close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Разработка нового блокатора рецептора ГП IIb-IIIa тромбоцитов в ряду производных ксантина

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Самородов Александр Владимирович
РАЗРАБОТКА НОВОГО БЛОКАТОРА РЕЦЕПТОРА ГП IIB-IIIA
ТРОМБОЦИТОВ В РЯДУ ПРОИЗВОДНЫХ КСАНТИНА
14.03.06 - Фармакология, клиническая фармакология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук
Казань – 2018
2
Работа
выполнена
в
Федеральном
государственном
бюджетном
образовательном учреждении высшего образования «Башкирский государственный
медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации и
Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего
образования «Ижевская государственная медицинская академия» Министерства
здравоохранения Российской Федерации
Научные консультанты:
Ураков Александр Ливиевич - доктор медицинских наук, профессор
Камилов Фэликс Хусаинович - заслуженный деятель науки РФ, доктор
медицинских наук, профессор
Официальные оппоненты:
Удут Елена Владимировна - доктор медицинских наук, профессор РАН, ведущий
научный сотрудник Научно-исследовательского института фармакологии и
регенеративной медицины имени Е.Д. Гольдберга ФГБНУ "Томский национальный
исследовательский медицинский центр Российской академии наук"
Ловцова Любовь Валерьевна - доктор медицинских наук, доцент, заведующий
кафедрой общей и клинической фармакологии ФГБОУ ВО "Приволжский
исследовательский медицинский университет" Минздрава России
Гуляева Инна Леонидовна - доктор медицинских наук, профессор, заведующий
кафедрой патологической физиологии ФГБОУ ВО «Пермский государственный
медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера» Минздрава России
Ведущая организация: Федеральное государственное
учреждение "Институт экспериментальной медицины"
бюджетное
научное
Защита диссертации состоится «24» сентября 2018 г. в « » часов на заседании
Диссертационного совета Д 208.034.03 при ФГБОУ ВО «Казанский государственный
медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации
(420012, г.Казань, ул. Бутлерова, 49).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВО «Казанский
государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения
Российской Федерации (420012, г. Казань, ул. Бутлерова, 49 «Б») и на сайте
www.kazangmu.ru
Автореферат разослан
«__»
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор медицинских наук, доцент
_2018 г.
Г.Р. Хасанова
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования. Основная цель использования
антиагрегационных препаратов - снижение вероятности тромбоза после разрыва
атеросклеротической бляшки, профилактика и лечение острого инфаркта
миокарда, нарушения мозгового кровообращения по ишемическому типу и
тромбоза стента после интервентационных кардиологических вмешательств. В
связи с тем, что тромбоциты играют ключевую роль в инициации
тромбообразования, ингибирование их активности представляет собой один из
наиболее перспективных способов профилактики и терапии тромбозов
(Подоплелова Н.А. и др., 2016). Современной тенденцией является разработка
рецептор-ассоциированной антиагрегационной терапии. Активно продолжаются
исследования среди блокаторов рецептора PAR-1 (Muller K.A. et al., 2011), P2Y12
(Goto S. et al., 2015), фактора фон Виллебранда (Goto S. et al., 2015) и
гликопротеинов Ibα (Gresele P. et al., 2012) и VI (Nieswandt B. et al., 2001;
Ohlmann P. et al., 2008; Ungerer M. et al., 2013). Однако центральным
рецептором, реализующим связывание тромбоцитов с фибриногеном/фибрином,
является ГП IIb-IIIa, и именно его блокада должна обеспечивать наиболее
эффективное ингибирование агрегации тромбоцитов и образование тромбов.
В настоящее время в качестве антиагрегационных средств,
блокирующих тромбоцитарные рецепторы - ГП IIb-IIIa, в клинических условиях
используются три препарата для парентерального введения (Giugliano R.P. et al.,
2000). Первым, получившим одобрение FDA в 1994 году, было рекомбинантное
моноклональное антитело абциксимаб (Centocor/Eli Lilly, Нидерланды)
(Fratantoni J.C., 1983). Вторым - эптифибатид (Glaxo Operations UK Limited,
Великобритания), был одобрен в 1998 году, в его основу легли дезинтегрин и
барбурин, полученные из змеиного яда, с последовательностью Lys-Gly-Asp
(KGD). Третий одобренный препарат тирофибан (Correvio, Великобритания)
представляет собой непептидное соединение, которое моделируется на основе
лиганд-миметического пептида RGD. Успех многоцентровых контролируемых
исследований позволил внедрить блокаторы ГП IIb-IIIа в широкую
клиническую практику, в первую очередь для профилактики тромботических
осложнений при эндоваскулярных вмешательствах. Указанные лекарства
оказались более эффективными, чем другие антитромбоцитарные препараты
(аспирин, тиенопиридины) (Patrono C. et al., 2011).
Результаты
ранее
проведенных
собственных
исследований
свидетельствуют о высокой вероятности связывания рецептора - ГП IIb-IIIa
тромбоцита, у некоторых производных ксантина (Самородов А.В., 2012). В
связи с этим разработка новых отечественных блокаторов ГП IIb-IIIа среди
производных данного ряда представляется весьма перспективным направлением
в профилактике и лечении тромбозов.
4
Степень разработанности темы. В настоящее время на разных этапах
клинических и доклинических испытаний находятся препараты, блокирующие
рецепторы PAR-1 (Muller K.A. et al., 2011), P2Y12 (Goto S. et al., 2015), фактора
Виллебранда (Goto S. et al., 2015) и гликопротеинов Ibα (Gresele P. et al., 2012) и
VI (Ungerer M. et al., 2013). Однако и гликопротеин IIb-IIIa (интегрин αIIbβ3,
CD41/CD61)
по-прежнему
остается
перспективной
мишенью
антитромбоцитарной терапии (Giugliano R.P. et al., 2000) по причине
достаточного клинического опыта применения препаратов данной группы у
разных категорий пациентов.
В ФГБОУ ВО "Башкирский государственный медицинский университет"
Минздрава России совместно с ФГБОУ ВО "Ижевская государственная
медицинская академия" Минздрава России инициировались попытки поиска
потенциальных антитромботических препаратов на основе конденсированных
азотсодержащих гетероциклов. Были выявлены активные вещества, которые по
уровню и спектру антиагрегационной активности значительно превосходили
препараты сравнения (патент 2373929RU от 11.11.2008; патент 2459825RU от
31.05.2011; патент 2459826RU 31.05.2011). Установлено, что в химической
основе тиетанилксантина возможна реализация нескольких механизмов
антиагрегационного эффекта (Самородов А.В., 2012; Камилов Ф.Х. и др., 2015;
Халиуллин Ф.А. и др., 2017). В связи с этим важной является перспектива
разработки новых потенциальных блокаторов ГП IIb-IIIa среди производных
данного ряда и углубленное изучение их фармакологических свойств.
Целью исследования являются выявление и разработка потенциального
блокатора тромбоцитарного рецептора - ГП IIb-IIIa среди тиетансодержащих
производных гетероциклов.
Задачи исследования:
1. Провести скрининг ряда производных ксантина, триазола и
имидазола на систему гемостаза с выбором наиболее перспективного
соединения.
2. Изучить механизм антиагрегационного действия 3-метил-8пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорида.
3. Оценить
активность
3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1этилксантина гидрохлорида в условиях in vitro.
4. Оценить эффективность 3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1этилксантина гидрохлорида в условиях in vivo при введении интактным
животным и в условиях модельных тромбозов.
5. Разработать модель тромбоэмболии легочной артерии и оценить
эффективность терапии и профилактики 3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)1-этилксантина гидрохлоридом.
6. Изучить роль в поражение миокарда продуктов перекисного
5
окисления липидов в условиях экспериментальной тотальной ишемии и
ишемии-реперфузии
с
последующей
оценкой
эффективности
фармакологических средств коррекции.
Научная новизна. Впервые проведено изучение in vitro новых 250
тиетансодержащих производных ксантина, триазола и имидазола в отношении
антиагрегационной и антикоагуляционной активностей. Для малорастворимых в
воде соединений разработан биологически инертный растворитель (патент
2537260RU от 08.10.2013). Установлено, что в химической основе
пиперазинсодержащего
тиетанилксантина
возможна
реализация
и
антиагрегационной, и гемостатической активностей (патент 2373929RU от
11.11.2008; патент 2404181RU от 02.06.2009; патент 2459825RU от 31.05.2011;
патент 2459826RU от 31.05.2011). В результате скрининга найдено 20 активных
производных 7-тиетанил-8-пиперазиноксантинов, среди которых наиболее
перспективным является соединение 3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1этилксантина гидрохлорид (патент 2404181RU от 02.06.2009). Впервые
установлено, что пиперазинсодержащие производные тиетанилксантина
обладают способностью связывания с рецептором тромбоцитов - ГП IIb-IIIa
(патент 2643336RU от 31.01.2018). Установлены и изучены у 3-метил-8пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорида антиагрегационная,
дезагрегационная, противовоспалительная и антиоксидантная активности и
способность снижать тромбогенный потенциал сосудистой стенки. Впервые
проведена оценка токсичности и фармакокинетических параметров 3-метил-8пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина
гидрохлорида.
В
условиях
модельного тромбоза нижней полой вены у крыс установлена эффективность 3метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорида как в качестве
средства профилактики, так и средства лечения тромбоза. На оригинальной
разработанной нами модели тромбоэмболии легочной артерии (патент
2610212RU от 24.12.2015) продемонстрировано, что применение 3-метил-8пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина
гидрохлорида
способствует
реканализации
ранее пораженных эмболией сосудов легких аналогично
стандартной тромболитической терапии. Впервые проведена оценка
эффективности действия стандартных антиагрегационных препаратов и 3метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина
гидрохлорида
на
метаболизм миокарда в условиях тотальной ишемии и ишемии-реперфузии.
Биохимическими и инструментальными методами доказано, что
применение экспериментального вещества эффективно снижает зону
повреждения миокарда и препятствует обусловленному инфарктом
ремоделированию миокарда. По результатам впервые проведенного комплекса
оценки
влияния
соединения
3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1этилксантина гидрохлорида на систему гемостаза в условиях in vitro, ex vivo и in
6
vivo оно рекомендовано для клинических испытаний.
Теоретическая практическая значимость работы. По результатам
скрининга определены перспективные базовые структуры для поиска и
последующего изучения новых тиетансодержащих производных ксантина и
триазола, проявляющих антиагрегационную и антикоагуляционную активности.
Полученные экспериментальные данные позволяют проводить дальнейший
направленный поиск антиагрегационных веществ среди азотсодержащих
производных гетероциклов с заданным механизмом действия.
Выявленные
закономерности
между
антиагрегационной
и
антикоагуляционной активностями и химической структурой используются при
синтезе новых веществ в ФГБОУ ВО "Башкирский государственный
медицинский университет" Минздрава России (г. Уфа) и ФГАОУ ВО
"Самарский национальный исследовательский университет им. академика С.П.
Королева" (г. Самара).
Результаты работы внедрены в лекционные курсы кафедры
фармакологии ФГБОУ ВО "Ижевская государственная медицинская академия"
Минздрава России, кафедры органической, биоорганической и медицинской
химии ФГАОУ ВО "Самарский национальный исследовательский университет
им. академика С.П. Королева", кафедрах фармакологии и фармацевтической,
аналитической и токсикологической химии ФГБОУ ВО "Башкирский
государственный медицинский университет" Минздрава России.
Методологические подходы к изучению влияния азотсодержащих
производных гетероциклов на систему гемостаза, оригинальный растворитель
малорастворимых в воде веществ и экспериментальная модель тромбоэмболии
легочной артерии на крысах используются при проведении исследований в
лабораториях кафедр фармакологии ФГБОУ ВО "Башкирский государственный
медицинский университет" Минздрава России (г. Уфа), ФГБОУ ВО "Ижевская
государственная медицинская академия" Минздрава России (г. Ижевск) и
лабораториях ФГАОУ ВО "Самарский национальный исследовательский
университет им. академика С.П. Королева" (г. Самара).
Модель прогноза развития тромбоэмболических осложнений у
пациентов с высоким риском внедрена в практику клинических отделений ГБУЗ
"Республиканская клиническая больница им. Г.Г. Куватова" (г. Уфа), ГБУЗ
"Самарская городская клиническая больница № 1 им. Н.И. Пирогова" (г.
Самара), ООО "Клинический институт мозга" (г. Екатеринбург), ГАУЗ
"Центральная городская клиническая больница №18" (г. Казань).
Установлен механизм действия, определена область применения и
целесообразность доклинических и клинических исследований для нового
синтетического блокатора тромбоцитарных рецепторов ГП IIB-IIIa 3-метил-8пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина
гидрохлорида.
Результаты
7
исследования легли в основу заявки для получения разрешения I фазы
клинических испытаний.
Методология и методы исследования. Исследовательская работа
проведена в строгом соответствии с рекомендациями «Руководства по
экспериментальному изучению новых фармакологических веществ» (Москва,
2012).
Работа выполнена в период 2012-2017 гг. на кафедрах биологической
химии ФГБОУ ВО "Башкирский государственный медицинский университет"
Минздрава России и общей и клинической фармакологии ФГБОУ ВО
"Ижевская государственная медицинская академия" Минздрава России с
использованием научной методологии, основанной на системном подходе с
применением формально-логичных, общенаучных и специфических методов.
Для решения поставленных задач применялся весь разрешенный комплекс
доклинических исследований, который включает в себя изучение активности в
условиях in vitro на крови здоровых добровольцев, ex vivo у пациентов с
состоявшимся тромбозом, in vivo на здоровых лабораторных животных и
экспериментальную работу в условиях модельных тромбозов нижней полой
вены, тромбоэмболии легочной артерии и модели тотальной ишемии и ишемииреперфузии миокарда. Все эксперименты проведены с учетом требований
международных и российских законодательных актов о юридических и
этических принципах исследований с использованием лабораторных животных.
Для решения поставленных цели и задач исследования использовались
следующие методы: тромбоэластография, тромбодинамика, проточная
цитофлоуметрия, индуцированная агрегация тромбоцитов, стандартные
клоттинговые тесты, иммунотурбидиметрический метод и метод хромогенных
субстратов, спектрометрия, иммуноферментный анализ, хемилюминесценция,
хроматография, гистологические исследования и методы прижизненного
мониторинга основных витальных функций. Статистическая обработка
результатов экспериментов проводилась с помощью пакета прикладных
программ «Statistica 10.0» (StatSoft, США), «Kinetica 5.0» (Thermo Fisher
Scientific Inc., США) и «GraphPad Prism» (GraphPad Software, Inc., США).
Все исследования были одобрены этическим комитетом ФГБОУ ВО
«Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России
(протокол №1 от 14.02.2018).
Положения, выносимые на защиту
1. Соединение 3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина
гидрохлорид - новый синтетический блокатор тромбоцитарного рецептора ГП
IIb-IIIa.
2. В условиях эксперимента на этапах in vitro и in vivo соединение 3метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорид в качестве
8
средства профилактики и лечения тромбоза превосходит по уровню
антиагрегационной активности и эффективности все используемые в клинике
современные антиагрегационные препараты.
3. Соединение 3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина
гидрохлорид в условиях экспериментальной ишемии и ишемии-реперфузии
миокарда протектирует интенсивность процессов перекисного окисления
липидов, уменьшая зону повреждения миокарда.
4. Обоснована целесообразность дальнейшей оценки безопасности
соединения 3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорида
для получения разрешения на проведение клинических испытаний.
Степень достоверности и апробации результатов. Достоверность
результатов и обоснованность выводов базируется на адекватности
экспериментальных моделей in vitro и in vivo, достаточном объеме
исследований,
использовании
сертифицированного
оборудования
и
современных методов исследования, корректной статистической обработке
результатов исследования. Анализ данных и их обобщение проведены с
применением методов математической статистики и прикладной математики,
соответствующих характеру полученных данных и задачам диссертационной
работы. Все выявленные закономерности, эффекты, обобщения и выводы
подтверждались сериями независимых экспериментов, компьютерными
расчетами и результатами статистического анализа.
Основные материалы диссертации докладывались и обсуждались на 80й, 81-й республиканских научных конференциях студентов и молодых ученых
«Вопросы теоретической и практической медицины» (Уфа, 2015 и 2016 годы),
ежегодном международном конгрессе "Experimental Biology" (США, 2014 и
2017 годы), Российской научно-практической конференции с международным
участием, посвященной памяти профессора Д.М. Зубаирова «Актуальные
вопросы медицинской биохимии и клинической лабораторной диагностики»
(Казань, 2013 год), VII и VIII Российских научно-практических конференциях
«Здоровье человека в XXI веке» (Казань, 2015 и 2016 годы), Российской научнопрактической конференции «Зубаировские чтения: новое в коагулологии» и
российской научно-практической конференции «Медицинская биохимия:
достижения и перспективы» (Казань, 2015 год), XLVIII-XLIX международной
научно-практической конференции "Современная медицина: актуальные
вопросы" (Новосибирск, 2015 год), IV Международной научной конференции
«Перспективы развития биологии, медицины и фармации» (Казахстан, 2016
год), 7-м европейском конгрессе по фармакологии EPHAR-2016 (Турция, 2016
год), 3-м всемирном конгрессе «Controversies in Thrombosis and Hemostasis
(CiTH)», проводимом совместно с 8-й Всероссийской конференцией по
клинической гемостазиологии и гемореологии (Москва, 2016 год),
9
Всероссийской конференции молодых ученых "Химия и технология
гетероциклических соединений" (Уфа, 2017 год), Российском конгрессе
«Обоснованная терапия нарушений гемостаза» (Казань, 2017 год).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 45 работ, в том числе
19 статей в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень
российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования
основных научных результатов диссертаций, и 8 патентов на изобретения. 18
работ опубликованы в материалах всероссийских и международных
конференций и симпозиумов.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 279
страницах машинописного текста, иллюстрирована 56 рисунками, 50
таблицами, содержит 12 приложений. Состоит из введения, обзора литературы,
шести глав собственных исследований, заключения, выводов и списка
литературы, включающего 51 отечественных и 264 зарубежных источников.
Личный вклад автора. Автору принадлежит определяющая роль в
формировании научной тематики, обосновании цели и постановке задач. Автор
принимал непосредственное участие в создании базы данных соединений и
проведении экспериментов in vitro, ex vivo и in vivo. Интерпретация и анализ
полученных результатов, их публикация в научных изданиях и обсуждение на
конференциях, формулировка выводов и практических рекомендаций, а также
написание диссертации выполнены автором лично.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Исследовательская работа проведена в соответствии с рекомендациями
«Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых
фармакологических веществ» (Москва, 2012) в четыре основных этапа. Первым
этапом исследования был скрининг 250 новых производных ксантина,
имидазола и триазола, синтезированных на кафедре фармацевтической химии
Башкирского государственного медицинского университета, и ряда
лекарственных препаратов в отношении системы гемостаза в условиях in vitro.
В начале исследовали влияние соединений на адгезивно-агрегационную
функцию тромбоцитов (в концентрации 2×10-3 М) и коагуляционный компонент
гемостаза (в концентрации 10-3 г/мл) на крови здоровых доноров. Было отобрано
20 наиболее активных соединений; далее установили наиболее перспективное с
точки зрения потенциального лекарственного препарата активное соединение.
На втором этапе исследования в условиях in vitro изучили механизм
антиагрегационной активности наиболее перспективного соединения, его

Выражаем признательность заведующему кафедрой фармацевтической химии ФГБОУ ВО БГМУ
Минздрава России, профессору Ф.А. Халиуллину, предоставившему для исследования соединения.
10
влияние на процессы активации и агрегации тромбоцитов с расчетом показателя
IC50 и сопоставлением с препаратами сравнения. Далее изучили
гемосовместимость, антиоксидантные свойства, активность плазминогена и
пространственную
динамику
фибринообразования
в
концентрации
соответствующей IC50 соединения I для агрегации тромбоцитов. Завершили
второй этап оценкой эффективности наиболее перспективного соединения и
препаратов сравнения в отношении гиперагрегации тромбоцитов при
состоявшемся тромбозе ex vivo.
На третьем этапе исследования в экспериментах in vivo изучили
антиагрегационную активность препаратов сравнения и нового соединения при
внутрижелудочном и внутривенном введении крысам с определением
показателя ED50. Тирофибан, аспирин, пентоксифиллин и соединение I при
однократном внутривенном введении изучали в дозах эквимолярных 1, 2 и 4 мг/кг
интегриллина. Для соединения I дозы составили 0,5, 1 и 2 мг/кг, для тирофибана 0,5, 1 и 1,5 мг/кг, пентоксифиллина - 0,35, 0,7 и 1,5 мг/кг, аспирина - 0,22, 0,44 и
0,88 мг/кг. При однократном пероральном введении начинали исследовать
вещества в дозировке эквимолярной 19 мг/кг ацетилсалициловой кислоте (29 и 39
мг/кг), которая для соединения I составила 40,6 мг/кг (20, 10, 5, 2,5 и 1 мг/кг), для
тиклида - 32 мг/кг (20 и 10 мг/кг) и плагрила - 44 мг/кг (20, 10, 5, 2,5 мг/кг). Далее
изучили острую токсичность при разных путях введения и особенности
фармакокинетики (150 мг/кг) при внутривенном и пероральном введениях
мышам, длительность перфузии в кровотоке и возможность кумуляции в
органах и тканях. Оценили противовоспалительную, гемолитическую
активность, способность восстанавливать антитромботические свойства
сосудистой стенки при внутривенном введении соединения I в дозе равной
ED50 (0,9 мг/кг).
На четвертом этапе исследования изучили эффективность наиболее
перспективного с точки зрения потенциального лекарственного препарата
активного соединения и препаратов сравнения на экспериментальных моделях:
тромбоз нижней полой вены, тромбоэмболия легочной артерии, модель
тотальной ишемии и ишемии-реперфузии миокарда. Оценка эффективности на
данном этапе исследования для всех моделей тромбоза проводилась при
внутривенном пути введения. Соединения были изучены в дозах эквимолярных
дозе 1 мг/кг эптифибатида, что для соединения I соответствует 0,5 мг/кг,
тирофибана – 0,55 мг/кг, пентоксифиллина - 0,35 мг/кг, аспирина - 0,22 мг/кг;
монофрам был изучен в дозе 0,4 мг/кг.
На разных этапах исследования в условиях in vitro экспериментальная
работа выполнена на крови здоровых доноров-мужчин в возрасте 18-23 лет (485
человек) и пациентов (90 человек), находящихся в анестезиологореанимационном отделении №1 ГБУЗ "Республиканская клиническая больница
им. Г.Г. Куватова" (г. Уфа) в период 2012-2014 гг. со следующими остро
11
возникшими
заболеваниями:
острый
коронарный
синдром
(ОКС),
тромбоэмболия легочной артерии (ТЭЛА), тромбоз глубоких вен
(ТГВ)/мезентериальный тромбоз (МТ). Для сопоставления с группой тромбоза
была сформирована группа контроля, в которую включили 32 мужчин и 28
женщин. Информированное согласие было получено у всех участников
исследования до забора крови.
Вся экспериментальная работа в условиях in vivo выполнена на 990
белых беспородных половозрелых крысах и 675 половозрелых мышах обоего
пола с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по
защите позвоночных животных для экспериментальных животных, правил
лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ
(ГОСТ 3 51000.3-96 и 51000.4-96, ГОСТР 50258-92) и приказа
Минздравсоцразвития России № 708н от 23.08.2010 "Об утверждении Правил
лабораторной практики" (GLP). Исследование влияния на систему гемостаза в
условиях in vivo проводили при внутривенном введении крысам изучаемых
веществ в эквимолярных концентрациях.
Все тесты проводились на обогащенной и обедненной тромбоцитами
плазме. Образцы богатой тромбоцитами плазмы получали центрифугированием
цитратной крови при 1000 об/мин в течение 10 минут, бестромбоцитарной
плазмы - при 3000 об/мин в течение 20 минут. В работе использовалась
центрифуга ОПн-3.02 "Дастан" (ОАО ТНК "ДАСТАН", Киргизия).
Тромбоэластографию проводили на аппарате TEG 5000 (Haemoscope
Corporation, США). При анализе тромбоэластограмм определяли общую
тенденцию коагуляции (R), функциональную активность тромбоцитов и
фибриногена (МА, Angle), активность фибринолиза (CLT) и физикомеханические свойства образовавшихся сгустков (G). В качестве активатора
ТЭГ на разных этапах исследования использовали 0,2М р-р CaCl2,
рекомбинантный тканевой фактор (Innovin®, Dade Behring, Германия) и тромбин
(“Технология-Стандарт”, Россия).
Изучение агрегационной функции тромбоцитов проводили по методу
Born на агрегометре “Thromlite-1006A” и лазерном анализаторе агрегации
тромбоцитов Биола LA 220 (г. Москва). В качестве индукторов агрегации
тромбоцитов на разных этапах исследования использовались аденозиндифосфат
(АДФ) в концентрации 20 мкг/мл, коллаген в концентрации 5 мг/мл, адреналин
в концентрации 5 мкг/мл и ристомицин в концентрации 10 мг/мл производства
“Технология-Стандарт” (Россия). Анализ агрегатограмм проводился с
использованием программного обеспечения AGGR с учетом следующих
показателей: общий характер агрегации (одноволновая, двухволновая;
обратимая, необратимая), значение максимальной агрегации (МА),
максимальной скорости агрегации (tg α), среднего размера тромбоцитарных
12
агрегатов в относительных единицах (МРА).
Цитофлюориметрический анализ* проводили на базе кафедры
биологической химии ФГБОУ ВО КГМУ Минздрава России на приборе BD
FACSCanto II (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, США), используя
программное обеспечение «FACSDiva». Измеряли связывание с тромбоцитами
крови здоровых доноров флюорисцентно-меченых антител против СD61 и
CD41. Для этого вносили по 10 мкл PRP в пластиковые пробирки, разводили в
100 раз фосфатно-солевым буферным раствором (PBS). Образцы инкубировали
5 минут при комнатной температуре. После инкубации с исследуемым
веществом и препаратами сравнения образцы PRP инкубировали 20 минут при
комнатной температуре с моноклональными антителами CD41a, меченными PE
(фикоэритрином) и CD61, меченными FITC (флюоресцеинизотиоционатом),
(Becton Dickinson, США) согласно рекомендациям производителя.
В качестве маркера активации тромбоцитов измеряли экспрессию Рселектина на поверхности тромбоцитов. Для этого образцы богатой
тромбоцитами плазмы разводили в 100 раз 0,15 М фосфатно-солевым буферным
раствором (рН 7,0-7,5), вносили исследуемые препараты и инкубировали в
течение 5 минут. Для активации тромбоцитов в пробы вносили АДФ до
конечной концентрации 20 мкг/мл и перемешивали. Активацию проводили в
течение 15 минут, после чего клетки фиксировали добавлением 1% раствора
формалина. После инкубации образцы богатой тромбоцитами плазмы
окрашивали
20
минут
при
комнатной
температуре
мышиными
моноклональными антителами CD62, меченными APC (алофикоцианином)
(Becton Dickinson, США) согласно рекомендациям производителя.
Параметры настройки прибора были одинаковы для всех измерений. Для
каждой пробы собирали не менее 10000 событий. «Тромбоцитарное окно»
выделяли по параметрам прямого (FCS) и малоугольного (SSC) светорассеяний
в логарифмической шкале координат. Оценивали количество позитивных
клеток (%) по CD41а, СD61 и СD62.
Определение циркулирующих агрегатов проводили по методу Wu &
Hoak в модификации F.H. Kohanna. Венозную кровь набирали в две пробирки, в
одной из которых содержался раствор ЭДТА, а в другой - смесь раствора ЭДТА
с 4% раствором формалина. После перемешивания содержимое пробирок
отстаивали 30 минут при комнатной температуре. Во время отстаивания
тромбоцитарные агрегаты оседают, а отдельные тромбоциты остаются в
надосадочном слое. Затем подсчитывали число тромбоцитов в надосадочном
слое в каждой из пробирок.
Антиоксидантные свойства оценивали в простых модельных
*
Выражаем признательность заведующему кафедрой биологической химии ФГБОУ ВО КГМУ Минздрава
России, профессору И.Г. Мустафину за возможность проведения цитофлюориметрического анализа и
оценки пространственной динамики фибринообразования.
13
системах,
имитирующих
наиболее
распространенные
реакции
свободнорадикального окисления в организме и в средах, в которых
инициировалось образование активных форм кислорода и реакции перекисного
окисления липидов. Контролем служили модельные системы без добавления
исследуемого
соединения.
Регистрацию
свечения
проводили
на
хемилюминомере «ХЛМ-003» (Россия). В качестве интегрального показателя
интенсивности хемилюминесценции использовали светосумму свечения.
Определение гемолитического действия в условиях in vitro проводили
на спектрофотометре СФ-56 («ОКБ Ломо-Спектр», Россия) при длине волны
540 нм с регистрацией оптической плотности исследуемых растворов,
контрольной пробы (физиологический раствор), пробы со 100% гемолизом
(дистиллированная вода) против холостой пробы (вода).
Изучение влияния препаратов сравнения и соединения I на активность
плазминогена проводили с использованием стандартных наборов "ХромоТехПлазминоген" (“Технология-Стандарт”, Россия). Регистрировали изменение
оптической плотности (поглощения) на спектрофотометре СФ-56 ("ОКБ ЛомоСпектр", Россия) при длине волны 405 нм после добавления уксусной кислоты
(двухточечный метод).
Пространственную динамику фибринообразования исследовали на
базе кафедры биологической химии ФГБОУ ВО КГМУ Минздрава России на
приборе "Регистратор тромбодинамики Т-2" ("ГемаКор", Москва) путем
видеорегистрации направленного роста фибринового сгустка при активации
свертывания иммобилизированным тканевым фактором (Lipets E., 2014).
Для оценки биохимических показателей как результата ишемического
повреждения миокарда производили забор ткани сердца крыс с последующим
приготовлением гомогенатов и плазмы крови после полной перевязки /
временной окклюзии левой коронарной артерии. Биохимические показатели
определяли по стандартным методикам на автоматическом биохимическом
анализаторе с открытой реагентной системой Dirui CS-T240 (DIRUI Industrial
Co., Ltd, Китай) с применением оригинальных наборов реагентов.
Оценку фармакокинетических параметров выполняли на 70 белых
нелинейных мышах-самцах массой 20-25 г при внутривенном и
внутрижелудочном введении соединения I. Для этого опытным животным с
помощью шприца в хвостовую вену или зондом в желудок вводили исследуемое
вещество, растворенное в дистиллированной воде в дозе 150 мг/кг. Оценивали
динамику содержания соединения I в крови, распределение по органам и
тканям, производя забор крови и органов через 5, 10, 15, 30, 60 минут, 2, 4, 6, 12,
24 и 48 часов после введения. Образцы крови отстаивали в течение 10 минут в
условиях комнатной температуры. После центрифугирования (3000 об/мин в
течение 10 минут) отбирали плазму крови, которая хранилась в морозильной
14
камере при температуре –30° С. Количественный анализ проводили на
хроматографической системе Shimadzu LC-20 со спектрофотометрическим
диодно-матричным детектором ЦКП «Химия»* Уфимского института химии
РАН. Использовали колонку с фазой Bondapak C18 300х3,9 мм, 10 мкм. В
качестве подвижной фазы применяли элюент состава ацетонитрил: 0,01%
ацетатный буфер = 40:60. Скорость потока составляла 1 мл/мин.
Детектирование проводили при длине волны 290 нм. 5,0 мкл раствора образца
закалывались в хроматографическую петлю объемом 20 мкл и записывалась
хроматограмма.
Токсикологические исследования проводили на белых мышах-самцах и
самках в возрасте 2 месяцев со средней массой тела 20-21 г (Прозоровский В.Б.,
1962; Миронов А.Н., 2012) при внутривенном, внутрибрюшном и
внутрижелудочном введении. Вещества исследовали в дозах 100, 150, 200, 250,
275, 300, 350 мг/кг. Наблюдение за опытными группами проводилось в течение
14 суток.
Антиагрегационную активность сосудистой стенки исследовали
согласно методу D. E. MacIntyre (1978) в модификации В.П. Балуды (1980),
который основан на способности кусочка сосудистой стенки, помещенного в
богатую тромбоцитами плазму, выделять простациклин и ингибировать
агрегацию кровяных пластинок, вызванную различными индукторами.
Оценка противовоспалительного эффекта проводилась с помощью
моделей формалинового отека и экссудативного перитонита, вызванного
внутрибрюшинным введением 1% раствора уксусной кислоты.
Показатели, характеризующие состояние эндотелия, активность
коагуляционого звена гемостаза и маркеры процессов тромбообразования и
фибринолиза при действии изучаемых веществ, регистрировали на
автоматизированном селективном анализаторе гемостаза STA-Сompact (Ф.
Хоффманн-Ля Рош Лтд., Франция) стандартными клоттинговыми тестами
(АПТВ,
ПВ,
ТВ,
каолиновое
время,
рептилазное
время),
иммунотурбидиметрическим методом (D-димеры, концентрация фактора
Виллебранда) и методом хромогенных субстратов (активность антитромбина
III) с использованием оригинальных наборов реактивов производства Roche
Diagnostics.
Антитромботическую активность соединения I и препаратов сравнения
изучали на модели артериального тромбоза сонной артерии у крыс,
вызванного поверхностной аппликацией 50% раствора хлорида железа (III).
Крыс интраперитониально наркотизировали тиопенталом натрия (40,0 мг/кг),
послойно отпрепаровывали сонную артерию протяженностью в 3 см. На
*
Выражаем признательность с.н.с., к.х.н. С.П. Иванову и н.с., к.х.н. Абдрахимовой Г.С. за
выполнение количественного анализа методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
15
участок длиной около 1 см укладывали ватный диск размером 1,5х5,0 мм,
смоченный 50% раствором хлорида железа (III). Мониторинг кровотока
проводили проксимальнее ватного тампона в режиме доплер на аппарате
Samsung PT60A (Samsung Medison Co., Ltd., Корея). Регистрация проводилась
до полной окклюзии сонной артерии. Исследование влияния соединения I,
ацетилсалициловой кислоты, клопидогреля и тиклопидина на время окклюзии
сонной артерии проводили через 2 часа после внутрижелудочного введения.
Исследование влияния соединения I, пентоксифиллина, тирофибана,
эптифибадида и монофрама проводили при внутривенном введении за 10 мин
до моделирования тромбоза.
Моделирование тромбоза нижней полой вены. Экспериментальным
животным под наркозом (тиопентал натрия 50 мг/кг, внутрибрюшинно)
проводили срединную лапаротомию. Освобождали от соединительной ткани
участок нижней полой вены длиной 3 см в каудальном направлении от места
впадения левой почечной вены, подводили под нижнюю полую вену лигатуру и
завязывали ее, полностью перекрывая просвет сосуда, затем рану ушивали. Для
изучения эффективности соединения I и препаратов сравнения в качестве
средств профилактики тромбоза проводили внутривенное введение
исследуемых веществ за 1 час до моделирования тромбоза нижней полой вены.
Терапевтическая эффективность оценивалась моделированием тромбоза нижней
полой вены с последующим внутривенным введением изучаемых веществ через
каждые 24 часа в течение 7 суток в эквимолярных дозировках. После вывода
животных из эксперимента оценивали эффективность профилактического и
терапевтического эффектов по следующим показателям: выживаемость-падеж,
разница массы влажного и сухого тромбов, результаты гистологических
исследований и показатели системы гемостаза.
Моделирование тромбоэмболии легочной артерии (ТЭЛА) проводили
согласно оригинально разработанному нами методу (патент 2610212RU от
24.12.2015).
Факт
ТЭЛА
документировали
ангиопульмонографией,
морфогистологической оценкой легких крыс. Ангиопульмонографию
проводили на ангиографическом комплексе GI Innova 3100 (GE Healthcare,
США). В качестве контрастного вещества использовали водорастворимый
оптирей 350 (Tyco Healthcare, Канада). Контраст вводили в бедренную вену
крыс. Для световой микроскопии материал фиксировали в 10% растворе
формалина. После стандартной проводки готовили парафиновые срезы
микротомом LEICA RM 2145 (Leica Biosystems, Германия), которые
окрашивали гематоксилином и эозином. Оценка морфологических изменений
проводилась в 10 полях зрения на световом оптическом уровне при увеличении
x40 и x100 с помощью бинокулярного микроскопа "LEICA CME" (Leica
Biosystems, Германия).
16
Моделирование острого инфаркта миокарда. В стерильных условиях
проводили наркотизацию крыс внутрибрюшинным введением тиопентала
натрия (50 мг/кг). После подготовки операционного поля (бритье, обработка
антисептическими растворами и обкладывание стерильными салфетками)
проводили L-образный кожный разрез от верхнего края тела грудины до
мечевидного отростка по средней линии и далее по ходу VII ребра до средней
аксиллярной линии, разводили грудные мышцы и на уровне четвертого
межреберья, проводили торакотомию. На границе свободного края левого
желудочка визуализировали левую коронарную артерию, под которую
подводили лигатуру (пролен 6/0, Ethicon, Германия). Для моделирования
ишемии-реперфузии на нитку предварительно насаживали полиэтиленовую
трубку для создания временной окклюзии. По истечении 150 минут лигатуру
срезали, полиэтиленовую трубку удаляли, кровоток по левой коронарной
артерии восстанавливался. Для создания необратимой ишемии проводили
полную перевязку левой коронарной артерии. Операционную рану ушивали
послойно, проводили аспирацию остатков воздуха шприцем из плевральной
полости. Шов на коже обрабатывали спиртовым раствором хлоргексидина.
Для оценки профилактического эффекта за 1 час до перевязки
коронарной артерии внутривенно в хвостовую вену вводили исследуемые
вещества. Терапевтическую эффективность оценивали внутривенным
введением аналогичных дозировок (как на этапе оценки профилактического
эффекта) через 150 минут после остановки кровотока по левой коронарной
артерии, что соответствует среднему показателю «симптом-баллон», т.е. началу
медикаментозного сопровождения реваскуляризации.
Интраоперационно на 15, 30, 60-й минутах, 1-е, 3-и, 7-е сутки
эксперимента животным проводили непрерывный мониторинг основных
витальных показателей кардиологическим монитором МПР 6-03 «Тритон»
(ООО «Тритон-Электроникс», Россия) в режиме "Неонатал". Регистрировали
электрокардиограмму
в
стандартных
отведениях,
анализировали
вариабельность сердечного ритма, ST-сегмент, частоту сердечных сокращений и
насыщение артериальной крови кислородом трансперкутанно с задней лапки.
Эхокардиографию (ЭхоКГ) для оценки морфофункциональных
показателей сердца проводили на аппарате Samsung PT60A (Samsung Medison
Co., Ltd., Корея) до операции, через 15, 30, 60 минут и на 1-е, 3-и, 7-е сутки
эксперимента. Для обеспечения необходимого качества изображения
использовали сосудистые линейные датчики с частотой 13 МГц, глубина
сканирования составляла 2 см. После вывода животных из эксперимента
оценивали эффективность профилактического и терапевтического эффекта по
следующим показателям: выживаемость-падеж, результаты гистологических
исследований, показатели системы гемостаза и биохимические маркеры
17
поражения миокарда.
В качестве препаратов сравнения на разных этапах исследования
использовали:
1. 3,7-диметил-1-(5-оксогексил)ксантин ("Пентоксифиллин", ОАО
"Дальхимфарм", Россия).
2. Соль 1,3-диметилксантина с 1,2-этилендиамином ("Эуфиллин", ОАО
"Дальхимфарм", Россия).
3. Соль 1,3,7-триметилксантина с бензоатом натрия ("Кофеин-бензоат
натрия", ОАО "Дальхимфарм", Россия).
4. 2-ацетилоксибензойная кислота ("Ацетилсалициловая кислота",
Фармацевтическая фабрика Шандонг Ксинхуа Фармасьютикал Ко., ЛТД,
Китай).
5. Эптифибатид ("Интегрилин", Glaxo Operations UK Limited,
Великобритания).
6. Тирофибан ("Aggrastat", Correvio, Великобритания).
7. F(ab')2 фрагменты мышиных моноклональных антител FRaMon
против рецептора фибриногена тромбоцитов ГП IIb-IIIa ("Монафрам®", ЗАО
"Фрамон", Россия).
8. Эноксапарин натрия ("Клексан", Санофи-Авентис Франс, Франция).
9.
2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина
сукцинат
(Этилметилгидроксипиридина сукцинат, "Мексидол", ООО "НПК "Фармасофт",
Россия).
10. Кетопрофен ("Кетопрофен", ОАО "Синтез", Россия).
11. Тиклопидин ("Тиклид", Санофи-Авентис Франс, Франция).
12. Клопидогрел ("Плагрил", Dr. Reddy's Laboratories Ltd., Индия).
Статистическая обработка.
Результаты исследования были обработаны с применением
статистического пакета Statistica 10,0 (StatSoft Inc, США). Проверку на
нормальность распределения фактических данных выполняли с помощью
критерия Шапиро-Уилка. Для описания групп использовали медиану и
межквартильный интервал. Дисперсионный анализ проводили с помощью
критериев Краскела-Уоллиса или Манна–Уитни (для независимых наблюдений)
и Фридмена (для повторных наблюдений). Сравнение категориальных
переменных проводили с использованием теста χ2 или точного критерия
Фишера. Взаимосвязь признаков оценивали с расчетом коэффициента
корреляции Пирсона (r) и коэффициента детерминации (r2). Оценку частоты
признаков в общей структуре выборки провели методом сопряженных таблиц с
использованием χ2 Пирсона. Оценку мощности и объем выборки для ключевых
показателей системы гемостаза проводили с применением модуля Statistica
Power Analysis. Анализ выживаемости при тромбозе нижней полой вены
18
проводили методом Каплана-Мейера. Различия выживаемости между группами
оценивали при помощи критерия Вилкоксона. Для установки зависимости и
описания вероятности «ТЭЛА-предикторы» применяли регрессионный логитанализ с выводом функции зависимости. Критический уровень значимости р
для статистических критериев принимали равным 0,05. Фармакокинетический
анализ проведен с применением программного обеспечения Kinetica 5.0 (Thermo
Fisher Scientific Inc., США). Величину IC50 и ЕD50 рассчитывали с помощью
нелинейного фиттинга кривых, описывающих антиагрегационную активность
(%) по логарифмическому уравнению с 4 параметрами, используя программное
обеспечение GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., США).
Результаты исследования.
В первой главе представлен анализ отечественной и зарубежной
литературы, обосновывающий основные направления разработки препаратов
для рецептор-ассоциированной антиагрегационной терапии. Описываются
основные направления и новые подходы к поиску и созданию
антиагрегационных
препаратов.
В
данной
главе
подтверждается
перспективность разработки новых препаратов, ингибирующих рецептор ГП
IIb-IIIa тромбоцитов.
Вторая глава посвящена скринингу 250 новых производных
тиетансодержащих гетероциклических соединений и выбору наиболее
перспективного соединения. В процессе проведения скрининга была решена
проблема оценки биологической активности малорастворимых в воде веществ
разработкой оригинального растворителя на основе средств для
парентерального питания (патент 2537260RU от 08.10.2013). По результатам
скрининга установлено, что пиперазинсодержащие тиетанилксантины
потенциально могут являться новым классом антиагрегантов. Среди наиболее
активных соединений этого класса веществ выбрано производное под шифром
Ф-168 (рисунок 1) или 3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина
гидрохлорид (соединение I) как наиболее перспективное соединение (патент
2404181RU от 02.06.2009).
O
H 5C 2
O
N
N
N
N N
S
.
HCl
NH
CH3
Рисунок 1 – Структура 3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина
гидрохлорида (соединение I)
19
Третья глава посвящена углубленному изучению действия соединения I
в отношении системы гемостаза в условиях in vitro. Методом индукториндуцированной агрегации тромбоцитов и проточной цитометрией соединение I
сравнили с применяемыми в практике антиагрегантами и установили механизм
его антиагрегационной активности (таблица 1).
Таблица 1 - Показатели антиагрегационной активности изученных веществ при
индуктор-индуцированной агрегации тромбоцитов
Антиагрегационная активность,
IC50
Вещество,
М/л
Соединение I
Пентоксифил
лин
Аспирин
Тирофибан
Эптифибатид
Монофрам,
мкг/мл
АДФ,
20 мкг/мл
Коллаген,
5 мг/мл
TRAP,
10 мкМ
4,3×10-4
4,3×10-4
5,7×10-7
1,4×10-3
н.э.
4,2×10-3
6,4×10-5
5,1×10-5
1,4
Дезагрегац.
активность,
IC50
Связывание с
итнегринами ГП IIbIIIa, IC50
CD41a
CD61
7,7×10-4
0,47×10-3
1,73×10-3
н.э.
6,4×10-3
н.э.
н.э.
н.э.
6,3×10-5
5,4×10-5
н.э.
4,3×10-8
5,3×10-5
н.э.
н.э.
н.э.
н.э.
н.э.
2,7×10-4
н.э.
н.э.
н.э.
1,7
1,2
н.э.
1,34
н.э.
Установлено, что в присутствии пентоксифиллина и аспирина
происходит связывание МкАТ со всеми рецепторами тромбоцитов ГП IIb-IIIa по
интегринам CD41a и CD61. Эптифибатид демонстрирует эффект связывания с
интегрином CD41a рецептора ГП IIb-IIIa, который носит выраженный
дозозависимый характер. Соединение I в аналогичных дозировках связывается с
интегринами CD41a и CD61 рецептора ГП IIb-IIIa тромбоцитов. Результаты
исследования антиагрегационной активности показали, что соединение I
превосходит пентоксифиллин и ацетилсалициловую кислоту как по уровню
антиагрегационной активности - IC50, при которой агрегация тромбоцитов,
индуцированная АДФ, снижается на 50%, для соединения I составляет 4,3×10-4
М/л, для пентоксифиллина - 1,4×10-3 М/л. По результатам корреляционного
анализа установлена высокая взаимосвязь между антиагрегационной
активностью и эффектом связывания с рецептором ГП IIb-IIIa по интегринам
CD41a (АДФ: r=0.978, r2=0.957, p=0.00001; Коллаген: r=0.958, r2=0.919,
p=0.0001) и CD61 (АДФ: r=0.985, r2=0.971, p=0.00001; Коллаген: r=0.966,
r2=0.971, p=0.0001) для соединения I. При этом соединение I обладает
дезагрегационной
активностью,
т.е.
способностью
разрушать
уже
сформированные тромбоцитарные агрегаты, что среди всех общепризнанных
препаратов характерно только для пентоксифиллина. Следует отметить, что в
отношении
функциональной
активности
тромбоцитов
помимо
антиагрегационной и дезагрегационной активностей установлен эффект
ингибирования активации тромбоцитов для впервые синтезированного
20
соединения I.
На показатели активности коагуляционного звена гемостаза и
плазминогена эффектов ни соединения I, ни препаратов сравнения не
регистрировалось, что полностью соотносится с данными, отраженными в
данной работе, которые получены методами тромбоэластографии и
тромбодинамики.
Соединение I оказалось активнее ацетилсалициловой кислоты и
пентоксифиллина как в условиях тромбоэластограмм, активированных
тканевым фактором (ТФ) и тромбином (ТР), так при моделировании лечения ex
vivo пациентов с верифицированным тромбозом (таблицы 2 и 3).
Таблица 2 – Показатели антиагрегационной активности аспирина и
пентоксифиллина на образцах артериальной и венозной крови пациентов с
тромбозом, Ме (25%-75%)
Группа
Кровь
Вена
Тромбоз
Препарат
IC50
Пентоксифиллин
Аспирин
Монофрам
Эптифибатид
4,4×10-3 М/л
3,9×10-3 М/л
1,5 мкг/мл
5,1×10-5 М/л
Контроль
Тирофибан
6,3×10-5 М/л
Пентоксифиллин
4,4×10-3 М/л
Аспирин
3,9×10-3 М/л
Монофрам
1,5 мкг/мл
Артерия
Эптифибатид
5,1×10-5 М/л
Тирофибан
6,3×10-5 М/л
Пентоксифиллин
1,4×10-3 М/л
Аспирин
4,2×10-3 М/л
Монофрам
1,9 мкг/мл
Вена
Эптифибатид
5,1×10-5 М/л
Тирофибан
6,3×10-5 М/л
Пентоксифиллин
1,4×10-3 М/л
Аспирин
4,2×10-3 М/л
Артерия
Монофрам
1,5 мкг/мл
Эптифибатид
5,1×10-5 М/л
Тирофибан
6,3×10-5 М/л
p>0,05 для артериальной и венозной крови
21
Таблица 3 - Динамика показателей тромбоэластограмм в присутствии
изучаемых веществ в концентрации 2×10-3 М в зависимости от активатора, Ме
(25%-75%)
Показатель
Контроль
R, min
Angle, deg
MA, mm
G, dyn/cm2
CLT, min
Пентоксифиллин
R, min
Angle, deg
MA, mm
G, dyn/cm2
CLT, min
Аспирин
R, min
Angle, deg
MA, mm
G, dyn/cm2
CLT, min
Эптифибатид
R, min
Angle, deg
MA, mm
G, dyn/cm2
CLT, min
ЦК, n=7
ЦК+ТФ, n=7
ЦК+TР, n=7
12,8
(10,3-15,6)
44,7
(39,8-49,4)
57,3
(54,2-61,2)
9,7
(7,4-10,6)α
51,4
(49,1-53,8)β
69,4
(65,2-71,8)β
17,5
(13,6-20,7)β
44,6
(42,3-47,8)α
9,5
(8,4-10,4)
43,7
(41,9-45,6)**
53,7
(51,2-55,6)**
11,5
(10,6-13,5)*
42,1
(39,6-44,2)
9,1
(8,5-11,3)
46,4
(41,2-48,5)*
44,7
(41,2-48,5)**
8,4(7,2-9,4)**
39,6
(37,4-40,2)
9,1
(8,7-10,4)
39,1
(34,6-39,7)**
26,5
(22,1-30,2)**
6,4
(5,9-8,1)**
35,9
(33,8-37,5)
7,2
(5,1-8,7)β
56,3
(53,6-59,8)β
68,4
(66,1-70,2)β
18,6
(16,4-19,2)α †
45,6
(43,2-47,4)α
8,4
(7,2-9,4)
47,8
(44,8-48,2)**
61,7
(59,2-62,8)**
13,9
(12,5-14,7)*
43,1
(39,7-44,7)
5,7(4,5-8,1)
38,7
(35,4-42,4)
14,6
(13,2-15,8)
33,7
(29,6-35,2)*
41,8
(39,8-45,6)*
4,1
(3,6-4,4)**
36,2
(31,2-38,7)
13,6
(11,2-14,4)
33,7
(29,6-35,2)**
36,3
(31,2-39,5)*
3,7(3,1-4,6)*
38,4
(36,7-39,4)
14,1
(11,3-16,7)
24,7
(24,5-26,9)**
28,9
(23,5-30,1)**
3,1
(2,4-3,6)**
38,6
(35,1-38,9)
9,3(8,1-10,7)
41,2
(37,9-44,7)*
39,5
(37,5-43,1)*
7,9(7,6-8,2)**
36,2
(34,1-39,8)
7,4
(5,9-7,0)
38,5
(34,6-40,7)**
31,4
(29,1-34,1)**
7,4
(6,8-8,5)**
35,4
(31,6-39,1)
22
Продолжение таблицы 3
10,6
8,9
(8,3-11,5)
(7,6-8,2)
32,6
39,1
Angle, deg
(30,4-35,1)** (35,1-42,8)**
26,3
34,2
MA, mm
(22,1-30,2)** (31,1-38,6)**
6,1(4,2G, dyn/cm2 2,4(2,1-3,3)**
8,1(6,9-8,3)**
7,3)**
36,8
32,9
35,9
CLT, min
(35,1-38,7)
(31,1-35,8)
(34,6-38,7)
13,4
R, min
9,1(8,3-10,4)
7,9(6,2-8,3)
(11,6-14,8)
23,1
34,3
40,1
Angle, deg
(21,6-24,9)** (31,7-38,5)** (38,1-42,8)**
24,6
27,5
34,4
MA, mm
(21,5-27,3)** (25,1-30,2)** (30,7-34,5)**
6,7(5,2G, dyn/cm2 2,4(2,1-3,5)**
7,1(6,4-8,1)**
8,3)**
36,2
36,1
34,7
CLT, min
(33,7-39,1)
(34,5-38,4)
(32,4-38,1)
13,1
R, min
8,2(7,6-9,4)
7,4(5,9-8,0)
(12,3-15,4)
22,4
35,8
38,5
Angle, deg
(20,4-23,1)** (35,4-37,7)** (34,6-40,7)**
23,5
25,9
31,4
MA, mm
(22,4-25,3)** (24,9-29,3)** (29,1-34,1)**
6,9(5,3G, dyn/cm2 2,7(2,0-3,1)**
7,4(6,8-8,5)**
7,5)**
37,1
34,9
36,2
CLT, min
(34,9-36,5)
(32,6-36,4)
(35,1-39,6)
α
β
p<0,05; p<0,001- ЦК+TФ или ЦК+TР в сравнении с ЦК. *p<0,05; **p<0,001-в
сравнении с контролем. †p <0,05 – ЦК+ТР в сравнении с ЦК+TФ.
15,2
(14,6-18,3)
24,9
(22,5-28,3)**
29,4
(27,2-32,5)**
Соединение I
Монофрам
Тирофибан
R, min
Действие ацетилсалициловой кислоты и пентоксифиллина эффективнее
реализуется при активации свертывания тканевым фактором в сравнении с
тромбином. Соединение I проявляет антиагрегационную активность,
аналогичную препаратам сравнения, – эффективность больше на ТФактивированной тромбоэластограмме. При этом показатели максимальной
амплитуды тромбоэластограммы статистически значимо снижаются в
сравнении с контрольными значениями и препаратами сравнения. Показатель
прочности сгустка G в присутствии соединения I практически снижается до
значений тромбоэластограмм, регистрируемых без активации тромбином или
23
тканевым фактором. Концентрация пентоксифиллина, при которой АДФиндуцированная агрегация тромбоцитов крови пациентов с тромбозом
снижается на 50% (IC50), составляет 4,4×10-3 М/л против 1,4×10-3 М/л в
контроле. При этом расчетное IC50 ацетилсалициловой кислоты составляет
4,2×10-3 М/л для контрольной группы и 3,9×10-3 М/л – в условиях
гиперактивности тромбоцитов. Сопоставление показателей зависимости
концентрация-эффект для интактных тромбоцитов и тромбоцитов в состоянии
гиперактивности
демонстрирует
троекратное
увеличение
дозы
пентоксифиллина и снижение дозы аспирина для достижения аналогичного
эффекта, что свидетельствует о том, что эффективность аспирина в условиях in
vitro при исходно компрометированных тромбоцитах возрастает. Анализ
зависимости антиагрегационной активности от концентраций препаратов
группы блокаторов ГП IIb-IIIa для интактных тромбоцитов и тромбоцитов в
состоянии гиперактивности демонстрирует аналогичные концентрации IC50 для
АДФ. Подобно группе блокаторов ГП IIb-IIIa соединение I характеризуется
одинаковыми значениями IC50 для интактных тромбоцитов и тромбоцитов в
состоянии гиперагрегации.
Завершили данный этап исследовательской работы оценкой
антиоксидантных свойств и гемосовместимостью соединения I. По результатам
проведенного исследования в условиях моделирования генерации активных
форм кислорода и процессов ПОЛ установлено, что соединение I подавляло и
образование активных форм кислорода, и активацию ПОЛ, а все изученные
концентрации соединения I не вызывают гемолиза, что свидетельствует о его
полной гемосовместимости.
В главе 4 представлены результаты исследования активности соединения
I в условиях in vivo. Исходя из величин острой токсичности (LD50) при
энтеральном и парентеральных путях введения согласно классификации
химических веществ по параметрам острой токсичности И.В.Березовской и
критерию вредности и токсичности при оценке опасности химических веществ
по И.В. Саноцкому и И.П. Улановой соединения I относится к классу
малотоксичных веществ (таблица 4).
Таблица 4 - Острая токсичность (LD50) соединения I и препаратов сравнения,
мг/кг.
Путь
Пол
Соед. I
Аспирин
Пентоксифиллин
введения
♂
152,83
139,37
111,41
В/в
♀
137,91
125,31
107,32
♂
300,92
302,94
241,35
В/б
♀
286,52
301,46
229,54
♂
1657,85
1158,84
1364,84
Per os
♀
1474,46
1100,67
1221,63
24
Установлено, что соединение I независимо от способа введения
(пероральный или внутривенный) достигает максимальных концентраций с
разницей в 13,7±2,4 минуты (рисунок 2). Величина стационарного объема
распределения указывает на способность соединения I интенсивно проникать в
органы и ткани животных, особенно в миокард и почки (таблица 5).
Таблица 5 - Фармакокинетические параметры соединения I в плазме при
введении мышам в дозе 150 мг/кг
Показатель
Внутривенное введение
Энтеральное введение
AUC, мкг/мл×ч
40,2
38,2
-1
Kel, час
0,24
0,34
2
AUMC, мкг/мл×ч
217,81
210,6
Т1/2, ч
2,45
2,14
MRT, ч
6,2
5,9
CI, мл/час×кг
0,78
0,84
Vd, мл/г
3,54
4,31
Vss, мл/г
4,6
5,2
Рисунок 2 - Показатели зависимости концентрация-время в плазме крови
мышей в зависимости от способа введения соединения I в дозе 150 мг/кг
Результаты оценки антиагрегационной активности при введении крысам
позволяют констатировать, что расчетное ED50 для эптифибатида составила 1,9
мг/кг, тирофибана - 1,1 мг/кг, монофрама - 2,7 мг/кг, соединения I - 0,9 мг/кг.
Аналогичный эффект пентоксифиллина регистрировался в концентрации 27,8
мг/кг, а аспирина - 21,7 мг/кг. Таким образом, соединение I при внутривенном
25
введении активнее пентоксифиллина в 30,8 раза, аспирина в 20,1 раза,
монофрама в 3,0 раза и эптифибатида в 1,9 раза. Соединение I оказывает
антиагрегационный эффект сопоставимый с тирофибаном.
Следует отметить, что изученное вещество достоверно восстанавливало
способность стенки аорты угнетать процессы агрегации тромбоцитов. Меньшим
эффектом обладал пентоксифиллин, который восстанавливал способность
стенки аорты угнетать процессы агрегации тромбоцитов. У аспирина и
препаратов группы блокаторов ГП IIb-IIIa данный эффект в изученных дозах не
регистрировался (таблица 6).
Таблица 6 - Влияние соединения I на антиагрегационную активность
сосудистой стенки, Ме (25%-75%)
Исследуемое
Ингибирование агрегации тромбоцитов,
соединение
отн. ед.
PRP
PRP + сосудистая стенка
исходно
после введения
вещества
Соединение I
15,1 (13,2-17,5)*
20,7 (18,3-21,9)*
29,4
(27,3-31,5)
Пентоксифиллин
15,1 (13,2-17,5)*
16,8 (16,5-18,1)
*- p<0,05-изменения статистически значимы по отношению к контролю; PRP обогащенная тромбоцитами плазма
На модели тромбоза сонной артерии крыс, индуцированного
аппликацией 50% хлорида железа (III), соединение I проявило выраженную
антитромботическую активность и по показателю ED50 при пероральном
введении превосходит ацетилсалициловую кислоту в 3,9 раза, тиклопидина и
клопидгрель в 5,3 и 3,6 раза соответственно. При внутривенном введении
соединения I по ED50 превосходит препарат сравнения эптифибатид в 1,4 раза и
сопоставимо с эффектом тирофибана (таблица 7).
Таблица 7 - Показатели ED50 соединения I и препаратов сравнения при
внутривенном и внутрижелудочном введении крысам
Препарат
ED50 per os, мг/кг
Внутривенно, i.v., мг/кг
Ацетилсалициловая
127,3
кислота
Тиклопидин
173,5
Клопидогрел
117,9
Эптифибатид
1,7
Тирофибан
1,4
Соединение I
32,6
1,25
По результатам серии экспериментов, направленных на оценку
противовоспалительного эффекта, установлено, что при субплантарном
введении 0,1 мл 2% раствора формалина максимальный отёк лапки у крыс,
превышающий контрольные значения на 31,3% (р<0.05), регистрировался через
26
2 часа после введения формалина (таблица 8). На 2-е сутки наблюдений
статистической разницы между размерами конечности интактных и
контрольных животных не было. При внутривенном введении кетопрофена (50
мг\кг) выраженность отека лапок подопытных животных до 6-го часа
наблюдения была в среднем меньше, чем в контроле. При внутривенном
введении соединения I отмечалось статистически значимое уменьшение
«формалинового» отёка по сравнению с контрольной группой.
Таблица 8 - Динамика толщины лапок крыс под действием соединения I в дозе
0,9 мг/кг и кетопрофена на модели «формалинового отека», Ме (25%-75%)
Серия опыта Исходно 2 часа
4 часа
6 часов
24 часа
48 часов
3,5
5,1*
4,7*
4,5*
4,3*
3,6
0,9% NaCl
(3,1-3,8) (4,9-5,2) (4,6-4,8) (4,4-4,8) (4,2-4,4) (3,5-3,7)
3,5
4,6*,§,†
4,4*,§,†
4,2*,§,†
4,2*,†
3,8
Соединение I
(3,1-3,8) (4,4-4,7) (4,1-4,5) (4,1-4,3) (4,1-4,3) (3,6-4,0)
3,5
4,3*,§
4,1*,§
3,9*,§
3,7*,§
3,5
Кетопрофен
(3,1-3,8) (4,1-4,4) (4,0-4,3) (3,7-4,1) (3,5-3,9) (3,4-3,7)
* - p<0.05 до и после развития отека внутри групп, § - p<0.05 - группы опыта в
сравнении с группами физраствора, † - p<0.05 группа соединения I против группы
кетопрофена
Показатели антиэксудативного эффекта соединения I представлены в
таблице 9.
Таблица 9 - Антиэкссудативное действие соединения I в дозе 0,9 мг/кг, Ме
(25%-75%)
Количество
Количество
Угнетение
Группы
экссудата, % к
экссудата, мл
экссудации, %
контролю
Интактные крысы
0,5 (0,2-0,6)
S. NaCl 0.9%
2,1 (1,9-2,4)*
100,0
0,0
Соединение I
1,2 (1,1-1,3)*, §
42,8
57,2
* - p<0.05 в сравнении с интактными животными, § - p<0.05 - группа опыта в
сравнении с группой физраствора
В контрольной группе (нелеченные животные) через 3 часа после
введения раствора уксусной кислоты в брюшной полости появлялся экссудат
красновато-бурого цвета в количестве 2,1 (1,9-2,4) мл. В группе животных,
получавших соединение I, количество экссудата достоверно меньше - процент
угнетения экссудации составил 57,2%.
В главе 5 представлены результаты экспериментальной работы,
посвященной оценке эффективности терапевтического и профилактического
воздействия соединения I на модели тромбоза нижней полой вены на крысах.
Введение соединения I эффективно препятствовало образованию тромба в
27
условиях полной окклюзии нижней полой вены - при визуальном осмотре
участков нижней полой вены признаков тромбоза не было. Также соединение I
эффективно корректировало изменения системы гемостаза на фоне уже
состоявшегося тромбоза. Агрегация тромбоцитов, индуцированная АДФ и
коллагеном, статистически значимо снижалась практически в 2,3 раза в
сравнении с группой физиологического раствора. Уровень тромбоцитарных
агрегатов, рассчитанных по методу Wu-Hoak, снижался, что свидетельствует об
уменьшении массивности тромбоза и количества тромбоцитов в состоянии
гиперагрегации. Показатели масс тромбов (М) в группе соединения I были
наименьшими по сравнению с контролем и препаратами сравнения (таблица 10).
Таблица 10 - Показатели антитромботической активности соединения I и
препаратов сравнения при моделировании тромбоза нижней полой вены, Ме
(25%-75%)
Вещества
АДФ,
Коллаген, Wu-Hoak,
М
М
Δ М,
мм
мм
%
мокрая,
сухая,
г
г
г
Ложноопери
46,5
43,7
6,8
рованные
(44,6-53,1) (41,2-47,5) (4,6-9,1)
крысы
NaCl 0,9%
66,2**
68,6**
17,5*
11,3
4,6
4,4
(57,5-71,2) (58,9-72,4) (14,2-19,4) (8,9-10,6) (4,4-5,2) (4,3-4,9)
Пентоксифил
38,3
33,2
15,8**
8,2
3,7
4,5
лин
(37,1-43,2) (24,9-36,3) (13,6-16,9) (7,1-8,6) (2,2-4,1) (3,6-5,7)
АСК
49,9
42,4
13,5*
7,4**
3,3
4,1
(44,1-53,5) (37,3-45,7) (11,6-15,2) (6,5-9,3) (2,5-4,3) (3,5-6,2)
Соединение I
21,3**
24,5**
3,2
0,0
0,0
0,0
(19,2-25,8) (20,1-26,4) (1,1-4,3) (0,0-0,0) (0,0-0,0) (0,0-0,0)
Клексан
43,4
41,6
0,8**
0,0
0,0
0,0
(41,6-48,2) (40,2-45,3) (0,0-1,1) (0,0-0,0) (0,0-0,0) (0,0-0,0)
Эптифибатид
19,7**
22,4**
1,9**
0,0
0,0
0,0
(17,2-21,2) (21,7-24,5) (1,1-2,3) (0,0-0,0) (0,0-0,0) (0,0-0,0)
Монофрам
23,4**
26,9*
2,1**
0,0
0,0
0,0
(21,7-25,6) (24,5-29,1) (1,2-3,5) (0,0-0,0) (0,0-0,0) (0,0-0,0)
Тирофибан
22,7*
24,9*
1,1*
0,0
0,0
0,0
(19,6-24,5) (21,4-26,8) (0,9-1,3) (0,0-0,0) (0,0-0,0) (0,0-0,0)
*-p≤0.05, **-p≤0.001 - при сравнении опытных и контрольной группы
В главе 6 представлены результаты разработки оригинальной модели
тромбоэмболии легочной артерии и доказательства ее состоятельности как
инструмента доклинических испытаний (патент 2610212RU от 24.12.2015). На
следующем этапе экспериментов оценили эффективность соединения I при
данном состоянии. Установлено, что в группе крыс, получивших 0,9% раствор
NaCl, эптифибатид, монофрам и тирофибан, рентгенохирургическая картина
28
после инъекции физиологического раствора полностью соответствовала
исходной рентгенологической картине ТЭЛА - «размытый» характер
контрастирования с множественными дефектами наполнения в просвете
сосудов. В группе альтеплазы и соединения I отмечалась реканализация ранее
пораженных эмболией сосудов легких с полным восстановлением нормальной
рентгенологической картины - симметричный и свободный ток контрастного
вещества по малому кругу кровообращения с равномерным окрашиванием
легочного рисунка (рисунок 3).
А
Б
В
Г
Рисунок 3 - Пример ангиопульмонограмм: А - снимок крысы в нативе, Б диагностика ТЭЛА, В - на фоне в/в введения тирофибана или эптифибатида, или
монафрама, Г - на фоне в/в введения альтеплазы или соединения I
Принимая во внимание факт, что применение препаратов группы
блокаторов рецептора ГП IIb-IIIa в настоящее время регламентировано только в
интервенционной кардиологии, в главе 7 представлены результаты оценки
эффектов соединения I в отношении системы гемостаза и метаболизма
миокарда в условиях острого коронарного синдрома. На модели тотальной
29
ишемии по данным световой микроскопии зона инфаркта визуально не
отличалась от картины групп лечения и контроля. Однако в ткани миокарда
крыс, получивших соединение I, содержание креатинфосфата определялось
выше группы тотальной ишемии без лечения на 48,8% (p=0.002) и 13,2%
(p=0.001), а пирувата на 101% (p=0.004) и 80% (р=0.002) соответственно в
первые и третьи сутки эксперимента. При этом уровень лактата в ткани
миокарда был ниже в среднем на 30,5% (p<0.001) в первые, третьи и седьмые
сутки наблюдения, к 14-му дню эксперимента уровень лактата был ниже
контрольных значений на 11,7% (p=0.002). Активность каталазы в первые сутки
развития инфаркта миокарда оставалась выше на 21,5% (p=0.004), а на третьи
сутки - ниже на 22,5% (p=0.002) по сравнению с контрольной группой.
Концентрация МДА в группе соединения I на 1-е (p=0.001) и 3-и (p=0.002) сутки
наблюдений превышала значения интактных животных, однако на 7-е (p=0.2) и
14-е (p=0.3) сутки различий в содержании у интактных животных, в отличие от
других препаратов сравнения, уже не было. Общая динамика сывороточных
маркеров инфаркта миокарда у животных, получавших соединение I,
соответствует картине развивающегося некроза кардиомиоцитов в группе
животных без лечения. Активность ЛДГ статистически значимо отличалась от
группы контроля на 18,5% (p=0.002), 15,7% (p=0.001), 27,8 (p=0.002) и 30,5%
(p=0.003) соответственно для 1, 3, 7, 14-х суток. Уровни активности КФК и
КФК-МВ на весь период наблюдений были меньшими относительно
показателей крыс с тромбозом в среднем на 10% (p<0.05), а также в содержании
миоглобина и тропонина I статистически значимых различий не отмечалось
(рисунок 4). Эти результаты в комплексе свидетельствуют о предупреждении
доминирования энергосинтеза миокарда менее эффективным анаэробным путем
при инфаркте миокарда.
Отсутствие кровотока после эпизода перевязки коронарной артерии, с
одной стороны, значительно снижает эффективность любых фармакологических
воздействий на миокард, с другой - предварительное введение соединения I с
депонированием в ткани миокарда в сочетании с установленной
антиоксидантной и противовоспалительнной активностью позволяет оказывать
значительные эффекты на так называемый "оглушенный" и "гибернационный"
миокард, реально снижая область поражения. По результатам ЭхоКГисследования установлено, что дилатация камер и стенок сердца, систолическая
и диастолическая дисфункции у опытной группы животных значительно
меньшее в сравнении с группой контроля и препаратов сравнения (рисунок 5).
30
Рисунок 4 - Динамика биохимических показателей плазмы на фоне терапии
исследуемыми препаратами на модели необратимой ишемии
31
Рисунок 5 - Динамика показателей ЭхоКГ-мониторинга на фоне терапии
исследуемыми препаратами на модели необратимой ишемии
Более низкие значения NT-proBNP на 14-е сутки наблюдения
свидетельствуют о клинически менее выраженной сердечной недостаточности
по сравнению с другими группами исследования.
Применение основных препаратов из группы антиагрегантов на этапе
реканализации
положительно
влияет
на
морфофункциональные
и
метаболические характеристики миокарда. Использование препаратов группы
селективных блокаторов рецепторов тромбоцитов ГП IIb-IIIa при этом наименее
эффективно. Содержание и восстановление основного макроэрга креатинфосфата и уровень продуктов ПОЛ статистически не отличаются от
группы контроля. Однако зона поврежденного миокарда по результатам
световой микроскопии, данные ЭхоКГ (рисунок 6) на всех сроках эксперимента
свидетельствуют о менее выраженной кардиомиопатии и сократительной
дисфункции,
что
может
быть
объяснено
нивелированием
гемостазиологического компонента, усугубляющего стаз в месте нарушения
кровотока. Наиболее эффективен при этом оказался аспирин. Применение
ацетилсалициловой кислоты снижало отек и дилатацию камер и стенок сердца,
возникающих в результате реперфузии, препятствуя отсроченному
ремоделированию миокарда и развитию сердечной недостаточности.
32
Рисунок 6 - Динамика показателей ЭхоКГ-мониторинга на фоне терапии
исследуемыми препаратами на модели ишемии-реперфузии
Соединение I эффективнее аспирина влияло на процессы
энергетического обмена в миокарде. Установлено, что в ткани миокарда
животных данной группы содержание креатинфосфата в первые сутки
наблюдения определялось больше контрольной группы ишемии-реперфузии без
лечения на 36,9% (p=0.002) и меньше на 12,6% (p=0.001) интактных животных.
Содержание пирувата в ткани миокарда крыс группы соединения I в первые
сутки после реперфузионного синдрома было больше, чем в группе контроля, на
47,7% (p=0.003), но меньше, чем у интактных животных, на 23,3% (р=0.002).
Далее на 3-и, 7 и 14-е сутки статистических различий между группой контроля и
группой соединения I и интактными животными в концентрации
креатинфосфата и пирувата в миокарде не регистрировалось. При этом уровень
лактата в ткани миокарда на весь период наблюдения был ниже контрольной
группы на 24,1% (p=0.001) для первых суток и на 19,7% (p=0.003), 11,1%
(p=0.002) и 19,5% (p=0.001) для третьих, седьмых и четырнадцатых суток
эксперимента соответственно. На 14-е сутки исследования уровень лактата
соответствовал значению лактата интактных животных. Активность каталазы в
первые сутки развития реперфузионного синдрома снижалась на 24,6%
(p=0.001), далее, вплоть до 14 суток показатель оставался на уровне интактных
животных. Малоновый диальдегид в группе соединения I на всем протяжении
эксперимента характеризовался самым низким содержанием в сравнении с
группами препаратов сравнения и контроля. Однако в первые сутки его
содержание было выше на 19,4% (p=0.001), в третьи - на 15,5% (p=0.002), а в
седьмые - уже на 4,3% (p=0.3) и в четырнадцатые сутки - на 2,3% (p=0.4) по
сравнению с интактными животными. Общая динамика сывороточных маркеров
инфаркта миокарда в группе соединения I соответствовала картине группы
животных с ишемией-реперфузией без лечения (рисунок 7), но
33
характеризовалась менее выраженной интенсивностью.
Рисунок 7 - Динамика биохимических показателей ткани миокарда на фоне
терапии исследуемыми препаратами на модели ишемии-реперфузии.
34
Заключение
Таким образом, найдено активное соединение 3-метил-8-пиперазино-7(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорид, превосходящее по уровню
антиагрегационной активности все используемые в клинике препараты
сравнения, механизм действия которого заключается в блокировании
рецепторов тромбоцитов ГП IIb-IIIa. В ходе проведенного исследования
обоснована целесообразность завершения доклинических исследований,
касаемо аспектов безопасности, по результатам которых 3-метил-8-пиперазино7-(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорид может быть рекомендован к
клиническим испытаниям.
Перспективы дальнейшей разработки темы. Перспективным является
дальнейший поиск средств воздействия на систему гемостаза с разными
механизмами действия среди тиетансодержащих производных ксантина. После
завершения полного комплекса токсикологических исследований и получения
допуска целесообразно проведение клинических испытаний 3-метил-8пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорида.
Выводы
1. Скрининг 250 впервые синтезированных азотсодержащих
гетероциклических соединений выявил 20 производных 7-тиетанил-8пиперазиноксантинов, проявляющих биологическую активность в отношении
системы гемостаза. Наибольшей антиагрегационной активностью обладает 3метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорид.
2. Основным механизмом антиагрегационной активности 3-метил-8пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина
гидрохлорида
является
блокирующий эффект рецептора тромбоцитов ГП IIb-IIIa.
3. 3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорид в
условиях in vitro проявляет антиагрегационную, дезагрегационную и
антиоксидантную активности, превосходящие ряд препаратов сравнения.
4. При внутривенном введении крысам 3-метил-8-пиперазино-7(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорид оказывает антиагрегационное
действие, сопоставимое с тирофибаном, активнее пентоксифиллина в 30,8 раза,
аспирина в 20,1 раза, монофрама в 3,0 раза и эптифибатида в 1,9 раза. При
внутрижелудочном
введении
3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1этилксантина гидрохлорид превосходит по уровню антиагрегационной
активности аспирин в 8,7 раза, тиклопидин и клопидогрел в 5,1 и 2,6 раза
соответственно.
5. В условиях экспериментального тромбоза нижней полой вены крыс
введение 3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорида
препятствует образованию тромба, оказывает положительное корригирующее
влияние на систему гемостаза на фоне состоявшегося тромбоза. В сравнении с
35
группой
контроля
3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина
гидрохлорид нормализует значения тромбоэластографии, снижает агрегацию
тромбоцитов в 2,3 раза и количество тромбоцитарных агрегатов, рассчитанных
по методу Wu-Hoak, что в совокупности с результатами макроскопической
оценки свидетельствует об уменьшении массивности тромбоза и падении
количества тромбоцитов в состоянии гиперагрегации.
6. 3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорид
способствует реканализации пораженных эмболией сосудов легких на
оригинально разработанной модели ТЭЛА в отличие от эптифибатида,
монофрама и тирофибана.
7. Введение
3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина
гидрохлорида в условиях тотальной ишемии и ишемии-реперфузии
способствует снижению зоны поражения миокарда, что подтверждается
результатами гистологического исследования, ЭхоКГ и динамикой
биохимических маркеров поражения кардиомиоцитов. 3-метил-8-пиперазино-7(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорид снижает переход энергосинтеза
миокарда на анаэробный путь и препятствует постинфарктному
ремоделированию миокарда эффективнее всех изученных препаратов
сравнения.
Практические рекомендации
1. Рекомендовать 3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина
гидрохлорид для дальнейшей оценки безопасности с перспективой получения
разрешения на проведение клинически исследований.
2. Рекомендовать включить в обязательный объем доклинических
исследований средств, влияющих на систему гемостаза, разработанную
модель тромбоэмболии легочной артерии.
3. Рекомендовать разработанную модель прогноза развития тромбоза в
качестве средства выявления пациентов с высоким риском тромбоэмболических
осложнений.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИ
1. Антиагрегационная активность новой циклогексиламмониевой
соли на основе 1-этилксантина в условиях in vitro / Ф.Х. Камилов, Г.А.
Тимирханова, А.И. Самородова и др. // Казанский медицинский журнал. 2013. - Т. 94, № 5. - С. 692-695.
2. Choosing potential dissolution medium to study the influence of waterinsoluble substances on aggregation of platelets within preclinical studies under
conditions in vitro / F.K. Kamilov, G.A. Timirkhanova, A.V. Samorodov et al. //
Biology and Medicine. - 2013. - Vol. 5, №1. - P. 15-19.
3. Выбор растворителя для изучения влияния водонерастворимых
веществ на коагуляционный компонент гемостаза в условиях in vitro на
36
доклиническом этапе / Ф.Х. Камилов, Г.А. Тимирханова, А.И. Самородова
и др. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2014. - Т.12, № 6. - С. 11-14.
4. Antithrombotic activity of new 1-ethylxanthine cyclohexylammonium salt /
A.V. Samorodov, F.Kh. Kamilov, G.A. Timirkhanova et al. // FASEB Journal. - 2014.
- Vol. 28, S1. - 1054.5. - Режим доступа:
https://www.fasebj.org/doi/abs/10.1096/fasebj.28.1_supplement.1054.5
5. Новая циклогексиламмониевая соль на основе 1-этилксантина, как
средство профилактики тромбоза в эксперименте / А.В. Самородов, Ф.Х.
Камилов, Г.А. Тимирханова и др. // Здоровье человека в XXI веке: сборник
научных статей. - Казань, 2015. - С. 710-713.
6. Поиск новых антиагрегантов в ряду тиетансодержащих аналогов
пуриновых алкалоидов / Ю.В. Шабалина, М.А. Уразбаев, А.В. Исакова и др. //
Республиканский научный журнал “VESTNIK”. - 2015. - Т. 73, № 4. - С. 20-21.
7. Антиагрегационная активность нового производного ксантина в
условиях гиперагрегации тромбоцитов in vitro / А.В. Самородов, Ф.Х.
Камилов, Ф.А. Халиуллин и др. // Казанский медицинский журнал. - 2015. Т. 96, № 5. - С. 857-862.
8. Соли тиетансодержащих (ксантинил-8-тио)уксусных кислот как
потенциальные антиагреганты / Ю.Ф. Ахметзянова, Я.И. Кожевникова, И.В.
Шигапова и др. // Вестник Башкирского государственного медицинского
университета. - 2015. - S2. - С. 550-555.
9. Поиск потенциальных антикоагулянтов среди производных
азотсодержащих гетероциклов / А.В. Самородов, Ф.Х. Камилов, А.Р. Халимов и
др. // Сборник статей по материалам XLVIII-XLIX международной научнопрактической конференции "Современная медицина: актуальные вопросы". Новосибирск, 2015. - С. 132-136.
10. Antithrombotic effect of new cyclohexilammonium salt 2-[1-ethyl-3-methyl7-(dioxothietanyl-3)xanthinyl-8-thio]acetic acid on experimental venous thrombosis /
A.V. Samorodov, F.Kh. Kamilov, F.A. Khaliullin et al. // В сборнике: 7th European
Congress of Pharmacology (EPHAR2016) Congress Book. - 2016. - С. 167.
11. Влияние солей тиетанилксантинов на АДФ-индуцированную агрегацию
тромбоцитов в условиях in vitro / А.Р. Халимов, А.В. Самородов, Г.А.
Тимирханова и др. // Материалы 81-й Республиканской научной конференции с
международным участием «Вопросы теоретической и практической медицины».
– Уфа, 2016. – С.193-196.
12. Первичный анализ зависимости антикоагуляционной активности
тиетансодержащих
производных
теофиллина
от
стереохимических
особенностей строения молекул / Г.А. Тимирханова, Ф.А. Халиуллин, А.В.
Самородов и др. // Здоровье человека в XXI веке. - Казань, 2016. - С. 430-433.
13. Анализ взаимосвязи "структура-антикоагуляционная активность" в ряду
тиетансодержащих производных ксантина. Сообщение II / А.В. Самородов, А.Р.
Халимов, Г.А. Тимирханова и др. // Материалы 81-й республиканской научной
конференции с международным участием «Вопросы теоретической и
практической медицины». – Уфа, 2016. – С. 528-532.
14.
Результаты
доклинических
исследований
новой
циклогексиламмониевой
соли
2-[3-метил-7-(1,1-диоксотиетанил-3)-1-
37
этилксантинил-8-тио]уксусной кислоты в отношении системы гемостаза в
условиях in vivo / А.В. Самородов, Ф.Х. Камилов, Ф.А. Халиуллин и др. //
Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2016. № 8. - С. 10-17.
15.
Антиагрегационная
активность
солей
производных 7тиетанилксантина в условиях in vitro / А.В. Самородов, Ф.Х. Камилов, А.Р.
Халимов и др. // Современные проблемы науки и образования. - 2016. - № 5.
- С. 32.
16. Морфологические критерии эффективности антитромботической
терапии на модели острого тромбоза нижней полой вены у крыс на этапе
доклинических исследований / А.В. Самородов, Ф.Х. Камилов, Ф.А. Халиуллин
и др. // Тромбоз, гемостаз и реология. 2016. - Т.67, № S3. - С. 368-369.
17. Синтез и изучение влияния на систему гемостаза солей 2-[3-метил1-пропилксантинил-8-тио]уксусных кислот, содержащих тиетановый цикл
/ Ф.А. Халиуллин, Ю.В. Шабалина, А.В. Самородов и др. // Медицинский
вестник Башкортостана. -2016. - Т. 11, № 5. - С. 140-144.
18. Влияние новой калиевой соли на основе 3-тиетанилзамещенного
триазола на систему гемостаза / А.В. Самородов, Ф.Х. Камилов, А.Р.
Халимов и др. // Биомедицина. - 2016. - № 3. - С. 59-67.
19. Поиск новых биологически активных веществ в ряду
тиетансодержащих аналогов пуриновых алкалоидов / Ю.В. Шабалина, А.В.
Самородов, Г.Г. Давлятова и др. // Оңтүстік Қазақстан мемлекеттік
фармацевтика академиясы Хабаршысы. - 2016. - Т. 2, №4. - С. 116-118.
20. Стереохимические показатели молекулы, как предикторы
антикоагуляционной активности в ряду тиетансодержащих производных
ксантина / Г.А. Тимирханова, А.В. Самородов, Ф.Х. Камилов, Ф.А. Халиуллин //
Наука и инновации в XXI веке: актуальные вопросы, открытия и достижения:
сборник статей Международной научно-практической конференции, 2017. - С.
215-218.
21. Уровни антитромбина III и D-димеров как предикторы развития
тромбоэмболии лёгочной артерии у пациентов с тромбозом глубоких вен /
А.Л. Ураков, К.Г. Гуревич, Ф.Х. Камилов и др. // Казанский медицинский
журнал. - 2017. - Т. 98, № 6. - С. 957-962.
22. Особенности экспрессии Р-селектина и агрегации тромбоцитов под
действием лекарственных препаратов / А.Л. Ураков, А.В. Самородов, Ф.Х.
Камилов и др. // Фармация. - 2017. - Т. 66, № 3. - С. 43-46.
23. Влияние калиевой соли 2-[3-бром-1-(тиетанил-3)-1,2,4-триазолил-5тио]уксусной кислоты на систему гемостаза / В.Г. Кукес, Н.Б. Лазарева,
Д.Б. Никитюк и др. // Фармация. - 2017. - Т. 66, № 6. - С. 51-55.
24. Полирегионарная агрегатометрия крови пациентов с острым
тромбозом, как потенциальная модель доклинических исследований новых
корректоров системы гемостаза ex vivo / А.Л. Ураков, А.В. Самородов, Ф.Х.
Камилов и др. // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. - 2017. Т. 16, № 1 (61). - С. 65-71.
38
25. Antithrombotic activity of new potassium salt 2-[3-bromine-1-(thietanil-3)1,2,4-triazolil-5-thio]acetic acid / A.V. Samorodov, F.Kh. Kamilov, E.E. Klen et al. //
FASEB Journal. - 2017. - Vol. 31, S1. - 674.14. - Режим доступа:
https://www.fasebj.org/doi/abs/10.1096/fasebj.31.1_supplement.674.14
26. Синтез новых солей 2-[1-бензил-3-метил-7-(тиетанил-3) ксантинил8-тио] уксусной кислоты и их влияние на систему гемостаза / М.А.
Уразбаев, Ф.А. Халиуллин, А.В. Самородов, Ф.Х. Камилов // Здоровье и
образование в XXI веке. - 2017. - Т. 19, № 10. - С. 374-378.
27. Результаты первичного скрининга новых солей производных 7тиетанил-3-пропил-ксантина в отношении системы гемостаза в условиях in
vitro / А.Л. Ураков, А.В. Самородов, Ф.Х. Камилов и др. // Здоровье и
образование в XXI веке. - 2017. - Т. 19, № 2. - С. 117-121.
28. Dynamics of thrombosis and hemostasis system indicators in rats with
thrombosis of inferior vena cava in experiment as a model for preclinical studies
/ A.L. Urakov, A.V. Samorodov, F.Kh. Kamilov et al. // Biomedical and
Pharmacology Journal. - 2017. - Т. 10, № 1. - С. 237-245.
29. Анализ взаимосвязи "структура-антикоагуляционная активность" в ряду
тиетансодержащих производных ксантина. Сообщение III / М.А. Уразбаев, А.В.
Самородов, Е.В. Захарова, Р.Ф. Файзуллина // Вестник Башкирского
государственного медицинского университета. - 2017. - S2. - С. 799-802.
30. Антикоагуляционная активность и сульфоксиды тиетансодержащих
производных ксантина / Р.Ф. Файзуллина, Е.В. Захарова, А.В. Самородов //
Вестник Башкирского государственного медицинского университета. - 2017. S2. - С. 839-843.
31. Hemostatical activity of new benzylammonium salt 2-[3-methyl-1npropyl-7-(1,1-dioxotiethanyl-3)xantinyl-8-thio]acetic acid / A.L. Urakov, A.V.
Samorodov, F.Kh. Kamilov et al. // National Journal of Physiology, Pharmacy
and Pharmacology. - 2017. - Vol.7, №12. - P. 1-6.
32. Антикоагуляционная активность в ряду тиетансодержащих
производных ксантина / Г.А. Тимирханова, М.А. Уразбаев, А.В. Самородов и
др. // Оңтүстік Қазақстан мемлекеттік фармацевтика академиясы Хабаршысы. 2017. - № 1 (78). - С. 137-140.
33. Синтез и влияние на систему гемостаза тиетансодержащих солей 2-[3метил-1-пропилксантинил-8-тио]уксусных кислот / Ю.В. Шабалина, А.В.
Самородов, Ф.А. Халиуллин и др. // Материалы Всероссийской конференции
молодых ученых "Химия и технология гетероциклических соединений". - Уфа,
2017. - С. 150 -151.
34.
Антикоагуляционная
активность
среди
тиетансодержащих
производных ксантина / М.А. Уразбаев, Г.А. Тимирханова, А.В. Самородов,
Ф.А. Халиуллин // Материалы Всероссийской конференции молодых ученых
"Химия и технология гетероциклических соединений". - Уфа, 2017. - С. 153 154.
35. Синтез и влияние на систему гемостаза солей 2-[3-метил-7-(1оксотиетанил-3)-1-этилксантинил-8-тио]уксусной
кислоты
/
Ю.В.
Шабалина, Ф.А. Халиуллин, А.Л. Ураков и др. // Медицинский вестник
Башкортостана. - 2017. - Т. 12, № 6 (72). - С. 140-144.
39
36. The off-label use of drugs for parenteral nutrition as a solvent of
substances slightly soluble in water in pharmacological research / A.L. Urakov,
I.G. Mustafin, A.V. Samorodov et al. // Journal of Advanced Pharmaceutical
Technology & Research. - 2018. - Vol. 9, №1. - P. 9-14.
37. Синтез и антиагрегационная активность солей 2-[3-метил-1этилксантинил-8-тио]уксусных кислот, содержащих тиетановый цикл /
Ф.А. Халиуллин, Ю.В. Шабалина, А.В. Самородов и др. // Химикофармацевтический журнал. - 2018. - Т.52, №1. - С.29-32.
Патенты:
1.
Соли
[3-метил-1-н-пропил-7-(1,1-диоксотиетанил-3)ксантинил-8тио]уксусной кислоты, проявляющие проагрегантную активность / Ф.Х.
Камилов, Г.А. Тимирханова, А.В. Самородов и др. // Патент РФ № 2459825 от
27.08.2012.
2. Циклогексиламмониевая соль [3-метил-1-н-пропил-7-(1-оксотиетанил3)ксантинил-8-тио]уксусной кислоты, проявляющая антитромботическую
активность / Ф.А. Халиуллин, Р.А. Губаева, Ю.В. Шабалина и др. // Патент РФ
№ 2459826 от 27.08.2012.
3. Растворитель малорастворимых в воде соединений / Ф.А. Халиуллин,
Ф.Х. Камилов, Г.А. Тимирханова, А.В. Самородов и др. // Патент РФ №
2537260 от 08.10.2013.
4. Способ моделирования тромбоэмболии легочной артерии у крыс / А.В.
Самородов, Ф.А. Халиуллин, Ф.Х. Камилов, А.Р. Халимов // Патент РФ №
2610212 от 24.12.2015.
5. Устройство бережной фиксации мелких лабораторных животных,
позволяющее производить манипуляции с выбранным участком поверхности
тела, для проведения доклинических исследований / А.В. Самородов, Ф.А.
Халиуллин, Ф.Х. Камилов и др. // Патент РФ № 2633781 от 28.12.2016.
6. Средство, проявляющее системный гемостатический эффект / П.П.
Пурыгин, В.А. Ермохин, А.С. Гильмутдинова и др. // Патент РФ № 2017116283
от 10.05.2017.
7. Гидрохлориды 1-алкил-3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)ксантина,
проявляющие антитромботический эффект посредством блокирования
рецепторов тромбоцитов ГП IIb-IIIa / Ф.А. Халиуллин, Ю.В. Шабалина, А.В.
Самородов и др. // Патент РФ № 2640579 от 10.01.2018.
8. Средство, проявляющее антитромботический эффект посредством
блокирования рецепторов тромбоцитов ГП IIb-IIIa (варианты) / Ф.А.
Халиуллин, А.В. Самородов, Ю.В. Шабалина и др. // Патент РФ № 2643336 от
31.01.2018.
40
Используемые сокращения:
АДФ – аденозиндифосфат
АПТВ – активированное парциальное тромбопластиновое время
АТ III – антитромбин III
ГП IIb-IIIa – гликопротеин IIb-IIIa
ЛД50 – 50% летальная доза
ЛДГ - лактатдегидрогеназа
МДА - малоновый диальдегид
МТ - мезонтериальный тромбоз
КФК- креатинфосфокиназа
ПВ – протромбиновое время
ПОЛ - перекисное окисление липидов
ТВ – тромбиновое время
ТГВ - тромбоз глубоких вен
ТЭГ – тромбоэластография
ТЭЛА- тромбоэмболия легочной артерии
ЭхоКг - электокардиография
MA – максимальная амплитуда - характеризует функциональную активность
тромбоцитов, максимальную прочность сгустка
TMA – время формирования устойчивого сгустка до максимальной прочности
G – фактическая мера прочности сгустка
А – расчетная прочность или эластичность сгустка
TPI – индекс тромбодинамического потенциала
LY30 – процент, на который уменьшается величина сгустка в течение 30 минут
после достижения МА.
CLT – время лизиса сгустка
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
2
Размер файла
1 106 Кб
Теги
ряду, тромбоцитов, iiia, разработка, нового, IIB, производной, ксантина, рецепторов, блокаторов
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа