close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Связь белков сыворотки крови выявленных с помощью протеомного анализа с особенностями патогенеза психогенных и эндогенных психических расстройств

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
ЛОГИНОВА
Лариса Викторовна
СВЯЗЬ БЕЛКОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ,
ВЫЯВЛЕННЫХ С ПОМОЩЬЮ ПРОТЕОМНОГО АНАЛИЗА,
С ОСОБЕННОСТЯМИ ПАТОГЕНЕЗА ПСИХОГЕННЫХ
И ЭНДОГЕННЫХ ПСИХИЧЕСКИХ РАССТРОЙСТВ
Специальности:
14.03.03 – Патологическая физиология
14.01.06 – Психиатрия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации
на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Томск – 2018
Работа выполнена в Научно-исследовательском институте психического
здоровья Федерального государственного бюджетного научного учреждения
«Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской
академии наук»
Научные руководители:
Заслуженный деятель науки РФ,
доктор медицинских наук, профессор,
академик РАН
Бохан Николай Александрович
кандидат медицинских наук
Смирнова Людмила Павловна
Официальные оппоненты:
Меньщикова Елена Брониславовна, доктор медицинских наук, НИИ
экспериментальной
и
клинической
медицины
Федерального
исследовательского центра фундаментальной и трансляционной медицины,
руководитель лаборатории молекулярных механизмов свободнорадикальных
процессов
Дроздовский Юрий Викентьевич, доктор медицинских наук, профессор,
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего образования «Омский государственный медицинский университет»
Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующий кафедрой
психиатрии, медицинской психологии
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное научное
учреждение «Научно-исследовательский институт общей патологии и
патофизиологии»
Защита состоится «
»
2018 года в __ часов на заседании
диссертационного совета Д 002.279.03, созданного на базе Федерального
государственного бюджетного научного учреждения «Томский национальный
исследовательский медицинский центр Российской академии наук», по адресу:
г. Томск, пр. Ленина, 3, Научно-исследовательский институт фармакологии и
регенеративной медицины имени Е.Д. Гольдберга
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального
государственного бюджетного научного учреждения «Томский национальный
исследовательский медицинский центр Российской академии наук», адрес сайта
http://www.tnimc.ru
Автореферат разослан ___ 2018 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
доктор медицинских наук, профессор РАН
Удут Елена Владимировна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования. Психические расстройства (ПР) относят к
социально значимым заболеваниям современности, которые характеризуются
распространенностью, частыми рецидивами и, в случае эндогенных психических
расстройств, короткими периодами ремиссий или их полным отсутствием.
Существует этиологическое деление всех психических расстройств на эндогенные и
психогенные (Тиганов А.С., 1999). На эндогенное заболевание указывает спонтанный
характер возникновения болезни, т.е. отсутствие какого-либо внешнего фактора. К
таким заболеваниям относят расстройства шизофренического спектра и биполярное
аффективное расстройство (БАР).
Несмотря на большую социальную значимость, этиология и патогенез ПР
остаются не до конца изученным (Lakhan S.E., 2006). В основе шизофрении и, в
определённой мере, других расстройств шизофренического спектра и БАР
(биполярное аффективное расстройство) лежит нарушение процессов синаптической
передачи, приводящее к нарушению нейротрансмиссии (Hashimoto M. et al., 2003). До
сих пор параллельно существует несколько гипотез патогенеза этих заболеваний.
Последнее время возрос интерес к глутаматергической гипотезе; в её основе лежит
дисфункция глутаматной рецепторной системы (Ehrlich A. et al., 2015; Chitty K.M. et
al., 2015). Появились также сообщения, что активация синтеза глутамата имеет
патогенетическое значение при нейродегенеративных заболеваниях мозга, глутамат
осуществляет повреждающее действие на нейроны и может опосредовать гибель
клеток (Arundine M., Tymianski M., 2004; Martin H., Wang Y., 2010). Но, тем не менее,
не выявлено неопровержимых доказательств ведущей роли нарушения
глутаматергической нейротрансмиссии в патогенезе шизофрении и каких-либо
биологических маркёров этих процессов.
Трудности в создании новых эффективных методов диагностики и лечения
психических расстройств связаны с недостаточным пониманием молекулярных
механизмов патогенеза болезней. На начальных этапах заболевания многие ПР имеют
сходную клиническую картину. Но развитие заболевания и его исход совершенно
разный: для шизофрении характерно разрушение эмоций и способностей, ведущее к
формированию дефекта личности и инвалидизации, для других видов эндогенных
психических расстройств в период ремиссий не наблюдается дефекта психических
функций и снижения интеллекта. Поэтому крайне актуальна ранняя
дифференциальная диагностика психических расстройств.
В настоящее время не существует параклинических лабораторных методов
дифференциальной диагностики психических расстройств. Для постановки диагноза
того или иного психического расстройства используют только анамнестические и
клинико-психопатологические данные, основанные на клинических оценках
преобладания тех или иных психогенных симптомов. Поэтому правильность диагноза
того или иного психического расстройства зависит исключительно от квалификации
лечащего врача. Особую сложность при постановке диагноза представляют пациенты,
впервые поступившие в психиатрическую клинику. На сегодняшний день являются
перспективными исследования, связанные с поиском белков, специфичных для
расстройств шизофренического спектра, БАР и других ПР (English J. et al., 2010;
Lakhan S., 2006; Domenici E., 2010) отражающих характерные изменения патогенеза
этих расстройств.
Степень разработанности темы исследования. Несмотря на длительное
изучение психических расстройств, до сих пор не удавалось обнаружить наличие
патогенетического дефекта, специфично характеризующего данные патологические
процессы (Pickard B., 2011). В последнее время активно развиваются новые подходы
к диагностике психических заболеваний и поиску их патогенетических маркеров, в
том числе и методом протеомного анализа (Ding Y.H. et al., 2015; Song Y.R. et al.,
2015; Sabherwal S. et al., 2016; Giusti L. et al., 2016; Davalieva K. et al., 2016; Guest P.C.,
Rahmoune H., 2017). По протеомному анализу больных с психическими
расстройствами
имеются
немногочисленные
исследования,
в
основном
представленные работами по шизофрении (Martins-de- Souza D., 2010-2011; Horvth S.
et al., 2011; Cafe-Mendes C.C., Torrao E.S. et al., 2014; Song Y.R. et al., 2015, Sabherwal
S. et al., 2016). Протеомные исследования ПР представлены, в основном, работами,
выполненными на постмортальном материале, а по исследованию белкового состава
сыворотки крови представлены единичные работы (Wan C. et al., 2007, Lisitsa S. et al.,
2014, Knochel C. et al., 2016; Sabherwal S. et al., 2016), данные которых противоречивы
и в большей степени не подтверждены другими методами. Есть единичные работы по
протеомике депрессии и БАР (Domenici E., 2012; Carboni L., 2014; Sussulini A. et al.,
2014). Несмотря на повышенный интерес к протеомным исследованиям ПР и
интенсивные исследования в этом направлении, в доступной литературе не
встречается работ, посвященных анализу белкового спектра методом 1D
электрофореза у больных ПР, также совсем отсутствуют протеомные исследования
при шизотипическом расстройстве и расстройстве адаптации. Сравнительный
протеомный анализ при разных ПР также не проводился. Кроме того, в
представленной мировой литературе практически отсутствуют попытки связать
выявленные белки с патогенезом расстройств.
Таким образом, является обоснованным выявление белка-маркера или
регуляторных
белков,
участвующих
в
патогенезе
шизофрении,
ШТР
(шизотипического расстройства), БАР и РА (расстройства адаптации) в доступном
для использования в диагностических целях биоматериале – сыворотке крови,
которые максимально приблизят нас к пониманию специфичных патогенетических
моментов ПР и могут послужить дополнением к имеющимся клиническим критериям
дифференциальной диагностики различных эндогенных психических расстройств и
основой для разработки персонализированного подхода к терапевтической тактике.
Анализ литературных данных в этой области исследований психических расстройств
свидетельствует об актуальности проблемы, ее приоритетности и нерешенности
заявляемых задач.
Цель исследования – выявить связь специфических белков, обнаруженных с
помощью сравнительного протеомного анализа, с особенностями патогенеза ряда
психических расстройств: шизофрении, шизотипического расстройства, биполярного
аффективного расстройства и расстройства адаптации.
Задачи исследования:
1. Определить закономерности электрофоретического распределения белков
сыворотки крови больных эндогенными психическими расстройствами и
расстройством адаптации.
2. Выявить специфичные для шизофрении, шизотипического расстройства,
биполярного аффективного расстройства и расстройства адаптации белки с помощью
масс-спектрометрии из белковых областей, имеющих достоверные различия между
исследуемыми группами.
3. Определить связь белков, специфичных для каждой из изучаемых патологий, с
особенностями патогенеза эндогенных и психогенных расстройств.
4. Оценить вклад выявленных белков (mGlu6, z-NMDAR) в нарушение
глутаматергической нейротрансмиссии при эндогенных психических расстройствах.
5. Выявить связь идентифицированных белков с изменениями в гипоталамогипофизарно-надпочечниковой системе, участвующих в патогенезе расстройства
адаптации.
Научная новизна работы. В результате комплексного исследования с
использованием современных методов впервые выявлены особенности изменений
белкового спектра сыворотки крови при расстройствах шизофренического спектра,
биполярного аффективного расстройства и расстройстве адаптации в сравнении со
здоровыми лицами. Впервые получены достоверные отличия в электрофоретических
картинах распределения сывороточных белков при различных видах психических
расстройств и выявлены специфичные белковые области, характеризующие каждое
заболевание, используемые в дальнейшем для масс-спектрометрии. В результате
масс-спектрометрического анализа впервые были идентифицированы специфичные
белки для каждой изучаемой патологии: шизофрении, шизотипического расстройства,
биполярного аффективного расстройства и расстройства адаптации. Впервые в крови
больных эндогенными расстройствами определено достоверное увеличение
концентрации белка метаботропного глутаматного рецептора 6 типа, z-1
субъединицы глутаматного NMDA-рецептора и глутамата и оценен их вклад в
нарушение глутаматергической нейротрансмиссии у этих больных. Впервые
выявлена патогенетическая роль в развитии эндотелиальной дисфункции у больных
эндогенными психическими расстройствами таких белков, как: тирозин-зависимая
протеинкиназа ABL 2, актин α-2 и актин α-3, кадгерин-5, мaк-2-связывающий
гликопротеин, гельзолин, белок внеклеточного матрикса 1, рецептор фактора роста
эндотелия сосудов 1. По итогам работы впервые представлена гипотетическая схема
участия всех выявленных белков в патогенезе эндогенных расстройств. У больных
расстройством адаптации патогенетические изменения в функционировании
гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой
системы
впервые
подтверждены
определением в крови белка специфического фактора удлинения глюкокортикоидных
рецепторов, а изменения в иммунном ответе – секреторным актин-связывающим
белком. Выявление этих белков расширило и дополнило имеющиеся сведения о
патогенезе расстройства адаптации в контексте ключевых механизмов его развития.
Теоретическая и практическая значимость работы. Данное исследование
позволило выявить изменения в белковом спектре сыворотки крови при психических
расстройствах, играющие роль в патогенезе изучаемых заболеваний. В работе
выявлен ряд специфичных белков, отражающих особенности патогенеза больных тем
или иным расстройством и не встречающихся при других нозологических формах. По
итогам работы впервые выявлены потенциальные белковые маркёры, являющиеся
значимыми патогенетическими факторами у больных эндогенными психическими
расстройствами
–
нарушение
глутаматергической
нейротрансмиссии
и
эндотелиальная дисфункция; у больных расстройствами психогенного спектра –
белки, характеризующие изменения в гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой и
нейроиммунных системах.
Использование
результатов
оценки
электрофоретического
спектра
распределения сывороточных белков и выделения белковых областей сыворотки
крови, характеризующих только одну конкретную нозологию, легло в основу двух
патентов: патента РФ № 2522236 «Лабораторный способ дифференциальной
диагностики эндогенных психозов» (2014 г.) и патента РФ № 2558056 «Лабораторный
способ диагностики биполярного аффективного расстройства» (2015г.). На основании
данных об уровне глутамата в сыворотке крови больных разными формами
расстройств шизофренического спектра в зависимости от клинических особенностей
заболевания получены два патента: патент РФ № 2569741 «Лабораторный способ
диагностики шизотипического расстройства» (2015г.) и патент РФ № 2578957
«Лабораторный способ диагностики ведущей негативной симптоматики у больных
шизофренией» (2016г.). На основе патентов РФ № 2569741 и № 2522236 разработаны
и внедрены в клиническую практику новые медицинские технологии: «Лабораторная
диагностика шизотипического расстройства на основе определения количества
глутамата в сыворотке крови» и «Лабораторный метод дифференциальной
диагностики шизофрении и острого полиморфного психотического расстройства на
основе электрофоретического анализа белков сыворотки крови». Результаты
исследования в дальнейшем могут служить теоретической базой для разработки
принципиально новых методов диагностики ПР, основанных на параклинических
критериях. Использование новых знаний об участии выявленных белков в патогенезе
ПР, позволит назначать лекарственные препараты с учётом патогенетических
особенностей течения заболевания и тем самым увеличить эффективность
проводимой терапии. Применение результатов исследования в практическом
здравоохранении
будет
способствовать
улучшению
качества
оказания
индивидуальной специализированной психиатрической помощи.
Методология и методы исследования. В соответствии с поставленными
задачами были использованы современные высокоинформативные методы
исследования. Материалом для исследования являлась сыворотка крови
обследованных лиц.
Основные методы исследования: клинико-психопатологический (шкала оценки
позитивных и негативных симптомов PANSS; оценка тяжести депрессивного
симптома по шкале Гамильтона версия для сезонного аффективного расстройства
(SIGH-SAD); биохимические: аффинная хроматография и концентрирование белков;
электрофорез и расчет молекулярной массы белков, разделённых с помощью 1D;
трипсинолиз белковых пятен из ПААГ; ESI масс-спектрометрический анализ белков;
идентификация белков с использованием баз данных системы Mascot; целевой
количественный масс-спектрометрический анализ белка сыворотки крови mGluR6 с
использованием синтетических пептидных стандартов, меченных стабильными
изотопами; определение концентрации глутамата в сыворотке крови; определение
концентрации кадгерина-5 в сыворотке крови; определение концентрации кортизола в
сыворотке крови; статистический анализ результатов.
Положения, выносимые на защиту:
1. У больных с психическими расстройствами в сыворотке крови впервые
определены специфичные патогенетически значимые белки: для шизофрении –
тирозинзависимая протеинкиназа ABL, ά актин-2 и ά-3, белок метаботропного
глутаматного рецептора 6 типа; для шизотипического расстройства –
компонент комплемента C9; для больных биполярным аффективным
расстройством – z-1 субъединица глутаматного NMDA-рецептора; рецептор
фактора роста эндотелия сосудов 1, для больных расстройством адаптации –
секреторный актин-связывающий белок и белок специфического фактора
удлинения глюкокортикоидных рецепторов AF1.
2. У больных эндогенными расстройствами выявлено увеличение количества
белка метаботропного глутаматного рецептора, z-1 субъединицы NMDA
рецептора и глутамата, которые являются важными патогенетическими
факторами нарушения глутаматергической нейротрансмиссии.
3. У больных психогенными расстройствами обнаружен белок специфического
фактора удлинения глюкокортикоидных рецепторов, который в сочетании с
двукратным
увеличением
концентрации
кортизола,
подтверждает
вовлеченность
механизмов
гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой
регуляции в патогенез расстройства адаптации.
Степень достоверности и апробация результатов диссертации. Результаты
проведенных исследований доложены и обсуждены на конференциях всероссийского
и международного уровней, таких, как международная научно-студенческая
конференция «Молекулярная медицина и безопасность» (Москва, 2010); 66-я
Всероссийская научно-практическая конференция молодых ученых и студентов с
международным участием «Актуальные вопросы современной медицинской науки и
здравоохранения» (Екатеринбург, 2011); I Международная интернет-конференция
«Молекулярные механизмы шизофрении» (Казань, 2011); XIV Всероссийская медикобиологическая конференция молодых исследователей с международным участием
(Санкт-Петербург, 2011); Российская научно-практическая конференция «Адаптация
больных шизофренией» (Томск, 2013); Современные проблемы психических и
соматических расстройств: грани соприкосновения (Томск, 17-18 июня 2014);
Российский форум с международным участием "Актуальные вопросы
фундаментальной медицины" (Екатеринбург, 23-25 октября, 2014); XVII Отчетная
научная сессия ФГБУ «НИИ психического здоровья» (Томск, 6 октября 2015); XVI
съезд психиатров России (Казань, 23-26 сентября 2015); VII Российский симпозиум
«Белки и пептиды» (Новосибирск, 12-17 июля 2015); “Mental Health, Direction and
Challenges”WPA Regional Conference (Tbilisi, 27-30 April 2016); Российская
конференция с международным участием и школы-семинара молодых ученых
«Биомаркеры в психиатрии: поиски и перспективы» (Томск, 12—13 мая 2016); 12
международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и
психологии» (Судак, Крым, Россия, 5-11 июня 2016); The 10th anniversary International
Multiconference «Bioinformatics of Genome Regulation and Structure\ Systems Biology»
(Novosibirsk, 29 August – 2 September 2016); V Съезд физиологов СНГ, V съезд
биохимиков России и Конференции ADFLIM (Сочи, Россия, 4–8 октября 2016); 10-я
конференция по протеомике стран Восточной и Центральной Европы: «10th Central
and Eastern European Proteomic Conference» (Венгрия, Будапешт, 11-14 октября 2016);
6th European Conference on Schizophrenia Research: Advancing Research-Promoting
Recovery (Германия, Берлин, 14-16 сентября 2017 г.); International Conference «Clinical
Proteomics. Postgenome Medicine» (Москва, 30 октября-1 ноября 2017г.) и другие.
Работа выполнялась в рамках междисциплинарного интеграционного проекта
СО РАН «Медицинская протеомика и метаболомика человека. Химические и
генетические подходы к персонализированной терапии», №90, 2009-2011 гг. и
поддержаны государственным контрактом № 14.740.12.0819 Федеральная Целевая
Программа «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на
2009-2013 годы и интеграционным проектом СО РАН и СО РАМН №5 от 09 февраля
2012 года «Медицинская протеомика: поиск маркеров социально значимых
психических расстройств (2012-2014 годы)». Грант РНФ 14-15-00480 «Поиск
ключевых биомаркеров патогенеза социально значимых эндогенных психических
расстройств» (2014-2016).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 50 печатных работ, из
которых 5 статей в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК
РФ, одна статья подана в международную печать; 4 патента на изобретение РФ, 2
новые медицинские технологии.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 237 страницах
машинописного текста, состоит из введения, трех глав, выводов, списка
использованной литературы, содержащего 472 источника, в том числе 99
отечественных и 373 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 23 таблицами и 12
рисунками.
Личное участие автора. Автор принимал непосредственное участие в
разработке дизайна и планировании исследования, подборке и анализе литературы,
проведении всех экспериментальных работ, обработке данных масс-спектрометрии,
статистической обработке полученных данных и интерпретации результатов.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении обоснована актуальность, определены цели и задачи
исследования, научная новизна, практическая значимость работы, сформулированы
основные положения, выносимые на защиту.
В первой главе представлены данные отечественных и зарубежных
литературных источников, посвященных современным аспектам патогенеза ПР, а
также состояние новых подходов к диагностике психических заболеваний и поиску
биомаркеров ПР, основанных на методах протеомного анализа. Анализ литературных
данных свидетельствует об отсутствии разработанности проблемы связи выявляемых
протеомными методами потенциальных белковых маркёров ПР с патогенезом
исследуемых расстройств. Данные по специфике белкового состава сыворотки крови
больных ПР, малочисленны и не подтверждены другими методами. Отсутствуют
работы, посвященные анализу белкового спектра больных ПР методом 1D
электрофореза, сравнительному протеомному анализу сыворотки крови больных
психогенными и эндогенными психическими расстройствами и протеомным
исследованиям при ШТР и РА.
Во второй главе представлены материалы и методы исследования.
Формирование групп пациентов для исследования и клиническая верификация
диагноза выполнена в клиниках НИИ психического здоровья Томского НИМЦ на
базе отделения эндогенных расстройств (руководитель отделения – д-р мед. наук,
профессор Семке А.В.), отделения аффективных состояний (руководитель отделения
– д-р мед. наук, профессор Счастный Е.Д.) и отделения пограничных состояний
(руководитель отделения – д-р мед. наук, профессор Аксёнов М.М.).
Пациенты. В исследование включено 200 пациентов, поступивших на
стационарное лечение в клинику НИИ психического здоровья ТНИМЦ на фоне
обострения клинической симптоматики. Диагностическая оценка и клиническая
квалификация проводилась врачами клиники в соответствии с МКБ-10: 110 человек –
шизофрения (F 20.00, F 20.01, F20.02, F20.09, F20.6, F20.5, F20.3, F20.1, F20.8,
F20.006, F20.004; средний возраст 34,1±13,1 лет); 20 человек – шизотипическое
расстройство (F 21,1; средний возраст 29,1±9,9 лет); 23 человека – биполярное
аффективное расстройство (F31.1, F31.3, F31.4, F31.5, F31.6, F34.1; средний возраст
44,1±15,2 лет); 47 человек – расстройство адаптации (F43,2; средний возраст
40,33±14,1лет). Длительность заболевания шизофренией у больных основной группы
составила 9,13 [3;13] лет. Продолжительность болезни для пациентов с диагнозом
шизотипическое расстройство – 7,82 [4; 8] лет, для пациентов с БАР – 7 [2;11].
Группа психогенных невротических расстройств, как группа сравнения, в
исследовании представлена расстройством адаптации с преобладанием депрессивных
реакций (F43,2), развивающимся чаще всего после перенесённых психических
стрессов (Семке В.Я., Рудницкий В.А., 2008).
Критерии включения: 1) согласие пациента на участие в исследовании.
Настоящее исследование одобрено Локальным этическим комитетом при НИИ
психического здоровья Томского НИМЦ (протокол №45 от 21.11.2011г., дело
№45/3.2011); 2) наличие установленного диагноза на основании критериев МКБ-10;
3) возраст пациентов от 20 до 58 лет; 4) отсутствие острой соматической патологии.
Критерии исключения: 1) возраст старше 60 лет; 2) наличие соматической
патологии в стадии обострения, эпилепсии, алкоголизма, наркомании или другого
психического расстройства, не включённого в исследование.
Контрольная группа. 40 психически и соматически здоровых людей (средний
возраст 32,6±2,2 лет), не имеющих хронических заболеваний и не состоящих на
диспансерном учете, без признаков перенесенных острых инфекционных заболеваний
на момент исследования.
Критерии включения:1) согласие на участие в исследовании; 2) возраст от 20 до
58 лет; 3) отсутствие соматических и психических заболеваний.
Критерии исключения: 1) возраст старше 60 лет; 2) наличие психических и
соматических заболеваний; 3) отказ от участия в исследовании.
Дизайн исследования. На начальном этапе работы применялась очистка образов
сыворотки крови от 6-и мажорных белков методом аффинной хроматографии.
Концентрированные белки разделены методом 1D по Laemmli (Laemmli U., 1970) в
соответствии с молекулярным весом и проведен расчет их молекулярной массы в геле
при помощи системы гель-документации Alliance 2.7. В дальнейшем проводили
трипсинолиз и экстрагирование пептидов из белковых бендов имеющих
статистически значимые различия в группах исследования.
На следующем этапе проведено масс-спектрометрическое исследование
белкового состава образцов в ИБМХ РАМН г. Москва на масс-спектрометре LTQ
Velos (Thermo Scientific) на базе ЦПК «Протеом человека». Идентификация белков
проведена путем поиска совпадения значений экспериментальных масс с массами
белков, аннотипированных в соответствующих базах данных с использованием
программного обеспечения Mascot Ver. 2.1 (Matrix Science). Были выявлены белки,
специфичные для каждого вида изучаемых расстройств. Наиболее интересные в
патогенетическом отношении белки были подвергнуты количественному изучению. С
помощью целевого количественного масс-спектрометрического анализа с
использованием синтетического меченого стандарта определено количество белка
mGluR6. Выполнено определение концентрации глутамата в сыворотке крови
больных шизофренией, ШТР, БАР и здоровых лиц с помощью набора «Glutamat
Assay Kit» фирмы BioVision Research Products, Montain, USA. Количество кадгерина-5
было оценено в крови у больных эндогенными психическими расстройствами и
здоровых лиц, методом ИФА набором ELISA Kit for cadherin 5 (CDH5) from Homo
sapiens (Cloud-Clone Corp., USA). У больных психогенными психическими
расстройствами в сыворотке крови была определена концентрация кортизола методом
ИФА при помощи наборов реактивов ЗАО «Алкор Био», Санкт-Петербург.
Статистическая обработка данных. Для проведения статистической
обработки
полученных
результатов
использовали
статистический
пакет
«STATISTICA» версии 10.0 для Windows. Полученные результаты были проверены
на нормальность при помощи критерия Колмогорова-Смирнова. Для нормально
распределенных признаков использовали параметрический критерий Стьюдента.
Достоверность
различий
между
несколькими
независимыми
группами,
характеризующимися
количественными
признаками,
не
подчиняющихся
нормальному
закону
распределения,
оценивалась
с
использованием
непараметрического рангового критерия Краскела-Уоллиса, для двух независимых
групп – с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Для оценки
достоверности различий качественных признаков использовался точный
непараметрический критерий Фишера. Статистически значимыми считались различия
между группами при р<0,05. (Боровиков В., 2001; Гланц С., 1999; Реброва О.Ю.,
2002).
В третьей главе представлены результаты исследования и их обсуждение с
привлечением данных литературы. Полученные данные представлены в виде таблиц
и рисунков.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
На начальном этапе работы было проведено определение значимых различий в
распределении белков сыворотки крови всех исследуемых групп, проведённых
методом одномерного электрофореза. В результате проведения сравнительного
анализа выявлены значимые отличия в распределении белков больных шизофренией
и здоровых лиц в следующих областях молекулярных масс: 206, 180, 128, 97, 94, 88,
40, 32, 30, 28, 20, 15, 12 кДа; больных шизотипическим расстройством и здоровых
контрольной группы – в областях молекулярных масс: 206, 180, 128, 97, 94, 64, 40, 32,
30, 28, 20, 15, 12 кДа; больных БАР и здоровых лиц – в областях молекулярных масс:
206, 200, 180, 165, 150, 107, 97, 94, 84, 81, 75, 73, 49, 40, 23, 20 кДа; больных
расстройством адаптации и здоровых лиц в следующих областях молекулярных масс:
254, 180, 145, 97, 90, 52, 46, 25, 16 кДа. Некоторые из полученных нами результатов
согласуются с уже имеющимися в литературе изменениями белкового спектра,
выявленными у больных шизофренией. В работе Tanaka Y. обнаружены изменения в
плазме крови больных шизофренией в следующих областях белкового спектра: 180,
140, 120, 75, 68 и 52 кДа (Tanaka Y., Yoshida S., Shimada Y., 2007).
При сравнении электрофоретического распределения белков больных БАР и
шизофренией выявлены значимые различия в следующих белковых областях: 200,
150, 138, 128, 88, 84, 75, 56, 49, 40, 32, 30, 25 кДа; больных расстройством адаптации и
шизофренией в областях молекулярных масс: 257, 145, 128, 95, 91, 88, 60, 46, 38, 32,
30, 28 кДа; больных расстройством адаптации и БАР в областях молекулярных масс:
200, 150, 94, 84, 75, 56, 50, 46, 40, 20 кДа.
После анализа полученных результатов исследования выявлены области
белкового спектра, характерные только для исследуемых заболеваний: для БАР – 200,
150, 84, 75, 49 кДа, для шизофрении – 128, 88, 32, 30, 28 кДа, для РА – 145, 90, 46 кДа.
Белки, выделенные из выявленных областей, были идентифицированы с
помощью
масс-спектрометрического
анализа
и
ресурса
Mascot
(www.matrixscience.com) («Matrix Science», США). В результаты работы включены
белки специфично присутствующие в сыворотке крови только одной группы больных
и не встречающиеся при остальных ПР. В таблицу, приведённую ниже, включены
наиболее интересные в патогенетическом отношении белки по всем изученным
группам ПР (таблица 1).
Таблица 1 – Основные патогенетически значимые белки, выявленные путём
сравнительного протеомного анализа сыворотки крови, у больных эндогенными и
психогенными расстройствами
Молекулярная
масса, Да
95376
128263
87474
Международное название белка
Код белка
Белок метаботропного
глутаматного рецептора 6
(Metabotropic glutamate
receptor 6)
Тирозин-протеинкиназа ABL 2
(Abelson tyrosine-protein
kinase 2, ABL 2)
Кадгерин-5
(Cadherin-5)
O15303
P42684
P33151
Актин гладкой мышцы α-2
(Actin, aortic smooth muscle
(Alpha-actin-2)
41982
P62736
Актин гладкой мышцы α-3
(Alpha-actin-3, γ actin )
P63267
41850
62974
Компонент комплемента C9
(Complement component C9)
P02748
105306
z-1 субъединица глутаматного
NMDA-рецептора
(Glutamate [NMDA] receptor
subunit zeta-1)
Q05586
150673
Рецептор фактора роста
эндотелия сосудов 1
(Vascular endothelial growth
factor receptor 1)
P17948
93402
Ингибитор 3 компонента интеральфа-трипсина
P19827
(Inter-alpha-trypsin inhibitor
complex component III)
46240
Специфический фактор
удлинения глюкокортикоидных Q9NZS6
рецепторов AF1
Функция
белка
Специфичен
для
заболевания
Нейротрансмиссия,
Шизофрения
сигналинг, клеточная адгезия
и моторика
Ремоделирование
цитоскелета через F актин,
моторика,
адгезия
и
эндоцитоз
рецепторов
и
клеток,
регуляция
нейротрансмиссии
Клеточная
адгезия,
сигналинг
пролиферации,
дифференцировки
и
миграции
эндотелиальных
клеток
Структура
цитоскелета,
сократительный
аппарат,
клеточная
моторика,
везикулярный
транспорт,
ангиогенез, экспрессия генов,
регуляция постсинаптических
глутаматных
NMDA–
рецепторов,
нейротрансмиссия
Структура
цитоскелета,
клеточная
моторика,
везикулярный
транспорт,
сократительный
аппарат,
экспрессия
генов,
фибринолиз
Иммунный ответ, цитолиз,
активация комплемента
Нейротрансмиссия,
синаптическая пластичность
гомеостаз ионов Са и АФК,
аксоногенез,
морфогенез
дендритов
Ангиогенез,
моторика,
клеточная
адгезия
пролиферация
и
дифференцировка; сигналинг,
фосфорилирование
Адгезия и восстановление
эпителия, иммунный ответ,
регуляция
фагоцитоза,
противовоспалительный
ответ
Синтез белка, транскрипция,
трансляция, иммунный ответ,
сигналинг, ремоделирование
Шизофрения
Шизофрения
Шизофрения
Шизофрения
ШТР
БАР
БАР
РА
РА
цитоскелета, синаптическая
пластичность
Модуляция иммунного ответа
(CD4-Th1-клеточное звено)
P12273 Сигналинг:
регуляция
транскрипции, пролиферация
и апоптоз; трансмембранный
транспорт
(Glucocorticoid receptor AF-1
specific elongation factor)
Секреторный актин связывающий белок
(secretory actin-binding protein)
16562
РА
На основании анализа основных функций идентифицированных в нашей работе
белков выявлено, что для всей группы эндогенных психических расстройств
выявлены белки, характеризующие наличие изменений в системе глутаматергической
нейротрансмиссии: при шизофрении – белок метаботропного глутаматного рецептора
6 типа (95376 Да), актин гладкой мышцы α-2 (41982 Да); при БАР z-1 субъединица
глутаматного NMDA-рецептора (105306 Да). Для количественной оценки этих белков
использовались методы ИФА и количественной масс-спектрометрии. Во всех случаях
выявлено достоверное увеличение количества этих белков в группах больных
эндогенными психическими расстройствами. В частности, в группе больных
шизофренией наблюдается двукратное увеличение концентрации белка mGluR6 в
сыворотке крови (0,765 фмоль/мг) по сравнению с концентрацией данного белка у
здоровых лиц (0,405 фмоль/мг) (р=0,005) (рисунок 1).
Увеличение в сыворотке крови больных эндогенными психическими
расстройствами белков глутаматных рецепторов говорит о серьёзных нарушениях в
системе глутаматергической нейротрансмиссии у этой категории больных.
Существует большое количество работ, свидетельствующих об уменьшении
плотности глутаматергических рецепторов у больных шизофренией (Konradi C.,
Heckers S., 2003; Schwartz T.L. et al., 2012; Moghaddam B., Javitt D., 2012; Колос Е.А. и
др., 2015; Hu W. et al., 2015).
0,9
0,8
*
mGluR6 фмоль/мкг
0,7
0,6
0,5
0,4
Здоровые
Шизофрения
0,3
0,2
0,1
0
Рисунок 1 – Концентрации mGluR6 в сыворотке крови больных шизофренией и
здоровых лиц: первый столбец – здоровые лица, второй – больные шизофренией.
Примечание. * – р˂ 0,05 значимые различия между группой больных шизофренией и
здоровых лиц.
Снижение плотности рецепторов, очевидно, увеличивает синаптическую
активность глутамата, особенно в префронтальной коре и в гиппокампе (Olney et al.,
1991, Homoyoun H., Moghaddam B., 2007). Косвенным признаком отражения этого
процесса в сыворотке крови больных может быть изменение количества самого
нейротрансмиттера глутамата.
По результатам определения количества глутамата в сыворотке крови было
показано, что его уровень у больных расстройствами шизофренического спектра и
БАР достоверно выше, чем у здоровых лиц. Как показано на рисунке 2, у здоровых
лиц уровень глутамата составляет 12,18±5,33 нмоль/мл. Это значение достоверно
отличается от уровня глутамата больных в первой (шизофрения) группе 15,12±4,81
нмоль/мл (р=0,014) и во второй (БАР) 15,89±4,00 нмоль/мл (р=0,0009). Не выявлено
достоверных отличий в концентрации глутамата у больных шизофренией и БАР.
25
* *
Глутамат нм/мл
20
*
15
*
10
5
0
Контроль
Шизофрения
БАР
Шизотипическое
р-во
Рисунок 2 – Концентрация глутамата в сыворотке крови
шизофренией, шизотипическим расстройством, БАР и здоровых лиц.
больных
Примечание. * – р˂ 0,05 значимые различия между группой контроля и больных
шизофренией, БАР; ** – р˂ 0,05 значимые различия между группой ШТР и больных шизофренией,
БАР.
Максимальная концентрация глутамата, в 1,5 раза превышающая контрольные
значения (р=0,0042), обнаружена у больных ШТР (18,95±5,86 нмоль/мл). Различия в
концентрации глутамата у больных ШТР с другими группами больных также
являются достоверными.
В литературе встречаются работы по исследованию концентрации глутамата в
сыворотке крови при депрессии и других расстройствах настроения. При
аффективных расстройствах выявлено увеличение концентрации глутамата в плазме
и СМЖ, а также изменение пропорции глутамат/глутамин (Altamura C.A. et al., 1993,
1995; Levine J., 2000; Mitani H. et al., 2006). Но данных по количеству глутамата в
сыворотке крови при расстройствах шизофренического спектра и БАР нами не
найдено. Существует несколько вариантов объяснения полученных результатов.
Антагонизм метаботропных глутаматных рецепторов, например аутоантителами в
процессе развития патологии, может привести к увеличению внеклеточного
глутамата (Moghaddam B. et al., 1997; Dwyer J.M. et al., 2013). Кроме того, установлен
факт увеличения глутаматергической нейротрансмиссии и активации глутамата при
депрессивных расстройствах (Tokarski K. et al., 2008; Wieronska J.M. et at., 2011). Он
может быть объяснен, в том числе и дефицитом ГАМКергической системы, который
лежит в патофизиологической основе депрессивного расстройства (Fatemi S.H. et al.,
2005; Guidotti A. et al., 2000). Во всех изучаемых нами заболеваниях, депрессия
входила в клиническую картину у многих из обследованных пациентов.
Таким образом, полученные нами результаты обозначают факт наличия
нарушений глутаматергической нейротрансмиссии у больных эндогенными
психическими расстройствами. Выявленные в сыворотке крови больных белки
претендуют на роль потенциальных биологических маркёров нарушения
глутаматергической нейротрансмиссии: белок метаботропного глутаматного
рецептора, z-субъединица NMDA рецептора, количество глутамата в сыворотке
крови.
В результате нашего исследования выявлено, что самое многочисленное
семейство белков, представленное у больных шизофренией, шизотипическим
расстройством и БАР – это белки, ответственные за цитоскелет клетки и
межклеточную адгезию. У больных шизофренией идентифицированы такие белки,
как тирозин-зависимая протеинкиназа ABL 2, актин α-2 и актин α-3, кадгерин-5; у
больных шизофренией и ШТР – мaк-2-связывающий гликопротеин, гельзолин, белок
внеклеточного матрикса 1; у больных БАР – рецептор фактора роста эндотелия
сосудов 1. Выявление всех этих белков говорит о нарушении целостности
межэндотелиальных контактов и барьерных функций мембран эндотелиоцитов и
глиальных клеток, что проявляется в наличии эндотелиальной дисфункции и, как
следствие, повреждении ГЭБ, которому отводится важная роль в патогенезе
шизофрении (Бурбаева Г.Ш. и др., 2008; Pedrosa E. et al., 2008; Говорин Н.В.,
Васильева А.И., 2011).
Из этой группы белков для дальнейшего изучения был выбран кадгерин-5.
Исследования белков кадгериновой группы очень популярны именно при
психических расстройствах. Кадгерины представляют собой суперсемейство
трансмембранных рецепторов, обладающих адгезионными свойствами при белокбелковых взаимодействиях. Некоторые члены этого семейства опосредуют миграцию
нейронов в процессе развития, морфогенез и рост аксонов (Gumbiner B., 2005; PerezMoreno M., Jamora C., Fuchs E., 2003). Включенность семейства кадгериновых белков
в патогенез психических расстройств уже неоднократно показана (Singh S.M. et al.,
2010; Yagi T., 2000; Wu Q., Maniatis T., 1999). Но кадгерин-5 не был представлен в
изученной литературе по психическим расстройствам. Основная функция кадгерина-5
– это обеспечение правильной сборки адгезивных контактов и обеспечение
нормального функционирования эндотелиального барьера (Matsuyoshi N. et al., 1997).
При анализе содержания кадгерина-5 у новорожденных детей с перинатальным
поражением ЦНС, эндотелиальной дисфункцией и повреждением ГЭБ выявлено его
значимое снижение. Автор работы предлагает использовать этот белок как маркёр
вышеназванных состояний (Попова И.Г., 2010). Кадрегин-5 в сыворотке крови
исследуемых групп определялся методом ИФА. При расчете количества кадгерина-5
в сыворотке крови у исследуемых групп больных и здоровых лиц получились данные,
представленные в таблице 2.
Таблица 2 – Содержание кадгерина-5 в крови больных шизофренией, БАР и
здоровых лиц
Кадгерин-5 нг/мл
Шизофрения
БАР
Контроль
Me [Q25;Q75]
2.70
[0.40;5.40]
Me [Q25;Q75]
3.51
[2.09;6.35]
Me [Q25;Q75]
2.73
[1.91;4.84]
Kruskal-Wallis
тест, p
Median
тест, p
0.42
0.55
Достоверных различий в концентрации кадгерина-5 между группами не
выявлено. Но обращает на себя внимание большой разброс значений у больных
шизофренией квартили – [0.40;5.40] и БАР – [2.09;6.35] в сравнении с относительно
однородной ([1.91;4.84]) группой контроля. Этот факт послужил поводом к
дальнейшему исследованию содержания кадгерина-5 у больных в зависимости от
клинических особенностей течения заболевания. В результате дальнейших
исследований достоверные различия (p=0,035) были обнаружены в уровнях
кадгерина-5 между подгруппами больных шизофренией с ведущей позитивной (4.78
[2.71;7.12] нг/мл) и ведущей негативной симптоматикой (1.86 [0.001;4.11] нг/мл)
(рисунок 3).
7
Кадгерин-5 нг/мл
6
5
4
3
2
1
0
1
2
Рисунок 3 – Содержание кадгерина-5 в сыворотке крови больных шизофренией
с ведущей позитивной (1) и ведущей негативной (2) симптоматикой.
Это, по всей видимости, обуславливает наличие более выраженной
эндотелиальной дисфункции у больных с ведущей негативной симптоматикой и, как
следствие, повреждения ГЭБ у этой категории больных. Больные с преобладанием
ведущей негативной симптоматики характеризуются как больные с наиболее тяжело
протекающей болезнью, чаще всего для них характерно безрецидивное течение и
плохой прогноз отвечаемости на терапию. Следовательно, определение количества
кадгерина-5 у больных шизофренией имеет определённые перспективы для
улучшения диагностики психических расстройств.
На рисунке 4 представлена гипотетическая схема участия выявленных белков в
патогенезе эндогенных расстройств. Дисбаланс дофаминово-глутаматного гомеостаза
приводит к активации окислительного стресса (ОС). Генерализованный ОС в
организме больных вызывает экспрессию белка LANCL1 в головном мозге, который
защищает нейроны от АФК (Mayer H., Bauer H., Prohaska R., 2001). Увеличение тока
ионов кальция и активация всех кальций-зависимых процессов наблюдается при
выраженных процессах ОС в головном мозге. Также увеличение Са2+ способствует
деполимеризации внеклеточного актина. Мы предполагаем, что деполимеризованный
актин, связываясь с NMDAR, запускает процесс образования к нему аутоантител, что
может приводить к снижению плотности NMDAR. Кроме того, увеличение Са2+
снижает скорость проведения сигнала по NMDAR (Lei S., 2001). Это приводит к
гипостимуляции тормозных рецепторов и высвобождению глутамата. Избыток
глутамата в синапсах активирует метаботропные глутаматные рецепторы, что
приводит к гиперактивации нейронов. Наличие таких белков, как тирозинзависимая
протеинкиназа ABL 2, актин α-2 и актин α-3, кадгерин-5, VEGF, говорит о нарушении
целостности межэндотелиальных контактов и барьерных функций мембран
эндотелиоцитов и глиальных клеток, что проявляется в наличии эндотелиальной
дисфункции и, как следствие, повреждении ГЭБ, которому отводится важная роль в
патогенезе эндогенных расстройств. Вследствие увеличения проницаемости ГЭБ
многие белки, характерные для головного мозга, оказываются в кровотоке.
Рисунок 4 – Гипотетическая схема участия выявленных белков в патогенезе
эндогенных психических расстройств по собственным результатам и данным
литературы.
Примечание. NMDAR – N-метил-D-аспартатный рецептор; ABL2 – тирозин-протеинкиназа
Aбельсона; mGluR6 – метаботропный глутаматный рецептор; VEGFR1– рецептор фактора роста
эндотелия сосудов 1. ↓– снижение количества;↑ – увеличение количества. Красным цветом выделены
белки, выявленные в нашей работе.
В качестве группы сравнения, для оценки разницы в протеомном спектре
сыворотки крови больных эндогенными и психогенными расстройствами было
выбрано расстройство адаптации с преобладанием депрессивных реакций (F 43.2).
В сыворотке крови больных РА обнаружены следующие белки: гипотетический
белок CAE93899 (14466 Да), ингибитор 3 компонента интер-альфа-трипсина (ITIH1)
(93402 Да), белок специфического фактора удлинения глюкокортикоидных
рецепторов (AF1) (46240 Да), секреторный актин-связывающий белок (PIP) (16562
Да). Все три белка с известными функциями имеют в качестве наиболее
функционально значимой – модуляцию иммунного ответа. Причём изменения в
иммунном ответе, известные при этом расстройстве (Никитина В.Б., 2011), вероятно,
реализуются под действием повышенного содержания глюкокортикоидов. Два других
белка реализуют адаптивный ответ организма на стрессовое воздействие
психогенного фактора.
Ингибитор 3 компонента интер-альфа-трипсина, кроме способности выступать
в качестве противовоспалительного белка (Choi-Miura N.H., 2000; 2001; Kashyap R.S.
et al., 2009), функционально взаимодействует с различными компонентами
внеклеточного матрикса и является важным регулятором восстановления эпителия
после повреждения (Adair J.E. et al., 2009). Способность актин-связывающего белка
связываться с молекулой CD4 и блокировать CD4-опосредованный апоптоз указывает
на то, что этот белок модулирует адаптивный иммунный ответ при расстройстве
адаптации (Autiero M. et al., 1995; Caputo E. et al., 2003).
Наиболее интересной находкой в патогенетическом плане является белок
специфического фактора элонгации глюкокортикоидных рецепторов AF1. Это
наименее исследованный белок из семейства трёх факторов элонгации (AF1, eEF1A1,
EF-Tu) с очень схожими функциями и близким молекулярным весом настолько, что
часто их принимают за изоформы одного белка. Основная известная функция АF1 –
это участие в синтезе белка и ремоделировании цитоскелета, в частности, в
глюкокортикоидных рецепторах. Для наиболее изученного из них – фактора
удлинения 1-альфа 1 (eEF1A1) уже доказано активное участие в регуляции
синаптической пластичности, через регуляцию синтеза белка, в том числе и в
рецепторах минералкортикоидов, также сопряжённых со стрессом (Jump et al., 2014).
Выявление у больных расстройством адаптации с депрессивным эпизодом
специфического фактора элонгации глюкокортикоидных рецепторов свидетельствует
о напряжении гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы этих больных.
Известно, что депрессивное, вызванное стрессом расстройство ассоциируется с
гиперкортицизмом, уменьшением чувствительности глюкокортикоидной обратной
связи и ослаблением функции памяти (Wingenfeld K. et al., 2007).
Для подтверждения этого факта и определения уровня психоэмоционального
стресса у этих больных было предпринято определение количества кортизола в
сыворотке крови больных расстройством адаптации и здоровых лиц, исходя из того,
что кортизол является одним из основных глюкокортикоидных гормонов,
задействованных в патогенезе РА.
В результате исследования показано, что концентрация кортизола у лиц с РА
достоверно выше показателей в группе психически здоровых лиц (рисунок 5).
1200
Кортизол нм/л
1000
800
600
400
200
0
1
2
Рисунок 5 – Концентрация кортизола в сыворотке крови больных
расстройством адаптации: 1- группа, больные расстройством адаптации; 2- группа,
здоровые лица.
Основной функцией повышения кортизола в крови является адаптивный ответ
организма на острый или хронический стресс (Бельтикова К.В., Кочетков Я.А., 2004;
Никитина В.Б., 2011). Состояние психической дезадаптации при РА определяется не
только нарушением биологических механизмов психической деятельности, но и
гормональными факторами (Рядовая Л.А. и др., 2008). При расстройстве адаптации
организм реагирует повышением количества кортизола в крови, ведущего за собой
увеличение функциональной активности глюкокортикоидных рецепторов (Воробьева
О.В., 2009). Этот факт – увеличение функциональной активности рецепторного
аппарата – подтверждается выявлением белка специфического фактора удлинения
глюкокортикоидных рецепторов. Необходимо отметить, что функции всех белков,
выявленных у больных РА, направлены на адаптивный ответ организма.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В ходе сравнительного протеомного анализа сыворотки крови больных
эндогенными и психогенными ПР выявлены достоверные отличия в распределении
белков у всех обследованных лиц. Выявлены достоверные отличия в
электрофоретических картинах распределения сывороточных белков для каждого
заболевания и белковые области, специфично характеризующие каждое расстройство.
Белки, выделенные из этих областей, были идентифицированы с помощью массспектрометрического анализа и ресурса Mascot («Matrix Science», США). В
результаты работы включены белки, специфично присутствующие в сыворотке крови
только одной группы больных и не встречающиеся при остальных ПР и у здоровых
лиц.
Анализ результатов проведённого исследования показал, что больные
эндогенными психическими расстройствами и расстройствами психогенного
происхождения имеют специфичные наборы белков совершенно разной
функциональной направленности. Обращает на себя внимание факт, что при ПР
эндогенного происхождения, которые чаще всего становятся хроническими и
приводят к инвалидизации больных в молодом возрасте, преобладающими оказались
белки, явившиеся по сути следствием хронического патологического процесса в
организме больных. Выявленные белки свидетельствуют о нарушении
глутаматергической нейротрансмиссии и эндотелиальной дисфункции у этих
больных. Подтверждение выявления белка метаботропного глутаматного рецептора и
z-1 субъединицы глутаматного NMDA-рецептора количественными методами
позволяет этим белкам претендовать на роль биомаркёров эндогенных психических
расстройств.
Напротив, функции всех белков, выявленных у больных РА, направлены на
адаптивный ответ организма и свидетельствуют о развившейся острой
воспалительной
реакции.
Белок
специфического
фактора
удлинения
глюкокортикоидных рецепторов AF1 в сочетании с увеличением количества
кортизола констатирует вклад глюкокортикоидов в патогенез этого заболевания.
Безусловно, в нашем исследовании мы смогли отразить лишь некоторые
моменты патогенетического значения белков, выявленных методом протеомного
анализа, в развитии ПР. Но эта работа является хорошим заделом для более
детального изучения функции выявленных белков и оценки их патогенетической
роли и значимости. Надеемся, что эта работа положит основу для дальнейшего
изучения неизвестных моментов патогенеза ПР и может быть началом создания
лабораторной панели для дифференциальной диагностики ПР.
Анализ результатов проведенного исследования позволил сформулировать
следующие выводы.
ВЫВОДЫ
1. Определены отличия в электрофоретических картинах распределения
сывороточных белков методом 1D электрофореза для каждого заболевания и
белковые области, специфично характеризующие шизофрению – 128, 88, 32, 30, 28
кДа; БАР – 200, 150, 84, 75, 49 кДа и расстройство адаптации – 145, 90, 46 кДа.
2. Для каждого психического расстройства путём масс-спектрометрического
анализа выявлены несколько патогенетически значимых белков, характерных только
для данной патологии:
– для больных шизофренией – KRAB-содержащий белок ZNF747, тирозинзависимая протеинкиназа ABL 2; ланк лантибиотик С-1 компонент синтетазы,
гаплоидный зародышевый клеточно-специфический ядерный белок-1, ά актин 2 и ά-3
и белок метаботропного глутаматного рецептора 6 типа;
– для больных шизотипическим расстройством – компонент комплемента C9;
– для больных биполярным аффективным расстройством – z-1 субъединица
глутаматного NMDA-рецептора; рецептор фактора роста эндотелия сосудов 1;
– для больных расстройством адаптации – секреторный актин-связывающий
белок; белок специфического фактора удлинения глюкокортикоидных рецепторов
AF1; гипотетический белок CAE93899 и ингибитор 3 компонента интер-альфатрипсина.
3. Присутствие тирозин-зависимой протеинкиназы ABL 2, актина α-2, актина α3, мaк-2-связывающего гликопротеина, белка внеклеточного матрикса 1, кадгерина-5,
гельзолина и рецептора фактора роста эндотелия сосудов 1 в крови у больных
шизофренией, шизотипическим и биполярно-аффективным расстройствами
свидетельствует о развитии эндотелиальной дисфункции при эндогенных
расстройствах.
4. Высокая концентрация белка метаботропного глутаматного рецептора 6
типа, z-1 субъединицы глутаматного NMDA-рецептора и глутамата в крови больных
шизофренией, шизотипическим и биполярным аффективным расстройством
свидетельствует
о
развитии
типовых
нарушений
глутаматергической
нейротрансмиссии при эндогенных психических расстройствах.
5. Одновременное выявление белка специфического фактора элонгации
глюкокортикоидных рецепторов и увеличение концентрации кортизола в крови
больных расстройством адаптации свидетельствует о закономерном участии
гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы в патогенезе психогенных
расстройств.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК РФ
1.
Логинова Л.В. Масс-спектрометрический анализ белков сыворотки
крови больных шизофренией / Л.В. Логинова, Л.П. Смирнова, В.В. Коваль, О.С.
Фёдорова, А.В. Семке, С.А. Иванова // Бюллетень Сибирского отделения
Российской академии медицинских наук. – 2011. – Т.31, № 6. – С.63-68.
2.
Логинова Л.В. К вопросу поиска биомаркеров при биполярном
аффективном расстройстве / Л.В. Логинова, Л.П. Смирнова, А.А. Серегин, Е.М.
Дмитриева, Е.В. Мазин, Г.Г. Симуткин // Вестник уральской медицинской
академической науки. – 2014. – Т.3, № 49. – С. 139-141.
3.
Дмитриева Е.М. Анализ различий в электрофоретическом распределении
белков сыворотки крови больных шизофренией и здоровых лиц / Е.М. Дмитриева,
Л.П. Смирнова, Л.В. Логинова, А.А. Серегин, Е.Г. Дмитриева, С.А. Иванова //
Вестник уральской медицинской академической науки. – 2014. – Т.3, 49. – С. 209210.
4.
Смирнова Л.П. Первые результаты сравнения протеомов сыворотки
крови больных шизофренией и биполярным аффективным расстройством / Л.П.
Смирнова, Л.В. Логинова, Е.М. Дмитриева, А.А. Серёгин, А.В. Семке, Г.Г.
Симуткин, С.А. Иванова // Сибирский вестник психиатрии и наркологии. – 2016. –
Т.2, № 91 – С.42-47.
5.
Смирнова Л.П. Результаты поиска биомаркеров шизофрении / Л.П.
Смирнова, Д.А. Паршукова, Е.А. Ермаков, Е.М. Дмитриева, А.С. Бойко, О.Ю.
Федоренко, Л.В. Логинова, Н.М. Кротенко, А.А. Серёгин, А.А. Летова, Л.Е.
Синянский, Е.Г. Корнетова, С.А. Иванова // Сибирский вестник психиатрии и
наркологии. – 2018. – Т.2, № 99 – С.33-43.
6.
Smirnova, L. Рroteomics approach to the search for serum protein 3 markers
of schizophrenia and bipolar disorder / L. Smirnova, I. Boksha, A. Seregin, E. Dmitrieva, G.
Simutkin, E. Kornetova, A. Letova, O. Savushkina, L. Loginova, N. Bokhan, V. Zgoda and
S. Ivanova // Proteomes. – 2018. (Подано в печать).
Патент на изобретение
7.
Патент РФ № 2522236. Лабораторный способ дифференциальной
диагностики эндогенных психозов / Л.П. Смирнова, С.А. Иванова, Л.В. Логинова,
В.В. Коваль, Е.Г. Корнетова, А.В. Семке // Бюл. №19, 2014г. Официальная заявка.
Опубликовано 15.05.2014 г.
8.
Патент РФ № 2558056. Лабораторный способ диагностики биполярноаффективного расстройства / Л.П. Смирнова, Л.В. Логинова, С.А. Иванова, В.В.
Коваль, Г.Г. Симуткин // Бюл. № 21,2015г. Официальная заявка. Опубликовано
27.07.2015г.
9.
Патент РФ № 2569741. Лабораторной способ диагностики
шизотипического расстройства / Л.П. Смирнова, Л.В. Логинова, С.А. Иванова, Е.М.
Дмитриева, А.А. Серегин, А.В. Семке, Н.А. Бохан // Бюл.№33, 2015г. Официальная
заявка. Опубликовано 27.11.2015г.
10. Патент РФ № 2578957 Лабораторный способ диагностики ведущей
негативной симптоматики у больных шизофренией / Л.П. Смирнова, Е.Г. Корнетова,
Л.В. Логинова, С.А. Иванова, Б-Х.В. Дармаева, А.В. Семке, Н.А. Бохан Бюл. № 9,
2016г. Официальная заявка. Опубликовано 1.03.2016г.
Медицинские технологии
11. Смирнова Л.П. Лабораторный метод дифференциальной диагностики
шизофрении и острого полиморфного психотического расстройства на основе
электрофоретического анализа белков сыворотки крови: Медицинская технология /
Л.П. Смирнова, Л.В. Логинова, А.А. Серегин, Е.Г. Корнетова, Е.М. Дмитриева, А.А.
Летова, А.В. Семке, С.А. Иванова – Томск: «Иван Федоров», 2016. – 23 с.
12. Смирнова
Л.П.
Лабораторная
диагностика
шизотипического
расстройства на основе определения количества глутамата в сыворотке крови:
Медицинская технология / Л.П. Смирнова, Л.В. Логинова, С.А. Иванова, Е.М.
Дмитриева, А.А. Серегин, А.А. Летова, А.В. Семке, Н.А. Бохан. – Томск: «Иван
Федоров», 2015. – 20 с.
Материалы конференций
13. Логинова Л.В. Сравнительный протеомный анализ белков сыворотки
крови при психических расстройствах / Л.В. Логинова // XLIX МНСК «Студент и
научно-технический прогресс». – Новосибирск, 2010. – С. 35.
14. Логинова Л.В. Сравнительный протеомный анализ белков сыворотки
крови больного шизофренией / Л.В. Логинова, Ф.Ф. Микелев, О.С. Федорова, Л.П.
Смирнова // Современные проблемы психических и соматических расстройств: грани
соприкосновения: сборник тезисов II региональной конференции молодых ученых и
специалистов. – Томск, 2010. – С. 72-73.
15. Былкова А.Ю. Изменения белкового спектра плазмы крови больных
шизофренией / А. Ю. Былкова, Л.В. Логинова, Н.С. Старновская, Ю.Н. Бородюк,
Л.П. Смирнова // Современные проблемы психических и соматических расстройств:
грани соприкосновения: сборник тезисов II региональной конференции молодых
ученых и специалистов. – Томск, 2010. – С. 38-39.
16. Смирнова Л.П. Ответ на окислительный стресс у больных шизофренией /
Л.П. Смирнова, Л.В. Логинова, Н.С. Фаттахов, В.Н. Бунева, В.В. Коваль, О.С.
Федорова, С.А. Иванова // Сборник тезисов ежегодной научной конференции
«Фундаментальные науки медицине». – Новосибирск, 2010. – С.47.
17. Логинова Л.В. Первые результаты поиска маркерных белков
шизофрении в протеомных исследованиях / Л.В. Логинова, Л.П. Смирнова, С.А.
Иванова, О.С. Федорова // Сборник материалов VII Международной конференции
«Молекулярная медицина и безопасность». – Москва, 2010. – С. 117-118.
18. Коваль В.В. Протеомные маркёры психоневрологических заболеваний /
В.В. Коваль, Л.П. Смирнова, Л.В. Логинова, С.А. Иванова, О.С. Федорова // Москва I
Международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в
биологии, лабораторной и клинической медицине». – Москва, 2010. – С. 47.
19. Логинова Л.В. Протеомный анализ белков сыворотки крови при
шизофрении / Л.В. Логинова // Всероссийская 69-я итоговая НСК, посвященная 200ю со дня рождения Н.И.Пирогова. – Томск. – 2010. – С. 324-326.
20. Смирнова Л.П. Первые результаты протеомного анализа сыворотки
больных шизофренией выявили белки окислительного стресса / Л.П. Смирнова, В.В.
Коваль, Л.В. Логинова, О.С. Федорова, С.А. Иванова // Молекулярные механизмы
шизофрении, Сборник трудов I Международной Интернет - Конференции. – КазаньМосква, 2011. – С. 50.
21. Логинова Л.В. Анализ протеома сыворотки крови больных
шизофренией / Л.В. Логинова // 66-й Всероссийской научно-практической
конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные
вопросы современной медицинской науки и здравоохранения». – Екатеринбург, 2011.
– С. 347-349.
22. Логинова Л.В. Исследование белкового спектра больных шизофренией с
помощью масс-спектрометрии - значимый вклад в изучение патогенеза болезни / Л.В.
Логинова, Р.С. Гомбоева // II-й Российской (итоговой) конкурс - конференции
студентов и молодых ученых «Авиценна 2011». – Новосибирск, 2011.– С. 339- 340.
23. Логинова Л.В. Первые результаты протеомного анализа сыворотки
крови больных шизофренией подтверждают наличие окислительного стресса / Л.В.
Логинова // «Фундаментальная наука и клиническая медицина» 14-я всероссийская
конференция «Человек и его здоровье». – Санкт- Петербург, 2011. – С.159-160.
24. Smirnova L.P. Proteomic analysis confirms oxidative stress in patients with
schizophrenia Abstracts of the 10th World Congress of Biological Psychiatry / L.P.
Smirnova, V.V. Koval, L.V. Loginova, O.S. Fedorova, S.A. Ivanova // Prague, Czech
Republic. – 2011. – P. 338.
25. Смирнова Л.П. Использование масс- спектрометрии в анализе белков
сыворотки крови больного с первым психотическим эпизодом / Л.П. Смирнова, В.В.
Коваль, Л.В. Логинова, Ю.В. Герасимова, О.С. Федорова // IV всероссийская
конференция с международным участием «Масс- спектрометрия и ее прикладные
проблемы». – Москва, 2011. – С. 70.
26. Смирнова Л.П. Протеомика сыворотки крови больных шизофренией
выявила маркёры эндотелиальной дисфункции / Л.П. Смирнова, В.В. Коваль, Л.В.
Логинова, О.С. Федорова, В.Я. Семке, С.А. Иванова // II международная научнопрактическая конференции «Постгеномные методы анализа в биологии,
лабораторной и клинической медицине». – Новосибирск, 2011. – С. 98.
27. Коваль В.В. Масс-спектрометрический подход к поиску протеомных
маркёров социально-значимых психических расстройств / В.В. Коваль, Л.П.
Смирнова, Л.В. Логинова, С.А. Иванова, О.С. Федорова // II международная научнопрактическая конференции «Постгеномные методы анализа в биологии,
лабораторной и клинической медицине». – Новосибирск, 2011– С. 86.
28. Smirnova L.P. Search of plasma protein biomarkers for schizophrenia / L.P.
Smirnova, V.V. Koval, L.V. Loginova, O.S. Fedorova, A.V. Semke, S.A. Ivanova //
Международная конференция «Постгеномные технологии для биомедицины». –
Новосибирск, 2012. – С. 110.
29. Дмитриева Е.М. Электрофоретический анализ распределения белков
сыворотки крови больных простой и параноидной формами шизофрении и
шизотипическим расстройством / Е.М. Дмитриева, Р.С. Гомбоева, А.А. Серёгин, Ф.Ф.
Микилев, Л.В. Логинова // «Современные проблемы психических и соматических
расстройств: грани соприкосновения»: материалы II региональной конференции
молодых учёных и специалистов. – Томск. – 2012. – С. 53-54.
30. Логинова Л.В. Белки сыворотки крови больных шизофренией,
выявленные с помощью масс-спектрометрии / Л.В. Логинова // «Современные
проблемы психических и соматических расстройств: грани соприкосновения»:
материалы II региональной конференции молодых учёных и специалистов. – Томск,
2012. – С.76 -78.
31. Коваль В.В. Протеомная стратегия поиска белков сыворотки крови –
маркеров психических расстройств / В.В. Коваль, Л.В. Логинова, Л.П. Смирнова,
С.А. Иванова, О.С. Федорова // Современные проблемы биологической психиатрии и
наркологии: сборник тезисов Третьей Всероссийской конференции с международным
участием. – Томск, 2013. – С. 96-97.
32. Логинова Л.В. Протеомные исследования открывают новые
возможности диагностики эндогенных психозов / Л.В. Логинова, Л.П. Смирнова,
А.А. Серегин, Е.М. Дмитриева, С.А. Иванова, А.В. Семке // XVI научная отчетная
сессия ФГБУ «НИИ психического здоровья» СО РАМН. Российская научнопрактическая конференция «Адаптация больных шизофренией». – Томск, 2013. – С.
161-163.
33. Серегин А.А. Масс-спектрометрический анализ плазмы крови больных
биполярным аффективным расстройством / А.А. Серегин, Л.В. Логинова, Е.М.
Дмитриева // сб. «Материалы V Российской (итоговой) научно-практической конкурсконференции студентов и молодых ученых «Авиценна- 2014». – Новосибирск, 2014. –
С. 90-91.
34. Дмитриева Е.М. Сравнительный анализ распределения белков сыворотки
крови больных шизофренией и биполярным аффективным расстройством / Е.М.
Дмитриева, А.А. Серегин, Л.В. Логинова // Сб. Современные проблемы психических
и соматических расстройств: грани соприкосновения: сборник тезисов IV
региональной конференции молодых ученых и специалистов. – Томск, 2014. – С. 6263.
35. Дмитриева Е.М. Протеомные исследования сыворотки крови больных
шизофренией / Е.М. Дмитриева, Л.П. Смирнова, В.В. Коваль, В.Г. Згода, Л.В.
Логинова, А.А. Серегин, Е.Г. Корнетова, О.С. Федорова, С.А. Иванова // VII
Российский симпозиум «Белки и пептиды». – Новосибирск, 2015. – С. 243.
36. Серегин А.А. Новые возможности лабораторной диагностики
эндогенных психозов с помощью методов протеомики / А.А. Серегин, Л.П.
Смирнова, Е.М. Дмитриева, Л.В. Логинова, А.А. Летова, А.В. Семке, С.А. Иванова //
VII Российский симпозиум «Белки и пептиды». – Новосибирск, 2015. – С. 250.
37. Смирнова Л.П. Протеомные исследования сыворотки крови больных
параноидной шизофренией выявили изменения в метаболизме глутамата / Л.П.
Смирнова, Л.В. Логинова, Е.М. Дмитриева, А.А. Серегин, А.В. Семке, В.Г. Згода,
С.А. Иванова // XVI съезд психиатров России. – Казань, 2015.– С. 123.
38. Дмитриева Е.М. Идентификация различий в белковом спектре сыворотки
крови больных шизофренией и здоровых лиц с помощью масс- спектрометрии / Е.М.
Дмитриева, Л.В. Логинова, В.В. Коваль, Л.П. Смирнова // Актуальные вопросы
психиатрии и наркологии. XVII отчетная научная сессия. – Томск, 2015. – С. 96-98.
39. Смирнова Л.П. Нарушения NMDA-зависимой глутаматергической
передачи выявлено при биполярном аффективном расстройстве / Л.П. Смирнова, Л.В.
Логинова, А.А. Серегин, С.А Иванова // Актуальные вопросы психиатрии и
наркологии. XVII отчетная научная сессия. – Томск, 2015. – С. 203-204.
40. Dmitrieva E. Evidence of damage metabotropic glutamate receptors in patients
with schizophrenia / E. Dmitrieva, L. Smirnova, A. Seregin, L. Loginova, A. Semke, А.
Moisa, S. Ivanova // Abstract book “Mental Health, Direction and Challenges” WPA
Regional Conference. – Tbilisi, 2016. – P. 56.
41. Серегин А.А. Поиск биомаркеров у больных биполярным аффективным
расстройством / А.А. Серегин, Л.П. Смирнова, Е.М. Дмитриева, Л.В. Логинова, С.А.
Иванова, Г.Г. Симуткин // Биомаркеры в психиатрии: поиски и перспективы. Сборник
тезисов Российской конференции с международным участием и школы-семинара
молодых ученых. – Томск, 2016. – С. 112.
42. Дмитриева Е.М. Потенциальный белок-маркер в крови больных
шизофренией / Е.М., Дмитриева, Л.П. Смирнова, А.А. Серегин, Л.В. Логинова, А.А.
Летова, В.Г. Згода, А.В. Семке, С.А. Иванова // Биомаркеры в психиатрии: поиски и
перспективы. Сборник тезисов Российской конференции с международным участием
и школы-семинара молодых ученых. – Томск, 2016. – С. 47.
43. Серегин А.А. Потенциальные патогенетические белковые маркеры
биполярного аффективного расстройства / А.А. Серегин, Л.П. Смирнова, Л.В.
Логинова, Е.М. Дмитриева, Г.Г. Симуткин, С.А. Иванова // Нейронаука для
медицины и психологии: 12-й Международный междисциплинарный конгресс. –
Судак, Крым, 2016. – С. 354.
44. Smirnova L.P. Comparative proteomic analysis of serum from patients with
bipolar disorder and healthy individuals / L.P. Smirnova, A.A. Seregin, L.V. Loginova,
G.G. Simutkin, V.G. Zgoda, S.А. Ivanova // International symposium «cognitive sciences,
genomics and bioinforma. – Novosibirsk, 2016. – P. 55.
45. Смирнова Л.П. «Протеомный поиск маркеров патогенеза эндогенных
психических расстройств» / Л.П. Смирнова, Л.В. Логинова, Е.М. Дмитриева, А.А.
Серегин, А.В. Семке, В.Г. Згода, С.А. Иванова // Научные труды V съезда физиологов
СНГ, V съезда биохимиков России, конференции ADFLIM. – Сочи, 2016. – С.133.
46. Smirnova L.P. Search for biomarkers in bipolar disorder / L.P. Smirnova, A.A.
Seregin, E.M Dmitrieva, L.V. Loginova, S.А. Ivanova, G.G. Simutkin, V.G. Zgoda, // 10th
Central and Eastern European Proteomics Conference. – Budapest, Hungary, 2016. – Р. 83
47. Letova A. Violation of glutamatergic neurotransmission is found in patients
with schizophrenia by the proteomics methods / A. Letova, L. Smirnova, Е. Dmitrieva, А.
Seregin, L. Loginova, A. Semke, S. Ivanova // European archives Psychiatry + Clinical
Neuroscience The 6th European Conference on Schizophrenia Research: Advancing
Research - Promoting Recovery. – Germany, Berlin, 2017. – Vol. 267. – P. 97-98.
48. Smirnova L. Comparative proteomic analysis of serum form patients with
bipolar disorder and paranoid schizophrenia / L. Smirnova, E. Dmitrieva, A. Seregin, L.
Loginova, A. Semke, G. Simutkin, S. Ivanova, V. Zgoda // Book of abstracts of the
International Conference «Clinical Proteomics. Postgenome Medicine». – Москва, 2017. –
P. 60.
49. Seregin A. Features of the serum proteome of patients with adaptation disorder
/ A. Seregin, L. Loginova, A. Letova, E. Dmitrieva, N. Karageorgiy, V. Rudnitckiy, L.
Smirnova // Book of abstracts of the International Conference «Clinical Proteomics.
Postgenome Medicine». – Москва, 2017. – P. 160.
50. Смирнова Л.П. Поиск биологических маркеров эндогенных психических
расстройств с помощью методов протеомики / Л.П. Смирнова, Л.В. Логинова, А.А.
Серегин, П.К. Полежаев, А.В. Семке, С.А Иванова // Современные проблемы
биологической психиатрии и наркологии: сборник тезисов конференции с
международным участием. – Томск, 2018 – С. 134.
Благодарности
Автор выражает глубокую признательность и благодарность руководителю
лаборатории системной биологии и отдела протеомных исследований и массспектрометрии НИИБМХ им. В.Н. Ореховича, г. Москва, д.б.н. Згоде В.Г., н.с., к.б.н.
Мойса А.А., лаборанту-исследователю Новиковой С.Е. того же института за помощь,
оказанную при проведении масс-спектрометрии образцов сыворотки крови
исследованных лиц. Также выражает благодарность руководителю объединенного
центра геномных, протеомных и метаболомных исследований ИХБФМ,
г.Новосибирск, к.х.н. Ковалю В.В. за помощь, оказанную при проведении
исследования и обсуждении результатов.
Список сокращений
ПР – психические расстройства
ШТР – шизотипическое расстройство
РА – расстройство адаптации
ГАМК – гамма-аминомасляная кислота
ПААГ – полиакриламидный гель
ИФА – иммуноферментный анализ
ОС – окислительный стресс
1D электрофорез – одномерный
электрофорез
БАР – биполярное аффективное
расстройство
mGluR6 – метаботропный
глутаматный рецептор 6 типа
ESI– масс- спектрометрия с
ионизацией в электроспрее
MDA – N-метил-D-аспартат
АТ – антитела
Подписано к печати 28.09.2018 г.
Формат 60х841/16. Печать офсетная.
Бумага офсетная № 1.
Гарнитура «Times Roman».
Тираж 100 экз. Заказ №
__________________________________________________
Тираж отпечатан в типографии «Иван Фёдоров»
634026, г. Томск, ул. Розы Люксембург, 115/1
тел.: (3822) 78-80-80, тел./факс: (3822) 40-79-55
E-mail: mail@if.tomsk.ru1
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа