close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Исследование поверхностных белковых антигенов бактерий Azospirillum brasilense

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
БУДАНОВА Ангелина Андреевна
ИССЛЕДОВАНИЕ ПОВЕРХНОСТНЫХ БЕЛКОВЫХ АНТИГЕНОВ
БАКТЕРИЙ AZOSPIRILLUM BRASILENSE
03.02.03 – микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва – 2018
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении
науки Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов
Российской академии наук (ИБФРМ РАН)
Научный руководитель
Матора Лариса Юрьевна,
доктор биологических наук, профессор,
врио директора ИБФРМ РАН
Официальные оппоненты:
Николаев Юрий Александрович,
доктор биологических наук,
и.о. заведующего лабораторией
выживаемости микроорганизмов
ФИЦ Биотехнологии РАН
Карпунина Лидия Владимировна,
доктор биологических наук, профессор,
профессор кафедры микробиологии,
биотехнологии и химии ФГБОУ ВО
«Саратовский государственный аграрный
университет имени Н.И. Вавилова
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное
научное учреждение «Всероссийский
научно-исследовательский институт
сельскохозяйственной микробиологии»
Защита состоится «26» декабря 2018 г. в 13 час. на заседании
диссертационного совета Д.220.043.03 на базе ФГБОУ ВО «Российский
государственный аграрный университет – МСХА имени К.А. Тимирязева» по
адресу: 127550, г. Москва, ул. Прянишникова, д.19. Тел./факс (499)976-24-92.
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной
библиотеке имени Н.И. Железнова ФГБОУ ВО
«Российский
государственный аграрный университет – МСХА имени К.А. Тимирязева» и
на сайте Университета www.timacad.ru.
Автореферат разослан «___»___________________2018 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
кандидат биологических наук, доцент
Селицкая Ольга Валентиновна
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Значительная часть выявленных к настоящему
моменту закономерностей возникновения и развития растительномикробных ассоциаций установлена с использованием в качестве модели
бактерий рода Azospirillum. Азоспириллы, первоначально выделенные из
ризосферы злаков и прошедшие с ними разнообразные, в том числе, полевые
испытания, достаточно успешно коммерциализированы [Pereg et al., 2016].
Исследование особенностей взаимодействия микроорганизмов с растениями
обеспечивает создание научно-обоснованных подходов к подбору
эффективных вариантов инокуляции растений и, в конечном итоге,
способствует
развитию
экологически
безопасных
современных
агробиотехнологий.
Степень разработанности темы исследования. Колонизация и
прикрепление бактерий к корням растений являются основополагающими
этапами формирования растительно-микробных ассоциаций. У многих
грамотрицательных бактерий процесс закрепления на корнях растений
опосредуется жгутиками, фимбриями (или пилями), представляющими
собой, в основном, белковые структуры [DeWeger et al., 1987; Dörr et al.,
1998; Croes et al., 1993; DeTroch, Vanderleyden, 1996]. Первые необходимы
для подвижности бактерий в жидкой среде или по поверхности твердых сред,
а вторые – для адгезии и осуществления других функций. У ассоциативных
бактерий рода Azospirillum при культивировании в жидких средах имеется
один полярно расположенный жгутик, обеспечивающий подвижность и
хемотаксис [Zhulin, Armitage, 1992], изолированный от окружающей среды
липополисахаридным чехлом [Бурыгин и др., 2007], а при росте в средах с
повышенной вязкостью и на плотных средах образуются дополнительные
латеральные жгутики (Khammas et al., 1989; Tarrand et al., 1978). Полагают,
что полярный жгутик A. brasilense содержит в своем составе адгезивный
компонент, вовлеченный в связывание с корнями пшеницы [RodriguezNavarro et al., 2007].
В ряде работ имеются сведения о появлении фибриллярного материала
при закреплении азоспирилл на корнях растений, однако его природа
остается невыясненной [DeTroch, Vanderleyden, 1996]. При этом установлено,
что в ходе адаптации к существованию на корнях пшеницы у A. brasilense
повышается количество представленных на клеточной поверхности
родоспецифичных белковых поверхностных антигенов, участвующих в
процессе микроколониального распространения данных бактерий [Шелудько
и др., 2010]. В осуществлении указанного способа коллективной миграции
3
азоспирилл и в колонизации ими корней пшеницы могут участвовать
белковые пили или пилеподобные структуры.
Компоненты поверхности бактериальных клеток, как правило,
изучаются, будучи отделенными от клеточной массы. Существует немного
работ, относящихся к исследованию архитектуры клеточной поверхности,
степени представленности на клетке, а также обособленности от
окружающей среды тех или иных поверхностных бактериальных структур.
Очень хорошую перспективу для решения подобных задач имеют
иммунохимические подходы, основанные на использовании специфических
антител для оценки экспонированности на поверхности бактериальных
клеток
детерминант
различной
природы,
задействованных
во
взаимодействии с макропартнерами. Эти сведения могут быть полезны для
контроля над многими процессами, такими как бактериальная адгезия и
адсорбция, а также при разработке приемов выявления и серологической
идентификации бактерий.
Существенным вкладом в раскрытие механизмов растительномикробной ассоциативности могут стать сведения о том, что происходит с
бактериальными клетками и с их поверхностью в прикорневой зоне растений
при контактах с агентами, меняющими способ распространения бактерий. В
первую очередь, это относится к информации о представленности на
поверхности бактерий тех или иных структур, опосредующих различные
механизмы подвижности. Кроме этого, представляет интерес возможность
участия мажорных белковых антигенов ассоциативных бактерий, в
частности, флагеллина полярного жгутика, в развитии ответных реакций у
растений.
Получение с помощью биоинформатического анализа данных о
молекулярном строении флагеллина и пилиноподобных белков
ассоциативных бактерий открывает перспективы изучения физических
свойств поверхности этих макромолекул, в значительной степени
определяющих биологическую активность исследуемых структур.
Целью настоящей работы являлось изучение мажорных белковых
антигенов Azospirillum brasilense, отвечающих за бактериальную
подвижность и взаимодействие с растительными партнерами.
Для реализации поставленной цели предстояло решить следующие
задачи:
1. Выполнить иммуномикроскопическую визуализацию флагеллиновых и
пилиновых детерминант бактерий Azospirillum brasilense.
2. Сравнить иммунохимические свойства флагеллинов полярных
жгутиков штаммов A. brasilense Sp245 и A. brasilense Sp7, относящихся
4
к разным серологическим группам согласно характеристикам их Оантигенов.
3. Исследовать изменения клеточной поверхности и структуры
макроколоний Azospirillum brasilense под влиянием витального
красителя конго красного, меняющего способ распространения данных
бактерий.
4. Оценить влияние флагеллина полярного жгутика эндофитного штамма
A. brasilense Sp245 на митотическую активность апикальных меристем
проростков пшеницы.
5. Провести биоинформатический анализ 3D структур флагеллина и
пилиноподобных
белков
с
использованием
результатов
полногеномного секвенирования ДНК штамма A. brasilense Sp245.
Научная новизна работы. Впервые в составе поверхности бактерий
Azospirillum brasilense выявлены детерминанты пилина/пилиноподобного
белка. Впервые продемонстрированы штаммовые серологические различия
белковых детерминант гликозилированных флагеллинов бактерий
Azospirillum brasilense. Впервые показано положительное влияние
флагеллина полярного жгутика ассоциативных бактерий на митотическую
активность апикальных меристем проростков пшеницы. Методом
гомологичного моделирования и моделирования по шаблону для штамма A.
brasilense Sp245 впервые описаны на уровне 3D структур белки флагеллы и
пилиноподобные белки, гены которых представлены в его геноме.
Практическая
значимость
работы.
Разработан
способ
пробоподготовки клеток азоспирилл для иммуноэлектронной микроскопии,
обеспечивающий удаление прочно связанного полисахаридного чехла с
полярного жгутика. Модифицирована методика препаративного выделения
химически чистого препарата гликозилированного флагеллина азоспирилл.
Полученные в работе препараты и антитела были использованы при
проведении плановых НИР ИБФРМ РАН. Методические приемы,
разработанные в диссертационной работе, применялись при подготовке
квалификационных
работ
студентами
биологического
факультета
Саратовского госуниверситета.
Основные положения, выносимые на защиту
1. На поверхности бактерий Azospirillum brasilense выявляются белковые
антигены пилийного происхождения, не проявляющие штаммовой
специфичности.
2. Изолированные субъединицы флагеллина полярного жгутика
эндофитного штамма A. brasilense Sp245 повышают митотическую
активность апикальных меристем проростков пшеницы.
5
3. Взаимодействие бактерий Azospirillum brasilense с витальным
красителем конго красным, меняющим способ их распространения в
полужидких средах, приводит к формированию организованных
клеточных структур, способных покидать границы роения единичных
клеток. Клетки в таких образованиях не имеют полярных жгутиков и
покрыты слоем фибриллоподобного материала.
Степень достоверности и апробация результатов. Степень
достоверности полученных результатов определяется значительным объемом
данных, полученных с помощью современных научных методов в
повторяющихся экспериментах. Статистическая обработка результатов,
отличающихся
качественной
(двояковозможной)
изменчивостью,
проводилась по адекватным формулам и алгоритмам. Основные положения
диссертации были представлены в виде устных и стендовых сообщений на VI
и VIII Всероссийских конференциях молодых ученых «Стратегия
взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой»
(Саратов, 2012; 2016); X Молодежной школе-конференции с международным
участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва,
2015); III Пущинской школе-конференции «Биохимия, физиология и
биосферная роль микроорганизмов» (Пущино, 2016) и 21-й Международной
Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI
века» (Пущино, 2017).
Связь работы с научными программами и личный вклад автора в
исследования. Работа выполнена на базе лаборатории иммунохимии
ИБФРМ РАН в соответствии с плановой темой НИР «Антигенные структуры
и ответные реакции партнеров в процессе межклеточных и
межорганизменных коммуникаций» (2013-2017 гг., № гос. регистрации
01201359056).
Личный вклад автора состоит в непосредственном получении и
обработке экспериментальных данных, планировании экспериментов,
анализе литературных источников. Автором лично разработаны
методические подходы к освобождению бактериальных клеток от
капсульного и очехляющего жгутик материала для проведения
иммуномикроскопических исследований, а также этапы проведения прямой и
стереоскопической световой микроскопии бактериальных популяций.
Совместно с сотрудниками ЦКП «Симбиоз» ИБФРМ РАН были проведены
работы по электронномикроскопической визуализации поверхностных
родоспецифичных белковых антигенов бактерий Azospirillum brasilense.
Биоинформатический анализ 3D структур флагеллина и пилиноподобных
белков штамма A. brasilense Sp245 проводился совместно с д.х.н. проф.
6
Щеголевым С.Ю. При непосредственном участии автора осуществлялась
подготовка основных публикаций по теме диссертационного исследования.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, из них 2
статьи в журнале, рекомендованном ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения,
обзора литературы, экспериментальной части, описывающей материалы и
методы исследований, изложения полученных результатов и их обсуждения,
заключения, выводов и списка использованных литературных источников,
содержащего 263 наименования. Работа изложена на 132 страницах
машинописного текста, включает 26 рисунков и 1 таблицу.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Характеристика методов исследования
Диссертация выполнена в ФГБУН Институт биохимии и физиологии
растений и микроорганизмов Российской академии наук» (ИБФРМ РАН) в
период 2013-2017 гг. Все описанные в работе микроскопические
исследования выполнялись на базе ЦКП «Симбиоз» ИБФРМ РАН.
При выполнении работы применяли как традиционные, так и
современные микробиологические, биохимические, иммунохимические и
биоинформатические методы исследования. Были использованы штаммы
бактерий из Коллекции ризосферных микроорганизмов ИБФРМ РАН
(Коллекция ризосферных микроорганизмов): A. brasilense Sp7 (IBPPM 150),
Sp245 (IBPPM 219), а также мутант Sp245: SK048 [Scheludko et al., 1998].
Культуры клеток выращивали до поздней логарифмической фазы роста при
30оС на синтетической малатной среде [Döbereiner, Day, 1976] с добавлением
NH4Cl (1 г/л). Полужидкая среда содержала 0,4 % агар-агара. Для
ингибирования роения бактерий и проявления у них Gri +-фенотипа в
культуральную среду добавляли конго красный до концентрации 37,5 мкг/мл.
Посев бактерий в полужидкий агар осуществляли уколом петлей в среду
культивирования. Для изучения особенностей фронта распространения
азоспирилл в среде, содержащей краситель, бактерии культивировали в
течение 2-х суток. В исследованиях применялись как полученные в данной
работе антитела на весь пул поверхностных бактериальных антигенов
штамма A. brasilense SK048 и антитела на субъединицы полярного жгутика
A. brasilense Sp245, так и ранее полученные кроличьи родоспецифичные
антитела на электрофоретически очищенный и элюированный из геля
препарат флагеллина типового штамма A. brasilense Sp7 [Бурыгин и др.,
2007], штаммоспецифичные антитела на ЛПС A. brasilense Sp245 [Матора и
7
др., 1998] и антитела на интактные клетки азоспирилл типового штамма A.
brasilense Sp7 [Широков и др., 2015]. Для получения коньюгатов антител с
коллоидным золотом золотые сферические наночастицы диаметром 15 нм
получали методом цитратного восстановления HAuCl4 [Frens, 1973]. Для
обработки растений раствором флагеллина полярного жгутика семена мягкой
яровой пшеницы сорта Саратовская 29 (НИИСХ Юго-Востока, г. Саратов)
стерилизовали и проращивали в течение 3-х суток как описано Шелудько с
соавторами (2010). Определение митотического индекса меристематических
клеток корней пшеницы проводили согласно общепринятой методике
[Паушева, 1988] с модификациями. Статистическую обработку результатов,
отличающихся качественной (двояковозможной) изменчивостью, проводили
по соответствующим формулам и алгоритмам [Доспехов, 1985]. 3D
структуры белковых молекул по их аминокислотным последовательностям in
silico проводили с применением методов компьютерного моделирования по
шаблону [Yang et al., 2015] с использованием соответствующего
программного обеспечения [I-TASSER. Protein Structure & Function
Predictions [сайт] URL: https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER],
осуществляющего поиск в базе данных PDB экспериментальных белковых
структур [PDB. Protein Data Bank. An Information Portal to 133589 Biological
Macromolecular Structures [сайт] URL: https://www.rcsb.org/pdb/home/home.do]
с максимально сходным фолдингом либо супервторичной структурой.
Выявление детерминант флагеллина очехленного жгутика A.
brasilense Sp245
Для визуализации детерминант очехленного флагеллина полярного жгутика в
составе поверхностных антигенов модельного штамма A. brasilense Sp245
была отработана процедура пробоподготовки, заключающаяся в
освобождении клеток бактерий от капсульного материала и чехла полярного
жгутика, при которой отрыв флагелл от клеток оказывался минимальным.
Трёхкратный отмыв суспензий бактериальных клеток ЗФР с деликатным
ресуспендированием и центрифугированием при 3000 g обеспечивал
наилучшее взаимодействие меченых коллоидным золотом родоспецифичных
антител на флагеллин с клетками. По результатам иммуноэлектронной
микроскопии родоспецифичные антитела на флагеллин азоспирилл
взаимодействовали собственно с флагеллой отмытых от чехла клеток, а
штаммоспецифичные анти-липополисахаридные антитела у бактерий с
очехленным жгутиком распознавали на нем материал, антигенно
родственный липополисахариду (ЛПС) (рис. 1 и 2).
8
А
Б
Рис. 1. Результат иммуноэлектронной
микроскопии клеток A. brasilense Sp245
с использованием антител на флагеллин
(А) и на ЛПС (Б), меченных золотыми
сферическими наночастицами.
Рис.
2.
Схематическое
изображение
результатов иммуноэлектронной микроскопии
клеток A. brasilense Sp245 с использованием
антител на флагеллин (А), ЛПС (Б) и
родоспецифичных антител на поверхностные
белковые детерминанты(В).
Полученные результаты полностью подтвердили сделанное ранее
предположение о том, что флагеллин азоспирилл, закрытый от окружающей
среды полисахаридным чехлом, способен принимать участие в процессах
прикрепления исключительно как носитель субстанции, участвующей в
адсорбции данных бактерий на корнях растения [Бурыгин, 2003].
Получение и анализ антител на флагеллин A. brasilense Sp245
В предыдущем разделе для выявления белковых детерминант
флагеллина штамма Sp245 были использованы родоспецифичные антитела,
полученные на флагеллин типового штамма A. brasilense Sp7 [Бурыгин и др.,
2007]. Для выявления возможных иммунохимических различий флагеллинов
штаммов Sp245 и Sp7, относящихся к разным серологическим группам на
основании характеристик их ЛПС [Матора и др., 2008], были получены
кроличьи антитела на извлеченные из ПААГ субъединицы флагеллина
штамма Sp245.
Для получения электрофоретически чистого препарата флагеллина
Sp245 модифицировали схему выделения, предложенную в работе [Беляков и
др., 2010]. В упомянутой работе объектом исследований служили бактерии
штамма Sp7, жгутик которых менее прочно связан с телом клетки (по
сравнению с Sp245). Модифицированная схема включала, помимо
механического воздействия на бактериальные клетки с помощью блендера,
9
дополнительное гидродинамическое и ультразвуковое воздействие (данные
операции
чередовались
три
раза).
После
нескольких
этапов
центрифугирования при разных режимах (для освобождения от клеточного
материала)
полученный
супернатант,
содержащий
фрагменты
флагеллиновых
молекул,
подвергали
ультрацентрифугированию.
Осажденный флагеллин диссоциировали с помощью кислоты, удаляли
недиссоциированную
высокомолекулярную
фракцию,
проводя
ультрацентрифугирование. Значение pH полученного супернатанта доводили
до нейтрального и проводили ещё одно ультрацентрифугирование.
Полученный в результате супернатант представлял собой свободный от
примесей раствор мономеров флагеллина, имеющих молекулярную массу
100 кДа.
Серологический анализ флагеллина A. brasilense Sp245
Иммунохимические свойства флагеллинов полярных жгутиков
штаммов Sp245 и Sp7 сравнивали методом
дот-анализа
и
в
реакции
иммунодиффузии.
В экспериментах, основанных на
использовании ферментной метки (дотанализ),
зафиксировано
практически
равное по интенсивности взаимодействие
антител на флагеллин Sp245 и антител на
флагеллин
Sp7
с
препаратами
флагеллинов этих штаммов, однако в
реакции иммунодиффузии (основанной на Рис. 3.
Результат
иммуноформировании
преципитата) диффузионного анализа препарата
взаимодействие антител на флагеллин Sp7 флагеллина полярного жгутика
Sp245 (А) с антителами на
с препаратом флагеллина Sp245 было изолированные
субъединицы
значительно менее интенсивным (рис. 3). полярного жгутика A. brasilense Sp7
Образование так называемой шпоры (1) и Sp245 (2, 3) и с антителами на
ЛПС Sp245 (4). В лунки 5 и 6 был
(одностороннее
продолжение
линии внесен ЗФР.
преципитации,
сформированной
антителами на флагеллин Sp245, на рисунке отмечена стрелкой). указывает
на то, что в составе антител на флагеллин Sp245 имеются антитела на
детерминанты анализируемого антигена, отсутствующие в составе антител
на флагеллин Sp7.
Полученные результаты говорят о наличии штаммовых серологических
отличий у флагеллинов бактерий Azospirillum brasilense. Кроме того, есть
10
основания полагать, что антигенная близость, обеспечивающая ранее
установленную родовую антигенную специфичность белковых детерминант
флагеллинов полярного жгутика азоспирилл [Беляков, 2011], обеспечивается,
преимущественно, наличием общих секвенциальных детерминант в составе
флагеллинов разных штаммов Azospirillum brasilense. В то время как
конформационные детерминанты (вносящие существенный вклад в
формирование полноценного иммунного преципитата) у разных штаммов
могут количественно различаться. Также с помощью реакции
иммунодиффузии с антителами на ЛПС в составе гликозилированного
флагеллина штамма Sp245 выявлены углеводные детерминанты, идентичные
детерминантам ЛПС этого штамма (рис. 3).
Выявление белковых пилей у A. brasilense Sp245 и мутантного штамма
A. brasilense SK048
Результаты иммуноэлектронной микроскопии клеток штамма Sp245 с
применением ранее полученных родоспецифичных антител на белковые
детерминанты [Широков и др., 2015] показали, что наночастицы золота
выявляют взаимодействие антител с пилеподобными поверхностными
структурами, несколько различающимися морфологически (рис. 4 и рис. 3B).
Картина иммуномечения клеток мутантного штамма SK048 (рис. 5)
свидетельствует
о
причастности
данных
структур
к
процессу
микроколониального
распространения
азоспирилл.
Являясь
мутантом штамма A.
brasilense Sp245, штамм
SK048
представляет
собой удобный объект
для
изучения
коллективной миграции
с
формированием
Клетки
Рис. 4.
Результат
иммуноэлектронной микроколоний.
лишены
микроскопии клеток A. brasilense Sp245 с использованием SK048
родоспецифичных антител на поверхностные белковые полярного жгутика и
детерминанты, меченных золотыми сферическими
распространяются
в
наночастицами.
полужидких средах не
посредством роения, а образуя микроколонии, напоминающие по виду
11
заключенные в среду гранулы (фенотип получил название Gri+ – от англ.
granular inclusions) [Шелудько, Кацы, 2001]. Данные, представленные на
рисунке 5, демонстрируют выявление на поверхности мутантного штамма A.
brasilense SK048 большого количества пилей, которые выглядят более
массивными образованиями (по сравнению с таковыми для штамма Sр245).
Эти результаты хорошо согласуются с данными Шелудько с соавторами
(2010) о том, что механизм миграции с формированием микроколоний(Gri+
фенотип) эффективно обеспечивает заселение бактериями растущих корней,
а в ходе взаимо действия с корнями пшеницы у азоспирилл происходит
увеличение продукции предсуществующих белковых поверхностных
структур – очевидно, пилей, задействованных в Gri+-подвижности.
Рис. 5.
Результат
иммуноэлектронной микроскопии клеток Gri+
мутанта
A.
brasilense
SK048
с
использованием родоспецифичных антител
на поверхностные белковые детерминанты,
меченных
золотыми
сферическими
наночастицами.
Рис. 6.
Результат
электронной
микроскопии клеток Gri+ мутанта A.
brasilense SK048, контрастированных
цитратом свинца.
Характер расположения наночастиц коллоидного золота на
поверхности клеток SK048 (рис. 5) позволил предположить, что в процессе
иммуномечения происходит обрыв соединившихся с меткой длинных
филаментов, в результате чего связанными с клеткой остаются только
короткие фрагменты меченых пилей. Чтобы оценить истинный размер этих
структур, применили метод контрастирования бактериальных образцов
цитратом свинца для выявления филаментов без использования иммунной
12
метки. Электронная микроскопия контрастированных образцов показала, что
клетки SK048 равномерно покрыты фибриллярными структурами, длина
которых составляет примерно 0,1-0,2 мкм (рис. 6). Получение и анализ
антител на клетки Gri+ мутанта SK048 позволили установить, что
пилеподобные структуры клеток штамма с Gri+ фенотипом не имеют какихлибо новых/дополнительных детерминант по сравнению с пилеподобными
структурами клеток штаммов диких типов, а отличаются только степенью
своей представленности на поверхности клеток мутантного штамма.
Анализ изменений клеточной поверхности и структуры макроколоний
бактерий Azospirillum brasilense под влиянием конго красного
С применением метода световой микроскопии исследовали
особенности фронта миграции из точки инокуляции в полужидкую среду
двух модельных штаммов A. brasilense Sp245 и Sp7. Для ингибирования
роения азоспирилл и проявления у них Gri+-фенотипа в культуральную среду
добавляли конго красный, модулирующий изменения социального поведения
азоспирилл.
Добавление в среду красителя приводило к изменению визуальной
структуры бактериальных макроколоний, представляющих собой массив
роящихся клеток. В полужидкой среде, содержащей конго красный,
небольшие мобильные колонии возникали среди единичных клеток обоих
штаммов и, сформировавшись, покидали границы фронта роения (рис. 7 А,
Б). При этом клетки Sp7 на среде без добавления красителя
распространялись исключительно посредством роения (рис. 7 В), а у Sp245
перед фронтом роящихся клеток обнаруживались единичные мигрирующие
микроколонии (рис. 7 Г), что свидетельствует о штаммовых различиях у
изучаемых бактерий в способности к спонтанному проявлению Gri +фенотипа. Результаты стереомикроскопии (рис. 8) показали, что
микроколонии, формируемые азоспириллами в присутствии красителя,
представляют собой не хаотичные агрегаты клеток, а организованные
бактериальные структуры. Методом электронной просвечивающей
микроскопии были оценены изменения поверхности бактерий, выращенных в
течение 2 суток в полужидкой среде в присутствии конго красного.
13
А
Б
В
А
Б
Г
Рис. 7.
Результат
прямой
световой
микроскопии фронта распространения бактерий
A. brasilense Sp7 (А, В) и Sp245 (Б, Г) в
полужидкой среде, содержащей краситель
конго красный (А, Б) в сравнении с контролем
(роение бактерий в среде без красителя) (В, Г).
1
Рис. 8.
Результат
стереомикроскопии
микроколоний,
формируемых A. brasilense Sp7 (А) и
Sp245 (Б) в полужидкой среде,
содержащей конго красный.
2
А
Б
Рис. 9.
Результат
электронной
микроскопии клеток A. brasilense Sp7 (1) и
Sp245 (2), выращенных на среде без конго
красного (А) и в присутствии красителя
(Б).
Показано,
что
клетки,
выращенные на среде, не содержащей
красителя, имеют полярные жгутики
(рис. 9А), тогда как клетки со среды с
конго красным не имеют жгутиков и
покрыты слоем фибриллоподобного
материала
(рис. 9Б), очевидно,
опосредующего микроколониальное
распространение.
Принимая во внимание сведения
о
комплексообразовании
конго
красного
с
углеводсодержащими
поверхностными структурами ряда
штаммов A. brasilense [Коннова и др.,
1994], мы оценили возможность ЛПС
этих бактерий выступать в роли
рецептора красителя.
Интерес к ЛПС определялся его
значительным вкладом в состав
наружной мембраны азоспирилл, а
также тем обстоятельством, что
14
выявленный ранее полисахаридный чехол, изолирующий от окружающей
среды филамент полярного жгутика у A. brasilense Sp7 и Sp245 [Бурыгин и
др., 2007], имеет антигенные детерминанты, идентичные детерминантам
соматических ЛПС данных штаммов.
Результаты, полученные с применением специфичных антител и ИКспектроскопии, позволяют рассматривать ЛПС азоспирилл в качестве
возможного рецептора конго красного.
О взаимодействии конго красного с ЛПС свидетельствовало частичное
ингибирование реакции агглютинации клеток Sp245, выращенных в
присутствии красителя, со штаммоспецифичными анти-ЛПС антителами.
Результаты ИК-спектроскопии препаратов бактериальных мембран
позволили сделать вывод о включении конго красного в состав комплекса с
компонентами мембран азоспирилл в хиноидной форме.
Оценка влияния флагеллина A. brasilense Sp245 на митотическую
активность растительных апикальных меристем
Одним
из
информативных
показателей,
характеризующим
положительное воздействие ассоциативной микрофлоры, является
повышение
интенсивности
деления
клеток
корневых
меристем
инокулированных растений [Levanony, Bashan, 1989]. Было оценено влияние
изолированных препаратов флагеллина полярного жгутика A. brasilense
Sp245 на функциональную активность клеток корневых меристем проростков
пшеницы, характеризуемую результатами определения митотического
индекса. Для оценки влияния флагеллина 3-суточные проростки пшеницы в
течение 3 ч инкубировали в растворе этого препарата с концентрацией 10
мкг/мл. Установлено, что обработка проростков пшеницы препаратом
флагеллина приводила к увеличению показателя митотической активности
меристематических клеток – достоверному росту митотического индекса
более чем на 30% за семь суток после обработки и общему превышению
этого показателя по сравнению с контролем на 25-50%.
Ранее
аналогичный
эффект
был
продемонстрирован
для
липополисахарида A. brasilense Sp245, при этом влияние изолированного
препарата ЛПС на интенсивность деления клеток корневых меристем
проростков пшеницы было сравнимо с влиянием целых бактериальных
клеток данного штамма [Evseeva et al., 2011]. Митогенная активность
бактериальных ЛПС по отношению к животным клеткам, например, Влимфоцитам, является хорошо изученным фактом [Аклеев, 2009], в то время
как способность флагеллинов влиять на деление клеток макропартнеров
отражена только в единичных публикациях. Так, в работе [Tsujimoto et al.,
15
2005] установлено, что ЛПС из E. coli 0111:B4 и рекомбинантный флагеллин,
синтезированный штаммом E. coli BL21, могут индуцировать пролиферацию
нормальных киллеров, изолированных из селезенки мыши. Способность
флагеллина ассоциативных бактерий влиять на интенсивность деления
клеток макроорганизма, в частности, растения-ассоцианта в настоящей
работе установлена впервые.
Можно предположить, что бактериальный флагеллин взаимодействует
со специфическими лектинами а также с рецептор-подобными киназами
[Antolin-Llovera et al., 2012; Felix et al., 1999], локализованными на
поверхности растительной клетки. Это взаимодействие способствует
трансдукции сигнала в ядро, что в дальнейшем может активизировать
функциональную активность клеток апикальных меристем растения [Zhu et
al., 2013].
Биоинформатический анализ 3D структур флагеллина и
пилиноподобных белков с использованием результатов полногеномного
секвенирования ДНК штамма A. brasilense Sp245
Нами был проведен анализ молекулярных 3D структур основных белков,
формирующих полярный жгутик, а также пилеподобных структур,
выявляемых на поверхности клеток штамма A. brasilense Sp245, методом
молекулярного моделирования по аминокислотным последовательностям,
аннотированным в сборке генома данного штамма [Wisniewski-Dye et al.,
2011]. Была использована одна из наиболее эффективных разработок в этом
направлении, реализованная на соответствующем веб-ресурсе (I-TASSER)
[Yang et al., 2015]. Указанный метод обеспечивает высокоточные
предсказания in silico пространственной структуры и основных функций
белков (связывание с лигандами, ферментативные свойства, генноонтологические характеристики) с использованием гомологичных шаблонов,
отыскиваемых программой в базе данных PDB экспериментально
определенных белковых структур (www.rcsb.org).
По итогам моделирования белков, аннотированных в геноме A.
brasilense Sp245 как флагеллин филамента полярного жгутика, установлено,
что, в зависимости от локализации генов белка в конкретном репликоне
(хромосома, плазмиды), он представлен в трех вариантах, различных по
молекулярной
массе
M,
рассчитанной
по
аминокислотной
последовательности (28,3; 43,6 и 65,2 кДа), и степени выраженности
вариабельной части (-структуры и петли), расположенной между высоко
консервативными N- и C-концевыми доменами (-спирали) аминокислотной
последовательности белка.
16
Белок массой 28,3 кДа морфологически практически не отличается от
соединительного белка FlgL и, возможно, таковым и является. С учетом
гомологии генов белок массой 43,6 кДа идентифицируется как флагеллин
Laf1 латерального жгутика [Moens et al., 1995].
Таким образом, внешний филамент жгутика формирует белок 65,2 кДа,
ген которого локализован на хромосоме и плазмиде p1 A. brasilense Sp245, в
наибольшей
мере
задействованный
в
растительно-бактериальных
взаимодействиях. Пример проекции на плоскость определенной 3D
структуры данного белка представлен на рис. 10. Следует заметить, что в
этом методе не учитывается эффект гликозилирования, вклад которого в
суммарную молекулярную массу флагеллинов азоспирилл может достигать
порядка 30% [Belyakov et al., 2012]. При внесении такой поправки к
значению M=65,2 кДа моделированного нами FliC значение молекулярной
массы белка становится соизмеримым
с его значением, определенным
методом ПААГ-электрофореза.
Среди семи белков, формирующих
пилеподобные
структуры,
гены
которых локализованы на плазмиде p4
A. brasilense Sp245, нами рассмотрены
3D структуры препилина Flp IVb и
белка CpaB. Первый представляет
собой
молекулярную
заготовку
главного структурного компонента
пилей, второй известен возможным
участием в процессах образования
биопленок [Wisniewski-Dye et al.,
2011].
Для Flp IVb программой был
Рис. 10. 3D структура белка FliC (65,2 определен ряд структурных аналогов,
кДа) A. brasilense Sp245
среди которых наиболее близкими
оказались эндотоксин из Bacillus
thuringiensis и модельный белок, сконструированный искусственно,
закристаллизованный и охарактеризованный методом рентгеноструктурного
анализа [Brunette et al., 2015]. Этот белок относится к категории
повторяющихся структурных элементов типа спираль-петля-спираль-петля,
широко распространенных среди разных организмов. Однако в данном
случае авторами [Brunette et al., 2015] была разработана и реализована
модель, существенно отличающаяся от известных повторяющихся белков без
какой-либо значительной структурной гомологии с ними. Так что
17
полученный нами результат может стать одним из первых прецедентов
обнаружения этой структуры в составе бактериального генома.
Для CpaB программой была предсказана
его структурная близость с шапероном из
одного из штаммов сальмонелл (рис. 11).
Полученный
результат
согласуются
с
результатами работы [Kinsella et al., 2017], в
которой
описывается
взаимодействие
протеазы CpaA с входящим в секреторную
систему
II
типа
мембраносвязанным
шапероном CpaB и оценивается их вклад в
вирулентность
представителей
рода
Acinetobacter.
Таким образом, нами впервые для
стимулирующих рост растений ризобактерий
A. brasilense Sp245 методом молекулярного Рис. 11. 3D структура CpaB A.
моделирования
определены
трехмерные brasilense Sp245 в сравнении с
структуры белков филамента полярного и каркасом шаблона PDB 3TEE –
шаперона
FlgA
латерального жгутиков, а также препилина и из
S.
enterica
SJW1446
шапероноподобного белка, определяющего (сплошная линия)
способность данного штамма к образованию
биопленок.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В настоящей работе выполнена иммунохимическая визуализация
поверхностных родоспецифичных белковых антигенов бактерий Azospirillum
brasilense, для чего оптимизирована процедура пробоподготовки
бактериальных клеток, обеспечивающая выявление на них in situ
поверхностных белковых структур. Электронно-микроскопический анализ с
использованием меченых металлическими наночастицами антител позволил
обнаружить в составе клеточной поверхности A. brasilense Sp245
детерминанты флагеллина полярного жгутика, исходно экранированные у
данных бактерий от окружающей среды липополисахаридным чехлом. На
поверхности дикого типа Sp245 и его Flaˉ Swaˉ Omegon-Km мутанта SK048
впервые
для
азоспирилл
выявлены
пилеподобные
структуры,
предположительно
вовлечённые
в
процесс
микроколониального
распространения этих бактерий. Следует отметить, что данные структуры
обнаруживаются в большем количестве у лишенного полярного жгутика
мутантного штамма SK048, распространяющегося в полужидких средах с
образованием микроколоний. Есть основания полагать, что эти
18
пилеподобные образования представляют собой выявленные ранее
антигенные маркеры Gri+-фенотипа у данных бактерий [Широков, 2008].
С использованием витального красителя конго красного в качестве
агента, способного изменять способ распространения бактерий, оценено
изменение поверхностных структур A. brasilense при переходе от роения в
полужидкой среде к распространению с образованием микроколоний. С
помощью
прямой
и
стереоскопической
световой
микроскопии
проанализированы особенности фронта миграции азоспирилл в полужидкой
среде. Установлено, что в среде с конго красным в массиве единичных
клеток азоспирилл образуются небольшие мобильные колонии, способные
покидать границы фронта роения. При этом микроколонии, формируемые
азоспириллами
в
присутствии
красителя,
представляют
собой
организованные бактериальные структуры. С помощью электронной
просвечивающей микроскопии показано, что лишенные жгутиков клетки со
среды с конго красным покрыты слоем фибриллоподобного материала,
очевидно, опосредующего распространение микроколоний, в отличие от
клеток, культивированных на среде без красителя, для которых характерно
наличие полярного жгутика. Результаты, полученные с применением
специфичных антител и ИК-спектроскопии, позволяют рассматривать ЛПС
азоспирилл в качестве возможного рецептора конго красного.
С помощью модифицированного способа получения химически
чистого
флагеллина
полярного
жгутика
выделен
препарат
гликозилированного
флагеллина
штамма
A.
brasilense
Sp245,
использованный для получения специфических антител и в экспериментах по
оценке влияния флагеллина азоспирилл на пролиферативную активность
клеток проростков пшеницы. Сравнительный иммунохимический анализ
флагеллинов бактерий, относящихся к серогруппе I (A. brasilense Sp245) и
серогруппе II (A. brasilense Sp7), выявил серологические отличия белковых
детерминант флагеллинов исследуемых штаммов. Впервые для
ассоциативных бактерий выявлено положительное влияние флагеллина
полярного жгутика эндофитного штамма A. brasilense Sp245 на
митотическую активность апикальных меристем проростков пшеницы.
Биоинформатический
анализ
3D
структур
флагеллина
и
пилиноподобных белков штамма A. brasilense Sp245, проведенный с
использованием результатов полногеномного секвенирования его ДНК,
позволил впервые для данных бактерий охарактеризовать трехмерные
структуры белков филамента полярного и латерального жгутиков, а также
препилина и шапероноподобного белка, определяющего способность
данного штамма к образованию биопленок. Структурные аналоги
19
исследуемых белков, выявленные методом гомологичного моделирования,
расширяют представления об их структуре и функциях.
ВЫВОДЫ
1. С помощью иммуноэлектронной микроскопии у штамма A. brasilense
Sp245 впервые для азоспирилл выявлены равномерно распределенные
на клеточной поверхности фимбрии и/или пилеподобные структуры,
имеющие в своем составе родоспецифичные белковые детерминанты.
Данные структуры выявляются в большем количестве у лишенного
полярного жгутика производного этого штамма, распространяющегося
в полужидких средах с образованием микроколоний.
2. Установлено, что в среде с конго красным в массиве единичных клеток
азоспирилл образуются организованные бактериальные структуры,
способные покидать границы роения. При этом клетки со среды с конго
красным не имеют жгутиков и покрыты слоем фибриллоподобного
материала, очевидно, опосредующего распространение микроколоний.
3. Обнаружены штаммовые серологические различия белковых
детерминант гликозилированных флагеллинов бактерий A. brasilense
Sp245 и Sp7.
4. Впервые для ассоциативных бактерий выявлено положительное
влияние флагеллина полярного жгутика эндофитного штамма A.
brasilense Sp245 на митотическую активность апикальных меристем
проростков пшеницы.
5. По
аминокислотным
последовательностям
флагеллина
и
пилиноподобных белков, закодированных в геноме штамма A.
brasilense Sp245, методом молекулярного моделирования впервые для
данных бактерий определены трехмерные структуры белков филамента
полярного и латерального жгутиков, а также препилина и
шапероноподобного белка, определяющего способность данного
штамма к образованию биопленок, с идентификацией разновидностей
флагеллинов, кодирующие последовательности которых локализованы
на разных репликонах.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ
1. Широков,
А.А.
Иммуноэлектронно-микроскопическое
исследование
поверхности клеток штаммов Azospirillum brasilense / А.А. Широков, А.А. Буданова,
А.М. Буров, Б.Н. Хлебцов, А.И. Красов, С.Ю. Щеголев, Л.Ю. Матора // Микробиология. –
2017. – Т. 86. – № 4. – С. 476-482.
20
2.
Буданова, А.А. Анализ изменений клеточной поверхности и структуры
макроколоний бактерий Azospirillum brasilense под влиянием конго красного /
А.А. Буданова, А.А. Широков, С.Ю. Щеголев, Л.Ю. Матора // Микробиология. – 2018. –
Т. 87. – № 1 – С. 50-55.
3. Бурыгин, Г.Л. Исследование мажорных антигенов клеточной поверхности
бактерий рода Azospirillum и их вклад в растительно-микробные взаимодействия /
Г.Л. Бурыгин, Л.Ю. Матора, Н.В. Евсеева, А.А. Широков, И.А. Красов,
Ю.А. Филипьечева, А.А. Буданова, И.А. Попова, С.Ю. Щеголев // Биомика. – 2018. –
Т. 10. – № 2. – С. 169-174.
4. Буданова, А.А. Визуализация поверхностных родоспецифичных белковых
антигенов бактерий Azospirillum brasilense / А.А. Буданова, А.А. Широков // Сб. науч. тр.
«Исследования молодых ученых в биологии и экологии». – Саратов: Изд-во Сарат. ун-та,
2012. – Вып. 10. – С. 3.
5. Буданова А.А. Визуализация поверхностных родоспецифичных белковых
антигенов бактерий Azospirillum brasilense / А.А. Буданова // Тез. науч. работ студ.
высших учеб. Заведений Саратовской области – участников областного конкурса
«Студенческая наука 2012». – Саратов: Научная книга, 2012. – С. 51-54.
6. Широков, А.А. Визуализация поверхностных родоспецифичных белковых
антигенов бактерий Azospirillum brasilense / А.А. Широков, А.А. Буданова, Л.Ю. Матора,
С.Ю. Щеголев // Материалы VI Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия
взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой». – Саратов: Научная
книга, 2012. – С. 116.
7. Буданова, А.А. Одновременная визуализация разных антигенов в составе
поверхности
Azospirillum brasilense методом иммуноэлектронной микроскопии с
использованием золотых и золото-серебряных наночастиц / А.А. Буданова // Сб. науч. тр.
«Исследования молодых ученых в биологии и экологии». – Саратов: Изд-во Сарат. ун-та,
2013. – Вып. 11. – С. 11.
8. Широков, А.А. Серологический мультидот анализ бактерий рода Azospirillum /
А.А. Широков, А.А. Буданова, Е.В. Панфилова, Б.Н. Хлебцов, С.Ю. Щеголев,
Л.Ю. Матора // Материалы II Всероссийской конференции «Фундаментальная
гликобиология». – Саратов: ООО «Ракурс», 2014. – С. 60.
9. Буданова, А.А. Исследование антигенных структур белковой и
липополисахаридной природы на поверхности бактерий Azospirillum brasilense /
А.А. Буданова, А.А. Широков, Л.Ю. Матора // Тезисы X молодежной школы –
конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной
микробиологии». – Москва, 2015. – С.34.
10. Широков, А.А. Анализ изменений клеточной поверхности и характера
подвижности бактерий Azospirillum brasilense под влиянием конго красного /
А.А. Широков, А.А. Буданова, В.С. Гринев, Л.Ю. Матора // Материалы VIII
Всероссийской
конференции
молодых
ученых
«Стратегия
взаимодействия
21
микроорганизмов и растений с окружающей средой». – Саратов: ООО «Ракурс», 2016. –
С.76.
11. Буданова,
А.А.
Иммуноэлектронно-микроскопическое
исследование
клеточной поверхности PGPR Azospirillum brasilense / А.А. Буданова, А.А. Широков,
А.И. Красов, С.Ю. Щеголев, Л.Ю. Матора // Материалы VIII Всероссийской конференции
молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей
средой». – Саратов: ООО «Ракурс», 2016. – С.84.
12. Буданова, А.А. Как прижизненный краситель конго красный взаимодействует
с клеточной поверхностью Azospirillum brasilense и влияет на социальное поведение
бактерий / А.А. Буданова, А.А. Широков, В.С. Гринев, Л.Ю. Матора // Сб. тезисов
III Пущинской школы-конференции «Биохимия, физиология и биосферная роль
микроорганизмов». – Москва: ООО «ИД «Вода: химия и экология», 2016. – С. 14-15.
13. Матора, Л.Ю. Белковые антигены клеточной поверхности ассоциативных для
растений бактерий рода азоспирилл in vitro и in silico / Л.Ю. Матора, А.А. Широков,
А.А. Буданова, С.Ю. Щеголев // Вавиловские чтения – 2017: Сборник статей межд. науч.практ. конф., посвященной 130-й годовщине со дня рождения академика Н.И. Вавилова.
Саратов, Саратовский ГАУ, ООО «Амирит», 2017. – С. 139-143.
14. Буданова, А.А. Исследование клеточной поверхности и социального
поведения бактерий Azospirillum brasilense Sp7 и Sp245 / А.А. Буданова, А.А. Широков,
Л.Ю. Матора // Сб. тезисов 21-й Международной Пущинской школы-конференции
молодых ученых «Биология-наука XXI века». – Пущино, 2017. – С. 8-9.
22
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
2
Размер файла
925 Кб
Теги
brasilense, бактерии, поверхностные, azospirillum, антигенов, исследование, белковые
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа