close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Разработка технологии получения бактериальной целлюлозы из плодовых оболочек овса

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Гладышева Евгения Константиновна
РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ
БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ ИЗ ПЛОДОВЫХ ОБОЛОЧЕК ОВСА
Специальность 03.01.06 – Биотехнология
(в том числе бионанотехнологии)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени кандидата технических наук
Щелково 2017
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении
науки Институте проблем химико-энергетических технологий Сибирского отделения
Российской академии наук (ИПХЭТ СО РАН)
Научный руководитель:
Скиба Екатерина Анатольевна, кандидат технических
наук, доцент, старший научный сотрудник Лаборатории
биоконверсии ИПХЭТ СО РАН
Официальные оппоненты: Громовых Татьяна Ильинична, доктор биологических
наук, профессор кафедры биотехнологии ФГАОУ ВО
Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России
(Сеченовский Университет)
Красноштанова
Алла
Альбертовна,
доктор
химических наук, профессор кафедры биотехнологии
ФГБОУ ВО РХТУ им Д.И. Менделеева
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное
учреждение высшего образования «Национальный исследовательский Мордовский
государственный университет им. Н. П. Огарёва»
Защита состоится
2017 года в___ч на заседании диссертационного совета
Д 006.069.01 при Федеральном государственном бюджетном научном учреждении
«Всероссийский
научно-исследовательский
и
технологический
институт
биологической промышленности» по адресу: 141142, Московская область,
Щелковский район, пос. Биокомбината,
д. 17, ФГБНУ ВНИТИБП;
е-mail: vnitibp@mail.ru.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБНУ ВНИТИБП и на сайте
www.vnitibp.com.
Автореферат разослан «___»_________ 2017 г.
Автореферат «____» ___________ 2017 г. размещен на сайте ФГБНУ ВНИТИБП
www.vnitibp.ru и на официальном сайте Министерства образования и науки РФ
http://www.vak.ed.gov.ru.
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат биологических наук
2
Фролов Юрий Дмитриевич
1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования. Направление исследований получения,
свойств и применения бактериальной целлюлозы развивается в мировой науке с
1954 г. Бактериальная целлюлоза является востребованным материалом в различных
отраслях промышленности, таких как пищевая, биотехнологическая, химическая,
целлюлозно-бумажная, электронная, а также в ветеринарии и гуманной медицине.
Биосинтез бактериальной целлюлозы – сложный и дорогостоящий процесс. Это
связано с ограниченным выходом бактериальной целлюлозы и использованием
дорогостоящих питательных сред из пищевого сырья, которые увеличивают
стоимость конечного продукта.
В Российской Федерации нет действующего производства бактериальной
целлюлозы, поэтому разработка технологии ее биосинтеза является актуальной.
Замена пищевого сырья на непищевое, массовое, возобновляемое в промышленных
масштабах сырьё, позволит значительно снизить себестоимость бактериальной
целлюлозы. В мировой науке предложены различные варианты решения данной
проблемы. Новым направлением в данной области является получение питательных
сред из недревесного возобновляемого целлюлозосодержащего сырья. Однако
исследования носят поисковый характер, нет готовых методов и технологий по
биосинтезу бактериальной целлюлозы, направленных на снижение себестоимости
конечного продукта за счет удешевления питательной среды.
Для Российской Федерации перспективным источником недревесного
возобновляемого целлюлозосодержащего сырья являются плодовые оболочки овса.
Для создания технологии нужно проводить исследования процесса биосинтеза
бактериальной целлюлозы на ферментативных гидролизатах плодовых оболочек овса.
Уникальность данных исследований обусловлена не только использованием сырья,
экономически выгодного именно для России, но и направленностью на разработку
технологии получения бактериальной целлюлозы, которая в будущем может быть
масштабирована и внедрена в производство.
Степень разработанности темы. Опубликованные литературные данные
подтверждают целесообразность исследований биосинтеза, свойств и применения
бактериальной целлюлозы. В этой области успешно работают в России и за рубежом
Громовых Т.И., Ревин В.В., Ткаченко А.А., Хрипунов А.К., Son H.J., Cavka A., Guo
X., Yang X.X. и другие исследователи (1954-2017). В мировой практике такого рода
исследования носят поисковый характер, нет готовых методов и технологий по
превращению растительного сырья в бактериальную целлюлозу, необходимо
проведение исследований по разработке технологии ее получения для создания
высокотехнологичного крупномасштабного производства. Общие подходы к
биотехнологическим производствам в России разрабатывались такими учёными, как
3
Варламов В.П., Варфаломеев С.Д., Гернет М.В., Градова Н.Б., Егоров Н.С., Еремец
В.И., Красноштанова А.А., Нетрусов А.И., Панфилов В.И., Самуйленко А.Я.
Цель диссертационной работы – разработка технологии получения
бактериальной целлюлозы из плодовых оболочек овса.
Для реализации поставленной цели сформулированы следующие задачи:
– научное обоснование выбора продуцента и исследование влияния условий
культивирования (pH, концентрация глюкозы в питательной среде, температура,
соотношение объемом культуральной среды и воздуха, влияние стимулирующих
добавок) на выход бактериальной целлюлозы;
– исследование физико-химических и фундаментальных свойств бактериальной
целлюлозы, синтезированной на синтетической питательной среде выбранным
продуцентом;
– исследование процесса биосинтеза бактериальной целлюлозы в зависимости
от способа предварительной химической обработки плодовых оболочек овса;
– исследование физико-химических свойств бактериальной целлюлозы,
синтезированной на ферментативных гидролизатах плодовых оболочек овса;
– разработка технологии получения бактериальной целлюлозы из плодовых
оболочек овса;
– исследование перспективы применения бактериальной целлюлозы в
ветеринарии и гуманной медицине.
Научная новизна
Научно обоснована и экспериментально разработана технология получения
бактериальной целлюлозы на ферментативном гидролизате технической целлюлозы
плодовых оболочек овса, полученной азотнокислым способом, с помощью
продуцента Мedusomyces gisevii Sa-12.
Экспериментальным путем определены условия биосинтеза бактериальной
целлюлозы продуцентом Мedusomyces gisevii Sa-12, обеспечивающие ее
максимальный выход: концентрация редуцирующих веществ от 20 до 25 г/л; pH
регулируется симбиозом; температура от 24 °С до 27 °C; содержание экстрактивных
веществ черного чая в питательной среде от 1,6 до 4,8 г/л; продолжительность
культивирования от 7 до 12 суток.
Экспериментально подтверждена возможность использования ферментативных
гидролизатов плодовых оболочек овса в качестве питательных сред для
микробиологического синтеза бактериальной целлюлозы; при этом выход колеблется
от 2,5 % до 9 % в зависимости от химического способа получения субстрата для
ферментативного гидролиза.
Научно
обосновано
и
экспериментально
доказано
использование
симбиотической культуры Мedusomyces gisevii Sa-12 для биосинтеза бактериальной
целлюлозы на ферментативных гидролизатах плодовых оболочек овса. Степень
кристалличности образцов бактериальной целлюлозы, синтезированных продуцентом
4
Мedusomyces gisevii Sa-12 составляет от 87 % до 90 %. Образцы бактериальной
целлюлозы имели сетчатую структуру со средней толщиной микрофибрилл от 28 до
33 нм. В образцах бактериальной целлюлозы преобладала низкосимметричная фаза
Iα, ее содержание изменялось от 93,7 % до 100 %.
Доказана принципиальная возможность получения нитратов бактериальной
целлюлозы.
Подтверждена перспективность использования бактериальной целлюлозы в
качестве гемостатического средства в ветеринарии и гуманной медицине.
Новизна технических решений подтверждена патентами РФ № 2597291 и
№ 2624242.
Теоретическая и практическая значимость работы. Разработана технология
получения бактериальной целлюлозы из плодовых оболочек овса, включающая
предварительную
химическую
обработку последовательно
разбавленными
растворами азотной кислоты и гидроксида натрия с получением технической
целлюлозы; ферментативный гидролиз технической целлюлозы с помощью
ферментных препаратов «Целлолюкс-А» и «Брюзайм BGX»; приготовление
питательных сред для биосинтеза бактериальной целлюлозы; биосинтез
бактериальной целлюлозы с помощью симбиотической культуры Мedusomyces gisevii
Sa-12; промывку бактериальной целлюлозы с помощью разбавленных растворов
гидроксида натрия и соляной кислоты; стерилизацию и упаковывание бактериальной
целлюлозы.
Подтверждены высокая степень кристалличности бактериальной целлюлозы и
преобладание низкосимметричной фазы Іα в образцах бактериальной целлюлозы (Акт
испытаний выдан ФГБОУ ВО «Петрозаводский государственный университет», г.
Петрозаводск).
Подтверждена возможность применения полученных образцов бактериальной
целлюлозы в медицине в качестве гемостатического средства (Акт внедрения выдан
ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава РФ, г. Москва).
Подтверждена возможность применения полученных образцов бактериальной
целлюлозы в абдоминальной хирургии (Акт испытаний выдан ФГБОУ ВО
«Алтайский государственный медицинский университет» Минздрава России и
КГБУЗ «Краевая клиническая больница», г. Барнаул).
По результатам исследований разработана технологическая документация,
утвержденная директором ИПХЭТ СО РАН.
Методология и методы исследования
Объектами исследований являлись:
– плодовые оболочки овса;
– продуцент Мedusomyces gisevii ВКПМ Sa-12 (симбиотическая культура,
состоящая из 15-30 родов дрожжей, в том числе Zygosaccharomeces sp., Saccharomyces
5
sp., Schizosaccharomyces pombe и др., 8-10 родов уксуснокислых бактерий, в том числе
Acetobacter sp., Gluconobacter oxydans, Bacterium kutzingianum).
Методики экспериментов:
Предварительную химическую обработку сырья проводили четырьмя
различными способами: одностадийная обработка плодовых оболочек овса (ПОО)
раствором 4 %-ной азотной кислоты позволила получить лигноцеллюлозный
материал (ЛЦМ); одностадийная обработка раствором 4 %-ного гидроксида натрия –
волокнистый продукт (ВП). Дальнейшая обработка ЛЦМ раствором 4 %-ного
гидроксида натрия позволила получить техническую целлюлозу (азотнокислый
способ) (ТЦ (АС)); дальнейшая обработка ВП раствором 4 %-ной азотной кислоты –
техническую целлюлозу (комбинированный способ) (ТЦ(КС)).
Ферментативный гидролиз полученных субстратов проводили в ферментере
объёмом 11 л в водной среде при (47±2) °С в течение 72 ч с помощью ферментных
препаратов Целлолюкс-А (0,04 г/г субстрата) и Брюзайм BGX (0,1 мл/г субстрата),
активную кислотность поддерживали на уровне (4,7±0,2) с помощью гидроксида
аммония и ортофосфорной кислоты, начальная концентрация субстрата составила
30 г/л.
Поддержание жизнеспособности продуцента Мedusomyces gisevii Sa-12
осуществляли методом субкультивирования. Для этого использовали стандартную
питательную среду, приготовленную растворением глюкозы в экстракте черного чая.
Исследования проводили на питательных средах, приготовленных на основе
ферментативных гидролизатов. В отфильтрованный ферментативный гидролизат
вносили охлажденный настой чая, при этом питательную среду стандартизовали по
содержанию редуцирующих веществ (РВ). Далее вносили симбиотическую культуру
Мedusomyces gisevii Sa-12 – 10 % инокулята от объема питательной среды.
Культивирование проводили в термостате при постоянной температуре в статических
условиях.
Удаление с поверхности бактериальной целлюлозы (БЦ) остатков питательной
среды и клеток осуществляли поэтапной обработкой раствором 2 %-ного гидроксида
натрия и раствором разбавленной соляной кислоты (pH 3) с последующей промывкой
дистиллированной водой.
Состав и характеристики исследуемых субстратов, ферментативных
гидролизатов и БЦ определяли по общепринятым методикам: массовая доля
целлюлозы по Кюршнеру по Оболенской и др., 1991; массовая доля α-целлюлозы по
ГОСТ 6840-78; массовая доля кислотонерастворимого лигнина по Оболенской и др.
(1991); массовая доля пентозанов по ГОСТ 10820-75; массовая доля золы по ГОСТ
18461-93. Степень полимеризации целлюлозы определяли по ГОСТ 25438-82.
Ферментативный гидролиз БЦ проводили в условиях, описанных ранее.
Нитрование БЦ проводили нитрующей смесью состава: 56-59 % HNO3 и 4144 % HSO4, при 30 °С в течение 40 мин, с последующей стабилизацией (Пат.
6
2556940). Определение массовой доли азота в нитрате БЦ проводили
ферросульфатным методом. Определение вязкости нитрата БЦ – по ГОСТ В 5769-75.
Определение растворимости нитрата БЦ – по ГОСТ В 5766-75.
Технологическое оборудование
Концентрацию РВ в пересчете на глюкозу и концентрацию ксилозы определяли
на спектрофотометре Unico UV-2804. Уровень активной кислотности контролировали
с помощью иономера И-160 МИ. Определение моносахаридного состава
ферментативных гидролизатов проводили на микроколоночном жидкостном
хроматографе Милихром А-02. ИК-спектроскопию образцов БЦ проводили на
спектрофотометре Инфралюм ФТ-801 в таблетках KBr, исследование образцов БЦ
методом ЯМР – на спектрометре Bruker «Аvance 400» с высокотемпературными
датчиками высокого разрешения твердого тела (до 300 °C), исследование образцов
БЦ методом рентгеноструктурного анализа – на дифрактометре ДРОН-6,
исследование образцов БЦ методом растровой электронной микроскопии – на
микроскопах JSM-840 и Zeiss SIGMA VP.
Общее количество дрожжей и уксуснокислых клеток определяли методом
прямого подсчета клеток в счетных камерах с использованием оптического
микроскопа Optika B-150.
Методы доклинических исследований. Исследование перспективы
применения бактериальной целлюлозы в ветеринарии и гуманной медицине
проводили согласно методике, утвержденной Фармкомитетом МЗ РФ для
доклинической оценки потенциальных лекарственных средств (Руководство по
проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. – М.:
Гриф и К, 2013. – 994 с.)
Структурно-методологическая схема исследований для достижения цели
диссертационной работы представлена на рисунке 1.
Основные положения, выносимые на защиту:
– технология получения бактериальной целлюлозы из плодовых оболочек овса;
– результаты исследования зависимости выхода бактериальной целлюлозы,
синтезируемой продуцентом Мedusomyces gisevii Sa-12 от условий культивирования:
pH, концентрации редуцирующих веществ, температуры, соотношения объемов
культуральной среды и воздуха, наличия стимулирующих добавок;
– результаты исследования зависимости выхода бактериальной целлюлозы,
синтезируемой продуцентом Мedusomyces gisevii Sa-12, от способа предварительной
химической обработки плодовых оболочек овса;
– эффективность применения продуцента Мedusomyces gisevii Sa-12 для
биосинтеза высококачественной бактериальной целлюлозы.
7
Анализ существующих способов получения
БЦ из целлюлозосодержащего сырья
Разработка алгоритма технологии БЦ
из целлюлозосодержащего сырья
Обоснование выбора объектов исследования
Плодовые оболочки овса
Симбиотическая культура
Мedusomyces gisevii Sa-12
Предварительная химическая
обработка
Ферментативный гидролиз
Исследование влияния
условий культивирования
на биосинтез БЦ
Исследование биосинтеза БЦ на ферментативных
гидролизатах из плодовых оболочек овса
Исследование
физико-химических
и фундаментальных
свойств БЦ
Исследование
физико-химических
свойств БЦ
Разработка технологии получения БЦ
из плодовых оболочек овса
Исследование перспективы
применения БЦ в ветеринарии
и гуманной медицине
Акт
испытания
Патент
Патент
Акт испытания
Акт внедрения
Рисунок 1 – Структурно-методологическая схема исследований
Степень достоверности и апробация результатов. Обработку полученных
данных проводили с использованием программы «Microsoft Excel 2010» и «Microsoft
Word 2010». Экспериментальные данные были получены в трехкратной повторности,
результаты в виде среднего значения, а погрешности – в виде стандартного
отклонения по выборке.
Достоверность результатов исследований подтверждается соответствием
теоретических данных с полученными результатами экспериментальных
исследований и производственных испытаний. Экспериментальные данные, выводы и
рекомендации основаны на общепринятых теоретических закономерностях, не
противоречат и с достаточной степенью точности согласуются с известными
концепциями.
8
Основные положения и научные результаты диссертационной работы
доложены и обсуждены на всероссийских и международных конференциях:
«Биотехнологии в химико-лесном комплексе» (г. Архангельск, 2014 г.), «Новые
достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (г. Барнаул,
2014, 2017 гг.), «Низко-температурные и пищевые технологии в XXI веке» (г. СанктПетербург, 2015 г.), «Химия и химическая технология в XXI веке» (г. Томск, 2015 г.),
«Перспективы развития химических и биологических технологий в XXI веке» (г.
Саранск, 2015 г.), «Биотехнология и общество в XXI веке» (г. Барнаул, 2015 г.),
«Химия и технология новых веществ и материалов» (г. Сыктывкар, 2015-2016 гг.),
«Структура и физико-химические свойства целлюлоз и нанокомпозитов на их основе»
(г. Петрозаводск, 2016 г.), «Технологии и оборудование химической,
биотехнологической и пищевой промышленности» (г. Бийск, 2014-2017 гг.),
«Материалы и технологии XXΙ века» (г. Бийск, 2015 г.), «Перспективы создания и
применения конденсированных высокоэнергетических материалов» (г. Бийск, 2014,
2016 гг.).
Публикации. Основные результаты диссертации опубликованы в 26 научных
работах, в том числе 13 статей в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ,
имеются 2 патента РФ.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Результаты
научных исследований соответствуют пп. 2, 3, 4 и п. 7 паспорта специальности
03.01.06 Биотехнология (в том числе биотехнологии).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав,
выводов, списка литературы, включающего 209 источника и приложения. Работа
изложена на 157 страницах машинописного текста и содержит 44 рисунка, 28 таблиц.
Личный вклад автора заключается в формулировании проблемы и разработке
основных положений, выносимых на защиту, постановке целей и задач исследований,
решении поставленных задач, планировании эксперимента и выполнении
исследований, обобщении результатов. Результаты диссертационной работы
являются совокупностью научных исследований, проведенных в ИПХЭТ СО РАН
лично автором и при его непосредственном участии в качестве ответственного
исполнителя.
Благодарности. Автор выражает благодарность научному руководителю,
к.т.н., доценту, Е.А. Скибе за практическую и консультативную помощь при
выполнении данной работы; к.х.н., доценту, В.В. Будаевой, коллективу Лаборатории
биоконверсии ИПХЭТ СО РАН; а также сотрудникам САФУ: д.т.н., профессору,
Новожилову Е.В. и к.т.н., доценту, Болотовой К.С. – за исследование БЦ методом
растровой электронной микроскопии; сотруднику ИК им. Г.К. Борескова СО РАН,
д.х.н., Степанову А.Г. за исследование БЦ методом ядерного магнитного резонанса;
сотруднику ПетрГУ к.ф.-м.н., доценту, Алешиной Л.А. за исследование БЦ методом
рентгеноструктурного анализа; сотруднику ФГБУ ГНЦ Минздрава РФ, д.м.н.,
9
Белозерской Г.Г. за исследование гемостатической активности БЦ; сотрудникам
ФГБОУ ВО АГМУ: д.м.н., профессору, В.Г. Лубянскому и д.м.н., доценту, А.Н.
Жарикову – за исследование применения БЦ в абдоминальной хирургии.
2 ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Работа выполнялась в 2013-2016 гг. в Лаборатории биоконверсии ИПХЭТ СО
РАН.
2.1 Условия культивирования продуцента Medusomyces gisevii Sa-12,
обеспечивающие максимальный выход БЦ. В результате проведенных
исследований, установлено:
– процесс биосинтеза БЦ продуцентом Medusomyces gisevii Sa-12 не нуждался в
корректировке pH. Уровень активной кислотности регулировался продуцентом
самостоятельно, создавая при этом благоприятную среду для жизнедеятельности
целлюлозосинтезирующих микроорганизмов и биосинтеза БЦ. При этом
устанавливаемый уровень активной кислотности не позволял развиваться
посторонней микрофлоре. Использование продуцента Medusomyces gisevii Sa-12
является выгодным при масштабировании процесса биосинтеза БЦ, т.к. не
потребуется покупка соответствующих реактивов для поддержания уровня активной
кислотности, снизятся трудозатраты, поэтому это упростит аппаратурное оформление
процесса;
– концентрация РВ в питательной среде, обеспечивающая максимальный выход
БЦ, находилась в диапазоне от 20 до 25 г/л (рисунок 2). При недостаточных
концентрациях РВ в питательной среде целлюлозосинтезирующим микроорганизмам
не хватало питания для биосинтеза БЦ, при избыточной концентрации РВ происходил
синтез побочных продуктов (органических кислот), которые негативно влияли как на
целлюлозосинтетическую активность микроорганизмов, так и на качество БЦ;
– температура, обеспечивающая максимальный выход БЦ, находилась в
диапазоне от 24 °С до 27 °С (рисунок 3). Температура ниже этого оптимума
замедляла скорость ферментативных реакций в клетках целлюлозосинтезирующих
микроорганизмов, а температура выше этого оптимума приводила к
конформационным изменениям ферментов, входящих в целлюлозосинтезирующий
энзимный комплекс, что снижало выход БЦ;
– симбиотическая культура не нуждалась в добавлении в питательную среду
стимулирующих компонентов, таких как дрожжевой экстракт и этанол. В ходе своего
развития у симбиоза сложился особый вариант обмена веществ, при котором все
необходимые для его нормального функционирования вещества синтезируются у
разных партнеров, что благоприятно для биосинтеза БЦ в промышленных условиях;
– содержание экстрактивных веществ черного чая в питательной среде,
обеспечивающее наибольший выход БЦ, составляло от 1,6 до 4,8 г/л (рисунок 4). При
содержании экстрактивных веществ черного чая в питательной среде ниже
10
представленного оптимума происходило замедление процессов жизнедеятельности в
клетках уксуснокислых бактерий, а при содержании экстрактивных веществ чая выше
представленного оптимума – угнетение целлюлозосинтезирующей способности
микроорганизмов;
Рисунок 2 – Зависимость выхода БЦ от
различной концентрации
РВ в питательной среде
Рисунок 3 – Зависимость выхода БЦ от
температуры на 16 сутки
культивирования
Рисунок 4 – Выход БЦ на питательных
средах с различным содержанием
экстрактивных веществ черного чая
Рисунок 5 – Зависимость выхода БЦ от
различных соотношений объёмов
культуральной среды и воздуха
– для симбиотической культуры наибольший выход БЦ достигался при
соотношении объёмов культуральной среды и воздуха 1:10 (рисунок 5).
Таким образом, симбиотическая культура Medusomyces gisevii Sa-12 является
перспективным продуцентом БЦ.
2.2 Исследование физико-химических свойств БЦ, синтезированной на
синтетической питательной среде. Степень полимеризации образца БЦ составила
11
4850, массовая доля кислотонерастворимого лигнина – 0,80 %, массовая доля золы –
64,0
C CP/MAS NMR
73.8
106.1
13
90.0
0,14 %. На рисунке 6 представлен ИК-спектр образца БЦ, на рисунке 7 – ЯМР-спектр.
Бактериальная целлюлоза
300
Рисунок 6 – ИК-спектр образца БЦ
250
200
150
ppm
100
50
0
Рисунок 7 – ЯМР-спектр образца БЦ
В ИК-спектре валентные колебания OH-групп характеризовала интенсивная
полоса при 3432 см-1, валентные колебания групп CH2, CH характеризовали менее
интенсивные колебания в области при 2920 и 2852,0 см-1. Интенсивная полоса с
максимумом при 1641 см-1 принадлежала деформационным колебаниям OH-групп
прочно связанной воды. Валентные колебания OH-групп в спиртах характеризовали
слабые колебания при 1281 см-1, валентные колебания C-O-C и C-O в спиртах
характеризовала полоса при 1059 см-1. Наличие β-1,4 связей подтверждала полоса при
899 см-1.
В ЯМР-спектре резонансные линии для образцов БЦ соотносились с
углеродами С1 – 106,1 м.д., С4 – 90,0 м.д., С6 – 64,0 м.д. Резонансная линия при 7080 м.д. принадлежала углеродам С2, С3 и С5. Таким образом, методами ЯМР и ИК –
спектроскопии подтверждено, что БЦ является чистым соединением, содержащим
только целлюлозу.
На рисунке 8 приведена сетчатая структура БЦ, на рисунке 9 – распределение
значений ширины микрофибрилл БЦ.
Трехмерная сетчатая структура является свойством, характерным именно для
БЦ. Для анализа структуры микрофибрилл БЦ проводили статистическую обработку
значений их ширины, в расчете использовали выборку данных, включающих 1000
измерений. Средняя ширина микрофибрилл составила 30,6 нм.
12
-50
Рисунок 8 – Сетчатая структура
микрофибрилл БЦ
Рисунок 9 – Распределение значений
диаметра микрофибрилл БЦ
На рисунке 10 представлены рентгенограммы образцов БЦ, отснятых на
отражение и на прохождение. Рентгенограммы, отснятые на отражение и
прохождение, резко различались. Это означает, что пленки анизотропны. Степень
кристалличности полученного образца БЦ составила 87 %. Содержание фазы Ια в
образце БЦ – 98 %.
а)
б)
Рисунок 10 – Рентгенограммы образца БЦ, отснятые на:
а) отражение; б) прохождение
2.3 Исследование способности БЦ к ферментативному гидролизу. БЦ
обладала высокой реакционной способностью к ферментативному гидролизу. Выход
РВ от массы БЦ составил 100 %.
2.4 Исследование способности БЦ к химической трансформации. Получен
образец нитратов БЦ со следующими характеристиками: массовая доля азота –
10,92 %; вязкость 2 %-го раствора нитрата БЦ в ацетоне – 916 сП; растворимость в
спирто-эфирной смеси – 47,18 %; выход – 158 %.
2.5 Изучение биосинтеза БЦ на ферментативных гидролизатах ПОО
13
2.5.1 Определение химического состава субстратов. В таблице 1
представлены химические составы сырья и субстратов, полученных химической
обработкой различными способами ПОО.
Таблица 1 – Химический состав сырья и субстратов ПОО
n≥3
Показатели
Выход из 100 кг ПОО, %
М.д. α-целлюлозы, %
М.д. кислотонерастворимого
лигнина, %
М.д. золы, %
М.д. пентозанов, %
Степень полимеризации
Сумма гидролизуемых веществ, %
Примечание: м.д. – массовая доля
44,7±0,2
Субстраты для ферментативного гидролиза
ЛЦМ
ТЦ (АС)
ВП
ТЦ (КС)
37,5±0,1
22,0±0,1 34,7±0,1 32,6±0,1
79,4±0,3
93,2±0,3 86,7±0,3 88,4±0,3
18,1±0,1
13,8±0,1
0,8±0,05
5,4±0,1
0,5±0,05
4,6±0,1
30,8±0,2
75,5±0,3
8,2±0,1
9,2±0,1
88,6±0,3
1,4±0,05
3,0±0,1
1140±10
96,2±0,3
1,1±0,05
11,1±0,1
97,8±0,3
0,2±0,05
7,0±0,1
1140±10
95,4±0,3
ПОО
Субстраты, полученные различной химической обработкой ПОО, по
содержанию гидролизуемых компонентов расположились в ряд: ВП > ТЦ(АС) >
ТЦ(КС) > ЛЦМ. Сумма гидролизуемых компонентов для различных субстратов
изменялась от 88,6 % до 97,8 %. Небольшая часть относилась к негидролизуемым
компонентам – остаточному лигнину (0,53 %– 13,78 %) и золе (0,13 % – 8,2 %).
2.5.2 Определение состава ферментативных гидролизатов. В таблице 2
представлено содержание РВ в ферментативных гидролизатах, полученных из разных
субстратов ПОО.
Таблица 2 – Моносахаридный состав ферментативных гидролизатов в зависимости от
способа предварительной химической обработки
n≥3
Показатели
Ферментативные гидролизаты ПОО
ЛЦМ
ТЦ (АС)
ВП
ТЦ (КС)
Выход РВ от массы субстрата, %
80,3±0,3
73,5±0,3 83,9±0,3
81,0±0,3
Концентрация РВ, г/л
26,8±0,2
24,5±0,2 28,0±0,2
27,0±0,2
Концентрация ксилозы, г/л
4,4±0,1
2,2±0,1
3,8±0,1
3,2±0,1
После стандартизации по РВ
Концентрация РВ, г/л
20,0±0,2
20,0±0,2 20,0±0,2
20,0±0,2
Концентрация ксилозы, г/л
3,3±0,1
1,76±0,1
2,7±0,1
2,4±0,1
Примечание – моносахаридный состав ферментативных гидролизатов ПОО представлен
глюкозой и ксилозой. Маннозы, галактозы, рамнозы, арабинозы не обнаружено.
По выходу РВ от массы субстрата ферментативные гидролизаты
расположились в следующий ряд: ВП > ТЦ(КС) > ЛЦМ > ТЦ(АС). Доля ксилозы в
ферментативных гидролизатах составила от 9 % до 16,5 %.
14
2.5.3 Исследование процесса биосинтеза БЦ на ферментативных
гидролизатах ПОО. Биосинтез БЦ проводили согласно пункту 3.1. В ходе
культивирования Мedusomyces gisevii Sa-12 на ферментативных гидролизатах ПОО
контролировали изменение количества дрожжей и уксуснокислых бактерий (рисунки
11 и 12).
Рисунок 11 – Изменение количества
дрожжей
Рисунок 12 – Изменение количества
уксуснокислых бактерий
Количество клеток микроорганизмов в питательных средах располагалось в
порядке убывания в ряд: ТЦ(АС) > ТЦ(КС) > ВП > ЛЦМ. Наибольшую численность
дрожжей и уксуснокислых бактерий наблюдали при использовании в качестве
питательной среды ферментативного гидролизата ТЦ, полученной азотнокислым
способом. Биологически – это самая доброкачественная среда для роста и
размножения продуцента Medusomyces gisevii Sa-12, поэтому можно предположить,
что на ней будет наблюдаться эффективный биосинтез БЦ.
На рисунке 13 представлено изменение уровня активной кислотности при
культивировании Мedusomyces gisevii Sa-12 на ферментативных гидролизатах ПОО,
на рисунке 14 – снижение концентрации РВ.
Исходное значение pH на питательных средах находилось в диапазоне 4,0-4,1.
При культивировании Мedusomyces gisevii Sa-12 на ферментативных гидролизатах
ЛЦМ, ВП, ТЦ, полученной комбинированным способом, значение pH изменялось в
диапазоне от 3,0 до 3,7. На ферментативном гидролизате ТЦ, полученной
азотнокислым способом, в ходе первых трех суток культивирования значение pH
понизилось до 3,6, затем рН повышалось до 6,1, что нехарактерно для процесса
15
биосинтеза БЦ. Предположительно, Мedusomyces gisevii Sa-12 использует кислоты
для поддержания нормального метаболизма и жизнедеятельности.
Рисунок 13 – Изменение уровня активной
кислотности
Рисунок 14 – Изменение концентрации
редуцирующих веществ
На питательных средах ферментативных гидролизатов ПОО утилизация РВ
происходила в два периода. В первый период быстрая утилизация РВ, связана с
увеличением количества клеток в питательной среде. Во второй период РВ медленно
расходовались на метаболические процессы. Расходование РВ в этот период можно
объяснить метаболизмом поддержания.
Изменение концентрации
ксилозы
(рисунок
15)
в
питательной среде свидетельствовало о том, что для
продуцента Мedusomyces gisevii
Sa-12 предпочтительным источником
углерода
является
глюкоза.
Выход БЦ в процессе
культивирования
Мedusomyces
gisevii Sa-12 на ферментативных
гидролизатах ПОО представлен
Рисунок 15 – Изменение концентрации ксилозы
на рисунке 16. На ферментативном гидролизате ЛЦМ через
6 дней культивирования выход БЦ составил 2,6 %. На 10 сутки – выход БЦ
увеличился до 3,2 %, далее выход БЦ не увеличивался. Поскольку БЦ синтезируют
16
уксуснокислые бактерии, следует отметить, что их содержание в данной питательной
среде было самым низким (рисунок 12), а остаточное количество РВ высоким – 7,5 г/л
на 24 сутки культивирования (рисунок 14).
При культивировании Мedusomyces gisevii Sa-12 на ферментативном
гидролизате ВП выход БЦ увеличился с 1,0 % до 5,0 % с 3 по 9 сутки
культивирования. С 9 по 13 сутки выход БЦ не увеличивался. С 13 по 24 сутки масса
БЦ снизилась на 45 %, это указывало на идущие процессы деструкции.
На ферментативном гидролизате
ТЦ,
полученной
комбинированным способом,
выход БЦ увеличился с 1,1
до 3,4 % с 3 по 6 сутки
культивирования. С 6 по 24
сутки выход БЦ увеличился
до 4,8 %. Таким образом,
ферментативные
гидролизаты ЛЦМ, ВП и ТЦ,
полученной комбинированным способом, не являются
благоприятными питательными
средами
для
биосинтеза БЦ.
При
использовании
Рисунок 16 – Выход БЦ
ферментативного гидролизата ТЦ, полученной азотнокислым способом, в качестве питательной среды выход
БЦ увеличился с 2,5 % до 8,3 % с 3 по 8 сутки культивирования. С 8 по 24 сутки
выход БЦ увеличился до 9 %. Биосинтез БЦ в данном случае был сопряжён с ростом
уксуснокислых бактерий в питательной среде (рисунок 12), таким образом,
численность уксуснокислых бактерий может служить маркером эффективности
биосинтеза БЦ.
Ферментативный гидролизат ТЦ, полученной азотнокислым способом, являлся
благоприятной питательной средой для биосинтеза БЦ, на ней достигался
наибольший выход – 9,0 %, что сопоставимо с выходом БЦ на синтетической
питательной среде.
2.5.4 Исследование физико-химических свойств образцов БЦ, полученных
на ферментативных гидролизатах ПОО. В таблице 3 представлены основные
характеристические частоты ИК-спектров образцов БЦ.
ИК-спектры образцов БЦ показали, что независимо от используемой
питательной среды все образцы имеют одинаковую химическую структуру, которая
17
соответствует химической структуре БЦ, полученной на синтетической питательной
среде (пункт 3.2).
На рисунке 17 представлены ЯМР-спектры образцов БЦ, полученных на
ферментативных гидролизатах ПОО.
Таблица 3 – Отнесение полос поглощения функциональных групп в образцах БЦ.
Максимум полосы поглощения, см-1
ЛЦМ ТЦ (АС)
ВП
ТЦ (КС)
Отнесение полос поглощения*
ν OH-групп, участвующих в межмолекулярных и
внутримолекулярных H-связях
ν связей в группах CH и CH2
δ связей HOH обусловлено присутствием прочно
связанной воды
δ групп CH2
δ групп OH в CH2OH
δ групп CH2 в CH2OH
3384
3432
3438
3419
2896
1649
1536
1428
1362
1336
1317
1281
1249
1235
1204
2921
1643
1532
1431
1375
2897
1652
1533
1428
1362
1336
1317
2896
1651
1539
1428
1361
1337
1318
1281
1248
1235
1204
C CP/MAS NMR
73.8
64,0
13
90.0
106.1
δ групп OH
ν связей C-O (характерные для полисахаридов полосы,
1165
обусловленные наличием ацетильных связей C-O-C и
1072
связей С-О в спиртах)
β-1,4 связи
898
* ν – валентные колебания, δ – деформационные колебания.
ЛЦМ
ТЦ (АС)
ВП
ТЦ (КС)
300
250
200
150
ppm
100
50
0
Рисунок 17 – ЯМР-спектры образцов БЦ
18
-50
1281
1249
1281
1235
1204
1205
1164
1107
1017
898
1102
899
1164
1073
898
Резонансные линии в
ЯМР-спектре для образцов БЦ,
полученных
на
ферментативных гидролизатах ПОО,
полностью
совпадают
с
резонансными линиями в ЯМРспектре для образца БЦ,
полученного на синтетической
питательной среде (пункт 3.2).
Таким
образом,
методами
ЯМР- и ИК – спектроскопии
подтверждено, что БЦ является
чистым соединением, содержащим только целлюлозу.
На рисунке 18 представлены фотографии сетчатой структуры образцов БЦ,
показывающие их идентичность сетчатой структуре образца БЦ, полученного на
синтетической питательной среде (пункт 3.2).
Степень полимеризации образцов БЦ, синтезированных на ферментативных
гидролизатах ПОО составила: ЛЦМ – 1090; ВП
– 1430; ТЦ(КС) – 2010;
ТЦ(АС) – 1760. Таким
образом, по возрастанию степени полимериа
образцов БЦ,
б зации
полученных на ферментативных гидролизатах
ПОО, можно расположить в ряд: БЦ (ЛЦМ)>
БЦ (ВП)> БЦ (ТЦ (АС))
> БЦ (ТЦ (КС)). Степень
полимеризации образв
г
цов БЦ, полученных на
Рисунок 18 – Сетчатая структура образцов БЦ на
ферметативных гидроферментативных гидролизатах: а) ЛЦМ; б) ВП;
лизатах ПОО ниже, чем
в) ТЦ (КС); г) ТЦ (АС).
степень полимеризации
образцов БЦ, полученных на синтетической среде в аналогичных условиях – 2600
(пункт 3.2).
В таблице 4 приведены результаты расчета степени кристалличности (СК) и
областей когерентного рассеяния (ОКР) образцов БЦ, полученных на
ферментативных гидролизатах. СК образцов БЦ составила от 87 % до 90 %, что
соответствует СК образца БЦ, синтезированного на синтетической питательной среде
(87 %).
Таблица 4 – Значение СК и ОКР образцов БЦ.
Образец БЦ,
СК, Размер кристаллитов D (Å) в направлениях
выращенной на:
%
[100]
[010]
[110]
[01-2]
синтетической питательной
87
46
74
57
58
среде (глюкоза)
гидролизате ЛЦМ
87
46
62
50
58
гидролизате ТЦ (АС)
90
49
73
61
51
гидролизате ВП
90
51
57
50
72
гидролизате ТЦ (КС)
87
46
55
50
57
Погрешность: ∆ СК=±5 %; ∆D=±5 Å
19
Минимальные размеры поперечного сечения элементарных фибрилл имел
образец БЦ, синтезированный на ферментативном гидролизате ТЦ, полученной
комбинированным способом. Максимальными размерами характеризовались образцы
БЦ, синтезированные на ферментативном гидролизате ТЦ, полученной азотнокислым
способом, и на синтетической питательной среде.
Размеры элементарной ячейки для образцов БЦ, синтезированных на
ферментативных гидролизатах ПОО, соответствовали размерам элементарной ячейки
образца БЦ, синтезированного на синтетической питательной среде. Во всех
анализируемых образцах БЦ преобладала низкосимметричная фаза Iα, ее содержание
изменялось от 93,7 % до 100 %. Таким образом, ферментативные гидролизаты ПОО
являются пригодными для получения БЦ высоко качества.
Таким образом показано, что способ химической предобработки ПОО влияет
на выход БЦ, но не влияет на ее качество независимо от состава питательной среды
Мedusomyces gisevii Sa-12 синтезирует БЦ со стабильными характеристиками.
2.5.5 Разработка технологии получения БЦ из ПОО. На рисунке 19
приведена принципиальная технологическая схема получения БЦ из ПОО. ПОО
подвергали обработке разбавленными растворами азотной кислоты и гидроксида
натрия с получением технической целлюлозы. Техническую целлюлозу подвергали
ферментативному гидролизу. Полученный водный гидролизат – раствор сахаров с
преимущественным содержанием глюкозы с помощью симбиотической культуры
Мedusomyces gisevii Sa-12 преобразовывали в ценный продукт – БЦ. Далее БЦ
промывали от остатков питательной среды и клеток, стерилизовали и упаковывали.
2.6 Перспективы применения БЦ в ветеринарии и гуманной медицине
2.6.1 Изучение гемостатической активности БЦ проводили на кроликах
породы «Шиншилла» обоего пола массой от 3,0 до 3,5 кг. Установлено, что образцы
БЦ, полученные из ТЦ плодовых оболочек овса, полученной азотнокислым способом,
обладали выраженной гемостатической активностью: время остановки кровотечения
составило (35±8) с при контроле (марлевый тампон) (246±22,0) с, объем масса
кровопотери (0,527±0,162) г при контроле (5,9±1,4) г. Гемастатическая активность
полученных образцов БЦ составила (85,81±11,16) %.
2.6.2 Исследование возможности применения БЦ в абдоминальной
хирургии проводили на собаках массой 12 кг. Достигнуты положительные
результаты: при микробиологическом исследовании условно-патогенной архивной
культурой E.coli БЦ проявляла антибактериальную активность; после фиксации БЦ на
апоневрозе передней брюшной стенки и на ране тонкой кишки инфицирования
материала не происходило; спустя 14 суток представленные образцы способствовали
разрастанию грануляционной ткани, закрывающей как кишечный, так и
апоневротический шовный материал, влажная БЦ обладала гемостатическим
эффектом.
20
Плодовые оболочки овса
Предварительная химическая обработка ПОО:
– промывка;
– обработка раствором азотной кислоты (концентрация 4%, 90-96 °C, 1-6 ч);
– щелочная обработка (концентрация NaOH 4%, 90-96 °C, 1-6 ч);
– кисловка (концентрация HNO3 0,7-1,2 %, 50-60 °С, 0,5-2 ч).
Техническая целлюлоза плодовых оболочек овса
Ферментативный гидролиз технической целлюлозы ПОО в водной среде:
концентрация субстрата 30 г/л; температура 45-49 °С, pH 4,5-4,9; ферментные препараты
Целлолюкс-А (0,04 г/ г субстрата) и Брюзайм BGX (0,1 г/г субстрата); 24-72 ч.
Ферментативный гидролизат
Приготовление питательной среды на основе ферментативного гидролизата:
– фильтрация или сепарирование;
– стандартизация по концентрации редуцирующих веществ (20-25 г/л);
– добавление экстракта черного байхового чая (5 - 15 г сухого чая на 1 л жидкости);
– стерилизация (0,5 атм, 20 мин).
Питательная среда
Инокулят Мedusomyces gisevii
(10 % от объема питательной среды)
Аэробное культивирование БЦ:
температура 24-27 °С, 7-12 суток, статические условия, pH саморегулируется
Бактериальная целлюлоза
Промывка бактериальной целлюлозы:
– промывка слабым щелочным раствором (концентрация NaOH 2 %, 20 °C, 48 ч);
– декатионирование (концентрация HCl 0,25 %, 20 °C, 24 ч);
– промывка дистиллированной водой.
Очищенная бактериальная целлюлоза
Стерилизация бактериальной целлюлозы: 1 атм, 40 мин.
Готовый продукт
Рисунок 19 – Принципиальная технологическая схема получения БЦ из ПОО
21
2.7 Экономическое обоснование проведения опытно-конструкторских
работ. Себестоимость 1 кг влажной БЦ, синтезированной на ферментативном
гидролизате ТЦ, полученной азотнокислым способом, в лабораторных условиях
составила 4705 руб.
3 ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате выполненной научно-практической работы были решены все
поставленные задачи и достигнута поставленная цель. Полученные результаты
доказали, что разработана технология получения высококачественной бактериальной
целлюлозы из бросового, массового, возобновляемого в промышленных масштабах
сырья – плодовых оболочек овса.
3.1 Выводы
1 Научно обоснован выбор продуцента Мedusomyces gisevii Sa-12, и
определены условия его культивирования, обеспечивающие максимальный выход
БЦ: 1) уровень pH регулировался симбиозом; 2) концентрация редуцирующих
веществ от 20 до 25 г/л; 3) температура от 24 °С до 27 °С; 4) содержание
экстрактивных веществ черного чая в питательной среде от 1,6 до 4,8 г/л; 5) не
требовалось добавление стимулирующих компонентов, таких как этанол и
дрожжевой экстракт; 6) соотношение объемов культуральной среды и воздуха
составляло 1:10.
2 Использование продуцента Мedusomyces gisevii Sa-12 позволило получить
образец БЦ со следующими характеристиками: степень полимеризации – 4850;
средний диаметр микрофибрилл – 30 нм; степень кристалличности – 87 %,
содержание триклинной фазы Iα – 98 %. Установлена высокая реакционная
способность БЦ к ферментативному гидролизу: выход РВ от массы БЦ составил
100 %. Установлена принципиальная возможность получения нитратов из БЦ со
следующими характеристиками: массовая доля азота – 10,92 %; вязкость 2 %-го
раствора нитрата БЦ в ацетоне – 916 сП; растворимость в спирто-эфирной смеси –
47,18 %; выход – 158 %.
3 Экспериментально доказана возможность использования ферментативных
гидролизатов в качестве питательных сред для микробиологического биосинтеза БЦ с
выходом от 2,5 % до 9 % в зависимости от химического способа получения субстрата
для ферментативного гидролиза. Наибольший выход БЦ получен на ферментативном
гидролизате технической целлюлозы ПОО, полученной азотнокислым способом.
4 Показано соответствие полученных образцов БЦ по химической структуре
образцу БЦ, синтезированному на синтетической питательной среде. Установлено,
что полученные образцы БЦ имеют сетчатую структуру. Наибольшие степени
полимеризации имели образцы БЦ, синтезированные на питательных средах
ферментативных
гидролизатов
технических
целлюлоз,
полученных
комбинированным и азотнокислым способами. Степень кристалличности образцов
БЦ, полученных на ферментативных гидролизатах ПОО, составила от 87 % до 90 %.
22
Установлено, что в образцах БЦ преобладала триклинная модификация Iα, ее
содержание составляло от 93,7 % до 100 %.
5 Разработана технология получения БЦ из ПОО, включающая
предварительную
химическую
обработку последовательно разбавленными
растворами азотной кислоты и гидроксида натрия с получением технической
целлюлозы; ферментативный гидролиз технической целлюлозы из плодовых
оболочек овса; биосинтез БЦ с помощью симбиотической культуры Мedusomyces
gisevii Sa-12; промывку БЦ с помощью разбавленных растворов гидроксида натрия и
соляной кислоты; стерилизацию и упаковывание БЦ.
6 Доказано, что использование разработанной технологии позволяет получать
БЦ, которая может применяться в ветеринарии и гуманной медицине, поскольку
образцы БЦ обладали выраженной гемостатической активностью: время остановки
кровотечения составило (35±8) с при контроле (марлевый тампон) (246±22,0) с, объем
массы кровопотери (0,527±0,162) г при контроле (5,9±1,4) г. Гемастатическая
активность БЦ составила (85,81±11,16) %; применение БЦ в абдоминальной хирургии
способствовало разрастанию грануляционной ткани, закрывающей как кишечный, так
и апоневротический шовный материал.
3.2 Рекомендации и перспективы дальнейшей разработки темы
Дальнейшие исследования данной темы будут проводиться в рамках проекта
Российского научного фонда № 17-19-01054 «Фундаментальные инженерные аспекты
технологии получения бактериальной наноцеллюлозы из легковозобновляемого
целлюлозосодержащего сырья», 2017-2019 гг., направленные на создание
технологического регламента и внедрение его в производство.
Полученная БЦ является перспективным материалом для использования в
ветеринарии и гуманной медицине, а также для получения новых материалов для
технической химии.
3.3 Практические предложения
Результаты исследований могут быть использованы в учебном процессе при
подготовке
студентов
соответствующих
специальностей,
а
также
в
биотехнологической промышленности.
Для практического использования предложены следующие документы:
– Методика. Приготовление питательной среды на основе ферментативного
гидролизата из легковозобновляемого целлюлозосодержащего сырья для биосинтеза
бактериальной целлюлозы. М 10018691.02100.00088 от 15.09.2017 г., утвержденная
директором ИПХЭТ СО РАН;
– Методика. Приготовление инокулята симбиотической культуры Мedusomyces
gisevii SA-12. М 10018691.02100.00089 от 15.09.2017 г., утвержденная директором
ИПХЭТ СО РАН;
– Методика. Биосинтез технической бактериальной целлюлозы с помощью
продуцента Мedusomyces gisevii sa-12 на питательной среде на основе
23
ферментативного гидролизата из легковозобновляемого целлюлозосодержащего
сырья. М 10018691.02100.00090 от 15.09.2017 г., утвержденная директором ИПХЭТ
СО РАН;
–
Методика.
Промывка
технической
бактериальной
целлюлозы.
М 10018691.02100.00091 от 15.09.2017 г., утвержденная директором ИПХЭТ СО
РАН;
– Технологическая пропись получения бактериальной целлюлозы на установке
комплексной переработки растительного сырья в целлюлозосодержащие продукты.
ТП 10018691.02101.00074 от 26.09.2017 г., утвержденная директором ИПХЭТ СО
РАН.
СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Список статей в журналах, рекомендованных ВАК
1.
Гладышева, Е.К. Влияние углеродного состава питательных сред на
продуктивность целлюлозосинтезирующих бактерий (обзор) / Е.К. Гладышева, Е.А.
Скиба // Ползуновский вестник. – 2014. – № 3. – С. 168-173.
2.
Гладышева, Е.К. Обоснование выбора питательной среды для синтеза
бактериальной целлюлозы / Е.К. Гладышева // Вестник алтайской науки. – 2014. –
№ 1. – С. 307-310.
3.
Гладышева, Е.К. Изучение биосинтеза бактериальной целлюлозы
культурой Мedusomyces gisevii J. Lindau на средах с различной начальной
концентрацией глюкозы / Е.К. Гладышева // Фундаментальные исследования. – 2015.
–№ 2-1. – С. 13-17.
4.
Гладышева, Е.К. Исследование физико-химических свойств бактериальной
целлюлозы, продуцируемой культурой Мedusomyces gisevii / Е.К. Гладышева //
Фундаментальные исследования. – 2015. – № 5-1. – С. 53-57.
5.
Гладышева,
Е.К.
Результаты
рентгенографических
исследований
бактериальной целлюлозы / Е.К. Гладышева // Фундаментальные исследования. –
2015. – № 7-2 . – С. 240-244.
6.
Гладышева, Е.К. Исследование структуры и химического строения
бактериальной целлюлозы / Е.К. Гладышева // Ползуновский вестник. – 2015. – № 4-2.
– С. 100-105.
7.
Гладышева, Е.К. Биосинтез бактериальной целлюлозы культурой
Мedusomyces gisevii / Е.К. Гладышева, Е.А. Скиба // Вестник Воронежского
государственного университета инженерных технологий. – 2015. – № 3. – С. 149-156.
8.
Гладышева, Е.К. Исследование влияния температуры на синтез бактериальной
целлюлозы продуцентом Мedusomyces gisevii / Е.К. Гладышева // Современные
наукоемкие технологии. – 2016. – № 8-1. – С. 36-40.
24
9.
Гладышева, Е.К. Исследование процесса биосинтеза бактериальной
целлюлозы на ферментативном гидролизате волокнистого продукта плодовых
оболочек овса / Е.К. Гладышева // Фундаментальные исследования. – 2016. – № 11-2.
– С. 260-265.
10. Гладышева, Е.К. Особенности структурных характеристик бактериальной
целлюлозы, синтезированной на ферментативном гидролизате лигноцеллюлозного
материала плодовых оболочек овса / Е.К. Гладышева, Е.А. Скиба, Л.А. Алешина //
Ползуновский вестник. – 2016. – № 4-1. – С. 152-156.
11. Гладышева, Е.К. Биосинтез бактериальной целлюлозы на ферментативном
гидролизате технической целлюлозы из плодовых оболочек овса / Е.К. Гладышева,
Е.А. Скиба // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. – 2017. – Т. 7, № 1.
– С. 140-146.
12. Лубянский, В.Г. Экспериментальное исследование возможности применения
бактериальной целлюлозы в хирургии / В.Г. Лубянский, А.Н. Жариков, Е.К.
Гладышева, Е.А. Скиба, В.В. Будаева, Е.Н. Семенова / Альманах Института. – 2017.
– № S1. – С. 226-227.
13. Сакович, Г.В. Технологические основы получения бактериальной
наноцеллюлозы из сырья с нулевой себестоимостью / Г.В. Сакович, Е.А. Скиба, В.В.
Будаева, Е.К. Гладышева, Л.А. Алёшина // Доклады Академии наук. – 2017. – № 1
(477). – С. 109-112.
Список патентов
14. Пат. РФ № 2597291, С12N 1/22, C12P 19/04. Способ получения бактериальной
целлюлозы / В.В. Будаева, Е.К. Гладышева, Е.А. Скиба, Г.В. Сакович –
№ 2015129304/10; заявл. 16.07.2015; опубл. 10.09.2016, Бюл. № 25. – 9 с.
15. Пат. РФ № 2624242, А61L 15/18, А61L 15/44, А61L 15/28, А61F 13/00. Раневое
покрытие с гемостатическим действием и способ его получения / В.Г. Савченко, Г.Г.
Белозерская, В.А. Макаров, Л.С. Малыхина, О.Е. Неведрова, Д.Ю. Бычичко, Е.М.
Голубев, Т.И. Широкова, Д.В. Шальнев, Н.М. Никитина, В.А. Кабак, А.П. Момот,
И.И. Шахматов, В.В. Будаева, Е.К. Гладышева, Е.А. Скиба, Г.В. Сакович, Е.И.
Макарова, Ю.А. Гисматулина, Н.В. Бычин – № 2016133023; заявл. 10.08.2016; опубл.
03.07.2017, Бюл. № 19. – 19 с.
Список научных публикаций в других изданиях
16. Гладышева, Е.К. Рентгенографические исследования бактериальной
целлюлозы, выращенной на ферментативном гидролизате мискантуса / Е.К.
Гладышева, И.В. Люханова / Новые достижения в химии и химической технологии
растительного сырья: материалы VI Всероссийской конференции с международным
участием, г. Барнаул, 21-24 апреля 2014 г. / Под ред. Н.Г. Базарновой, В.И. Маркина.
– Барнаул: Изд-во Алт. ун-та, 2014. – С. 404-406.
25
17. Гладышева, Е.К. Влияние начальной концентрации субстрата на биосинтез
гель-плёнки бактериальной целлюлозы культурой Мedusomyces gisevii J. Lindau / Е.К.
Гладышева / Биотехнологии в химико-лесном комплексе: материалы Международной
научной конференции, 11-12 сентября 2014 г., г. Архангельск. – Архангельск: ИД
САФУ, 2014. – С. 130-133.
18. Гладышева, Е.К. Изучение влияния этанола и дрожжевого экстракта на
биосинтез бактериальной целлюлозы, продуцентом Мedusomyces gisevii / Е.К.
Гладышева / Пищевые инновации и биотехнологии: материалы Международной
научной конференции, 28 апреля 2015 г., г. Кемерово. – Кемерово, 2015. – С. 48-50.
19. Гладышева, Е.К. Изучение влияния различных условий на синтез
бактериальной целлюлозы, продуцентом Мedusomyces gisevii / Е.К. Гладышева, Е.А.
Скиба / Химия и химическая технология в XXI веке: материалы XVI Международной
научно-практической конференции студентов и молодых ученых, посвященной 115летию со дня рождения профессора Л.П. Кулева, в 2-х т, 25-29 мая 2015 г., г. Томск /
Томский политехнический университет. – Томск: Изд-во Томского политехнического
университета, 2015. – Т. 2. – С. 277-278.
20. Гладышева, Е.К. Изучение влияния температуры на биосинтез бактериальной
целлюлозы / Е.К. Гладышева / Пищевые технологии и биотехнологии: материалы ХIV
Международной конференции молодых ученых, г. Казань, 13-14 мая 2015 г.: сборник
тезисов докладов. – Казань: Издательство «БРИГ», 2015. – С. 64.
21. Гладышева, Е.К. Изучение влияния соотношения объёмов питательной среды
и воздуха на биосинтез бактериальной целлюлозы / Е.К. Гладышева / Химия и
технология новых веществ и материалов: тезисы доклада V Всероссийской
молодежной научной конференции Института химии Коми научного центра. –
Сыктывкар, 2015. – С. 156-158.
22. Гладышева, Е.К. Получение бактериальной целлюлозы на синтетической
питательной среде в реакторе объемом 16 литров / Е.К. Гладышева, Е.А. Скиба /
Низкотемпературные и пищевые технологии в XXI веке: материалы VII
Международной научно-технической конференции, Cанкт-Петербург, 17–20 ноября
2015 г. – СПб.: Университет ИТМО, 2015. – Ч. II. – С. 297-300.
23. Гладышева, Е.К. Возможность получения бактериальной целлюлозы на
средах из легковозобновляемого растительного сырья / Е.К. Гладышева, Е.А. Скиба /
Перспективы развития химических и биологических технологий в XXI веке:
материалы Всероссийской научной конференции с международным участием, г.
Саранск, 23-25 сентября 2015 г. – Саранск, 2015. – С. 27.
24. Гладышева, Е.К. Биотехнологические основы синтеза бактериальной
целлюлозы продуцентом Мedusomyces gisevii (Biotechnological fundamentals for
synthesis of bacterial cellulose by the Мedusomyces gisevii producer) / Е.К. Гладышева,
Е.А. Скиба / Биотехнология и общество в XXI веке: сборник статей по материалам
26
Международного биотехнологического симпозиума «Bio-Asia 2015», 15-18 сентября
2015 г., г. Барнаул. – Барнаул, 2015. – С. 150-153.
25. Гладышева, Е.К. Исследование структуры бактериальной целлюлозы методом
рентгеноструктурного анализа / Е.К. Гладышева, Л.А. Алешина, Е.А. Скиба, В.В.
Будаева / Структура и физико-химические свойства целлюлоз и нанокомпозитов на
их основе: материалы II Всероссийской научно-практической Интернет-конференции
с международным участием, 6-7 октября, 2016, Карелия, Россия. – Красноярск:
Научно-инновационный центр, 2016. – С. 132-136.
26. Гладышева, Е.К. Биотехнологические основы получения бактериальной
целлюлозы из целлюлозосодержащего сырья / Е.К. Гладышева / Новые достижения в
химии и химической технологии растительного сырья: материалы VI Всероссийской
конференции с международным участием, г. Барнаул, 24-28 апреля 2017 г. / Под ред.
Н.Г. Базарновой, В.И. Маркина. – Барнаул: Изд-во Алт. ун-та, 2017. – С. 389-391.
ОСНОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
АС – азотнокислый способ;
БЦ – бактериальная целлюлоза;
ВП – волокнистый продукт;
ИК – инфракрасная спектроскопия;
КС – комбинированный способ;
ЛЦМ – лигноцеллюлозный материал;
М.д. – массовая доля;
ОКР – область когерентного рассеяния;
ПОО – плодовые оболочки овса;
РВ – редуцирующие вещества;
СК – степень кристалличности;
ТЦ – техническая целлюлоза;
ЯМР – ядерно-магнитный резонанс.
27
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
24
Размер файла
1 055 Кб
Теги
овса, разработка, технология, плодовых, бактериальной, целлюлозы, получения, оболочек
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа