close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Разработка методических подходов для определения содержания бактериальных эндотоксинов в фармацевтических субстанциях

код для вставкиСкачать
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность и степень разработанности темы. Важным критерием
безопасности активных фармацевтических субстанций, используемых в производстве
стерильных
лекарственных
препаратов,
является
показатель
«Бактериальные
эндотоксины», направленный на определение источников пирогенных реакций [Good
Manufacturing Practices (GMP) Guidelines for Active Pharmaceutical Ingredients (APIs),
2013, Неугодова, Н.П., 2000]. Оценку данного показателя выполняют согласно
требованиям
ГФ
РФ
действующего
издания
[Государственная
фармакопея
Российской Федерации XIII издания. Том 1, 2015] и ведущих зарубежных фармакопей
мира [British Pharmacopeia, 2017, European pharmacopoeia 9, 2017, Japanese
Pharmacopoeia, 17th edition, 2016, The United States Pharmacopoeia.  40-th ed.  2017] с
помощью ЛАЛ (Limulus amebocyte lysate) - теста, реактив которого специфически
реагирует с эндотоксином.
Нормативная документация на активные фармацевтические субстанции (АФС),
используемые в производстве стерильных лекарственных препаратов, обязательно
включает раздел «Бактериальные эндотоксины» с нормой предельного содержания
бактериальных эндотоксинов (БЭ) и ссылкой на ОФС 1.2.4.0006.15. В данной статье
приведены общие сведения о выполнении анализа лекарственных средств на наличие
БЭ, но отсутствуют подробные рекомендации для проведения ЛАЛ-теста и не
указаны условия пробоподготовки образцов. Это значительно усложняет процедуру
определения БЭ, особенно в тех случаях, когда изучаемые АФС:
- водонерастворимы,
- окрашены,
- обладают мешающими факторами.
В настоящее время один из наиболее сложных вопросов при определении БЭ в
водонерастворимых АФС является выбор растворителя, так как он может оказывать
влияние на активность эндотоксина и тем самым затруднять получение достоверных
результатов. Согласно лишь единичным разрозненным данным литературы [Williams
Kevin L., 2007] в качестве растворителей можно использовать этиловый спирт 96%,
диметилсульфоксид, диметилформамид, однако данное предположение требует
подтверждения.
3
Цель исследования заключается в разработке методических подходов для
определения
содержания
бактериальных
эндотоксинов
в
фармацевтических
субстанциях.
Задачи исследования:
1.
Провести
сравнительный
анализ
отечественной
и
зарубежной
нормативной документации, регламентирующей условия определения бактериальных
эндотоксинов в образцах АФС.
2.
Установить растворители для водонерастворимых АФС, которые не
обладают мешающими факторами в ЛАЛ-тесте.
3.
Определить методические особенности и разработать универсальную
схему проведения анализа АФС по показателю «Бактериальные эндотоксины».
4.
Разработать методики определения бактериальных эндотоксинов в АФС,
которые обладают мешающими факторами в ЛАЛ-тесте.
5.
Провести валидационные исследования разработанных методик с
помощью обоснованных параметров и критериев их оценки.
Научная новизна работы.
Впервые разработаны методические подходы для определения бактериальных
эндотоксинов,
направленные
на
обоснование
и
оптимизацию
условий
пробоподготовки и проведения анализа фармацевтических субстанций с учетом их
физико-химических свойств (растворимость, вязкость, кислотность, щелочность,
химическое строение и др.).
Обоснована
и
установлена
схема
пробоподготовки
АФС
с
разной
растворимостью, позволяющая исключить ложноотрицательные результаты ЛАЛтеста.
Определены основные критерии выбора растворителя для водонерастворимых
АФС, которые обосновывают отсутствие влияния на биологическую активность БЭ и
реакцию ЛАЛ-реактива с контрольным стандартным образцом эндотоксина.
Усовершенствована методика определения бактериальных эндотоксинов в
фармацевтической субстанции терафтала, способствующая устранению мешающего
фактора и определению реального содержания эндотоксинов в меньшем разведении
основного раствора субстанции.
4
Для анализа водонерастворимой субстанции рифампицина на наличие
бактериальных эндотоксинов установлен и рекомендован этиловый спирт 96%, как
инертный к эндотоксинам растворитель, и не влияющий на результаты испытаний.
Определены и обоснованы критерии выбора метода определения БЭ (гельтромб тест или инструментальные методы), способствующие рациональному
проведению испытаний.
Предложена
процедура
проведения
валидационных
исследований
с
соответствующими параметрами и критериями приемлемости.
Теоретическая и практическая значимость работы:
Разработаны методики определения БЭ в 54 наименованиях АФС с
экспериментальным обоснованием применения рабочего разведения для устранения
мешающих факторов.
На фармацевтическом предприятии ФГУП ГНЦ «НИОПИК» были внедрены
рекомендации, направленные на устранение ложноотрицательных результатов при
определении
БЭ
в
АФС
терафтала
(акт
внедрения
от
23.11.2005 г.).
Для 16 наименований АФС малорастворимых и практически нерастворимых в
воде усовершенствованы методики пробоподготовки.
Впервые
экспериментально
подтверждена
возможность
использования
этилового спирта 96% для определения БЭ в водонерастворимых АФС. Установлена
кратность его разведения в воде, при которой отсутствуют мешающие факторы,
влияющие на результаты опыта.
Установлено, что использование диметилформамида и диметилсульфоксида в
качестве растворителей для водонерастворимых АФС нежелательно.
Материалы диссертации были использованы при подготовке ОФС 1.2.4.0006.15
«Бактериальные эндотоксины» Государственной Фармакопеи ГФ XIII издания,
проекта ОФС «Бактериальные эндотоксины» Государственной Фармакопеи РФ XIV
издания, ФС.2.10032.15 «Рифампицин» (акт внедрения 20.06.2017 г.), а также в
разработке методических рекомендаций «Правила составления, изложения и
оформления нормативной документации на фармацевтические субстанции» (2009 г.).
5
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Критерии выбора растворителя для водонерастворимых фармацевтических
субстанций.
2. Методики определения бактериальных эндотоксинов в фармацевтических
субстанциях.
3. Результаты валидационных исследований разработанных методик.
Методология исследования заключалась в выборе оптимальных условий
проведения испытаний АФС с помощью ЛАЛ-теста, апробации и валидации
разработанных методик.
Степень
достоверности
экспериментальных
работ
и
апробации
использовано
результатов.
оборудование
Для
с
проведения
действующими
свидетельствами о поверке, аттестации, калибровке.
Научные положения и выводы достаточно обоснованы, логически вытекают из
полученных данных, основанных на значимом количестве экспериментальных
исследований, обработанных статистически с помощью компьютерной программы
«Statistica 6.0».
Достоверность первичных материалов подтверждена и не вызывает сомнений.
Апробация работы. Результаты и основные положения работы доложены и
обсуждены на ХIII, ХIV, и ХV Российских национальных конгрессах «Человек и
лекарство», (Москва, 2006, 2007, 2008 г.), заседании секции медицинской и
фармацевтической микробиологии Московского отделения Всероссийского научнопрактического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва,
2017 г.).
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук.
Диссертационная
работа
выполнена
в
рамках
государственного
задания,
утвержденного Минздравом России 29.12.2014 г. на 2015 год и плановый период 2016
и 2017 гг., по НИР «Разработка и совершенствование научно-методических критериев
стандартизации
лекарственных
средств
для
медицинского
применения
и
последующей экспертной оценки их качества» (№ государственной регистрации
115111740008).
6
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные
положения
диссертации
соответствуют
формуле
специальности
14.04.02
-
фармацевтическая химия, фармакогнозия, конкретно пункту 2 «формулирование и
развитие
принципов
обеспечивающих
стандартизации
терапевтическую
и
установление
активность и
нормативов
качества,
безопасность лекарственных
средств», пункту 3 – «разработка новых, совершенствование, унификация и
валидация существующих методов контроля качества лекарственных средств на
этапах разработки, производства и потребления».
Личное участие автора в получении научных результатов. Автору
принадлежит основная роль в определении цели и постановке задач, выборе объектов
исследования,
теоретических
изысканий,
проведении
экспериментальных
исследований, обобщении результатов, а так же представлении материалов
диссертационной работы в виде докладов, публикаций, проектов ОФС.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, из них 4 в изданиях, входящих в «Перечень российских рецензируемых научных журналов и
изданий» ВАК Минобрнауки РФ.
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 120
страницах компьютерного набора, содержит 29 таблиц, 21 рисунков, включает
введение, обзор литературы (глава 1), экспериментальные исследования (главы 2-5),
список цитируемой литературы, содержащий 112 библиографических источников, из
которых 53 работы зарубежных авторов.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
В ходе настоящего информационно-аналитического анализа нормативной
документации (НД) на отечественные и зарубежные АФС 406 серий установлено, что
39% НД нуждаются в уточнении условий пробоподготовки, где в 18% случаев
требуется устранить мешающие факторы, способствующие получению ложных
результатов испытаний. Обнаружено, что в 11% случаев для получения основных
растворов водонерастворимых АФС использовали другие растворители, из них 6% органические (этиловый спирт 96%, диметилформамид, диметилсульфоксид).
7
Объекты исследования
В экспериментальных исследованиях использовали:
- 168 образцов 54 наименований АФС, различающихся по способам
производства (синтетического, биотехнологического и природного происхождения) и
фармакологическим группам: алкилирующие средства (терафтал, цисплатин),
спазмолитические средства (дротаверина гидрохлорид, папаверина гидрохлорид,
платифиллина гидротартрат), витамины и витаминоподобные средства (аскорбиновая
кислота, оксикобаламина гидрохлорид, тиамина хлорид), анальгетики (налтрексона
гидрохлорид, промедол, трамадол, фентанил), электролитные растворы (калия
хлорид, кальция хлорид гексагидрат, магния сульфат), диагностические средства
(гексиловый эфир 5-аминолевулиновой кислоты гидрохлорид, флуоресцеин-ликво),
ноотропы (натриевая соль N-никотиноил гамма-аминомасляной кислоты, пирацетам),
противоопухолевые
паклитаксел,
средства
фталосенс),
(даунорубицина
гормоны
(инсулин
гидрохлорид,
оксалиплатин,
рекомбинантный
человеческий,
медроксипрогестерона ацетат, октреотида ацетат), антибактериальные средства
(диоксидин,
метронидазол), аналептическое средство (cульфокамфорная кислота),
вспомогательные вещества (лимонная кислота моногидрат);
-
растворители:
вода
для
ЛАЛ-теста,
трис-буфер
(трис-
гидроксиметиламинометана гидрохлорида), раствор магния хлорида (10 мМ),
этиловый спирт 96%, диметилформамид, диметилсульфоксид;
Материалы и методы исследования
В работе использовали: - диагностические многокомпонентные наборы для
определения БЭ фирм «Charles River Endosafe», США», «Cambrex», «LONZA»,
«Associates of CAPE COD, Inc»: ЛАЛ-реактив, контрольный стандартный образец
эндотоксина,
- оборудование: суховоздушный нагревательный прибор для инкубации при
температуре 37оС, фотометр для микропланшет со специальным программным
обеспечением на персональном компьютере, автоматические дозаторы с переменным
объѐмом 20–200 мкл и 100–1000 мкл, встряхиватель (вихревая мешалка), рН-метр,
секундомер, штативы для пробирок.
- материалы: наконечники для автоматических дозаторов, круглодонные
пробирки с диаметром 13 мм и 10 мм, микропланшеты стерильные 96-луночные.
8
Для получения экспериментальных данных были использованы следующие
методы:
гель-тромб
тест,
кинетический
турбидиметрический,
кинетический
хромогенный.
Результаты исследований обрабатывали с помощью статистической программы
«Statistica 6.0» (анализ частот, описательная статистика, в том числе вычисление
средних
при
арифметических
P = 95%
с
построением
значений
и
соответствующих
доверительных
графиков).
Для
границ
выявления
неоднородности результатов определения БЭ в разных сериях одних и тех же
препаратов использовали выборочный размах (Q-критерий).
Растворимость фармацевтических субстанций, влияние органических
растворителей на результаты испытания водонерастворимых субстанций по
показателю «Бактериальные эндотоксины»
Испытуемые образцы 54 наименований АФС обладали разной степенью
растворимости в воде: 27% из них мало растворимы или практически нерастворимы в
воде (Рисунок 1). Именно для таких образцов проведено исследование, направленное
на поиск решений для использования органических растворителей: этиловый спирт
96%, диметилформамид, диметилсульфоксид, использование которых наиболее часто
упоминалось в анализируемой нормативной документации.
Очень легко
растворим
Легко растворим
14%
2%
20%
Растворим
11%
Умеренно растворим
8%
8%
37%
Мало растворим
Очень мало
растворим
Практически
нерастворим
Рисунок 1 – Анализ АФС по показателю «Растворимость»
9
Эксперименты
с
вышеперечисленными
органическими
растворителями
проводили в два этапа с помощью гель-тромб теста:
1)
исследование влияния растворителя на активность БЭ;
2)
определение кратности разведения растворителя в воде для ЛАЛ-теста, в
которой отсутствует ингибирование реакции гелеобразования.
В
результате
проведенных
опытов
выявлено,
что
использование
диметилформамида и диметилсульфоксида нецелесообразно, так как они приводят к
разрушению эндотоксина или уменьшению его биологической активности. Об этом
свидетельствуют данные таблицы 1, в которой полученные значения концентрации
БЭ отличаются более чем в два раза от заявленной чувствительности ЛАЛ-реактива.
Таблица 1 – Результаты определения заявленной чувствительности ЛАЛреактива
с
помощью
контрольного
стандартного
образца
эндотоксина,
приготовленного на различных растворителях
Наименование растворителя
Кратность λэ / λ
Вода для ЛАЛ-теста
1
Этиловый спирт 96%
1,2
Диметилформамид
11,3
Диметилсульфоксид
13,47
Условные обозначения: λэ – значение концентрации БЭ в опыте;
λ – истинное
значение концентрации БЭ, равное чувствительности используемого ЛАЛ-реактива
(0,03 ЕЭ/мл).
В опытах с этиловым спиртом 96%, наоборот, было отмечено, что БЭ из
спиртового раствора полностью переходят в водную фазу в условиях интенсивного
перемешивания.
Чувствительность
ЛАЛ-реактива
подтверждена,
так
как
не
отличается более чем в два раза.
Поэтому дальнейшие исследования были выполнены только с использованием
растворов этилового спирта 96%, где ингибирование реакции гелеобразования
устранялось при разведении водой для ЛАЛ-теста, начиная с кратности 1 : 16
(таблица 2).
10
Таблица 2 – Результаты исследования этилового спирта 96% на наличие мешающих
факторов в опытах гель-тромб теста
1:1
1:2
1:4
1:8
1:16
1:32
Отрицательный
контроль этилового
спирта
1






2






Положительный
контроль
этилового спирта
1




+
+
2




+
+
++
Отрицательный
Фактор разведения
№
Положительный
Наименование
исследуемых
образцов
Контроли
воды для
ЛАЛ-теста
 
Условные обозначения: «+» образование плотного геля; «—» отсутствие геля
Таким образом, была доказана возможность анализировать основные растворы
водонерастворимых АФС на этиловом спирте 96% с помощью гель-тромб теста в
разведении не менее чем в 16 раз.
Разработка и совершенствование методик определения содержания
бактериальных эндотоксинов для фармацевтических субстанций
В рамках настоящего исследования выполняли анализы, направленные на
определение БЭ в образцах 54 наименований АФС согласно разработанной схеме,
представленной на рисунке 2.
На первом этапе осуществляли расчет норм предельного содержания БЭ с
учетом международных требований к их количеству и инструкции по применению
для лекарственных препаратов, в производстве которых используется АФС
конкретного наименования. Полученные рассчитанные величины сравнивали с
нормами предельного содержания БЭ на аналогичные лекарственные средства в
ведущих фармакопеях мира и принимали норму с меньшим значением, таким
образом, предъявляя более жесткие требования к безопасности АФС.
11
Анализ инструкции по
медицинскому
применению
лекарственного препарата,
для приготовления
которого используется
АФС
АФС для стерильных ЛП
Анализ ФС,
монографий
отечественных и
зарубежных
фармакопей
Расчет нормы
предельного
содержания БЭ с учетом
максимальной разовой
дозы, вводимой в час
Растворение
АФС в неводном
растворителе
НЕТ
Выбор нормы
предельного
содержания
Растворение АФС в
воде для ЛАЛ-теста
БЭ
БЭ с более
низким
значением
частично
ДА
Растворение АФС при
нагревании или в
большом объеме
Устранение с помощью
разведений водой для
Выбор метода и расчет
ЛАЛ-теста
МДР препарата, для
воды для ЛАЛ-теста
приготовления
которого используется
АФС
используется АФС
Исследование
влияния
растворителя на
БЭ и ЛАЛ-реактив
Качественный
анализ
Наличие
мешающих
факторов
Количественный анализ
ДА
Устранение с
помощью
разведений водой
для ЛАЛ-теста
ДА
НЕТ
НЕТ
Валидация рабочего
разведения
ДА
Методика определения
БЭ в АФС для
стерильных ЛП
НЕТ
Устранение с использованием
специальных буферных
растворов, реагентов и пр.
Рисунок 2– Универсальная схема определения БЭ в АФС
12
Пробоподготовка образцов АФС включала следующие процессы:
1. Готовили исходный раствор с концентрацией, близкой или равной
содержанию
исследуемой
АФС
в
лекарственном
препарате,
учитывая
содержание активного вещества и влаги.
2. Выполняли оценку растворимости, возможности растворения в воде для
ЛАЛ-теста и других растворителях.
3.
Устанавливали
соответствующие
условия
растворения
для
малорастворимых в воде АФС. Например, диоксидин, инозин, метронидазол
растворяли в воде для ЛАЛ-теста при нагревании 370С до получения
прозрачного и однородного раствора для дальнейших испытаний. Липоевую
кислоту, паклитаксел, рифампицин растворяли в этиловом спирте 96%, как в
наиболее подходящем растворителе и не оказывающем влияние на БЭ.
4. Определяли pH основных водных растворов АФС. В случае
возникновения значительных отклонений от оптимального диапазона (pH=6-8),
например, при приготовлении растворов дротаверина гидрохлорида, папаверина
гидрохлорида,
сульфокамфорной
кислоты,
платифиллина
гидротартрата
готовили 5-, 10-, 20-кратные разведения основных растворов АФС и наблюдали
динамику
изменения
водородного
показателя.
Далее
выбирали
метод
определения БЭ, ориентируясь на критерии, представленные в таблице 3.
В качестве метода исследования и разработки методик определения БЭ в
испытуемых образцах АФС был выбран гель-тромб тест, как наиболее
доступный, общепринятый метод определения и являющийся арбитражным.
Кроме того, основные растворы нескольких наименований исследуемых АФС
(например, даунорубицин, рифампицин, терафтал, флуоресцеин-ликво) имели
окраску,
способную
влиять
на
результаты
инструментальных
методов
определения.
13
Таблица 3 – Основные критерии выбора метода определения БЭ
№
Критерии выбора
Гель-тромб тест
1
Техническое оснащение
Инкубирующий прибор
(термоблок)
2
Свойства
образцов
испытуемых Возможность
определения БЭ в любом
растворе
3
Кратность
наличие
факторов
МДР
и Подвержен
влиянию
мешающих мешающих факторов
4
Количество испытуемых Количество,
образцов
анализируемых образцов
зависит от возможности
инкубационного
прибора
(бани
или
термоблока)
Наличие программного Не
предусмотрено, Автоматический учѐт
обеспечения
только
визуальная результатов
оценка результатов
фиксируются
и
архивируются
с
помощью
компьютерной
программы
5
С
учетом
чувствительности
используемого
Инструментальные
методы
Вертикальный
фотометр
для
микропланшет
с
перемешиванием
и
подогревом
Сложно
оценивать
мутные,
вязкие,
цветные растворы и
растворы,
образующие пену
Высокая
чувствительность
позволяет увеличить
кратность разведения
и уменьшить влияние
мешающих факторов
На
одном
микропланшете
можно
оценить
качество около 20
образцов
ЛАЛ-реактива,
норм
предельного содержания БЭ и концентраций основных растворов АФС
проводили расчет значений максимально допустимого разведения (МДР),
которые варьировались от 1 до 5600.
14
Выполняли качественный анализ в МДР, устанавливая соответствие
рассчитанной норме предельного содержания БЭ в испытуемых образцах. Затем
с помощью гель-тромб теста определяли реальное содержание БЭ в основных
растворах АФС.
Для
количественного
анализа
готовили
два
параллельных
ряда
двукратных последовательных разведений в воде для ЛАЛ-теста или на
специальных
растворителях,
не
превышающих
кратность
рассчитанного
максимально допустимого разведения. Одновременно для «положительного
контроля раствора АФС (контроля ингибирования)», делали два параллельных
ряда таких же разведений АФС, но на растворе контрольного стандартного
образца эндотоксина. Концентрация эндотоксина в каждом из разведений
составляла значение в два раза превышающее чувствительность ЛАЛ-реактива
(2λ).
Результаты
количественного
анализа
необходимы
для
получения
следующей информации:
1) стабильность образцов;
2) наличие мешающих факторов;
3) кратность разведения для подтверждения его в качестве рабочего разведения.
В проведенных экспериментальных исследованиях было установлено, что
76% изучаемых АФС оказывали ингибирующее действие на реакцию
гелеобразования с ЛАЛ-реактивом.
Для дальнейшей апробации методик предпринимали меры по устранению
интерференции
со
стороны
испытуемых
растворов
фармацевтических
субстанций. Причины возникновения ингибирования и целесообразные способы
их устранения представлены в таблице 4.
Разведение основного раствора АФС вплоть до ½ МДР первоначально
позволило устранить мешающие факторы. В случаях, где была небольшая
кратность МДР, вместо воды для ЛАЛ-теста использовали трис-буферные
растворы, корректирующие pH и оптимальный состав катионов (Таблица 5). В
установленных
концентрациях
АФС
оценивали
содержание
БЭ.
15
Таблица 4 – Причины и способы устранения ингибирования
Причина
Решение
Значение pH испытуемой смеси не
соответствует
оптимальному
диапазону для проведения
испытания
Разведение образца до максимально
допустимого разведения;
2.
Добавление
или
разведение
растворами кислот или щелочей;
3.
Разведение образца в буферных
растворах.
Агрегация
и
адсорбция 1.
Разбавления
диспергирующими
эндотоксина в положительном растворами в максимально допустимых
контроле
пределах;
2.
Не использовать полипропи-леновые
материалы на всех этапах тестирования, за
исключением наконечников для пипеток;
3.
Активное вихревое смешивание.
Недостаточная
концентрация 1.
Разведение образца до максимально
катионов
допустимого разведения;
2.
Использование
трис-буферных
2+
растворов с катионами Ca и Mg2+
1.
Таблица 5 – Концентрации образцов в трис-буферном растворе, при
которых устраняется ингибирование в гель-тромб тесте
Наименование
АФС
Липоевая кислота
Аскорбиновая
кислота
Лимонная кислота
Налтрексона
гидрохлорид
Концентрация
основного
раствора АФС,
(мг/мл)
25
Концентрация
раствора АФС без
ингибирования,
(мг/мл)
0,3
Кратность
разведения АФС
без
ингибирования
80
50
6,3
8
100
1,6
64
10
5,0
2
В процессе экспериментальной работы была установлена другая причина
ингибирования реакции гелеобразования со стороны субстанции терафтала.
Образцы
данной
АФС обладали
комплексообразующими свойствами в
отношении двухвалентных ионов, необходимых для поддержания оптимума
ферментативной
активности
ЛАЛ-реактива.
Недостаточное
количество
свободных катионов являлось причиной ингибирования магний-зависимой
16
реакции гелеобразования. Поэтому для устранения данного мешающего фактора
использовали 10 мМ раствор магния хлорида, что позволило определить
содержание БЭ не только в кратности, близкой к МДР (1: 691), но и в разведении
вплоть до ¼ МДР (1:160). Таким образом, стало возможно оценивать образцы
данной АФС с большим запасом надежности (Таблица 6).
Таблица 6 – Содержание бактериальных эндотоксинов в терафтале
Растворитель субстанции
терафтала
Кратность разведения, в
которой не наблюдается
ингибирование
Содержание БЭ,
(ЕЭ/мг)
640
1,92
160
0,48
вода для ЛАЛ-теста
раствор магния хлорида
(10 мМ)
В связи с тем, что валидированные рабочие разведения являются одной из
важных составляющих методики определения БЭ, на основании результатов
количественного анализа подбирали рабочее разведение основного раствора для
АФС всех наименований. При выборе руководствовались следующими
условиями:
1)
в разведении раствора не обнаружено БЭ и мешающих факторов;
2)
кратность рабочего разведения как минимум в 2 раза меньше
максимально допустимого разведения, то есть равным или менее ½ МДР.
Для оценки применимости рабочего разведения сравнивали полученные
значения чувствительности ЛАЛ-реактива с раствором эндотоксина в воде для
ЛАЛ-теста и в растворах АФС. В результате проведѐнных экспериментов для
всех исследуемых образцов была
подтверждена чувствительность ЛАЛ-
реактива: значение не отличалось более чем в два раза от значения заявленной
чувствительности. В выбранных рабочих разведениях основного раствора всех
исследуемых
наименований
АФС
не
наблюдалось
ингибирования
или
потенцирования реакции ЛАЛ-реактива с эндотоксином.
Использование установленных рабочих разведений позволило оценить
реальное содержание БЭ. Показана значимая разница между рабочим
разведением (РР) основного раствора АФС и максимально допустимым (МДР)
на примере нескольких АФС (Рисунок 3).
17
400
350
300
250
200
150
100
50
0
МДР
РР
Рисунок 3 – Сравнение кратностей разведения для основных растворов
фармацевтических субстанций
Валидация методик определения бактериальных эндотоксинов
В рамках настоящего исследования для каждого метода были определены
параметры валидации и критерии их оценки с учетом отечественного и
международного опыта [Юргель Н.В., 2007, The United States Pharmacopoeia. 
40-th ed.  2017] (таблица 7).
Таблица 7 – Параметры, определяемые при валидации методов
определения БЭ
Параметр
Гель-тромб тест
Кинетические тесты
Специфичность
Да
Да
Предел обнаружения
Да
Да
Линейность
Нет
Да
Прецизионность
Нет
Да
Правильность
Нет
Да
В процессе работы выполнена валидация методик определения БЭ в АФС
с обработкой экспериментальных данных и оценкой валидационных параметров.
Для этого выполняли сравнительные испытания образцов АФС (декстроза
моногидрат, кальция хлорид гексагидрат, магния сульфат, натрия хлорид,
пирацетам) согласно разработанным методикам с помощью гель-тромб теста и
параллельно кинетическими методами (турбидиметрическим и хромогенным).
18
Результаты гель-тромб теста фиксировали и оценивали визуально. В
кинетических
тестах
с
помощью
автоматизированного
программного
обеспечения получали результаты, которые статистически оценивали по
выбранным и обоснованным параметрам.
Показано, что достоверную оценку наличия БЭ возможно осуществлять с
помощью любого из вышеуказанных методов в установленном и доказанном
рабочем разведении анализируемой субстанции, при котором все критерии
приемлемости соответствуют заявленным нормам. Результаты обобщены в
таблице 8.
Таблица 8 – Критерии приемлемости в сравнении с результатами
испытаний.
Параметр
Специфичность
Критерии
Результаты
Возможность определения
Подтверждена
БЭ
среди
остальных
возможность
пирогенных примесей в
определения БЭ в
опытах с использованием
АФС
контрольного стандартного
образца эндотоксина
Минимальная
обнаружи- Для гель-тромб теста:
ваемая концентрация БЭ
0,06 - 0,30 ЕЭ/мл
гель-тромб тестом –
В кинетических
от 0,03 ЕЭ/мл и выше;
методах:
кинетическими методами 0,019 - 0,060 ЕЭ/мл
от 0,005 ЕЭ/мл и выше
Для
отрицательного
0 – 20%
контроля СV<20%
Предел обнаружения
Прецизионность
(для кинетических
методов)
Линейность
(для кинетических
методов)
Правильность
(для кинетических
методов)
R > 0,980
CV≤10 %
R = 0,992 - 0,996
CV ≤10%
50–200 %
68 – 108%
Отклонений результатов валидационных исследований от установленных
критериев приемлемости не было выявлено. Следовательно, разработанные
методики
пригодны
для
определения
БЭ
в
АФС,
используемых
для
парентеральных лекарственных препаратов.
19
ВЫВОДЫ:
1)
Результаты
сравнительного
анализа
отечественной
и
зарубежной
нормативной документации 406 наименований АФС (131 отечественных и 275
зарубежных) свидетельствуют о необходимости регламентирования условий
определения бактериальных эндотоксинов в образцах. Установлено, что 39% НД
нуждаются в уточнении условий пробоподготовки и совершенствовании
методики определения БЭ в них.
2)
Доказана возможность использования этилового спирта 96% в качестве
растворителя водонерастворимых АФС
при определении бактериальных
эндотоксинов. Применение диметилформамида и диметилсульфоксида для
указанной цели нецелесообразно в связи с разрушением бактериальных
эндотоксинов.
3)
Определены
теоретические,
экспериментальные
и
методические
особенности всесторонней оценки качества АФС по показателю «Бактериальные
эндотоксины», которые были положены в основу универсальной схемы
проведения ЛАЛ-теста. Предложенный подход представляет собой оптимальное
сочетание методов и условий проведения анализа, обеспечивающее исключение
ложных результатов.
4)
Разработаны методики определения бактериальных эндотоксинов в АФС с
учѐтом растворимости и мешающих факторов. 76% наименований АФС
оказывали ингибирование реакции эндотоксина с ЛАЛ-реактивом за счет
мешающих факторов, а в 27% случаев подобранные оптимальные условия
растворения
или
соответствующие
растворители
позволили
получить
достоверные результаты.
5)
тромб
Выполнены валидационные исследования АФС пяти наименований гельтестом
эндотоксинов
Сравнительные
и
со
кинетическими
методами
статистической
результаты
по
оценкой
параметрам
определения
бактериальных
выбранных
специфичность
параметров.
и
предел
обнаружения отвечали заданным критериям приемлемости. Для кинетических
методов правильность находилась в пределах от 50 до 200%, коэффициент
вариации (СV) для параметра прецизионность имел значение <20%, с помощью
20
рассчитанного коэффициента корреляции R>0,98 подтвердили линейность в
области действия методики.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1.
Долгова,
Г.В.
Определение
бактериальных
эндотоксинов
в
фармацевтических субстанциях, используемых для изготовления инфузионных
растворов / Г.В. Долгова, Н.П. Неугодова, О.В. Шаповалова, Г.А.
Сапожникова , Ж.И. Аладышева // Ведомости Научного Центра экспертизы
средств медицинского применения. – 2006. – №2 – С.67 – 74.
2.
Шаповалова, О.В. Разработка раздела Бактериальные эндотоксины на
фармацевтические субстанции для Государственной фармакопеи XII / О.В.
Шаповалова, Г.В. Долгова, Г.А. Сапожникова, Н.П. Неугодова // ХIII
Российский национальный конгресс Человек и лекарство, Москва 3-7 апреля
2006 г., М., – 2006 г., С. 770 – 771.
3.
Шаповалова, О.В. Определение бактериальных эндотоксинов в
фармацевтической субстанции, нерастворимой в воде / О.В. Шаповалова, Г.В.
Долгова, Г.А. Сапожникова, Н.П. Неугодова // ХIV Российский национальный
конгресс «Человек и лекарство», Москва 16-20 апреля 2007 г., М., – 2007 г., С.
38.
4.
Шаповалова, О.В. Долгова Г.В., Сапожникова Г.А., Неугодова Н.П. /
«Определение пирогенных примесей в опытах на кроликах in vivo и с помощью
ЛАЛ-теста in vitro» // ХV Российский национальный конгресс «Человек и
лекарство», Москва 14-18 апреля 2008 г., М., – 2008 г., С. 570.
5.
Меркулова, Ю.В. Особенности проведения испытания на бактериальные
эндотоксины лекарственных средств в виде масляных растворов / Ю.В.
Меркулова, Г.В. Долгова, Л.А. Чайка, О.Н. Гомон, Н.П. Неугодова, О.В.
Шаповалова // Фармаком. – 2008. – №1. – С. 67 – 73.
6.
Шаповалова, О.В. Особенности проведения разработки раздела
Бактериальные эндотоксины для субстанций антибиотиков / О.В. Шаповалова,
Н.П. Неугодова, Г.В. Долгова, Г.А. Сапожникова // Антибиотики и
химиотерапия. – 2008. – № 53. – С. 34 – 38.
7.
Шаповалова, О.В. Методические подходы к разработке показателя
«Бактериальные эндотоксины» в фармацевтических субстанциях / О.В.
Шаповалова, Н.П. Неугодова, Г.В. Долгова, Г.А. Сапожникова // Ведомости
Научного Центра экспертизы средств медицинского применения. – 2012. – №2. –
С.47 – 50.
21
8.
Шаповалова, О.В. Использование органических растворителей для
определения показателя «Бактериальные эндотоксины» в фармацевтических
субстанциях, нерастворимых в воде / О.В. Шаповалова, Г.В. Долгова, Н.П.
Неугодова, Г.А. Сапожникова // Антибиотики и химиотерапия. – 2013. – № 58.
– С. 41 – 44.
9.
Шаповалова, О.В. Альтернативные биологические методы оценки
качества лекарственных средств /О.В. Шаповалова, Н.П. Неугодова, М.С.
Рябцева, А.А. Агаширинова, О.В. Гунар //Фармация. – 2017. – № 2. – С.7 –10.
10. Шаповалова, О.В. Влияние мешающих факторов и подходы к их
устранению при определении бактериальных эндотоксинов в лекарственных
средствах / О.В. Шаповалова, Н.П. Неугодова, Г.А. Сапожникова, А.А.
Агаширинова, О.В. Гунар // Фармация.– 2017. – № 6. –– С. 9 – 14.
Используемые сокращения
АФС
– активная фармацевтическая субстанция
БЭ
– Бактериальные эндотоксины
ГФ
– Государственная Фармакопея
ДМСО
– Диметилсульфоксид
ДМФА
– Диметилформамид
ЕЭ
– Единица эндотоксина
МДР
– Максимально допустимое разведение
НД
– Нормативная документация
ПЗЧ
– Подтверждение заявленной чувствительности
РР
– Рабочее разведение
РФ
– Российская Федерация
λ
– Чувствительность ЛАЛ-реактива (ЕЭ/мл)
22
ШАПОВАЛОВА ОЛЬГА ВЛАДИМИРОВНА
РАЗРАБОТКА МЕТОДИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ ДЛЯ
ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ
ЭНДОТОКСИНОВ В ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ СУБСТАНЦИЯХ
14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учѐной степени
кандидата фармацевтических наук
Формат __×__/__ Усл.п.л. __
Тираж ___ экз.
Подписано в печать
Заказ №
Типография , тел.
адрес
сайт
23
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа