close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Сравнительная цитогенетика эмбриобласта трофобласта и внутриполостной жидкости бластоцисты человека

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
ЖИГАЛИНА ДАРЬЯ ИВАНОВНА
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ЦИТОГЕНЕТИКА ЭМБРИОБЛАСТА, ТРОФОБЛАСТА
И ВНУТРИПОЛОСТНОЙ ЖИДКОСТИ БЛАСТОЦИСТЫ ЧЕЛОВЕКА
03.02.07 – генетика
Автореферат диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Томск – 2018
Работа выполнена в Федеральном государственном автономном образовательном
учреждении высшего образования «Национальный исследовательский Томский
государственный университет», г. Томск и в Федеральном государственном
бюджетном научном учреждении «Томский национальный исследовательский
медицинский центр Российской академии наук», в Научно-исследовательском
институте медицинской генетики, г. Томск.
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор РАН,
Лебедев Игорь Николаевич
Официальные оппоненты:
Рыкова Елена Юрьевна, доктор биологических наук; Федеральное государственное
бюджетное учреждение науки «Институт химической биологии и фундаментальной
медицины Сибирского отделения Российской академии наук», старший научный
сотрудник лаборатории молекулярной медицины (г. Новосибирск);
Пендина Анна Андреевна, кандидат биологических наук; Федеральное
государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский
институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта», научный
сотрудник лаборатории пренатальной диагностики (г. Санкт-Петербург).
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное
генетический научный центр», г. Москва.
научное
учреждение
«Медико-
Защита состоится «____» __________ 201__ года в ___.___ часов на заседании
диссертационного совета Д 002.279.04 на базе Федерального государственного
бюджетного научного учреждения «Томский национальный исследовательский
медицинский центр Российской академии наук» по адресу г. Томск, Московский
тр., 3, Научно-исследовательский институт медицинской генетики Томского НИМЦ.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального
государственного бюджетного научного учреждения «Томский национальный
исследовательский медицинский центр Российской академии наук», адрес сайта
http://tnimc.ru/
Автореферат разослан «___» ________ 2018 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат биологических наук
Хитринская И.Ю.
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования. Изучение цитогенетики эмбрионального
развития человека на преимплантационном этапе представляется актуальным с точки
зрения фундаментальной биологии, а также имеет большое клиническое значение.
Репродуктивные потери у человека являются крайне частым событием. Одной из
причин, вносящих значительный вклад в этиологию ранней эмбриональной гибели,
являются хромосомные аномалии [Баранов В.С., Кузнецова Т.В, 2007; Lebedev I.N.,
2011]. Существуют данные, что частота летальных хромосомных мутаций
значительно выше, а спектр шире на преимплантационном этапе эмбрионального
развития по сравнению с дальнейшими стадиями внутриутробного периода
онтогенеза [Fragouli E. et al., 2013]. Показано, что значительная часть
регистрируемых числовых нарушений хромосом находится в мозаичном состоянии с
нормальными клетками [Baart E.B. et al., 2006; Gleicher N. et al., 2016; Orvieto R. et al.,
2016]. Именно поэтому, данные, полученные на основании биопсии клеток
трофэктодермы, следует с осторожностью экстраполировать на клетки эмбриобласта
[Evsikov S., Verlinsky Y., 1998; Johnson D.S. et al., 2010]. Хромосомный мозаицизм
увеличивает вероятность диагностической ошибки и снижает шансы на успех
процедуры экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) [Esfandiari N. et al., 2016].
Одной из проблем ЭКО является невозможность оценить наличие мозаичных клонов
у эмбрионов на стадии дробления или на стадии бластоцисты. Кроме того,
однозначно не установлено влияние мозаицизма в эмбриобласте (ЭБ) и
трофэктодерме (ТЭ) на вероятность имплантации бластоцисты и рождения ребенка.
Вопрос относительно наличия механизмов самокоррекции эмбрионального
кариотипа в ходе онтогенеза широко обсуждается в настоящее время [Bazrgar M.
et al., 2013]. Помимо этого, остается неясным соотношение различных
цитогенетических механизмов, приводящих к формированию мозаичного кариотипа.
В 2013 году появилась идея о проведении преимплантационного генетического
скрининга (ПГС) с использованием внеклеточной ДНК (внДНК) из внутриполостной
жидкости бластоцисты [Palini S. et al., 2013]. Использование внДНК, теоретически,
может решить проблему детекции хромосомного мозаицизма. Сопоставление
результатов молекулярного кариотипирования ДНК из тканей бластоцисты и ДНК из
внутриполостной жидкости может позволить проследить источник происхождения
хромосомных мутаций, а также определить цитогенетические и онтогенетические
механизмы их возникновения. Однако результаты первых, пока еще
немногочисленных исследований, посвященных молекулярному кариотипированию
внеклеточной ДНК, противоречивы [Gianaroli L. et al., 2014; Werner M.D. et al., 2014;
Tobler K.J. et al., 2015; Magli M.C. et al., 2016].
Степень научной разработанности темы исследования. В последние годы
опубликована серия работ, посвященных молекулярно-цитогенетическому анализу
внДНК из внутриполостной жидкости бластоцист человека [Poli M. et al., 2014;
Gianaroli L. et al., 2014; Werner M.D. et al., 2014; Tobler K.J. et al., 2015; Magli M.C.
3
et al., 2016; Kuznyetsov V. et al., 2018], в которых были представлены результаты
сопоставления молекулярных кариотипов бластомеров, клеток трофэктодермы,
целых бластоцист и внеклеточной ДНК. Однако ни в одном из них не было проведено
сравнение молекулярных кариотипов, реконструированных по анализу внеклеточной
ДНК внутриполостной жидкости бластоцисты и двух ее компартментов –
трофэктодермы и эмбриобласта. Кроме того, результаты проведенных до настоящего
времени исследований крайне противоречивы.
Цель исследования:
Установить и сопоставить разнообразие числовых хромосомных мутаций в
различных компартментах бластоцисты на преимплантационных этапах развития
человека (в трофэктодерме, эмбриобласте и внеклеточной ДНК из бластоцеля) в
условиях культивирования in vitro.
Задачи исследования:
1.
Определить спектр и частоту числовых хромосомных аномалий в клетках
трофэктодермы, эмбриобласта, и во внеклеточной ДНК из внутриполостной
жидкости бластоцист человека.
2.
Исследовать зависимость частоты числовых хромосомных аномалий в
различных компартментах бластоцисты от возраста женщины, стадии развития
и морфологических характеристик бластоцист.
3.
Оценить соответствие хромосомных наборов клеток трофэктодермы,
эмбриобласта и молекулярного кариотипа, реконструированного по анализу
внеклеточной ДНК.
4.
Установить частоту внутри- и межтканевого хромосомного мозаицизма на
стадии бластоцисты.
5.
Оценить частоту постзиготических ошибок сегрегации хромосом на основе
идентификации реципрокных анеуплоидий.
6.
Сравнить чувствительность и специфичность методов микроматричной
сравнительной геномной гибридизации и массового параллельного
секвенирования при анализе ДНК из внутриполостной жидкости бластоцисты,
эмбриобласта и трофэктодермы.
Научная новизна. В ходе настоящего исследования впервые проведено
сравнение молекулярных кариотипов клеток трофэктодермы, эмбриобласта и
молекулярного кариотипа, реконструированного по анализу внеклеточной ДНК,
содержащейся во внутриполостной жидкости бластоцисты. Полученные результаты
свидетельствуют о низкой степени соответствия молекулярных кариотипов
исследованных
компартментов
бластоцист.
Сравнительный
анализ
продемонстрировал недооценку частоты внутри- и межтканевого хромосомного
мозаицизма на стадии бластоцисты. С помощью молекулярного кариотипирования
внДНК во внутриполостной жидкости бластоцисты впервые оценен спектр
хромосомных аберраций, клетки с которыми наиболее вероятно элиминируются в
ходе преимплантационного развития. Таким образом, было продемонстрировано
наличие механизмов самокоррекции аномального эмбрионального кариотипа.
4
Благодаря регистрации феномена реципрокных анеуплоидий (наличие в бластоцисте
клеточных клонов с трисомией и с моносомией по одной и той же паре гомологичных
хромосом) впервые получена минимальная оценка частоты митотических ошибок,
ведущих к возникновению de novo числовых хромосомных аномалий в мозаичной
форме. Впервые установлено, что не менее чем 32 % мозаичных форм числовых
хромосомных аномалий возникает вследствие de novo митотических ошибок
сегрегации хромосом на преимплантационных этапах развития.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные расширяют
представления о спектре и частоте летальных хромосомных мутаций, а также об
уровне хромосомного мозаицизма в трофэктодерме и эмбриобласте бластоцист
человека. Результаты работы указывают на возможность дифференциации механизма
происхождения числовых хромосомных аберраций за счет регистрации феномена
реципрокных анеуплоидий. Впервые показано, что внеклеточная ДНК из полости
бластоцисты может быть использована как важный, дополнительный к стандартной
биопсии трофэктодермы, источник информации о кариотипе эмбриона при
проведении ПГС. Вместе с тем, использование внДНК в качестве единственного
биологического материала для преимплантационного генетического скрининга
анеуплоидий не представляется возможным.
Методология и методы исследования. Научная идея исследования
заключается в том, что дифференциальный анализ клеток эмбриобласта и
трофэктодермы, а также молекулярное кариотипирование внДНК из полости
бластоцисты позволяет получить новые уникальные данные о хромосомной
конституции эмбрионов на стадии бластоцисты, ранее не представленные в
литературе. Все бластоцисты были получены в ОГАУЗ «Областной перинатальный
центр» (г. Томск) и ООО «Красноярский центр репродуктивной медицины» в случаях
отказа пациентов от хранения бластоцист после завершения цикла ЭКО и подписания
пациентами информированного согласия. Работа проводилась с соблюдением
принципов
добровольности
и
конфиденциальности
в
соответствии
с
Федеральным законом «Об основах охраны здоровья граждан в Российской
Федерации» от 21.11.2011 № 323-ФЗ. Перед началом работы было получено
разрешение комитета по биоэтике Биологического института Национального
исследовательского Томского государственного университета.
Для выявления анеуплоидий в бластоцистах был использован метод
метафазной сравнительной геномной гибридизации (CGH), с помощью которого
были установлены молекулярные кариотипы 14 бластоцист, и метод микроматричной
сравнительной геномной гибридизации (aCGH), с помощью которого было
проанализировано 15 бластоцист. Данные экспериментальные исследования были
выполнены на базе Центра коллективного пользования научно-исследовательским
оборудованием и экспериментальным биологическим материалом «Медицинская
геномика» с использованием ресурсов биологической коллекции «Биобанк населения
Северной Евразии» (НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ, г. Томск). Оценка
уровня хромосомного мозаицизма была проведена с помощью метода массового
5
параллельного секвенирования (MPS) на базе ЦКП «Медицинская геномика» НИИ
Медицинской генетики Томского НИМЦ и на базе Университета г. Тарту (Эстония).
1.
2.
Положения, выносимые на защиту:
Молекулярный кариотип, реконструированный по анализу внеклеточной ДНК,
демонстрирует низкую степень соответствия хромосомным наборам клеток
трофэктодермы и эмбриобласта, составляющую 8 % и 9 %, соответственно. В
то же время, соответствие хромосомных наборов клеток эмбриобласта и
трофэктодермы достигает 41 %.
Формирование 32 % числовых хромосомных аберраций связано с de novo
постзиготическими ошибками сегрегации хромосом в преимплантационном
периоде развития человека, что подтверждается регистрацией феномена
реципрокных анеуплоидий.
Степень достоверности и апробация результатов. Высокая степень
достоверности данных, полученных в ходе выполнения настоящей работы,
обеспечивается использованием современных молекулярно-цитогенетических и
эмбриологических методов исследования, а также статистической обработкой
полученных результатов.
Апробация материалов диссертации. Материалы диссертационной работы
были представлены на VII Съезде Российского общества медицинских генетиков
(Санкт-Петербург, 2015); XXV Юбилейной конференции Российской ассоциации
репродукции человека (Сочи, 2015); Всероссийской молодежной научной
конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии»
(Томск, 2015); Международной конференции «Хромосома 2015» (Новосибирск,
2015); региональной школе для врачей акушеров-гинекологов, педиатров
«Профилактика и оптимизация пренатальной диагностики врожденных пороков
развития» (Томск, 2015); Всероссийской конференции «50 лет ВОГиС: успехи и
перспективы» (Москва, 2016); Международной научной конференции молодых
ученых «Актуальные проблемы медицинской генетики» (Томск, 2016); VII
Международной школе молодых ученых по молекулярной генетике «Геномика и
биология живых систем» (Звенигород, 2016); Международной конференции
«Хромосомы и митоз» (Новосибирск, 2016); Второй международной научнопрактической конференции «NGS в медицинской генетике» (Суздаль, 2017); II
Всероссийской конференции с международным участием «Высокопроизводительное
секвенирование в геномике» (Новосибирск, 2017); конференции молодых ученых
«День открытых дверей Томского НИМЦ: встреча у кардиологов» (Томск, 2017); XI
научной конференции «Генетика человека и патология» (Томск, 2017); научном
семинаре в Институте молекулярной и клеточной биологии Университета г. Тарту,
Эстония (Тарту, 2017); 34 Ежегодной конференции Европейского общества
репродукции человека и эмбриологии (Барселона, 2018); Конгрессе молодых ученых
«Актуальные вопросы фундаментальной и клинической медицины» (Томск, 2018).
6
Публикации. По теме исследования опубликовано 22 работы, в том числе 8
статей в журналах Перечня ВАК РФ, из них 3 статьи в журналах, реферируемых в
базе данных Web of Science, 1 статья в издании, входящем в базу данных Scopus, 4
статьи в журналах, индексируемых в базе данных РИНЦ. 16 публикаций – статьи в
сборниках и тезисы конференций.
Личный вклад автора. Основные результаты настоящего исследования
получены автором самостоятельно, либо в ходе совместной работы с коллегами из
лаборатории цитогенетики НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ и
Университета Тарту (г. Тарту, Эстония). Изучение литературы по теме диссертации,
экспериментальная работа, анализ, обобщение и статистическая обработка
результатов, написание диссертации выполнены лично автором. Диссертант
участвовал на всех этапах обсуждения полученных результатов и их опубликования.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 179 страницах
машинописного текста и включает введение, основные главы (обзор литературы,
материал и методы исследования, результаты и обсуждение), выводы, список
литературы и 3 приложения. Работа иллюстрирована 32 рисунками, 19 таблицами.
Библиография включает 165 литературных источников, из них 10 источников
отечественной и 155 источников зарубежной литературы.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалом исследования являлась 31 бластоциста человека на пятый день
после оплодотворения, полученная от 15 женщин в рамках циклов
экстракорпорального оплодотворения. Средний возраст матерей составил
32,25±5 года. Бластоцисты культивировались до 5-го дня после оплодотворения, а
затем подвергались криоконсервации. Морфология бластоцист и степень развития ЭБ
и ТЭ в соответствии с классификацией Гарднера варьировали от 2AB до 5BB
[Gardner D.K., Schoolcraft W.B., 1999]. Для каждой бластоцисты была проведена
аспирация внутриполостной жидкости в соответствии с процедурой, описанной ранее
другими исследователями [D’Alessandro A. et al., 2012; Gianaroli L. et al., 2014]. Объем
забираемой жидкости составлял 1 мкл. После аспирации внутриполостной жидкости
эмбриологом проводился забор ЭБ, а затем перенос в микропробирку оставшейся ТЭ.
Для 12 бластоцист данные микрохирургические процедуры были осуществлены с
помощью лазерной микрохирургической системы «ZILOS-tk» (Hamilton Thorne,
США). Для 19 бластоцист – с помощью микроманипулятора «OCTAX Laser Shot»
(MTG, Германия). Таким образом, объем сформированной выборки составил 93
образца (по 31 образцу ТЭ, ЭБ и внутриполостной жидкости).
В дальнейшем для всех образцов, позитивных и негативных контролей была
проведена полногеномная амплификация (ПГА). Для 15 бластоцист (45 образцов)
ПГА была проведена с помощью метода, основанного на ПЦР, с использованием
коммерческого набора PicoPlex (Rubicon Genomics, США). Продукты полногеномной
амплификации (42 образца) были исследованы методом aCGH с использованием
микрочипов SurePrint G3 Human CGH, 8×60K (Agilent Technologies, США) в
7
соответствии с протоколом производителя. Микрочипы анализировали с помощью
сканера SureScan (Agilent Technologies, США) и программного обеспечения
«CytoGenomics (v3)» (Agilent Technologies, США).
Для остальных 16 бластоцист (48 образцов) ПГА была проведена методом
амплификации со множественным замещением цепи (от англ. Multiple displacement
amplification, MDA) с помощью коммерческого набора REPLI-g Mini (Qiagen, США).
Продукты ПГА 14 бластоцист были проанализированы с помощью метода
сравнительной геномной гибридизации на метафазных пластинках (CGH). В качестве
контрольного образца использовали ДНК индивида мужского пола с нормальным
кариотипом (#5190-4370, Agilent Technologies, США). Гибридизация ДНК-зондов на
метафазные хромосомы проводилась в течение 72 часов при 37 С с 50-кратным
избытком C0t-1 ДНК (Agilent Technologies, США) в гибридизационной камере
«ThermoBrite» (Abbott Molecular, США). Детекцию гибридизационных сигналов
проводили с помощью люминесцентного микроскопа «AxioImager.Z2» (Сarl Zeiss,
Германия). Для анализа результатов метафазной CGH использовали программное
обеспечение «Isis» (Metasystems, Германия).
38 образцов после ПГА на основе ПЦР и 6 образцов после ПГА на основе MDA
были проанализированы с помощью массового параллельного секвенирования. В
соответствии с рекомендациями производителя был использован набор реактивов
PGS VeriSeq (Illumina, США) и секвенатор «MiSeq» (Illumina, США). Анализ
результатов проводился с помощью программного обеспечения «BlueFuse Multi v4.3»
(Illumina, США). Статистическую обработку полученных данных проводили с
помощью критерия χ-квадрат Пирсона, критерия Краскела-Уоллиса, U-критерия
Манна-Уитни, а также коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Показатели
считали статистически значимыми при p < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Полногеномная амплификация образцов ДНК из клеток эмбриобласта,
трофэктодермы и из внутриполостной жидкости бластоцист
Настоящее исследование было направлено на проведение сравнительного
молекулярного кариотипирования ДНК из клеток ЭБ и ТЭ и внДНК из
внутриполостной жидкости бластоцисты. В соответствии с поставленными задачами
была сформирована выборка образцов клеток ЭБ и ТЭ, а также жидкости из полости
31 бластоцисты. Эффективность ПГА определяли с учетом результата электрофореза
амплифицированной ДНК в агарозном геле, концентрации двухцепочечной ДНК в
образцах и возможности интерпретации результатов анализа образцов, полученных с
помощью методов CGH, aCGH и MPS. Эффективность ПГА методом MDA для
внДНК, ЭБ и ТЭ составила 75 %, 94 %, 100 %, соответственно. Эффективность ПГА
методом ПЦР для внДНК, ЭБ и ТЭ составила 80 %, 93 % и 100 %. Статистически
значимых отличий между числом образцов внДНК и ЭБ, успешно
амплифицированных разными методами, выявлено не было (p = 0,740 и
p = 0,963, соответственно). Эффективность ПГА для внеклеточной ДНК, полученная
8
в настоящем исследовании, близка к аналогичному показателю у других
исследовательских групп [Palini S. et al., 2013; Gianaroli L. et al., 2014; Tobler K.J. et
al., 2015; Zhang Y. et al., 2016]. Далее нами было проведено сравнение результатов
молекулярного кариотипирования, полученных для одних и тех же образцов двумя
разными методами – aCGH и MPS (Табл. 1).
Таблица 1 – Чувствительность и специфичность aCGH и MPS
Метод
CGH
MPS
Показатель
Чувствительность
Специфичность
Чувствительность
Специфичность
внДНК
0,64
0,98
0,93
0,90
ЭБ
0,86
0,98
0,67
0,99
ТЭ
0,54
1,00
0,95
0,95
По результатам aCGH и MPS частота полного совпадения молекулярных
кариотипов образцов ЭБ и ТЭ составила 91 % (10/11) и 82 % (9/11), соответственно, а
молекулярных кариотипов, реконструированных по анализу внДНК – 18 % (2/11).
Таким образом, в сравнении с aCGH при анализе внДНК метод MPS имеет более
высокую чувствительность, но уступает в специфичности.
Спектр хромосомных аномалий в образцах внутриполостной жидкости,
эмбриобласта и трофэктодермы
Числовые хромосомные аномалии были выявлены в эмбриобласте и
трофэктодерме 23 из 31 обследованной бластоцисты (Рис. 1). Таким образом, частота
эмбрионов с анеуплоидиями в нашем исследовании составила 74 %. Всего при
анализе 31 бластоцисты было выявлено 224 хромосомные аномалии. Трисомии,
моносомии, частичные три- и моносомии встречались с частотой 46 %, 37 %, 4 % и
2 %, соответственно. Были отмечены тетрасомии, нуллисомии и анеуплоидии
половых хромосом в 1 %, 2 % и 8 % бластоцист. Наиболее часто в обследованных
бластоцистах отмечались нарушения числа хромосом 13, 16, 17, 19, 20, 21, 22, X.
Спектр числовых хромосомных нарушений в клетках ЭБ и ТЭ представлен
преимущественно трисомиями и моносомиями аутосом, частота которых составила
48 % и 35 % в эмбриобласте и 47 % и 32 % в трофэктодерме. Анализ молекулярного
кариотипа, реконструированного по исследованию внДНК, показал, что частота
трисомий составила 42 %, а моносомий 43 %.
Статистически значимых отличий между показателями соотношения числа
трисомий и моносомий при сравнении внДНК (35:36) и ЭБ (32:23) (р = 0,322), внДНК
(35:36) и ТЭ (35:24) (р = 0,254), а также между этим соотношением в ЭБ (32:23) и ТЭ
(35:24) (р = 0,902) выявлено не было. Таким образом, не было зафиксировано
преимущественной локализации клеток с определенным вариантом числового
хромосомного нарушения в одном из компартментов бластоцист.
9
Рисунок 1 – Распределение хромосомных аномалий между эмбриобластом,
трофэктодермой и внутриполостной жидкостью 31 бластоцисты
Примечание:
10
Влияние хромосомных аномалий на морфологические характеристики
бластоцист
В настоящей работе было показано, что возраст женщины не влияет на степень
зрелости бластоцист 5-го дня развития (р = 0,4525), а также на число анеуплоидий,
регистрируемых в ЭБ (p = 0,1843) и ТЭ (p = 0,7788). Однако была выявлена
корреляция между возрастом женщины и числом анеуплоидий во внДНК (rs = 0,6535;
p = 0,0009). Положительная связь между числом анеуплоидий, обнаруженных при
анализе внДНК, и возрастом женщины может быть объяснена тем, что в тканях
эмбрионов при повышении возраста женщины увеличивается число хромосомных
аномалий, но при этом происходит более интенсивная коррекция эмбрионального
кариотипа за счет элиминации клеток с анеуплоидиями.
Анализ связи между числом хромосомных аберраций, обнаруженных во
внутриполостной жидкости, эмбриобласте, трофэктодерме и бластоцисте в целом, и
морфологическими характеристиками бластоцисты был проведен на основе данных о
качестве бластоцист, представленных эмбриологом в соответствии с классификацией
Гарднера [Gardner D.K., Schoolcraft W.B., 1999]. Нами не было обнаружено
статистически значимой связи между числом хромосомных аномалий в бластоцисте и
степенью её зрелости (группы 2-5, по классификации Гарднера) (р = 0,089). Однако,
были выявлены статистически значимые различия между числом хромосомных
аберраций отдельно в эмбриобласте и отдельно в трофэктодерме в группах
бластоцист, дифференцированных по степени зрелости. В более зрелых бластоцистах
(группы 4-5, по классификации Гарднера) в обоих обследованных зародышевых и
внезародышевых листках отмечалось меньшее количество анеуплоидий (р = 0,0141 и
р = 0,0436, соответственно).
В данной работе не было выявлено статистически значимых различий между
числом анеуплоидий в ЭБ (р = 0,5992) и ТЭ (р = 0,5934) бластоцист с разными
характеристиками эмбриобласта (группы «А» или «B», по классификации Гарднера).
При этом было показано, что статистически значимо группы отличаются по числу
хромосомных аномалий во внДНК (р = 0,0352). Такие результаты могут указывать на
то, что в бластоцистах с более качественной морфологией внутренней клеточной
массы интенсивнее происходят процессы элиминации анеуплоидных клеток.
Полученные результаты поддерживают гипотезу о наличии механизмов
самокоррекции эмбрионального кариотипа в процессе преимплантационного
развития [Barbash-Hazan S. et al., 2009; Bazrgar M. et al., 2013].
Оценка частоты и спектра реципрокных анеуплоидий
Сравнительное кариотипирование трех компартментов каждой бластоцисты
позволило обнаружить в настоящем исследовании феномен реципрокных
ануеплоидий, т.е. таких числовых хромосомных нарушений, возникновение которых
является взаимозависимым событием и происходит в результате одной митотической
ошибки сегрегации хромосом (Рис. 2). О наличии у эмбриона реципрокных
анеуплоидий (РА) можно говорить в том случае, когда присутствуют клеточные
11
клоны с трисомией и с моносомией по одной и той же паре гомологичных хромосом.
Поскольку при коррекции трисомной зиготы, отставание хромосом приводит к
формированию двух клеточных клонов – трисомного и с нормальной хромосомной
конституцией, а нерасхождение – к формированию дисомного и тетрасомного
клонов, то становится более вероятным то, что РА с сочетанием три- и моносомии
могут сформироваться только в ходе одного события митотического нерасхождения
хромосом в клетке с изначально нормальным кариотипом.
Рисунок 2 – Механизм формирования реципрокной анеуплоидии и пример ее
детекции с помощью массового паралелльного секвенирования ДНК из разных
компартментов бластоцисты (моносомия 9 во внутриполостной жидкости и
трисомия 9 в трофэктодерме и эмбриобласте). Процентами обозначен уровень
мозаичного клеточного клона с реципрокной анеуплоидией.
РА были обнаружены в 39 % (12/31) бластоцист. По результатам сравнительного
анализа тканей и внДНК из внутриполостной жидкости бластоцист 67 из 209 (32 %)
анеуплоидий были отнесены к реципрокным. Таким образом, возникновение 32 %
мозаичных числовых хромосомных аберраций связано с de novo постзиготическими
ошибками сегрегации хромосом в преимплантационном периоде развития человека.
Наиболее часто к формированию РА приводило нарушение числа хромосом 16,
17, 19, 21, 22. В настоящей работе впервые с помощью регистрации феномена РА
было продемонстрировано, что 88 % (14/16) анеуплоидий с вовлечением
12
хромосомы 16 и 67 % (6/9) нарушений числа хромосомы 22, традиционно
рассматриваемых как результат мейотических ошибок сегрегации хромосом, имеют
постзиготическое митотическое происхождение. Таким образом, оценка частоты
реципрокных анеуплоидий отражает интенсивность постзиготических de novo
ошибок сегрегации хромосом, лежащих, в том числе, в основе возникновения
хромосомного мозаицизма.
Хромосомный мозаицизм у эмбрионов человека на стадии бластоцисты
В рамках исследования с помощью метода MPS нами был оценен уровень
хромосомного мозаицизма в бластоцистах. Частота внутритканевого хромосомного
мозаицизма в эмбриобласте составила 36 % (5/14), а в трофэктодерме – 29 % (4/14). В
14 % (2/14) бластоцист были отмечены различия по хромосомной конституции
трофэктодермы и эмбриобласта, то есть межтканевой хромосомный мозаицизм.
Анализ внДНК выявил хромосомный мозаицизм в 57 % (8/14) бластоцист, что
позволило на 21 % повысить вероятность детекции хромосомного мозаицизма
относительно ЭБ и на 28 % – относительно ТЭ. Вероятно, на более ранних этапах
развития эмбриона (например, стадия морулы) клетки с этими хромосомными
аномалиями подверглись апоптозу и были полностью элиминированы из тканей к
стадии бластоцисты. В результате, анеуплоидии были обнаружены нами во
внутриполостной жидкости, но не выявлялись при анализе ЭБ и ТЭ. Примечательно,
что уровень хромосомного мозаицизма, выявленный при анализе внДНК (57 %),
близок к предсказанному ранее в математической модели для стадии 8-клеточной
морулы (60 %) [Los F.J. et al., 2004], а также соответствует результатам молекулярноцитогенетического анализа эмбрионов на этапе дробления (49-58 %) [Bielanska M. et
al., 2002]. Таким образом, полученные результаты поддерживают гипотезу о
самокоррекции эмбрионального кариотипа в ходе развития («trisomy rescue»),
проявляющейся появлением у эмбриона с изначально анеуплоидным хромосомным
набором в зиготе мозаичных клеточных клонов с нормальным кариотипом,
приобретающих селективное преимущество.
Сравнение молекулярных кариотипов эмбриобласта, трофэктодермы и
молекулярного кариотипа, реконструированного по анализу внеклеточной ДНК
из внутриполостной жидкости бластоцисты
Нами было проведено сравнение молекулярных кариотипов клеток ЭБ и ТЭ и
внДНК из внутриполостной жидкости, при этом трисомию и моносомию по одной и
той же паре гомологичных хромосом (РА) в разных образцах учитывали, как одну и
ту же аберрацию (Табл. 2). Совпадение молекулярных кариотипов считалось
частичным при обнаружении хотя бы одной общей для двух образцов анеуплоидии
на фоне других дополнительно присутствующих хромосомных аномалий. Было
показано, что ТЭ, в отличие от внДНК, более точно отражает молекулярный
кариотип ЭБ (χ2 = 6,230; p = 0,013).
13
Чувствительность и специфичность определения наличия или отсутствия
анеуплоидий во внДНК и ТЭ относительно ЭБ представлены в таблице 3.
Таблица 2 – Сравнение молекулярных кариотипов в образцах внутриполостной
жидкости, эмбриобласта и трофэктодермы
Полное
совпадение
внДНК/ЭБ 9,1 % (2/22)
внДНК/ТЭ 8,3 % (2/24)
ЭБ/ТЭ
40,7 % (11/27)
Частичное
совпадение
50,0 % (11/22)
54,2 % (13/24)
37,0 % (10/27)
Полное
несоответствие
40,9 % (9/22)
37,5 % (9/24)
22,2 % (6/27)
Таблица 3 – Чувствительность и специфичность определения наличия или отсутствия
анеуплоидий во внутриполостной жидкости и трофэктодерме относительно
эмбриобласта
Образец
Чувствительность
Специфичность
внДНК / ЭБ внДНК / ТЭ
0,50
0,71
0,50
0,71
ТЭ / ЭБ
0,88
0,93
Полученные значения для ТЭ существенно выше, чем аналогичные показатели
для внДНК. Таким образом, биопсия ТЭ более эффективно позволяет определять
эуплоидный/анеуплоидный статус ЭБ по сравнению с внДНК.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Результаты настоящей работы в значительной степени поддерживают идею о
наличии механизмов самокоррекции эмбрионального кариотипа за счет элиминации
анеуплоидных клеток из тканей бластоцисты [Bazrgar M. et al., 2013]. Так, нами были
обнаружены бластоцисты с эуплоидным кариотипом в трофэктодерме и
эмбриобласте на фоне выявления хромосомных аномалий при анализе внеклеточной
ДНК. Кроме того, было показано, что более качественные эмбрионы по
морфологическим характеристикам эмбриобласта содержат больше аномалий во
внутриполостной жидкости, что, вероятно, указывает на более эффективную
элиминацию анеуплоидных клеток. Развитие эмбриона сопровождается гибелью
клеток путем апоптоза или аутофагии. ДНК из погибших клеток попадает во
внутриполостную жидкость бластоцисты, в результате чего формируется пул
внеклеточной ДНК [Rule K.N. et al., 2017]. Молекулярное кариотипирование
внеклеточной ДНК в настоящем исследовании показало, что бластоцисты с
нормальным кариотипом, либо с низким уровнем хромосомного мозаицизма, имели,
по всей видимости, значительно больше хромосомных аберраций на более ранних
этапах своего развития.
14
В данной работе было показано, что хромосомная конституция клеток
трофэктодермы,
эмбриобласта,
а
также
молекулярный
кариотип,
реконструированный по анализу внеклеточной ДНК из полости бластоцисты,
характеризуются высокой вариабельностью. В бластоцистах человека был отмечен
широкий спектр хромосомных аберраций. Их частота составила 74 % (23 из 31
бластоцисты). Преимущественно хромосомные аномалии были представлены
трисомиями (46 %) и моносомиями (37 %) аутосом, при этом наиболее часто
выявлялись анеуплоидии хромосом из групп E, F и G. Полученные результаты для
целых бластоцист согласуются с представленными в литературе данными
[Franasiak J.M. et al., 2014]. Однако для внеклеточной ДНК из внутриполостной
жидкости разнообразие хромосомных анеуплоидий было оценено впервые. Кроме
того, в настоящем исследовании были получены уникальные данные о частоте и
спектре анеуплоидий в эмбриобласте, который недоступен для цитогенетического
анализа в рамках процедур преимплантационной генетической диагностики.
Благодаря возможности сравнения молекулярных кариотипов трех
компартментов одной бластоцисты, нами был зарегистрирован феномен
реципрокных анеуплоидий, т.е. наличие в бластоцисте клеточных клонов с
трисомией и с моносомией по одной и той же паре гомологичных хромосом.
Результаты ряда работ подтверждают существование феномена реципрокных
анеуплоидий у эмбрионов на этапе дробления и стадии бластоцисты [Vanneste E.
et al., 2009; Fragouli E. et al., 2011; Chow J.F. et al., 2014]. Регистрация реципрокных
анеуплоидий позволила впервые в настоящем исследовании оценить вклад
митотических de novo ошибок сегрегации хромосом в генерацию хромосомного
мозаицизма на преимплантационных этапах развития. Установлено, что
формирование 32 % мозаичных форм числовых хромосомных аберраций связано с de
novo постзиготическими ошибками сегрегации хромосом. В частности, трисомии по
хромосомам 16 и 22 в 88 % и 67 % случаев, соответственно, возникают вследствие
хромосомного нерасхождения на постзиготических этапах развития, хотя ранее
считалось, что они формируются только в результате мейотических нарушений
сегрегации хромосом [Hassold T., Hunt P., 2001]. Таким образом, было показано, что
молекулярное кариотипирование внеклеточной ДНК может быть информативным
для дифференциации цитогенетических механизмов формирования анеуплоидий. С
практической точки зрения, регистрация реципрокных анеуплоидий по анализу
внДНК (как дополнительного источника информации о кариотипе эмбриона) может,
вероятно, способствовать снижению рисков, связанных с последствиями коррекции
хромосомных мутаций мейотического происхождения у эмбрионов с мозаичным
кариотипом (нарушения геномного импринтинга и гомозиготизация рецессивных
мутаций) при принятии решения о переносе таких эмбрионов в рамках циклов ЭКО.
Проведенное исследование имеет ряд ограничений. Так, все изученные
бластоцисты были получены in vitro в циклах ЭКО. На модельных животных было
показано, что у эмбрионов на преимплантационном этапе развития, полученных в
рамках циклов ЭКО in vitro, частота хромосомных аномалий выше, как правило, чем
15
у эмбрионов в естественных циклах in vivo [Rambags B.P. et al., 2005; Coppola G. et al.,
2007; Tšuiko O. et al., 2017]. Таким образом, есть основания полагать, что в
естественных циклах частота анеуплоидий и хромосомного мозаицизма у бластоцист
человека может быть ниже, чем было показано в проведенном нами исследовании.
Методические ограничения связаны с тем, что методы сCGH и aCGH позволяют
обнаружить анеуплоидии в случае, если они представлены хотя бы в 30-50 % клеток,
а метод MPS – в 20 % клеток [Mamas T. et al., 2012]. В связи с этим, часть
хромосомных аберраций, представленных в небольшом проценте клеток, могла быть
не выявлена. Принцип метода CGH не позволяет детектировать анеуплоидию, в
случае, если в анализируемом образце представлены эквивалентные по частоте
клеточные клоны с трисомией и моносомией по одной и той же паре гомологичных
хромосом. Таким образом, полученная нами оценка частоты реципрокных
анеуплоидий может быть несколько занижена. Тем не менее, полученные результаты
по разнообразию и частоте хромосомных аномалий, а также по их распределению
между различными компартментами бластоцисты представляют интерес для
понимания механизмов возникновения, распределения и селекции клеток с
анеуплоидиями на ранних этапах онтогенеза человека.
1.
2.
3.
4.
ВЫВОДЫ
Хромосомные мутации в различных компартментах бластоцисты представлены
преимущественно трисомиями и моносомиями аутосом, частота которых
составляет 48 % и 35 % в эмбриобласте, 47 % и 32 % в трофэктодерме, 42% и 43%
во внеклеточной ДНК. Статистически значимых отличий между показателями
соотношения числа трисомий и моносомий в трофэктодерме, эмбриобласте и
внутриполостной жидкости бластоцисты не обнаружено.
Возраст женщины оказывает влияние на частоту анеуплоидий, детектируемых при
молекулярном кариотипировании внеклеточной ДНК (rs = 0,6535; p = 0,0009), но
не на уровень числовых хромосомных нарушений в трофэктодерме и эмбриобласте
бластоцист 5 дня развития.
Частота числовых хромосомных аномалий, выявляемых при молекулярном
кариотипировании внеклеточной ДНК, статистически значимо выше в
бластоцистах с хорошей морфологией эмбриобласта, по сравнению с
бластоцистами с нарушениями формирования внутренней клеточной массы
(р = 0,0352), что отражает процессы элиминации анеуплоидных клеток в ходе
ранних этапов преимплантационного развития.
Хромосомные наборы клеток трофэктодермы, эмбриобласта, а также
молекулярный кариотип, реконструированный по анализу внеклеточной ДНК из
полости бластоцисты, характеризуются высокой вариабельностью. Максимальная
степень соответствия молекулярных кариотипов отмечается в паре
«трофэктодерма – эмбриобласт», составляя 41 %, снижаясь до 9 % и 8 % в парах
«эмбриобласт – внеклеточная ДНК» и «трофэктодерма – внеклеточная ДНК»,
соответственно.
16
5. Частота хромосомного мозаицизма на стадии бластоциты, определенная по
анализу клеток трофэктодермы и эмбриобласта, составляет 36 %. Молекулярное
кариотипирование внеклеточной ДНК позволяет выявить дополнительные
хромосомные аномалии, присутствовавшие в эмбрионе на более ранних этапах
преимплантационного развития, и повысить вероятность выявления хромосомного
мозаицизма до 57 %.
6. Установлено, что 29 % и 36 % бластоцист имеют мозаичную хромосомную
конституцию в трофэктодерме и эмбриобласте, соответственно, при этом 14 %
бластоцист имеют отличия по хромосомному набору исследованных
внезародышевых и зародышевых листков.
7. На основании регистрации феномена реципрокных анеуплоидий впервые
установлено, что 32 % мозаичных форм анеуплоидий сформировались de novo в
результате
постзиготических
ошибок
сегрегации
хромосом
на
преимплантационном этапе эмбрионального развития человека.
8. Метод массового параллельного секвенирования при анализе внеклеточной ДНК
из внутриполостной жидкости бластоцисты обладает большей чувствительностью,
по сравнению с микроматричной сравнительной геномной гибридизацией (0,93 и
0,64, соответственно), но уступает ей в специфичности (0,90 и 0,98,
соответственно).
1.
2.
3.
4.
5.
СПИСОК РАБОТ,
ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК:
Скрябин Н.А., Лебедев И.Н., Артюхова В.Г., Жигалина Д.И., Степанов И.А.,
Кривощекова Г.В., Светлаков А.В. Молекулярное кариотипирование внеклеточной
ДНК из жидкости бластоцеля как основа неинвазивного преимплантационного
генетического скрининга анеуплоидий // Генетика. – 2015. – Т. 51. – №. 11. –
C. 1301–1307.
Жигалина Д.И., Скрябин Н.А., Артюхова В.Г., Светлаков А.В., Лебедев И.Н.
Преимплантационная генетическая диагностика на основе бластоцентеза:
проблемы и перспективы // Генетика. – 2016. – Т. 52. – №. 1. – C. 5–13.
Tšuiko O., Zhigalina D.I., Jatsenko T., Skryabin N.A., Kanbekova O.R., Artyukhova
V.G., Svetlakov A.V., Teearu K., Trošin A, Salumets А., Kurg A., Lebedev I.N. The
karyotype of the blastocoel fluid demonstrates low concordance with both trophectoderm
and inner cell mass // Fertility and Sterility. – 2018. – V. 109. – №. 6. – P. 1127–1134e1.
Жигалина Д.И., Скрябин Н.А., Артюхова В.Г., Светлаков А.В., Лебедев И.Н.
Молекулярное кариотипирование внеклеточной ДНК из внутриполостной
жидкости бластоцисты человека, клеток эмбриобласта и трофэктодермы //
Цитология. – 2016. – Т. 58. – №. 6. – С. 488–492.
Жигалина Д.И., Скрябин Н.А., Лебедев И.Н. Неинвазивная ДНК-диагностика в
репродуктивной медицине // Медицинская генетика. – 2015. – №. 10. – C. 3–13.
17
6. Скрябин Н.А., Жигалина Д.И., Артюхова В.Г., Светлаков А.В., Лебедев И.Н.
Информативность бластоцентеза в оценке хромосомного мозаицизма на стадии
бластоцисты // Медицинская генетика. – 2016. – Т. 15. – №. 5. – С. 35-37.
7. Жигалина Д.И., Скрябин Н.А., Артюхова В.Г., Светлаков А.В., Лебедев И.Н.
Распространение реципрокных анеуплоидий на преимплантационном этапе
развития на основе данных молекулярного кариотипирования внеклеточной ДНК
бластоцисты // Медицинская генетика. – 2016. – Т. 15. – №. 4. – С. 39-42.
8. Жигалина Д.И., Скрябин Н.А., Канбекова О.Р., Артюхова В.Г., Светлаков А.В.,
Лебедев И.Н. Сравнительная цитогенетика эмбриобласта, трофэктодермы и
внутриполостной жидкости бластоцисты человека // Медицинская генетика. –
2018. – Т. 17. – №. 2. – С. 46–52.
Статьи в сборниках и материалах конференций:
9. Скрябин Н.А., Жигалина Д.И., Кашеварова А.А., Лебедев И.Н. Возможности и
перспективы сравнительной геномной гибридизации на микрочипах в клинической
цитогенетике и репродуктивной медицине // Медицинская генетика. Тезисы VII
Съезда Российского общества медицинских генетиков г. Санкт-Петербург 19-23
мая, 2015 г. – 2015. – №. 4. – С. 14.
10. Скрябин Н.А., Жигалина Д.И., Кашеварова А.А., Лебедев И.Н. Возможности и
перспективы ДНК-микрочипов в клинической практике // Молекулярнобиологические технологии в медицинской практике / Под ред. чл. корр. РАЕН А.Б.
Масленникова. – Вып. 22. – Новосибирск: Академиздат, 2015. – 2015. – С. 113–117.
11. Жигалина Д.И., Скрябин Н.А., Лебедев И.Н. Технологии молекулярногенетического анализа на основе внеклеточных нуклеиновых кислот в
пренатальной и преимплантационной генетической диагностике // Молекулярнобиологические технологии в медицинской практике / Под ред. чл. корр. РАЕН А.Б.
Масленникова. – Вып. 22. – Новосибирск: Академиздат, 2015. – 2015. – С. 118–136.
12. Скрябин Н.А., Жигалина Д.И., Артюхова В.Г., Светлаков А.В., Лебедев И.Н.
Перспективы бластоцентеза как малоинвазивного метода преимплантационного
генетического скрининга // Материалы XXV Юбилейной конференции РАРЧ
«Репродуктивные технологии сегодня и завтра» 9-12 сентября 2015 г. Сочи. – 2015.
– С. 86–87.
13. Жигалина Д.И., Скрябин Н.А., Артюхова В.Г. Сравнительное молекулярное
кариотипирование геномной ДНК из внутриполостной жидкости и тканей
бластоцисты // Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии.
Материалы II Всероссийской молодежной научной конференции (Томск, 24–26
ноября 2015 г.). Томск: Издательский Дом ТГУ. – 2015. – С. 94–95.
14. Жигалина Д.И., Скрябин Н.А., Артюхова В.Г., Светлаков А.В., Лебедев И.Н.
Сравнительное молекулярное кариотипирование клеток трофобласта, внутренней
клеточной массы и ДНК из внутриполостной жидкости бластоцисты человека //
Материалы международной конференции «Хромосома 2015». – 2015. – С. 96–97.
15. Жигалина Д.И., Скрябин Н.А., Канбекова О.Р., Артюхова В.Г., Лебедев И.Н.
Внутриполостная жидкость бластоцисты человека как новый источник
18
информации о кариотипе эмбриона // Тезисы VII Международной школы молодых
ученых по молекулярной генетике «Геномика и биология живых систем», 14-18
ноября 2016 г., Москва-Звенигород. – 2016. – C. 31.
16. Жигалина Д.И., Скрябин Н.А., Артюхова В.Г., Светлаков А.В., Лебедев И.Н.
Неоднозначность результатов сравнительного молекулярного кариотипирования
ДНК из внутриполостной жидкости бластоцисты, трофэктодермы и внутренней
клеточной массы // Сборник тезисов Всероссийской конференции 50 лет ВОГиС:
успехи и перспективы, Москва, 8-10 ноября 2016 г. – 2016. – C. 158.
17. Скрябин Н.А., Жигалина Д.И., Лебедев И.Н. Проблемы и перспективы
преимплантационной генетической диагностики хромосомных болезней //
Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике / Под ред. чл.
корр. РАЕН А.Б. Масленникова. – Вып. 24. – Новосибирск: Академиздат. – 262 с. –
2016. – С. 114–119.
18. Жигалина Д.И., Скрябин Н.А., Канбекова О.Р., Артюхова В.Г., Лебедев И.Н.
Перспективы использования секвенирования нового поколения для анализа
внутриполостной жидкости бластоцисты при проведении ПГД // Тезисы Второй
международной научно-практической конференции «NGS в медицинской
генетике», Суздаль, 26-28 апреля 2017 г. – 2017. – С. 8.
19. Жигалина Д.И., Скрябин Н.А., Канбекова О.Р., Артюхова В.Г., Лебедев И.Н.
Сравнение эффективности методов NGS и array CGH при детекции хромосомных
аберраций у эмбрионов человека на стадии бластоцисты // Acta Naturae.
Спецвыпуск. – 2017. – Т. 9. – №. 1. – C. 86.
20. Жигалина Д.И., Скрябин Н.А., Канбекова О.Р., Степанов И.А., Артюхова В.Г.,
Светлаков А.В., Лебедев И.Н. Сравнительная цитогенетика трофобласта и
внутренней клеточной массы на основе данных молекулярного кариотипирования
внеклеточной ДНК в полости бластоцисты // Генетика человека и патология:
сборник научных трудов / под. ред. В.А. Степанова. – Вып. 11. – Томск:
Литературное бюро. – 2017. – С. 183–184.
21. Жигалина Д.И., Скрябин Н.А. На пути к неинвазивной преимплантационной
генетической диагностике // Современные молекулярно-генетические технологии в
медицине: аннотированный указатель научной литературы за 2014 и 2015 гг. /
ФАНО России, Сиб. Отд-ние медицинских наук; сост. И.Н. Лебедев Новосибирск: Академиздат, 2015. – C. 18–28.
22. Tšuiko O., Zhigalina D., Jatsenko T., Skryabin N., Kanbekova O., Artyukhova V.,
Svetlakov A., Teeru K., Trošin A., Salumets A., Kurg A., Lebedev I. The karyotype of
the blastocoel fluid demonstrate low concordance with both trophectoderm and inner cell
mass // Human Reproduction. – 2018. – V. 33. – Suppl. 1. – P. i426.
19
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
внДНК – внеклеточная ДНК
ПГА – полногеномная амплификация
ПГС – преимплантационный
генетический скрининг
ПЦР – полимеразная цепная реакция
РА – реципрокные анеуплоидии
ТЭ – трофэктодерма
ЭБ – эмбриобласт
ЭКО – экстракорпоральное
оплодотворение
aCGH – от англ. array-based
Comparative Genomic Hybridization,
матричная сравнительная геномная
гибридизация на микрочипах
cCGH – от англ. Conventional
Comparative Genomic Hybridization,
метафазная сравнительная геномная
гибридизация
MDA – от англ. Multiple Displacement
Amplification, амплификация
со множественным замещением цепи
MPS – от англ. Massive Parallel
Sequencing, массовое параллельное
секвенирование
Просьба высылать отзывы на автореферат по адресу:
НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ
634050, г. Томск, ул. Набережная реки Ушайки, 10
Ученому секретарю диссертационного совета Д 002.279.04
канд. биол. наук Хитринской И.Ю.
e-mail: khitrinskaya@tnimc.ru
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа