close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Апоптоз нейронов сенсомоторной коры головного мозга трансгенных мышей HER-2 neu при старении и его регуляция цитофлавином и пирацетамом

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Соколова Юлия Олеговна
АПОПТОЗ НЕЙРОНОВ СЕНСОМОТОРНОЙ КОРЫ ГОЛОВНОГО
МОЗГА ТРАНСГЕННЫХ МЫШЕЙ HER-2/neu ПРИ СТАРЕНИИ И ЕГО
РЕГУЛЯЦИЯ ЦИТОФЛАВИНОМ И ПИРАЦЕТАМОМ
03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
АСТРАХАНЬ ─ 2018
Работа выполнена в Лаборатории сравнительной биохимии клеточных функций
Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Институт
эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова» Российской
академии наук
Научный руководитель:
Бажанова Елена Давыдовна
доктор биологических наук,
ведущий научный сотрудник
Официальные оппоненты:
Ордян Наталья Эдуардовна
доктор биологических наук, ФГБУН
«Институт физиологии им. И.П. Павлова»
Российской академии наук, лаборатория
нейроэндокринологии, заведующий
Менджерицкий Александр Маркович
доктор биологических наук, профессор,
ФГАОУ
ВО
«Южный
федеральный
университет», кафедра физиологии человека
и животных, профессор кафедры
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное
научное
учреждение
«Институт
экспериментальной медицины», г. СанктПетербург
Защита состоится « 08 » июня 2018 г. в 10:00 часов на заседании объединенного
диссертационного совета Д 999.149.03 в ФГБОУ ВО «Астраханский
государственный университет» по адресу: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна,
1, ауд. 101.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВО «Астраханский
государственный университет» по адресу: 414056, г. Астрахань, ул. Татищева,
20а и на сайте: http://www.asu.edu.ru.
Автореферат разослан «_____» __________ 2018 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
Курьянова Евгения Владимировна
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Старение - многофакторный феномен,
характеризующийся динамическим снижением физиологических функций
(Mandavilli B.S. et al., 2002). На данный момент существует множество теорий,
объясняющий процесс старения, однако ни одна из них не является
общепризнанной (Jin K., 2010). Старение мозга сопровождается образованием
свободных радикалов (Harman D., 1992), уменьшением функциональных связей
между нервными клетками (Costa K.M., 2014), снижением выработки гормонов,
нейрогормонов и нейромедиаторов, в том числе серотонина, норадреналина и
дофамина (Miguez J.M. et al., 1999; Neven M.M. et al., 2012), образованием
сенильных бляшек в различных отделах головного мозга (Howieson D.B., 2015),
изменением проницаемости гематоэнцефалического барьера (Viggars A.P. et al.,
2011; Marques F. et al., 2013; Almutairi M.M. et al., 2016).
В настоящее время исследование патологического старения, а именно
ускоренного
старения
представляет
большой
интерес,
как
для
фундаментальной биологии, так и для практической медицины. В нашем
исследовании моделью патологического старения были трансгенные мыши со
сверхэкспрессией HER-2/neu, контролем выступали мыши дикого типа линии
FVB/N. Трансгенные мыши линии HER-2/neu были выведены на основе линии
мышей FVB/N, поскольку линия FVB/N характеризуется высокой
плодовитостью и хорошей выживаемостью эмбрионов после инъекций (Taketo
et al., 1991). Сверхэкспрессия активированного HER-2/neu у трансгенной самки
мышей FVB/N приводит к злокачественной трансформации эпителиальных
клеток молочных желез с последующим развитием нескольких аденокарцином
молочных желез (Muller W.J. et al., 1988, 1998). Выявленная гиперинсулинемия,
гипергликемия, а также снижение активности антиоксидантной системы и
репродуктивной системы у трансгенных мышей HER-2/neu являются
биомаркерами преждевременного старения (Panchenko A.V. et al., 2016). Таким
образом, трансген HER-2/neu не только инициирует малигнизацию
эпителиальных клеток молочных желез, но также вызывает гормональнометаболические изменения, характерные для ускоренного старения (Panchenko
A.V. et al., 2016).
Список сокращений: АФК – активные формы кислорода, АТФ – аденозинтрифосфат, ГАМК – гаммааминомасляная
кислота,
НАД
–
никотинамидадениндинуклеотид,
НАДФ
–
никотинамидадениндинуклеотидфосфат, ЦНС– центральная нервная система, AKT– RAC-альфа-серин /
треонин-протеинкиназа (RAC-alphaserine/threonine-proteinkinase), Bax – BCL-2-ассоциированный X белок (BCL2-associated X protein), Bcl-2 –B-клеточная лимфома-2 (B-cell lymphoma-2), CD95 –кластер дифференцировки 95
(cluster of differentiation 95), CD95L – лиганд CD95 (ligand CD95), FOXO –семейство Forkhead box класса О
(Forkhead box О), ERK½–киназа, регулируемая внеклеточными сигналами (extracellular-signal-regulated kinase
½), Mcl-1 – миелоидная клеточная лейкемия-1 (Myeloid cell leukaemia-1), Mdm2 – мышиной двойной минуте 2
гомолог (Mouse double minute 2 homolog), NMDA – N-метил-D-аспартат (N-methyl-D-aspartate), PARP– поли(АДФ-рибозы)-полимеразы (poly-(ADP-ribose)-polymerase), р53 – опухолевый белок (tumor protein p53), p-АКТ
– фосфорилированная форма RAC-альфа-серин/треонин-протеинкиназы (phosphorylated form RAC-alpha
serine/threonine-protein kinase), p-ERK½ – фосфорилированная форма киназы, регулируемой внеклеточными
сигналами ½ (extracellular-signal-regulated kinase ½), TNF – фактора некроза опухоли (tumor necrosis factor),
VES– сукцинат витамина Е (vitamin E succinate).
3
При старении наблюдается потеря нейронов, доходящая до 20 и более
процентов, в различных частях головного мозга, таких как голубое пятно,
черная субстанция, гиппокамп, хвостатое ядро, скорлупа и кора головного
мозга (Anglade P. et al., 1997; Park D.C., Yeo S.G., 2013).
По литературным данным (Warner H.R., 1999; Higami Y., Shimokawa I.,
2000), апоптоз тесно связан со старением и нейродегенеративными
заболеваниями. Повышение уровня апоптоза фиксируется в постмитотических
тканях при старении (Pollack M. et al., 2002), в том числе в стриатуме старых
крыс (Zhang A.L. et al., 1995). Показано, что причиной активации
апоптотической смерти Т-клеток, миоцитов сердца, скелетных мышц и
нейронов коры головного мозга при физиологическом старении является
митохондриальная дисфункция (Pollack M., Leeuwenburgh C., 2001). Выявлена
апоптотическая активность у старых крыс, о чем свидетельствуют такие
маркеры, как цитоплазматический цитохром С, активация Bax, p53 и caspase-3,
расщепление PARP и ник-концевое мечение dUTP (Kapasi A., Singhal P., 1999;
Martin D. et al., 2002). Однако в настоящее время недостаточно данных,
описывающих молекулярные механизмы, связанные с апопотической смертью
нейронов. В связи с этим представляется актуальным исследовать механизмы
апоптотической смерти клеток при физиологическом старении и при
сверхэкспрессии онкогена HER-2/neu, поэтому важно определить содержание
белков-индукторов апоптотической смерти клеток и антиапоптотических
белков.
Кроме того, при физиологическом и патологическом старении
(сверхэкспрессия онкогена HER-2/neu) важную роль играют сигнальные
каскады PI3K/AKT/mTOR и MAPK/ERK, активируемые рецепторами
эпидермального фактора роста (ERBB, HER), следовательно, актуально
исследовать данные сигнальные пути.
Для увеличения продолжительности жизни человека необходимо понять,
какие клеточные программы ответственны за старение, и выявить возможности
их тонкого регулирования (DiLoreto R., Murphy C.T., 2015). Старение связано с
возрастными изменениями когнитивных и двигательных процессов (Smith C.D.
et al., 1999; Krampe R.T., 2002). Возрастные изменения моторной деятельности
связаны с проблемами координации (Seidler et al., 2002), замедлением движения
(Kirkendall D.T., Garrett W.E., 1998) и обусловлены дисфункцией центральной и
периферической нервной системы, а также дегенерацией мышечных тканей
(Seidler et al., 2010). Инволюция некоторых функций тканей и органов может
начаться в довольно молодом возрасте. В связи с этим важно исследовать
локомоторную активность, ориентировочно-исследовательское поведение и
эмоциональное состояние трансгенных мышей HER-2/neu в сравнении с
мышами дикого типа FVB/N на поздних этапах онтогенеза. Согласно
литературным данным, современные поведенческие тесты, такие как «открытое
поле» и Suok-тест, являются важными методами изучения механизмов, которые
лежат
в
основе
ориентировочно-исследовательского
поведения
и
психоэмоционального поведения (Калуев А.В., Туохимаа П., 2005; Курьянова
Е.В. и др., 2013).
4
Возрастные изменения различных систем организма, - сердечнососудистой, легочной, нервной, эндокринной, иммунной, а также двигательной,
требуют фармакокоррекции. Актуальным является поиск средств,
способствующих восстановлению локомоторных и когнитивных функций, а
также лечению возрастных изменений.
Степень разработанности темы исследования. В настоящее время для
коррекции возрастных изменений в клинической практике используются
различные лекарственные препараты. Так, выявлен нейропротекторный эффект
лекарственного препарата мемантина, применяемого для лечения болезни
Альцгеймера (Karolczak D. et al., 2013). В результате клинических
исследований (Pandi-Perumal S.R. et al., 2013) было выявлено, что мелатонин
обладает нейропротекторной активностью и может применяться при лечении
нейродегенеративных заболеваний, отека головного мозга после черепномозговой травмы или инсульта посредством сохранения митохондриального
гомеостаза, уменьшения образования свободных радикалов и синтеза АТФ.
Выявлено (Li T. et al., 2016), что терапия рутином улучшает метаболическую
функцию у старых крыс. Показано, что применение рапамицина способствует
снижению уровня β-амилоида на моделях болезни Альцгеймера и устранению
когнитивных нарушений (Spilman P. et al., 2010), при длительном приеме
рапамицина в течение жизни наблюдается улучшение возрастных расстройств
познавательных способностей (Majumder S. et al., 2012), данный препарат
благоприятно влияет на обучение и память у молодых мышей и сохраняет
память у старых мышей, а также оказывает анксиолитическое и
антидепрессивное действие (Halloran J. et al., 2012). Однако результаты не
всегда бывают однозначными, и проблемы, связанные со старением организма,
в настоящее время не решены. Механизм действия многих лекарственных
препаратов, в том числе цитофлавина и пирацетама, до конца не изучен,
несмотря на их использование в клинической практике. Таким образом,
изучение возможного про- или антиапоптотического действия лекарственных
препаратов цитофлавина и пирацетама является актуальной задачей.
Цель исследования: выяснение механизмов апоптоза нейронов
сенсомоторной коры головного мозга, изучение участия цитофлавина и
пирацетама в регуляции апоптоза, а также оценка ориентировочноисследовательского поведения, локомоторного и психоэмоционального статуса
мышей при физиологическом и патологическом (сверхэкспрессия HER-2/neu)
старении и возможность фармакологической коррекции возрастных
двигательных и поведенческих нарушений.
Задачи исследования:
1.
Оценить уровень апоптоза, выявить механизмы и пути его реализации
(определить содержание апоптоз-ассоциированных белков (p53, CD95, caspase3, caspase-8, Mcl-1, Bcl-2)) и активность AKT- и ERK½-сигнальных путей в
клетках сенсомоторной коры головного мозга при физиологическом старении и
при сверхэкспрессии онкогена HER-2/neu.
5
2.
Определить механизмы влияния цитофлавина и пирацетама на регуляцию
апоптоза нейронов коры головного мозга при физиологическом и
патологическом (сверхэкспрессия HER-2/neu) старении.
3.
Определить
ориентировочно-исследовательскую
активность,
локомоторный и психоэмоциональный статус старых мышей в сравнении с
молодыми двух линий - FVB/N (дикий тип) и HER-2/neu-трансгенных в
контрольной группе и под воздействием цитофлавина и пирацетама.
Научная новизна работы. Показано, что при физиологическом старении
наблюдается запуск возраст-зависимого апоптоза нейронов сенсомоторной
коры головного мозга, протекающего по внешнерецепторному пути. При
сверхэкспрессии HER-2/neu отмечается подавление основных механизмов
активации программированной гибели, одной из причин является активация
рецепторами HER-2/neu AKT-зависимого пути выживания.
Впервые выявлено участие лекарственных препаратов цитофлавина и
пирацетама в регуляции апоптоза клеток сенсомоторной коры головного мозга
при физиологическом старении. Нейропротекторное действие цитофлавина и
пирацетама при физиологическом старении осуществляется путем активации
антиапоптотического белка Mcl-1, что способствует подавлению гибели клеток
коры и, таким образом, предупреждению возраст-зависимой нейродегенерации.
Впервые установлено проапоптотическое действие цитофлавина и
пирацетама при сверхэкспрессии HER-2/neu. Показано, что данные препараты
подавляют активность антиапоптотических AKT и ERK сигнальных путей,
активируемых трансмембранными рецепторами HER-2/neu, что приводит к
умеренному повышению уровня апоптоза.
Выявлено, что у молодых трансгенных мышей при действии пирацетама
апоптоз клеток коры головного мозга протекает по р53-зависимому и
внешнерецепторному пути. У старых трансгенных мышей после введения
цитофлавина наблюдается активация р53- и TNF-зависимых каскадов, при
действии пирацетама апоптоз идет по р53-зависимому пути.
Впервые описаны характерные черты локомоторной активности,
ориентировочно-исследовательского поведения и психоэмоционального
статуса трансгенных мышей линии HER-2/neu. Показано, что молодые
трансгенные мыши обладают низкой локомоторной активностью, в отличие от
молодых мышей дикого типа, и не обнаружено значительных изменений при
старении. Молодые трансгенные мыши более стрессоустойчивы и обладают
пониженными вегетативными признаками тревоги, по сравнению со старыми.
Показаны
значительные
изменения
ориентировочно-локомоторной
деятельности у старых животных обеих линий при действии цитофлавина и
пирацетама.
Теоретическая и практическая значимость работы. Анализ
полученных данных имеет фундаментальное значение для понимания
механизмов апоптотической смерти клеток сенсомоторной коры головного
мозга при физиологическом и патологическом старении (сверхэкспрессии HER2/neu), при этом определено значение активации или подавления сигнальных
путей выживания клеток – AKT- и ERK-зависимого.
6
Понимание про- или антиапоптотического действия лекарственных
препаратов цитофлавина и пирацетама является перспективным для разработки
новых подходов при лечении ряда нейродегенеративных и, возможно,
онкологических заболеваний.
Кроме того, полученные в результате исследования данные могут быть
использованы в курсах лекций для студентов и аспирантов биологических и
медицинских направлений.
Материалы и методы исследования. Экспериментальная модель трансгенные мыши самцы со сверхэкспрессией онкогена HER-2/neu в возрасте
2 и 10 месяцев. В качестве контроля служили мыши самцы дикого типа FVB/N
в возрасте 2 и 18 месяцев. Мышей получали из Italian National Research Center
for Aging, их разведение поддерживается в НИИ онкологии им. Петрова (г.
Санкт-Петербург). Животные каждой линии были разделены на 2 возрастные
группы. В каждой возрастной группе было 3 подгруппы: первая подгруппа
являлась контрольной, второй и третьей подгруппе вводили лекарственные
препараты цитофлавин и пирацетам. Всего было 12 групп мышей, в каждой
подгруппе было 6 животных. Схема эксперимента приведена в таблице 1.
Таблица 1. Схема эксперимента.
Мыши дикого типа FVB/N
Молодые (2 мес.) Старые (18 мес.)
1. Контрольная 1. Контрольная
группа, n=6
группа, n=6
2. Цитофлавин, 2. Цитофлавин,
n=6
n=6
3. Пирацетам, n=6 3. Пирацетам, n=6
Трансгенные мыши HER-2/neu
Молодые (2 мес.) Старые (10 мес.)
1. Контрольная 1. Контрольная
группа, n=6
группа, n=6
2. Цитофлавин, 2. Цитофлавин,
n=6
n=6
3. Пирацетам, n=6 3. Пирацетам, n=6
Животные содержались в стандартных условиях вивария при свободном
доступе к воде и к корму.
Цитофлавин, раствор для внутривенного введения производства ООО
«НТФФ «ПОЛИСАН» вводили внутрибрюшинно в дозе 0,014 мл/10 г 1 раз в
сутки в течение 10 дней; пирацетам, раствор производства ОАО «Акционерное
Курганское общество медицинских препаратов и изделий «Синтез» (0,05 мл/10
г - внутрибрюшинно 1 раза в сутки также в течение 10 дней). Контрольной
группе вводили 5% раствор глюкозы. Согласно инструкции, препараты можно
разводить в одном из совместимых инфузионных растворов, среди которых
упоминается 5% раствор глюкозы. Для проведения экспериментов мы выбрали
5% раствор глюкозы, как один из возможных универсальных растворителей.
Необходимые дозы были вычислены на основании терапевтических доз
препаратов.
По завершении десятидневного эксперимента у всех групп животных
оценивали локомоторную активность, ориентировочно-исследовательскую
активность и эмоциональный статус с помощью двух современных методов:
теста «открытое поле» и Suok-теста. Далее животных под золетиловым
7
наркозом (золетил 4 мг/кг веса) декапитировали, извлекали головной мозг для
дальнейшего гистологического и биохимического исследования. Эксперимент
проводили по схеме, предлагающей проведение тестов, оценивающих
поведение, и забой по 2 группы мышей в день.
Гистологическая обработка материала. Исследуемый материал (мозг)
фиксировали в 4% растворе формальдегида на PBS (24ч, +40С). Затем материал
промывали 2 часа в PBS и помещали в раствор сахарозы (24ч, +40С). В конце
была применена быстрая заморозка биологического материала в изопентане
при –500С с помощью сухого льда. Материал хранили при –800С. Далее на
криостате изготавливались серии чередующихся срезов сенсомоторной коры
головного мозга, сделанных во фронтальной плоскости, толщиной 6 мкм.
Метод TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick
End Labeling) использовали для определения уровня апоптоза нейронов
сенсомоторной
коры
головного
мозга
мышей разного
возраста
(нерадиоактивное мечение биотином, выявление диаминобензидином) с
использованием
терминальной
дезоксинуклеотидил-трансферазы
для
выявления разрывов ДНК (кит для TUNEL Sileks, Россия).
Иммуногистохимический
метод.
Выявление
поверхностного
рецептора, члена суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей (tumor
necrosis factor receptor superfamily) CD95 (APO-1) в нейронах сенсомоторной
коры головного мозга проводили иммуногистохимическим методом.
Вестерн блоттинг анализ. Содержание исследуемых белков (p53,
CD95, caspase-3, caspase-8, Mcl-1, Bcl-2, AKT, p-AKT, ERK½, p-ERK½, Actin) в
пробах оценивали с помощью Вестерн блоттинга.
Анализ изображений. Изображения срезов сенсомоторной коры
головного мозга после выполнения TUNEL и ИГХ реакции были получены с
помощью микроскопа PFM (WPI, USA) и цветной видеокамеры camera DIC-E
(WPI, USA), Leika DFC 300 FX (Германия), разрешение 1392х1040 пикселей
(увеличение х40). Для оценки интенсивности содержания изучаемого белка и
уровня апоптоза использовалась программа VideoTestSoftware.
Подсчитывали количество апоптотических клеток (абсолютные значения,
т.е. подсчитывалось количество темноокрашенных апоптотических клеток,
взятое как среднее на один срез) на 4-5 срезах коры мозга у каждого
экспериментального животного.
Проводили
количественную
оценку
содержания
СD95иммунореактивного вещества в клетках на 5-6 срезах сенсомоторной коры
головного мозга для каждого животного. С помощью полученных данных
подсчитали среднюю оптическую плотность (выражена в относительных
единицах, представляющих отношение яркости фона к яркости объекта)
исследуемого белка для каждой группы животных.
Содержание апоптоз-ассоциированных белков (CD95, р53, caspase-8,
caspase-3, Bcl-2, Mcl-1, AKT, p-AKT, ERK, p-ERK) и Actin в коре головного
мозга после выполнения Вестерн блоттинг анализа определяли с помощью
программы ImageJ (денситометрия).
8
Тест «открытое поле». В тесте «открытое поле» локомоторную
активность оценивали по горизонтальной активности, которая складывается из
количества пересеченных периферических квадратов и пересеченных
центральных квадратов (Акулина И.В., Булыгина И.Е., 2012; Леушкина Н.Ф.,
Калимуллина Л.Б., 2010; Кучер Е.О. и др., 2012). Количество пересеченных
периферических квадратов регистрируют отдельно от количества пересеченных
центральных квадратов. Вначале мыши передвигаются вдоль стен, а
внутренние квадраты пересекают достаточно редко (Буреш Я. и др., 1991).
Исследовательскую активность регистрировали по количеству пересеченных
центральных квадратов, периферических стоек, центральных стоек (Акулина
И.В., Булыгина И.Е., 2012; Леушкина Н.Ф., Калимуллина Л.Б., 2010),
ориентировочную активность – по вертикальной активности, которая
складывается из количества периферических стоек и центральных стоек, в том
числе стоек с упором о стенку арены и без упора.
В тесте «открытое поле» «определение типологических особенностей
поведения крыс возможно проводить по параметрам двигательной и
исследовательской активности, рассчитывая на их основе суммированный
показатель основной активности» (Курьянова Е.В. и др., 2013). Таким образом,
в тесте «открытое поле» основная активность является комплексным
параметром, которая складывается из числа пересеченных периферических и
центральных квадратов, и количества периферических и центральных стоек
(Курьянова Е.В. и др., 2013).
Эмоциональный статус животных регистрировали по количеству болюсов
дефекации, уринации (Буреш Я. и др., 1991), количеству времени и актов
груминга (Курьянова Е.В. и др., 2013), остановкам (Леушкина Н.Ф.,
Калимуллина Л.Б., 2010). По методу Буреша (Буреш Я. и др., 1991) у животных,
обладающих низкой локомоторной активностью, отмечается большое
количество болюсов, и они являются более эмоциональными, чем те, у которых
наблюдается высокий уровень двигательной активности и низкая дефекация.
Suok-тест. Двигательную активность в Suok-тесте оценивали по
количеству пересеченных сегментов, латентному периоду выхода из
центральной зоны, количеству переходов через центр, исследовательскую
активность – по количеству заглядываний вниз, ориентировочную активность по количеству ориентационных движений головой (Dow E. et. al., 2014). В
Suok-тесте поведенческая активность является комплексным параметром,
которая складывается из горизонтальной активности, т.е. числа пересеченных
сегментов, а также количества заглядываний вниз и ориентационных движений
головой (Кучер Е.О. и др., 2012).
Эмоциональный статус регистрировали по количеству болюсов
дефекации, латентности дефекации, количеству остановок, времени груминга,
количеству актов груминга, количеству падений, латентности первого падения,
количеству соскальзываний задних лап (Кучер Е.О. и др., 2012; Dow E. et. al.,
2014).
Снижение показателей, характеризующих поведенческую активность
(пересечения, стойки, заглядывания, ориентации), и увеличение количества
9
соскальзываний, падений, уринаций, дефекаций говорит об увеличении уровня
тревоги у животных (Кучер Е.О. и др., 2012).
Статистический анализ результатов. Статистическую обработку
результатов проводили с использованием критерия Стьюдента с помощью
программы Microsoft Excel 5.0a. В исследовании были использованы методы,
применяемые для нормального распределения данных, по причине
однородности содержания животных во всех исследуемых группах и
невозможности опровергнуть нулевую гипотезу о нормальности распределения
из-за небольшого количества единиц наблюдения в статистической обработке.
Проводилось определение границ вариации изучаемого признака (коэффициент
вариации CV), который не превышал 10%, что позволяет считать уровень
вариабельности признака слабым. Согласно полученным результатам, значение
нормированного отклонения признака колебалось в допускаемых пределах +3
сигмы. Определяли статистическую достоверность различия величины
изучаемых показателей в сопоставляемых группах при р<0,05.
Положения, выносимые на защиту:
1. У мышей дикого типа на поздних этапах онтогенеза апоптоз клеток
коры головного мозга протекает по внешнерецепторному пути с участием CD95
и caspase-8. При действии цитофлавина и пирацетама происходит снижение
уровня апоптоза в коре головного мозга при физиологическом старении.
2. У трансгенных мышей HER-2/neu уровень гибели нейронов коры мозга
низкий и не изменяется при старении. После введения цитофлавина и
пирацетама наблюдается снижение активности белков p-AKT и p-ERK с
последующей инициацией клеточной смерти. У молодых трансгенных мышей
при действии пирацетама апоптоз протекает по р53-зависимому и по
внешнерецепторному пути. У старых трансгенных мышей после введения
цитофлавина активируются р53- и TNF-зависимые каскады, при действии
пирацетама - р53-зависимый.
3. При физиологическом старении отмечается снижение локомоторной
активности и ориентировочно-исследовательского поведения, и повышение
психоэмоционального статуса (мыши линии FVB/N). При сверхэкспрессии
HER-2/neu наблюдается низкая двигательная реакция у старых мышей, а также
повышение эмоциональной реактивности, по сравнению с молодыми. По
уровню психоэмоционального состояния мыши обеих линий (FVB/N и HER2/neu) практически не различаются.
4. При физиологическом старении (мыши линии FVB/N) после введения
цитофлавина наблюдается повышение двигательной и ориентировочноисследовательской активности. У молодых и старых трансгенных HER-2/neu
мышей при введении цитофлавина и пирацетама наблюдается активация
локомоторной и исследовательской деятельности. Исследуемые препараты
обладают
анксиолитическим
действием
при
физиологическом
и
патологическом старении.
Апробация работы. Результаты исследования представлены и
обсуждены на Всероссийской конференции с международным участием
«Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических
10
состояний мозга» (Санкт-Петербург-Колтуши, 2014), XV Всероссийском
совещании с международным участием и VIII школы по эволюционной
физиологии, посвященной памяти академика Л.А. Орбели и 60-летию ИЭФБ
РАН
(Санкт-Петербург,
2016),
Научно-практической
конференции
«Инновационные российские технологии в геронтологии и гериатрии» (СанктПетербург, 2017).
Публикации. Основные положения диссертации нашли полное
отражение в 8 печатных работах, 3 из которых – статьи в рецензируемых
журналах, рекомендованных ВАК РФ для размещения материалов
кандидатских диссертаций, 1 - статья в рецензируемом журнале и 4 - тезисы
докладов на всероссийских и международных конференциях.
Личный вклад автора. Личный вклад автора в диссертационное
исследование состоял в составлении плана исследования, проведении опытов,
статистической обработке и анализе данных, полученных в результате изучения
путей апоптотической смерти клеток сенсомоторной коры головного мозга и
экзогенного влияния на эти пути, а также в результате исследования
двигательной активности, ориентировочно-исследовательского поведения и
психоэмоционального статуса мышей дикого типа в сравнении с трансгенными
мышами.
В ходе выполнения исследования автором освоены метод TUNEL,
иммуногистохимический метод, Вестерн блоттинг анализ, а также
поведенческие тесты, позволяющие исследовать локомоторные способности,
ориентировочно-исследовательскую
активность
и
оценить
уровень
эмоциональной реактивности. Автор принимала участие во всех
экспериментах, включавших в себя гистологическую обработку материала,
микроскопию, денситометрию и статистический анализ данных. Имена
соавторов указаны в соответствующих публикациях.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 164 страницах и
состоит из введения, обзора литературы – глава 1, описания методики – глава 2,
описания результатов исследования – глава 3, обсуждения результатов – глава
4, заключения, выводов, списка сокращений и списка литературы, который
включает 344 источников (из них 314 иностранных), а также приложения.
Работа иллюстрирована 70 рисунками и 5 таблицами.
Благодарности. Автор и научный руководитель работы выражают
благодарность сотрудникам Лаборатории сравнительной биохимии клеточных
функций ИЭФБ РАН им. И.И. Сеченова: главному научному сотруднику,
доктору биологических наук, Черниговской Елене Валерьевне, кандидату
биологических наук, заведующий лабораторией Глазовой Маргарите
Владимировне, старшему научному сотруднику, кандидату биологических
наук, Никитиной Любови Сергеевне за полезные рекомендации и консультации
при написании диссертационной работы.
11
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Исследование механизма апоптоза нейронов сенсомоторной коры
головного мозга у мышей FVB/N и HER-2/neu на поздних этапах
онтогенеза
1.1. Уровень апоптоза нейронов у контрольной группы мышей при
физиологическом старении
В нашем исследовании показано, что у молодых мышей дикого типа
уровень гибели нейронов низкий (рис. 1А, 1Б). У этих мышей в регуляции
процессов выживания-гибели клеток коры участвуют AKT- и ERK-сигнальные
каскады, обеспечивающие низкий уровень апоптоза (см. предлагаемую нами
схему - рис. 2А). На данной схеме и аналогичных отображены результаты
нашей работы.
Согласно литературным данным, снижение AKT способствует
подавлению активности факторов транскрипции (FOXO) семейства Forkhead
(Carpenter R.L., Lo H.W., 2013). При этом инактивированные факторы
транскрипции FOXO индуцируют повышение другого проапоптотического
фактора - CD95L (Zhao G.X. et al., 2015). По нашим данным, у молодых мышей
дикого типа наблюдается высокое содержание р-AKT, которое способствует
низкому уровню CD95 (см. предлагаемую нами схему - рис. 2А).
По литературным данным, сигнальный путь ERK участвует в
нейропротекции путем подавления воспаления и окислительного стресса при
церебральной ишемии (Zhao Y., Wang S., 2013). Выявлено, что активация
ERK½ ингибирует апоптоз, вызываемый различными воздействиями, такими
как TNF, CD95L, TRAIL (Tran S.E. et al., 2001). В нашей работе показано, что у
молодых мышей FVB/N наблюдается высокая активность белка p-ERK½,
снижающаяся на поздних этапах онтогенеза, вероятно, это объясняет запуск
возраст-зависимого апоптоза (см. предлагаемую нами схему - рис. 2Б).
Поскольку мы выявили повышение содержания проапоптотических
белков, таких как CD95, сaspase-8 и caspase-3 у старых мышей дикого типа,
можно заключить, что клеточная гибель в коре при физиологическом старении
протекает по внешнерецепторному пути (см. предлагаемую нами схему - рис.
2Б).
Кора молодых
мышей FVB/N
Кора старых
мышей FVB/N
Рис. 1А. Влияние препаратов на уровень Рис. 1Б. Детекция уровня апоптоза методом
апоптоза у мышей линии FVB/N.
TUNEL.
12
Примечание. Здесь и далее: * – p<0,05 в сравнении с контрольной группой животных того же возраста
и той же линии, # - в сравнении с молодыми животными той же группы, & - в сравнении с аналогичной группой
мышей дикого типа (FVB/N), М – молодые мыши, С – старые мыши.
Обнаружено, что активация ERK½ путем конститутивной экспрессии
MEK1, или инициации Т-клеток посредством стимуляции их рецепторов,
способствует ингибированию caspase-8, расщеплению Bid и потере
мембранного потенциала митохондрий, индуцированного ионизирующим
излучением или активированием CD95, TNF и TRAIL-рецепторов (Holmstrom
T.H. et al., 2000). Как показано в нашей работе, у старых мышей дикого типа
наблюдается повышение уровня CD95 и caspase-8 при одновременном
снижении содержания p-ERK½. Вероятно, именно уменьшение уровня
активации p-ERK способствует запуску внешнерецепторного пути в клетках
коры мозга при старении (см. предлагаемую нами схему - рис. 2Б).
Рис. 2А. Схема регуляции апоптоза у Рис. 2Б. Схема регуляции апоптоза у
молодых мышей линии FVB/N.
старых мышей линии FVB/N.
Уровень апоптоза в коре головного мозга у контрольной группы
HER-2/neu мышей
HER-2/neu является представителем семейства тирозинкиназных
рецепторов эпидермального фактора роста и участвует в органогенезе и
эпителиальной дифференциации (Andrechek E.R. et al., 2000).
Белок HER-2/neu сверхэкспрессируется в разнообразных эпителиальных
злокачественных опухолях (Selvarajan S. et al., 2004; Chen M. et al., 2014;
Alotaibi A.M. et al., 2015), в том числе молочной железы, яичников, желудка и
поджелудочной железы (Datta J. et al., 2015). В доступных литературных
источниках нет информации о содержании белка HER-2/neu в нейронах коры
1.2.
13
головного мозга мышей дикого типа линии FVB/N и трансгенных мышей
линии HER-2/neu. В связи с этим мы показали наличие сверхэкпрессии HER2/neu в сенсомоторной коре головного мозга в группах мышей FVB/N и HER2/neu.
У молодых и старых трансгенных мышей высокое содержание белка рAKT обеспечивает низкий уровень апоптоза клеток коры (рис. 3А-3Г).
Известно, что HER-2/neu опосредует активацию АКТ-сигнального пути,
который играет большую роль в подавлении апоптоза (Arman K. et al., 2014).
Так, TNF-α-зависимый апоптоз супрессирован в клетках со сверхэкспрессией
HER-2/neu, и для этого необходима АКТ-опосредованная активация NF-κB
(Zhou B.P. et al., 2000). Таким образом, АКТ-сигнальный путь является
супрессором индуцированного TNF-α апоптоза (Thakkar H. et al., 2001).
Кора молодых
мышей HER-2/neu
Кора старых
мышей HER-2/neu
Рис. 3А. Влияние препаратов на уровень Рис. 3Б. Детекция уровня апоптоза
апоптоза у мышей линии HER-2/neu.
методом TUNEL.
p-AKT
HER-2/neu м HER-2/neu с
контроль
контроль
Actin
Рис. 3В. Влияние препаратов на
содержание p-AKT у мышей линии HER2/neu.
Рис. 3Г. Уровень
блоттинг анализ).
p-AKT
(Вестерн
Как выявлено в нашей работе, у молодых и старых мышей HER-2/neu не
наблюдается повышения уровня CD95, при этом обнаружено значительное
увеличение содержания р-AKT (рис. 3В) и низкий уровень гибели нейронов
(рис. 3А, см. предлагаемые нами схемы - рис. 4А, 4Б). Следовательно,
изменение содержания p-AKT и уровня апоптоза находятся в обратной
зависимости.
Выявлено, что HER-2/neu также подавляет активность р53 путем
активации AKT. Снижение экспрессии р53, в конечном счете, ингибирует
апоптоз. AKT фосфолирирует Mdm2, способствуя экспорту р53 из ядра, где
Mdm2 стимулирует убиквитинизацию р53, что приводит к его деградации
14
(Mayo L.D., Donner D.B., 2001; Zhou B.P. et al., 2001). Как показано в нашей
работе, у молодых и старых трансгенных мышей наблюдается значительная
активация p-AKT (рис. 3В), что способствует низкому уровню белка р53, а
также снижению уровня апоптоза (см. предлагаемые нами схемы - рис. 4А, 4Б).
Обнаружено, что AKT фосфорилирует проапоптотический белок Bad
(Datta S.R. et al., 1997), предотвращая тем самым взаимодействие Bad с
антиапоптотическими белками семейства Bcl-2, и таким образом, подавляя Badиндуцированную гибель клеток (Carpenter R.L., Lo H.W., 2013). Подобные
процессы наблюдались в нашем исследовании, - увеличение уровня p-AKT у
молодых и старых мышей HER-2/neu ингибирует белок Bcl-2, однако это не
влияет на уровень клеточной гибели (см. предлагаемые нами схемы - рис. 4А,
4Б). Поскольку у молодых трансгенных мышей основные пути активации
апоптоза уже супрессированы, у старых трансгенных мышей, вероятно,
высокое содержание белка Mcl-1 приводит к подавлению апоптоза (см.
предлагаемые нами схемы - рис. 4А, 4Б).
Рис. 4А. Схема регуляции апоптоза у Рис. 4Б. Схема регуляции апоптоза у
молодых мышей линии HER-2/neu.
старых мышей линии HER-2/neu.
Исследование механизмов влияния цитофлавина и пирацетама на
регуляцию апоптоза в коре головного мозга у экспериментальных
групп мышей при физиологическом старении и при
сверхэкспрессии HER-2/neu
Цитофлавин представляет собой сбалансированный комплекс веществ,
таких как янтарная кислота, рибоксин, никотинамид, рибофлавин
мононуклеотид (Регистр лекарственных средств в России, 2003).
Следовательно, фармакологическое действие цитофлавина обусловлено
комплексным воздействием компонентов, входящих в его состав (Биттирова
А.Э., 2014). Основным компонентом цитофлавина является янтарная кислота.
Она стимулирует шестую стадию цикла трикарбоновых кислот, т.е.
сукцинатгидраназа катализирует обратное окисление сукцината до фумаровой
кислоты, активизируя аэробный гликолиз (Tretter L. et al., 2016). Показано, что
терапия цитофлавином снижает уровень клеточной смерти нейронов в
пирамидальном слое гиппокампа у крыс с моделью ишемии головного мозга
(Bul'onV.V. et al., 2004). Следовательно, можно предположить, что цитофлавин,
помимо
антиоксидантного,
метаботропного
действия,
обладает
1.3.
15
нейропротекторным влиянием. По нашим данным, у молодых мышей дикого
типа введение цитофлавина не изменяет долю апоптотических клеток (рис. 1А),
возможно, причиной выживаемости клеток является повышение содержания
антиапоптотического белка Mcl-1 (рис. 5А, см. предлагаемую нами схему - рис.
5Б). Как известно, белок Mcl-1, входящий в состав семейства Bcl-2,
способствует выживаемости различных клеток, в том числе нейронов (Arbour
N. et al., 2008), лимфоцитов (Opferman J.T. et al., 2003) и нейтрофилов
(Dzhagalov I. et al., 2007).
Данные об участии сукцината и его производных в запуске клеточной
смерти противоречивы. Установлено, что янтарная кислота посредством
активации АКТ может ингибировать гибель кардиомиоцитов при гипоксии
(Tang X.L. et al., 2013). Однако в нашей работе показано, что у старых мышей
дикого типа при действии сукцинатсодержащего препарата происходит
снижение активности p-АКТ и, в то же время, ингибирование клеточной смерти
(рис. 1А). Вероятно, предупреждение возраст-зависимой нейродегенерации
осуществляется посредством высокого уровня антиапоптотического белка Mcl1 (рис. 5А).
При этом у молодых и старых мышей дикого типа после инъекций
цитофлавина наблюдается повышение содержания апоптоз-ассоциированных
белков, таких как CD95, p53, cаspase-3, а также снижение уровня p-ERK, но это
не приводит к активации клеточной гибели (рис. 1А, см. предлагаемые нами
схемы - рис. 5Б, 5В).
Рис. 5А. Влияние препаратов на содержание Mcl-1 у мышей линии FVB/N.
Рис. 5Б. Схема регуляции апоптоза у Рис. 5В. Схема регуляции апоптоза у
молодых мышей линии FVB/N при старых мышей линии FVB/N при введении
введении цитофавина.
цитофавина.
16
Пирацетам является циклическим производным нейротрансмиттера
гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) (Winblad B., 2005). В результате
фармакокинетического исследования пирацетама (Федин А.И., 2006) было
выявлено, что циклическая часть его молекулы не подвергается размыканию с
образованием ГАМК, следовательно, механизм действия пирацетама не связан
с влиянием ГАМК (Winblad B., 2005; Navarro S.A. et. al., 2013), и точный
механизм действия исследуемого препарата остается неизвестным.
Данный препарат используют для восстановления когнитивных
способностей при онкогенезе, травмах головного мозга и деменции (Muller
W.E. et al., 1999; Winblad B., 2005). Показано, что положительное влияние
пирацетама на текучесть мембраны в лобной коре, гиппокампе и стриатуме, а
также на плотность NMDA-рецепторов в гиппокампе может быть связано с
улучшением когнитивных функций у старых крыс (Scheuer K. et al., 1999).
Однако механизм действия пирацетама остается до сих пор не раскрытым.
Показано, что при действии аналога пирацетама леветирацетама наблюдается
снижение доли апоптотических клеток как в гиппокампе, так и в коре
головного мозга у новорожденных крыс линии Wistar при гипоксии.
Следовательно,
леветирацетам
проявляет
противоэпилептическую
и
антиапоптотическую активность (Kilicdag H. et al., 2013). Как выявлено в нашей
работе, у молодых и старых мышей дикого типа при действии пирацетама
наблюдается снижение содержания белков p-АКТ (рис. 6А) и p-ERK½, а также
подавление смерти клеток коры (рис. 1А). Вероятно, это можно объяснить
высоким содержание белка Mcl-1 у таких мышей (рис. 5А, см. предлагаемые
нами схемы - рис. 6Б, 6В). Наши данные подтверждают известные ранее
сведения об антиапоптотической функции белка Mcl-1, так, выявлено, что в
миелоидной клетке-предшественнике обнаруженный высокий уровень Mcl-1
подавляет апоптотическую смерть (Zhou P. et al., 1997).
p-AKT
FVB/N м
контроль
FVB/N м
пирацетам
Actin
Рис. 6А. Содержание p-AKT (Western Рис. 6Б. Схема регуляции апоптоза у
blotting).
молодых мышей линии FVB/N при
введении пирацетама.
17
p-AKT
HER-2/neu м HER-2/neu м
контроль
цитофлавин
Actin
Рис. 6В. Схема регуляции апоптоза у Рис. 6Г. Содержание p-AKT (Western
старых мышей линии FVB/N при blotting).
введении пирацетама.
У молодых мышей HER-2/neu при введении цитофлавина наблюдается
высокий уровень проапоптотических белков таких, как CD95, р53, а также
снижение содержания р-AKT (рис. 6Г) и p-ERK, однако, это не влияет на
уровень апоптоза клеток коры мозга (рис. 3А), вероятно, из-за высокого
содержания белка Mcl-1 (рис. 7А, 7Б, см. предлагаемую нами схему - рис. 7В).
Активированная Mcl-1 является маркером разных наследственных аномалий
при канцерогенезе (Beroukhim R. et al., 2010). Обнаружено, что продуктивный
синтез Mcl-1 способствует повышению выживаемости гемопоэтических клеток
у трансгенных мышей (Zhou P. et al., 1998).
Другой сукцинатсодержащий препарат - VES (vitamin E succinate)
проявляет антипролиферативное и проапоптотическое действие путем
подавления активности p-АКТ и p-ERK½ (Donapaty S. et al., 2006). Выявлено,
что VES стимулирует индукцию p53, что, в свою очередь, активирует DRs
(death receptor), это приводит к запуску TRAIL–опосредованного апоптоза
(Tomasetti M. et al., 2006). Эти результаты согласуются с полученными нами
данными. Так, у старых трансгенных животных при действии цитофлавина
наблюдается снижение содержания p-АКТ и p-ERK½, что также приводит к
повышению уровня проапоптотических белков CD95, р53 и апоптоза (рис. 3А).
Клеточная смерть протекает по внешнерецепторному пути и по р53-зависимому
пути (см. предлагаемую нами схему - рис. 7Г). Можно заключить, что влияние
цитофлавина на апоптотическую смерть клеток зависит от биохимического
состояния клетки.
У молодых мышей HER-2/neu при воздействии пирацетама происходит
снижение активности p-АКТ и p-ERK½, соответственно, это приводит к
стимуляции синтеза апоптоз-ассоциированных белков. Клеточная смерть
протекает по внешнерецепторному пути с участием CD95 (рис. 8А) и
последующей активацией caspase-8, и р53-зависимому пути (см. предлагаемую
нами схему - рис. 8Б). Можно заключить, что у молодых мышей HER-2/neu
пирацетам способен оказывать проапоптотическое действие, снижая уровень
фосфо-АКТ и ERK½.
При этом у старых мышей HER-2/neu после введения пирацетама
происходит снижение активности p-АКТ (рис. 3В), повышение содержания
18
Mcl-1
HER-2/neu м HER-2/neu м
контроль
цитофлавин
Actin
Рис. 7А. Влияние препаратов на Рис. 7Б. Содержание p-AKT (Western
содержание Mcl-1 у мышей линии HER- blotting).
2/neu.
Рис. 7В. Схема регуляции апоптоза у Рис. 7Г. Схема регуляции апоптоза у
молодых мышей линии HER-2/neu при старых мышей линии HER-2/neu при
введении цитофлавина.
введении цитофлавина.
другого белка - p-ERK½ (рис. 8В), не наблюдается изменений в
содержании CD95, однако повышается уровень р53 и, соответственно,
наблюдается индукция апоптоза (рис. 3А, см. предлагаемую нами схему – рис.
8Г).
Выявлено, что активация ERK½ ингибирует апоптоз, вызываемый
различными воздействиями, такими как TNF, CD95L (Lu Z., Xu S., 2006). По
нашим данным, у старых мышей HER-2/neu после введения пирацетама
наблюдается повышение уровня р-ERK½ (рис. 8В), который по литературным
данным способен ингибировать CD95, и действительно, мы не наблюдаем
повышения уровня CD95. Однако повышается содержание другого
проапоптотического белка - р53 и, соответственно, наблюдается индукция
апоптоза. Таким образом, у старых мышей HER-2/neu клеточная смерть
протекает по р53-зависимому пути (см. предлагаемую нами схему - рис. 8Г).
На основании этого можно предположить, что цитофлавин и пирацетам
блокируют передачу сигнала на p-АКТ и p-ERK½ у мышей со
сверхэкспрессией HER-2/neu, тем самым исследуемые препараты могут
индуцировать развитие апоптоза. Можно заключить, что механизм
терапевтического действия данных препаратов заключается именно во влиянии
19
их на антиапоптотические AKT- и ERK-сигнальные пути (см. предлагаемые
нами схемы - рис. 8Б, 8Г).
HER-2/neu м
контроль
HER-2/neu м
пирацетам
Рис.
8А.
Содержание
CD95- Рис. 8Б. Схема регуляции апоптоза у
иммунореактивного материала в коре молодых мышей линии HER-2/neu при
головного мозга (Иммуногистохимия)
введении пирацетама.
p- ERK½
HER-2/neu с HER-2/neu с
контроль
пирацетам
Actin
Рис. 8В. Содержание p-ERK½ (Western Рис. 8Г. Схема регуляции апоптоза у
blotting).
старых мышей линии HER-2/neu при
введении пирацетама.
2. Поведенческая активность и психоэмоциональное состояние у
мышей FVB/N и HER-2/neu при старении
В наших экспериментах молодые мыши дикого типа продемонстрировали
высокую локомоторную и ориентировочно-исследовательскую активность. При
этом молодые мыши FVB/N показали низкий уровень эмоциональной
реактивности.
При нормальном старении когнитивные способности ухудшаются
медленнее и в меньшей степени, чем физические показатели (Erickson C.A.,
Barnes C.A., 2003). В нашей работе выявлено, что у старых мышей линии
FVB/N наблюдается снижение двигательной реакции, что подтверждается
снижением количества пересеченных периферических квадратов, а также
ухудшение ориентировочно-исследовательского поведения. Вероятно, это
объясняется возрастными нарушениями в сенсомоторной коре головного мозга.
Обнаружено, что прогрессивное снижение физиологических функций часто
связано с потерей клеток, можно заключить, что гибель клеток играет важную
роль в процессе старения (Cooper D.M., 2012). Полученные нами результаты
подтверждают литературные данные.
20
Различными
авторами
показано
снижение
функциональных
возможностей ЦНС при старении, а именно ухудшение когнитивных
способностей (Mahncke H.W. et al., 2006; Buga A.M. et al., 2011; Bouchard J.,
Villeda S.A., 2015; Sperduti M. et al., 2016). Подобное снижение функций
сопровождается
возрастными
изменениями
нейронов
в
пределах
префронтальной коры и медиальной части височной коры головного мозга, эти
участки мозга отвечают за память, внимание, принятие решений и зрительнопространственные способности (Gallagher M., Rapp P.R., 1997; Erickson C.A.,
Barnes C.A., 2003). Наши данные согласуются с результатами других авторов,
которые отмечают, что с возрастом ухудшается двигательная активность
(Young A., 1997; Mahncke H.W. et. al., 2006). При этом в наших экспериментах у
старых мышей дикого типа наблюдается повышение эмоциональной
реактивности, что подтверждается повышением количества болюсов
дефекации.
В нашей работе впервые описаны локомоторная активность,
ориентировочно-исследовательское поведение и эмоциональное состояние
молодых и старых трансгенных мышей линии HER-2/neu. Выявлено, что у
молодых трансгенных мышей уровень локомоторной активности ниже по
сравнению с молодыми мышами дикого типа, и практически не изменяется при
старении. Показано снижение ориентировочно-исследовательского поведения у
молодых трансгенных животных на поздних этапах онтогенеза.
По уровню эмоциональной активности мыши обеих линий (FVB/N и
HER-2/neu) практически не различаются. При этом молодые трансгенные мыши
более стрессоустойчивы, и у них менее выражены вегетативные признаки
тревоги, по сравнению со старыми. Таким образом, выявлены поведенческие и
психологические особенности трансгенных мышей линии HER-2/neu в
онтогенезе - низкая двигательная реакция у молодых и старых животных,
уменьшение ориентировочно-исследовательского статуса и повышение
эмоциональной реактивности при старении.
3. Влияние цитофлавина и пирацетама на поведенческую активность и
психоэмоциональное состояние у мышей FVB/N и HER-2/neu при
старении
Одной из задач исследования было изучить возможность применения
цитофлавина и пирацетама как фармакологических корректоров возрастзависимых нарушений функций сенсомоторной коры головного мозга.
Входящие в состав цитофлавина компоненты, такие, как янтарная кислота,
рибоксин, никотинамид и рибофлавин, определяют механизм действия данного
препарата. Установлено, что препарат благоприятно влияет на процессы
клеточного дыхания, нормализует активность ферментов антиоксидантной
системы (Биттирова А.Э., 2014). В нашей работе показано, что у молодых
мышей HER/neu цитофлавин положительно влияет на локомоторную
активность, что подтверждается повышением количества пересеченных
периферических квадратов в тесте «открытое поле» (рис. 9А).
21
Подобное действие цитофлавина можно объяснить антиоксидантным
действием янтарной кислоты, способствующей повышению активности НАДзависимых ферментов (Бизенкова М.Н. и др., 2005; Mills E., O'Neill L.A., 2014).
Рибофлавин обеспечивает работоспособность нейронов за счет образования
флавиновых коферментов, входящих в состав флавиновых дегидрогеназ, а
именно они участвуют в окислении сукцината в цикле Кребса (Золотарева Р.А.,
Логинова Н.Ю., 2016). Никотинамид входит в состав кодегидрогеназ I (НАД) и
II (НАДФ), регулирует их соотношение в цикле Кребса и участвует в других
окислительно-восстановительных процессах (Бизенкова М.Н. и др., 2006;
Маркевич П.С. и др., 2011). Следовательно, цитофлавин может выступать в
роли антагониста NMDA-рецепторов и способствовать подавлению
эксайтотоксичности, а именно клеточной смерти нейронов головного мозга
(Маркевич П.С. и др., 2011).
Выявлено, что цитофлавин улучшает когнитивные способности у
пациентов с хронической ишемией головного мозга (Суслина З.А. и др., 2009).
Как показано в нашей работе, данный сукцинатсодержащий препарат
способствует повышению двигательной активности у старых мышей дикого
типа (рис. 9Б) и у старых трансгенных мышей (рис. 9А), а также улучшению
ориентировочно-исследовательского поведения у старых мышей дикого типа
(рис. 9В).
Пирацетам
(2-оксо-1-пирролидин-ацетамин)
представляет
собой
соединение с низкомолекулярным весом (Topdag M. et al., 2012). Выявлено, что
пирацетам улучшает когнитивные способности животных (Muller W.E. et al.,
1999; Gupta S. et al., 2009).
По данным наших экспериментов, пирацетам оказывает положительное
влияние на двигательную активность и ориентировочно-исследовательское
поведение у молодых трансгенных животных (рис. 9А, 9В). Пирацетам
улучшает кровообращение и поглощение кислорода в отделах головного мозга
крыс (Elgendy M.O., 2012). Предполагается, что пирацетам действует на ионные
каналы (Na+ и K+) или ионные носители, что приводит к повышению
возбудимости нейронов (Elgendy M.O., 2012). Показано, что он влияет на
холинергическую,
серотонинергическую,
норадренергическую
и
глутаматергическую системы (Winblad B., 2005). Пирацетам не имеет сродства
к
этим
рецепторам,
по-видимому,
он
увеличивает
количество
постсинаптических рецепторов или восстанавливает функцию этих рецепторов
(Winblad B., 2005).
Считается, что одной из основных причин старения является
митохондриальная дисфункция (Loeb L.A. et al., 2005). Митохондриальные
мутации, которые накапливаются с возрастом, могут способствовать
увеличению производства активных форм кислорода (АФК), и повышать
восприимчивость ко многим нейродегенеративным заболеваниям (Mandavilli
B.S. et al., 2002). В литературе описывается, что пирацетам действует путем
восстановления подвижности мембран (Navarro S.A. et al., 2013). Показано, что
терапия пирацетамом улучшает потенциал митохондриальной мембраны
22
нейронов головного мозга и образования АТФ в значительной степени в группе
пожилых животных и в меньшей степени - у молодых (Keil U. et al., 2006).
Эти данные согласуются с нашими результатами, показывающими, что у
старых трангенных животных после введения пирацетама отмечается
повышение локомоторных способностей (рис.9А), а также ориентировочной и
исследовательской активности. Вероятно, восстановление и сохранение
митохондрий является одним из главных механизмов, объясняющих действие
пирацетама при старении.
Наши результаты показали, что исследуемые препараты оказывают
анксиолитическое действие на молодых и старых мышей обеих генетических
линий, что подтверждается снижением количества болюсов дефекации и
времени груминга,
Таким образом, полученные нами данные показали, что изученные
препараты
способствуют
сохранению
и
умеренной
активизации
функциональных возможностей коры головного мозга при старении улучшают локомоторной деятельность, ориентировочно-исследовательскую
активность и снижают эмоциональную реактивность.
Рис.
9А.
Влияние
цитофлавина,
пирацетама на динамику показателей
теста «открытое поле» у трансгенных
мышей (линия HER-2/neu). Уровень
локомоторной активности.
Рис.
9Б.
Влияние
цитофлавина,
пирацетама на динамику показателей
теста «открытое поле» у мышей дикого
типа
(линия
FVB/N).
Уровень
локомоторной активности.
Рис. 9В. Влияние цитофлавина, пирацетама на динамику показателей теста
«открытое поле» у мышей дикого типа (линия FVB/N). Уровень ориентировочной
активности.
23
ВЫВОДЫ
1. У молодых мышей дикого типа в сенсомоторной коре головного мозга
сигнальные каскады AKT и ERK обеспечивают низкий уровень апоптоза. У
старых мышей FVB/N содержание фосфорилированной ERK½ в коре
снижается, что приводит к активации внешнерецепторного каскада апоптоза. У
молодых и старых HER-2/neu мышей активация p-AKT вызывает супрессию
р53- и TNF-зависимых каскадов, результатом чего является низкий уровень
апоптоза в коре головного мозга.
2. У молодых и старых мышей FVB/N после введения цитофлавина и
пирацетама наблюдается повышение содержания антиапоптотического белка
Mcl-1, что приводит к снижению уровня апоптоза нейронов коры головного
мозга.
3. У молодых трансгенных мышей после воздействия цитофлавина отмечается
повышение содержания Mcl-1, что является причиной низкого уровня апоптоза
нейронов коры. Введение пирацетама вызывает снижение содержания p-АКТ и
p-ERK½ и повышение уровня р53- и TNF-зависимого апоптоза, вероятно,
вследствие снижения активности рецепторов HER-2/neu и, соответственно,
уменьшения возможности их влияния на АКТ и ЕRК пути.
Цитофлавин и пирацетам при старении в условиях сверхэкспрессии HER-2/neu
обладают умеренным апоптоз-стимулирующим действием: при действии
исследуемых препаратов уменьшается содержание p-AKT, что приводит к
повышению уровня р53-зависимого апоптоза нейронов.
4. На поздних этапах онтогенеза у мышей FVВ/N наблюдается снижение
локомоторной
деятельности,
исследовательской
и
ориентировочной
активности, и повышение эмоциональной реактивности. В отличие от мышей
дикого типа, для молодых трансгенных мышей HER-2/neu характерен
достаточно низкий локомоторный статус, без возрастной динамики, хотя
эмоциональная реактивность при старении возрастает. По уровню
эмоциональной активности мыши обеих линий (FVB/N и HER-2/neu)
практически не различаются.
5. Введение цитофлавина вызывает увеличение двигательной активности и
ориентировочно-исследовательского поведения у старых мышей дикого типа, а
также повышение локомоторной деятельности у трансгенных мышей разного
возраста. Введение пирацетама стимулирует ориентировочно-локомоторную
деятельность у мышей линии HER-2/neu, независимо от возраста. Исследуемые
препараты оказывают анксиолитическое действие, снижая уровень
эмоциональной реактивности у молодых и старых мышей обеих линий.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи в рецензируемых журналах:
1. Козлова (Соколова), Ю.О. Влияние нейрометаболитов на уровень
апоптоза и поведенческую активность мышей HER2/neu при старении /
Ю.О. Козлова, Е.Д. Бажанова, Д.Л. Теплый // Естеств. науки. – 2015. – № 3
(52). – С. 48-55.
24
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Козлова (Соколова), Ю.О. Фармакологическая коррекция уровня
апоптоза нейронов коры у трансгенных мышей HER2/neu при старении /
Е.Д. Бажанова, Ю.О. Козлова, В.Н. Анисимов, Д.С. Суханов, Д.Л. Теплый
// Журн. эволюц. биохимии и физиологии. – 2016. – Т. 52. – № 1. – С. 5866.
Козлова (Соколова), Ю.О. Пути апоптоза нейронов и функцональные
возможности коры головного мозга при старении – роль некоторых
препаратов (ангиоген, цитофлавин, пирацетам) / Е.Д. Бажанова, Ю.О.
Козлова, В.Н. Анисимов, Д.С. Суханов, Д.Л. Теплый // Патологическая
физиология и экспериментальная терапия. – 2016. – Т. 60. – № 2. – С. 1319.
Козлова (Соколова), Ю.О. Психоэмоциональное состояние и
локомоторная активность трансгенных мышей HER2/neu в сравнении с
мышами дикого типа FBV при старении / Е.Д. Бажанова, Ю.О. Козлова //
Международный научный Институт "Educatio". Ежемесячный научный
журнал. – 2015. – № 3 (10). – Часть 6. – С. 93-96.
Тезисы докладов:
Козлова (Соколова), Ю.О. Апоптоз нейронов сенсомоторной коры
головного мозга и локомоторный и психоэмоциональный статус мышей
разных генетических линий при старении / Е.Д. Бажанова, Ю.О. Козлова,
М.Е. Слаква, В.Н. Анисимов // Нейрохимические механизмы
формирования адаптивных и патологических состояний мозга:
Всероссийская конференция с международным участием (СанктПетербург, 24–26 июня 2014 года). Тезисы докладов. – СПб.: Институт
физиологии им. И. П. Павлова РАН, 2014. – С. 22.
Козлова (Соколова), Ю.О. Анализ возрастных изменений локомоторного
и психоэмоционального статуса трансгенных мышей HER2 / Ю.О.
Козлова, М.Е. Слаква, И.Г. Попович, Д.Л. Теплый, Е.Д. Бажанова //
Нейрохимические
механизмы
формирования
адаптивных
и
патологических состояний мозга: Всероссийская конференция с
международным участием (Санкт-Петербург, 24–26 июня 2014 года).
Тезисы докладов. – СПб.: Институт физиологии им. И. П. Павлова РАН,
2014. – С. 74.
Козлова (Соколова), Ю.О. Участие цитофлавина и пирацетама в
активации ERK- и AKT-сигнальных путей в нейронах сенсомоторной зоны
коры головного мозга у трансгенных мышей HER-2/neu при старении /
Ю.О. Козлова, Е.Д. Бажанова, В.Н. Анисимов, Д.Л. Теплый // Пятнадцатое
Всероссийское Совещание с международным участием и восьмая Школа
по эволюционной физиологии. Сборник материалов. Санкт-Петербург, 17
– 22 октября 2016 г. – СПб.: ВВМ, 2016. – С. 111.
Соколова, Ю.О. Участие цитофлавина и пирацетама в регуляции апоптоза
нейронов коры головного мозга у трансгенных мышей HER-2/neu / Ю.О.
Соколова, Е.Д. Бажанова // Материалы конференции «Инновационные
российские технологии в геронтологии и гериатрии». Санкт-Петербург,
14-16 декабря 2017 г. – СПб.: «Эскулап», 2017. – С. 72.
25
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа