close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Сравнительная характеристика лектинов сапрофитных и фитопатогенных штаммов грибов Fusarium solani

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Мухаммадиев Ришат Салаватович
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЛЕКТИНОВ САПРОФИТНЫХ И
ФИТОПАТОГЕННЫХ ШТАММОВ ГРИБОВ FUSARIUM SOLANI
03.02.03 - микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Казань – 2018
2
Работа выполнена на кафедре биохимии и биотехнологии Института
фундаментальной медицина и биологии ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский)
федеральный университет»
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор,
Багаева Татьяна Вадимовна
Официальные оппоненты: Дегтярева Ирина Александровна, доктор
биологических наук, зав. отделом агроэкологии
и микробиологии Татарского НИИАХП –
обособленного структурного подразделения
ФГБУН
«Федеральный
исследовательский
центр «Казанский научный центр Российской
академии наук» (г. Казань)
Пахомова Валентина Михайловна, доктор
биологических наук, профессор, профессор
кафедры биотехнологии, животноводства и
химии ФГБОУ ВО «Казанский государственный
аграрный университет» (г.Казань)
Ведущая организация:
Институт биологии Уфимского федерального
исследовательского центра РАН (г.Уфа)
Защита диссертации состоится «29» марта 2018 г. в 13.00 на заседании
диссертационного
совета
Д 212.081.36
при
ФГАОУ ВО
«Казанский
(Приволжский) федеральный университет» по адресу: 420055, Республика
Татарстан, г. Казань, ул. Карла Маркса, д. 74, аудитория № 205А.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И.
Лобачевского при Казанском (Приволжском) федеральном университете.
Автореферат разослан «
»
Ученый секретарь диссертационного
совета, доктор биологических наук
2018 г.
Абрамова З.И.
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
В настоящее время одним из перспективных подходов к разработке
биопрепаратов для защиты растений путем формирования их индуцированной
устойчивости является применение соединений, участвующих в процессах
патогенеза.
Известно, что на первых стадиях патогенеза растений существенную роль
играют поверхностные структуры партнеров, которые вступают в определенные
не до конца изученные взаимодействия. Одним из видов такого взаимодействия
является углевод-белковое распознавание, где важную роль отводят лектинам.
Лектины - гемагглютинирующие гликопротеины, обладающие уникальной
способностью избирательно взаимодействовать со структурами клеток тканей,
содержащими углеводные детерминанты, и изменять сигналы в биологической
системе [Garner, Baum, 2008; Houser, 2014]. Исследования, проводимые
зарубежными лектинологами на микроскопических грибах, показывают, что
лектины, находящиеся на поверхности клеток микромицетов, могут играть
значимую роль в процессах патогенеза растений [Larroque et al., 2011].
Среди фитопатогенов, способных паразитировать на высших растениях,
наибольший интерес вызывают грибы рода Fusarium. Они широко
распространены
природе
и
способны
к
поражению
большинства
сельскохозяйственных и культурных растений [Голиков, 2003]. К активным
фитопатогенам относится вид Fusarium solani - возбудитель корневой гнили,
который способен поражать горох, фасоль, сою, пшеницу, томаты, огурцы, дыни
и арбузы [Горленко, 1976; Bogale et al., 2009; Домаш с соавт., 2014;]. Данный вид
производит широкий спектр вторичных токсичных метаболитов, микотоксинов
(монилиформин и трихотецены ДОН, Т-2, зеараленон) [Монастырский, 2000;
Гагкаева с соавт., 2009; Рыстаева с соавт., 2009; Carvajal-Moreno, 2015], с
которыми связаны не только болезни растений, фузариозы, но и болезни
человека, домашних животных, такие как микозы, гипертрофия миокарда,
гематологические заболевания и другие. Высокая агрессивность этих
микромицетов в значительной степени определяется особенностями жизненной
стратегии и их обширным диапазоном приспособительных реакций, среди
которых, и способность к синтезу поверхностных лектинов. Однако в литературе
имеется незначительное количество данных о способности микромицетов рода
Fusarium к синтезу лектинов, а информация по синтезу поверхностных лектинов,
в том числе и фитопатогенными видами, отсутствует.
4
В связи с этим, учитывая важность лектинов в физиологических процессах
живых организмов, является актуальным направление исследований по
сравнительной характеритике лектинов сапрофитных и фитопатогенных грибов, а
также процесса их биосинтеза, свойств и специфичности.
Цель работы - выделение, характеристика и изучение биохимической
активности поверхностных лектинов сапрофитных и фитопатогенных грибов
F.solani и их влияние на рост растений при патогенезе.
Для решения этой проблемы были поставлены следующие задачи:
1.
Провести выделение и скрининг микромицетов рода Fusarium для
выявления видовой способности штаммов продуцировать лектины.
2.
Установить зависимость между активностью лектинов и
фитопатогенностью изучаемых микромицетов.
3.
Разработать условия получения гомогенных лектинов сапрофитного и
фитопатогенного штаммов микромицетов Fusarium solani.
4.
Определить физико-химические и биохимические свойства лектинов
сапрофитного и фитопатогенного штаммов.
5.
Изучить влияние лектина фитопатогенного штамма на рост растений
при патогенезе.
Научная новизна
Впервые проведено комплексное изучение зависимости между
фитопатогенностью микромицетов и их способностью к синтезу активных
лектинов. Установлено, что фитопатогенные штаммы микромицетов, независимо
от условий культивирования продуцентов, синтезируют лектины более высокой
степени активности по сравнению с сапрофитными штаммами.
Разработана и стандартизована схема выделения и очистки лектинов
сапрофитных и фитопатогенных штаммов микромицетов Fusarium solani,
позволяющая получить гомогенные препараты.
Впервые получены новые гомогенные лектины из сапрофирного и
фитопатогенного штаммов Fusarium solani, сравнительная характеристика
которых, выявила значительные различия в их молекулярной массе,
аминокислотной
последовательности
структуры
лектинов,
углеводной
специфичности, температурном - и рН - оптимуме.
Впервые обнаружено, что лектин фитопатогенного микромицета Fusarium
solani обладает выраженной способностью защиты растений от фузариоза.
Предварительная обработка корней растений препаратом поверхностного лектина
F.solani 6 до их инфицирования фитопатогеном оказывает положительное
действие на рост и развитие надземной и подземной частей растений, а также
существенно уменьшает степень поражения и распространенность гнили корней
гороха.
5
Теоретическая и научно-практическая значимость работы
Полученные в рамках диссертационной работы результаты о скрининге,
динамике
образования,
физико-химических
свойствах,
углеводной
специфичности лектина штаммов микромицетов Fusarium solani расширяют
знания в области лектинологии.
Установленная зависимость активности лектинов от фитопатогенности
штаммов микромицетов, позволяет рекомендовать их в качестве маркеров для
экспресс анализа штаммов на фитопатогенность.
Полученные новые препараты лектинов сапрофитного и фитопатогенного
микромицета Fusarium solani, могут быть использованы для экспериментов в
изучении механизмов углевод-белкового и углевод-углеводного взаимодействия
биологических структур, а также в расшифровке механизма патогенеза растений.
Установленная способность лектина фитопатогенного штамма микромицета
F.solani 6 способствовать защите растений от фузариоза в процессе
предобработки корней растений, позволяет рекомендовать его, для дальнейшего
исследования в качестве потенциального препарата для сельского хозяйства.
Положения, выносимые на защиту:
1.
Микромицеты, синтезирующие активные лектины, обладают
выраженными фитопатогенными свойствами.
2.
Сапрофитные и фитопатогенные микромицеты одного вида, при
одинаковых условиях культивирования, синтезируют разные по физикохимическим свойствам и углеводной специфичности лектины.
3.
Лектины фитопатогенных микромицетов F.solani могут служить
средствами защиты растений от фузариозов.
Достоверность результатов проведенных исследований подтверждается
значительным
объемом
многократных
лабораторных
экспериментов,
выполненных и проанализированных с использованием современных
высокоточных приборов, а также опубликованием полученных результатов в
международных и отечественных журналах с рецензированием ведущими
учеными в данной области.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы докладывались,
обсуждались и были представлены на Итоговой научной конференции (Казань,
КФУ, 2016, 2014, 2012), I Республиканской выставке-конференции
«Биотехнология в Республике Татарстан - состояние и перспективы» (Казань,
РЦИБ, декабрь 24-25, 2015), IV Международной научной Интернет - конференции
«Биотехнология. Взгляд в будущее» (Казань, КФУ, март 24-25, 2015), III
Международной научной – Интернет конференции «Биотехнология. Взгляд в
будущее» (Казань, КФУ, апрель 17-19, 2012), VII Молодежная школаконференция с международным участием «Актуальные аспекты современной
6
микробиологии» (Москва, Институт микробиологии им. Виноградского РАН,
2011),
1-ая
Международной
Интернет-конференции
"Растения
и
микроорганизмы" (Казань, КФУ, 2011).
Связь работы с научными программами. Исследования выполнены в
соответствии с тематическим планом НИР Казанского (Приволжского)
федерального университета «Микробные ферменты и метаболиты как основа
новых биотехнологий в сельском хозяйстве (Проект 14-83 от 2014 г.).
Работа была выполнена при финансовой поддержке гранта по
инновационным исследованиям «У.М.Н.И.К.», НИОКР по теме: «Исследования и
разработки молодыми учеными IT-систем, алгоритмов и программ, способов,
материалов, устройств, приборов и механизмов по направлениям:
информационные технологии; медицина будущего; современные материалы и
технологии их создания; новые приборы и аппаратные комплексы;
биотехнологии» (государственный контракт № 11717р/17263 от «05» апреля
2013г.).
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 9 научных
работ, включая 5 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях,
входящих в Перечень Scopus и ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из
разделов: введение, обзор литературы, описания материалов и методов
исследований, результатов исследования, их обсуждения, выводов и списка
литературы. Объем работы составляет 148 страниц, включает 16 таблиц и 29
рисунков. Библиографический список включает 58 наименований российских и
136 наименований зарубежных авторов.
Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность и
признательность научному руководителю д.б.н., профессору ИФМиБ КФУ Т.В.
Багаевой за неоценимую помощь и всестороннюю поддержку при подготовке
диссертации. Автор искренне благодарен к.б.н., доценту Т.И. Абдуллину, к.б.н.,
Р.С. Мухаммадиеву, к.б.н., доценту Н.И. Акберовой. к.б.н., доценту А.М.
Мардановой, д.б.н., профессору Ф.К. Алимовой, д.б.н., профессору З.И.
Абрамовой за советы, поддержку и помощь в работе. Автор выражает глубокую
признательность всем сотрудникам кафедры биохимии и биотехнологии КФУ за
всестороннюю помощь и доброжелательную рабочую атмосферу.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Объекты исследования. В работе были использованы микроскопические
грибы рода Fusarium, выделенные из образцов различных экологических ниш
7
Республики Татарстан: с поверхности овощных культур (картофель), с
поверхности семян зерновых культур (пшеница, кукуруза, ячмень), из образцов
почвы различных районов, а также из музея культур микромицетов кафедры
биохимии и биотехнологии, Института фундаментальной медицины и биологии
Казанского (Приволжского) федерального университета.
При исследовании фитопатогенной активности F.solani по отношению к
растениям использовали сорт семян озимой мягкой пшеницы Казанская 560 и
сорт семян посевного гороха Альбумен. Озимая мягкая пшеница сорт «Казанская
560» выведен в ГУ Татарского научно-исследовательского института сельского
хозяйства с помощью многократного отбора из сорта Мeшинская. Горох сорт
«Альбумен» создан в ФГБНУ Фаленской селекционной станции научноисследовательского института сельского хозяйства Северо-Востока имени
Н.В.Pудницкого путем многократного отбора из гибpидной комбинации Надежда
(Россия) и Рrimcovert, к-5432 (Франция).
Молекулярно-генетические анализы. Идентификацию микроорганизмов
проводили определением структуры нуклеотидной последовательности ITS-1 и
ITS-2 регионов с использованием универсальных праймеров [White et al., 1990]:
ITS1-5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′
и
ITS4-5′TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′. Полученную последовательность сравнивали с
последовательностями из международного банка данных NCBI (National Center
for Biotechnological Information, USA) c помощью пакета программ BLAST (Basic
Local Alignment Search Tool).
Филогенетический анализ нуклеотидных послеловательностей. После
множественного выравнивания нуклеотидных последовательностей и перевода их
в MEGA формат, строили филогенетические деревья программой MEGA 6
[Tamura et al., 2013] методами максимальной парсимонии, ближайших соседей и
максимального правдоподобия. Построение филогенетического дерева методом
максимального правдоподобия выполняли, используя модель GTR + I
(инвариабельные сайты) +G (сайты, описываемые гамма-распределением)
[Watanabe et all, 2011; Tunarsih et all, 2015]. При построении дерева методом
ближайших соседей, в качестве модели замен применялась модель Кимура-2
[Oechsler et all, 2009; Lin et all, 2014]. Кластеры (узлы), которые были поддержаны
бустреп значением более чем на 50% считали достоверными.
Микробиологические методы анализа. Выделение фитопатогенов с
клубней картофеля осуществляли методом выявления скрытой инфекции
[Рудаков, Рудаков, 2005].
Выделение грибов из почв проводили методом разведений с дальнейшим
высевом культуры на плотную питательную среду Чапека [Нетрусов, 2005].
8
Определение фитопатогенности микромицетов проводили с помощью
выращивания семян зерновых и овощных культур в водной суспензии конидий
микромицетов [Чекмарев, Зеленева, 2016]. Степень развития корневой гнили
пшеницы и гороха оценивали дифференцированно по органам, используя
пятибальную шкалу [Чулкина, Торопова, 2004; Рябуха с соавт., 2015].
Физиолого-биохимические методы. Определение активности лектинов
проводили
реакцией
прямой
гемагглютинации
с
нативными
и
модифицированными эритроцитами человека группы крови АВО в U-образных
иммунологических планшетах [Singh et al., 2008].
Определение рН-оптимума активности лектинов осуществляли по реакции
прямой гемагглютинации после инкубации лектинов при температуре 20°С в
течение часа с использованием различных буферных растворов [Singh et al.,
2013].
Определение температурного оптимума активности лектинов проводили по
реакции гемагглютинации выдерживанием очищенных лектинов в диапазоне
температур от 10 до 90°C в течение 20 минут в 20 мМ Tris-HCl буфере (рН 7,8 для
лектина F.solani 4 и 7,4 - для F.solani 6).
Действие ионов металлов на активность лектинов устанавливали по методу
Datta и Al-Saman с соавторами [Datta et al., 1991; Al-Saman et al., 2015].
Углеводную специфичность лектинов определяли по их взаимодействию с
различными сахарами в иммунологических 96 - луночных U-образных планшетах
методом ингибирования реакции гемагглютинации, используя 2%-ную суспензию
нативных эритроцитов и растворы различных углеводов [Singh et al., 2008].
Исследование биологической активности лектина фитопатогенного гриба
F.solani 6 проводили изучением роста и развития растений гороха сорта Альбумен
предварительно обработанных препаратом белка в концентрациях 1,25; 2,5; 5,0 и
10,0 мкг/мл до их инфицирования патогеном [Zhang et al., 2010].
Изучение влияние лектина F.solani 6 на активность пероксидазы гороха
проводилось путем обработки семян препаратом лектина в концентрации 5,0
мкг/мл в течение 24 часа [Zhang et al., 2010]. Измерение величины активности
пероксидазы производили колориметрически с помощью методики Бояркина
[Павловская с соавт., 2010]. Активность антиоксидантного фермента пероксидазы
рассчитывали по скорости окислительной реакции бензидина пероксидом
водорода под влиянием фермента растений [Бояркин, 1951].
Хроматографическая
очистка
лектинов.
Очистку
лектинов
микромицетов проводили с помощью хроматографической системы низкого
давления BioLogic LP производства компании Bio-Rad с использованием колонок
Phenyl Sepharose High Performance, Bio-Scale™ Mini Macro-Prep High Q, Sephadex
9
G-50. Связавшийся лектин F.solani 6 с фенил-сефарозной колонки,
предварительно уравновешенной 20 мМ Tris-HCI буфером (рН 7,4), содержащим
1,5 М сульфат аммония, элюировали линейным градиентом 1,5→0 М (NH4)2SO4
при скорости потока 0,5 мл/мин. Элюцию белка на колонке с Sephadex G-50
осуществляли Tris-HCl буфером (рН 7,4) при скорости потока 0,5 мл/мин.
Элюцию связавшегося лектина F.solani 4 с гидрофобного сорбента осуществляли
градиентом концентрации 1,5→0 М (NH4)2SO4 в растворе 20 мМ Tris-HCI буфера
(рН 7,8) при скорости 1,0 мл/мин. Элюцию лектина на колонке Bio-Scale™ Mini
Macro-Prep High Q осуществляли линейным градиентом NaCl 0→1М в растворе
20 мМ Tris-HCI буфера (рН 7,8) со скоростью 3 мл/мин. Чистоту полученных
препаратов подтверждали с помощью метода электрофореза в 12,5 %
полиакриламидном геле в денатурирующих условиях [Laemmli, 1970].
Определение молекулярной массы лектинов. Определение молекулярной
массы лектинов проводили методом гель-фильтрации на колонке Econo - Column
(1,5 × 50 см, Bio-Rad) с Sephadex G-100 (диаметр частиц 40-120 мкм),
уравновешенной раствором стандартного буфера. Калибровочная кривая по
определению молекулярной массы лектинов была построена по линейной
зависимости логарифма молекулярной массы белка (lg M) от объема элюирования
его с колонки (Vе).
Масс-спектрометрический анализ (MALDI-TOF). Подготовку образцов
осуществляли, используя 600/384 TM AnchorChip MALDI пластинки (фирма
Bruker Daltonik, Германия), на которые наносили 2 мкл раствора пептидов
лектинов и 0,5 мкл раствора матрицы - 2,5-дигидроксибензойной кислоты (SigmaAldrich, 20 мг/мл). Пептидные фрагменты лектинов получали трипсином по
методу, который изложен на сайте (http://www.bioc.uzh.ch). Последовательности
аминокислот пептидов лектинов были изучены с помощью масс-спектрометра
ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF (фирма Bruker Daltonik) и анализированы с
использованием пакета программ FlexAnalysis 2,4 (фирма Bruker Daltonik). Поиск
сходства аминокислотных последовательностей лектинов среди гомологичных
белков организмов осуществляли в базе данных NCBI программой Mascot
(http://www.matrixscience.com). Статистически значимыми считали белки, которые
имели критерий score > 80 (p < 0,05).
Математическая обработка результатов. Статистическую обработку
полученных результатов проводили нахождением средних арифметических
значений и их стандартных ошибок, используя стандартный пакет программ
Microsoft Office Excel 2013. Уровень значимости, установленный в работе,
составляет 0,05.
10
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Определение
биоразнообразия
грибов
рода
Fusarium,
распространенных на территории Республики Татарстан. Выделение и
идентификация изолятов грибов рода Fusarium по комплексу физиологоморфологических признаков
Первой задачей наших исследований было провести выделение
микромицетов данного рода из природных образцов различных экологических
ниш Республики Татарстан: почва различных районов Татарстана, с поверхности
клубней картофеля (сортов Розара, Ред Скарлетт, Фелокс и Невский), зерновых
культур (пшеница, кукуруза). Дальнейшее изучение физиолого-морфологических
свойств, выделенных изолятов, показало видовое разнообразие выделенных
изолятов. В результате проведенных исследований было получено 182 изолята
микромицетов рода Fusarium, которые по морфологическим показателям были
объединены в 9 групп, соответствующих отдельным видам (рис. 1).
F. oxysporum
23%
45
Количество штаммов
40
35
30
25
20
15
F. redolens
4%
F. culmorum
7%
F. solani
19%
F.moniliforme
7%
10
5
0
F. equiseti
8%
F.
sporotrichioide
s
10%
F.avenaceum
12%
F.
graminearum
10%
Рисунок 1. Выделенные представители микромицетов рода Fusarium по
количеству штаммов (слева) и частоте встречаемости (справа).
Таким образом, проведенные эксперименты подтвердили широкое
распространение микромицетов рода Fusarium в природных образцах различных
экологических ниш Республики Татарстан. Среди видового состава
преимущественно были выявлены 9 видов: F.oxysporum, F.solani, F.redolens,
F.culmorum, F.moniliforme, F.graminearum, F.avenaceum, F.sporotrichoides,
F.equiseti. Наиболее распространенными видами, которые выявлялись на всех
сортах картофеля и почвах Зеленодольского, Верхнеуслонского, Пестречинского
и Лаишевского районов, оказались микромицеты F.oxysporum и F.solani. На
образцах зерновых культур - F.graminearum и F.moniliforme.
11
2. Скрининг грибов рода Fusarium на присутствие лектинов в
мицелии изолятов
Определение способности микромицетов рода Fusarium к синтезу
лектинов показало, что из 79 наиболее активно растущих изолятов наибольшая
активность лектинов мицелия была определена в сырых экстрактах F.solani 6
(титр 4096) и F.solani (титр 2048). Полное отсутствие активности лектинов, в
принятых условиях выделения, наблюдалось у 18 изолятов микромицетов.
Значительные отличия в активности лектинов наблюдалась и внутри
видового состава микромицетов, например, когда один штамм, F.solani, обладал
активностью лектинов (титр 2048), а другой, штамм F.solani 5, не проявлял ее.
Таким образом, скрининг экстрактов мицелия микромицетов рода
Fusarium, показал, что большинство изолятов данного рода обладают
способностью к синтезу активных лектинов. Кроме того, способность
микромицетов к синтезу лектинов не зависит от видовой принадлежности
штамма.
Среди исследованных микромицетов, штаммы вида F.solani обладали
наибольшими различиями в значениях активности лектинов и поэтому были
отобраны для дальнейших экспериментов.
3. Выявление взаимосвязи способности микромицетов рода
Fusarium к синтезу лектинов и их фитопатогенностью
Лектины являются одними из первых соединений, принимающих участие в
межклеточных взаимодействиях, поэтому можно было предположить, что
имеется связь между синтезом активных лектинов и фитопатогенностью
микромицетов.
Определение фитопатогенных свойств, выделенных микромицетов F.solani,
показало, что 44 % штаммов (F.solani, F.solani 1, F.solani 6, F.solani 8, F.solani 12,
F.solani 13, F.solani 15, F.solani 17) обладали выраженной фитопатогенной
активностью. Остальные 56 % F.solani (F.solani 2, F.solani 3, F.solani 4, F.solani 5,
F.solani 7, F.solani 9, F.solani 10, F.solani 11 и F.solani 14, F.solani 16) не
оказывали значительного действия на всхожесть и развитие растений, т.е. были
отнесены к сапротрофным штаммам.
Скрининг изучаемых микромицетов показал, что большинство
исследуемых штаммов, способных к синтезу общих мицелиальных лектинов,
были способны и к синтезу лектинов слабо связанных с поверхностью клеток.
Штамм F.solani 6, проявляющий высокую фитопатогенность относительно тестрастений, обладал наибольшей активностью мицелиальных и поверхностных
лектинов (титр 4096 и 128, соответственно). Такая же закономерность
наблюдалась и для ряда других штаммов. С другой стороны, у большинства
12
штаммов микромицетов не проявляющих фитопатогенную активность или
проявляющих невысокую фитопатогенную активность, отмечалось отсутствие
гемагглютинирующей активности в экстрактах мицелия микромицетов.
Исследование
корреляционной
взаимосвязи
активности
общих
мицелиальных и поверхностных лектинов с фитопатогенными свойствами
микромицетов F.solani, включая основные количественные признаки (всхожесть,
длина и биомасса проростков и корней), а также развития болезни показало, что
коэффициент
корреляции
между
гемагглютинирующей
активностью
поверхностных лектинов и интенсивностью поражения гнилью корней гороха
составляет - 0,57, что указывает о достоверности изучаемой зависимости,
несмотря на средние значения значимости между данными показателями (рис. 2).
Рисунок 2. Зависимость между активностью поверхностных лектинов
грибов F.solani и зараженностью проростков гороха посевного (Pisum sativum).
Корреляция была значима при p = 0,02.
4. Общая характеристика поверхностных лектинов мицелия
фитопатогенных и сапрофитных штаммов микромицетов Fusarium solani
Следующей задачей наших исследований было сравнительное изучение
свойств поверхностных лектинов сапрофитных и фитопатогенных микромицетов
F.solani. На первом этапе устанавливали их избирательную способность по
взаимодействию с эритроцитами различных групп крови.
Эксперименты показали, что большинство лектинов микромицетов F.solani
не зависимо от их принадлежности к фитопатогенным или сапрофитным штаммам
являются панагглютининами, т. е. белками, способными проявлять специфичность к
молекулам антигенов всех групп крови АВО. Не было отмечено и значительных
различий между лектинами сапрофитных и фитопатогенных видов и при
взаимодействии с модифицированными эритроцитами. В наших экспрериментах
было установлено, что увеличение активности поверхностных лектинов в 2-4 раза
наблюдается у микромицетов при обработке эритроцитов трипсином, в 2-32 и 8-64
13
раза-при обработке нейраминидазой и проназой, соответственно. Можно
предположить, что повышение чувствительности гемагглютинирующей реакции при
обработке эритроцитов нейраминидазой, по-видимому, связано с отщеплением
сиаловых кислот и освобождением субтерминальных галактозильных групп
поверхностно расположенных гликопротеинов, при этом на поверхности
эритроцитов уменьшается отрицательный заряд, увеличивая их способность к
реакции гемагглютинации. Обработка эритроцитов протеолитическими ферментами,
такими как трипсин и проназа, по-видимому, приводит к удалению полипептидов,
выступающих на внешней поверхности эритроцитов, тем самым освобождая
поверхностные сахара (антигены) для взаимодействия с лектинами. Однако, если
трипсин оказывал свое влияние только на трансмембранный белок гликофорин А, на
долю которого приходится 75% всех мембранных сиалогликопротеинов,
находящихся на поверхности эритроцитов, то проназа, затрагивала и белки «полос 3
и 5» [Bender et al., 1971; Triplett, Carraway, 1972; Steck,1974], поэтому
чувствительность реакции гемагллютинации возрастала более значительно.
Характеризуя агглютинины, выделенные из поверхности гиф мицелия грибов
F.solani, было интересно установить их избирательную способность связывать
различные углеводы, поскольку именно это уникальное свойство служит основой их
классификации [Sharon, Lis, 2004]. Кроме того, определение специфичности
поверхностных агглютининов фитопатогенных штаммов F. solani к определённым
углеводам свидетельствует об участии данных лектинов-рецепторов при заражении
растения-хозяина, тем самым выявляя молекулярные механизмы патогенеза
растений, в частности фузариоза.
Результаты исследований показали, что лектины фитопатогенных и
сапрофитных штаммов резко отличались по углеводной специфичности.
Большинство фитопатогенных штаммов микромицетов F.solani взаимодействовали в
большинстве случаев с простыми по структуре сахарами, таким как L-фукоза и Dглюкуроновая кислота, указывая на возможное участие данных моносахаридов в
процессе межклеточного распознавания при заражении растения-хозяина
возбудителем заболевания фузариоза. Для большинства сапрофитных штаммов F.
solani была найдена углеводная специфичность относительно полисахаридов и
гликопротеинов.
Интересным является факт специфичности лектинов к углеводам и их
взаимодействие с эритроцитами разных групп крови. Так, более высокая углеводная
специфичность лектина фитопатогенного штамма F.solani 6 к моносахариду Lфукозе подтверждает полученные данные о способности лектина F.solani 6 вызывать
агглютинацию эритроцитов только 1-ой группы крови человека, содержащих фукозу
на своей их поверхности. Высокое сродство поверхностного лектина F.solani 12 к
14
моносахаридам L-фукозе и D-галактозе подтвердило результаты специфического
связывания лектина с рецепторами поверхности эритроцитов 1 и 3 группы крови,
которые характерны для эритроцитов данных групп.
5. Молекулярно-филогенетический анализ штаммов Fusarium solani
на основе секвенированной области ITS1-5.8SrDNA-ITS2 рДНК
С целью дальнейшего сравнительного изучения лектинов фитопатогенных и
сапрофитных видов микромицетов F.solani, была проведена генетическая
идентификация двух изолятов: фитопатогенного штамма F.solani 6 и
сапрофитного
штамма
F.solani
4.
Идентификация
нуклеотидной
последовательности фрагментов в базе международного банка данных позволила
установить 100% степень сходства полученных последовательностей
микромицетов с имеющимися в NCBI. Анализ видовой принадлежности штамма
по нуклеотидной последовательности участка ITS1-5.8SrDNA-ITS2 позволил
подтвердить видовую принадлежность сапрофитного и фитопатогенного
штаммов, а именно F.solani 4 и F.solani 6, к одному виду.
Для установления более точной картины родства, были построены
филогенетические деревья, используя методы максимальной парсимонии,
ближайших соседей и максимального правдоподобия. В результате исследований
было установлено, что принципиальных отличий в топологии деревьев,
полученных различными методами, не наблюдалось, отличия были в индексах
поддержки узлов дерева (рис. 3).
Fusarium oxysporum
Fusarium oxysporum
Fusarium moniliforme
Fusarium moniliforme
Fusarium equiseti
Fusarium equiseti
Fusarium sporotrichioides
Fusarium graminearum
Fusarium sporotrichioides
Fusarium graminearum
Fusarium culmorum
Fusarium culmorum
Fusarium solani 6
Fusarium solani 6
Fusarium solani 4
Fusarium solani 4
Fusarium redolens
Fusarium redolens
Fusarium avenaceum
Fusarium avenaceum
Aspergillus versicolor S66
Aspergillus versicolor S66
Anthoxanthum aristatum
Anthoxanthum aristatum
Рисунок
3.
Филогенетическое
дерево,
реконструированное
с
использованием алгоритма NJ (слева) и ML (справа) по фрагменту ДНК ITS1ITS2. У ветвей показаны значения бутстреп-счета.
Последовательности 5.8, 18, 28S рРНК межгенного участка грибов рода
Fusarium на филогенетических деревьях, построенных с использованием
15
различных методов анализа, распадаются на две большие группы. Одна,
распадающаяся на два кластера, представлена видами: F.oxysporum, F.moniliforme,
F.equiseti, F.sporotrichoides, F.graminearum и F.culmorum. Другая распадается на
два отдельных кластера и объединяет в себя три вида Fusarium: F.solani,
F.redolens и F.avenaceum. Сходство нуклеотидных последовательностей
фрагментов ITS штаммов грибов F.solani 4 и F.solani 6 составили 100 и 99%.
6. Определение динамики накопления активных лектинов в процессе
роста фитопатогенного и сапрофитного штаммов F.solani
Изучение динамики образования лектинов микромицетов F.solani 6 и
F.solani 4 проводили при выращивании штаммов на среде КГ, при температуре
28ºС, в течение 12 суток (рис. 4).
Рисунок 4. Динамика роста и накопление поверхностного лектина в
мицелии сапрофитного микромицета F.solani 4 (слева) и F.solani 6 (справа)
Результаты исследований показали, что процесс образования лектинов
микромицетами фитопатогенного и сапрофитного штамма микромицетов
несколько отличается. У фитопатогенного штамма образование лектинов
происходило значительно активнее, с более длительным сохранением активности,
чем у сапрофитного штамма. Однако максимальная активность лектинов
отмечалась на 7-8 сутки роста микромицетов (в начале стационарной фазы роста)
независимо от степени фитопатогенности штамма. Образование лектинов зависит
от роста культуры микроорганизмов, но прямой корреляция мкжду этими
показателями нет, поскольку при сохранении биомассы мицелия в период
поздней стационарной фазы роста культуры, активность лектинов резко падает.
7. Выделение и очистка поверхностного лектина фитопатогенного и
сапрофитного микромицетов F.solani 6 и F.solani 4
С целью дальнейшего изучения физико-химических свойств и
биологических функций поверхностных лектинов микромицетов F.solani 6 и
16
F.solani 4 была разработана и стандартизована 6 ступенчатая схема их
выделения и очистки (рис. 5 и 6).
Рисунок 5. Схема выделения и очистки препарата поверхностного лектина
микромицета F.solani 6
Различия в схемах очитки препаратов сапрофитного и фитопатогенного
штаммов наблюдались уже на первых этапах осаждения лектинов, если лектины
фитопатогенного штамма лучше осаждались сульфатом аммония, то лектины
сапрофитого штамма - ацетоном. Значительные отличия наблюдались и в
хроматографических спектрах поверхностных белков (рис. 7). Кроме того, общее
количество белков у сапрофитного штамма было значительно меньше, чем у
фитопатогена.
Однако подобранные нами индивидуальные условия для
выделения и очистки лектинов сапрофитного и фитопатогенного штаммов,
позволили получить гомогенные препараты белка с удельной активностью 100,0
± 3,3 U/мг и 7111 ± 51,6 U/мг, соответственно (табл.1 и 2).
17
Рисунок 6. Схема выделения и очистки препарата поверхностного лектина
сапрофитного микромицета F.solani 4
Таблица 1. Выделение и очистка поверхностного лектина мицелия F.solani 6
Очистка
Объем,
мл
Белок,
мг/мл
Титр
ГА
Общая
ГА1, U
Удельная
ГА2, U/мг
Исходный экстракт
5,5
6,5
512
2816,0
78,8
Фракционирование
3
7,3
1024 3072,0
140,3
(NH4)2SO4 и диализ
ГХ Phenyl Sepharose
3
0,22
512
1536,0
2327,3
High Performance
ГХ Phenyl Sepharose
3
0,16
512
1536,0
3200,0
High Performance
ГФ Sephadex G-50
2,0
0,09
512
1024,0
7111,1
1
Общая гемагглютинирующая активность = ГА × объем (мл).
2
Удельная гемагглютинирующая активность = U / белок (мг).
Степень
очистки
Выход,
%
1
1,8
100
109,1
29,6
52,6
40,6
52,6
90,3
36,4
18
Таблица 2. Выделение и очистка поверхностного лектина мицелия F.solani 4
Очистка
Исходный экстракт
Фракционирование
ацетоном и диализ
ГХ Phenyl Sepharose
High Performance
ИХ Bio-Scale™ Mini
Macro-Prep High Q
ГФ Sephadex G-50
Объем,
мл
5,7
3,0
Белок,
мг/мл
6,8
7,2
Титр
ГА
8
16
Общая
ГА1, U
45,6
48,0
Удельная
ГА2, U/мг
1,2
2,2
Степень
очистки
1
1,9
Выход,
%
100
105,3
2,0
4,8
16
32,0
3,3
2,8
70,2
3,0
0,13
4
12,0
30,8
25,6
54,6
2,5
0,04
4
10,0
100,0
83,3
21,9
8. Определение степени чистоты и структуры лектинов F.solani 4 и
F.solani 6
Степень чистоты поверхностных лектинов F.solani 4 и F.solani 6 была
подтверждена наличием одной полосы на электрофореграммах, полученных
методом электрофореза в 12,5% полиакриламидном геле в денатурирующих
условиях (рис. 7). Молекулярная масса лектина F.solani 6 в денатурирующих
условиях соответствовала 15,0 ± 1,6 кДа, а лектина F.solani 4 – 19,0 ± 2,0 кДа.
Однако дальнейшее определение молекулярной массы нативных лектинов
F.solani 6 и F.solani 4 методом гель-фильтрации на Sephadex G-100 показало, что
для F.solani 6 она была равна 30,0 ± 2,1 кДа, а для F.solani 4 - 38,0 ± 2,5 кДа.
Рисунок 7. Электрофореграмма поверхностного лектина микромицета
F.solani 6 и F.solani 4, проявленная с помощью нитрата серебра: М - белкимаркеры; LFS 6 - препарат лектина F.solani 6 после гидрофобных хроматографий
и гель - фильтрации; LFS 4 - препарат лектина F.solani 4 после ионообменной
хроматографии и гель - фильтрации. Стрелкой показаны лектины изолятов
F.solani 6 и F.solani 4.
19
Сравнение полученных результатов проведенных опытов позволило сделать
вывод, что лектины исследуемых штаммов микромицетов являются димерами и
имеют двухсубъединичную структуру белковой части молекулы.
Определение первичной структуры очищенных поверхностных лектинов
F.solani 4 и F.solani 6 и поиск гомологичных белков среди различных организмов
показал, что некоторые аминокислотные последовательности пептидов
поверхностных лектинов F.solani 4 и F.solani 6 были схожи с
последовательностями полипептидных цепей других организмов. Однако
критерий сходства score для исследуемых аминокислотных последовательностей
пептидов имел значения меньше 80, что свидетельствует о достоверном
отсутствии принадлежности последовательностей лектинов F.solani 4 и F.solani 6
к белкам других организмов. Следовательно, полученные лектины F.solani 6 и
F.solani 4 являются новыми белками микромицетов.
9. Изучение физико-химических свойств поверхностных лектинов
сапрофита F.solani 4 и фитопатогена F.solani 6
Основными физико-химическими характеристиками лектинов являются
устойчивость к температурному воздействию, к значениям рН и зависимость от
ионов металлов [Khan, Khan, 2011].
Изучение влияния температуры и рН на активность лектинов
фитопатогенного и сапрофитного штамма показало, что оба лектина обладали
устойчивостью в широком интервале температурных и рН значений. Однако
оптимум температуры и рН для фитопатогенного лектина F.solani 6 находился в
более широком диапазоне (табл.3).
Таблица 3. Физико-химические свойства поверхностных лектинов
сапрофитного штамма F.solani 4 и фитопатогенного штамма F.solani 6
Штаммы
Молек.
Кол-во
Оптимум
Углеводная
Ионы
масса, кДа субъед.
специфичность металлов
t°С
рН
F.solani 4
38
2
10-60 6,5-8,5
Фетуин,
Н.т.
фибриноген
L-фукоза, LF.solani 6
30
2
5-75 5,5-9,0
арабиноза, DН.т.
манноза
Проверка действия широкого спектра ионов металлов (Са, Mg, Zn, Fe, Cu,
Cо) на активность поверхностных лектинов фитопатогенного и сапрофитного
штаммов показала независимость гемагглютинирующей активности от их
присутствия.
20
Отсюда можно заключить, что сапрофитные и фитопатогенные
микроорганизмы одного вида при одинаковых условиях культивирования
синтезируют разные по физико-химическим свойствам и углеводной
специфичности лектины.
10. Лектины микромицетов как средство защиты растений
С целью изучения способности лектинов к защите растений от
фитопатогенов, проводили обработку корней 3-х суточных проростков посевного
гороха поверхностным лектином штамма F.solani 6 в концентрациях 1,25; 2,5; 5,0
и 10,0 мкг/мл в течение 24 часов (рис. 10). На 5-ые сутки опытные и контрольные
растения обрабатывались споровой суспензией фитопатогенного штамма F.solani
6, а на 8 сутки анализировались на изменение длины корней и проростков, а также
на накопление биомассы и развитие гнилостного процесса.
Обработка корней гороха препаратом лектина в концентрации 5,0 мкг/мл
приводила к достоверному повышению роста надземной части в среднем на 5,7%
и подземной - на 12,7 %, по сравнению с контролем. Соответственно наблюдалось
увеличение накопления биомассы побегов и корней проростков, на 10,1 % и 15,6
%, соответственно. Применение остальных концентраций исследуемого препарата
лектина существенно меньше влияло на процесс развития растений (рис. 8).
Рисунок 8. Влияние лектина фитопатогенного штамма на биомассу побега и
корней посевного гороха, обработанного фитопатогеном F.solani 6
Дополнительным показателем влияния лектинов на растения в качестве
средств их защиты было определение параметров интенсивности поражения и
распространение корневой гнили у проростков гороха (рис 9).
21
Рисунок 9. Влияние лектина фитопатогенного штамма на развитие корневых
гнилей гороха при искусственном заражении растений F.solani 6
Результаты исследований показали, что на 8-ые сутки после обработки
растений препаратом лектина в концентрации 5 мкг/мл происходит снижение
интенсивности поражения корней грибом F.solani 6 на 39,7 %,
распространенности фузариоза на 32,1 %.
10.1. Изучение влияния поверхностного лектина F.solani 6 на
активность пероксидазы проростков гороха
Связь лектинов с фитопатогенной активностью микромицетов позволила
сделать предположение, что они участвуют в процессе патогенеза растений,
способствуя выработки их защитной реакции. Фермент пероксидаза является
одним из показателей антиоксидантной системы, повышение уровня которой в
клетках растений свидетельствует об увеличение их устойчивости, в том числе и к
патогенезу [Павловская с соавт., 2010].
В связи с этим проводили обработку семян растений гороха препаратом
лектина F.solani 6 в концентрации 5 мкг/мл в течение суток. Активность
пероксидазы проростков гороха определяли, начиная с первых суток после
обработки (рис. 10).
В контрольных образцах, пероксидазная активность проростков гороха в
течение 96 часов в норме изменялась от 85 до 135 у.е.
Обработка семян растений препаратом лектина в начале их прорастания
приводит к увеличению активности пероксидазы почти в 2 раза, а затем к
плавному уменьшению ее активности до 142 у.е.
22
Рисунок 10. Динамика активности пероксидазы проростков гороха,
обработанных препаратом лектина F.solani 6.
Выявленное увеличение пероксидазной активности фермента у
обработанных лектином растений, свидетельствовало о повышении устойчивости
растений, его иммунного статуса. По-видимому, поверхностный лектин
фитопатогенного штамма F.solani 6 выступает в качестве элиситора
индуцированного иммунитета растений.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Настоящая диссертация посвящена выделению, характеристике и изучению
биохимической активности поверхностных лектинов сапрофитных и
фитопатогенных грибов F.solani, и их влиянию на рост растений при патогенезе.
В результате проведенных экспериментов было установлено, что изоляты F.solani
различались не только по активности мицеллиальных лектинов, но и
характеризовались различной степенью фитопатогенности, причем между
данными показателями наблюдалась достоверная взаимосвязь.
Изучение углеводной специфичности и других биохимических свойств
поверхностных лектинов мицелия фитопатогенных и сапрофитных штаммов
микромицетов F.solani установило, что практически все поверхностные лектины
микромицетов вызывали гемагглютинацию эритроцитов независимо от группы
человеческой крови, но обладали выраженной углеводной специфичностью:
лектины фитопатогенных форм грибов избирательно взаимодействовали с
моносахаридами, в то время как лектины сапрофитных форм – с полисахаридами и
гликопротеинами.
Исследование физико-химических свойств лектинов сапрофитного и
фитопатогенного штаммов Fusarium solani показало, что лектины одного вида
микромицетов, но синтезируемые сапрофитными и патогенными штаммами,
имеют как общие черты, так и значительные отличия, в том числе по времени
23
начала синтеза, аминокислотной последовательности, молекулярной массе,
функционирования в широком диапазоне температур и рН значений.
Сравнительный анализ лектинов сапрофитного и фитопатогенного штаммов
выявил также, что лектин фитопатогенного штамма обладал более высоким
биологическим потенциалом. Предварительная обработка растений гороха
препаратом лектина F.solani 6 вызывало достоверное повышение индуцированной
устойчивости растений к фузариозу, поэтому данный лектин может быть
рекомендован для дальнейших исследований в качестве биопрепарата
сельскохозяйственного назначения.
ВЫВОДЫ
1. Микромицеты рода Fusarium (62 из 79 штаммов), выделенные из
различных природных источников (овощные культуры, почвы районов
Татарстана), обладали способностью к синтезу лектинов различной степени
активности, которая не зависела от их видовой принадлежности.
2. Установлена достоверная взаимосвязь между активностью лектинов и
фитопатогенностью штаммов микромицетов. Фитопатогенные микромицеты,
независимо от условий культивирования, синтезируют лектины с более высокой
степенью активности по сравнению с сапрофитными штаммами.
3.
Разработаны схемы получения гомогенных препаратов лектинов
сапрофитных и фитопатогенных штаммов вида F.solani, отличающиеся этапом
осаждения лектинов и хроматографией с использованием ионообменных и
гидрофобных носителей.
4. Лектины, синтезируемые сапрофитными и патогенными штаммами
одного вида (Fusarium solani), имеют ряд отличительных свойств:
- лектин сапрофитного штамма синтезируется грибом на 6 сутки
культивирования на жидкой питательной среде в диапазоне рН 6,5-8,5 и
температуре 10-60°С; имеет молекулярную массу 38 кДа и специфично
связывается с гликопротеинами;
- лектин фитопатогена синтезируется на 3 сутки культивирования в
диапазоне рН 5,5-9,0 и температуре от 5 до 75°С; имеет молекулярную массу 30
кДа и взаимодействует с простыми углеводами
5. Обработка корней растений лектином фитопатогенного штамма
микромицета в концентрации 5 мкг/мл влияет на иммунный статус растений,
повышая их устойчивость к фузариозу.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи в научных изданиях, включенных в список Scopus и ВАК:
1. Мухаммадиев Р.С. Влияние поверхности эритроцитов АВО групп и ее
модификация на геммаглютинирующую активность лектинов Fusarium solani //
24
Р.С. Мухаммадиев, Р.С. Мухаммадиев, Т.В. Багаева / Ветеринарный врач. – 2018.
- № 1, С. 24-30.
2. Мухаммадиев Р.С. Углеводная специфичность поверхностных лектинов
грибов Fusarium solani // Р.С. Мухаммадиев, Р.С. Мухаммадиев, Т.В. Багаева /
Вестник биотехнологии. - 2017. - Т. 12, № 3. - С. 26-30.
3. Muhammadiev R.S. Lectins micromycetes genus Fusarium and the dynamics
of their formation / Muhammadiev R.S., Bagaeva T.V. // Research Journal of
Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. - 2015. -V.6 (6). -P.1769-1775.
4. Muhammadiev R.S. Screening and partial characterization of new lectins from
Fusarium sp. / Muhammadiev R.S., Bagaeva T.V. // Research Journal of
Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. - 2015. - V.6 (5). - P.1650-1657.
5. Багаева Т.В. Скрининг микромицетов по способности к синтезу лектинов //
Т.В. Багаева, Р.С. Мухаммадиев, Р.С. Мухаммадиев, Ф.К. Алимова / Микология
и фитопатология. - 2014. - Т. 48, № 2. - С. 107-111.
Другие статьи и тезисы в сборниках материалов конференций:
1.
Мухаммадиев Р.С. Внеклеточные лектины микромицетов // Р.С.
Мухаммадиев, Р.С. Мухаммадиев, Г.В. Надеева, Т.В. Багаева / Сборник трудов
IV Международной научной Интернет - конференции «Биотехнология. Взгляд в
будущее». Казань, март 24-25. - 2015. - С. 79- 82.
2.
Мухаммадиев Р. С. Фитопатогенные микромицеты как источник
физиологически активных лектинов // Р.С. Мухаммадиев, Р.А. Габитов, Р.С.
Мухаммадиев, Т.В. Багаева / Тезисы школа конференция с международным
участием конгресса студентов и аспирантов-биологов "Актуальные аспекты
современной микробиологии". Казань, КФУ. - 2011. - С.96-97.
3.
Мухаммадиев Р. С. Биоразнообразие грибов рода Fusarium на
территории Татарстана // Р.С. Мухаммадиев, Р.А. Габитов, Р.С. Мухаммадиев,
Т.В. Багаева / Сборник трудов 1 Международной Интернет-конференции
"Растения и микроорганизмы". Казань, КФУ. - 2011. - С.190-193.
4.
Мухаммадиев Р.С., Мухаммадиев Р.С., Багаева Т.В., Алимова Ф.К.,
Панкова А. В., Ибрагимов А.Н. Лектины грибов рода Trichoderma // Сборник
трудов III Международной научной – Интернет конференции «Биотехнология.
Взгляд в будущее». Казань, апрель 17-19. - 2012. - С. 157-159
E-mail адрес автора: tashir9891@mail.ru
Отзывы на автореферат просим высылать по адресу: 420008, Казань, ул.
Кремлевская, 18, главное здание Казанского федерального университета, отдел
аттестации научно-педагогических кадров, Ученому секретарю Диссертационного
совета Д 212.081.36 Абрамовой Зинаиде Ивановне, факс: (843) 238-76-01, e-mail:
ziabramova@mail.ru
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
3
Размер файла
1 014 Кб
Теги
лектинов, фитопатогенных, штаммов, fusarium, грибов, характеристика, сравнительный, solani, сапрофитные
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа