close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Структурная вариабельность генома при болезнях сердечно-сосудистого континуума

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Слепцов Алексей Анатольевич
Структурная вариабельность генома
при болезнях сердечно-сосудистого континуума
03.02.07 – генетика
Автореферат диссертации на соискание
ученой степени кандидата медицинских наук
Томск – 2018
2
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении
«Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук» (Томский НИМЦ), в Научно-исследовательском институте медицинской
генетики, г. Томск.
Научный руководитель:
академик РАН, доктор медицинских наук, профессор
Пузырев Валерий Павлович
Официальные оппоненты:
Полоников Алексей Валерьевич, доктор медицинских наук, профессор, директор
научно-исследовательского института генетической и молекулярной эпидемиологии
Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего
образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства
здравоохранения Российской Федерации (г. Курск);
Гусакова Светлана Валерьевна, доктор медицинских наук, заведующая кафедрой
биофизики и функциональной диагностики Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (г. Томск).
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук» (г. Новосибирск).
Защита состоится «____» __________ 2018 года в «___:___» часов на заседании диссертационного совета Д 002.279.04 на базе Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Томский национальный исследовательский медицинский
центр Российской академии наук» по адресу г. Томск, Московский тр., 3, Научноисследовательский институт медицинской генетики Томского НИМЦ.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук», адрес сайта http://tnimc.ru/
Автореферат разослан «____» __________ 2018 года
Ученый секретарь
диссертационного совета,
кандидат биологических наук
Хитринская И. Ю.
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования
Исследование природы феномена сочетания болезней имеет фундаментальное
значение для развития медицины. Причин этому несколько: стойкая тенденция увеличения числа лиц со множеством заболеваний, обусловленная увеличением продолжительности жизни; сочетание широко распространённых многофакторных заболеваний (МФЗ) изменяет их клиническую картину и течение, характер и тяжесть
осложнений, а также затрудняет лечебно-диагностический процесс. Предполагается,
что важным условием для развития сочетания заболеваний являются общие паттерны
патогенетических событий и процессов, существующие между заболеваниями.
Широкое распространение среди многофакторных заболеваний в России и мире
имеют болезни системы кровообращения, главным образом, ишемическая болезнь
сердца (ИБС) (ВОЗ, 2015; Росстат, 2015). Известно, что ИБС без сопутствующей патологии или «униморбидная ИБС» встречается в 15-20%, а, в большей степени, она
сочетается с артериальной гипертензией (АГ), дислипидемией (ДЛЕ) и/или сахарным
диабетом 2 типа (СД2; Khot U.N. et al., 2003; Шальнова С.А. et al., 2016). Исследователями Dzau V. J. и Braunwald E. (1991) предложена концепция «сердечнососудистого континуума» (ССК), согласно которой «цепь событий, приводящая к
сердечной недостаточности и летальному исходу, обусловлена сочетанием нескольких сердечно-сосудистых факторов риска и заболеваний (ИБС, АГ, ДЛЕ и СД2)»
(Dzau V. J., Braunwald E., 1991; Dzau V.J. et al., 2006). Концепция ССК выдвинута после ряда клинических и эпидемиологических исследований. Автор концепции Dzau V.
J. (2006) заключает, что изучение генетических маркеров для оценки риска, ранней
диагностики и прогноза ССК, имеет важное значение (Dzau V.J. et al., 2006).
Несмотря на то обстоятельство, что феномен сочетания болезней имеет клиническую доказательную базу, «классические» исследования, изучающие отдельные заболевания, по-прежнему, превалируют (Jansen H. et al., 2015; Au Yeung S.L., Lam H.S.,
Schooling C.M., 2017; Murphy A. et al., 2018). Имеется существенный пробел в изучении генетической компоненты ССК, поскольку работы, проведенные в данном
направлении, единичны и, в некоторой степени, имеют неоднозначные результаты
(Wu C. et al., 2012; Gottesman O. et al., 2012; Rankinen T. et al., 2015).
Вариабельность генома человека также представлена и структурными вариациями, которые, наряду с однонуклеотидными полиморфными вариантами (SNP), могут
вносить определенный вклад в риск развития заболеваний (Sachidanandam R. et al.,
2001; International T. et al., 2003; Sneddon T.P., Church D.M., 2012). Только за последнее десятилетие, возникновение таких технологий, как массовое параллельное секвенирование и матричная сравнительная геномная гибридизация (array comparative
genome hybridization, сокр. aCGH), позволило оценить спектр и характер структурных
вариаций у фенотипически здоровых индивидов (Sneddon T.P., Church D.M., 2012).
Вариации по числу копий участков ДНК (copy number variation, CNV) представляют
собой большую группу структурных вариаций, имеющих широкий диапазон размер-
4
ности (от одной тысячи пар оснований до одного миллиона), которые затрагивают
большое количество генов и/или регуляторных регионов, что, в итоге, может обусловливать целый ряд фенотипических проявлений. Предполагается, что данный вид
генетической вариабельности имеет важное значение для формирования предрасположенности многофакторных заболеваний, а также является потенциальным источником «недостающей наследуемости» (Almal S.H., Padh H., 2012).
Таким образом, оценка генетической компоненты заболеваний сердечнососудистого континуума по SNP и CNV-маркерам представляет существенный интерес. Выявление молекулярно-генетических механизмов, лежащих в основе заболеваний ССК, в значительной степени определит разработку новых стратегий профилактики и лечения данных патологий.
Степень разработанности темы исследования:
Существует большое количество генетико-эпидемиологических исследований в
отношении заболеваний ССК, однако в данных работах в фокусе внимания исследователей находится анализ ассоциаций SNP с униморбидными состояниями – ИБС,
АГ, ДЛЕ или СД2 (Saxena R. et al., 2007; Samani N.J. et al., 2007; Kathiresan S. et al.,
2009; Kristiansson K. et al., 2012).
Отмечается значительный пробел в представлении генетической компоненты ССК
(Tinoco Mesquita E. et al., 2016). Существует ряд работ в области исследований коморбидности некоторых болезней ССК (Пузырев В.П., Макеева О.А., Голубенко
М.В., 2006; Wu C. et al., 2012; Gottesman O. et al., 2012; CARDIoGRAMplusC4D
Consortium et al., 2013; Jansen H. et al., 2015; Rankinen T. et al., 2015). Тем не менее,
эти исследования представляют собой мета-анализ результатов GWAS по униморбидным состояниям болезней ССК.
Кроме того, задача по оценке вклада CNV в формирование ИБС, особенно при болезнях ССК, остается нерешенной. В настоящее время, существует небольшой ряд
работ, посвященных исследованиям CNV при некоторых заболеваниях ССК в различных популяциях, которые имеют неоднозначные результаты (Sale M.M., Woods J.,
Freedman B.I., 2006; Kathiresan S. et al., 2009; Gancheva K. et al., 2009; Surti A. et al.,
2009; Sha B.Y. et al., 2009; Jeon J.P. et al., 2010; Bochukova E.G. et al., 2010; Shia W.C.
et al., 2011; Costelloe S.J. et al., 2012; Zhao W. et al., 2012; Ascencio-Montiel I.D.J. et al.,
2017; Aerts E. et al., 2018; Iacocca M.A., Hegele R.A., 2018).
Цель работы:
Изучить генетическую структуру подверженности к униморбидной ишемической
болезни сердца (ИБС), ИБС в сочетании с артериальной гипертензией, и сердечнососудистому континууму (сочетание ИБС, артериальной гипертензии, дислипидемии
и сахарного диабета 2 типа).
5
Задачи:
1. Провести сравнительный анализ ассоциаций однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) с риском развития униморбидной ИБС, ИБС в сочетании с артериальной
гипертензией, и сердечно-сосудистого континуума.
2. Оценить прогностическую эффективность SNP-маркеров, ассоциированных с
риском развития униморбидной ИБС, ИБС в сочетании с артериальной гипертензией,
и сердечно-сосудистого континуума.
3. Осуществить полногеномный поиск вариаций числа копий участков ДНК
(CNV) у больных с фенотипом «сердечно-сосудистый континуум».
4. Выполнить сравнительный анализ ассоциаций идентифицированных вариаций
числа копий участков ДНК с риском развития ИБС в сочетании с артериальной гипертензией, и сердечно-сосудистого континуума.
Научная новизна.
Впервые оценена генетическая структура подверженности для униморбидной
ишемической болезни сердца, ИБС в сочетании с артериальной гипертензией, и сердечно-сосудистого континуума. Установлено отличие структуры подверженности
данных заболеваний по генетическим маркерам, SNP и CNV.
Выявлены особенности генетической компоненты болезней ССК относительно
вовлеченности белковых продуктов генов в такие биологические процессы, как липидный обмен и иммуновоспалительный ответ.
Впервые оценен спектр вариаций числа копий участков ДНК у больных с сердечно-сосудистым континуумом с помощью высокоразрешающих микрочиповых технологий. Впервые выявлена ассоциация CNV-делеции в гене SFMBT1 (3p21.1) с сердечно-сосудистым континуумом (ССК). Установлены две CNV-амплификации, включающие гены ERLIN1 (в локусе 10q24.31), и UNG и ACACB (в локусе 12q24.11) только у
больных с ССК и при ИБС в сочетании с АГ, тогда как у здоровых индивидов идентифицируется только уменьшение числа копий данных участков ДНК.
Рассчитана прогностическая эффективность SNP-маркеров в отношении униморбидной ИБС, ИБС в сочетании с артериальной гипертензией и сердечно-сосудистого
континуума.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Результаты диссертационной работы имеют фундаментальное значение для исследований в области изучения коморбидности. Идентифицированные в результате
комплексного анализа SNP и CNV при униморбидной ИБС, ИБС в сочетании с артериальной гипертензией и ССК расширяют имеющиеся представления о концепции
коморбидности, а также прогноза их риска развития.
В работе установлены наиболее информативные генетические маркеры для прогноза риска развития ИБС, ИБС в сочетании с АГ, и сердечно-сосудистого континуума, а также оценена их прогностическая эффективность. Выявлены как новые, так и
известные SNP-маркеры подверженности к сердечно-сосудистым заболеваниям и
6
факторам риска. Характеристика выявленных SNP-маркеров по сетям генных онтологий расширяет имеющиеся представления о молекулярно-генетических механизмах
заболеваний ССК. Установлено, что сердечно-сосудистый континуум, главным образом, характеризуется вовлечением генов липидного обмена, а униморбидная ИБС и
ИБС в сочетании с АГ как генов липидного обмена, так и генов иммуновоспалительного ответа. В целом, несмотря на ожидаемую картину выявления генов липидного
обмена в данном исследовании, гены, показавшие ассоциацию с униморбидной ИБС,
ИБС в сочетании с АГ, и ССК, между собой не пересекаются, что указывает на особенности генетической конституции при данных патологических состояниях.
Оценен спектр структурной вариабельности, в частности по CNV, размером от 1
тыс.п.о. до 2 млн.п.о., у больных с фенотипом «ССК», которые могут быть использованы для дальнейшего исследования при МФЗ в других популяциях. Установлена
статистически значимая ассоциация CNV-делеции в гене SFMBT1 (3p21.1) с риском
развития сердечно-сосудистого континуума, а также показано присутствие CNVамплификации в хромосомных субсегментах 10q24.31 (ERLIN1) и 12q24.11 (UNG и
ACACB) только при ИБС в сочетании с АГ и сердечно-сосудистого континуума. Данные CNV-маркеры потенциально могут быть использованы для прогноза риска развития ССК.
Разработан программный пакет на платформе статистической среды R (“aggi”),
который позволяет оптимизировать анализ данных микроматричной сравнительной
геномной гибридизации. Результаты диссертационного исследования опубликованы в
виде учебно-методического пособия и внедрены в педагогический процесс на кафедре
медицинской генетики ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России.
Методология и методы исследования.
Теоретическую и методологическую основу работы обеспечили исследования в
области изучения многофакторных заболеваний, а также разработки в области изучения однонуклеотидных полиморфных вариантов и вариаций числа копий участков
ДНК. Кроме того, за основу были взяты наработки в области изучения концепции коморбидности, в том числе сердечно-сосудистого континуума.
В диссертационном исследовании была оценена общность и специфичность генетической структуры предрасположенности униморбидной ИБС, ИБС в сочетании с
АГ, а также сердечно-сосудистого континуума, в целом. Особенностью работы является изучение как SNP, так и CNV-маркеров для проведения анализа ассоциации с заболеваниями ССК.
В диссертационной работе использованы современные молекулярно-генетические
методы, такие как: матричная сравнительная геномная гибридизация (array-CGH) для
идентификации вариаций по числу копий участков ДНК, гибридизация на биологических микрочипах для определения генотипов по однонуклеотидным полиморфным
вариантам, ПЦР в режиме реального времени с помощью технологии TaqMan для верификации выявленных CNV и масс-спектрометрия MALDI-TOF для верификации
SNP-маркеров.
7
Статистические методы и подходы, примененные в данной работе, включали первичный анализ данных на базовом проприоритарном программном обеспечении производителей оборудования и анализ данных с помощью разработанных ранее пакетов
прикладных программ (из репозиториев CRAN и Bioconductor) для статистической
среды R, а также разработанным пакетом для оптимизации работы с ними.
Положения, выносимые на защиту:
1. Униморбидная ИБС, ИБС в сочетании с артериальной гипертензией и сердечнососудистый континуум различаются по генетической компоненте подверженности,
оцененной с использованием комплекса SNP-маркеров.
2. Отдельные SNP-маркеры, ассоциированные с риском развития униморбидной
ИБС, ИБС в сочетании с артериальной гипертензией, сердечно-сосудистым континуумом, обладают средней прогностической эффективностью. Для униморбидной ИБС
аддитивный эффект SNP-маркеров, ассоциированных с данной патологией, имеет высокую прогностическую эффективность.
3. Делеция фрагмента интрона 2 гена SFMBT1 (3p21.1) ассоциирована с риском
развития заболеваний сердечно-сосудистого континуума. Увеличение числа копий
участка ДНК гена ERLIN1 (10q24.31) наблюдается при ССК и ИБС в сочетании с артериальной гипертензией; CNV-амплификация, включающая фрагменты генов UNG и
ACACB (12q24.11), встречается только у больных с сердечно-сосудистым континуумом.
Степень достоверности и апробация результатов.
Достоверность и обоснованность результатов исследования достигнута благодаря
большим объемам выборок (общее количество – 923 образца), клинико-лабораторным
исследованиям, проведенным квалифицированными специалистами Кемеровского
кардиологического центра (Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечнососудистых заболеваний»), а также современными молекулярно-генетическими методами и статистическими подходами анализа данных.
Апробация материалов диссертации.
Основные результаты исследования по теме диссертационной работы представлены на российских и международных конференциях: Международная конференция,
посвященная памяти Ю.Г. Рычкова (г. Москва, 2013); Актуальные вопросы клинической и экспериментальной кардиологии (г. Томск, 2013); Мутагенез и его роль в различных проблемах генетики человека, посвященная памяти Н.П. Бочкова (г. Москва,
2013); Медицинские и социальные проблемы орфанных болезней: диагностика, лечение, профилактика (г. Томск, 2014); VI Съезд ВОГиС (г. Ростов-на-Дону, 2014);
International symposium "Human genetics" (г. Новосибирск, 2014); Генетика человека и
патология: проблемы эволюционной медицины (г. Томск, 2014); The European Human
Genetics Conference (г. Милан, Италия, 2014; г. Копенгаген, Дания, 2017); VII съезд
Российского общества медицинских генетиков (г. Санкт-Петербург, 2015); The
8
European Atherosclerosis Society Congress (г. Инсбрук, Австрия, 2016; г. Прага, Чехия,
2017); The 13th International Congress of Human Genetics (г. Киото, Япония, 2016); 10-я
Международная мультиконференция по биоинформатике регуляции и структуре геномов и системной биологии (г. Новосибирск, 2016); American Society of Human
Genetics 66th Annual Meeting (г. Ванкувер, Канада, 2016); Актуальные проблемы медицинской генетики (г. Томск, 2016); 50 лет ВОГиС: успехи и перспективы (г.
Москва, 2016); IХ Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика 2017» (г. Москва, 2017); VIII международный конгресс «Кардиология на перекрестке наук» (г. Тюмень, 2017); Современные
подходы и перспективы генетических исследований в Якутии (г. Якутск, 2017); XI
научная конференция «Генетика человека и патология», посвящённая 35-летию НИИ
Медицинской Генетики (г. Томск, 2017).
Публикации.
Всего по теме диссертации опубликована 31 научная работа, в том числе восемь
статей в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ, одно
учебно-методическое пособие, две статьи в сборниках, 20 тезисов в материалах отечественных и зарубежных конференций.
Личный вклад автора.
Основные результаты диссертационной работы получены автором исследования.
Анализ литературных данных по теме диссертации, экспериментальная работа, биоинформатическая обработка данных, статистический анализ, описание и обобщение
полученных результатов, а также подготовка публикаций по результатам исследования выполнены лично автором.
Структура и объем диссертации.
Диссертация изложена на 230 страницах машинописного текста и включает введение, основные главы (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования с обсуждением), заключение, выводы, список литературы, а
также приложение. Работа иллюстрирована 24 рисунками, 23 таблицами и девятью
формулами. Библиография включает 519 литературных источников, из них 19 источников отечественной и 541 источника зарубежной литературы.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
На первом этапе сформированы две выборки: больные с ишемической болезнью
сердца (n = 579, мужчин 444 и женщин 135) и контрольная группа здоровых индивидов, без клинических признаков заболеваний ССК (n = 344, мужчин 178 и женщин
166). Все индивиды были русскими по национальности и не состояли в родстве между собой. От всех обследованных получено добровольное информированное согласие
на участие в данном исследовании. Проведение работы одобрено Комитетом по биомедицинской этике НИИ медицинской генетики ФГБНУ Томского НИМЦ РАН (г.
9
Томск) и ФГБНУ НИИ Комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний (г.
Кемерово). Исследования выполнены с использованием биоколлекции «Биобанк
населения Северной Евразии» на базе Центра коллективного пользования «Медицинская геномика» НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ.
Средний возраст пациентов составил 61,7 ± 4,95 лет. Средняя длительность ИБС в
группе больных составляет 10 ± 5 лет. Всем пациентам проведено детальное клиниколабораторное обследование, как в отношении основного диагноза, так и в отношении
сопутствующих патологий. Структура патологических состояний в группе больных
состояла из основного заболевания «ишемическая болезнь сердца» (ИБС, где в
анамнезе как минимум одно событие инфаркта миокарда), а также сопутствующих
болезней, таких как артериальная гипертензия (АГ), дислипидемия (ДЛЕ), сахарный
диабет 2 типа (СД2). Выборка пациентов подразделена на три подгруппы: «униморбидная ИБС» (n = 61), «ИБС в сочетании с АГ» (n = 364) и пациенты с фенотипом
«ССК» (n = 154).
Контрольная группа сформирована из относительно здоровых индивидов (n = 344)
с учетом отсутствия сердечно-сосудистой патологии в анамнезе, в том числе по данным ЭКГ. Средний возраст индивидов в данной группе составляет 46,6 ± 5 лет. Дизайн исследований представлен на рисунке 1.
Генотипирование однонуклеотидных полиморфных вариантов осуществляли
на микрочипах, которые были изготовлены по заказу ЗАО «Геноаналитика» для геномного сервиса «Мой ген» на платформе iSelect HD Custom BeadChip (Illumina,
США), согласно протоколу производителя (Illumina, США). Сканирование микрочипа
осуществлялось на приборе BeadArray Reader (Illumina, США). Первичные данные
были обработаны в GenomeStudio Software (Illumina, США) с применением первичного контроля качества кластеризации генотипов. В целом, прогенотипировано 1913
SNP в выборках больных с фенотипом «униморбидная ИБС» (n = 61), «ИБС в сочетании с АГ» (n = 180), «ССК» (n = 68) и контрольной группы (n = 134).
В качестве верификации использовался метод генотипирования с помощью
масс-спектрометрии методом времяпролетной матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (MALDI-TOF) на приборе Sequenom MassARRAY Analyzer 4 (Sequenom / Agena Bioscience, США). Дизайн праймеров для ПЦР-этапов разработан с помощью программы Assay Design Suite Software (Sequenom / Agena Bioscience, США). В целом, прогенотипировано 16 SNP с помощью MALDI-TOF у групп
пациентов с фенотипом «ИБС в сочетании с АГ» (n = 51), «ССК» (n = 55) и контрольная группа (n = 47).
Детекция вариаций числа копий участков ДНК производилась с помощью
матричной сравнительной геномной гибридизации (array-CGH) у больных с фенотипом «ССК» (n = 10). Использовались микрочипы SurePrint G3 CGH+SNP 2х400K
(Agilent Technologies, США) в блоках SureHyb Hybridization Chamber (Agilent Technologies, США) в гибридизационной ротаторной камере Agilent Microarray Hybridization Oven (Agilent Technologies, США), согласно протоколу производителя. Для выполнения aCGH использовались наборы «Oligo aCGH Hybridization Kit», «SureTag
10
Complete DNA Labeling Kit», «Oligo aCGH Wash Buffer Kit» (Agilent Technologies,
США), согласно протоколу производителя. Сканирование микрочипов выполнялось
на приборе Agilent SureScan Microarray Scanner (Agilent Technologies, США). Экстракция изображений микрочипов выполнена в программе Feature Extraction v.11 (Agilent Technologies, США).
Рисунок 1. Дизайн исследования. Примечание: ИБС – ишемическая болезнь сердца,
АГ – артериальная гипертензия, ССК – сердечно-сосудистый континуум, SNP – однонуклеотидный полиморфизм, CNV – вариации по числу копий участков ДНК.
Анализ ассоциации и верификация идентифицированных CNV с риском развития «ИБС в сочетании с АГ» и «ССК» производилась с помощью ПЦР в режиме реального времени с TaqMan-зондами на больших выборках: 270 пациентов с ИБС, из
них «ИБС в сочетании с АГ» в числе 184 человек, и 86 пациентов с фенотипом
«ССК», и 256 относительно здоровых индивидов. Количественная ПЦР в режиме реального времени проводилась на приборе AriaMx Realtime PCR System (Agilent
Technologies, США) с реагентами TaqMan Genotyping Master Mix (Life Technologies).
В качестве калибратора использовалась «ДНК мужчины европейского происхождения» (Agilent Euro Male, Agilent Technologies, США). Всего проанализировано три
CNV генов SFMBT1 (3p21.1), ERLIN1 (10q24.31) и ACACB (12q24.11). «Внутренним»
контролем послужила TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P (Thermo
Fisher). Определение уровня CNV производилось с помощью относительной количественной оценки, методом M.W. Pfaffl (2004) с учетом эффективности амплификации
(E) для каждой пары праймеров.
Биоинформатическая обработка данных SNP-микрочипов производилась с
использованием программных пакетов «GenABEL» (Aulchenko Y.S. et al., 2007) и
«genetics» (Warnes A.G. et al., 2012) в статистической среде R версии 3.0.3. Статисти-
11
ческая значимость различий оценивалась на основе точного теста Фишера для таблиц
сопряженности 2х2. Для снижения ложноположительных результатов проведен сравнительный анализ частот генотипов и аллелей в исследуемых выборках методом перестановок (permutation test, 10000 итераций) для получения точных оценок статистики χ2 Пирсона. Сетевой анализ межгенных взаимодействий проводился на платформе
“Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins”. Для аннотации метаболических и сигнальных путей использовался “WEB-based Gene Set Analysis Toolkit”,
“STRING-DB”, и “Gene Ontology”.
Оценка прогностической эффективности полиморфных вариантов, показавших
статистически значимые ассоциации с изучаемыми фенотипами, проводилась с помощью ROC-анализа и расчетов «площади под кривой» (AUC, area under curve), с использованием программного пакета «pROC» для статистической среды R. Графики и
диаграммы результатов оценки прогностической эффективности выполнены с использованием программного пакета «ggplot2» для статистической среды R.
Биоинформационной анализ aCGH данных проводился с помощью программного обеспечения Agilent Genomic Workbench v7.0 (Agilent Technologies, США) и с
помощью алгоритма циркулярной бинарной сегментации (CBS, Circular Binary Segmentation) для повышения надежности идентифицированных CNV. Фоновая коррекция производилась с проведением анализа двумерного пространственного локально
взвешенного сглаживания двумерной диаграммы рассеяния (2D Spatial LOWESS) для
учета кривизны считываемого микрочипа и распределения красителей с последующей коррекцией (Edwards D., 2003; Serhal P., Lemieux S., bastien, 2013). Для разработки данных алгоритмов были использованы следующие программные пакеты для статистической среды R: “doParallel”, “ggplot2”, “reshape2”, “RColorBrewer” и “plyr”. В
качестве препроцессинга внутричиповой и межчиповой нормализаций использован
программный пакет “limma”. Для коррекции GC-контента применялись программные
пакеты “ArrayTV”, “BSgenome” и “BSgenome.Hsapiens.UCSC.hg19”, а также метод
WACA (Leprêtre F. et al., 2010). Детекция CNV осуществлялась с помощью алгоритма
циркулярной бинарной сегментации из статистических пакетов “DNAcopy” и “CGHcall” (Wie M.A. van de et al., 2007; Seshan V.E., Olshen A.B., 2014; Seshan V.E., Olshen
A., 2016). Таким образом, был разработан пакет прикладных программ “aggi” для статистической среды R с целью оптимизации работ с микрочиповыми данными.
Аннотация выявленных структурных вариантов выполнялась с помощью баз
данных Database of Genomic Variants (DGV, сборка NCBI37, hg19), NCBI RefSeq и
HuGE Navigator Database. Для аннотирования полученных результатов и их последующей обработки использовался программный пакет “biomaRt” для статистической
среды R. Последующий анализ аннотаций генов производился аналогичным способом, что и при обработке данных SNP-микрочипов.
12
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Генетические маркеры, ассоциированные с фенотипом «униморбидная ишемическая болезнь сердца», «ИБС в сочетании с артериальной гипертензией» и
«сердечно-сосудистый континуум».
В целом, идентифицировано 14 однонуклеотидных полиморфных вариантов, ассоциированных с фенотипом «униморбидная ИБС» (табл. 1). Сравнительный анализ
частот аллелей и генотипов показал, что все 14 SNP-маркеров имеют высокую статистическую значимость различий между анализируемыми группами (pexact < 0,03 и pperm
< 0,016, соответственно). По локализации два варианта rs1367117 в гене APOB и
rs763361 в гене CD226 расположены в экзонах и являются миссенс заменами, в то
время как семь вариантов: rs1898830 в гене TLR2, rs10239794 в гене DPP6, rs4763655
в гене KLRB1, rs7975232 в гене VDR, rs4765623 в гене SCARB1, rs3865418 в гене
NEDD4L и rs2267439 в гене SREBF2 локализованы в интронных областях. Вариант
rs3095870 располагается вблизи 5’-UTR гена NKX2-5. В то же время, среди выявленных генетических вариантов, четыре варианта (rs12487066, rs7807268, rs10896449 и
rs944289) локализуются в межгенных областях.
Таблица 1. Полиморфные варианты, ассоциированные с группой «униморбидная ИБС»
Хромосома
3q13.1
7q36.2
7q36.1
12q24.31
12q13.11
2p24
Ген
DPP6
SCARB1
VDR
APOB
22q13
11q13
14q13.3
18q21
18q22.3
SREBF2
NEDD4L
CD226
4q32
5q34
12p13
TLR2
NKX2-5
KLRB1
Локализация SNP
интрон
интрон
интрон
экзон
(миссенс)
интрон
интрон
экзон
(миссенс)
интрон
5’-UTR
интрон
rs12487066
rs10239794
rs7807268
rs4765623
rs7975232
rs1367117
Аллель:
MAF
G:0,23
A:0,37
C:0,45
A:0,25
С:0,46
A:0,29
Генотип: OR
(95% CI)
AA:0,37 (0,18-0,74)
AA:3,35 (1,4-8,26)
CC:2,73 (1,29-5,82)
GG:0,4 (0,2-0,8)
AA:0,32 (0,11-0,8)
AA:3,59 (1,25-10,85)
0,0031
0,0041
0,0065
0,0068
0,009
0,01
rs2267439
rs10896449
rs944289
rs3865418
rs763361
G:0,39
G:0,46
G:0,38
G:0,47
A:0,39
AA:2,32 (1,17-4,67)
AA:2,36 (1,16-4,8)
AA:0,42 (0,18-0,9)
AA:0,36 (0,13-0,86)
AA:2,51 (1,11-5,7)
0,01
0,011
0,017
0,017
0,018
rs1898830
rs3095870
rs4763655
G:0,34
A:0,39
A:0,34
AA:0,43 (0,19-0,9)
GG:2,09 (1,06-4,17)
GG:0,45 (0,21-0,94)
0,021
0,024
0,031
SNP
pperm
C фенотипом «ИБС в сочетании с АГ» ассоциированы 13 SNP (табл. 2). Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей между анализируемыми выборками «случай-контроль» показал, что все 13 SNP-маркеров имеют статистическую значимость
различий (pexact = pperm < 0,03). Локализация выявленных полиморфных вариантов разнообразна. Часть вариантов (rs801114, rs10499194, rs13207033, rs2398162 и rs6501455)
расположена в межгенной области. Пять полиморфных вариантов (rs763317,
rs7794745, rs4765623, rs4430796 и rs1160312) локализованы в интронной области ге-
13
нов (EGFR, CNTNAP2, SCARB1, HNF1B и LINC01432, соответственно). Два варианта
(rs2076530 и rs663048) являются миссенс заменами (BTNL2 и SEZ6L, соответственно),
а rs2440 расположен в 3’-UTR гена XRCC5.
Таблица 2. Полиморфные варианты, ассоциированные с группой «ИБС в сочетании с АГ»
ХромосоГен
ЛокалиSNP
Аллель:
Генотип: OR
pperm
ма
зация SNP
MAF
(95% CI)
1q42
rs801114
C:0,39
CC:0,3 (0,12-0,7)
0,0018
6q23
rs10499194 A:0,35
GG:2,07 (1,25-3,44) 0,0037
12q24.31 SCARB1
интрон
rs4765623
A:0,25
AA:0,49 (0,3-0,82)
0,0038
6q23
rs13207033 A:0,35
GG:2,02 (1,22-3,36) 0,004
7p12
EGFR
интрон
rs763317
A:0,42
GG:0,5 (0,29-0,88)
0,011
7q35
CNTNAP2 интрон
rs7794745
T:0,36
AA:0,52 (0,31-0,87) 0,011
22q12.1
SEZ6L
экзон
rs663048
A:0,19
CC:0,53 (0,31-0,88) 0,011
(миссенс)
20p11
LINC01432 интрон
rs1160312
G:0,42
GG:2,21 (1,16-4,38) 0,013
2q35
17q21.3
17q24.3
15q26
6p21.3
XRCC5
HNF1B
BTNL2
3'-UTR
интрон
экзон
(миссенс)
rs2440
rs4430796
rs6501455
rs2398162
rs2076530
A:0,33
G:0,36
G:0,32
G:0,4
G:0,39
AA:2,48 (1,12-5,93)
GG:2,12 (1,09-4,3)
AA:2,4 (1,08-5,75)
AA:0,43 (0,19-0,93)
GG:1,96 (1,02-3,92)
0,017
0,024
0,024
0,027
0,034
В совокупности, при проведении ассоциативного анализа выявлено 14 полиморфных
вариантов,
связанных с фенотипом
«ССК»
(табл.
3). Все SNPмаркеры показали высокую статистическую значимость различий при сравнительном анализе частот и генотипов между анализируемыми выборками (pexact < 0,032 и
pperm < 0,023, соответственно). Локализация идентифицированных SNP-маркеров разнообразна. Так, три варианта представлены миссенс-заменами, где rs1726866 и
rs10246939 расположены в гене TAS2R38, а rs66048 – в гене SEZ6L; три – являются
синонимичными заменами: rs2291439 в гене RAD54B, rs1143674 в гене ITGA4 и rs688
в гене LDLR; три – локализованы в области 5’-UTR генов APOA2 (rs5082), KLF7
(rs7568369) и CETP (rs183130); два варианта в интронных областях генов LDLR
(rs2738446) и MTAP (rs7023329) и три SNP-маркера локализованы в межгенных промежутках: rs1333048 и rs1333049 в области 9p21.3 вблизи 3’-UTR гена CDKN2B-AS1,
и rs6501455, расположенный между генами SOX9 и KCNJ2.
Таблица 3. Полиморфные варианты, ассоциированные с группой «ССК»
ХромосоГен
ЛокалиSNP
Аллель:
Генотип: OR
ма
зация SNP
MAF
(95% CI)
2q32
KLF7
5’-UTR
rs7568369 A:0,28
CC:0,34 (0,16-0,68)
17q24.3
rs6501455 G:0,32
GG:3,91 (1,56-10,33)
19p13.2
LDLR
интрон
rs2738446 G:0,34
CC:0,38 (0,18-0,77)
экзон
rs688
A:0,34
GG:0,38 (0,18-0,77)
(син.зам.)
pperm
0,0007
0,0016
0,0045
0,0048
14
ХромосоГен
ма
2q31.3
ITGA4
1q21
7q34
9p21
7q34
8q22.1
16q21
9p21.3
22q12.1
Локализация SNP
экзон
(син.зам.)
APOA2
5’-UTR
TAS2R38 экзон
(миссенс)
MTAP
интрон
TAS2R38 экзон
(миссенс)
RAD54B
экзон
(син.зам.)
CETP
5’-UTR
CDKN2B- 3’-UTR
AS1
SEZ6L
экзон
(миссенс)
rs1143674
Аллель:
MAF
A:0,39
Продолжение таблицы 3
Генотип: OR
pperm
(95% CI)
AA:2,84 (1,27-6,47)
0,0069
rs5082
rs1726866
G:0,47
G:0,48
AA:2,42 (1,22-4,82)
AA:2,42 (1,22-4,82)
0,007
0,0073
rs7023329 A:0,48
rs10246939 G:0,48
AA:2,38 (1,2-4,76)
AA:2,42 (1,22-4,82)
0,0079
0,0084
rs2291439
G:0,42
GG:0,25 (0,06-0,77)
0,011
rs183130
rs1333048
rs1333049
rs663048
A:0,35
C:0,45
G:0,44
A:0,19
GG:2,19 (1,13-4,32)
AA:0,37 (0,15-0,87)
CC:0,39 (0,16-0,88)
CC:0,49 (0,25-0,95)
0,013
0,018
0,022
0,027
SNP
Оценка прогностической эффективности каждого полиморфного варианта, показавшего статистически значимые ассоциации с фенотипом ССК выявила, что высокие значения AUC (> 0,60) имеются у трех SNP (rs7568369, rs2738446 и rs688). Среди
них rs7568369 (KLF7) имеет один из самых высоких значений AUC (0,63). Анализ
прогностической эффективности SNP-маркеров, ассоциированных с группой «ИБС в
сочетании с АГ» и «униморбидная ИБС» показал средние значения, не превышающие
0,60.
При построении прогностической модели по всем SNP- маркерам (аддитивная модель), показавших статистическую значимость ассоциации с фенотипом «ССК», значение AUC достигает уровня 0,72, для фенотипа «ИБС в сочетании с АГ» - 0,69 и для
фенотипа «униморбидная ИБС» – 0,8 (рис. 2), что свидетельствует о хорошей прогностической эффективности данных SNP-маркеров, в особенности для «униморбидной
ИБС».
(а)
(б)
(в)
Рисунок 2. Диаграмма ROC-кривой SNP-маркеров, ассоциированных с фенотипом
«ССК» (а), «ИБС в сочетании с АГ» (б) и «униморбидная ИБС» (в). Примечание: 95% доверительный интервал (CI) приведен для AUC.
15
Идентификация CNV у пациентов с фенотипом «сердечно-сосудистый континуум» с помощью матричной сравнительной геномной гибридизации.
Всего у больных ССК идентифицировано 90 CNV, из них 33 являлись CNVамплификациями, 53 - CNV-делециями и 4 локуса представлены как CNV-делециями
у одних индивидов, так и CNV-амплификациями у других. Таким образом, соотношение CNV-делеций к CNV-амплификациям было 1:0,65. Отдельно стоит отметить, что
55 CNV (61%) идентифицированы у более чем одного пациента и только 35 CNV являлись уникальными, т.е. регистрировались у одного индивида. В среднем, на одного
индивида приходилось 38,4 CNV, в пределах от 31 до 46 CNV. Средний размер CNV
составил 217 тыс.п.о., в диапазоне от 4,4 тыс.п.о. до 2 млн.п.о. Аннотационный анализ
идентифицированных CNV с помощью базы данных RefSeq показал, что 72 (80%)
CNV включали гены.
Впервые выявлены пять CNV в хромосомных субсегментах 1p13.1 (IGSF3), 2p11.2
(IGKV4-1, IGKV5-2, IGKV7-2, PGBD43), 7p12.1 (FLJ45974), 10q24.31 (ERLIN1) и
Xp11.4, которые не реферированы в базе данных DGV. Большинство из них являются
редкими событиями (n=1), за исключением CNV в хромосомных субсегментах 1p13.1
(n = 9) и 2p11.2 (n = 10).
Идентифицировано 13 CNV, которые располагаются вне гипервариабельных регионах: 2q13 (MALL, NPHP1, LINC00116, LOC100507334), 3q12.2 (GRP128, TFG),
5q23.1, 7p14.1, 10q11.21 (TMEM72-AS1), 10q21.3 (CTNNA3), 10q24.31 (ERLIN1),
12q21.31 (TMTC2), 13q12.11 (GJB6), 15q26.3 (TM2D3), 17q22 (C17orf112), Xp11.1 и
Xq22.2 (MIR1256, H2BFWT, H2BFM, H2BFXP).
В настоящем исследовании выявлено 14 CNV, гены которых ранее показали ассоциацию с факторами риска и болезнями ССК: 10q21.3(CTNNA3), 3p21.1 (SFMBT1),
1q31.3 (CFHR3, CFH, CDHR1), 22q11.23 (GSTTP1, LOC391322, GSTT1, GSTTP2),
9p21.1 (LING02), 16q22.1 (PDPR, CLEC18C, LOC1005), 16p13.12-p13.11 (PDXDC1),
10q24.31 (ERLIN1), 17p11.2 (FAM27L, FLJ36000, MTRNR2L1), 1p21.1 (AMY2B), 7q33
(LRGUK), 10q21.1 (PCDH15), 1p22.2 (GBP3) и 12q24.11 (UNG, ACACB). Размер данных CNV не превышал 500 тыс.п.о. и варьировал от 4,4 тыс.п.о. до 418 тыс.п.о. Большинство зарегистрированных CNV представляли собой единичные случаи (уникальные CNV), и лишь пять CNV идентифицированы у более чем одного больного.
Верификация и анализ частоты идентифицированных CNV.
Для подтверждающего тестирования отобраны три CNV: CNV-делеция в гене
SFMBT1 (3p21.1), CNV-амплификация, затрагивающая гены UNG и ACACB
(12q24.11), и CNV-амплификация в гене ERLIN1 (10q24.31) (рис. 3). В результате тестирования данных CNV у пациентов с фенотипом ССК, у которых ранее они были
идентифицированы методом aCGH, подтверждено их наличие. В частности, у двух
пациентов верифицирована CNV-делеция в гене SFMBT1 (3p21.1), у одного – CNVамплификация, затрагивающая гены UNG и ACACB (12q24.11), и у одного – CNVамплификация в гене ERLIN1 (10q24.31).
16
(а)
(б)
(в)
Рисунок 3. Профиль CNV, полученный в ходе выполнения матричной сравнительной геномной гибридизации. Примечание: а – CNV-делеция во 2 интроне гена SFMBT1, б – CNVамплификация между генами UNG и ACACB, в – CNV-амплификация гена ERLIN1.
Проведение анализа CNV-делеции в хромосомном субсегменте 3p21.1 (SFMBT1) в
исследуемых выборках показало, что у 14 (16,3%) больных с фенотипом «ССК» выявлена данная CNV-делеция (табл. 4). В то же самое время, CNV-делеция по гену
SFMBT1 обнаружена у 22 (8,6%) индивидов из контрольной выборки. Таким образом,
данная CNV-делеция ассоциирована с риском развития «ССК» (OR = 2,97; 95%CI:
1,44-6,11; р = 0,0067).
Анализ CNV в хромосомном субсегменте 12q24.11 (UNG, ACACB) выявил ампли-
17
фикацию у троих пациентов в группе в целом (1%) , в то время как у одного индивида
из контрольной выборки идентифицирована CNV-делеция. Стоит отметить, что все
три пациента, у которых выявлена CNV-делеция по данному локусу, входили в группу больных с фенотипом «ССК».
Схожую картину продемонстрировал анализ CNV в хромосомном субсегменте
10q24.31 (ERLIN1). Так, данная CNV в образцах ДНК у трех пациентов с ИБС идентифицировалась как CNV-амплификация, тогда как в контрольной группе у трех индивидов детектировалась CNV-делеция. Кроме того, два пациента, у которых выявлена CNV-делеция по данному локусу, так же входили в группу больных с фенотипом
«ССК».
Таблица 4. Частота CNV в хромосомном субсегменте 3p21.1 (SFMBT1), 12q24.11 (UNG,
ACACB) и 10q24.31 (ERLIN1) среди больных ИБС в сочетании с АГ, ССК и относительно
здоровых индивидов.
CNV
Выборка па- Выборка
Выборка ССК
Контрольная
циентов в
«ИБС в сочетавыборка
целом
нии с АГ»
3p21.1 (SFMBT1)
CNV-делеция
31 (11,48%)
15 (8,15%)
14 (16,28%)
22 (8,59%)
Норма
239 (88,52%) 169 (91,85%)
72 (83,72%)
234 (91,41%)
12q24.11 (UNG, ACACB)
CNV- амплификация 3 (1,11%)
0
3 (3,49%)
0
Норма
267 (98,89%) 184 (100%)
83 (96,51%)
255 (99,61%)
CNV-делеция
0
0
0
1 (0,39%)
10q24.31 (ERLIN1)
CNV- амплификация 3 (1,11%)
1 (0,54%)
2 (2,33%)
0
Норма
267 (98,89%) 183 (99,46%)
84 (97,67%)
253 (98,83%)
CNV-делеция
0
0
0
3 (1,17%)
Таким образом, в настоящем исследовании выявлено, что частота CNV-делеции в
хромосомном субсегменте 3p21.1 (SFMBT1) у больных с фенотипом «ССК» составляет 16,3%, в то время как у индивидов контрольный выборки – 8,6%. CNV в хромосомном субсегменте 12q24.11 (UNG, ACACB) имеет редкую частоту, при этом CNVамплификация обнаруживается только у больных с фенотипом «ССК» (3,5%), тогда
как у индивидов контрольной выборки идентифицируется CNV-делеция (0,4%). Подобная картина наблюдается и при анализе CNV в хромосомном регионе 10q24.31
(ERLIN1), где у здоровых лиц наблюдалась CNV-делеция, тогда как у пациентов с фенотипом «ССК», регистрировалась CNV-амплификация. Кроме того, данная CNV выявлена впервые, так как ранее CNV в данном регионе (ERLIN1) ранее не была идентифицирована и не реферирована в базе данных DGV.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате исследования установлена ассоциация 14 полиморфных вариантов с
фенотипом «униморбидная ИБС», в том числе 10 генов APOB, CD226, NKX2-5, TLR2,
DPP6, KLRB1, VDR, SCARB1, NEDD4L, SREBF2 и четырех SNP-маркеров, локализованных в межгенных промежутках (rs10896449, rs12487066, rs7807268 и rs944289); 13
18
SNP с фенотипом «ИБС в сочетании с АГ», из них восемь полиморфных вариантов
расположены в генах BTNL2, CNTNAP2, EGFR, HNF1B, SCARB1, SEZ6L, XRCC5,
LINC01432 и пять в межгенных промежутках (rs801114, rs10499194, rs13207033,
rs2398162 и rs6501455); 14 полиморфных маркеров с фенотипом «ССК», том числе в
девяти генах TAS2R38, SEZ6L, APOA2, KLF7, CETP, ITGA4, RAD54B, LDLR и MTAP и
трех маркеров в межгенных регионах (rs1333048, rs1333049 и rs6501455).
Согласно данным литературы, три SNP в локусе 9p21.3 (rs7023329, rs1333048 и
rs1333049) показали ассоциацию с ИБС и СД2, SNP гена BTNL2 – с острым коронарным синдромом, ITGA4 – с инфарктом миокарда, APOB, APOA2, SCARB1, SREBF2,
CETP, LDLR и SEZ6L – с изменением уровней липидов в крови, KLF7 – с метаболическими нарушениями, TAS2R38 и rs3095870 гена NKX2-5 – с индексом массы тела, а
также употреблением алкоголя, никотиновой зависимостью, SNP в гене NEDD4L и
rs2398162 – с артериальной гипертензией, а SNP в генах TLR2, VDR и HNF1B – с ИБС,
АГ, ДЛЕ и СД2.
Существенная часть идентифицированных вариантов ранее не была ассоциирована с ИБС и ее факторами риска, а связана со злокачественными новообразованиями
(rs2291439 гена RAD54B, rs2440 гена XRCC5, rs763317 гена EGFR, межгенные варианты rs10896449, rs944289, rs801114 и rs6501455), аутоиммунными заболеваниями
(rs4763655 гена KLRB1, rs763361 гена CD226, межгенные варианты rs7807268,
rs12487066, rs10499194 и rs13207033), андрогенной алопецией (rs1160312), боковым
амиотрофическим склерозом (rs10239794 гена DPP6), а также аутизмом, шизофренией (rs7794745 гена CNTNAP2).
Сравнительный анализ показал, что небольшая доля SNP, ассоциированных с изучаемыми фенотипами, является общей (рис. 4). Это свидетельствует в пользу того,
что генетическая структура подверженности униморбидной ИБС и ССК различается.
Вследствие этого ССК является дополнительной сложностью для использования результатов ассоциативных исследований, выполненных на мононозологических выборках, в прикладных целях диагностики предрасположенности к многофакторным
заболеваниям.
Анализ прогностической эффективности показал, что SNP-маркеры обладают
наибольшей прогностической эффективностью при оценке аддитивного эффекта.
Анализ представленности генных онтологий по ассоциированным генам с «униморбидной ИБС», выявил, что белковые продукты генов VDR, TLR2, SCARB1, SREBF2 и
APOB участвуют в «позитивной регуляции хранения холестерина» (GO:0010886, pfdr =
4,06×10-5) и в «клеточном ответе на липиды» (GO:0071396, pfdr = 0,0132), а белковые
продукты генов TLR2, KLRB1, VDR, CD226 и NEDD4L вовлечены в иммуновоспалительный ответ в целом. Три гена LDLR, APOA2 и CETP, ассоциированные с фенотипом «ССК», связаны с одним биологическим процессом – «транспорт холестерола»
(GO:0030301, pfdr = 0,00407), а для фенотипа «ИБС в сочетании с АГ» формирование
генных сетей не было характерно.
Согласно функциональной аннотации ассоциированных генов и их классификации в отношении сигнальных и метаболических путей, в работе установлено, что ге-
19
Сердечно-сосудистый континуум
rs183130 (CETP)
rs1726866, rs10246939 (TAS2R38)
rs2738446, rs663048 (LDLR)
rs1333048, rs1333049
rs7568369 (KLF7)
rs5082 (APOA2)
rs7023329 (MTAP)
rs1143674 (ITGA4)
Липидный
обмен
rs2291439 (RAD54B)
rs801114
rs4430796 (HNF1A)
rs10499194
rs944289
rs10896449
rs7807268
rs12487066
rs6501455
rs663048 (SEZ6L)
rs763361 (CD226)
rs2440 (XRCC5)
rs3095870 (NKX2-5)
rs1367117 (APOB)
rs2398162
rs2076530 (BTNL2)
rs10239794 (DPP6)
rs2267439 (SREBF2)
rs13207033
rs763317 (EGFR)
rs4765623
(SCARB1)
rs1160312 (LINC01432)
Иммуновоспалительный ответ
rs7794745 (CNTNAP2)
rs1898830 (TLR2)
rs4763655 (KLRB1)
rs7975232 (VDR)
rs3865418 (NEDD4L)
Ишемическая болезнь сердца
Ишемическая болезнь сердца
с артериальной гипертензией
Рисунок 4. Функциональная аннотация генов, в которых расположены генетические
маркеры, ассоциированные с исследуемыми фенотипами.
ны липидного обмена (APOB, APOA2, SCARB1, SREBF2, CETP, LDLR и HNF1B) вовлечены в формирование всех трех фенотипов. В то время как гены, ответственные за
иммуновоспалительный ответ, преобладают в группах «униморбидная ИБС» и «ИБС
в сочетании с АГ» (рис. 4). С одной стороны, влияние обмена липидов на риск развития заболеваний ССК не вызывает сомнений. С другой стороны, отличная между фенотипами представленность участия генов указывает на различие в генетической
компоненте подверженности к заболеваниям ССК.
В целом при анализе CNV выявлено 90 вариаций, из них 14 вариаций, включают
гены, ранее показавшие ассоциацию с факторами риска и болезнями ССК, согласно
литературным данным, а также пять CNV, не реферированных в базе данных DGV, в
хромосомных субсегментах 1p13.1 (IGSF3), 2p11.2 (IGKV4-1, IGKV5-2, IGKV7-2,
PGBD43), 7p12.1 (FLJ45974), 10q24.31 (ERLIN1) и Xp11.4, Большинство из них встречались в единичных случаях, за исключением CNV в хромосомных субсегментах
1p13.1 (n = 9; IGSF3) и 2p11.2 (n = 10; IGKV4-1, IGKV5-2, IGKV7-2, PGBD43). Тем не
менее, выявленные CNV могут быть следствием более мелких вариаций, в связи с
ограничением разрешающей способности технологии aCGH и расположением CNV в
гипервариабельной области генома (1p13.1, CNVR402; 2p11.2, CNVR5292; 7p12.1,
CNVR9755; Xp11.4, CNVR11485). CNV в хромосомном субсегменте 10q24.31, включающая ген ERLIN1, является исключительно новой находкой, так как она не располагается в гипервариабельном регионе по CNV и ранее не была идентифицирована и
не реферирована в базе данных DGV.
В совокупности идентифицировано 13 CNV, располагающихся вне гипервариабельных регионов: 2q13 (MALL, NPHP1, LINC00116, LOC100507334), 3q12.2 (GRP128,
TFG), 5q23.1, 7p14.1, 10q11.21 (TMEM72-AS1), 10q21.3 (CTNNA3), 10q24.31 (ERLIN1),
20
12q21.31 (TMTC2), 13q12.11 (GJB6), 15q26.3 (TM2D3), 17q22 (C17orf112), Xp11.1 и
Xq22.2 (MIR1256, H2BFWT, H2BFM, H2BFXP). Большинство из них являются редкими событиями (n = 1), за исключением 7p14.1 (n = 10) и Xp11.1 (n = 4), не включающие гены. Идентифицированные CNV представляют интерес для их дальнейшего исследования с точки зрения оценки их частоты в популяции, а также анализа их связи с
патологией и определения функциональной значимости.
Анализ ассоциации показал, что CNV-делеция в гене SFMBT1 связана с риском
развития «ССК» (OR = 2,97 (95%CI: 1,44-6,11); р = 0,0067). Ген SFMBT1 кодирует белок, который обеспечивает метилирование гистоновых белков и эпигенетическую репрессию генов (Zhang J. et al., 2013; Lin S. et al., 2013). Показана связь полиморфизма
данного гена с АГ, а также с идиопатической гидроцефалией с нормальным давлением (Sato H. et al., 2016). Ассоциация данной CNV с риском развития фенотипа ССК,
который также включает в качестве фактора риска АГ, установлена впервые. Установлено, что увеличение числа копий участков ДНК в хромосомных субсегментах
12q24.11 (UNG, ACACB) и 10q24.31 (ERLIN1) регистрируется только в группах ИБС в
сочетании с АГ, и ССК, а среди относительно здоровых индивидов – только уменьшение числа копий.
Таким образом, проведенное исследование расширяет имеющиеся представления
о генетической структуре подверженности к болезням ССК, указывая на вовлеченность уже известных генов-кандидатов, а также на новые гены, сигнальные и метаболические пути. Предполагается, что расшифровка молекулярно-генетических механизмов формирования ССК приведет к лучшему пониманию природы феномена сочетания болезней. С практической точки зрения, характеристика генетической структуры подверженности к болезням ССК важна для улучшения диагностики, профилактики и лечения. Профилактические мероприятия до формирования ССК необходимо
начинать существенно раньше, особенно в случае, если пациент имеет соответствующую генетическую конституцию предрасположенности.
ВЫВОДЫ
1. Установлено, что оценённая по комплексу SNP-маркеров генетическая структура подверженности униморбидной ИБС, ИБС в сочетании с АГ, и ССК различна.
Общими генетическими маркерами являются: для фенотипов «униморбидная ИБС» и
«ИБС в сочетании с АГ» – rs4765623 гена SCARB1, для фенотипов «ИБС в сочетании
с АГ» и «сердечно-сосудистый континуум» – rs663048 гена SEZ6L и rs6501455, локализованный в межгенном регионе.
2. В формировании структуры генетической компоненты униморбидной ИБС
участвуют SNP-маркеры, ранее показавшие ассоциацию с уровнем холестерина
(rs1367117, APOB), АГ (rs3865418, NEDD4L) и сахарным диабетом 1 типа (rs763361,
NEDD4L; rs7975232, VDR), а также 11 новых SNP-маркеров, локализованных в генах
CD226 (rs763361), NKX2-5 (rs3095870), TLR2 (rs1898830), DPP6 (rs10239794), KLRB1
(rs4763655), SREBF2 (rs2267439), SCARB1 (rs4765623) и в межгенных регионах
21
(rs12487066, rs7807268, rs10896449 и rs944289).
3. В формировании структуры генетической компоненты ИБС в сочетании с АГ
вовлечены SNP-маркеры, ранее показавшие ассоциацию с АГ (rs2398162) и сахарным
диабетом 2 типа (rs4430796, HNF1B), а также 11 новых SNP-маркеров, локализованных в генах BTNL2 (rs2076530), EGFR (rs763317), CNTNAP2 (rs7794745), XRCC5
(rs2440), SCARB1 (rs4765623), SEZ6L (rs663048), rs1160312 (LINC01432) и в межгенных регионах (rs801114, rs10499194, rs13207033, rs6501455).
4. В формировании структуры генетической компоненты сердечно-сосудистого
континуума задействованы SNP-маркеры, ранее показавшие ассоциацию с ИБС
(rs5082, APOA2; rs1333048 и rs1333049, CDKN2B-AS1), уровнем холестерина и липопротеидов (rs183130, CETP; rs688; rs2738446, LDLR), а также ряд новых SNPмаркеров, локализованных в генах TAS2R38 (rs1726866, rs10246939), APOA2 (rs5082),
KLF7 (rs7568369), CETP (rs183130), ITGA4 (rs1143674), RAD54B (rs2291439), LDLR
(rs2738446, rs688) MTAP (rs7023329), и в межгенном регионе (rs6501455).
5. Показано, что с униморбидной ИБС, ИБС в сочетании с АГ, и ССК ассоциированы SNP-маркеры генов, белковые продукты которых вовлечены в липидный обмен
(APOB, APOA2, SCARB1, SREBF2, CETP, LDLR, SEZ6L и HNF1B). Выявлена специфика генетической предрасположенности для изученных заболеваний ССК, так с фенотипом «униморбидная ИБС» ассоциированы SNP-маркеры генов VDR, TLR2,
SCARB1, SREBF2 и APOB, белковые продукты которых участвуют в аккумуляции холестерола, и генов иммуновоспалительного ответа (TLR2, KLRB1, VDR и CD226); с
фенотипом «ССК» ассоциированы SNP генов LDLR, APOA2 и CETP, белковые продукты которых обеспечивают транспорт и метаболизм холестерола.
6. Установлено, что SNP-маркеры, для которых показана ассоциация с риском
развития униморбидной ИБС, ИБС в сочетании с АГ и ССК обладают средней прогностической эффективностью; только для униморбидной ИБС выявлен аддитивный
эффект SNP-маркеров с высокой прогностической эффективностью.
7. У больных с ССК идентифицировано 90 CNV, в том числе впервые выявлены
пять CNV в хромосомных субсегментах 1p13.1 (IGSF3), 2p11.2 (IGKV4-1, IGKV5-2,
IGKV7-2, PGBD43), 7p12.1 (FLJ45974), 10q24.31 (ERLIN1) и Xp11.4. Идентифицировано 13 CNV, расположенных в регионах с редкой частотой регистрации CNV: 2q13
(MALL, NPHP1, LINC00116, LOC100507334), 3q12.2 (GRP128, TFG), 5q23.1, 7p14.1,
10q11.21 (TMEM72-AS1), 10q21.3 (CTNNA3), 10q24.31 (ERLIN1), 12q21.31 (TMTC2),
13q12.11 (GJB6), 15q26.3 (TM2D3), 17q22 (C17orf112), Xp11.1 и Xq22.2 (MIR1256,
H2BFWT, H2BFM, H2BFXP).
8. Установлена ассоциация CNV-делеции фрагмента интрона 2 гена SFMBT1
(3p21.1) с риском развития ССК (OR = 2,97; 95%CI: 1,44-6,11; р = 0,0067). CNVамплификация в хромосомном субсегменте 12q24.11 (UNG, ACACB) регистрируется у
больных с ИБС в сочетании с АГ, и ССК; CNV-амплификация в хромосомном субсегменте 10q24.31 (ERLIN1) - только у больных ССК.
22
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи, опубликованные в журналах,
рекомендованных ВАК:
1. Слепцов А.А., Назаренко М.С., Лебедев И.Н., Скрябин Н.А., Фролов А.В., Попов
В.А., Барбараш О.Л., Барбараш Л.С., Пузырёв В.П. Соматическая вариабельность генома в
тканях сосудистой стенки и лейкоцитах периферической крови при атеросклерозе. // Генетика. 2014. Т. 50 № 8. С. 986-995.
2. Пузырев В.П., Назаренко М.С., Лебедев И.Н., Марков А.В., Слепцов А.А., Кашеварова А.А., Толмачева Е.Н., Фролова А.В., Попов В.А., Барбараш О.Л., Барбараш Л.С. Феномен
парадоминантного наследования при атеросклерозе. // Медицинская генетика. 2014. Т. 13.
№10. С. 41-48.
3. Макеева О.А., Слепцов А.А., Кулиш Е.В., Барбараш О.Л., Мазур А.М., Прохорчук
Е.Б., Чеканов Н.Н., Степанов В.А., Пузырев В.П. Геномное исследование коморбидности
сердечно-сосудистого континуума. // Acta Naturae. 2015. Т. 7. № 3 (26). С. 99-110.
4. Слепцов А.А., Назаренко М.С., Барбараш О.Л., Пузырев В.П. Вариации числа копий
гена ERLIN1 у больных с ишемической болезнью сердца. // Медицинская генетика. 2016. Т.
15. № 5 (167). С.42-44.
5. Nazarenko M.S., Sleptcov A.A., Lebedev I.N., Skryabin N.A., Markov А.V., Golubenko
M.V., Koroleva I.A., Kazancev A.N., Barbarash O.L., Puzyrev V.P. Genomic structural variations
for cardiovascular and metabolic comorbidity. // Scientific Reports. 2017. V. 7. № 41268.
6. Слепцов А.А., Назаренко М.С., Пузырев В.П. Структурная вариабельность генома
лейкоцитов и клеток артерий при атеросклерозе у человека. // Российский кардиологический
журнал. 2017. Т. 22. № 10 (150). С. 140-146.
7. Назаренко М.С., Слепцов А.А., Марков А.В., Пузырев В.П. Вариабельность генома
соматических клеток многофакторных заболеваний человека. // Медицинская генетика. 2017.
Т. 16. №12. С.4-8.
8. Слепцов А.А., Назаренко М.С., Скрябин Н.А., Казанцев А.Н., Барбараш О.Л., Пузырев
В.П. Спектр структурных вариаций генома у больных с ишемической болезнью сердца. //
Медицинская генетика. 2018. Т. 17. №3. С.30-33.
Статьи, опубликованные в сборниках
9. Слепцов А.А., Назаренко М.С. Соматическая изменчивость генома при атеросклерозе.
// Генетика человека и патология: проблемы эволюционной медицины. «Печатная мануфактура». Томск. 2014. Вып. 11. С. 152-155.
10. Назаренко М.С., Марков А.В., Слепцов А.А. Современные представления о молекулярно-генетических механизмах атерогенеза. // Молекулярно-биологические технологии в
медицинской практике. «Академиздат». Новосибирск. 2015. Вып. 22. С.56-68.
Материалы конференций:
11. Puzyrev V.P., Makeeva O.A., Barbarash O.L., Sleptcov A.A., Markova V.V., Polovkova
O.G. Genetic susceptibility profile for comorbidity variants of multifactorial diseases. // The Eighth
International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure\Systems Biology.
2012. P. 257.
12. Слепцов А.А., Назаренко М.С., Лебедев И.Н., Скрябин Н.А., Марков А.В., Фролов
А.В., Барбараш О.Л., Барбараш Л.С. , Пузырев В.П. Микроструктурные вариации генома при
атеросклерозе. // VI Съезд ВОГиС и ассоциированные генетические симпозиумы. 2014. С.
113.
13. Назаренко М.С., Марков А.В., Слепцов А.А., Лебедев И.Н., Скрябин Н.А., , Фролов
А.В., Барбараш О.Л., Барбараш Л.С., Пузырев В.П. Вариабельность генома в тканях сосудистой стенки различной локализации у больных атеросклерозом. // VI Съезд ВОГиС и ассоциированные генетические симпозиумы. 2014. С. 113.
14. Nazarenko M.S., Markov A.V., Sleptcov A.A., Lebedev I.N., Skryabin N.A., Kashevarova
A.A., Frolov A.V., Barbarash O.L., Puzyrev V.P. Genome-wide profiling of DNA copy number and
methylation in atherosclerosis. // International symposium "Human genetics". 2014. P.38.
23
15. Sleptcov A.A., Nazarenko M.S., Lebedev I.N., Skryabin N.A., Kashevarova A.A., Frolov
A.V., Popov V.A., Barbarash O.L., Puzyrev V.P. Prevalence of copy number changes and loss of
heterozygosity in atherosclerosis. // European Journal of Human Genetics. 2014. V. 22. P. 412.
16. Слепцов А.А., Назаренко М.С., Скрябин Н.А., Фролов А.В., Барбараш О.Л., Пузырев
В.П. Микроструктурные перестройки хромосом в тканях сосудистой стенки у больных ишемической болезнью сердца. // VII съезда Российского общества медицинских генетиков. Медицинская генетика. 2015. Т. 14. №4 (154). С. 14.
17. Назаренко М.С., Марков А.В., Слепцов А.А., Лебедев И.Н., Саженова Е.А., Фролов
А.В., Барбараш О.Л., Пузырев В.П. Феномен парадоминантного наследования при многофакторных заболеваниях человека. // VII съезда Российского общества медицинских генетиков. Медицинская генетика. 2015. Т. 14. №4 (154). С. 19.
18. Sleptcov A.A., Nazarenko M.C., Lebedev I.N., Scryabin N.A., Markov A.V., Frolov A.V.,
Barbarash O.L., Puzyrev V.P. DNA copy number and copy-neutral changes in patients with both
coronary artery disease and metabolic comorbidity. // The 13th International Congress of Human
Genetics. 2016. P. 921-922.
19. Nazarenko M.S., Markov A.V., Sleptcov A.A., Lebedev I.N., Skryabin N.A., Frolov A.V.,
Barbarash O.L., Puzyrev V.P. Assessment of somatic DNA methylation pro-filing and copy number
variations in atherosclerosis. // The 13th International Congress of Human Genetics. 2016. P. 1009.
20. Sleptcov A.A., Nazarenko M.S., Lebedev I.N., Skryabin N.A., Barbarash O.L., Puzyrev
V.P. Genomic rearrangements in human atherosclerotic vascular tissues. // Atherosclerosis. 2016.
№ 252. P. e167-e168.
21. Nazarenko M.S., Markov A.V., Sleptcov A.A., Lebedev I.N., Skryabin N.A., Frolov A.V.,
Barbarash O.L., Puzyrev V.P. DNA methylation and copy number events in atherosclerotic lesions.
// Atherosclerosis. 2016. № 252. P. e83.
22. Sleptsov A.A., Nazarenko M.S., Lebedev I.N., Barbarash O.L., Puzyrev V.P. Copy number
alteration of ERLIN1, ABCC9 and ACACB genes in coronary artery disease. // 10-я Международная мультиконференция по биоинформатике регуляции и структуре геномов и системной
биологии (Bioinformatics of Genome Regulation and Structure\ Systems Biology — BGRS\SB2016). 2016. P. 100.
23. Makeeva O.A., Sleptsov A.A., Kulish E.V., Markova V.V., Barbarash O.L., Mazur A.M.,
Prokhorchuk E.B., Chekanov N.N., Stepanov V.A., Puzyrev V.P. Cardiovascular comorbidity influence genetic association studies results. // American Society of Human Genetics 66th Annual
Meeting. 2016. P. 163.
24. Назаренко М.С., Слепцов А.А., Марков А.В., Лебедев И.Н., Скрябин Н.А., Барбараш
О.Л., Пузырев В.П. Структурная и эпигенетическая вариабельность генома человека при атеросклеротическом поражении артерий. // Сборник тезисов Всероссийской конференции «50
лет ВОГИС: успехи и перспективы». 2016. C. 237.
25. Слепцов А.А., Назаренко М.С., Скрябин Н.А., Денисов Е.В., Таширева Л.А., Лебедев
И.Н., Пузырев В.П. Соматическая структурная вариабельность генома при атеросклерозе у
человека. // Сборник тезисов Всероссийской конференции «50 лет ВОГИС: успехи и перспективы». 2016. C. 287.
26. Nazarenko M.S., Sleptsov A.A., Lebedev I.N., Skryabin N.A., Barbarash O.L., Puzyrev V.P.
Copy number variations in patients with advanced coronary artery disease. // Atherosclerosis. 2017.
V. 263. P. e90.
27. Слепцов А.А., Назаренко М.С., Барбараш О.Л., Пузырев В.П. Анализ вариации числа
копий гена SFBMT1 у больных с мультифокальным атеросклерозом. // IХ Всероссийская
научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика
2017». 2017. Т. 2. С. 134-135.
28. Назаренко М.С., Марков А.В., Слепцов А.А., Королева Ю.А., Барбараш О.Л., Пузырев
В.П. Молекулярное профилирование тканей при атеросклерозе. // IХ Всероссийская научнопрактическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика 2017»
2017. Т. 2. С. 132-133.
24
29. Назаренко М.С., Слепцов А.А., Марков А.В., Казанцев А.Н., Барбараш О.Л., Пузырев
В.П. Структурная и эпигенетическая вариабельность генома клеток сосудов и лейкоцитов
при атеросклеротическом поражении артерий. // Сборник XI научной конференции «Генетика человека и патология», посвящённой 35-летию НИИ Медицинской Генетики. Под редакцией В.А. Степанова. 2017. Выпуск 11. С. 89-90.
30. Nazarenko M.S., Sleptcov A.A., Markov A.V., Lebedev I.N., Skryabin N.A., Kazancev
A.N., Barabarash O.L., Nazarenko L.P., Puzyrev V.P. Microarray molecular profiling to define
pathogenesis and biomarkers of atherosclerosis. // Human Genomics. 2018. V. 12 (Suppl 1). № 9.
P. 48.
Учебно-методическое пособие:
31. Назаренко М.С., Марков А.В., Слепцов А.А. Генетические аспекты атеросклероза //
Учебно-методическое пособие. Серия «Наследственность и здоровье». 2014. Вып. 11. Под
ред. академика РАН, профессора В.П. Пузырева. Томск: Печатная мануфактура. 72 с.
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АГ
ДЛЕ
ИБС
МФЗ
п.о.
ПЦР
СД2
ССК
aCGH
–
–
–
–
–
–
–
–
–
CBS
CNV
CNVR
DGV
GO
GWAS
–
–
–
–
–
–
MALDITOF
–
pexact
–
pfdr
–
Pperm
–
SNP
–
артериальная гипертензия
дислипидемия
ишемическая болезнь сердца
многофакторные заболевания
пар оснований
полимеразная цепная реакция
сахарный диабет 2-го типа
сердечно-сосудистый континуум
англ. Array Comparative Genomic Hybridization, матричная сравнительная геномная гибридизация
англ. Circular Binary Segmentation, циркулярная бинарная сегментация
англ. Copy Number Variation, вариации по числу копий участков ДНК
англ. CNV-polymorphic region, гипервариабельные регионы по CNV
англ. Database of Genomic Variants, база данных геномных вариаций человека
англ. Gene Ontology, генная онтология
англ. Genome-Wide Association Study, широкогеномные ассоциативные исследования
англ. Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time Of Flight, массспектрометрия методом времяпролетной матрично-активированной лазерной
десорбции/ионизации
уровень статистической значимости, полученный при помощи точного теста
Фишера
скорректированный уровень статистической значимости методом “False Discovery Rate”
уровень статистической значимости, полученный методом пермутационного
теста
Single Nucleotide Polymorphism, однонуклеотидный полиморфизм
Просьба высылать отзывы на автореферат по адресу:
НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ
634050, г. Томск, ул. Набережная реки Ушайки, 10
Ученому секретарю диссертационного совета Д 002.279.04
канд. биол. наук Хитринской И.Ю.
Факс +7(3822)51-37-44
E-mail: khitrinskaya@tnimc.ru
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
3
Размер файла
938 Кб
Теги
геном, сосудистой, сердечно, вариабельность, болезням, континуумов, структурная
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа