close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Активность фитобиоремедиации нефтезагрязненных почв бактериальными консорциумами различных климатических зон

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
БАУТИСТА ЭСПИНОЗА ХЬЮГО
АКТИВНОСТЬ ФИТОБИОРЕМЕДИАЦИИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ
ПОЧВ БАКТЕРИАЛЬНЫМИ КОНСОРЦИУМАМИ РАЗЛИЧНЫХ
КЛИМАТИЧЕСКИХ ЗОН
03.02.03 – микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Казань – 2018
1
Работа выполнена на кафедре биохимии и биотехнологии Института
фундаментальной медицины и биологии ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский)
федеральный университет».
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор,
Багаева Татьяна Вадимовна
Официальные оппоненты:
Дегтярева Ирина Александровна, доктор биологических
наук, зав. отделом Агроэкологии и микробиологии Татарского НИИАХП- обособленного
структурного подразделения ФГБУН «Федеральный исследовательский цент «Казанский
научный цент Российской академии наук» (г. Казань).
Валиуллин Ленар Рашитович, кандидат биологических наук,
зав. сектором тканевой технологии и производства препаратов, Федеральное
государственное бюджетное научное учреждение «Федерального центра Токсикологии,
радиации и биобезопасности» (ФГБНУ-ВНИВИ) (г.Казань).
Ведущая организация: Институт проблем экологии и недропользования Академии наук
Республики Татарстан (ИПЭН АН РТ).
Защита диссертации состоится «20» сентября
2018 г. в 13.00 ч на заседании
диссертационного совета Д.212.081.36 при ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский)
федеральный университет» по адресу: г. Казань, ул. Карла Маркса, д.74, аудитория 205.
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского
при ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: г.
Казань, ул. Кремлевская, д.35.
Автореферат разослан «_____» __________2018 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
доктор биологических наук, профессор
З. И. Абрамова
2
1)
2)
3)
4)
ВВЕДЕНИЕ
По прогнозам ОПЭК, мировой спрос на нефть увеличится к 2030 году на 37% по
сравнению с 2016 годом. Рост добычи нефти и ее переработка ведет к значительному
загрязнению окружающей среды. В природе наблюдаются катастрофические последствия
действия нефтяных поллютантов на биотические компоненты экосистемы. Для
восстановления загрязненных нефтью земель разрабатываются различные методы,
включая механические, физико-химические и биологические методы [Adeniji et al., 2017].
Однако, применение многих из данных методов, не дает полной очистки окружающей
среды от нефтяных загрязнений [Drillia et al., 2003]. Значительно более перспективными и
экологичными являются биологические методы, которые дают значительно больший
эффект, но и они требуют дальнейшего совершенствования.
Среди биологических методов, в настоящее время, наиболее перспективным
методом является фитобиоремедиация. Данный процесс представляет собой сложный тип
технологии экологически чистого очищения объектов окружающей среды, который
включает как растения, так и связанные с его ризосферой микроорганизмы. Успех
стратеги фитобиоремедиации во многом зависит от толерантности растений к
загрязнителю, а также от взаимодействия растения с микроорганизмами. Ведется
дальнейший поиск наиболее эффективных углеводородокисляющих бактерий,
микроорганизмов, способных к деградации вязких нефтей, а также микроорганизмов,
синтезирующих сурфактанты, обладающих высокой эмульгирующей активностью,
способствующих снижению поверхностного натяжения нефти. Среди последних, особый
интерес вызывают микроорганизмы, которые не просто присутствуют и развиваются в
ризосфере растений, но и способны к колонизации их корней, которые могут активно
размножаться под действием секретируемых растениями корневых экссудатов и
распространяться в почве по мере их роста.
В литературе присутствует незначительное количество работ посвященных
вопросу колонизации растительных объектов, микроорганизмами ризосферы, и
полностью отсутствуют работы по исследованию колонизирующей возможности
консорциумов углеводородокисляющих бактерий (УОБ) различных климатических зон.
Целью
настоящей
работы
было
получить
и
проанализировать
углеводородокисляющие бактерии
различных климатических
зон, активных
колонизаторов растений, для создания системы «растение-консорциум бактерий»,
способной к эффективной фитобиоремедиации.
В связи с поставленной целью решались следующие задачи:
Выделить, идентифицировать и определить родство УОБ различных климатических зон;
Определить активность штаммов к деструкции нефти и углеводородов разного строения
(алканы, арены, полиароматические углеводороды), а также способность к синтезу
сурфактантов;
Провести анализ растений, способных расти и развиваться на загрязненных почвах
Татарстана;
Выявить закономерности колонизации корней растений, активными штаммамидеструкторами углеводородов;
3
5) Охарактеризовать фитобиоремедиационный потенциал созданных и оптимизированных
систем «растение-консорциум бактерий», различных климатических зон.
Научная
новизна.
Создана
новая
эффективная
коллекция
углеводородокисляющих микроорганизмов (УОМ), содержащая представителей
умеренно-континентальной и тропических зон. Впервые проведено молекулярногенетическое исследование данных микроорганизмов и установлена их видовая
принадлежность. Впервые исследованы свойства выделенных микроорганизмов к
деградации нефти и ее производных, а также способность к синтезу сурфактантов.
Установлена определенная зависимость синтеза сурфактантов от роста микроорганизмов
и условий их существования.
Впервые исследована колонизирующая способность углеводородокисляющих
микроорганизмов, умеренно-континентальной и тропических зон (Татарстан, Сургут,
Эквадор) установлено, что это свойство характерно для видов: Pseudomonas putida,
Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas fluorescens, Burkholderia cepacia, Bacillus subtilis,
Cellulosimicrobium cellulans и Cellulosimicrobium funkei.
Впервые созданы ассоциации - «растение-углеводородокисляющие бактерии» - на
основе люцерны (Medicago sativa, сем. Fabaceae) и консорциумов бактерий,
представителей умеренно-континентальной и тропических зон, способных к колонизации
корней растения и эффективных нефтедеструкторов. Доказан эффективный
фиторемедиационный потенциал созданных и оптимизированных систем.
Научно-практическая
значимость
работы.
Получено
20
штаммов
углеводородокисляющих микроорганизмов, представителей умеренно-континентальной и
тропических зон, способных к деградации нефти и ее производных. Показана
эффективность отдельных штаммов к деструкции алканов, аренов и полиароматических
углеводородов. Среди них -Pseudomonas putida и Pseudomonas aeruginosa (из консорциума
Татарстана), Bacillus subtillis и Bacillus licheniformis (из консорциума Сургута) и
Pseudomonas putida и Cellulosimicrobium cellulans (из консорциума Эквадора).
Большинство штаммов микроорганизмов северных районов умеренноконтинентальной зоны и некоторые представители ее центральной части, а также штаммы
тропической зоны были способны к синтезу сурфактантов, и поэтому могут быть
рекомендованы в качестве их продуцентов. Наиболее перспективны в этом отношении –
Aeromonas hydrophila и Pseudomonas aeruginosa (из консорциума Татарстана), Bacillus
subtilis и Klebsiella oxytoca (из консорциума Сургута) и Bacillus subtilis и Pseudomonas
aeruginosa (из консорциума Эквадора).
Доказано, что для процесса деградации нефтяного загрязнения почв и
восстановления почвенного покрова можно использовать растения. Среди последних,
можно рекомендовать травянистое растение – люцерну посевную (Medicago sativa, сем.
Fabaceae), среди зерновых культур – ячмень обыкновенный (Hordeum vulgаre).
Установлено, что наиболее эффективная деградация вязкой нефти происходит при
использовании ассоциации растения с углеводородокисляющими микроорганизмами,
которые не только деградируют углеводороды, но и способны к колонизации корней
растения, что позволяет расширять зону очистки почв. Созданная ассоциация на основе
Люцерны и консорциума штаммов Татарстана, снижала содержание нефтяных
4
1.
2.
3.
4.
углеводородов в почве до 65% в течение 30 суток, поэтому может быть рекомендована
для эффективного процесса фитобиоремедиации.
Полученные результаты используются в учебном процессе в рамках дисциплины
«Экологическая биотехнология», «Методы исследования в биологии и медицине»
«Биотехнология нефтяных производств».
Положения, выносимые на защиту:
Выделено 20 штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов, представителей
умеренно-континентальной и тропических зон, способных к деградации нефти.
Консорциумы ранжированы по способности к деструкции алканов, аренов и
полиароматических углеводородов; активность увеличивается в ряду: сообщество почв
Сургута < Эквадора < Татарстана
Наиболее эффективными штаммами по способности к биосинтезу сурфактантов были
Aeromonas hydrophila и Pseudomonas aeruginosa (из консорциума Татарстана), Bacillus
subtilis и Klebsiella oxytoca (из консорциума Сургута) и Bacillus subtilis и Pseudomonas
aeruginosa (из консорциума Эквадора).
В процессе фиторемедиации нефтезагрязненных почв среди исследованных растений
максимальную устойчивость и способность к удерживанию бактериального консорциума
проявило травянистое растение – люцернa (Medicago sativa).
Созданная ассоциация на основе люцерны и консорциума бактерий нефтезагрязненных
почв Татарстана снижала содержание углеводородов в почве на 65% в течение 30 суток и
может быть рекомендована для эффективного процесса фитобиоремедиации.
Достоверность результатов исследований подтверждается значительным объемом
многократных экспериментов, выполненных и проанализированных с использованием
современных приборов, а также публикацией полученных результатов работы в
международных и отечественных журналах с рецензированием ведущими учеными в
данной области.
Апробация работы Основные положения диссертации были представлены на
Международных, Всероссийских и Региональных конференциях: на II-ой Международной
научно-практической конференции, Фундаментальные и прикладные научные
исследования (Оренбург, 2018), на 1-ом Российском Микробиологическом Конгрессе
(Пущино, 2017), на Всероссийской научно-технической выставке Симбиоз-Россия
(Казань, 2017), на Всероссийской молодежной научно-практической конференции, с
международным участием, (Тюмень, 2016), на Международной научной конференции
студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2016" (Москва, 2016).
Связь работы с научными программами. Исследования выполнены в
соответствии с тематическим планом НИР Казанского (Приволжского) федерального
университета «Микробные ферменты и метаболиты как основа новых биотехнологий в
сельском хозяйстве» (Проект 14-83 от 2014 г.). Работа поддержанна грантом немецкой
службы академических обменов (DAAD) в рамках партнерства, договоры КФУ-ЮЛУ
(Гисенский университет имени Юстуса Либиха, г. Гисен, Германия, 2017 г),
индивидуальным грантом KIGAM (Корейский институт гео-науки и минеральных
ресурсов) на стажировку и интенсивный курс обучения по Исследованиям нефти:
развитие и производство (Южная Корея, 2017г.)
5
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 научных работ,
включая 2 статьи рекомендуемых ВАК и 4 статьи в ведущих рецензируемых научных
журналах и изданиях, входящих в перечень SCOPUS/WoS.
Структура и объем диссертации. Диссертация включает разделы: введение, обзор
литературы, материалы и методы, результаты исследований, обсуждение результатов,
заключение и список литературы. Работа изложена на 149 страницах машинописного
текста, содержит 14 таблиц и 28 рисунка. Библиография содержит 52 наименования
российских и 50 наименований зарубежных авторов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследований служили пробы почвы в местах нефтедобычи в
Республике Эквадор (0°03'25.8"S 76°34'05.9"W, Гуарумо месторождение), Республике
Татарстан (54°54′N 52°18′E, Альметьевское месторождение) и Тюменской области (61°21′
N, 73°26′ E, Сургутское месторождение). Усредненные образцы получали отбором почв из
верхнего 20-см слоя по Методу «конверта».
Определение количества УОБ в образцах проводили общепринятым методам
[Нетрусев и др., 2007].
Выделение и идентификацию выделенных УОМ осуществляли многократными
пересевами доминирующих представителей сообществ на среде Мюнца с добавлением 2%
нефти в качестве источника углеродного питания и энергии.
Идентификацию выделенных микроорганизмов проводили по морфологическим,
физиолого-биохимическим и молекулярно-генетическим показателям.
Амплификацию высоконсервативного участка гена 16S рРНК осуществляли,
применяя
комбинацию
универсальных
праймеров
27fm
(5’AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’) и 1522R (5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)
[Weisburg et al., 1991]. В работе использовали эндонуклеазу рестикции RsaI. Профили
фрагментов ДНК анализировали в 2% агарозном геле. Полученную последовательность
сравнивали с последовательностями из международного банка данных NCBI (National
Center for Biotechnological Information, USA) c помощью пакета программ BLAST (Basic
Local Alignment Search Tool).
Способность изолятов к росту и деструкции нефти и углеводородов разного
строения была проведена на минеральных средах, содержащих, либо нефть, либо алканы
(гексан), арены (толуол) или полициклические ароматические углеводороды (нафталин).
Продукцию экстрацеллюляных сурфактантов изолятами оценивали по
изменению поверхностного натяжения нефти, эмульгирующей активности культуральной
жидкости, гемолитической активности и анализа диаметра капель [Naziya et al., 2014;
Mulligan et al., 1985].
Оценка устойчивости растений к нефтяному загрязнению определялась по
всхожести и энергии прорастания семян, а также по росту растений на почве загрязненной
нефтью. Опыты проводили с пятью видами растений: рожь (Secale cereale), ячмень
(Hordeum vulgare), рапс (Brassica napus), люцерна посевная (Medicago sativa) и травосмесь
(овсяница красная – 70%, райграс многолетний – 20 %, мятлик луговой – 10 %).
Определение колонизирующей способности УОМ проводили в 6-и месячном
лабораторном
эксперименте.
Для
этого
выделенные
консорциумы
6
1.
2.
3.
4.
5.
углеводородокисляющих бактерий использовали для инокуляции суточных проростков
семян люцерны. Титр используемой суспензии клеток составлял 106 кл/мл. После первого
цикла колонизации (10 суток), бактерии, смытые с апикальной части корня (1 см) были
использованы для инокулирования стерильных семян без дополнительного их
проращивания. После второго цикла, (10 суток), изолированные с кончика корня
микроорганизмы были высеяны на агаризованную среду Мюнца с нефтью. Выросшие
микроорганизмы использовали для инокуляции третьего цикла стерильных семян
люцерны. Через 10 суток культивирования, определяли количество микроорганизмов
сохранившихся на корнях растения. Все три цикла обработки семян и их проращивания
выполняли в гнотобиотической системе (стерильный песок с 10% среды PNS) [Hoffland et
al, 1989].
Четвертый цикл обработки микроорганизмами проводился на пророщенных
семенах, которые затем высевались в стерильную почву зараженную нефтью.
Моделирование фитобиоремедиации. В работе использовали следующие
модельные системы «растение-консорциум бактерий):
Люцерна без бактерий +2 % нефть + почва – контроль;
Люцерна +2 % нефть + почва + консорциум Эквадора люцерна + 2 % нефть + почва
+ консорциум Татарстана;
Люцерна + 2 % нефть + почва + консорциум Сургутского месторождения;
Люцерна +2 % нефть + почва + смесь выделенных штаммов.
Остаточное количество нефти в образцах, на первом этапе определяли по
классическим методикам Тюрина и Къельдаля [Аринушкина, 1970], на втором с помощью
газовой хроматографии и анализа SARA [Чемоданов и др., 2018].
Статистическую обработку данных проводили с использованием программ Microsoft
Exсel 2008 и программного приложения Graph Pad Software (www.graphpad.com).
Статистическую значимость рассчитывали с использованием коэффициента Стьюдента и
95% стандартных отклонений. Различие значений опыта и контроля принимали за
значимое, если величина p-значения не превышала уровня 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
1. Выделение и характеристика углеводородокисляющих микроорганизмов,
выделенных из образцов нефтезагрязненных почв умеренно-континентальной и
тропической зон
Первой задачей наших исследований было провести определение численности и
выделение углеводородокисляющих микроорганизмов из природных образцов: почв
Эквадора, Татарстана и Сургута.
Общая численность УОМ в образцах нефтезагрязненных почв Татарстана и
Эквадора составляла 6,0-7,0 х108 , в образцах Сургута - 7,0 х104. Из выделенных штаммов
было отобрано 20 штаммов УОБ (таблица 1). Их идентификация, в том числе, с помощью
молекулярно-генетического анализа, подтвердили, что выделенные штаммы
соответствуют следующим видам:
7
Таблица 1. Разнообразие углеводородокисляющих микроорганизмов из
нефтезагрязненных почв Эквадора (Е), Татарстана (Т) и Сургута (С).
Таким образом, состав микрофлоры шламов различных климатических зон,
отличался по своему составу. Если для образцов умеренно-континентального климата
России было характерно наличие грамотрицательных бактерий, то в жарком и влажном
климате Эквадора, кроме грамотрицательных бактерий, были обнаружены и штаммы,
отнесенные к грамположительным бактериям. В образцах, полученных из северных
районов с умеренно-континентальными климатическими условиями, имели преимущество
штаммы грамположительных бактерий, способных к образованию спор. Все
доминирующие микроорганизмы имели определенную общность и по наличию гена
алкан-монооксигеназы были объединены в два кластера (рисунок 1).
Рисунок
1.
Сравнение
последовательностей гена алканмонооксигеназы и цитохром Р450зависимой
монооксинегазы
у
представителей
разных
видов
бактерий.
Нуклеотидные
последовательности взяты из базы
данных GenBank. * - штаммы,
обнаруженные в анализированных
образцах.
8
2. Анализ активности штаммов, различных климатических зон, к росту и
деструкции нефти и углеводородов разного строения
Следующим этапом исследований, было изучение способности отдельных
штаммов, выделенных из различных климатических зон, к росту и деструкции нефти.
Результаты исследований показали, что все выделенные штаммы росли на нефти в
большей или меньшей степени. Среди выделенных культур, по активности расти и
накапливать биомассу, выделялись несколько штаммов, а именно Pseudomonas putida и
Cellulosimicrobium cellulans (из Эквадора), Pseudomonas putida (из Татарстана), а также
Bacillus licheniformis и Bacillus subtilis (из Сургута), которые накапливали биомассу в
диапазоне 0,9-1,0 опт.ед., несмотря на то, что они принадлежали к разным видам и были
выделены из разных климатических зон (рисунок 2).
Необходимо отметить, что в отличие от консорциумов других климатических зон,
консорциум Татарстана, содержал большее количество бактерий, которые давали
ощутимый прирост биомассы до 0,4 опт.ед.
Рисунок 2. Рост углеводородокисляющих бактерий из образцов Эквадора (Е), Татарстана
(Т) и Сургута (С) при содержании нефти 2%.
Кроме того, для всех бактерий, растущих на нефти, был отмечен S-образный характер
роста популяции. Следовательно, бактерии сначала растут на более доступном субстрате,
а затем на более сложных углеводородах.
Проверка способности штаммов расти на алканах (гексан) показала, что на данных
углеводородах хорошо росло большинство штаммов УОМ, в отличие от аренов (толуол).
Значительно меньшее количество штаммов росло и накапливало биомассу на
полициклических ароматических углеводородах (ПАУ) (нафталин). Известно, что
деградация ПАУ во многом зависит от их молекулярного веса и, возможно, нафталин
является не лучшим субстратом в качестве источника углерода. Кроме того,
предполагается, что существует двухстадийный механизм утилизации ПАУ в почве, когда
9
на первом этапе бактерии деградируют ПАУ до некоторых промежуточных продуктов,
которые затем используются для роста бактерий.
В процессе роста бактерий на углеводородах различного строения было отмечено
определенное предпочтение штаммов в субстратах. Например, Delftia thsuruhatensis,
которая хорошо росла на алканах, слабо росла на углеводородах другого строения, или
Pseudomonas fluorescens, который из всех изучаемых углеводородов отдавал предпочтение
только толуолу в качестве субстрата (штамм из Эквадора), или нафталину (штамм из
Татарстана). С другой стороны, в исследованиях была отмечена и общность метаболизма
выделенных штаммов бактерий. Особенно четко она прослеживается у штаммов
Pseudomonas putida из образцов Эквадора и Татарстана. У них наблюдалась полная
идентичность в способности трансформировать нефть и углеводороды различного
состава. С другой стороны, физиологические возможности штаммов даже внутри одного
вида могли отличаться. Данный факт был установлен на нескольких видах, так например,
штамм Bacillus subtilis Сургутского месторождения, хорошо рос на нефти и толуоле в
отличие от штамма Bacillus subtilis из Эквадора. Штамм Pseudomonas aeruginosa из
Эквадора слабо рос на толуоле, а штамм Pseudomonas aeruginosa из Татарстана давал
достаточно хороший прирост биомассы.
Таким образом, было установлено, что все выделенные УОМ консорциумов
различных климатических зон, обладают способностью к росту и деградации нефти и ее
отдельных компонентов.
3. Оценка продукции экстрацеллюляных сурфактантов штаммами
микроорганизмов различных климатических зон
Еще одной важной характеристикой углеводородокисляющих консорциумов
является способность штаммов к образованию сурфактантов, поэтому следующей задачей
наших исследований была оценка способности выделенных штаммов к продукции данных
соединений (таблица 2).
Результаты исследований показали, что основными продуцентами сурфактантов
были Aeromonas hydrophila и Pseudomonas aeruginosa (из консорциума Татарстана),
Bacillus subtilis и Klebsiella oxytoca (из консорциума Сургута) и Bacillus subtilis и
Pseudomonas aeruginosa (из консорциума Эквадора).
Именно данные штаммы при росте на питательной среде с нефтью эффективно
снижали поверхностное натяжение нефти (рисунок 3). В процессе образования
сурфактантов наблюдалась определенная закономерность. Штаммы, которые наиболее
эффективно росли на нефти, а именно, Pseudomonas putida (из Эквадора и Татарстана) и
Bacillus licheniformis (из Сургутского месторождения), обладали очень слабой
эмульгирующей активностью и мало меняли поверхностное натяжение нефти. И
наоборот, более слабо растущие штаммы бактерий, такие как Bacillus subtilis (из
Эквадора), Pseudomonas aeruginosa (из Эквадора и Татарстана), Aeromonas hydrophila
активно синтезировали сурфактанты и снижали поверхностное натяжение нефти с
показаний от 71 мН/м до 26-27 мН/м.
Данные отличия, возможно, связаны с разной способностью взаимодействия
углеводородов с клетками. Штаммам, которые росли и накапливали биомассу слабее,
было необходимо увеличение количества доступного субстрата и поэтому они активно
10
синтезировали сурфактанты. С другой стороны, активно растущие штаммы, по-видимому,
лучше взаимодействовали с углеводородами своей клеточной поверхностью.
Таблица 2. Характеристика сурфактантных свойств бактерий Эквадора, Татарстана
и Сургута.
Следует отметить, что из 5 штаммов УОМ Сургутсткого месторождения, 4 активно
синтезировали сурфактанты. Исключением был штамм Bacillus licheniformis, который
активно рос и не синтезировал сурфактанты. Такая высокая активность штаммов к
образованию сурфактантов, по-видимому, связана с климатическими условиями отбора
образца. Суровые климатические условия Сургутского месторождения вызывают в
клетках бактерий активный синтез вторичных метаболитов, в том числе, обладающих
эмульгирующей активностью.
Рисунок 3. Динамика изменения поверхностного натяжения при росте штаммов из
Эквадора (Е), Татарстана (Т) и Сургута (С) на среде Мюнца, содержащей 2% нефти.
11
Таким образом, штаммы, выделенные из разных климатических зон, были
способны к синтезу сурфактантов. Наибольшая способность к синтезу сурфактантов
наблюдалась у штаммов, выделенных из образца Сугрутского месторождения.
4. Фитобиоремедиация
Среди методов очистки нефтезагрязненных почв, в настоящее время, появилось
новое направление – фитобиоремедиация.
Растения играют важную роль в детоксикации почв от различных поллютантов,
включая нефтяные загрязнения, поэтому, прежде всего, необходимо было провести
подбор растений, устойчивых к нефтяному загрязнению и способных к фиторемедиации.
4.1
Влияние нефтезагрязнения почв на всхожесть и вегетативный рост
сосудистых растений
В наших исследованиях было изучено 5 видов растений: рожь (Secale cereale), ячмень
(Hordeum vulgare), рапс (Brassica napus), люцерна посевная (Medicago sativa) и травосмесь
(овсяница красная – 70%, райграс многолетний – 20 %, мятлик луговой – 10 %). Данные
растения были проверены на почве трех уровнях загрязнения вязкой нефтью: 2%, 3% и
4%.
Результаты исследований показали, что среди изученных растений, наибольшей
устойчивостью к загрязнениям вязкой нефтью обладала люцерна, поскольку ее семена
сохраняли всхожесть и энергию прорастания в диапазоне нефтезагрязнений 2-3% и лишь
незначительно снижая всхожесть и энергию прорастания при загрязнении 4%. Данные
концентрации нефти, не вызывали значительных изменений и в приросте надземной и
корневой части у данного растения.
Среди зерновых культур по устойчивости к нефтяным загрязнениям можно отметить
семена ячменя.
4.2 Способность микроорганизмов к колонизации корней растения и
фитобиоремедиации
Рисунок 4 . Общая схема выделения бактерий с повышенной колонизационной
активностью.
12
На первых этапах эксперимента проводили инокуляцию семян люцерны
консорциумами микроорганизмов доминирующих штаммов, в течение 24 ч, которые через
гнотобиотическую систему высевались в стерильную почву загрязненную нефтью
(рисунок 4).
Культивирование растений и микроорганизмов на последнем этапе осуществляли в
течение 30 дней, после чего проводился отбор проб (4 повторности) из участков зоны
роста корней растений и апикальной меристемы. Затем образцы исследовались на
содержание КОЕ (рисунок 5).
Рисунок 5. Общая численность микроорганизмов через 30 дней культивирования
Люцерны
и
консорциумов
углеводородокисляющих
микроорганизмов
на
нефтезагрязненной почве (нефть 2 %): А – Апикальная часть корня растений, Р - Зона
роста корня растений.
Результаты исследований показали достоверное увеличение количества
микроорганизмов на корнях растений при обработке семян консорциумами
микроорганизмов различных климатических зон в условиях 2% загрязнения нефтью.
Повышение численности микроорганизмов было особенно значимым при анализе участка
апикальной зоны корня. Такое увеличение количества микроорганизмов в апикальной
части корня, по-видимому, связано с наличием наибольшего количества питательных
веществ, что позволяет микроорганизмам интенсивно размножаться.
Сравнивая
колонизирующую
способность
микроорганизмов
различных
климатических зон можно сказать, что наибольшее число микроорганизмов в апикальной
части корня и зоне его роста наблюдалось в случае обработки семян люцерны
консорциумом Татарстана. Возможно, это связано с тем, что в состав консорциума из
Татарстана входило большее число микроорганизмов, по сравнению с консорциумами
Эквадора и Сургутского месторождения. С другой стороны, самый невысокий прирост
клеток на корнях растений наблюдался в случае обработки семян люцерны всеми
выделенными штаммами. В данном случае, по-видимому, наблюдался процесс
конкуренции между микроорганизмами, которые вытесняли друг друга от мест
прикрепления клеток к поверхности корня.
13
4.2
Определение микроорганизмов эффективных колонизаторов растений
Дальнейшее определение микроорганизмов эффективных колонизаторов растений
показало, что из 20 выделенных доминирующих штаммов УОМ различных
климатических зон, было отобрано 7 штаммов, которые активно колонизировали корни
люцерны. Идентификация этих штаммов на основе последовательности гена 16S рРНК
гена показала, что они принадлежат к видам: Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida,
Pseudomonas fluorescens, Burkholderia cepacia, Bacillus subtilis, Cellulosimicrobium cellulans
и Cellulosimicrobium funkei.
4.3 Влияние комплекса «растение-консорциум микроорганизмов» на
деградацию нефти в почве
Для изучения активности процесса фиобиоремедиации в работе использовали
созданную модельную систему – «растение-консорциум бактерий» на основе
травянистого растения люцерны (лат. Medicago, сем. Fabaceae) и консорциума бактерий
нефтедеструкторов из Эквадора, Татарстана и Сургута, а также всех выделенных штаммов
УОМ.
Результаты исследований показали, что при использовании растительномикробных ассоциаций в почве наблюдалось снижение содержания нефти (рисунок 6).
Особенно значимое снижение нефти было установлено при использовании в модельной
системе «люцерна-бактерии-колонизаторы растения из Татарстана». Содержание нефти в
данном случае в почве снижалось до 65%. При использовании колонизаторов растений
отдельных консорциумов из Эквадора и Сургутского месторождения, снижение
содержания нефти было несколько меньше и составляло 45-50%. Наиболее слабое
снижение содержания нефти наблюдалось при использовании обработки семян смесью
микроорганизмов из разных климатических зон.
Рисунок 6-Изменение содержания нефти в почве при действии ассоциаций
растение консорциум углеводородокисляющих бактерий после 30 дней.
Дополнительным доказательством способности модельных систем к деградации
нефти были опыты по определению остаточной нефти в образцах почвы после их роста
(рисунок 7). Анализ нефтяных фракций проводился в диапазоне С18-С30.
Результаты исследований показали, что деградация нефти наблюдалась всех
фракций нефти при использовании созданных моделей.
14
Рисунок 7. Определение фракций остаточной нефти в диапазоне (С19-С30) после ее
деградации 30 дней. K - контроль (исходный состав), А - люцерна (лат. Medicago, сем.
Fabaceae), Б - люцерна-консорциум Татарстана, В –люцерна-консорциум Эквадора, Гконсорциум Сургутского месторождения.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведенные исследования показали, что состав микрофлоры консорциумов
различных климатических зон значительно отличался друг от друга, но имел
определенную общность по молекулярно-генетической структуре. В образцах шламов
центральной части умерено-континентального и тропического климата преобладали
грамотрицательные бактерии, а в северных районах умеренно-континентального климата
– грамположительные, спорообразующие бактерии. Идентификация штаммов на основе
последовательности гена 16SрРНК показала, что грамотрицательные микроорганизмы
относятся преимущественно к родам Pseudomonas, Cellulosimicrobium и Aeromonas, а
среди грамположительных бактерий преобладает род Bacillus. Все выделенные штаммы
хорошо росли на нефти и продуктах ее деградации. Наиболее перспективными хорошо
растущими на нефти и продуктах ее деградации были штаммы Pseudomonas putida и
Pseudomonas aeruginosa (из Татарстана), Pseudomonas putida и Cellulosimicrobium cellulans
(из Эквадора), а также Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis (из Сургута). Штаммы
различных климатических зон были способны также к синтезу сурфактантов. Однако
наиболее активными продуцентами сурфактантов были штаммы, полученные из образцов
нефтезагрязненных почв континентального климата. Среди них, можно отметить Bacillus
subtillus и Klebsiella oxytoca (из Сургута). Неплохие результаты по синтезу сурфактантов
других консорциумов принадлежали штаммам Bacillus subtillus и Pseudomonas aeruginosa
(из Эквадора) и Aeromonas hydrophila и Pseudomonas aeruginosa (из Татарстана). Из
полученных 20 штаммов углеводородокисляющих бактерий 7 штаммов, а именно
Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas fluorescens, Burkholderia
cepacia, Bacillus subtilis, Cellulosimicrobium cellulans и Cellulosimicrobium funkei, были
способны к эффективной колонизации растений, что позволяет рекомендовать их для
процессов фитобиоремедиации. Среди изученных растительных объектов наиболее
перспективными в процессах фиторемедиации были люцерна и ячмень.
Созданные на основе растений и микроорганизмов, растительно-микробные
ассоциации, состоящие из люцерны и штаммов-деструкторов, штаммов-колонизаторов,
Эквадора, Татарстана и Сургутского месторождения, показали высокую эффективность в
деградации вязких нефтей и могут быть рекомендованы для очистки почв от нефтяных
15
загрязнений. Наиболее активная фитобиоремедиация наблюдалась при использовании
ассоциации созданной на основе люцерны и консорциума бактерий нефтезагрязненных
почв Татарстана.
ВЫВОДЫ
1. Выделены и идентифицированы члены микробных сообществ трех образцов
нефтезагрязненных почв умеренно-континентальной и тропической климатических зон
(Сургут, Татарстан, Эквадор).
2.
Установлена способность штаммов различных консорциумов к использованию
нефти, алканов, аренов и полиароматических углеводородов, а также к синтезу
сурфактантов:
- наиболее активными деструкторами были штаммы Pseudomonas putida и
Pseudomonas aeruginosa (из консорциума Татарстана), Bacillus subtillis и Bacillus
licheniformis (из консорциума Сургута) и Pseudomonas putida и Cellulosimicrobium cellulans
(из консорциума Эквадора);
- синтез сурфактантов был наиболее высокий - Aeromonas hydrophila и
Pseudomonas aeruginosa (из консорциума Татарстана), Bacillus subtilis и Klebsiella oxytoca
(из консорциума Сургута) и Bacillus subtilis и Pseudomonas aeruginosa (из консорциума
Эквадора).
3.
Оптимальные параметры роста на нефтезагрязненной почве и максимальную
способность к удержанию бактериального сообщества продемонстрировала люцерна.
4.
Среди микробных консорциумов нефтезагрязненных почв различных
климатических зон самой высокой колонизирующей способностью обладали штаммы,
выделенные из образца Татарстана. Среди видового состава выделенных
углеводородокисляющих микроорганизмов, 35% штаммов, удерживались и развивались
на апикальной зоне проростков люцерны в течение 30 дней.
5.
Сравнительный анализ фитобиоремедиационной способности созданных систем на
основе растения люцерны и консорциумов бактерий выявил максимальный потенциал
системы «люцерна консорциум нефтезагрязненных почв Татарстана».
Список работ, опубликованных по теме диссертации.
1. Баутиста Х. Влияние нефтезагрязнения почв на всхожесть и вегетативный рост
сосудистых растений / Х. Баутиста, Т.В. Багаева, Ш.З. Валидов // Вестник биотехнологии
и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова - 2017.- Т.13.- №2.- С.5-9.
2. Bautista H. Study on degradation of crude oil and pure hydrocarbons by halotolerant
bacterial consortium from Iranian coasts/ H. Bautista, T. V. Bagaeva , S. Z. Validov// Journal of
Fundamental and Applied Sciences.- 2017.-V.9.-N1S .- Р. 1626-1635.
3. Bautista H. Isolation, selection and molecular identification of biosurfactant-producing
extremophilic bacteries from crude oil polluted soil / H. Bautista, T.V. Bagaeva, A.A.
Toymentseva, T. Hernandez-Gomez // International Journal of Pharmacy and Technology. 2016. – V.8.-N3.- P.15054-15065.
4. Bautista H. Hydrocarbon oxidizing microorganisms: their isolation and study of
colonization capacity for the use in rhizoremediation processes of contaminated soils / H.
16
Bautista, S. Gallyamova, Bagaeva T.V., Validov S.Z // International Journal of Pharmacy &
Technology.- 2016. –V.8.- N4.-Р. 24615-24621.
5. Bautista H. Review on the Sundarbans Delta Oil Spill: Effects On Wildlife and
Habitats / H. Bautista, K.M.M. Rahman // International Research Journal.-2016.-V.1.-N43.- P.
93-96.
6. Morozov N.V. Bacterial response of oil-degrading bacteria consortia to heavy oil upon
its transition to easy-flowing hydrocarbons / N.V. Morozov, T.V. Bagaeva, H. Bautista //
Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. - 2015. – V.6.-N4.P.2114-2124.
Тезисы докладов и статьи в сборниках материалов конференций
7. Галлямова C.P. Микробиологические способы борьбы с разложением алканов
(парафинов) микроорганизмами в республике Татарстан/С.Р. Галлямова, И.И. Идиятов, Х.
Баутиста /Фундаментальные и прикладные научные исследования (Электр. Источник):
Сборник статей II-ой Международной научно-практической конференции (21 февраля
2018г; г.Оренбург).: Центр «АнтроВита», 2018. - С.3-8 URL: http://socis.ru/wpcontent/uploads/Фундаментальные-и-прикладные-научные-исследования-2.pdf
8. Баутиста Х. Отбор растений, устойчивых к нефтяному загрязнению, определение
активности пероксидазы и оценка влияния нефти на их морфологические и
физиологические параметры/ Баутиста Х., Багаева Т.В., Валидов Ш.З./ ежегодная итоговая
научная конференция. [Электронный ресурс] КФУ.- 6 Фев.2017 https://shelly.kpfu.ru/eksu/docs/F1227589282/UTezis6fev2017_ispravl.pdf
9. Баутиста Х. Выделение галотолерантных нефтеокисляющих бактерий −
продуцентов биосурфактантов из прибрежного шельфа северной Кубы/ Баутиста Х.,
Эрнандес-Гомес Т., Кардинале М.,Колпаков А.И , Багаева Т.В/ 1-ый Российский
микробиологический конгресс: сборник тезисов/под ред. д.б.н. Решетиловой Т.А.М.:ООО «Вода: химия и экология», 2017.- 140с.
10.
Баутиста
Х.
Выделение
нефтеокисляющих
бактерий-продуцентов
биосурфактантов из амазонских джунглей эквадора /Х. Баутиста, Ш.З. Валидов, Т.В.
Багаева//Материалы конференции Симбиоз-Россия.- 2017. - С.301-302.
11. Баутиста Х. Определение бактериального консорциума деградирующего
компоненты нефти в условиях повышенной солёности/ Баутиста Х.,Валидов Ш.З., Багаева
Т.В./ ежегодная итоговая научная конференция КФУ. [Электронный ресурс] 22 янв.2016
https://kpfu.ru/main?p_id=38349&p_lang=&p_type=9&p_pub_type=29
12. Баутиста Х. Фиторемедиация нефтезагрязненных почв : Выделение
микроорганизмов, эффективно колонизующих растения/Баутиста Х., Валидов Ш.З.,
Багаева Т.В. /Научная и производственная деятельность: средство формирования среды
обитания человечества/Материалы Всероссийской молодежной научно-практической
конференции (с международным участием).- Тюмень: Тюменский индустриальный
университет, 2016.- с.46-48 .
13. Баутиста Х. Выделение штаммов ризосферных бактерий для эффективной
фиторемедиации нефтяных загрязнений/ Баутиста Х., Беркович Я. В./ Материалы
международного молодежного научного форум «Ломоносов-2016» /Отв. Ред. И.А.
Алешковский, АВ.. Андриянов, Е.А. Антипов.[Электронный ресурс] – http://lomonosov17
msu.ru/archive/Lomonosov_2016/data/8321/uid111208_ae8eba751d2c4ca8429cf9e5804615426
07c961f.doc
14. Bautista H. Effects of Crude Oil Pollution in the Tropical Rainforest Biodiversity of
Ecuadorian Amazon Region/ Bautista H. and Rahman K. M. M. // Journal of Biodiversity and
Environmental Sciences.-2016.- V.8.-N2.-P. 249-254.
15. Баутиста Х. Выбор оптимальных условий биодеструкции вязких нефтей
ассоциациями углеводородокисляющих микроорганизмов / Баутиста Х., Багаева Т.В./
Ежегодная итоговая научная конференция КФУ. [Электронный ресурс] 20.03.2015
https://kpfu.ru/main?p_id=38349&p_lang=&p_type=9&p_pub_type=29
Адрес для отзывов на автореферат: 420008, Казань, ул. Кремлевская, 18, главное здание
Казанского федерального университета, отдел аттестации научно-педагогических кадров,
Ученому секретарю Диссертационного совета Д 212.081.08 Абрамовой Зинаиде Ивановне,
факс: (843) 238-76-01. E-mail: ziabramova@mail.ru.
E-mail автора: hbautista@mail.ru
18
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа