close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Эффективность ЭКО у больных с нормогонадотропной овуляцией в зависимости от активности овариальной ароматазы

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
ЯКОВЛЕВ
Павел Павлович
ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЭКО У БОЛЬНЫХ С НОРМОГОНАДОТРОПНОЙ
АНОВУЛЯЦИЕЙ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ АКТИВНОСТИ ОВАРИАЛЬНОЙ
АРОМАТАЗЫ
14.01.01 – акушерство и гинекология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Санкт-Петербург – 2018
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении
"Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии
имени Д.О. Отта"
Научные руководители:
з.д.н. РФ, доктор медицинских наук,
профессор
Тарасова Марина Анатольевна
доктор медицинских наук
Гзгзян Александр Мкртичевич
Официальные оппоненты:
член-корреспондент РАН,
доктор медицинских наук, профессор,
ГБУЗ МО «Московский областной
научно-исследовательский институт
акушерства и гинекологии»,
руководитель отделения
репродуктологии
Краснопольская Ксения
Владиславовна
доктор медицинских наук, ООО «АваПетер», заместитель главного врача по
акушерству, гинекологии и
репродуктивной медицине
Калугина Алла Станиславовна
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное военное
образовательное учреждение высшего образования "Военно-медицинская академия
им. С.М. Кирова" Министерства обороны Российской Федерации
Защита диссертации состоится "____"_____________2018 г. в ____ часов на
заседании диссертационного совета Д 001.021.01 при ФГБНУ "Научноисследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии
имени Д.О. Отта" (199034, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, дом 3).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБНУ "Научноисследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О.
Отта" и на сайте https://ott.ru/files/news/pg/2018_yakovlev/dissertatsiia_yakovleva.pdf
Автореферат разослан "____" __________2018 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
доктор медицинских наук
Кузьминых Татьяна Ульяновна
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Бесплодный брак является глобальной медико-социальной проблемой, которую
имеют не менее 10-15 % супружеских пар (Inhorn, M.C. et al., 2015). При этом в
четверти случаев нарушение овуляции является основным этиологическим фактором
(NICE guidance. 2013). Нормогонадотропная ановуляция, классифицируемая ВОЗ как
ановуляция группы II, является наиболее распространенной причиной эндокринного
бесплодия. Основной причиной нормогонадотропной недостаточности яичников в
большинстве случаев является синдром поликистозных яичников (СПЯ) (ESHRE
Capri Workshop Group. 2012). Ановуляция у пациенток данной группы может быть
обусловлена как центральными регуляторными нарушениями, так и овариальными
факторами, к которым относится изменение активности овариальной ароматазы
(Николаенков И.П. и соавт., 2014; Савина, В. А. и соавт., 2010; Савина В.А. 2012;
Ниаури Д. А. и соавт., 2010).
Фермент ароматаза Р450 является ключевым ферментом в образовании
эстрадиола (Э2) в гранулезных клетках антральных фолликулов. Он играет важную
роль в определении динамики фолликулогенеза и подготовки эндометрия к
имплантации эмбриона как в физиологических условиях, так и при контролируемой
овариальной
стимуляции
(КОС)
гонадотропинами.
Активность
овариальной
ароматазы является одним из определяющих факторов успешного созревания
ооцитов. По мнению ряда авторов, снижение активности ароматазы Р450,
наблюдаемое при некоторых гинекологических заболеваниях, может являться
важным фактором развития нормогонадотропной недостаточности яичников.
Дефицит ароматазы антральных фолликулов выявляется у 22,8% больных с
нормогонадотропной ановуляцией (Я.А Самойлович и соавт. 2015). Так, экспрессия
данного фермента клетками гранулезы лидирующих фолликулов у женщин с
наружным генитальным эндометриозом (НГЭ) и СПЯ достоверно ниже, чем данный
показатель у женщин с сохраненным овуляторным циклом. Авторы предполагают,
что снижение активности ароматазы Р450 у данных групп пациенток может
приводить к недостаточному синтезу Э2 для запуска положительной обратной связи
и имеет определяющее значение в патогенезе ановуляции (Савина В.А. 2012).
Однако, в литературе имеются исследования, результаты которых свидетельствуют о
4
повышении активности овариальной ароматазы при НГЭ (Денисова В.М. и соавт.
2013), и работы по результатам которых НГЭ не оказывает существенного влияния
на экспрессию гена CYP19A1 в клетках гранулезы пациенток в протоколах ЭКО (De
Abreu L.G. et al., 2011). Большинство литературных данных указывает на снижение
активности овариальной ароматазы у пациенток с СПЯ (Савина, В. А. и соавт., 2012;
Kirilovas D. et al., 2006; Chen J. et al., 2015; Yang F. et al., 2015). По другим данным, у
больных с СПЯ встречается как сниженная ароматазная активность, так и
нормальная
и
повышенная
активность
гранулезных
клеток,
что
отражает
патогенетическую неоднородность данного заболевания (Николаенков и соавт.
2013).
На данный момент разработаны различные методики, позволяющие оценивать
активность овариальной ароматазы как при помощи получения ткани яичника или
клеток гранулезы, так и косвенным путем. К одной из них относится определение
коэффициента активности ароматазы овариальных фолликулов по соотношению Э2
и антимюллерова гормона (АМГ), отражающего число антральных фолликулов, на
2-й день менструального цикла (Потин В.В. и соавт. Патент 2017).
Проведение протоколов ЭКО/ИКСИ является наиболее эффективным методом
преодоления бесплодия у пациенток с нормогонадотропной ановуляцией. В
последние годы увеличивается потребность в применении вспомогательных
репродуктивных технологий для преодоления разных форм бесплодия. Важнейшей
задачей
современной
репродуктивной
медицины
является
повышение
результативности ЭКО. В связи с этим представляет значительную актуальность
изучение факторов, влияющих на эффективность программ ВРТ.
В литературе имеются немногочисленные работы, посвящённые влиянию
активности овариальной ароматазы на протоколы ЭКО (ЭКО/ИКСИ). Большинство
исследователей оценивали влияние полиморфизма гена CYP19 на показатели
эффективности протоколов ЭКО (ЭКО/ИКСИ). При этом, в научной литературе
отсутствуют исследования о сравнении экспрессии ароматазы Р450 в яичниках и
полиморфизма
гена
CYP19.
Учитывая
полученные
сведения
о
влиянии
полиморфизма гена CYP19 на показатели контролируемой овариальной стимуляции
протоколов ЭКО/ИКСИ (Lazaros L. et al., 2012; Altmäe S. et al., 2009), возможную
5
роль
снижения
активности
нормогонадотропной
овариальной
ановуляции, можно
ароматазы
предположить,
в
что
у
патогенезе
больных
с
нормогонадотропной ановуляцией различная активность овариальной ароматазы
может влиять на эффективность протоколов ЭКО (ЭКО/ИКСИ).
Целью исследования является определение эффективности программ ЭКО
(ЭКО/ИКСИ) у больных с нормогонадотропной ановуляцией в зависимости от
уровня овариальной ароматазы.
Задачи исследования:
1. Определить
активность
овариальной
ароматазы
у
женщин
с
нормогонадотропной ановуляцией, вступающих в протокол ЭКО (ЭКО/ИКСИ).
2. Сравнить гормональный и иммуноцитохимический методы определения
активности овариальной ароматазы.
3. Изучить
основные
показатели
эффективности
КОС
у
женщин
с
нормогонадотропной ановуляцией в протоколах ЭКО (ЭКО/ИКСИ) в зависимости от
активности овариальной ароматазы
4. Изучить основные характеристики эмбриологического этапа протокола ЭКО
(ЭКО/ИКСИ) у женщин с нормогонадотропной ановуляцией в зависимости от
активности овариальной ароматазы.
5. Определить
частоту
гиперергического
ответа
у
больных
с
нормогонадотропной ановуляцией в зависимости от активности овариальной
ароматазы.
6. Сравнить эффективность преодоления бесплодия в протоколах ЭКО
(ЭКО/ИКСИ) у больных с нормогонадотропной ановуляцией в зависимости от
активности овариальной ароматазы.
Научная новизна и теоретическая значимость исследования. Впервые
показано, что активность овариальной ароматазы, вычисленная при помощи
определения коэффициента активности ароматазы овариальных фолликулов,
коррелирует с показателями иммуноцитохимической оценки экспрессии фермента
ароматаза Р450 в кумулюсных клетках пациенток. Определена частота дефицита
ароматазы овариальных фолликулов у женщин с нормогонадотропной ановуляцией в
6
протоколах ЭКО (ЭКО/ИКСИ). Проведен сравнительный анализ показателей
контролируемой овариальной стимуляции гонадотропинами, эмбриологического
этапа и исходов протокола ЭКО (ЭКО/ИКСИ) у пациенток с нормогонадотропной
ановуляцией в зависимости от активности овариальной ароматазы. Проведен анализ
основных причин отмены переноса эмбрионов (ПЭ) и частоты гиперергического
ответа в протоколах ЭКО (ЭКО/ИКСИ) у пациенток с нормогонадотропной
ановуляции в зависимости от активности овариальной ароматазы.
Выявлено, что у пациенток с нормогонадотропной ановуляцией и низкой
активностью овариальной ароматазы, несмотря на большее количество полученных
ооцитов, доля зрелых ооцитов и частота оплодотворения ниже, чем у женщин с
нормальной активностью фермента. У 54,8% женщин с нормогонадотропной
ановуляцией
и
низкой
активностью
овариальной
ароматазы
наблюдается
гиперергический ответ на КОС с высоким риском синдрома гиперстимуляции
яичников (СГЯ). Показано, что низкая активность овариальной ароматазы у
пациенток с нормогонадотропной ановуляцией ассоциирована со снижением
результативности протоколов ЭКО (частоты клинической беременности и родов).
Практическое значение исследования. Результаты исследования показали
наличие достоверной высокой корреляционной зависимости между флюоресцентной
интенсивностью
экспрессии
овариальной
ароматазы,
определяемой
при
иммуноцитохимическом исследовании гранулезных клеток, и коэффициентом
активности ароматазы, вычисляемым по результатам определения Э2 и АМГ в крови
больных на 2-й день менструального цикла, что свидетельствует о возможности
использования последнего метода для адекватной оценки активности овариальной
ароматазы в протоколах ЭКО (ЭКО/ИКСИ).
Определено, что расчет активности овариальной ароматазы гормональным
методом у пациенток с нормогонадотропной ановуляцией, вступающих в протокол
ЭКО
(ЭКО/ИКСИ),
может
использоваться
с
целью
прогнозирования
гиперергического ответа на КОС, СГЯ и результативности протокола ЭКО
(ЭКО/ИКСИ). Разработаны методы оптимизации протоколов ЭКО у женщин с
нормогонадотропной ановуляцией с учетом активности ароматазы яичников.
7
Положения, выносимые на защиту:
1. Среди пациенток с нормогонадотропной ановуляцией в протоколах ЭКО
(ЭКО/ИКСИ) преобладают женщины с низкой активностью овариальной ароматазы
(60,8%). Нормальную активность овариальной ароматазы имеют 25,5% и высокую –
13,7%.
2. Активность
овариальной
ароматазы,
вычисленная
на
2-й
день
менструального цикла путем определения коэффициента активности ароматазы
овариальных фолликулов, положительно коррелирует с уровнем интенсивности
флюоресценции ароматазы в кумулюсных клетках (R = 0,75, P = 0,001), что
доказывает диагностическую значимость этого метода для оценки активности
овариальной ароматазы.
3. У пациенток с нормогонадотропной ановуляцией и сниженной активностью
овариальной ароматазы наблюдается высокая частота гиперергического ответа на
КОС (54,8%).
4. В протоколах ЭКО (ЭКО/ИКСИ) у пациенток с нормогонадотропной
ановуляцией и низкой активностью овариальной ароматазы наблюдается достоверно
более низкая доля зрелых ооцитов (р=0,04), частота оплодотворения (р=0,03) и
клинической беременности (р=0,01) по сравнению с данными показателями у
пациенток с нормальной активностью овариальной ароматазы, а также более низкая
частота клинической беременностей (р=0,01) и родов (р=0,02) на перенос эмбриона
по сравнению с пациентками с овуляторным циклом и нормальной активностью
овариальной ароматазы.
Апробация и внедрение результатов работы в практику. Апробация работы
проведена на совместном заседании отделений гинекологической эндокринологии и
вспомогательных
репродуктивных
технологий
Научно-исследовательского
института акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О.Отта. Материалы
диссертационной
работы
доложены
на
Международной
конференции
«Репродуктивная медицина: взгляд молодых – 2017», Санкт-Петербург, 2017; на
защите выпускной квалификационной работы ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта».
8
Полученные результаты внедрены и используются в практической работе
отделения вспомогательных репродуктивных технологий, научно-консультативного
отделения ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта» и в учебном процессе кафедры
акушерства, гинекологии и репродуктологии ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский
государственный университет».
Публикации. По результатам исследования опубликовано 5 научных работ, из них
2 – в рецензируемых научных журналах и изданиях.
Личное участие автора. Автором самостоятельно проводился набор материала
по теме диссертации, обследование и лечение пациенток, проведен анализ
медицинской документации, выполнена систематизация и компьютерная обработка
полученных результатов.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 121 странице
машинописного текста и содержит: введение, обзор литературы, материалы и
методы
исследования,
пациентов,
результаты
клиническую
собственных
характеристику
исследований,
групп
обследованных
обсуждение
полученных
результатов, выводы, практические рекомендации.
Библиографический
указатель
включает
20
отечественных
и
195
зарубежных источников. Работа иллюстрирована 21 таблицей и 9 рисунками.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Настоящая работа проводилась на базе отделения ВРТ (руководитель отделения
– д.м.н. Гзгзян А.М.) и отдела патоморфологии (руководитель отдела – проф.
Кветной
И.М.)
ФГБНУ
"НИИ
АГиР
им. Д.О. Отта".
Исследование
было
проспективным (когортным) и имело сравнительный характер. С целью решения
поставленных задач была обследована 181 пациентка. Всем пациенткам было
проведено лечение бесплодия с применением ЭКО или ЭКО/ИКСИ с последующим
анализом эффективности протоколов. Применялся протокол с антагонистами ГнРГ.
Диагноз хронической ановуляции устанавливался при наличии клинических данных
аменореи либо опсоменореи, данных УЗИ (отсутствие желтого тела) в сочетании с
уровнем прогестерона в венозной крови менее 16 нмоль/л во II фазе менструального
9
цикла, и/или при отсутствии пика ЛГ в середине менструального цикла,
определяемого с использованием мочевых тест-полосок (K. E. Lynch et al., 2014).
Критериями включения для пациенток основных групп являлись: возраст
20 – 38 лет; наличие бесплодия, требующего применения ЭКО(ЭКО/ИКСИ);
стимуляция яичников в протоколе ЭКО с использованием антагонистов ГнРГ; АМГ
более 1,0 нг/мл; наличие нормогонадотропной ановуляции.
Критериями включения для пациенток группы сравнения являлись:
возраст 20 – 38 лет; наличие бесплодия, требующего применения ЭКО (ЭКО/ИКСИ);
стимуляция яичников в протоколе ЭКО с использованием антагонистов ГнРГ; АМГ
более 1,0 нг/мл; нормальные уровни гонадотропинов на 2 – 3-й день менструального
цикла; нормальная активность овариальной ароматазы.
Критериями исключения являлись: ИМТ менее 18 кг/м2 и более 35 кг/м2;
НГЭ III – IV ст.; сахарный диабет 1-го типа; наличие противопоказаний для
проведения ЭКО согласно приказу МЗ от 30.08.2012 №107н (ред. от 01.02.2018);
тяжелые нарушения сперматогенеза: азооспермия, криптозооспермия у полового
партнера.
Активность овариальной ароматазы яичников определяли с помощью
неинвазивного,
оригинального,
запатентованного
гормонального
способа,
разработанного в отделении эндокринной гинекологии НИИАГиР имени Д.О. Отта.
Перед вступлением в протокол (на 2 д.м.ц.) у всех пациенток в сыворотке крови
определяли содержание Э2 и АМГ с последующим вычислением ароматазной
активности яичников по формуле КА = Э2/АМГ, где КА–коэффициент активности
ароматазы овариальных фолликулов; Э2-базальный уровень эстрадиола в крови на 2
д.м.ц. в пмоль/л; АМГ–уровень антимюллерова гормона в крови на 2 д.м.ц. в нг/мл.
При КА меньше 37,8 овариальная ароматазная активность оценивалась как низкая;
при КА от 37,8 до 90,7 как нормальная; при КА больше 90,7 как высокая.
Среди 181 обследованных у 79 пациенток был нормальный овуляторный цикл и
у 102 пациенток была зарегистрирована нормогонадотропная ановуляция.
В
зависимости
от
активности
овариальной
ароматазы
пациентки
нормогонадотропной ановуляции были разделены на III основные группы:
I группа – 62 пациентки с низкой активностью овариальной ароматазы;
с
10
II группа – 26 пациенток с нормальной активностью овариальной ароматазы;
III группа – 14 женщин с высокой активностью овариальной ароматазы.
Для выделения группы сравнения у пациенток с нормальным овуляторным
циклом также была определена активность овариальной ароматазы.
В группу сравнения включены 33 пациентки, у которых был определен
нормальный уровень активности овариальной ароматазы. 46 женщин имели высокую
активность овариальной ароматазы.
Кроме того, у 16 пациенток с низкой (n=8), нормальной (n=4) и высокой (n=4)
активностью овариальной ароматазы, вычисленной на 2-й день менструального
цикла, был произведен забор кумулюсных клеток при трансвагинальной пункции
(ТВП) для определения экспрессии ароматазы Р450 иммуноцитохимическим
методом.
Так полученные при ТВП ооцит-кумулюсные комплексы промывали 3–4 раза в
среде Flushing Medium (Origio, Дания). После чего часть кумулюсных клеток
отделяли от ооцит-кумулюсного комплекса, промывали в фосфатном буфере и
помещали на стекла с полилизиновым покрытием, высушивали и фиксировали 4%
раствором параформальдегида. Для промывки использовался фосфатносолевой
буфер с Tween х20. Клетки инкубировали в течение 30 минут с блокирующей
сывороткой при комнатной температуре. После промывки наносили первичные
антитела к Aromatase (Abcam, (ab18995) разведение 1:400), инкубировали в течение
1 часа при комнатной температуре. В качестве вторичных антител использовали
Alexa
fluor
647®, Abcam. Затем
срезы
докрашивались
DAPI, appliChem.
Положительная реакция с ароматазой имела красную флуоресценцию, ядра – синюю
(рис. 2). Все образцы были заключены в монтирующую среду DACO. Исследование
образцов проводили на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе Olympus
FV1000D. Для изучения объектов определяли интенсивность флюоресценции в
условных единицах. Оценку и подсчет проводили в 10 полях зрения при увеличении
400 (об. 40, ок. 10).
На 2–3–й день менструального цикла перед началом КОС с помощью УЗИ
производили оценку биометрических параметров матки, состояния эндометрия, его
толщины, размера яичников, количества антральных фолликулов и их размера. С
11
целью стимуляции суперовуляции использовался протокол с антагонистами ГнРГ.
Введение рекомбинантного ФСГ (рФСГ) (Пурегон, Organon, Нидерланды, гонал-Ф,
Merck Serono, Италия) проводилось ежедневно со 2 – 3-го дня менструального цикла.
Стартовая доза рекомбинантных гонадотропинов подбиралась индивидуально в
зависимости от возраста и состояния овариального резерва пациентки. В процессе
контролируемой
стимуляции
суперовуляции
выполнялся
ультразвуковой
мониторинг роста фолликулов и эндометрия. На 5-й день стимуляции овуляции
проводилась коррекция дозы гонадотропинов и решался вопрос о назначении
антагонистов ГнРГ (Цетротид, Merck Serono, Швейцария) для предотвращения
преждевременного пика ЛГ при достижении одним или несколькими лидирующими
фолликулами среднего размера 14 мм. Критерием назначения триггера финального
созревания ооцитов являлось достижение тремя лидирующими фолликулами
среднего размера не менее 17 мм. В качестве триггера овуляции использовался
препарат рекомбинантного хорионического гонадотропина человека: Овитрель в
дозе 250 мкг (Merc Serono, Италия), либо аГнРГ Диферелин в дозе 0,2 мг (Ipsen
Pharma, Франция). Через 36 часов после введения триггера овуляции проводились
ТВП и аспирация ооцитов под контролем УЗИ c влагалищным датчиком 7,5 МГц.
После ТВП ооцит-кумулюсные комплексы инкубировали в течение 3–4 часов в
универсальной среде для ЭКО (Origio, Дания) под минеральным маслом.
Оплодотворение проводили методом ЭКО или ИКСИ. В случае применения
процедуры ЭКО через 3–5 ч после пункции к ооцитам под контролем бинокулярной
лупы
добавляли
порцию
предварительно
подготовленной
спермы.
При
количественных и качественных отклонениях в показателях спермы вместо
оплодотворения in vitro использовали процедуру ИКСИ. К оплодотворению этим
методом прибегали в случаях, если полученный эякулят не удовлетворял
вышеперечисленным требованиям для проведения процедуры ЭКО, если в ходе
обработки качественные и количественные показатели спермы значительно
ухудшались,
а
также
при
выявлении
клинически
значимого
наличия
антиспермальных антител в эякуляте (MAR–test ≥30%). Для проведения ИКСИ
ооцит-кумулюсные комплексы денудировали в растворе гиалуронидазы (Origio,
Дания) и оценивали зрелость ооцитов. Ооциты на стадии метафазы II считали
12
зрелыми
(MII),
метафазы
I
–
незрелыми
(MI).
Оценку
эффективности
оплодотворения проводили через 17-18 часов по содержанию в зиготе двух
пронуклеусов, после чего диплоидные зиготы культивировали в среде ISM (Origio,
Дания) под маслом.
Оценка развития эмбрионов in vitro. На 2-й день эмбрионы переносили в
среду БластАссист (Origio, Дания) под масло и культивировали до переноса на 4-5
день. Оценку качества эмбрионов проводили на 4-й день. Эмбрионами отличного
качества считали: на 4–й день культивирования- морулы Grade 3 и 4. Перенос не
более двух эмбрионов в полость матки проводили на 4–5–й день культивирования
под контролем УЗИ с помощью мягкого катетера Cook.
Поддержка
стандартному
лютеиновой
протоколу
с
фазы
у
всех
назначением
пациенток
осуществлялась
натурального
по
микронизированного
прогестерона вагинально в дозе 600 мг/сутки со дня проведения ТВП. При
назначении аГнРГ в качестве триггера финального созревания фолликулов
использовалась усиленная поддержка с дополнительным применением эстрогенов.
Перенос эмбрионов в полость матки осуществляли также под контролем УЗИ.
При наличии положительного анализа крови на ХГЧ ультразвуковую
диагностику клинической беременности (определяемой по наличию сердцебиения
плода) проводили через 3 – 4 недели после переноса эмбрионов. При отсутствии
плодного яйца в полости матки или сердцебиения плода беременность считали
биохимической. По отношению к диагностированной клинической беременности
определяли (до I триместра гестации) частоту самопроизвольных абортов,
неразвивающейся беременности.
Оценивали следующие показатели эффективности протоколов ЭКО: стартовую
дозировку гонадотропинов, длительность стимуляции яичников гонадотропинами,
курсовую
дозу
гонадотропинов,
количество
полученных
ооцит-кумулюсных
комплексов при ТВП, частоту оплодотворения ооцитов, процент зрелых ооцитов,
количество эмбрионов хорошего качества на 4-й день развития, эффективную дозу
гонадотропинов,
количество
криоконсервированных
эмбрионов,
частоту
гиперэргического ответа (более 16 ооцитов), толщину эндометрия на момент
переноса эмбрионов. Эффективная доза определялась количеством затраченных
13
гонадотропинов для получения 1 ооцита/эмбриона хорошего качества. Частота
оплодотворения вычислялась отношением диплоидных зигот к общему числу
полученных ооцит-кумулюсных комплексов. Доля зрелых ооцитов определялась
отношением ооцитов на стадии MII к общему числу полученных ооцитов пациентки.
Клиническую
эффективность
протоколов
ЭКО
оценивали
по
следующим
показателям: частота наступления биохимической, клинической беременности и
родов. Биохимической беременностью считали положительный анализ крови на
хорионический гонадотропин человека на 14-й день после ПЭ.
Клинической
беременностью считалось наличие плодного яйца с определением сердцебиения по
данным УЗИ на 21-й день после ПЭ. Оценку частоты наступления беременности и
родов проводили в расчете на ПЭ и начатый цикл.
Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета
прикладных программ «Statistica v 10.0» (Statsoft, Inc. USA). Параметры
распределения выборки оценивались при помощи теста Шапиро–Уилка и
Лилиефорса.
Для качественных порядковых и количественных признаков с распределением,
отличающимся от нормального, рассчитывали: медиану (Ме), нижний (LQ) и
верхний квартили (UQ) в формате Ме (LQ;UQ). Для биноминальных признаков
определяли абсолютное количество (абс.) и относительную частоту в процентах
(отн.).
При распределении признаков, отличных от нормального, а также при анализе
межгрупповых
различий
использовали
критерии
Манна–Уитни
(U).
Для
множественных межгрупповых сравнений использовали H–критерий Краскела–
Уоллиса. Статистическую обработку качественных номинальных данных проводили
при построении многопольных таблиц с применением критерия хи-квадрат (и
точного критерия Фишера при малых выборках). Корреляционный анализ проводили
с помощью оценки коэффициента ранговой корреляции Спирмана (r). Критическое
значение уровня значимости (p) для проверки нулевых гипотез принимали р<0,05.
14
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Клинико-анамнестическая характеристика обследованных пациенток
Средний возраст пациенток, включенных в исследование (n=181) составил 32
года (29;35). Первичное бесплодие имели 107 пациенток (59,1%), вторичное – 74
(40,9%). При попарном сравнении было обнаружено, что возраст пациенток III
группы был статистически значимо больше возраста женщин I (р=0,018) и II
(р=0,033) групп. Длительность бесплодия у обследованных женщин в среднем
составила 4 (3;7) года. Статистических различий по этому параметру между
пациентками с нормогонадотропной ановуляцией 4 года (3;6) и нормальным
овуляторным циклом 5 лет (3;8) не установлено (р=0,18).
Среди пациенток с нормогонадотропной ановуляцией у 62 женщин (60,8%)
была выявлена сниженная активность овариальной ароматазы, у 26 (25,5%) –
нормальная активность и у 14 (13,7%) – высокая. Нормальный овуляторный цикл
был у 79 женщин. Из них нормальную активность фермента имели 33 (41,8%)
женщины и высокую активность овариальной ароматазы 46 (58,2%) пациенток.
Низкая активность овариальной ароматазы среди пациенток с нормальным
овуляторным циклом не установлена.
Причиной хронической ановуляции у пациенток с нормогонадотропной
ановуляцией были: СПЯ (64,7%); хронический сальпингоофорит (23,5%) и НГЭ
(11,8%). Причины нормогонадотропной ановуляции представлены на рисунке 1.
Возраст менархе у пациенток с
нормогонадотропной
составил
13
лет
ановуляцией
(12;14),
и
был
достоверно ниже, чем у пациенток с
нормальным
овуляторным
циклом,
средний возраст которых составил 14
лет (13;14) (р=0,046). Возраст менархе
Рисунок
1
-
Структура
нормогонадотропной
пациенток
причин
ановуляции
у
у
пациенток
в
III
группе
был
достоверно ниже, чем в I, II и группе
сравнения.
Среди
нормогонадотропной
пациенток
с
ановуляцией
15
нарушения
менструального
цикла
по
типу
опсоменореи
выявлены
у
72
(70,6%) больных, вторичная аменорея имелась у 10 (9,8%) женщин. При попарном
сравнении различий по частоте опсоменореи и аменореи между группами женщин с
нормогонадотропной ановуляцией не установлено.
При сравнении уровней ФСГ, ЛГ и пролактина среди исследуемых групп
достоверных различий не выявлено, за исключением более низкого содержания ФСГ
у женщин I группы по сравнению с аналогичным показателем в группе сравнения
р=(0,006). Уровень АМГ был максимальным в группе с низкой активностью
овариальной ароматазы и минимальным у пациенток с высокой активностью
фермента (табл. 1).
Таблица 1 – Результаты гормонального исследования пациенток обследованных
групп
I
II
III
Группа
группа
группа
Группа
сравнения
(n=62)
(n=26)
(n=14)
(n=33)
ФСГ, МЕ/л
5,75 (4,6;6,9)
6,2 (5,0;7,0)
7,5 (5,4;8,0)
7,25 (5,7;8,7)
ЛГ, МЕ/л
6,45 (4,5;8,0)
6,0 (5,0;6,5)
4,85 (3,5;8,0)
5,8 (5,0;7,0)
360 (255;480)
314 (250;456)
291 (164;454)
313 (263;428)
АМГ, нг/мл
8,5 (6,3;10,7)
3,9 (3,0;6,6)
1,6 (1,1;1,9)
3,0 (2,5;3,4)
Э2, пмоль/л
170 (121;220)
231 (201;324)
216 (173;305)
187 (147;214)
Параметр
Пролактин,
мМЕ/л
Результаты сравнения гормонального и иммуноцитохимического методов
определения активности овариальной ароматазы
У 16 пациенток был произведен забор кумулюсных клеток при ТВП для
определения экспрессии ароматазы Р450 иммуноцитохимическим методом. С низкой
активностью овариальной ароматазы было 8 пациенток, с нормальной 4 и с высокой
активностью 4 женщины.
16
При
сравнении
клинико-анамнестических
характеристик
пациентки
были
сопоставимы по возрасту, индексу массы тела, структуре и длительности течения
бесплодия.
Ароматаза/Ядро
Ароматаза/Ядро
А
В
Ароматаза/Ядро
С
Рисунок 2 - Кумулюсные клетки. Иммуноцитохимия. Красная флуоресценция
ароматазы. А - высокая интенсивность; В – нормальная; С – низкая. Olympus
FV1000D. Об. 40, ок. 10
При иммуноцитохимической оценке экспрессии ароматазы в кумулюсных
клетках интенсивность флюоресценции у пациенток с низкой активностью
овариальной ароматазы (n=8) составила 134 (122-161) (рис. 2С), у женщин с
нормальной активностью (n=4) – 238 (201-251) (рис 2В), у больных с высокой
активностью (n=4) – 259 (240-299) (рис 2А). Данные различия были статистически
значимыми (p=0,008). При попарном сравнении экспрессия ароматазы в кумулюсных
клетках у пациенток с низкой активностью была достоверно ниже, чем у женщин с
нормальной и высокой активностью (табл. 2).
Таблица 2 – Интенсивность экспрессии ароматазы в клетках кумулюса
Ароматазная активность яичников
Параметр
низкая 1
нормальная 2 высокая 3
(n=8)
(n=4)
(n=4)
Интенсивность
134,5
238
259
флюоресценции
(122;161)
(201;251)
(240;299)
Р
Р1-2=0,021
Р2-3=0,19
Р1-3=0,008
17
При проведении корреляционного анализа гормонального метода определения
активности овариальной ароматазы (n=16) с иммуноцитохимической оценкой
экспрессии ароматазы в гранулезных клетках была выявлена высокая положительная
корреляционная взаимосвязь (Spearman, R = 0,75, P = 0,001) (рис. 3).
Рисунок 3 – Зависимость между коэффициентом активности овариальной ароматазы
и экспрессией ароматазы Р450 в клетках кумулюса
Таким
образом,
выявленная
достоверная
и
высокая
корреляционная
зависимость между интенсивностью флюоресценции овариальной ароматазы,
определяемой при иммуноцитохимическом исследовании клеток кумулюса, и
коэффициентом активности ароматазы, вычисляемым по результатам определения
эстрадиола и АМГ в крови больных на 2-й день цикла, свидетельствует о
возможности использования последнего метода для адекватной оценки активности
овариальной ароматазы в циклах ЭКО.
Показатели стимуляции яичников у больных обследованных групп
Стартовая доза гонадотропинов в I группе была достоверно ниже, чем во III и
группе сравнения. Данный показатель не различался у пациенток I и II основных
групп.
18
Длительность стимуляции суперовуляции среди групп не различалась. Курсовая
доза гонадотропинов увеличивалась с повышением активности овариальной
ароматазы и была наибольшей в III группе. Общая доза гонадотропинов в III группе
была достоверно выше, чем в I, II и группе сравнения.
Число полученных ооцит-кумулюсных комплексов было максимальным в
группе с низкой активностью овариальной ароматазы и достоверно превышало этот
показатель во II, III и группе сравнения. Данные показатели во II и группе сравнения
не отличались между собой и были достоверно выше, чем в III группе (табл. 3).
Таблица 3 - Параметры стимуляции суперовуляции яичников у пациенток
исследуемых групп
Основные группы
Параметр
Стартовая
доза р-ФСГ,
МЕ
Длительность
Группа
I группа
II группа
III группа
(n=62)
(n=26)
(n=14)
150
150
225
(150;150)
(150;225)
(200;300)
9 (8;10)
9 (8;10)
9 (8;10)
сравнения
IV
Р
(n=33)
175
p I-III<0,001
р I-IV=0,005
(150;200) р II-III=0,002
р III-IV =0,003
9 (8;9)
-
стимуляции, дни
Общая доза
1450
р–ФСГ, МЕ
(1200;1800)
p I-III<0,002
р II-III=0,05
(1350;1950) (1600;3000) (1350;1900) р III-IV =0,017
1650
2037
1500
Количество
полученных
ооцитов
20,5 (13;26)
11,5 (10;19)
7 (4;8)
11 (7;13)
р I-II=0,002
p I-III<0,001
р I-IV<0,001
р II-III<0,001
р III-IV<0,001
Характеристика эмбриологической части протокола ЭКО (ЭКО/ИКСИ)
При сопоставлении числа и доли зрелых ооцитов у пациенток I и группы
сравнения было выявлено, что число зрелых ооцитов в I группе достоверно выше,
чем в группе сравнения, но доля ооцитов (MII) в группе сравнения достоверно
превышала данный показатель в I группе. Количество правильно оплодотворенных
19
ооцитов в I группе достоверно больше, чем в группе сравнения, однако процент
оплодотворения в группе сравнения достоверно больше по сравнению с показателем
в I группе. Количество эмбрионов высокого качества в I группе было достоверно
больше, чем в группе сравнения (табл. 4).
Таблица 4 – Характеристики эмбриологического протокола
Основные группы
Параметр
ИКСИ
Группа
I группа
II группа
III группа
(n=62)
(n=26)
(n=14)
28 (45,2%)
10 (38,4%)
7 (50%)
сравнения
IV
(n=33)
21 (63,6%)
Ооциты на
стадии метафазы, 12 (9;18,5)
10,5 (8;17)
6 (3;8)
9 (6;11)
MII
Доля зрелых
ооцитов, %
p I-III=0,002
р I-IV=0,01
р II-III=0,02
р III-IV=0,03
р I-II=0,04
78,5 (69;85) 89,0 (80;94) 89 (67;100) 90 (71;100) р I-IV=0,02
Количество
оплодотворен-
Р
11 (8;16)
10 (6;13)
4 (3;6)
7 (5;10)
ных ооцитов,
p I-III<0,001
р I-IV<0,001
р II-III<0,001
р III-IV=0,002
2PN
Оплодотворение
60 (50;74)
68,5 (58;86) 71 (43;80)
%
67 (57;83) р I-II=0,03
р I-IV=0,049
Количество
эмбрионов
высокого
качества
4 (2;6)
3 (2;6)
1 (0;1)
2 (2;3)
p I-III<0,001
р I-IV=0,049
р II-III<0,001
р III-IV<0,001
При сравнении II основной и группы сравнения значимых различий в
показателях эмбриологического этапа протокола ЭКО (ЭКО/ИКСИ) не выявлено.
При сравнении III и группы сравнения было определено, что число зрелых
ооцитов и количество правильно оплодотворенных ооцитов в группе сравнения
20
достоверно выше показателя III группы, однако доля ооцитов (MII) и процент
оплодотворения среди групп не различались. Количество эмбрионов высокого
качества в группе сравнения было достоверно больше, чем в III группе
Сравнение эмбриологических показателей в I и II основных группах показало,
что число зрелых ооцитов, количество правильно оплодотворенных ооцитов и
эмбрионов высокого качества среди групп не различались, но доля ооцитов (MII) и
процент оплодотворения во II группе были достоверно выше данных показателей I
группы.
Частота развития гиперергического ответа и отмены ПЭ в протоколе
ЭКО (ЭКО/ИКСИ).
Среди исследуемых групп частота гиперергического ответа была максимальной
в I и II основных группах. В I группе гиперергический ответ был диагностирован у
34 (54,8%) пациенток из 62, во II – у 9 (34,6%) женщин из 26. В группе сравнения
гиперергический ответ на КОС наблюдался у 1 пациентки из 33 и не обнаружен в III
группе.
Отмена ПЭ была максимальной в I группе (51,6%) и достоверно превышала
данный показатель во всех группах. Во II группе она составила 15,4%, в группе
сравнения – 15,2% и отсутствовала в III группе. Высокий риск развития СГЯ был
основным среди причин отмены ПЭ в I и II группах. В I группе отмена ПЭ по
причине высокого риска развития СГЯ была у 25 (40,3%) женщин из 62, во II – у 4
(15,4%) из 26. В III и группе сравнения отмены ПЭ по причине риска развития СГЯ
не выявлено.
Эффективность протоколов ЭКО у больных обследованных групп
рассчитанная на ПЭ
ПЭ был произведен у 94 (69,6%) женщин из 135 пациенток основных групп и
группы сравнения. Среди пациенток с нормогонадотропной ановуляцией у 66
(64,7%) из 102 и среди пациенток с нормальным овуляторным циклом у 28 (84,8%)
из 33. Биохимическая беременность была диагностирована у 30 пациенток (31,9%),
клиническая беременность – у 28 (29,8%) и роды – у 24 (25,5%) пациенток.
21
Внематочная беременность наступила у 2 (2,1%) женщин и у 2 (2,1%) пациенток
беременность прервалась на сроке до 12 недель.
При анализе результативности циклов ЭКО (ЭКО/ИКСИ) у пациенток
обследованных групп, рассчитанных на ПЭ было выявлено, что частота наступления
биохимической, клинической беременности и родов была достоверно выше в группе
сравнения, чем в I основной группе; не отличалась между группой сравнения и II
основной группой; группой сравнения и III основной группой (табл. 5).
Таблица 5 - Результативность циклов ЭКО (ЭКО/ИКСИ) у пациенток
обследованных групп, определяемая на ПЭ
Основные группы
Параметр
Биохимическая
беременность
Клиническая
беременность
Роды
Внематочная
беременность
Прерывание
беременности
Группа
сравнения
Р
I группа
II группа
III группа
(n=30)
(n=22)
(n=14)
3 (10%)
10 (45,5%)
5 (35,7%)
12 (42,9%)
р I-II=0,005
р I-IV=0,005
3 (10%)
9 (40,9%)
5 (35,7%)
11 (39,3%)
р I-II=0,011
р I-IV=0,010
4 (28,6%)
10 (35,7%) р I-IV=0,020
3 (10%)
7 (31,8%)
0
1 (4,5%)
0
1 (4,5%)
0
1 (7,1%)
IV
(n=28)
1 (3,6%)
0
-
-
Частота наступления биохимической и клинической беременностей у пациенток
II группы была достоверно выше, чем у пациенток I группы.
Частота родов у
пациенток II группы также превышала частоту родов у женщин I группы (р=0,053).
Различий между I и III основными группами по данным показателям не выявлено.
Также не было различий между группами по частоте внематочной беременности и
прерывания беременности до 12 недель.
Таким образом, пациентки с низкой активностью овариальной ароматазы
характеризуются меньшей частотой наступления беременности и родов среди
обследуемых групп. При этом, различий в частоте внематочной беременности и
22
прерываний беременности в первом триместре среди обследуемых групп не
выявлено.
ВЫВОДЫ
1.
Среди женщин с бесплодием, вступающих в протоколы ЭКО ЭКО/ИКСИ
нормогонадотропная ановуляция наблюдается в 56% случаев, 60,8% женщин имеют
низкую активность овариальной ароматазы, 25,5% – нормальную и 13,7% – высокую
активность овариальной ароматазы.
2.
Активность овариальной ароматазы, вычисленная на 2-й день менструального
цикла путем определения коэффициента активности ароматазы овариальных
фолликулов, положительно коррелирует с уровнем интенсивности флюоресценции
ароматазы в кумулюсных клетках (R=0,75, P=0,001), что подтверждает возможность
использовании
гормонального
метода
для
адекватной
оценки
активности
овариальной ароматазы в циклах ЭКО (ЭКО/ИКСИ).
3.
Активность
овариальной
ароматазы
не
влияет
на
длительность
контролируемой овариальной стимуляции, однако, у пациенток с высокой
активностью овариальной ароматазы требуется достоверно более высокая курсовая
доза гонадотропинов по сравнению с данным показателем у женщин с низкой
(р=0,002) и нормальной активностью овариальной ароматазы (р=0,05). Наибольшее
количество полученных ооцитов встречается у пациенток с низкой активностью
овариальной ароматазы (20,5 (13,0;26,0)) и минимальное – у пациенток с ее высокой
активностью (7(4;8)), (р<0,001).
4.
Доля зрелых ооцитов (89 (80;94)) и частота оплодотворения (68,5 (58,0;86,0))
у пациенток с нормальной активностью овариальной ароматазы достоверно выше,
чем данные показатели у пациенток с низкой активностью 78,5 (69,0;85,0), (р=0,04) и
60 (50;74), (р=0,03) соответственно. Количество эмбрионов высокого класса
достоверно ниже у пациенток с высокой активностью овариальной ароматазы по
сравнению с данным показателем у женщин с низкой и нормальной активностью
овариальной ароматазы (р<0,001).
23
5.
Гиперергический ответ на контролируемую овариальную стимуляцию
наблюдается у 54,8% пациенток с низкой активностью овариальной ароматазы,
34,6% – с нормальной активностью фермента и отсутствует у пациенток, имеющих
высокую активность овариальной ароматазы.
6.
Показатели частоты наступления биохимической (р=0,005), клинической
беременностей (р=0,01) и родов (р=0,02), рассчитанные на перенос эмбриона у
пациенток, имеющих овуляторный менструальный цикл и нормальную активность
овариальной
показателями
ароматазы
у
достоверно
пациенток
с
выше
по
сравнению
нормогонадотропной
с
аналогичными
ановуляцией
и
низкой
активностью овариальной ароматазы. Среди пациенток с нормогонадотропной
ановуляцией частота клинической беременности у пациенток с нормальной
активностью достоверно выше, чем у пациенток с низкой активностью овариальной
ароматазы (р=0,01).
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1.
У пациенток с нормогонадотропной ановуляцией, вступающих в протокол
ЭКО (ЭКО/ИКСИ), рекомендуется определять активность овариальной ароматазы
гормональным методом путем вычисления коэффициента активности ароматазы
овариальных фолликулов с целью прогнозирования гиперергического ответа на
КОС, СГЯ и результативности протокола ЭКО (ЭКО/ИКСИ).
2.
С учетом снижения эффективности протоколов ЭКО, высокого риска СГЯ у
пациенток с нормогонадотропной ановуляцией и низкой активностью овариальной
ароматазы целесообразно использовать сегментацию циклов с последующим
переносом криоконсервированных эмбрионов.
24
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Оценка влияния активности овариальной ароматазы на показатели эффективности
протоколов экстракорпорального оплодотворения / П.П. Яковлев, А.М. Гзгзян,
М.А.Тарасова, И.Ю. Коган, В.С. Мюллер, Е.А. Лесик, И.Д. Федорова, Е.М.
Комарова // Материалы VII регионального научного форума «Мать и дитя». – М.,
2016 – С. 262-263.
2. Яковлев,
П.П.
зависимости
от
Результативность
активности
экстракорпорального
ароматазы
яичников
оплодотворения
у женщин
в
старшего
репродуктивного возраста / П.П. Яковлев // Журнал акушерства и женских
болезней. – 2017. – Т. 66, спецвып. – С. 171-172.
3. Яковлев, П.П. Активность ароматазы Р450 яичников в естественном
менструальном цикле и при стимуляции суперовуляции / П.П. Яковлев //
Журнал акушерства и женских болезней. – 2017. – Т. 66, № 5. – С. 46-55. doi:
10.17816/JOWD66546-55
4. Активность овариальной ароматазы: методы оценки и клиническое
значение в протоколах экстракорпорального оплодотворения / П.П. Яковлев,
Ю.С. Крылова, И.Д. Мекина, В.О. Полякова, И.М. Кветной, М.А. Тарасова,
И.Ю. Коган, А.М. Гзгзян, В.Р. Родичкина // Журнал акушерства и женских
болезней. — 2018. — Т. 67, № 2. — С. 61-69. doi: 10.17816/JOWD67261-69
5. Яковлев,
П.П.
Активность
овариальной
ароматазы
в
патогенезе
нормогонадотропной ановуляции при синдроме поликистозных яичников и ее
влияние на протоколы ЭКО / П.П. Яковлев // Acta medica Eurasica. - 2018. - № 2. С. 42-49. URL: http://acta-medica-eurasica.ru/single/2018/2/7/
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа