Актуальной представляется ранняя диагностика,
которая может оказать влияние на снижение смертности (Евсеева, Е.В.,
Груздева И.И., Надежин А.С., 2014). Несмотря на то, что проблеме РМЖ
уделяется много внимания, до сих пор нерешенными остаются вопросы
применения прогностических маркеров и предикторов в ежедневной практике
онколога. А по мере появления новых знаний их перечень увеличивается.
Таким образом, на первый план выступает проблема выбора спектра
выполняемых исследований.
Сейчас уже нельзя рассматривать РМЖ как единообразное заболевание
(Семиглазов В.Ф., 2011; 2012). Имеются данные о корреляции известных
клинических и фенотипических различий на уровне экспрессии генов (Perou C.M.
et al., 2000; Sorlie T. et al., 2003). Несомненно, что факторы этиологии и риска, а
также пусковые механизмы развития РМЖ, весьма гетерогенны (Гарин А.М.,
2005; 2006). В 1982 году W. Albano et al. выделили «наследственный РМЖ»
(НРМЖ), как особую нозологическую единицу. Одним из значительных
достижений в исследовании наследственных форм РМЖ явилось открытие генов
BRCA1 и
BRCA2. Вероятность развития РМЖ у женщин-носительниц
чрезвычайно высока (Фарахтдинова А.Р., 2012; Antoniou A.C. et al., 2008; 2013).
Риск развития РМЖ в возрасте до 70 лет при мутации гена BRCA1 определяют до
84% случаев, а при мутации гена BRCA2 – до 35% (Часовникова О.Б. и соавт.,
2010; 2013). Рядом ученых отмечена фенотипическая гетерогенность РМЖ,
обусловленная
герминальными
мутациями
генов
BRCA1
или
BRCA2
(Батенева Е.И. и соавт., 2011). Дефекты генов BRCA характеризуются высокой
пенетрантностью и широкой географической вариабельностью (Ширлина Н.Г. и
соавт., 2014; Шумель А.К. и соавт., 2016; Navarro de Souza A. et al., 2014).
Проведенные исследования на территории Российской Федерации показали, что
4
это справедливо и в отношении нашей страны, и Ближнего Зарубежья (Батенева
Е.И. и соавт., 2014; Федоров В.Э. и соавт., 2015; Писарева Л.Ф. и соавт. 2017;
Steffen J. et al., 2006; Kaufman B. et al., 2014). На наш взгляд, Ростовская область
также представляет собой интересный для изучения в этом плане регион с
оседлым проживанием различных групп населения.
Степень разработанности темы
Как упоминалось выше, мутации BRCA 1 и BRCA 2 в настоящее время
считаются достоверно установленными маркерами НРМЖ. Однако, они не
являются
единственными,
обуславливающими
особенности
BRCA-
ассоциированного рака молочной железы. Многочисленные данные литературы
свидетельствуют
об
интенсивном
исследовании
других
молекулярно-
генетических и иммуногистохимических маркеров, включая p95, HER2
(Scaltriti M. et al., 2007; Loibl S. et al., 2011), PTEN (Perez E.A. et al., 2011),
PI3-киназу (Lo Russo P. et al., 2010; Cook J.W. et al., 2011), топоизомеразу 2α
(Burcombe R.J. et al., 2002; Pritchard K.I. et al., 2008; Esteva F.J. et al., 2009;
Harris L.N. et al., 2009), C-MYC (Perez E.A. et al., 2011), IGF-1R (Reinholz M.M.
et al., 2011; Yerushalmi R. et al., 2012), но до настоящего времени не установлено
достоверное значение ни одного из них. В то же время в литературе
отсутствуют данные о возможной взаимосвязи молекулярно-генетических,
иммуногистохимических и сывороточных маркеров при наследственном и
спорадическом РМЖ. Комплексное применение этих показателей позволит
добиться большей результативности диагностики и лечения рака молочной
железы (Семиглазов В.Ф. и соавт., 2011, Иванова О.А. и соавт., 2012; Lee J.S. et
al., 2013).
Цель исследования
Изучить
клинико-морфологические
и
молекулярно-генетические
характеристики клинически наследственного рака молочной железы c
подтвержденной и без подтвержденной мутацией BRCA 1, BRCA 2 в сравнении
со спорадическим раком молочной железы.
Поставленная цель достигалась решением следующих задач:
1.
Изучить
наследственного
клинико-анамнестические
рака
молочной
железы
особенности
с
клинически
подтвержденной
и
без
5
подтвержденной мутацией BRCA1, BRCA2 в сравнении со спорадическим раком
молочной железы.
2.
Изучить
иммуногистохимические
характеристики
(уровни
экспрессии топоизомеразы 2α, рецепторов эстрогена, прогестерона, андрогенов,
Е-кадгерина, показатель Ki67, HER2neu статус) клинически наследственного
рака молочной железы с подтвержденной и без подтвержденной мутацией
BRCA1, BRCA2 в сравнении со спорадическим раком молочной железы.
3.
Изучить уровни опухолевых маркеров СА 15-3 и sHer2-neu
внеклеточного домена в сыворотке крови больных клинически наследственным
раком молочной железы с подтвержденной и без подтвержденной мутацией
BRCA1, BRCA2 в сравнении со спорадическим раком молочной железы.
4.
Изучить данные ДНК цитометрии (плоидность) опухоли при
клинически наследственном раке молочной железы с подтвержденной и без
подтвержденной мутацией BRCA1, BRCA2 в сравнении со спорадическим раком
молочной железы.
Новизна исследования
- Впервые в сравнительном аспекте изучены закономерности развития
клинически НРМЖ с подтвержденной и без подтвержденной мутацией BRCA1,
BRCA2 в сравнении со спорадическим РМЖ с учетом факторов внешней и
внутренней среды.
- Впервые в сравнительном аспекте изучены иммуногистохимические
характеристики, данные ДНК цитометрии (плоидность) опухоли, уровни
опухолевых маркеров СА 15-3 и sHer2-neu внеклеточного домена в сыворотке
крови больных клинически НРМЖ с подтвержденной и без подтвержденной
мутацией BRCA1, BRCA2 в сравнении со спорадическим РМЖ.
- Выявлены признаки риска наследственной детерминированности РМЖ
по анамнестическим данным, позволяющий при скрининговом анкетировании
определить группу риска для последующего проведения комплексного
генетического исследования.
Теоретическая и практическая значимость работы
Исследование биологических характеристик наследственного РМЖ
6
позволило расширить знания о патогенезе заболевания. Полученные знания
открывают перспективные дополнительные критерии для отбора больных на
комплексное
генетическое
исследование,
в
том
числе
проведение
полногеномного секвенирования, что в свою очередь позволит повысить
уровень диагностики НРМЖ, избежать ненужных материальных расходов и
улучшить результаты лечения, а также разработать меры профилактики у
здоровых женщин-носительниц мутации BRCA1, BRCA2.
Методология и методы диссертационного исследования
Диссертация логически структурирована, представленные результаты
основаны на изучении большого клинического материала. Работа выполнена в
дизайне
открытого
сравнительного
исследования
с
использованием
анамнестических, общеклинических, лабораторных, статистических методов
исследования.
Основные положения, выносимые на защиту
1.
По ряду клинико-морфологических и молекулярно-генетических
показателей (молодой возраст на момент манифестации заболевания, тройной
негативный подтип опухоли, наличие бесплодия в анамнезе, повышенный
уровень экспрессии р53 и рецепторов андрогенов, сниженное содержание
анеуплоидных клеток и индекса пролиферации в опухоли) клинически НРМЖ
отличается от спорадического РМЖ.
2.
Данные показатели могут быть в перспективе использованы как
критерии для отбора больных клинически НРМЖ без подтвержденной мутации
BRCA 1/2 по стандартной панели для более углубленного генетического
обследования.
Степень достоверности и апробация результатов работы
Определяется
достаточным
количеством
больных,
вошедших
в
исследование, формированием групп сравнения, адекватными методами
исследования
и
корректными
методами
статистической
обработки.
Сформулированные в диссертации выводы, положения и практические
рекомендации аргументированы и логически вытекают из системного анализа
результатов выполненных исследований.
7
По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 4 в
журналах, рекомендованных ВАК Российской Федерации и 1 патент на
изобретение «Способ определения риска наследственной детерминированности
РМЖ по анамнестическим данным».
Апробация диссертации состоялась 8 ноября 2017 года на заседании
Ученого совета ФГБУ «РНИОИ» Минздрава России. Материалы исследования
представлены в виде публикаций в отечественных и зарубежных изданиях, а
также в виде устных докладов на I Российском онкологическом научнообразовательном форуме с международным участием «Белые Ночи» (СанктПетербург, 2015), ASCO 2015, ESMO 2015, Всероссийской конференции
молодых учѐных (Ростов-на-Дону, 2015), II-м Петербургском онкологическом
форуме «Белые Ночи» (Санкт-Петербург, 2016), на втором онкологическом
форуме Юга России, посвященном 85-летию Онкологического института и
совещании Главных онкологов Южного и Северо-Кавказского федеральных
округов (Ростов-на-Дону, 2016), на ХХ-м Онкологическом Конгрессе (Москва,
2016), Мульти-дисциплинарном форуме РООМ в Южном Федеральном Округе
XVI мероприятие РООМ (г. Ростов-на-Дону, 2018).
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 178 страницах машинописного текста; состоит
из введения, обзора литературы, характеристики материала и методов
исследования, 5 глав результатов собственных исследований, заключения,
выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего
156 отечественных и 245 зарубежных источников. Работа иллюстрирована
49 таблицами и 38 рисунками.
Соответствие диссертации научной специальности
Основные научные положения и выводы, описанные в диссертации,
соответствуют паспорту специальности 14.01.12 онкология, пункту 2 области
исследования:
исследования
по
изучению
этиологии
и
патогенеза
злокачественных опухолей, основанные на достижениях ряда естественных
наук (генетики, молекулярной биологии, морфологии, иммунологии, биохимии
и других).
8
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Характеристика клинического материала и методов исследования
В настоящем исследовании проанализированы клинические данные 221
пациентках, получавших лечение в ФГБУ «РНИОИ» Минздрава России в
период 2012–2015 гг.: 191 – с клиническими признаками НРМЖ и 30 – со
спорадическим РМЖ. Из 191 больной с клинически НРМЖ было отобрано 27, у
которых была подтверждена мутация генов BRCA1/2 – 1-я клиническая группа
и 33 больные, у которых не была подтверждена мутация генов BRCA1/2 – 2-я
клиническая группа. 30 больных со спорадическим РМЖ составили 3-ю группу
(контрольную) (рисунок 1).
Проанализированы данные 191 пациентки с
клиническими признаками наследственного
РМЖ, получавших лечение в ФГБУ «РНИОИ»
Минздрава России в период 2012-2015 гг.,
из них отобрано 60 больных
1-я клиническая группа
- 27 больных –
подтверждена мутация
генов BRCA1/2
3-я клиническая группа
(контрольная)
- 30 больных
спорадическим РМЖ
2-я клиническая группа
- 33 больных – НЕ
подтверждена мутация
генов BRCA1/2
Рисунок 1 Дизайн исследования
По критериям отбора 1 и 2-я группа были сопоставимы.
Характеристика клинического материала
Все пациентки проживали на территории Ростовской области и
самоиндентифицировали себя как «русская». К клиническим признакам НРМЖ
относили (Имянитов Е.Н. и соавт., 2010; Бит-Сава Е.М. и соавт., 2014;
Любченко Л.Н. и соавт., 2014; Батенева Е.И. и соавт., 2015):
- отягощенный онкологической патологией семейный анамнез (два и
более случая РМЖ и/или РЯ в семье у родственников I–II линии (бабушка,
мать, дочь);
9
- возникновение РМЖ в молодом возрасте до 50 лет;
- РЯ в любом возрасте;
- синхронный или метахронный РМЖ;
- первично-множественные злокачественные новообразования;
- рак грудной железы у мужчин;
- наследственные онкологические синдромы.
Но в нашем исследовании встречались пациентки только с тремя
клиническими признаками наследственного рака (таблица 1):
- отягощенный семейный анамнез;
- возникновение РМЖ в молодом возрасте до 50 лет;
- двусторонний РМЖ (синхронный или метахронный).
Таблица 1 – Характеристика основных групп по клиническим признакам НРМЖ, абс. ч. (%)
Клинический признак
1 группа
2 группа
Отягощенный семейный анамнез (2 и более случаев
РМЖ и/или РЯ в семье у родственников I-II линии)
21 (77,7)
24 (72,7)
Возникновение РМЖ в молодом возрасте до 50 лет
22 (81,5)
22 (66,7)
Двусторонний РМЖ (синхронный или метахронный)
9 (33,3)
8 (24,2)
Средний возраст больных в 1-й группе составил 40 лет, во 2-й – 42 года и
в 3-й – 61,5 лет. Подобное распределение больных по возрасту объясняется тем,
что молодой возраст манифестации заболевания является клиническим
признаком НРМЖ и преобладание этих пациенток в первых двух группах
является логичным. Это, в свою очередь, обусловило и характеристику больных
клинических групп по менструальному статусу (таблица 2).
Таблица 2 – Характеристика больных клинических групп по менструальному статусу,
абс. ч. (%)
1 группа,
n=(27)
2 группа,
n=(33)
3 группа,
n=(30)
Репродуктивный
21 (77,8)
17 (51,6)
-
Перименопауза
2 (7,4)
8 (24,2)
6 (20,0)
Постменопауза
4 (14,8)
8 (24,2)
24 (80,0)
27 (100,0)
33 (100,0)
30 (100,0)
Период
Всего
10
У всех пациенток, входящих в исследование, были I–IIа стадии
заболевания и гистологически инфильтрирующий протоковый рак.
До начала обследования все пациентки ФГБУ «РНИОИ» Минздрава
России дали письменное согласие на обработку персональных данных и
изучение биологического материала. На догоспитальном этапе все пациентки
проходили стандартное общеклиническое обследование: биохимический и
общий анализ крови, общий анализ мочи, спиральную компьютерную
томографию органов брюшной полости, грудной клетки, малого таза и
головного мозга, а также электрокардиограмму, остеосцинтиграфию и
консультации смежных специалистов (терапевта, невропатолога и гинеколога),
трепанобиопсию опухоли с гистологическим и ИГХ исследованием.
Характеристика методов исследования
Информацию о возможных факторах риска развития РМЖ получили
путем анкетирования, при сборе анамнеза заболевания, в процессе личных
бесед, изучении историй болезни и обследовании больных.
Морфологической оценке подвергался весь операционный материал
исследуемых больных. ИГХ-исследование проводилось на срезах с парафиновых
блоков опухолей, которые предназначались для выполнения стандартного
морфологического исследования. Парафиновые срезы депарафинировали и
регидратировали по отработанной методике. «Демаскировку» антигенов
проводили в PT-Link Thermo. Для визуализации иммуногистохимической
реакции использовалась система детекции Reveal Polyvalent HRP-DAB Detection
System. Срезы докрашивались гематоксилином Майера, для заключения
использовали бальзам Bio-Mount. Оценку полученных результатов окрашивания
проводили с применением светового микроскопа «Leica» (Германия) под
увеличением х10, х20, х40. При помощи Nottingham grading system (Elston and
Ellis, 1991) определялась гистологическая степень злокачественности опухоли.
Материалом для проведения ДНК-проточной цитометрии послужили
образцы опухолей всех больных, вошедших в исследование. Для ДНК-анализа
в ткани опухоли использовали CycleTESTTMPLUS DNA Reagent Kit. При
помощи компьютерной программы ModFit LT обрабатывали полученные
результаты.
11
Определение белков СА 15-3 и sHER-2/neu в сыворотках проводили с
помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Для подготовки
образцов, постановки и учета реакции использовали инструкции к ИФАнаборам производства Platinum ELISA BMS 207, eBiocience, Австрия (для
HER-2 neu) и «Вектор-Бест» (для СА 15-3).
В целях выявления мутаций в генах ВRCA 1/2 выполнялся молекулярногенетический анализ ДНК из лейкоцитов периферической крови. Детекцию
мутаций
проводили
с
использованием
набора
"BRCA-скрин"
(«Интерлабсервис», Россия) методом пиросеквенирования на оборудовании
PyroMark Q24 (Qiagen, Germany). Определялись следующие мутации в генах
BRCA1/2 (таблица 3).
Таблица 3 – Исследованные мутации в генах BRCA1/2
Ген
Полиморфизм
Последовательность для анализа
BRCA1
185delAG
TCTAAGATTTTC
BRCA1
300TG (C61G)
T/GGTCCTTTA
BRCA1
2080delA
TCTTTATC
BRCA1
4154delA
GAAGAAAGAGGA
BRCA1
5382insC
GATTCTCTTG
BRCA2
6174delT
ACTTGCTGT
При сравнении дискретных переменных (качественных показателей) и
анализе их сопряжения использовался критерий ² Пирсона с поправкой
Мантеля-Хэнзеля на правдоподобие (M-L Chi-square), коэффициент ранговой
корреляции Спирмена. Достоверность различий средних величин независимых
выборок оценивалась с помощью параметрического критерия Стьюдента, при
нормальном законе распределения и непараметрического критерия МаннаУитни,
при
отличии
распределения
показателей
от
нормального.
Статистический анализ полученных результатов проводился с помощью
программы STATISTICA 10.0 (StatSoft Inc., США).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Проведение нами молекулярно-генетического исследования мутаций в
генах BRCA1 и BRCA2 у 191-й пациенток с клиническими признаками НРМЖ
12
показало, что общая частота герминальных мутаций составила 14,1%
(27 случаев): BRCA1 5382 insC – 25 случаев и BRCA1 300T>G – 2 случая. Таким
образом, частота и спектр выявленных мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 у
больных
РМЖ
в
Ростовской
области
соответствует
общероссийским
показателям (рисунок 2). У 30-ти больных спорадическим РМЖ мутаций в
генах BRCA1/2 не обнаружено.
1%
13,1%
WT BRCA
BRCA1 5382insC
BRCA1 300T>G
85,9%
Рисунок 2 Распределение статуса генов BRCA1/2 в группе больных с клиническими
признаками НРМЖ
Анализ распределения мутаций среди общей выборки пациенток с
клинически НРМЖ (n=191) в возрастных группах до 50 и после 50 лет
представлен в таблице 4 (χ2=4,63; р=0,0313).
Таблица 4 – Встречаемость мутаций гена BRCA1 у пациенток с наследственным РМЖ в
зависимости от возраста (n=191)
Общая выборка (n=191) по возрастам до 50 лет и после 50 лет
<50
50
Количество WT, абс. ч. (%)
85 (81,0)*
79 (91,9)
Количество MT, абс. ч. (%)
20 (19,0)*
7 (8,1)
Возраст, лет
Примечание. * – различия достоверны в отношении больных >50 лет; WT (Wild Type)
– отсутствие мутаций; MT (Mutation Type) – наличие мутаций
HER2-neu+ статус опухоли не был ассоциирован ни с мутацией BRCA 1/2,
ни с клинически НРМЖ. При этом, тройной негативный рак (ТНР) встречался
статистически достоверно чаще, чем у больных с диким типом данного гена
(χ2=11,99; р=0,0006). Также отмечена ассоциация BRCA+ статуса с высокой
пролиферативной активностью опухоли (у 25 пациенток с мутациями в гене
13
BRCA1 индекс Ki67 составил от 30 до 100%, и только в двух случаях с
мутацией в гене BRCA1 300T>G отмечен низкий уровень данного маркера на
уровне 5%). Таким образом, полученные данные, во-первых, в основном
совпадали с литературными, что, на наш взгляд, логично, учитывая
достаточную однородность группы в этническом отношении. Во-вторых,
проведенное молекулярно-генетическое исследование позволило выделить две
основные (клинически НРМЖ BRCA+ и клинически НРМЖ BRCA-) и
контрольную
(спорадический
РМЖ)
группы.
Именно
эти
группы,
в
сравнительном аспекте, и подвергались дальнейшему изучению. Далее
обсуждаются только полученные статистически значимые различия.
Обе
группы
больных
клинически
НРМЖ
в
сравнении
с
3-й,
характеризовались превалированием самого неблагоприятного подтипа с
клинической точки зрения – ТНР – 33,3% в 1 группе и 12,1% во 2 группе
против 3,3% в 3 группе, отсутствием ассоциации с HER2-neu+ статусом
опухоли,
молодым
возрастом
больных
(см.
выше),
более
высокой
встречаемостью бесплодия, как первичного, так и вторичного – 22,2% в
1 группе и 6,1% во 2 группе против 0 в 3 группе, меньшим количеством
лактаций в анамнезе – 55,6% в 1 группе и 69,7% во 2 группе против 90% в
3 группе. Но самым интересным, на наш взгляд, явился тот факт, что по ряду
клинико-анамнестических данных больные 1-й группы отличались от 2-й
группы либо качественно, либо количественно. Так, ТНР во 2-й группе
встречался в 3 раза реже, чем у больных 1-й группы, а люминальные подтипы,
наоборот, в 1,5 раза чаще. Возраст наступления менопаузы (в том числе
хирургической) у больных BRCA+ был достоверно меньше – 41,5±0,67 лет, чем
у больных клинически НРМЖ без подтвержденной мутации BRCА –
46,4±1,88 лет (р<0,05). У больных РМЖ BRCA+ отмечено сниженное
количество беременностей – 3,0±0,39 в 1-й группе против 4,24±0,46 во 2-й
группе и 4,3±0,38 в 3-й группе, медицинских абортов – 1,5±0,47 в 1-й группе
против 2,41±0,49 во 2-й группе и 2,63±0,40 в 3-й группе, старше возраст на
момент первой беременности – 25,5±0,67 лет в 1-й группе против 21,2±0,41 лет
во 2-й группе и 22,4±0,38 лет в 3-й группе, высокая частота бесплодия – в
3,5 раза превышающая аналогичный показатель у больных 2-й группы, малое
14
количество лактаций (см. выше) и ее небольшая длительность – 6,2±0,26 мес. в
1-й группе против 9,14±1,02 во 2-й группе и 8,86±0,86 в 3-й группе, более
частое – 33,4% в 1-й группе против 9,1% во 2-й группе и 3,3 в 3-й группе и
длительное употребление оральных контрацептивов – 6,7±0,9 лет в 1-й группе
против 2,5±0,9 во 2-й группе и 1,3±0,7 в 3-й группе (p<0,05).
Исходя из предположительных факторов риска, мы разработали
регрессионную модель, которая заключается в разработке способа определения
риска наследственной детерминированности РМЖ по анамнестическим данным
(патент РФ № 2628865 от 22.08.2017 г.). Определение риска наследственной
детерминированности РМЖ происходит следующим образом: у пациенток
оценивают данные анамнеза, а именно возраст в годах, число абортов, число
беременностей, возраст наступления менопаузы в годах (если менопаузы нет,
то фактор не учитывается), длительность курения в годах (если женщина не
курит, то 0), число грудных вскармливаний и продолжительность грудного
кормления
в
месяцах.
прогностической
Далее,
таблицы
путем
каждому
использования
показателю
разработанной
устанавливается
прогностический коэффициент (ПК), а именно если возраст больной ≤42 года
ПК (+) 10, более 42 лет ПК (-) 7,7; если число абортов ≤1 ПК (+) 2,0, более 1 ПК
(-) 2,3; если число беременностей ≤2 ПК (+) 3,6, более 2 ПК (-) 2,6; если возраст
наступления менопаузы ≤41 год ПК (+) 3,6, более 41 года ПК (-) 3,7; при
длительности курения ≤9 лет ПК (+) 3, более 9 лет ПК (-) 5,4; если число
грудных вскармливаний ≤1 ПК (+) 4, более 1 ПК (-) 7; при продолжительности
грудного вскармливания ≤6 месяцев ПК (+) 5,4, более 6 месяцев ПК (-) 4,6;
после чего определяют сумму ПК и принимают решение о высоком риске
наследственного РМЖ, если сумма ПК≥(+) 18 либо отсутствии риска
генетической детерминации РМЖ, если сумма ПК меньше (+) 18 с
диагностической чувствительностью 85,7% и специфичностью 93,75%. Данный
способ внедрен в клиническую практику (акт внедрения результатов №37/17 от
14 сентября 2017 г.).
Проведенное ИГХ-исследование выявило повышение доли опухолей с
экспрессией p53 у больных клинически НРМЖ в 1,3–1,4 раза в сравнении со
спорадическим РМЖ (р˂0,05) (таблица 5).
15
Таблица 5 – Характеристика больных РМЖ исследуемых групп по частоте экспрессии p53 и
bcl-2
Исследуемая
группа
р53+
р53абс. ч.
Bcl-2+
абс. ч.
%
1-я группа (n=27)
12
44,4*↑
15
55,6
23
85,2*↑
4
14,8*↓
2-я группа (n=33)
11
45,4*
22
54,6
16
48,5*↓
17
51,5*↑
3-я группа (n =30)
10
33,3
20
66,7
21
70
9
30
%
абс. ч.
Bcl-2абс. ч.
%
%
Примечание. * – различия достоверны в отношении спорадического рака молочной
железы (p≤0,05)
При этом среднее содержание p53 позитивных клеток в опухолях 1 и 2-й
групп также достоверно выше в 2,3–3,4 раза в сравнении с 3-й группой
(p≤0,05).
Выявлены разнонаправленные отличия в накоплении Bcl-2 в цитоплазме
опухолевых клеток 1-й и 2-й группах по сравнению с 3-й группой (р˂0,05)
(таблица 5). Так, в 1-й группе в 23 из 27 случаев отмечена экспрессия Bcl-2.
Несколько реже, в 3-й группе – 21 из 30. Тогда как позитивных случаев по
экспрессии Bcl-2 во 2-й группе отмечено в 1,8 и 1,4 раза меньше в сравнении с
1-й и 3-й группами соответственно. Таких опухолей в нашем исследовании
выявлено 16 из 33.
Во всех исследуемых группах выявлено положительное окрашивание
ядер
опухолевых
клеток
к
рецепторам
андрогенов
(РА).
При
этом
максимальные значения среднего содержания позитивных опухолевых клеток
получены для 1-й группы, и в 1,9 раза достоверно превосходили данный
показатель для 2-й группы и в 2,1 раза значения для 3-й группы (p≤0,05).
Достоверных различий значений доли позитивно окрашенных ядер опухолевых
клеток к топоизомеразе 2ɑ и в отношении уровня экспрессии Е-кадгерина в
исследуемых группах не было (рисунок 3).
Повышение числа опухолей, экспрессирующих РА в 1-й группе
заставляет
задуматься
о
возможной
целесообразности
применения
антиандрогенной терапии у данной категории больных. Тем более, что интерес
к этому виду лечения в последние годы возрос, особенно в спектре перспектив
таргетной терапии ТНР.
16
%
1 группа
2 группа
3 группа
100
80
60
43,3•
88,0
91,7
84,4
39,3•
40
20,5
6,5
20
6,6
3,9
0
Рецепторы андрогенов
Топоизомераза 2a
Е-кадгерин
Рисунок 3 Среднее содержание клеток, экспрессирующих рецепторы андрогенов,
топоизомеразы 2a и Е-кадгерина в опухолях исследуемых групп.
Был обнаружен ряд различий по содержанию sHER-2/neu в сыворотках
больных РМЖ трех сравниваемых групп (таблица 6). Несмотря на выраженную
вариабельность индивидуальных данных, отмечены некоторые статистически
значимые различия. Уровень sHER-2/neu оказался выше у больных 1-й группы
в 1,9 раз по сравнению с больными 2-й группы и в 1,5 раза по сравнению с
больными 3-й группы (p˂0,05).
Таблица 6 – Сравнительная характеристика уровней sHER-2/neu в сыворотках больных
клинически наследственным и спорадическим РМЖ
Группа больных
sHER-2/neu (нг/мл)
Min - max
M±m
1-я группа (n=27)
4,64 – 41,1
18,62±5,35*ª↑
2-я группа (n=33)
2,54 – 22,3
9,78±0,99
3-я группа (n=30)
2,62 – 72,1
12,09±2,78
Примечание. * – статистически достоверные различия по отношению ко 2-й группе;
ª – статистически достоверные различия по отношению к 3-й группе (p≤0,05)
Как следует из наших данных, sHER-2/neu выявлялся не только при
наличии гиперэкспрессии или амплификации гена HER-2/neu. У больных
спорадическим РМЖ выявлены более высокие уровни sHER-2/neu при
люминальном В HER-2/neu- РМЖ – 13,7±2,6 нг/мл по сравнению с HER-2/neu+
подтипом – 16,98±11,03 нг/мл; у больных клинически НРМЖ статистически
17
достоверных различий не наблюдалось. Кроме того, отмечено в 2 раза более
высокое содержание sHER-2/neu при HER-2/neu подтипе у больных клинически
НРМЖ ВRCA- по сравнению со спорадическим, а у больных клинически
НРМЖ ВRCA+ такой разницы не обнаружено. При люминальном В HER-2/neuподтипе найдено максимальное содержание sHER-2/neu у больных клинически
НРМЖ ВRCA+ – 21,0±8,3 нг/мл, в 1,5 раза превышающее его уровень при
спорадическом раке – 13,7±2,6 нг/мл, и в 2,2 раза – при клинически НРМЖ
ВRCA- – 9,55±1,7 нг/мл, хотя и не установлена статистическая достоверность
этих различий в связи с высокой вариабельностью индивидуальных данных.
Хотя количество случаев ТНР в группе спорадического РМЖ недостаточно для
статистической обработки (n=1), нельзя не отметить, что показатель уровня
sHER-2/neu при ТНР у этой больной низкий – 2,68 нг/мл, тогда как при
клинически НРМЖ ВRCA- он составляет в среднем 11,9±3,9 нг/мл, колеблясь
от 5 до 19 нг/мл, а при клинически НРМЖ ВRCA+ 12,8±3,7 нг/мл с
колебаниями от 4,7 до 28,6 нг/мл. При люминальном A-подтипе уровни
sHER-2/neu не демонстрировали статистически значимых различий между
больными сравниваемых групп (рисунок 4).
нг/мл
21,0
25
20
12,8
15
10
*
13,3
11,9 11,7
10,0
12,3
** 17,0
13,7
*
**
6,2
9,6
7,7
6,8
2,7
5
0
1 группа
Люминальный А
2 группа
Люм. В HER-2/neu-
Люм. В HER-2/neu+
3 группа
THP
HER-2/neu+
Рисунок 4 Сравнительная характеристика уровня sHER-2/neu в сыворотках больных РМЖ
исследуемых групп при его разных подтипах; статистически достоверные различия между
показателями: * – различных групп; ** – различных подтипов РМЖ (p<0,05)
Кроме того, были установлены статистически значимые различия ДНКцитометрических характеристик опухолей исследуемых групп: снижение
среднего содержания анеуплоидных клеток в опухолях 1 и 2-й групп – 33,8±6,7
18
и 31,7±7,1% против 58,6±6,5% в 3-й группе (p˂0,05), с тенденцией к
увеличению доли анеуплоидных опухолей в 1 и 3-й группах – 63,0 и 60,0%
против 48,5% во 2-й группе (p=0,076).
В
группах
больных
клинически
НРМЖ
индекс
пролиферации
анеуплоидных опухолей отличался достоверно более низкими значениями –
13,6±2 и 10,6±2,8, в сравнении с аналогичным показателем у больных
спорадическим РМЖ – 21,5±2,8 (p˂0,05). При этом анеуплоидные опухоли 2-й
и 3-й групп по индексу и скорости пролиферации диплоидного и
анеуплоидного клона были практически на одинаково высоком уровне.
Итак, по полученным результатам можно сделать заключение, что,
несмотря на то, что клинические критерии отбора в группы клинически НРМЖ
совпадали, а также имелся ряд общих отличий этих двух групп от
спорадического РМЖ, имелись также и некоторые различия между ними. По
многим клинико-анамнестическим данным, ИГХ-показателям, параметрам
ДНК-цитометрии, содержанию сывороточного белка sHER-2/neu, клинически
НРМЖ BRCA+ отличается от контрольной группы спорадического РМЖ. При
этом опухоли, отнесенные нами в группу клинически НРМЖ BRCA-, занимают
промежуточное
положение
по
своему
биологическому
профилю,
что
объясняется нами тем, что часть этих опухолей, вероятно, имеет мутации
BRCA, но не в экзонах, входящих в стандартную панель. И это несмотря на то,
что
все
пациентки,
вошедшие
в
исследование,
были
славянского
происхождения, для которых эта панель считается актуальной. И в этой
ситуации целесообразно, по всей видимости, применение полноэкзомного
секвенирования. С другой стороны, вероятно, в этой группе были опухоли,
которые имели мутации в других генах, которые нами не исследовались
(например, CHEK2). Таким образом, впервые на большом материале изучены
клинико-морфологические и молекулярно-генетические аспекты клинически
НРМЖ с подтвержденной и без подтвержденной мутацией BRCA1, BRCA2 в
сравнении
со
перспективные
спорадическим
дополнительные
РМЖ.
Полученные
критерии
для
знания
отбора
открывают
больных
на
полноэкзомное секвенирование, что, в свою очередь, позволит повысить
уровень диагностики НРМЖ, избежать ненужных материальных расходов и
19
улучшить результаты лечения. Помимо этого, заложена база для последующих
исследований в области персонифицированной терапии больных BRCA 1/2ассоциированным РМЖ и разработки профилактических мероприятий у
здоровых женщин – носительниц мутации BRCA1, BRCA2.
ВЫВОДЫ
1.
больных
Частота и спектр выявленных мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 у
РМЖ
в
Ростовской
области
соответствует
общероссийским
показателям (p>0,05). У пациенток с мутациями в гене BRCA1 тройной
негативный подтип встречался статистически достоверно чаще, чем другие
биологические подтипы (χ2=11,99; р=0,0006), а возраст манифестации
заболевания был ниже (χ2=4,63; р=0,0313).
2.
Выявлены общие отличительные черты клинически НРМЖ в
сравнении со спорадическим: превалирование тройного негативного подтипа в
3,7–10 раз, отсутствие ассоциации с HER2-neu+ статусом опухоли, молодой
возраст больных (средний возраст 40 лет, 42 года и 61,5 лет, соответственно),
высокая частота бесплодия в анамнезе.
3.
Клинически
НРМЖ
отличался
от
спорадического:
частота
экспрессии p53 выше в 1,3–1,4 раза, рецепторов андрогенов в 1,9–2,1 раза
(р<0,05).
4.
Установлены
цитометрических
статистически
характеристик
значимые
клинически
НРМЖ
различия
и
ДНК-
спорадического:
снижение среднего содержания анеуплоидных клеток – 33,8±6,7 и 31,7±7,1%
против 58,6±6,5% соответственно, снижение индекса пролиферации и
диплоидных, и анеуплоидных опухолей – 4,9±1,1, 13,6±2 и 3,3±0,9, 10,6±2,8
против – 7,9±1,7 и 21,5±5,8.
5.
Клинически НРМЖ BRCA+ отличался от BRCA-: меньшее
количество беременностей – в 1,4 раза, медицинских абортов – в 1,6 раз,
большая частота и длительность приема оральных контрацептивов – в 3,7 и в
2,7 раза, соответственно; снижение уровней экспрессии Bcl-2 в опухоли в
1,8 раз.
6.
Наличие мутации в гене BRCA у больных РМЖ с большей частотой
сопровождалось наличием sHER-2/neu – 18,62±2,35 нг/мл, чем при клинически
20
наследственном РМЖ BRCA- – 9,78±0,99 нг/мл и спорадическим РМЖ –
12,09±2,78 нг/мл и при этом не зависело от подтипа опухоли.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1.
При отсутствии подтвержденной мутации BRCA 1/2 по стандартной
панели у больных с клиническими признаками НРМЖ целесообразно
использовать дополнительные клинико-морфологические и молекулярнобиологические критерии для отбора больных на дополнительное генетическое
исследование.
2.
При динамическом наблюдении за здоровыми носительницами
BRCA 1/2 мутаций необходимо учитывать выявленные факторы риска
манифестации заболевания у этой категории больных.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1.
Экспрессия p53 и BCL2 при различных подтипах рака
молочной железы / О.И. Кит, Ю.С. Шатова, И.А. Новикова, Л.Ю.
Владимирова,
Е.П.
Ульянова,
Е.А.
Комова,
Э.Э.
Кечеджиева
//
Фундаментальные исследования. – 2014. – №10. – С. 85–88.
2.
Частота встречаемости мутаций в генах ВRCA1/2 у больных с
клиническими признаками наследственного рака молочной железы в Южном
Федеральном Округе / Д.И. Водолажский, Ю.С. Шатова, Е.А. Комова, К.В.
Двадненко // 1-й Российский онкологический научно-образовательный форум с
международным участием «Белые Ночи – 2015». Сборник тезисов. М., 2015. –
506 с. ISBN 978-5-906484-13-0
3.
Some molecular biological characteristics of breast cancer / E.
Chernikova, I. Novikova, Y. Shatova, E. Ulianova, E. Komova, V. Nikitina, O.
Kravtsova, L. Vladimirova // European Journal of Cancer. – 2015 Sep. – Vol. 51,
suppl. S3, S300.
4.
Circulating tumor cells (CTCs) in breast cancer without distant
metastases. / Vera Gabaraeva, Oleg Ivanovich Kit, Inna Arnoldovna Novikova, Elena
Alekseevna Nikipelova, Yuliana Sergeyevna Shatova, Andrey Vladimirovich
Bakhtin, Elena N. Chernikova, Elizaveta A. Komova // ASCO Annual Meeting. –
2015; J Clin Oncol 33:5s, 2015 (suppl; abstr e22016)
21
5.
Частота встречаемости мутаций в генах ВRCA1/2 у больных с
клиническими признаками наследственного рака молочной железы в Южном
Федеральном округе / Е.А. Комова, Д.С. Кутилин, Е.Н., Гудуева, К.В.
Двадненко // Всероссийская конференция молодых учѐных. Сборник тезисов. –
Ростов-на-Дону, 2015. – С. 31-32.
6.
Частота встречаемости ВRCA-мутаций в Южном Федеральном
Округе у больных с клиническими признаками наследственного рака
молочной железы [Электронный ресурс] / Д.И. Водолажский, Ю.С.
Шатова, Е.А. Комова, К.В. Двадненко // Современные проблемы науки и
образования.
–
2015.
–
№3.
URL:
https://www.scienceeducation.ru/ru/article/view?id=17860
7.
Экспрессия Топоизомеразы-2Α и Е-кадгерина при различных
подтипах рака молочной железы и репродуктивном статусе больных
[Электронный ресурс] / Ю.С. Шатова, Л.Н. Ващенко, И.А. Новикова, Е.Ю.
Златник, Л.Ю. Владимирова, Е.П. Ульянова, Е.А. Комова, Е.Н. Черникова,
С.А. Машурова // Современные проблемы науки и образования. – 2015. –
№ 3. URL: https://www.scienceeducation.ru/ru/article/view?id=19671
8.
Анализ
мутаций
генов
ВRCA1/2
в
популяции
больных
наследственным раком молочной железы на Юге России / О.И. Кит, Д.И.
Водолажский, К.В. Двадненко, О.А. Богомолова, Ю.С Шатова, Е.А. Чеботарѐва,
М.И. Верескунова // II Петербургский онкологический форум «Белые Ночи –
2016». Сборник тезисов. М., 2016. – 467 с. ISBN 978-5-9908516-0-3
9.
ДНК-цитометрические
характеристики
наследственного
и
спорадического рака молочной железы / Е.А. Чеботарѐва, И.А. Новикова, Ю.С.
Шатова, В.В., Токмаков А.Н. Хугаева, Е.Н. Черникова, А.О. Гранкина, О.Н.
Селютина, Е.С. Бондаренко // Второй онкологический форум Юга России
посвященный 85-летию Онкологического института и совещание Главных
онкологов Южного и Северо-Кавказского федеральных округов. Тезисы. –
Ростов-на-Дону, 2016. – С. 115.
10.
ДНК-цитометрические
характеристики
опухоли
и
уровни
некоторых сывороточных белков при наследственном и спорадическом раке
молочной железы / Ю.С. Шатова, Е.Ю. Златник, И.А. Новикова, Г.И. Закора,
22
Д.И. Водолажский, Е.А. Чеботарѐва, В.В. Токмаков, А.Н. Хугаева, Е.Н.
Черникова, А.О. Гранкина, О. Н. Селютина, Е. С. Бондаренко, Е. И. Золотарева
// ХХ Онкологический Конгресс. Тезисы. Журнал «Злокачественные опухоли»
Спецвыпуск 1 – 2016. – №4, (21). – С. 203-204.
11.
Пат. 2628865 Российская Федерация, МПК А61В 5/00. Способ
определения риска наследственной детерминированности рак молочной
железы по анамнестическим данным [текст] / Кит О.И., Шатова Ю.С.,
Водолажский Д.И.; Чеботарѐва Е.А.; заявитель и патентообладатель
Ростовский научно-исследовательский онкологический институт (RU). №2016141717 заявл. 24.10.2016; опубл. 22.08.2017, Бюл. №24.
12.
Некоторые
генетические
клинико-морфологические
аспекты
у
пациенток
с
и
молекулярно-
клиническими
признаками
наследственного рака молочной железы / Ю.С. Шатова, Е.А. Чеботарѐва,
Е.Ю. Златник, И.А. Новикова, Д.И. Водолажский, Е.А. Дженкова.
Казанский медицинский журнал. – 2018. – Т. 99, №2. – С. 224-229.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ИГХ
– иммунногистохимия
ИП
– индекс пролиферации
МЖ
– молочная железа
НРМЖ
– наследственный рак молочной железы
РА
– рецепторы андрогенов
РМЖ
– рак молочной железы
РП
– рецепторы прогестерона
РЯ
– рак яичников
РЭ
– рецепторы эстрогенов
ТНР
– тройной негативный рак
ФГБУ
«РНИОИ»
бюджетное
Минздрава
учреждение
России
–
«Ростовский
онкологический институт» Минздрава России
Topo2α
– топоизомераза 2 альфа
федеральное
государственное
научно-исследовательский
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа