close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Молекулярно-генетические особенности патогенеза регионарного метастазирования рака желудка

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
ТАТИМОВ Мартин Замирович
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
ПАТОГЕНЕЗА РЕГИОНАРНОГО МЕТАСТАЗИРОВАНИЯ
РАКА ЖЕЛУДКА
14.01.12-онкология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Ростов-на-Дону, 2018
2
РАБОТА ВЫПОЛНЕНА В ФЕДЕРАЛЬНОМ ГОСУДАРСТВЕННОМ БЮДЖЕТНОМ
УЧРЕЖДЕНИИ «РОСТОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ
ИНСТИТУТ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Научный руководитель:
доктор
медицинских
корреспондент РАН
Кит Олег Иванович
наук,
профессор,
член-
Людмила Николаевна
– доктор
Официальные оппоненты: Любченко
медицинских наук, Федеральное государственное
бюджетное учреждение «Национальный медицинский
исследовательский центр онкологии имени Н.Н.
Блохина» Министерства здравоохранения Российской
Федерации, руководитель лаборатории клинической
онкогенетики
Немцова
Марина
Вячеславовна
–
доктор
биологических
наук,
профессор,
федеральное
государственное
автономное
образовательное
учреждение высшего образования Первый Московский
государственный медицинский университет имени
И.М. Сеченова Министерства здравоохранения
Российской Федерации (Сеченовский Университет),
заведующая лабораторией медицинской генетики
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное учреждение
«Российский научный центр рентгенорадиологии»
Министерства
здравоохранения
Российской
Федерации.
Защита диссертации состоится « ___ » ___________ 2018 г. в ____ часов на
заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д.208.083.02 при
федеральном государственном бюджетном учреждении «Ростовский научноисследовательский онкологический институт» Министерства здравоохранения
Российской Федерации (344037, г. Ростов-на-Дону, 14-я линия, 63).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте www.rnioi.ru
федерального государственного бюджетного учреждения «Ростовский научноисследовательский онкологический институт» Министерства здравоохранения
Российской Федерации
Автореферат разослан « ____ » ________________ 2018 г.
Ученый секретарь совета
по защите докторских и кандидатских диссертаций,
доктор биологических наук
Дженкова Е.А.
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования
Рак желудка занимает пятое место среди наиболее распространенных злокачественных новообразований и третье место среди ведущих причин смертности от рака по всему миру (Ferlay J. etal., 2012). Аденокарцинома желудка составляет 95% от общего числа злокачественных новообразований данного органа
(Dicken B.J. etal., 2005). Метастазы же выявляются у 90% больных, при этом выживаемость составляет 65% на ранней стадии заболевания и менее 15% в случае
поздней диагностики онкологического процесса (TakujiG. etal., 2000). Россия относится к странам с высокой заболеваемостью раком желудка – 30–40 случаев на
100 000 населения. Летальность больных в течение года с момента установления
диагноза в России достигает 50% (Каприн А.Д. и соавт., 2017).
Несмотря на усовершенствование терапевтических методов за счет сочетания хирургических методов, радио- и химиотерапии, большая часть случаев рака
желудка диагностируется на поздних стадиях и имеет ограниченные варианты
лечения и плохой прогноз (Torre L.A. etal., 2012). В силу этого поиск более чувствительных методов детекции, а, следовательно, и предиктивных и прогностических онкомаркеров является актуальным.
В течение прошлого десятилетия предложен список молекулярных прогностических факторов, который основан на изучении механизмов, определяющие агрессивность рака желудка (Колобаев И.В., 2009; Nitti D. etal., 2008). Важную роль в онкоморфологии начали занимать методы молекулярной биологии и
медицины, такие как иммуногистохимическое исследование маркеров р53, bcl-2,
Ki-67, her2neu для оценки метастатической и пролиферативной активности опухолевых клеток (Петров С.В., Райхлин Н.Т., 2004).
Генетическим факторам в последние годы уделяется все большее внимание, так как они играют важную роль в определении риска развития рака желудка, и являются обязательными для понимания канцерогенеза и патогенеза метастазирования в целом (Степанов И.В. и соавт., 2010). Важную роль играют исследования показателей генетической нестабильности (СNV).
4
Степень разработанности темы
Вариация числа копий гена – это однин из основных механизмов изменения генов-супрессоров опухолей и уровня экспрессии онкогенов и клетками рака (Chambers I., Tomlinson S.R., 2009). Copynumbervariation (CNV) – генетический полиморфизм, который возникает в результате несбалансированных хромосомных перестроек, таких как дупликации и делеции. Вариации могут проявиться повышением или снижением числа копий определенного гена, в результате
чего повышается или понижается экспрессия продукта гена – некодирующей
РНК или белка (Chen Z. etal., 2009).
Начиная с 2004 года в многочисленных исследованиях были представлены
данные о наличии множества субмикроскопических вариаций числа копий сегментов ДНК. Минимум 12% человеческого генома подвергается вариациям числа копий. Вклад CNVs в вариативность генома сопоставим с вкладом однонуклеотидных полиморфизмов или даже превышает его (Redon R. etal., 2006).
Анализ литературы позволяет сделать заключение о том, что роль CNV в
качестве фактора малигнизации тканей желудка была обнаружена в начале
2000-х годов. Публикации последних лет показывают, что CNV являются следующим уровнем в полном понимании молекулярного контекста развития опухолевого процесса, включая метастазирование (AndrewsJ. etal., 2010). Амлификации генов HER2, CCNE1, MYC, KRAS и EGFR обнаружены в 9, 5, 2, 1 и 1%
случаев метастатического рака желудка соответственно (Kim S. etal., 2014).
CNV играют важную роль в онко-трансформации многих видов рака, таких как рак желудка, рак яичников, печеночно-клеточный рак, колоректальный
рак, рак мочевого пузыря и так далее. Накопление CNV во время канцерогенеза
желудка может быть результатом отбора, с помощью которого трансформированные клетки получают эволюционное преимущество. Показано, что копии
генов-эффекторов апоптоза часто теряются во время развития рака, по сравнению с частой амплификации генов, связанных с пролиферацией (Liang L. etal.,
2015).
5
Недавние исследования выявили многочисленные увеличения (амплификации) и уменьшения (потери) в копийности генов у пациентов с раком желудка, причем амплификации более распространены, чем потери копий. Так же
определены участки хромосом, где наблюдаются амплификации – 3p22, 4q25,
8q24, 11p13 и 20q13, и потери копий генов – 1p36 и 9p21, связанных с раком
(CTNNB1, MYC, CDKN2A, top2a и так далее) (Deng N. etal., 2012).
CNV являются важными факторами влияния на экспрессию генов, регулирующих деятельность различных онкогенных или опухоль-подавляющих
путей. Это может объяснить клиническую значимость многих CNV при раке
желудка. У больных раком желудка с метастазами в лимфатические узлы имеется заметно больше CNV, чем в случаях без метастазов. Кроме того, в ряде
исследований установлено, что частые амплификации наблюдаются на хромосомах 1q, 5p, 7, 8, 13 и 20, а потери копий генов наблюдаются на хромосомах
1p, 3p, 4, 5q, 9P, 17р, 18q, 19p, 21 и 22. Хотя большое количество CNV областей было идентифицировано при раке желудка, эта область по-прежнему требует дальнейшего исследования, для определения и других затронутых генов,
играющих важные роли в развитии рака желудка (Liang L. etal., 2015). Это и
определяет цель настоящего исследования.
Цель исследования
Выявить факторы прогноза регионарного метастазирования рака желудка
на основе изучения иммуногистохимических, молекулярно-генетических особенностей первичной опухоли.
Поставленная цель достигалась решением следующих задач:
1.
Изучить особенности показателей генетической нестабильности
(CNV) при раке желудка с поражением и без поражения регионарных лимфоузлов.
2.
Исследовать экспрессию молекулярно-биологических маркеров
(р53, bcl-2, Ki-67, her2neu) в опухоли желудка с поражением и без поражения
регионарных лимфоузлов.
6
3.
Изучить влияние различных факторов на первичную распростра-
ненность у больных раком желудка
4.
Разработать алгоритм прогнозирования развития регионарного ме-
тастазирования рака желудка с инвазией Т3-4а, на основе изучения иммуногистохимических, молекулярно-генетических особенностей первичной опухоли.
Научная новизна
В диссертационной работе впервые проанализированы особенности показателей генетической нестабильности (CNV) в комплексе с особенностями экспрессии молекулярно-биологических маркеров (р53, bcl-2, Ki-67, her2neu) в
первичной опухоли с поражением и без поражения регионарных лимфоузлов
при раке желудка.
На основе полученных данных разработан алгоритм прогнозирования
риска развития регионарного метастазирования при раке (G2-3 аденокарцинома) желудка с инвазией T3-4а.
Теоретическая и практическая значимость работы
Показано влияние различных факторов внейшней среды на первичную
распространенность у больных раком желудка с инвазией T3-4а.
В клиническую практику внедрен метод, позволяющий прогнозировать
развитие метастазов в регионарные лимфоузлы при раке (G2-3 аденокарцинома) желудка с инвазией T3-4а, что позволило индивидуализировать подход к
адъювантному лечению больных.
Предложен способ прогнозирования развития метастазов у пациентов с
аденокарциномой
желудка
на
основе
комбинированного
молекулярно-
генетического (CNV генов NFKB и HER2) и иммуногистохимического (экспрессия белков KI67 и HER2) подхода.
Методология и методы диссертационного исследования
Методы научного познания и последовательное их применение, явилось
методологической основой диссертационной работы, которая выполнялась в
дизайне открытого проспективногосравнительного исследования с использованием общеклинических, анамнестических, лабораторных и статистических
методов исследования.
7
Внедрениерезультатов исследования в практику здравоохранения
На основании результатов данного исследования проводятся обследование
больныхв
отделениях
абдоминальной
онкологии
и
клинико-
диагностическом отделении ФГБУ «РНИОИ» Минздрава России.
Основные положения, выносимые на защиту
1.
Проведенный анализ роли факторов риска заболевания метаста-
тическим раком желудка дал возможность определить степень значимости
каждого фактора.
2.
Проведенное ИГХ-исследование выявило достоверное различие в
экспрессии клетками опухоли биологических онкомаркеров, а так же различие
пролиферативного потенциала в опухоли желудка с поражением и без поражения регионарных лимфоузлов.
3.
Показано, что относительная копийность (RCQ) исследованных 15-
ти ядерных и одного митохондриального генетических локусов в опухолях желудка с наличием метастазов в регионарные лимфатические узлы и без них изменяется не одинаково. Были выявлены характерные для аденокарциномT34N1-3M0 набор и частота аберрантных RCQ.
4.
Показано, возможность с высокой точностью прогнозировать тече-
ние аденокарцином желудка, с помощью разработанного алгоритм прогнозирования развития метастазов у пациентов с раком желудка на основе комбинированного молекулярно-генетического (CNV генов NFKB и HER2) и иммуногистохимического (экспрессия белков KI67 и HER2) подхода.
Степень достоверности
Определяется достаточным количеством больных, включенных в исследование, адекватным формированием групп сравнения, разнообразностью методов исследования, современными методами статистической обработки. В
диссертационной работе положения, выносимые на защиту, выводы и практические рекомендации сформулированы грамотно и являются логическим заключением системного анализа полученных результатов.
8
Апробация диссертации
На заседании Ученого Совета при ФГБУ «РНИОИ» Минздрава России,
08 июня 2017 года состоялась апробация диссертации. Материалы исследования представлены: на ESMO 18th World Congresson Gastrointestinal Cancer 29
June–2 July 2016 Barcelona, Spain; на II всероссийской конференции по молекулярной онкологии 6-8 декабря 2016, Москва.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Научные положения диссертационной работы соответствуют пункту 2
«Исследования по изучению этиологии и патогенеза злокачественных опухолей, основанные на достижениях ряда естественных наук (генетики, молекулярной биологии, морфологии, иммунологии и других)» паспорта специальности 14.01.12– «онкология».
Публикации
По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, из них 3в журналах, входящих в перечень рецензируемых научных изданий ВАК РФ, 1– в журнале из перечня международной реферативной базы данных и системы цитирования: CA(pt), WoS(ZR) и 1 патент на изобретение.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста; состоит
из введения, обзора литературы, характеристики методов исследования и клинического материала, 4 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка сокращений, указателя литературы, включающего 38 отечественных и 106 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 33 таблицами и 27 рисунками.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Характеристика клинического материала и методов исследования
В исследовательскую работу были включены 60 больных с диагнозом рак
желудка T3-4аN0-3M0, получавших лечение в клинике ФГБУ «РНИОИ» Минздрава России в период с 2014 по 2016 гг., разделенные на 2 группы сравнения:
9
1 группа – 30 больных с диагнозом рак желудка T3-4аN1-3M0,
2 группа – 30 больных с диагнозом рак желудка T3-4аN0M0.
После проведения радикальной операции, удаленная опухоль была исследована иммуногистохимически и генетически.
У пациентов обеих групп сравнения сопоставлялись возрастные данные.
Собирались жалобы, анамнез заболевания, анмнез жизни, при этом особое
внимание уделялось, сопутствующей патологии, в том числе и онкологической, отягощенной наследственности (генетической предрасположенности),
характеру употребляемой пищи, месту проживания, воздействию стрессорный
факторов и т.д., то есть, факторам риска развития рака желудка.
У всех больных раком желудка была аденокарцинома умеренной и низкой степени дифференцировки. В первой группе G3 аденокарцинома занимала 57%, а G2 аденокарциномы – 43%. Во второй группе наблюдалось обраное:
73% больных с G2 аденокарциномой и 27% – с G3 аденокарциномой.
Всем больным перед операцией проводилось стандартное обследование,
включающееобщеклиническое и биохимическое исследование крови, комплексный анализ показателей свертываемости крови, общий анализ мочи. Плановое обследование включало: обзорную рентгенографию органов грудной
клетки,определение
функций
внешнего
дыхания,
электрокардиогра-
фию.Ведущим инструментальным диагностическим методом являлось ФЭГДС,
компьютерная или МР- томография органов брюшной полости и малого.
Самыми распространенными по частоте операциями были гастрэктомия
с лимфодиссекцией в объеме D2 (47% в первой группе и 36% – во второй) и
дистальная субтотальная резекция желудка слимфодиссекцией в объеме D2
(33% в первой группе и 50% –во второй).
Данные морфологического заключения, явились базовым критерием отбора больных для настоящегоисследования. Верификацию процесса проводили
на догоспитальном этапе. Заключительный диагноз выставлялся после морфологического исследования удаленного препарата и регионарных лимфатических узлов.
10
Для генетического исследования использовали свежезамороженный биоптат первичной опухоли и условно нормальной ткани желудка больных с метастазами в регионарных лимфоузлах и без них.
Для определения изменения ДНК-копий отобраны 15 ядерных генов, которые являются участниками ключевых сигнальных путей, регулирующих выживание, рост клетки, метастазирование и устойчивость к химиотерапии
(AURKA,APC, CCND1, C-MYC, GKN1, IRX1, HER2, MET, MDM2, NFKB, P53,
POU5F1B,OCT1, S6K2 и PIK3CA), и некодирующий локусHV2 митохондриальной ДНК.
Принцип метода заключается в параллельной амплификации генамишени и референтного гена в контрольной и опытной пробах, в результате чего устанавливают уровни флуоресцентного сигнала в виде значения Ct.
Затем рассчитывали копийность каждого генетического локуса относительно референсного гена. Вывод об изменении дозы гена делали на основании
анализа соотношения ΔCtнорма/ ΔCtопухоль.(RCQ). При RCQ<0,5 и RCQ>1,5 полагали, что локус делетирован или амплифицирован, соответственно.
Дозу локуса гена считали равной диплоидному набору (2n), если отношение RCQопухоль/норма ~1. Если отношение RCQопухоль/норма было>1,5 или<0,5 дозу исследованного локуса считали увеличенной (>3n) или уменьшенной (<1n),
соответственно (Водолажский Д.И. и соавт., 2017).
Иммуногистохимическое исследование проводили на срезах с парафиновых блоков, предназначенных для стандартного гистологического исследования.
Депарафинизация и дегидратация парафиновых срезов выполнялась по
стандартной методике. В PT-LinkThermo проводили «Демаскировку» антигенов. Для визуализации иммуногистохимической реакции использовалась система детекции RevealPolyvalent HRP-DAB DetectionSystem. С применением
светового микроскопа «Leica» под увеличением х10, х20, х40, проводилась
оценка результатов иммуногистохимической реакции.
Проведено эпидемиологическое исследование, для определения факторов
риска развития рака желудка, методом «случай-контроль», в котором «случай»
– больные раком желудка, «контроль» – лица с неонкологической патологией и
11
практически здоровые люди. Для данного исследования разработана специальная анкета на основе данных отечественных и зарубежных исследований.
Относительный риск (ОР) расчитывали по формуле, которая выражает
соотношение частот изучаемых факторов в группах исследования: ОР=ad/bc,
где a – количество пациентов с определенным фактором риска, c – количество
пациентов без этого фактора риска, b –лица без злокачественной опухоли с
фактором риска,d – лица без злокачественной опухоли и без фактора риска.
По методике, предложенной М.А. Раху (1981) определялась достоверность показателя относительного риска. При значении относительного риска
больше 1 расценивается как значительный риск, а меньше 1 указывает на защитную роль воздействующего фактора. Связь между частотой возникновения
рака и изучаемыми факторами тем теснее, чем больше или меньше 1 (единицы)
показатель относительного риска. (Двойрин В.В., 1975).
Статистическая обработка
Полученные данные обрабатывали методом статистической обработки на
персональном компьютере типа IBMPC/AT. При этомиспользовались пакет
прикладных программ Statistica8.0, электронные таблицы Excel 2010. Изучаемые данные проверяли на соответствие нормальному распределению по критерию Колмогорова-Смирнова. Сравнение групп проводилось согласно критерию
Левена, посредством которого проверялось равенство дисперсий в первой и
второй группах. При получении положительного решения этих двух проблем
применялся t-критерий, позволяющий определить значимость статистических
различий количественных показателей в сформированных группах. В случае
отклонения данных от нормального распределения применяли непараметрические критерии (коэффициент корреляции Спирмена, критерий Манна-Уитни).
Для сравнения частот встречаемости событий использовали критерий χ2 с оценкой правдоподобия точным критерием Фишера.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Полученные данные свидетельствуют, что случаи аберрантных RCQ не
повлияли на средние показатели по группам (RCQопухоль/норма ~1). Исключения
составили локус HV2
(копийность в опухоли уменьшалась в сравнении с
12
условно нормальной тканью) и онкогены POU5F1B, OCT1, для которых отмечена тенденция увеличения копийности гена (таблица 1).
Таблица 1 – Средние значения RCQ 16-ти генетических локусов в группах сравнения
Локус
Средние значения аберрантныхRCQ
Средние значения RCQ
T3-4N1-3M0
T3-4N0M0
T3-4N1-3M0
T3-4N0M0
C-MYC
3,41±1,262
1,59±0,199
1,60±0,345
1,094±0,064
P53
0,45±0,004
0
0,93±0,045
0,968±0,045
MDM2
1,77±0,303
0
1,00±0,050
1,019±0,040
NFKB
2,88±0,603
0
1,41±0,219
0,915±0,068
0
0
0,95±0,024
0,989±0,054
AURKA
1,64±0,092
0
1,18±0,052
1,045±0,029
CCND1
2,26±0,426
1,77±0,087
1,18±0,124
1,166±0,096
HER2
3,68±1,610
4,28
1,73±0,481
1,185±0,187
HV2
0,59±0,147
0,35±0,125
0,74±0,073
0,683±0,095
IRX1
0,42±0,016
0
1,07±0,085
1,081±0,055
MET
1,74
0
1,03±0,039
0,972±0,041
GKN1
0
0
1,11±0,048
0,985±0,040
PIK3CA
1,49±0,030
1,85±0,075
1,06±0,046
1,025±0,071
POU5F1B
2,96±0,732
4,2±0,52
1,70±0,299
1,287±0,224
S6K2
1,74
0
1,03±0,031
0,956±0,040
OCT1
9,45±4,839
2,93±0,672
3,09±1,293
1,416±0,242
APC
Среднее значение RCQ амплифицированных локусов в группе T3-4N0M0
составило 1,06±0,83 на одного пациента, что меньше того же показателя в
группе T3-4N1-3M0 = 2,14±2,2. В целом, у 42 образцов опухолей желудка (70%)
выявлены амплификация и/или потеря хотя бы по одному локусу.
Результаты исследования показали, что аберрантное изменение RCQ выявлено для 14-ти изученных генов. Для опухолевого супрессора АРС и GKN1регулятора роста клеток эпителия желудка не было определено ни одного случая достоверного изменения копийности. Потеря копийности зафиксирована
для двух генов, кодирующих опухолевые супрессоры (IRX1 и P53), и в большинстве случаев аберрантного изменения RCQ некодирующего локуса мтДНК.
Для 14-ти онкогенов была характерна амплификация, за исключением одного
13
образца опухоли с метастазами в регионарные лимфатические узлы, которая
проявила себя потерей копийности локуса CCND1, кодирующего белок циклин
D1, и локуса NFKB, кодирующего транскрипционный фактор (рисунок 1).
%
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
RCQ<0,5
RCQ>1,5
Рисунок 1 Частота (%) амплификаций и потерь 16-ти генетических локусов
в образцах первичных опухолей желудка
При сравнении двух выделенных групп аденокарцином случаи аберрантных RCQ чаще были отмечены в образцах опухолей с метастазами в лимфоузлы (рисунок 2).
45
%
T3-4aN0M0
T3-4aN1-3M0
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Рисунок 2 Частота (%) аберрантных RCQ 16-ти генетических локусов в двух группах
аденокарцином желудка (T3-4N0M0 и T3-4N1-3M0)
14
Отметим, что изменения в 7 из 16-ти локусов выявлены только в
группе T3-4N1-3M0 – это утрата копийности двух опухолевых супрессоровP53, IRX1; а также амплификации четырѐх онкогенов AURKA, MDM2,
MET, S6K2; амплификации или потери транскрипционного фактора NFKB
(рисунок 2, таблица 1).
Данные корреляционного анализа выявили прямые статистически достоверные
ассоциации
между
амплификацией
четырех
онкогенов
HER2,
POU5F1B, NFKB, C-MYC и метастазированием в регионарные лимфоузлы
(р=0,026; 0,009; 0,011; 0,009, соответственно), а также между амплификацией
указанных онкогенов и дифференцировкой опухоли (р=0,042; 0,014; 0,023;
0,016, соответственно).
В группе с метастазами в регионарные лимфатические узлы статистически достоверно коррелировала амплификация генов POU5F1B и C-MYC
(R=0,809, р<0,01),которые локализуются рядом на 8q24 хромосоме.
Согласно полученным данным (см. таблицу 1), выявлена тенденция амплификации двух локусов POU5F1B и AURKA в опухолях с низкой степенью
дифференцировки G3 по сравнению с опухолями средней степени дифференцировки G2-3 (p=0,070 и p=0,074, соответственно).
Два генетических локуса NFKB и POU5F1B статистически достоверно
чаще были амплифицированы в группе с метастазами в регионарных лимфоузлах (χ2=10,6 и χ2=6,7, соответственно, р<0,01). В группе с метастазами в регионарные лимфатические узлы частота амплификации NFKB составила 30%,
POU5F1B – 34%, а в группе без метастазов амплификация POU5F1B идентифицирована только в 6% опухолей, а изменений RCQ локуса NFKB не было зафиксировано. Отмечена потенциальная информативность для идентификации
группы с регионарным метастазированием следующих маркеров: амплифицированный в 17% случаев HER2 (χ2=3,27; p=0,071) и редко встречающихся P53,
MDM2 (χ2=3,16; p=0,076) и IRX1, AURKA (χ2=4,29; p=0,057).
Распределение частот амплификации локуса HER2 по выделенным группам аденокарцином желудка продемонстрировало тенденцию к ассоциации
этого показателя с регионарным метастазированием (P=0,071), так как в группе
с метастазами аберрантное состояние этого маркера встречалось чаще.
15
Два из 16-ти генетических локусов показали статистически значимое различие групп T3-4N0M0 и T3-4N1-3M0: это – NFKB (Se –88%; Sp – 45%) и
POU5F1B (Se – 91%; Sp – 47%).
В таблице 2 представлена оценка эффективности идентификации риска
регионарного метастазирования аденокарциномы желудка с глубокой инвазией при включении в тестирование маркеров, как статистически значимо
дискриминирующих T3-4N0M0 и T3-4N1-3M0, так и продемонстрировавших
потенциальную информативность для данных целей. Согласно данным χ2теста выявлена статистическая значимость различий по частоте встречаемости аберрантных RCQ во всех трѐх вариантах наборов исследованных генетических локусов.
Таблица 2 – Оценка дискриминации групп T3-4N0M0 и T3-4N1-3M0 с помощью аберрантных
RCQ ряда генов
Набор исследованных генов
Параметры
NFKB,
POU5F1B
NFKB, POU5F1B,
HER2
NFKB, POU5F1B, HER2,
P53, AURKA, IRX1
χ2
6,123*
7,361*
11,798*
Вероятность (p)
0,0133
0,009
0,0006
6,828
4,345*
2,209*
0,961-48,51
1,115-16,926
1,37-3,562
Чувствительность (Se)
91,7%
87,5%
62,1%
Специфичность (Sp)
48,6%
51,6%
88,9%
Относительный риск
(RR)
95% доверительный интервал (CI 95%)
Примечание. * –статистически значимые показатели, р<0,05
Обнаружение в опухоли амплификации по одному из двух маркеров
(NFKB, POU5F1B), описанных выше, повышает риск метастазирования в
регионарные лимфатические узлы почти в 8 раз, но без статистической
значимой достоверности в пределах использованной нами выборки (95% CI:
0,961-48,51, p>0,05). Исследование двух маркеров прогнозирует развитие
метастаз в регионарные лимфоузлы с высокой степенью чувствительности (Se –
92%) и специфичности(Sp – 49%). Добавление локуса HER2 в паттерн маркеров
статистически значимо (95% CI: 1,115-16,926, p<0,05) повышает возможность
определения метастазирования в 4 раза.
16
Показатель относительного риска также свидетельствует о наличии
прямой связи между вероятностью развития метастазов в регионарных
лимфоузлах и наличием амплификации локусов NFKB, POU5F1B, HER2,
AURKA и/или потерь локусов P53, IRX1, NFKB.Кроме того при использовании
шести маркеров специфичность идентификации возрастает до 89%.
Положительная экспрессия р53 (>25%) в группе без метастазов была выявлена в 20% (6 из 30) пациентов, при этом разброс количества окрашенных
клеток находился в пределах от отсутствия окрашивания до 15% клеток, тогда
как отрицательная реакция была отмечена в 80% случаев (24 из 30).
Накопление р53 в ядрах клеток в группе с метастазами встречалось у 40%
(12 из 30) пациентов, разброс количества окрашенных клеток при этом находился в пределах от единичного окрашивания до 60% клеток. Отрицательная
экспрессия наблюдалась в 50% случаев (15 из 30). При распределении по критерию χ2 связь между факторным и результативным признаками была статистически значима (5,934>3,841) при уровне значимости р<0,05.
Среднее значение экспрессии белка р53 в ядрах опухолевых клеток в
группе без метастазов было ниже на 52,4% по сравнению с экспрессией данного маркера из группы с метастазами (различия статистически достоверны,
р≤0,05).
Положительная экспрессия bcl-2 в группе без метастазов была обнаружена в 60% случаев (18 из 30), при этом разброс количества окрашенных клеток
был небольшим и составлял от 10 до 30%. Отсутствие окрашивания клеток к
маркеру bcl-2 отмечалось в 40% случаев (12 из 30).
В группе с метастазами положительная реакция окрашивания к антителам
bcl-2цитоплазмы опухолевых клеток наблюдалась в 53,3% случаев (16 из 30) и
разброс составлял от 25 до 55%. Отсутствие окрашивания было отмечено в
46,7% (14 из 30). При распределении по критерию χ2 связь между факторным и
результативным признаками была статистически не значима (1,071<3,841) при
уровне значимости р>0,05.
При оценке пролиферативного потенциала клеток исследуемых групп,
определяемый по Ki-67,было выявлено наличие низкой, умеренной и высокой
пролиферативной активности (ПА). Данные представлены в таблице 3.
17
Таблица 3– Доля опухолей с различным уровнем пролиферации в исследуемых группах, %
Группа больных
Пролиферативная
активность
без метастазов (n=30)
с метастазами (n=30)
40 (n=12)
10 (n=3)
Умеренная
33,3 (n=10)
56,7 (n=17)
Высокая
26,7 (n=8)
33,3 (n=10)
Низкая
В группе без метастазов наблюдалось равномерное распределение пролиферативной активности между пациентами, но все-таки низкая ПА преобладала и была отмечена у 40% (12 из 30) пациентов. Умеренная и высокая пролиферативная активность отмечалась у 33,3% (10 из 30) и 26,7 % (8 из 30) пациентов соответственно. В группе же с метастазами максимальное количество опухолей было выявлено с умеренной пролиферативной активностью и отмечалось
у 56,7% (17 из 30) пациентов. Тогда как высокая ПА была отмечена у 33,3% пациентов (4 из 30), а низкая – всего у 10% больных (3 из 30).
Распределение пролиферативной активности показано на рисунке 3.
56,7
без метастазов
с метастазами
40
33,3
33,3
26,7
%
10
низкая
умеренная
высокая
Рисунок 3 Пролиферативная активность Ki-67 в опухолевых пациентов клетках
исследуемых групп, %
В группе без метастазов разброс Ki-67 положительных клеток находился
в пределах от 15 до 60%, а в группе с метастазами – от 20 до 70%. В группе без
метастазов отношение доли опухолей с низкой пролиферативной активностью
к доле опухолей с высокой пролиферативной активностью составило 1,5, а в
18
группе с метастазами в регионарных лимфатических узлах – 0,3. При распределении по критерию χ2 связь между факторным и результативным признаками
была статистически значима (7,437>5,991) при уровне значимости р<0,05.
Среднее значение экспрессии Ki-67 в группе без метастазов было ниже на
34,3% по сравнению с экспрессией данного маркера в группе с метастазами,
разница значений статистически достоверна (р≤0,05).
Негативный с-erbB-2 статус опухолей больных в группе без метастазов
определялся в 80% случаев (25 из 30) и выражался в полном отсутствии («-» –
негативная иммуногистохимическая реакция), что составляло 66,7% (20 наблюдений) или слабой мембранной реакции («+»– слабопозитивнаяиммуногистохимическая реакция) на поверхности опухолевых клеток (5 наблюдений 13,3%).
Интенсивное окрашивание мембраны раковых клеток («++» – умереннопозитивнаяиммуногистохимическая реакция) наблюдалось в 20% случаев (5 из 30).
Отрицательная экспрессия с-erbB-2 в группе с метастазами определялась
в 56,7% случаев (17 из 30), где полное отсутствие (-) наблюдалось в 46,7% (14
из 30 пациентов), а слабая мембранная реакция (+) в 10% (3 из 30 пациентов). В
данной группе нами была отмечена тенденция к повышению экспрессии сerbB-2.Так, гиперэкспрессия (++) и (+++) наблюдалась в 43,3 % случаев (13 из
30),
из
них
(++)
встречалась
в
16,6%
(5
из
30),
(«+++»
–
сильнопозитивнаяиммуногистохимическая реакция) –в 26,7% (8 случаев из 30).
Результаты показаны на рисунке 4.
66,7
без метастазов
с метастазами
46,7
%
26,7
20
13,3
16,6
10
0
негативная
слабопозитивная
умереннопозитивная
сильнопозитивная
Рисунок 4 Анализ иммуногистохимической реакции с-erbB-2 в опухолевых клетках
пациентов исследуемых групп, %
19
Хотя разброс количества положительно окрашенных клеток был неоднородным и находился от 10% до более, чем 50%, в основном все-таки преобладал высокий % окрашивания опухолевых клеток. При распределении по критерию χ2 связь между факторным и результативным признаками также была статистически значима (5,079>3,841) при уровне значимости р<0,05.
На основе изучения данных анкетирования, мы создали таблицу факторов
риска развития рака желудка с метастазами в регионарных лимфатических узлах (таблица 4).
Таблица 4 – Факторы риска развития метастатического рака желудка
Фактор риска
Больные метастатическим раком желудка (ОР)
женщины
мужчины
50-59
2,7
-
60-69
2,6
2,5
70-79
Стресс
6,8
2,3
-
Обильная мясная пища
3,26
3,33
Заболевания печени
3,41
2,12
Проживание в городе
2,75
-
Водопроводная вода
Самолечение при фоновых заболеваниях
желудка
2,8
2,1
-
3,5
Возраст, лет
Таким образом, проведенный анализ роли факторов риска заболевания
раком желудка с метастазами в регионарные лимфатические узлы, установил не
только факторы, которые способствуют развитию рака желудка, но и определить степень значимости каждого. Для высокого риска развития рака у женщин
наиболее значимыми явились психологическая травма (стресс), возраст 50–
69 лет, обильная мясная пища при наличии патологии печени, проживание в
городе, употребление водопроводной воды. Для мужчин такими факторами
оказались возраст 60–79 лет, обильная мясная пища при наличии патологии печени, употребление водопроводной воды.
На основе комбинированного молекулярно-генетического (CNV генов
NFKB иHER2) и иммуногистохимического (экспрессия белков KI67 и HER2)
20
подхода разработан алгоритм прогнозирования развития метастазов пациентов
с аденокарциномой желудка.
Сущность алгоритма заключается в том, что геномную ДНК экстрагируют из образцов тканей желудка и проводят амплификацию с высокоспецифичными праймерами для генов NFKB и HER2, и B2M, анализируют первичные
данные и вычисляют относительную копийность (RCQ) по формуле 2-ΔCt, где
ΔCt=(Ct (исследуемого гена) – Ct (B2M)), нормализуя относительно RCQ здоровой ткани желудка. Параллельно проводится ИГХ – исследование на срезах
парафиновых блоков, которые предназначены для стандартного морфологического исследования, с помощью моноклональных антител к Ki-67 и HER2.
Затем сравнивают полученные значения RCQ с прогностическими значениями копийности, и при значениях RCQNFKB0,8±0,02 и RCQHER21,1±0,08 в
комбинации с уровнем экспрессии в ядрах опухолевых клеток белка
KI67игх35,6±6,1 и негативной экспрессией HER2игх (-) прогнозируют отсутствие метастазов (чувствительность 75%), а при значениях RCQNFKB0,9±0,01 и
RCQHER22,0±0,1 в комбинации с уровнем экспрессии в ядрах опухолевых клеток белка KI67игх54,2±4,9 и позитивной экспрессией HER2игх (+++) прогнозируют развитие метастазов (чувствительность 70%).
Анализируя полученные результаты, можно заключить, что при планировании лечения пациентов с диагнозом рак (G2-3 аденокарцинома) желудка T34aN0M0, следует использовать разработанный алгоритм прогнозирования развития метастазов в регионарных лимфатических узлах, для решения вопроса о
возможности адъювантного лечения.
ВЫВОДЫ
1.
Относительная копийность (RCQ) исследованных 15-ти ядерных и
одного митохондриального генетических локусов в опухолях желудка с метастазами в регионарных лимфатических узлаз и без них, изменяется не одинаково. Были выявлены характерные для G2-3 аденокарцином T3-4N1-3M0 набор и
частота аберрантных RCQ. Амплификация локусов NFKB, POU5F1B, HER2,
AURKA и/или потеря копийности локусов P53, IRX1, NFKB является неблагоприятным прогностическим признаком в отношении метастазирования в регио-
21
нарные лимфоузлы в 90% случаев (из числа опухолей, имеющих аберрантные
показатели RCQ по перечисленным маркерам (95%CI: 1,37-3,562, р<0,05)).
2.
ИГХ-исследование выявило статистически достоверные различия
экспрессии опухолевыми клетками аберрантных форм р53 среди исследуемых
групп. В группе с метастазами в регионарные лимфоузлы показатели экспрессии аберрантного белка р53 в 2,1 раза превосходит данный показатель в группе
без метастазов, что свидетельствует о статистически значимой (р≤0,05) роли
инактивации белка р53 в регионарном метастазировании рака желудка. При
анализе экспрессии опухолевыми клетками bcl-2 в группе с метастазами в регионарные лимфоузлы выявлено статистически недостоверное (р≥0,05) преобладание положительно окрашенных клеток к данному маркеру в 1,2 раза по сравнению с таковыми из группы без метастазов, что говорит об отсутствии возможности использовать данный критерий для оценки метастазирования в регионарные лимфоузлы.
3.
Умеренная и высокая пролиферативная активность (ПА), определя-
емая по Ki 67, встречалась чаще у больных с метастазами в регионарные лимфоузлы в 1,7 и 1,2 раза соответственно. Среднее значение экспрессии Кi-67 в
группе без метастазов было ниже на 34,3% по сравнению с экспрессией данного маркера в группе с метастазами в регионарные лимфоузлы, что свидетельствует о, статистически достоверной (р≤0,05), прямой зависимости степени ПА
и вероятности метастазирования в регионарные лимфоузлы.
4.
При анализе проведенного ИГХ-исследования установлено, что в
группе без метастазов преобладала негативная экспрессия HER2, гиперэкспрессия данного маркера встречалась лишь в 20%. В группе же с метастазами в регионарные лимфоузлы выраженность гиперэкспрессии HER2 была выше в 2,2
раза по сравнению с предыдущей группой, тогда как негативная реакция встречалась в 1,4 раза ниже, что говорит о статистически значимой (р<0,05) роли гиперэкспрессии HER2 в регионарном метастазировании рака желука.
5.
Исследование экспрессии белка HER2 показало повышенную ча-
стоту встречаемости гиперэкспрессии в опухолях (G2-3 аденокарцинома) желудка с инвазией Т3-Т4а с наличием регионарных метастазов. Анализ данных
22
ИГХ и RCQ этого локуса выявил статистически значимую прямую корреляцию
(R=0,828 при р<0,01).В 80% случаев амплификация генетического локуса HER2
сопровождалась повышением экспрессии кодируемого им белка HER2.
6.
Наиболее значимыми для риска развития рака (G2-3 аденокарцино-
ма) желудка с инвазией Т3-Т4а с метастазами в регионарные лимфоузлы у
женщин явились психологическая травма, стресс (ОР 6,8; р=0,001), возраст 50–
69 лет (ОР=2,65;Р=0,04 ), обильная мясная пища (ОР=3,26 ; р=0,01), проживание в городе (ОР=2,75; Р=0,03), употребление водопроводной воды(ОР=2,8;
р=0,02). Для мужчин такими факторами оказались возраст 60–79 лет (ОР=2,4;
р=0,02), обильная мясная пища (ОР=3,33;Р=0,01), употребление водопроводной
воды (ОР=2,1; Р=0,02), самолечение при появлении симптомов заболевания
(ОР=3,5; Р=0,03).
7.
Разработан алгоритм прогнозирования развития регионарных мета-
стазов у больных раком (G2-3 аденокарцинома) желудка с инвазией Т3-Т4а на
основе комбинированного молекулярно-генетического (CNV генов NFKB и
HER2) и иммуногистохимического (экспрессия белков KI67 и HER2) подхода,
который позволяет с высокой (70%) чувствительностью прогнозировать течение такого заболевания как рак (G2-3 аденокарцинома) желудка с инвазией Т3Т4а.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
При планировании лечения пациентов с диагнозом рак (G2-3 аденокарцинома) желудка T3-4aN0M0, следует использовать разработанный алгоритм
прогнозирования развития метастазов в регионарныелимфатические узлы, для
решения вопроса о возможности адъювантного лечения.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1.
Изменение копийности генетических локусов – предиктивный
маркер метастазов у больных раком желудка / Кит О.И., Водолажский
Д.И., Кутилин Д.С., Татимов М.З., Гудуева Е.Н., Маслов А.А. // Современные проблемы науки и образования. – 2015. – № 6.;URL: https://scienceeducation.ru/ru/article/view?id=22967
2.
Study of copy number variations of OCT4 and SOX2 pluripotency genes
23
in stomach tumors / Vladimir Ser Trifanov, Tanzila Beksultanovna Kazieva, Konstantin Vladimirovich Dvadnenko, Martin Zamirovich Tatimov, Alexander V.
Snezhko, Sergey Vladimirovich Sanamyanc, Nikolai Borisovich Chizhikov, Oleg
Ivanovich Kit. // 2015ASCO Annual Meeting. J ClinOncol 33, 2015 (suppl; abstr
e15095).
3.
Copy number variation of genetic loci: A predictive marker of metastasis
in stomach cancer patients /Andrey A. Maslov, Oleg Ivanovich Kit, Denis S. Kutilin,
Martin Zamirovich Tatimov, Irina Tishchenko, Dmitry I. Vodolazhsky//
2016ASCO Annual Meeting. J ClinOncol 34, 2016 (suppl; abstr e23152).
4.
Изменение копийности генов как маркер возникновения метастазов
у больных раком желудка / Д.И. Водолажский, А.А. Маслов, Д.С. Кутилин,
М.З. Татимов, К.В. Двадненко, О.И. Кит // II Петербургский онкологический
форум «Белые Ночи – 2016». Сборник тезисов. – М., 2016. – С. 77.
5.
Detection of gene сopy number variation as predictive markers for me-
tastases in patients with gastric cancer / O. Kit, D. Kutilin, D. Vodolazhsky, M.
Tatimov, A. Maslov, L. Vladimirova // ESMO 18th World Congress on Gastrointestinal Cancer 29 June – 2 July 2016 Barcelona, Spain. doi:10.1093/annonc/mdw199.
6.
Изменение копийности генов у пациентов с диагнозом рак желудка
/ Д.И. Водолажский, М.З. Татимов, А.А. Маслов, Н.Н. Тимошкина // Материалы II Всероссийской конференции по молекулярной онкологии «Успехи молекулярной онкологии». – М., 2016. – Т. 3, № 4. – С.40.
7.
Изменение копийности генов при аденокарциноме желудка / Н.Н.
Тимошкина, Д.И. Водолажский, А.А. Маслов, М.З. Татимов, Е.Н. Колесников
// Сборник трудов IX Всероссийской научно-практической конференции с международным участием « Молекулярная диагностика 2017». – Москва, 2017. – Т.
1. – С.137-138.
8.
Копийность 17-ти генетических локусов пациентов с диагнозом
аденокарцинома желудка / Д.И. Водолажский, Н.Н. Тимошкина, А.А. Маслов, Е.Н. Колесников, М.З. Татимов // Современные проблемы науки и образования.
–
2017.
–
№
3.;URL:
https://science-
education.ru/ru/article/view?id=26405
9.
Аберрантный уровень копийности 17-ти локусов при аденокарци-
24
номе желудка / Н.Н. Тимошкина, А.А. Маслов, М.З.Татимов, Е.П. Ульянова,
И.А. Новикова, Д.И. Водолажский // III Петербургский международный онкологический форум «Белые Ночи – 2017». Сборникнаучныхработ – СанктПетербург, 2017. – С. 201.
10.
Исследование копийности 17 генетических локусов у пациентов с
резектабельным раком желудка / Д.И. Водолажский, Н.Н. Тимошкина, А.А.
Маслов, Е.Н. Колесников, М.З.Татимов // Материалы IX Съезда онкологов
России. – Уфа, 2017. – С.40.
11.
CNV генов в качетсве биомаркера и терапевтической мишени
при раке желудка / О.И. Кит, Д.И. Водолажский, М.З. Татимов, Н.Г. Васильченко, П.А. Пушкин, К.А. Куцын, Е.Н. Колесников, А.А. Маслов, Ю.А.
Геворкян, А.Ю. Максимов, М.Н. Дурицкий, Ю.А. Фоменко // Известия ВУЗов. Северно-Кавказский регион. Естественные науки. – 2017. – № 4-2 (196)
– С. 58-67. (входит в международные реферативные базы данных и системы цитирования: CA(pt), WoS(ZR)).
12.
Предиктивная диагностика метастатического поражения лим-
фоузлов у больных аденокарциномой желудка /О.И. Кит, Д.С. Кутилин,
М.З. Татимов, А.А. Маслов, Е.М. Франциянц, Д.И. Водолажский // Медицинский вестник Юга России. – 2018. –№ 9(1). –С. 51-62. DOI:10.21886/22198075-2018-9-1-51-62.
13.
Патент на изобретение № 2624505 Способ прогнозирования раз-
вития метастазов у больных раком желудка / О.И. Кит, Д.И. Водолажский,
Д.С. Кутилин, М.З. Татимов, А.А. Маслов / – 04.07.2017. –Бюл. №19.
ПЕРЕЧЕНЬ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
CNV
– вариация числа копий
ДНК
– дезоксирибонуклеиноваякислота
RCQ
– относительная копийность
ОР
– относительный риск
ПА
– пролиферативная активность
ИГХ
– иммуногистохимия
ФЭГДС
– фиброэзофагогастродуоденоскопия
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
3
Размер файла
903 Кб
Теги
особенности, патогенез, молекулярная, рака, метастазировании, генетический, желудка, регионарной
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа