close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Влияние оральных гормональных контрацептивов на функциональную активность гликопротеина–Р в эксперименте

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Котлярова Анна Анатольевна
ВЛИЯНИЕ ОРАЛЬНЫХ ГОРМОНАЛЬНЫХ КОНТРАЦЕПТИВОВ НА
ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ГЛИКОПРОТЕИНА–Р
В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология
АВТОРЕФЕРАТ
на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Рязань – 2018
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном
учреждении высшего образования «Рязанский государственный медицинский
университет имени академика И.П. Павлова»
Министерства здравоохранения Российской Федерации
(ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России)
Научный руководитель:
Доктор медицинских наук,
профессор
Якушева Елена Николаевна
Официальные оппоненты:
Доктор медицинских наук, профессор,
профессор кафедры молекулярной фармакологии и
радиобиологии им. академика П.В. Сергеева
ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова
Минздрава России
Карева Елена Николаевна
Кандидат биологических наук,
начальник отдела клинической
фармакогенетики и персонализированной
медицины Центра клинической фармакологии
ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России
Казаков Руслан Евгеньевич
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного
профессионального образования «Российская медицинская академия непрерывного
профессионального образования» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
(ФГБОУ ДПО РМАНПО Минздрава России)
Защита диссертации состоится «____»_________________2018 г. в_____ч на заседании
диссертационного совета Д. 001.024.01 на базе ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В.
Закусова» по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, 8.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ученой части ФГБНУ «НИИ
фармакологии имени В.В. Закусова» по адресу: 125315 Москва, ул. Балтийская, д.8 и на
сайте www.academpharm.ru
Автореферат разослан «____» ____________2018 года
Ученый секретарь
диссертационного совета
доктор медицинских наук,
профессор
Вальдман Елена Артуровна
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность. Широкое распространение полипрагмазии выводит на новый
уровень проблему лекарственных взаимодействий (Кукес В.Г. и соавт., М.: Гэотар –
Медиа, 2008. 293 с.; Сычев Д.А. и соавт., СПб.: ЦОП «Профессия», 2016. 224 с.).
Отдельную категорию пациентов, с позиции анализа лекарственных взаимодействий,
составляют лица с измененным гормональным статусом, а также получающие
гормонотерапию (Колпакова Т.А., Медицинский альянс. 2015. 2. С. 42–46; Смирнова О.М.
и соавт., Эффективная фармакотерапия. 2016. 37. С. 32– 43).
В прогнозировании и оценке межлекарственных взаимодействий все больший
интерес исследователей и клиницистов отмечается к особенностям функционирования
транспортных систем мембран клеток. Одно из ключевых мест среди транспортеров
занимает гликопротеин–P (Pgp, ABCB1 белок), участвующий в выведении (эффлюксе)
широкого спектра липофильных биобиотиков и ксенобиотиков из клетки. Учитывая
значимость белков–транспортеров в развитии межлекарственных взаимодействий,
регуляторы отдельных стран, например, FDA (Food and Drug Administration) в США,
рекомендуют тестировать новые лекарственные средства на принадлежность к
субстратам, индукторам и ингибиторам Pgp, а в инструкциях по применению указывать
возможные взаимодействия на уровне Pgp.
Интерес представляют исследования взаимного влияния на функциональную
активность Pgp совместного приема оральных гормональных контрацептивов и
лекарственных веществ–субстратов белка–транспортера, так как оральные гормональные
контрацептивы могут выступать в качестве самостоятельной стороны в формировании
лекарственных взаимодействий, что в реальной клинической практике требует
обязательного учета с целью коррекции доз.
Степень разработанности проблемы. Гормональная контрацепция является
одним из высокоэффективных методов предохранения от нежелательной беременности. В
настоящее время более 200 млн. женщин в мире применяют гормональные контрацептивы
(Якушевская О.В. и соавт., Русский медицинский журнал. 2013. 23. С. 1122), и даже по
самым скромным подсчетам к 2030 году эта цифра удвоится (United Nations, Department of
Economic and Social Affairs, Population Division. 2015. 70 р.; United Nations, Department of
Economic and Social Affairs, Population Division (2017). – NY: United Nations, 2017).
В ряде стран, в том числе и в России, в инструкциях по применению препаратов
стали указывать возможные взаимодействия на уровне ферментных систем (цитохром
P450) и белков–транспортеров (Pgp). Инструкции на многие оральные гормональные
контрацептивы содержат указания о потенциальной неэффективности при совместном
приеме с лекарственными веществами и лекарственными растениями, которые
индуцируют Pgp (например, рифампицин, зверобой, ингибиторы протеаз, карбамазепин,
3
барбитураты и др.). Но также имеются данные о том, что синтез белка–транспортера и его
функционирование
регулируется
эндокринной
системой,
а
гормоны
стероидной
структуры принимают в этом непосредственное участие (Fedoruk M.N. et al., The Prostate.
2004. 59. 1. P. 77– 90; Frohlich M. et al., Biochemical Pharmacology. 2004. 68, 12. P. 2409–
2416; Kim W.Y. et al., Pharmaceutical Research. 2004. 21. 7. P. 1284–1293).
Однако
комбинаций
отсутствуют
публикации,
этинилэстрадиола
и
отражающие
гестодена,
влияние
линестренола
этинилэстрадиола
и
и
диеногеста,
этинилэстрадиола и дроспиренона на функциональную активность Pgp в условиях
целостного организма.
Особенности
структуры
ряда
компонентов
оральных
гормональных
контрацептивов позволяют предположить их влияние на белок–транспортер в качестве
потенциальных ингибиторов функциональной активности и синтеза Pgp.
Кроме того, актуальным вопросом является выяснение и уточнение возможных
корреляционных
зависимостей
между
изменением
гормонального
статуса
и
фармакокинетическими параметрами фексофенадина – маркерного субстрата Pgp, а также
относительным количеством Pgp на мембранах клеток, что можно оценить только в
условиях целостного организма.
В
данной
связи
необходимо
изучить
влияние
оральных
гормональных
контрацептивов на функциональную активность и относительное количество белка–
транспортера Pgp на мембранах клеток.
Цель исследования. Оценить влияние оральных гормональных контрацептивов,
содержащих гестаген и гестагены в комбинации с этинилэстрадиолом на функциональную
активность и относительное количество Pgp на мембранах клеток в условиях нормы.
Основные задачи исследования. Для достижения цели были поставлены
следующие задачи:
1.
Изучить влияние курсового назначения комбинации этинилэстрадиола и гестодена
на функциональную активность и относительное количество Pgp на мембранах клеток.
2.
Изучить влияние курсового назначения комбинации этинилэстрадиола и
диеногеста на функциональную активность и относительное количество Pgp на
мембранах клеток.
3.
Изучить влияние курсового назначения комбинации этинилэстрадиола и
дроспиренона на функциональную активность и относительное количество Pgp на
мембранах клеток.
4.
Изучить влияние линестренола на функциональную активность и относительное
количество Pgp на мембранах клеток.
4
5.
Провести корреляционный анализ функциональной активности и относительного
количества Pgp на мембранах клеток с уровнем половых гормонов в крови при
назначении оральных гормональных контрацептивов.
Научная новизна. Впервые в эксперименте in vivo на кроликах изучено влияние
оральных гормональных контрацептивов на функциональную активность и относительное
количество Pgp на мембранах клеток на фоне нормы.
Впервые в эксперименте на кроликах показано влияние курсового введения в
течение 21 дня комбинаций этинилэстрадиола в дозе 6,5 мкг/кг и гестагенов: гестодена в
дозе 16,5 мкг/кг, диеногеста в дозе 450 мкг/кг и дроспиренона в дозе 650 мкг/кг на
функциональную активность и относительное количество Pgp на мембранах клеток в
условиях нормы.
Выявлено
этинилэстрадиола
ингибирующее
и
гестодена
влияние
на
курсового
функциональную
применения
активность
комбинации
Pgp,
о
чем
свидетельствуют изменения основных фармакокинетических параметров фексофенадина
и уменьшение относительного количества белка–транспортера на мембранах гепатоцитов,
энтероцитов и эндотелиоцитов ГЭБ, а также снижение уровня эндогенных регуляторов
Pgp – эстрадиола и тестостерона.
Установлено
этинилэстрадиола
ингибирующее
и
диеногеста
влияние
на
курсового
функциональную
применения
активность
комбинации
Pgp,
о
чем
свидетельствуют изменения основных фармакокинетических параметров фексофенадина
и уменьшение относительного количества белка–транспортера на мембранах гепатоцитов
и энтероцитов, а также снижение уровня эндогенного регулятора Pgp – прогестерона.
Выявлено
ингибирующее
влияние
курсового
применения
комбинации
этинилэстрадиола и дроспиренона на функциональную активность Pgp, о чем
свидетельствуют изменения основных фармакокинетических параметров фексофенадина
и уменьшение относительного количества белка–транспортера на мембранах гепатоцитов
и энтероцитов, а также снижение уровня эндогенных регуляторов Pgp – эстрадиола,
прогестерона и тестостерона.
Установлено ингибирующее влияние 28–дневного курса линестренола в дозе 110
мкг/кг массы на функциональную активность Pgp, что подтверждается значимыми
изменениями
фармакокинетических
параметров
маркерного
субстрата
белка–
транспортера – фексофенадина и снижением относительного количества белка–
транспортера на мембранах гепатоцитов, эндотелиоцитов ГЭБ, и сопровождается
уменьшением уровня эндогенных регуляторов Pgp – эстрадиола, прогестерона и
тестостерона.
5
Впервые в эксперименте установлены корреляционные зависимости между
изменением гормонального статуса кроликов, фармакокинетическими параметрами
фексофенадина и относительным количеством Pgp на мембранах клеток на фоне
курсового введения линестренола и комбинации гестагенов с этинилэстрадиолом в
условиях нормы.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследования
показали ингибирующее влияние линестренола, комбинаций этинилэстрадиола и
гестодена, этинилэстрадиола и диеногеста, этинилэстрадиола и дроспиренона на
функциональную активность и снижение относительного количества Pgp на мембранах
клеток. Полученные экспериментальные данные могут быть использованы в клинической
практике с целью коррекции доз лекарственных средств–субстратов Pgp в сторону
уменьшения в случае их комбинации с оральными гормональными контрацептивами,
чтобы избежать повышения плазменной концентрации и возникновения нежелательных
лекарственных реакций из–за ингибирования функциональной активности белка–
транспортера. Терапия заболеваний лекарственными веществами–субстратами Pgp
(дигоксин, варфарин, дабигатрана этексилата, ривароксибан, клопидогрел, доксорубицин,
тетрациклин, цефазолин, цефоперазон, левофлоксацин, спарфлоксацин, пароксетин и др.)
должна осуществляться с учетом возможных изменений их фармакокинетики в связи со
снижением
активности
белка–транспортера
на
фоне
линестренола,
комбинаций
этинилэстрадиола и гестодена, этинилэстрадиола и диеногеста, этинилэстрадиола и
дроспиренона. Результаты работы позволяют использовать предложенные схемы введения
оральных гормональных контрацептивов в качестве положительного контроля снижения
функциональной активности Pgp с целью поиска веществ аналогичного действия, а также
для прогнозирования возможной принадлежности изучаемых лекарственных веществ к
числу субстратов белка–транспортера.
Методология и методы исследования. В работе использованы современные
методы анализа функциональной активности, локализации и относительного количества
Pgp, концентрации половых гормонов: аналитический – высокоэффективная жидкостная
хроматография (ВЭЖХ) с УФ–детектированием, фармакокинетический – модельно–
независимый
анализ
фармакокинетики
фексофенадина,
иммуногистохимический
–
морфофункциональная оценка тканей, радиоиммунный – определение содержания половых
гормонов и методы математической статистики. Исследование соответствует пунктам 4, 8 и
14 паспорта специальности «14.03.06 – Фармакология, клиническая фармакология».
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Комбинация этинилэстрадиола в дозе 6,5 мкг/кг и гестодена в дозе 16,5 мкг/кг,
вводимая (в/ж) интактным кроликам в течение 21 дня, вызывает ингибирование
6
функциональной активности и уменьшение относительного количества Pgp на мембранах
гепатоцитов, энтероцитов и эндотелия гематоэнцефалического барьера.
2. Комбинация этинилэстрадиола в дозе 6,5 мкг/кг и диеногеста в дозе 450 мкг/кг,
вводимая (в/ж) интактным кроликам в течение 21 дня, вызывает ингибирование
функциональной активности и уменьшение относительного количества Pgp на мембранах
гепатоцитов и энтероцитов.
3. Комбинация этинилэстрадиола в дозе 6,5 мкг/кг и дроспиренона в дозе 650 мкг/кг,
вводимая (в/ж) интактным кроликам в течение 21 дня, вызывает ингибирование
функциональной активности и уменьшение относительного количества Pgp на мембранах
гепатоцитов и энтероцитов.
4. Линестренол, вводимый (в/ж) интактным кроликам в дозе 110 мкг/кг в течение 28
дней,
приводит
относительного
к
ингибированию
количества
Pgp
функциональной
на
мембранах
активности
гепатоцитов
и
снижению
и
эндотелия
гематоэнцефалического барьера.
5. Уровень эстрадиола в сыворотке крови имеет обратные корреляционные связи
средней силы с Сmax, AUC0–24 и AUC0–∞ фексофенадина, прямые корреляционные связи
средней силы с интенсивностью окраски Pgp–позитивных мембран гепатоцитов, а также
прямые корреляционные связи высокой силы с относительной площадью Pgp–позитивных
мембран гепатоцитов и интенсивностью окраски Pgp–позитивных мембран энтероцитов.
Уровень прогестерона в сыворотке крови имеет обратные корреляционные связи
средней силы с AUC0–24 и МRT24 фексофенадина, прямые корреляционные связи средней
силы с интенсивностью окраски и относительной площадью Pgp–позитивных мембран
гепатоцитов, интенсивностью окраски Pgp–позитивных мембран энтероцитов, а также
прямые корреляционные связи высокой силы с относительной площадью Pgp–позитивных
мембран гепатоцитов и мембран эндотелия капилляров головного мозга.
Степень достоверности. Достаточный объем экспериментальных исследований,
проведенных с использованием соответствующих поставленным задачам современных
методов исследования, последующий анализ и комплексная статистическая обработка
полученных данных обеспечивают высокую
степень достоверности полученных
результатов.
Личный вклад. Автором самостоятельно выполнен аналитический обзор
литературы по изучаемой проблеме, разработана программа исследования, выполнена
экспериментальная часть работы, проведены хроматографические исследования, анализ
гистологических срезов, статистическая обработка и интерпретация полученных данных.
По полученным результатам подготовлены публикации.
7
Внедрение результатов в практику. Результаты работы внедрены и используются
в учебном процессе при обучении студентов и ординаторов на кафедре фармакологии с
курсом фармации ФДПО ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы представлены
на Всероссийской научной конференции, посвященной 90–летию со дня рождения
профессора А.А. Никулина (Рязань, 2013), XIII–й международной конференции студентов
и молодых ученых (Витебск, 2013), Всероссийской конференции молодых ученых с
Международным участием, посвященной 150–летию со дня рождения академика Н.П.
Кравкова (Рязань, 2015), III Всероссийской научной конференции молодых специалистов,
аспирантов, ординаторов (Рязань, 2017), VII Международном молодежном медицинском
конгрессе «Санкт–Петербургские научные чтения» (Санкт–Петербург, 2017), а также
представлены на межкафедральном совещании кафедр фармакологии с курсом фармации
ФДПО,
нормальной
физиологии
с
курсом
психофизиологии,
патофизиологии,
биологической химии с курсом клинической лабораторной диагностики ФДПО,
неврологии и нейрохирургии, общей и фармацевтической химии, фармакогнозии с курсом
ботаники, биологии, сестринского дела ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России с
привлечением заинтересованных лиц 15 января 2018 г.
Публикации. Результаты исследования опубликованы в 5 статьях в ведущих
рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России, 1
патенте Российской Федерации и 7 тезисах докладов в материалах Российских и
международных конференций.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 162 страницах
компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания используемых
материалов и методов исследования, обсуждения результатов, выводов, практических
рекомендаций и списка литературы, включающего 256 источников, из них 39 –
отечественных и 217 – зарубежных источников. Работа иллюстрирована 25 таблицами и
54 рисунками. Диссертация выполнялась по основному плану научно–исследовательских
работ ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Экспериментальные животные. Исследование проведено на кроликах, которые
являются адекватной тест–системой для изучения функциональной активности Pgp
(Колхир С. В. Клиническое значение изучения активности транспортера лекарственных
средств гликопротеина–Р для оптимизации фармакотерапии: – автореф. дис. канд. мед.
наук: 14.00.25. М., 2007. 21 с.). Работа выполнена на 65 половозрелых кроликах–самках
породы Шиншилла, массой 4500 – 5100 г, находящихся в состоянии полиэструса. Фазу
эстрального цикла контролировали по внешним признакам (покраснение половой петли,
8
набухание половых губ и раскрытие вульвы) и уровню прогестерона в плазме крови (не
выше 3,5 нг/мл) (Fowler R.E. et al., Journal of Reproduction and Fertility. 1977. 50. 2. P. 301–
308). Животные имели необходимые ветеринарные свидетельства и прошли необходимый
карантинный режим. Весь период исследования кролики содержались в стандартных
условиях вивария ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России при искусственном освещении
с 10 часовым световым днем, в индивидуальных клетках, при свободном доступе к воде и
пище. Рацион питания животных соответствовал ГОСТ Р 50258–92. Работу с
экспериментальными
животными
осуществляли
в
соответствии
с
Приказом
Минздравсоцразвития РФ №708н от 23.08.2010 «Об утверждении правил лабораторной
практики». Эксперимент выполнялся в весенне–летний период с апреля по август.
Дизайн исследования. В соответствии с целью и задачами исследования схема
эксперимента предусматривала формирование четырех серий животных. Дизайн
исследования предполагал, что при определении функциональной активности Pgp и
уровня половых гормонов, интактные животные каждой серии являлись собственным
контролем, т.к. ранее установлено, что экспериментальные манипуляции не влияют на
функциональную активность Pgp (Якушева Е.Н. с соавт., Российский медико–
биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2014. 2. С. 76–79.), а значимого
изменения уровня половых гормонов в серии контроля на 14 и 21 сутки эксперимента не
выявлено (Щулькин А.В. с соавт., Вестник Уральской медицинской академической науки.
2017. 14. 4. С. 427–434). Для оценки относительного количества белка–транспортера на
мембранах клеток в норме и на фоне введения изучаемых гормональных контрацептивов
была предусмотрена серия контроля – интактные кролики (контроль, n=5), которым в
течение 21 дня вводили воду очищенную в количестве 5 мл. С целью приближения
полученных результатов к реальной клинической практике овариоэктомия перед началом
эксперимента не проводилась. Установлено, что хирургическая кастрация оказывает
влияние на функциональную активность Pgp (Щулькин А.В. с соавт., Вестник Уральской
медицинской академической науки. 2017. 14. 4. С. 427–434).
В сериях 1, 2, 3 и 4 осуществлялась оценка влияния гормональных контрацептивов
(таблица 1) на функциональную активность и относительное количество Pgp на
мембранах гепатоцитов, энтероцитов, эпителиоцитов проксимальных канальцев почек и
эндотелиоцитов ГЭБ.
Животные 1, 2, 3, и 4 серии были разделены на две группы. В 1–ой группе (n=10) 1,
2 и 3 серии изучались функциональная активность Pgp на уровне целостного организма и
динамика уровня половых гормонов (эстрадиола, тестостерона, прогестерона) после 14– и
21–дневного введения соответствующей комбинации гормональных веществ в виде
свежеприготовленной суспензии на воде очищенной.
9
Таблица 1.
Дозирование изучаемых гормональных препаратов
№
Изучаемые гормональные
Препарат
Производитель
серии
вещества
1
Этинилэстрадиол (6,5 мкг/кг) таблетки
«Gedeon Richter», Венгрия
и гестоден (16,5 мкг/кг)
«Линдинет 30»
2
Этинилэстрадиол (6,5 мкг/кг) драже «Жанин»
«Bayer Schering Pharma
и диеногест (450 мкг/кг)
производитель:
AG», Германия
3
Этинилэстрадиол (6,5 мкг/кг) таблетки «Ярина»
«Bayer Schering Pharma
и дроспиренон (650 мкг/кг)
производитель:
AG», Германия
4
Линестренол (110 мкг/кг)
таблетки «Экслютон» «Organon», Нидерланды
В 1–ой группе (n=10) 4 серии изучались функциональная активность Pgp на уровне
целостного организма и динамика уровня половых гормонов (эстрадиола, тестостерона,
прогестерона) после 14–, 21– и 28– дневного введения линестренола в виде
свежеприготовленной суспензии на воде очищенной. Во 2–ой группе (n=5) каждой серии
изучалось относительное количество Pgp на мембранах клеток и уровень половых
гормонов после 21–дневного (1, 2 и 3 серия) и 28–дневного (4 серия) введения изучаемого
орального гормонального контрацептива в виде свежеприготовленной суспензии на воде
очищенной.
Анализ функциональной активности гликопротеина–Р. Функциональную
активность Pgp оценивали in vivo по анализу динамики плазменной концентрации
фексофенадина – рекомендованного EMEA и FDA маркерного субстрата Pgp (Guideline on
the investigation of bioequivalence. European Medicines Agency. London. 2012. 60 р.).
Фексофенадин (таблетки «Телфаст» 180 мг, производитель: «Aventis Pharma», Италия)
вводили однократно, внутрижелудочно, используя зонд. Доза фексофенадина составляла
67,5 мг/кг массы тела кролика, в форме свежеприготовленной суспензии на воде
очищенной до, после 14–дневного, 21–дневного (в 1, 2, и 3 серии) и 28–дневного (в 4
серии) введения изучаемых гормональных контрацептивов.
Пробы крови отбирали в объеме 3–5 мл из краевой вены уха кролика в
гепаринизированные пробирки через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12 и 24 часа после однократного
внутрижелудочного введения фексофенадина, центрифугировали 10 минут при 3000
об/мин, плазму хранили при – 29°C до анализа (Колхир С. В. Клиническое значение
изучения активности транспортера лекарственных
средств гликопротеина–Р для
оптимизации фармакотерапии: – автореф. дис. канд. мед. наук: 14.00.25. М., 2007. 21 с.).
Содержание фексофенадина в плазме крови определяли методом ВЭЖХ на
высокоэффективном
жидкостном
хроматографе
«Стайер»
(Россия)
с
УФ–
спектрофотометрическим детектором UVV104 и обращено–фазовой колонкой Ultrasphere
фирмы «Вескman Coulter» 4,6*250 мм (зернение 5 мкм). Анализ выполняли при длине
волны 220 нм и скорости подвижной фазы 1 мл/мин.
10
Методом жидкостной экстракции проводили извлечение фексофенадина из плазмы
крови в органическую фазу экстрагента. Для этого к плазме (2 мл) добавляли 2 н кислоту
хлористоводородную в количестве 375 мкл. Проводили встряхивание проб на приборе
«Vortex», затем добавляли по 2 мл диэтилового эфира (Химмед), этилацетата (Acros
organics) и дихлорметана (Acros organics). Пробы встряхивали в течение 10 минут на
встряхивателе пробирок «Shaker S 3.01» (Elmi), после чего центрифугировали на
центрифуге «Elmi CM 6M» (Elmi) (3000 об/мин, 10 мин, 20°C). Органический слой
отбирали и помещали в колбу и выпаривали на роторно–вакуумном испарителе «VV –
Micro» (Heidolph). Полученный сухой остаток растворяли в подвижной фазе (300 мкл).
Аликвоту (100 мкл) полученного раствора анализировали методом ВЭЖХ. Коэффициент
экстракции маркерного субстрата Pgp из плазмы крови животных составил 59%.
Элюирование выполняли подвижной фазой следующего состава (на 200 мл): 133,7
мл воды деионизованной, 64 мл ацетонитрила («Химмед»), 2,33 мл ледяной уксусной
кислоты («Химмед») и 0,936 мл триэтиламина («Acros organics»), триэтиламина до
pH=4,3. Скорость потока подвижной фазы 1 мл/мин. Время удерживания фексофенадина в
данных условиях составило 12,31±0,01 мин. Определение концентрации фексофенадина в
плазме крови выполняли методом абсолютной калибровки по высоте пиков.
Используя модельно–независимый метод, при помощи программы «Kinetica 5.0»,
рассчитывали фармакокинетические параметры фексофенадина: С max – максимальная
концентрация (нг/мл); Тmax – время достижения максимальной концентрации (ч); AUC0–24
– площадь под кривой «концентрация – время» от нуля до последнего забора крови
(нг/мл)×ч; AUC0–∞ – площадь под кривой «концентрация – время» от нуля до
бесконечности (нг/мл)×ч; T½ – период полувыведения (ч); MRT – среднее время
удерживания препарата в системном кровотоке (ч); Kel – константа элиминации.
Определение относительного количества гликопротеина–Р на мембранах
клеток. Для определения относительного количества Pgp на мембранах клеток
использовали
непрямой
иммуногистохимический
метод.
Кроликов
выводили
из
эксперимента методом воздушной эмболии. Производили забор образцов внутренних
органов лабораторных животных (печень, почки, тонкий кишечник и кора больших
полушарий головного мозга). Образцы фиксировали в 10%–ном растворе нейтрального
формалина. Подготовку гистологического материала проводили стандартным методом:
обезвоживание в растворах этилового спирта возрастающей концентрации, просветление
ксилолом, заключение в парафин. Перед реакцией иммунного окрашивания производили
демаскировку антигенов тканей нагреванием на водяной бане в 10 мМ цитратном буфере
(рН 6,0). Блокировали эндогенную пероксидазу 3%–ным раствором пероксида водорода.
Затем срезы инкубировали с первичными антителами к Pgp (Mdr–1 3H2833: sc–71557
11
«Santa cruz biotechnology, Inc», США) в разведении 1:50 по стандартной методике. Для
иммунного окрашивания применяли полимерную систему детекции с пероксидазной
меткой («Dako», Дания). Ядра клеток докрашивали гематоксилином.
Микропрепарат фотографировали при увеличении в 400 раз цифровой камерой
Canon
Power
Shot
G5.
В
каждом
гистологическом
препарате
оценивали
10
репрезентативных участков (10 фотографий). В дальнейшем анализировали изображения с
использованием программы ImageJ (США), которая позволяет провести количественный
иммуногистохимический анализ (Varghese F., et al. PloS one. 2014. 9. 5. P. e96801). При
помощи модуля Histogram определяли интенсивность окраски мембран в тонком
кишечнике, печени, почках и ГЭБ (у.е. и «+»). С помощью модуля Analyze Particles в
печени и мозге определяли относительную площадь Pgp–позитивных мембран (Mezei T.,
et al., Acta Medica Marisiensis. 2011. 57. 6. – P. 679–684).
Биохимические методы исследования. Определение содержания половых
гормонов
(прогестерон,
эстрадиол,
тестостерон)
проводили
в сыворотке
крови
радиоиммунным методом (тест–системы «Immunotech», Чехия). Уровень прогестерона
выражали в нг/мл, эстрадиола – в пг/мл, тестостерона – в нмоль/л.
Забор крови осуществлялся из краевой вены уха кролика в объеме 5–6 мл перед
каждым этапом эксперимента в 8:00. Подготовка образцов сыворотки включала
следующие этапы: центрифугирование на холоде, помещение аликвоты в пластмассовую
пробирку типа эппендорф, замораживание и хранение в холодильнике (–290С) до момента
анализа (Колхир С. В. Клиническое значение изучения активности транспортера
лекарственных средств гликопротеина–Р для оптимизации фармакотерапии: – автореф.
дис. канд. мед. наук: 14.00.25. М., 2007. 21 с.).
Математико–статистическая обработка результатов. Полученные данные были
подвергнуты математико–статистической обработке с помощью программ «Microsoft
Office XP», «StatSoft Statistica 7.0» и «IBM SPSS Statistics 20». В таблицах раздела
«Результаты» представлены: среднее арифметическое значение (Mean), стандартное
отклонение (SD), а также медиана (Median), верхний и нижний квартили (lq; uq).
Для
расчетов
статистической
значимости
изменений
использовали:
корреляционный анализ с использованием коэффициента Пирсона и коэффициента
Спирмена, дисперсионный анализа (ANOVA) повторных измерений, критерий Фридмана,
параметрический и непараметрический варианты критерия Ньюмена–Кейлса, критерий
Стьюдента, критерий Манна–Уитни, критерий Шапиро–Уилка. Достоверными считали
результаты при p<0,05.
12
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Влияние курсового назначения комбинации этинилэстрадиола и гестодена на
функциональную активность, относительное количество гликопротеина–Р на
мембранах клеток и гормональный статус кроликов.
Введение кроликам комбинации этинилэстрадиола в дозе 6,5 мкг/кг и гестодена в
дозе
16,5
мкг/кг
в
течение
14
дней
достоверно
не
влияло
на
изучаемые
фармакокинетические параметры фексофенадина, а введение кроликам изучаемой
комбинации
курсом
21
день
сопровождалось
значимым
изменением
ряда
фармакокинетических показателей фексофенадина (↑Сmax, ↑AUC0–24, ↑AUC0–∞,) по
сравнению с данными интактных животных, что характеризует снижение эффлюксной
функции транспортера Pgp (таблица 2).
Таблица 2.
Фармакокинетические параметры фексофенадина (67,5 мг/кг) у кроликов при введении
комбинации этинилэстрадиола (6,5 мкг/кг) и гестодена (16,5 мкг/кг) курсом 14 и 21 день
(Mean±SD или Media (lq; uq))
Изучаемые
параметры
Исходные значения
n=10
Этинилэстрадиол (6,5
мкг/кг) и гестоден (16,5
мкг/кг)14 дней, n=10
Сmax, нг/мл
300,2±166,8
351,6±206,9
Тmax, ч
T½, ч
AUC0–24,
(нг/ч)×мл
AUC0–∞ ,
(нг/ч)×мл
MRT, ч
MRT24, ч
4,0 (4,0; 4,0)
8,7 (7,2; 10,9)
4,0 (4,0; 4,0)
9,4 (8,6; 13,8)
2655,2±1367,3
3798,5±2619,1
3398,2 (2250,7;4327,9)
4097,1 (1723,9; 8299,5)
14,2 (13,3; 18,2)
10,3±1,4
16,1 (9,4; 22,7)
10,2±1,8
Этинилэстрадиол (6,5
мкг/кг) и гестоден (16,5
мкг/кг)21 день, n=10
480,4±157,5*,**
↑60%*,↑36,6%**
4,0 (4,0; 4,0)
13,9 (8,1; 16,7)
5440,2±2132,5*,**
↑104,5%*,↑43,2%**
8774,3 (7404,7; 9062,1)*
↑158,2%
20,2 (13,6; 24,1)
10,8±1,5
Примечание: Здесь и далее в таблицах № 3–9.
– Mean±SD – при нормальном распределении данных;
– Media (lq; uq) – при распределении данных, отличном от нормального.
– * – достоверные различия по сравнению с показателями интактных животных (р˂0,05).
– ** – достоверные различия со значениями на 14 день введения препарата (р˂0,05).
Динамика сывороточных концентраций половых гормонов у интактных кроликов и
на фоне применения комбинации этинилэстрадиола в дозе 6,5 мкг/кг и гестодена в дозе
16,5 мкг/кг представлены в таблице 3.
Результаты
исследования
на
14
день
введения
изучаемой
комбинации
свидетельствуют о достоверном снижении концентрации эстрадиола, прогестерона и
тестостерона. На 21 день эксперимента уровень эстрадиола и тестостерона оставался
достоверно сниженным по сравнению с исходными значениями, уровень прогестерона
существенно не изменился.
13
Таблица 3.
Гормональный статус кроликов при введении комбинации этинилэстрадиола (6,5 мкг/кг) и
гестодена (16,5 мкг/кг) курсом 14 и 21 день (Mean±SD)
Изучаемые
Исходные
Этинилэстрадиол и
Этинилэстрадиол и
параметры
значения, n=10 гестоден, 14 дней, n=10 гестоден, 21 день, n=10
Эстрадиол, пг/мл
416,3±127,5
309,9±133,4* ↓25,6%
290,8±122,2* ↓30,1%
Прогестерон, нг/мл
1,83±0,796
1,35±0,60* ↓26,2%
1,73±0,73
Тестостерон, нмоль/л
0,295±0,188
0,142±0,087* ↓51,9%
0,168±0,094* ↓43,1%
После введения кроликам этинилэстрадиола и гестодена отмечалось снижение
относительного количества Pgp на мембранах гепатоцитов, энтероцитов и эндотелиоцитов
ГЭБ (рисунки 2 и 3). При изучении корреляции между фармакокинетическими
параметрами фексофенадина, относительным количеством Pgp на мембранах клеток и
гормональным статусом кроликов были получены зависимости, представленные на
рисунке 1.
Рисунок 1. Зависимость изучаемых
фармакокинетических параметров
фексофенадина и относительного количества
Pgp на мембранах клеток от гормонального
статуса кроликов при введении комбинации
этинилэстрадиола (6,5 мкг/кг) и гестодена
(16,5 мкг/кг) курсом 21 день (коэффициент
корреляции Спирмена – Rs).
Примечание (здесь и далее на рисунках
№ 4 – 8): Непрерывной линией показана прямо
пропорциональная связь, пунктирной линией –
обратно пропорциональная связь.
Рисунок 2. Интенсивность окраски Pgp – позитивных мембран, в у.е.
14
Рисунок 3. Относительная площадь Pgp – позитивных мембран, в %
2. Влияние курсового назначения комбинации этинилэстрадиола и диеногеста на
функциональную активность, относительное количество гликопротеина–Р на
мембранах клеток и гормональный статус кроликов
Введение кроликам комбинации этинилэстрадиола в дозе 6,5 мкг/кг и диеногеста в
дозе
450
мкг/кг
сопровождалось
достоверным
изменением
ряда
изучаемых
фармакокинетических показателей фексофенадина, как на 14, так и на 21 день
исследования (таблица 4).
Таблица 4.
Фармакокинетические параметры фексофенадина (67,5 мг/кг) у кроликов при
введении комбинации этинилэстрадиола (6,5 мкг/кг) и диеногеста (450 мкг/кг)
курсом 14 и 21 день (Mean±SD или Media (lq; uq))
Изучаемые
Этинилэстрадиол (6,5
Этинилэстрадиол (6,5
фармакокине
Исходные значения
мкг/кг) и диеногест
мкг/кг) и диеногест
тические
n=10
(450 мкг/кг)
(450 мкг/кг)
параметры
14 дней, n=10
21 день, n=10
248,31(155,4; 512,4)
901,3 ↑263%
805,83 ↑224,5%
Сmax, нг/мл
(459,1; 1143,53)*
(601,81;1343,79)*
Тmax, ч
4(3;5)
4(3;4)
4(4;4)
9,45(4,04; 15,78)
13,04(10,32;17,04)
23,90(18,72; 41,18)*,**
Т1/2, ч
↑152,9%*,↑83,2%**
AUC0–24,
1524,50
10632,01 ↑597,4%
9166,87 ↑501,3%
нг*ч/мл
(930,41; 3519,59)
(5715,71;12335,50)*
(6775,80; 16354,20)*
AUC0–∞,
2353,15
17713,10* ↑652,7%
23593,26* ↑902,6%
нг*ч/мл
(933,73; 5049,7)
(9330,24; 21470,5)
(18051,90;33272,50)
МRT24, ч
8,47±0,965
10,55±0,292* ↑24,6%
11,02±0,176* ↑30,1%
16,05(7,17; 22,16)
20,90(16,31; 26,47)
36,16(26,49; 57,84)*,**
МRT, ч
↑125,3%*,↑73%**
0,09(0,06; 0,3)
0,05(0,04; 0,07)
0,03(0,02; 0,04)*,**
Kel, 1/ч
↓66,7%*,↓40%**
15
Применение комбинации этинилэстрадиола и диеногеста в течение 14 дней
приводило к значимому увеличению Сmax, AUC0–24, AUC0–∞, МRT24, по сравнению с
исходными показателями. Введение комбинации гормонов в течение 21 дня вызывало
значимое увеличение Сmax, Т1/2, AUC0–24, AUC0–∞, МRT24, МRT и уменьшение Kel, в
сравнении с данными интактных животных. Увеличение концентрации фексофенадина в
крови и снижение его выведения свидетельствуют об ингибировании функциональной
активности Pgp.
На фоне введения комбинации этинилэстрадиола и диеногеста изучалась динамика
уровня половых гормонов кроликов: эстрадиола, прогестерона и тестостерона (данные
представлены в таблице 5).
Таблица 5.
Гормональный статус кроликов при введении комбинации этинилэстрадиола (6,5
мкг/кг) и диеногеста (450 мкг/кг) курсом 14 и 21 день (Mean±SD или Media (lq; uq))
Этинилэстрадиол и
Этинилэстрадиол и
Изучаемые
Исходные значения,
диеногест
диеногест
параметры
n=10
14 дней, n=10
21 день, n=10
374,33
272,06
245,29
Эстрадиол пг/мл
(322,84;407,07)
(248,23; 327,99)
(223,4; 357,17)
2,685±0,179
2,276±0,185
1,682±0,134*,**
Прогестерон нг/мл
↓37,4%*,↓26,1%**
Тестостерон нмоль/л
0,175 (0,1; 0,21)
0,21 (0,14; 0,24)
0,17 (0,14; 0,21)
Гормональный статус кроликов изменился незначительно. Выявлено лишь
достоверное снижение концентрации прогестерона на 21 день введения изучаемой
комбинации. После введения кроликам этинилэстрадиола и диеногеста отмечалось
снижение относительного количества Pgp на мембранах гепатоцитов и энтероцитов
(рисунки 2 и 3).
При
оценке
корреляции
между
фармакокинетическими
параметрами
фексофенадина, относительным количеством Pgp в изучаемых тканях и гормональным
статусом кроликов были получены зависимости, представленные на рисунке 4.
Рисунок 4.
Зависимость изучаемых
фармакокинетических параметров
фексофенадина и относительного
количества Pgp на мембранах клеток от
гормонального статуса кроликов при
введении комбинации этинилэстрадиола
(6,5 мкг/кг) и диеногеста (450 мкг/кг)
(коэффициент корреляции
Спирмена – Rs).
16
3.
Влияние курсового назначения комбинации этинилэстрадиола и
дроспиренона на функциональную активность, относительное количество
гликопротеина–Р на мембранах клеток и гормональный статус кроликов
Введение кроликам комбинации этинилэстрадиола в дозе 6,5 мкг/кг и
дроспиренона в дозе 650 мкг/кг сопровождалось достоверным изменением ряда
изучаемых фармакокинетических показателей фексофенадина, как на 14, так и на 21 день
исследования (таблица 6).
Применение комбинации этинилэстрадиола и дроспиренона в течение 14 и 21 дня
приводило к значимому изменению фармакокинетических параметров фексофенадина –
↑Сmax, ↑AUC0–24, ↑AUC0–∞, ↑Т1/2, ↑МRT24, ↑МRT, ↓Kel, по сравнению с исходными
показателями.
Таблица 6.
Фармакокинетические параметры фексофенадина у кроликов при введении
комбинации этинилэстрадиола (6,5 мкг/кг) и дроспиренона (650 мкг/кг)
курсом 14 и 21 день (Mean±SD или Media (lq;uq))
Изучаемые
параметры
Исходные значения
n=10
Этинилэстрадиол (6,5
мкг/кг) и
дроспиренон (650
мкг/кг) 14 дней, n=10
Этинилэстрадиол (6,5
мкг/кг) и
дроспиренон (650
мкг/кг), 21день, n=10
708,55* ↑70,9%
711,66*↑ 71,7%
(529,01;1133,42)
(660,88;775,91)
Тmax, ч
4 (3; 4)
4 (4; 4)
14,21 (12,33; 17,76)*
13,07 (11,46; 14,86)*
Т1/2, ч
↑204,3%
↑179,9%
2470,17±375,22
9132,73±1332,25*
10532,06±1556,02*
AUC0–24, нг*ч/мл
↑269,7%
↑326,4%
3248,12
11199,4* ↑244,8%
13763,7* ↑323,7%
AUC0–∞, нг*ч/мл
(1595,31; 3520,56)
(8956,55; 19594,5)
(10042,7; 17671,7)
8,22 (6,95; 9,45)
10,66 (10,05; 11,21) * 10,44 (10,34; 11,18) *
МRT24, ч
↑29,7%
↑27%
10,53 (6,98; 12,78)
21,52 (19,04; 25,81) * 20,87 (18,17; 22,61) *
МRT, ч
↑104,4%
↑98,2%
Kel, 1/ч
0,13±0,025
0,05±0,008* ↓61,5%
0,05±0,007* ↓61,5%
На фоне введения комбинации этинилэстрадиола (6,5 мкг/кг) и дроспиренона (650
Сmax, нг/мл
мкг/кг)
изучалась
414,50
(224,60;454,66)
4 (3; 5)
4,67 (4,23; 9,02)
динамика
уровня
половых
гормонов
кроликов:
эстрадиола,
прогестерона и тестостерона (данные представлены в таблице 7). Уровень эстрадиола
снизился на 14 и на 21 день введения изучаемой комбинации. Уровень прогестерона и
тестостерона достоверно снизился лишь на 21 день эксперимента. После введения
кроликам этинилэстрадиола и дроспиренона отмечалось снижение относительного
количества Pgp на мембранах гепатоцитов и энтероцитов (рисунки 2 и 3).
17
Таблица 7.
Гормональный статус кроликов при введении комбинации этинилэстрадиола
(6,5 мкг/кг) и дроспиренона (650 мкг/кг) курсом 14 и 21 день
(Mean±SD или Media (lq; uq))
Этинилэстрадиол и
Этинилэстрадиол и
Изучаемые
Исходные значения
дроспиренон,
дроспиренон,
параметры
n=10
14 дней, n=10
21день, n=10
502,95(333,45;717,56) 214,30(177,51;407,47)* 214,13(175,21;360,06)*
Эстрадиол, пг/мл
↓57,4%
↓57,4%
Прогестерон, нг/мл
1,75 (1,53;3,19)
1,26 (0,84;1,62)
1,04 (0,75;1,54)*↓40,6%
Тестостерон,нмоль/л
0,339±0,038
0,267±0,038
0,219±0,030*↓35,4%
При изучении корреляции между фармакокинетическими параметрами
фексофенадина, относительным количеством Pgp на мембранах клеток и гормональным
статусом кроликов были получены зависимости, представленные на рисунках 5 и 6.
Рисунок 5.
Рисунок 6.
Зависимость изучаемых
Зависимость относительного количества
фармакокинетических параметров
Pgp на мембранах клеток от гормонального
фексофенадина от гормонального статуса
статуса кроликов при введении
кроликов при введении комбинации
комбинации этинилэстрадиола (6,5 мкг/кг)
этинилэстрадиола (6,5 мкг/кг) и
и дроспиренона (650 мкг/кг).
дроспиренона (650 мкг/кг).
4.
Влияние курсового назначения линестренола на функциональную
активность, относительное количество гликопротеина–Р на мембранах клеток и
гормональный статус кроликов
Введение кроликам линестренола в дозе 110 мкг/кг в течение 28 дней
сопровождалось
достоверным
изменением
ряда
изучаемых
фармакокинетических
показателей фексофенадина на 14, 21 и 28 день исследования (таблица 8).
На 14 день введения линестренола произошло значимое увеличение С max, AUC0–24,
AUC0–∞, Т1/2, МRT24, МRT, снижение Kel, фексофенадина по сравнению с исходными
показателями. На 21 день исследования наблюдалось значимое увеличение С max, AUC0–∞,
МRT и уменьшение Kel фексофенадина по сравнению с данными интактных животных.
Введение линестренола курсом 28 дней вызывало значимое повышение С max, AUC0–∞, Т1/2,
МRT24, МRT, снижение Kel по сравнению с исходными данными.
18
Таблица 8.
Фармакокинетические параметры фексофенадина (67,5 мг/кг) у кроликов при
введении линестренола (110 мкг/кг) курсом 14, 21 и 28 дней (Mean±SD или Media (lq; uq))
Исходные
Линестренол
Линестренол
Линестренол
Изучаемые
значения
(110
мкг/кг)
(110
мкг/кг)
(110 мкг/кг)
параметры
n=10
14 дней, n=10
21 день, n=10
28 день, n=10
746,89±163,81*
891,12±142,48*
962,81±114,04*
Сmax, нг/мл
292,40±29,95
↑155,4%
↑204,8%
↑229,3%
Тmax, ч
4,0±0,15
3,9±0,1
3,8±0,13
3,7±0,26
14,65(9,22; 21,42)* 10,31(5,96; 16,22) 14,21(8,06; 23,03)*
Т1/2, ч
4,29(2,50; 8,55)
↑241,5%
↑231,2%
AUC0–24,
6618,68±898,45*
7380,95±1147,13
10014,86±866,7
2362,75±414,53
нг*ч/мл
↑180,1%
AUC0–∞,
2177,09
10177,50* ↑367,5% 10080,41* ↑363,0% 15476,25* ↑610,9%
(1378,56;3456,15)
нг*ч/мл
(7080,77;13611,02)
(4209,44;15756,40) (11012,71;19846,4)
МRT24, ч
8,95±0,59
10,62±0,41*↑18,7%
9,35±0,54
10,46±0,48*↑16,9%
22,77(14,54;31,11)* 17,52(9,96;24,28)* 23,21(19,18;31,51)*
МRT, ч
9,60(8,11;15,51)
↑137,2%
↑82,5%
↑141,8%
0,051±0,008*
0,080±0,015*
0,055±0,01*
Kel, 1/ч
0,175±0,031
↓70,9%
↓54,3%
↓68,9%
На фоне введения линестренола (110 мкг/кг) изучалась динамика сывороточных
концентраций половых гормонов кроликов: эстрадиола, прогестерона и тестостерона.
Наблюдалось достоверное снижение концентрации прогестерона на 21 и 28 день введения
препарата, снижении концентрации эстрадиола и тестостерона произошло лишь на 28
день эксперимента (таблица 9).
Таблица 9.
Гормональный статус кроликов при введении линестренола (110 мкг/кг) курсом 14,
21 и 28 дней (Mean±SD или Media (lq; uq))
Линестренол
Линестренол
Линестренол
Исходные
Изучаемые
(110 мкг/кг)
(110 мкг/кг)
(110 мкг/кг)
значения
параметры
14 дней
21 день
28 день
n=10
n=10
n=10
n=10
190,68
181,37
174,11
126,84*↓33,5%
Эстрадиол, пг/мл
(146,07;432,01) (109,05;223,92) (141,53;237,66) (104,38;275,69)
0,44(0,25;0,73)* 0,56(0,27;1,48)*
Прогестерон, нг/мл
1,08 (0,77;2,52) 0,8 (0,67;1,24)
↓59,3%
↓48,2%
0,840±0,116
0,648±0,139
0,677±0,140
0,443±0,076*
Тестостерон, нмоль/л
↓47,3%
После введения кроликам линестренола (110 мкг/кг) установлено достоверное
снижение относительного количества Pgp на мембранах гепатоцитов и эндотелия
капилляров головного мозга (рисунки 2 и 3).
При
изучении
корреляции
между
фармакокинетическими
параметрами
фексофенадина, относительным количеством Pgp на мембранах клеток и гормональным
статусом кроликов был получен ряд зависимостей (рисунки 7 и 8).
19
Рисунок 7.
Рисунок 8.
Зависимость изучаемых фармакокинети– Зависимость относительного количества Pgp на
ческих параметров фексофенадина от мембранах клеток от гормонального статуса
гормонального
статуса
кроликов
при кроликов при введении линестренола (110 мкг/кг)
введении
линестренола
(110
мкг/кг) (коэффициент корреляции Спирмена – Rs).
(коэффициент корреляции Спирмена – Rs).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Итоги
исследовании
выполненного
изучено
диссертационного
влияние
21–дневного
исследования.
курсового
В
назначения
проведенном
комбинации
этинилэстрадиола и гестодена, этинилэстрадиола и диеногеста, этинилэстрадиола и
дроспиренона, и 28–дневного курсового назначения линестренола на функциональную
активность и относительное количество Pgp на мембранах клеток.
Внутрижелудочное введение интактным кроликам комбинации этинилэстрадиола
(6,5 мкг/кг) и гестодена (16,5 мкг/кг) в течение 14 дней не влияет на функциональную
активность Pgp, тогда как введение изучаемой комбинации курсом 21 день, вызывает
ингибирование функциональной активности Pgp на уровне целостного организма, о чем
свидетельствует значимое изменение параметров фармакокинетики фексофенадина
(↑Сmax, ↑AUC0–24, ↑AUC0–∞), а также уменьшение относительного количества белка–
транспортера
на
мембранах
гепатоцитов,
энтероцитов
и
эндотелиоцитов
ГЭБ.
Установлены корреляционные связи средней и высокой силы между функциональной
активностью, относительным количеством Pgp на мембранах клеток и уровнем эстрадиола
в сыворотке крови кроликов.
Внутрижелудочное введение интактным кроликам комбинации этинилэстрадиола
(6,5 мкг/кг) и диеногеста (450 мкг/кг) в течение 14 и 21 дня вызывает ингибирование
функциональной активности Pgp на уровне целостного организма, о чем свидетельствует
значимое изменение основных параметров фармакокинетики фексофенадина (↑Сmax,
↑AUC0–24, ↑AUC0–∞) и снижение относительного количества изучаемого белка–
20
транспортера на мембранах гепатоцитов и энтероцитов. Установлены корреляционные
связи средней силы между функциональной активностью, относительным количеством
Pgp на мембранах клеток и уровнем прогестерона в сыворотке крови кроликов.
Внутрижелудочное введение интактным кроликам комбинации этинилэстрадиола
(6,5 мкг/кг) и дроспиренона (650 мкг/кг) в течение 14 и 21 дня приводило к значимому
изменению фармакокинетических параметров маркерного субстрата Pgp – фексофенадина
(↑Сmax, ↑AUC0–24, ↑AUC0–∞), что свидетельствует об ингибировании функциональной
активности Pgp. На фоне исследуемой комбинации произошло снижение относительного
количества белка–транспортера на мембранах гепатоцитов и энтероцитов. Установлены
корреляционные связи средней и высокой силы между функциональной активностью,
относительным количеством Pgp на мембранах клеток и уровнем эстрадиола и
прогестерона.
При курсовом введении (14, 21 и 28 дней) линестренола (110 мкг/кг) выявлено
снижение функциональной активности Pgp, установленное по значимому изменению ряда
основных фармакокинетических параметров фексофенадина (↑Сmax, ↑AUC0–24, ↑AUC0–∞) и
снижение относительного количества Pgp на мембранах гепатоцитов и эндотелиоцитов
ГЭБ. Установлены
корреляционные связи
между функциональной
активностью,
относительным количеством Pgp на мембранах клеток и гормональным статусом
кроликов. Выявлены корреляционные связи высокой силы между уровнем прогестерона и
относительным количеством Pgp на мембранах гепатоцитов и эндотелиоцитов ГЭБ.
Практические
рекомендации.
На
основании
результатов
проведенных
исследований, рекомендуется:
1. При необходимости совместного приема оральных гормональных контрацептивов,
содержащих комбинации этинилэстрадиола с гестагенами: гестоденом, диеногестом и
дроспиреноном, с препаратами–субстратами гликопротеина–Р, рекомендуется снижение
дозировок препаратов с целью профилактики побочных эффектов, связанных с
увеличением их концентрации в крови.
2. При необходимости совместного приема оральных гормональных контрацептивов,
содержащих линестренол, с препаратами–субстратами Pgp, целесообразно снижение
дозировок препаратов с целью предотвращения побочных эффеков, связанных с
увеличением их концентрации в крови.
3. Линестренол при введении in vivo кроликам в суточной дозе 110 мкг/кг массы
курсом 14, 21 или 28 дней рекомендуется в качестве положительного контроля
пониженной функциональной активности Pgp при поиске веществ аналогичного действия,
а также для оценки потенциальных субстратов Pgp при изучении лекарственных веществ
на этапе доклинических исследований.
21
Перспективы
дальнейщей
разработки
темы.
Выглядят
перспективными
дальнейшие доклинические исследования других гормональных контрацептивов, их
компонентов, гормональных и антигормональных веществ на принадлежность к
модуляторам экспрессии гена MDR1 и функциональной активности Pgp.
Перспективным
является
подтверждение
результатов,
полученных
в
доклинических исследованиях в клинической практике на целевой группе пациенток и
анализ возможных межлекарственных взаимодействий, связанных с Pgp, на фоне
оральных гормональных контрацептивов. Также целесообразно изучение зависимости
эффектов и безопасности применения гормональных контрацептивов от генотипа
пациенток по гену MDR1, кодирующему гликопротеин–Р.
ВЫВОДЫ
1. Комбинация этинилэстрадиола (6,5 мкг/кг в/ж) и гестодена (16,5 мкг/кг в/ж) при
введении
интактным
функциональной
кроликам
активности
в
течение
21
гликопротеина–Р,
дня
что
вызывает
ингибирование
подтверждается
значимым
изменением основных фармакокинетических параметров маркерного субстрата белка–
транспортера – фексофенадина, а также приводит к уменьшению его относительного
количества
на
мембранах
гепатоцитов,
энтероцитов
и
эндотелиоцитов
гематоэнцефалического барьера.
2. Комбинация этинилэстрадиола (6,5 мкг/кг в/ж) и диеногеста (450 мкг/кг в/ж) при
введении
интактным
функциональной
кроликам
активности
в
течение
гликопротеина–Р,
21
дня
что
вызывает
ингибирование
подтверждается
значимым
изменением основных фармакокинетических параметров маркерного субстрата белка–
транспортера – фексофенадина, и уменьшением его относительного количества на
мембранах гепатоцитов и энтероцитов.
3. Комбинация этинилэстрадиола (6,5 мкг/кг в/ж) и дроспиренона (650 мкг/кг в/ж)
при введении интактным кроликам в течение 21 дня вызывает ингибирование
функциональной
активности
гликопротеина–Р,
что
подтверждается
значимым
изменением основных фармакокинетических параметров маркерного субстрата белка–
транспортера – фексофенадина, и уменьшением его относительного количества на
мембранах гепатоцитов и энтероцитов.
4. Линестренол (110 мкг/кг в/ж) при введении интактным кроликам в течение 28
дней приводит к ингибированию функциональной активности гликопротеина–Р, что
подтверждается
значимыми
изменениями
соответствующих
фармакокинетических
параметров маркерного субстрата белка–транспортера – фексофенадина и снижением его
относительного
количества
на
мембранах
гематоэнцефалического барьера.
22
гепатоцитов
и
эндотелиоцитов
5. Корреляционный анализ показал, что при использовании гормональных
контрацептивов снижение уровня эстрадиола в сыворотке крови сопровождается
изменением
основных
фармакокинетических
параметров
(Cmax,
AUC0–t,
AUC0–∞)
маркерного субстрата белка–транспортера – фексофенадина и относительного количества
гликопротеина–Р
прогестерона
на
в
мембранах
сыворотке
гепатоцитов
крови
и
энтероцитов;
способствует
снижение
изменению
ряда
уровня
основных
фармакокинетических параметров фексофенадина и относительного количества белка–
транспортера
на
мембранах
гепатоцитов,
энтероцитов
и
эндотелиоцитов
гематоэнцефалического барьера. Снижение уровня тестостерона в сыворотке крови не
имеет четкой корреляционной связи между фармакокинетическими параметрами
фексофенадина и относительным количеством гликопротеина–Р.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи:
1.
Якушева Е.Н. Влияние орального гормонального контрацептива «Жанин» на
функциональную активность гликопротеина–Р [Текст] / Е.Н. Якушева, А.А. Котлярова,
А.А. Никифоров // Российский медико–биологический вестник им. академика И.П.
Павлова. – 2013. – №4. – С. 65–70.
2.
Котлярова А.А. Изучение влияния комбинированного орального контрацептива
«Ярина» на функциональную активность гликопротеина–Р [Текст] / А.А. Котлярова, Е.Н.
Якушева // Российский медико–биологический вестник имени академика И.П.
Павлова. – 2014. – №2. – С. 70–75.
3.
Половые различия функциональной активности и экспрессии гликопротеина–Р у
кроликов [Текст] / Е.Н. Якушева, И.В. Черных, А.В. Щулькин, А.А. Котлярова, А.А.
Никифоров // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. – 2014. – Т.
100, №8. – C. 944–952.
4.
Влияние комбинированного орального контрацептива на активность и экспрессию
гликопротеина–Р [Текст] / Е.Н. Якушева, А.А. Котлярова, А.В. Щулькин, И.Ю.
Виноградов, Н.М. Попова // Фармация. – 2015. – №4. – С. 44.
5.
Влияние комбинации этинилэстрадиола и гестодена на функционалную активность
и экспрессию гликопротеина–Р [Текст] / Е.Н. Якушева, А.А. Котлярова, А.В. Щулькин,
И.Ю. Виноградов, Н.М. Попова // Экспериментальная и клиническая фармакология.–
2016. – Т. 79, № 6. – С. 15–19.
Патент:
1.
Патент 2553362 РФ, МПК G09B23/28. Способ моделирования состояния
ингибирования
функциональной
активности
23
гликопротеина–Р
линестренолом
в
эксперименте / А.А. Котлярова, Е.Н. Якушева; патентообладатель: ФГБОУ ВО РязГМУ
Минздрава России. – № 2014100531. – заявл. 09.01.2014; опубл. 18.05.2015.
Тезисы:
1.
Котлярова А.А. Изменение функциональной активности гликопротеина–Р на фоне
гормонального контрацептива [Текст] / А.А. Котлярова, С.А. Качамина, А.М. Шестакова //
Студенческая медицинская наука XXI века: материалы XIII Международной научно–
практической конференции. – Витебск, 2013. – С. 190–191.
2.
Котлярова А.А. Оценка изменения функциональной активности гликопротеина–Р
на фоне комбинированного контрацептива [Текст] / А.А. Котлярова, Е.Н. Якушева //
Экспериментальная и клиническая фармакология: научные чтения:
сб.
тезисов
Всероссийской научной конф., посвященной 90–летию со дня рождения профессора
А.А.Никулина. – Рязань, 2013. – С. 88–92.
3.
Котлярова А.А. Функциональная активность гликопротеина –Р на фоне введения
комбинированного орального контрацептива [Текст] / А.А. Котлярова // Материалы
межрегиональной научной конференции с Международным участием. – Рязань: РязГМУ
им. акад. И.П. Павлова, 2014. – С. 11–13.
4.
Влияние
комбинированного
орального
контрацептива
«Линдинет–30»
на
функциональную активность и экспрессию гликопротеина–Р [Текст] / А.А. Котлярова,
Е.Н. Якушева, А.В. Щулькин, Н.М. Попова, И.Ю.Виноградов // Сб. материалов ежегодной
научной конференции РязГМУ им. акад. И.П. Павлова, посвященной 65–летию работы
университета на Рязанской земле. – Рязань, 2015. – С. 237–240.
5.
Котлярова А.А. Изучение воздействия линестренола на функциональную
активность гликопротеина–Р [Текст] / А.А. Котлярова, Е.Н. Якушева, А.А. Никифоров //
Сб. материалов Всероссийской конф. молодых ученых с Международным участием,
посвященной 150–летию со дня рождения акад. Н.П. Кравкова. – Рязань: РязГМУ им.
акад. И.П. Павлова, 2015. – С. 159–163.
6.
Изменение функциональной активности и экспрессии гликопротеина–Р на фоне
орального контрацептива [Текст] / А.А. Котлярова, Е.Н. Якушева, А.В. Щулькин,
И.Ю. Виноградов, Н.М. Попова // Инновационные технологии в медицине: взгляд
молодого специалиста: материалы III Всероссийской научной конференции молодых
специалистов, аспирантов, ординаторов. – Рязань, 2017. – С. 162–164.
7.
Котлярова А.А. Функциональная активность и экспрессия гликопротеина–Р на
фоне комбинации этинилэстрадиола и гестодена [Текст] / А.А. Котлярова, А.В. Щулькин,
Н.М. Попова // VII Международный молодежный медицинский конгресс «Санкт–
Петербургские научные чтения–2017». – СПб., 2017. – С. 408–409.
24
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
3
Размер файла
753 Кб
Теги
функциональная, влияние, эксперимент, гликопротеина, активности, контрацептивы, оральные, гормональный
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа