close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Взаимодействие кобаламинов с галогенокислородными соединениями

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Шпагилев Никита Игоревич
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КОБАЛАМИНОВ
С ГАЛОГЕНОКИСЛОРОДНЫМИ СОЕДИНЕНИЯМИ
02.00.04 – Физическая химия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата химических наук
Иваново – 2018
2
Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном
учреждении высшего образования «Ивановский государственный химикотехнологический университет»
Научный руководитель:
доктор химических наук, профессор
Макаров Сергей Васильевич
Официальные оппоненты:
Воробьев - Десятовский Николай
Владимирович
доктор химических наук, профессор
АО «Полиметалл Инжиниринг»,
управление гидрометаллургии,
начальник управления
Шейнин Владимир Борисович
кандидат химических наук, старший
научный сотрудник
ФГБУН «Институт химии растворов им.
Г.А. Крестова Российской академии наук», лаборатория 2-2. «Новые материалы
на основе макроциклических соединений», ведущий научный сотрудник
Ведущая организация:
ФГАОУ ВО «Белгородский
государственный национальный
исследовательский университет»
(НИУ «БелГУ»)
Защита состоится 8 октября 2018 г. на заседании диссертационного совета
Д 212.063.06 при Ивановском государственном химико-технологическом университете по адресу: 153000 г. Иваново, пр. Шереметевский, 7 в ауд. Г-205.
Тел.: (4932) 32-54-33
Факс: (4932) 32-54-33
e-mail: dissovet@isuct.ru
С диссертацией можно ознакомиться в Информационном центре ИГХТУ по адресу:
153000, г. Иваново, пр. Шереметевский, 10
и на сайте университета http://www.isuct.ru
по ссылке:
http://isuct.ru/sites/default/files/department/ightu/dissertacionnyesovety/files/shpagilev_nikita_igorevich-28052018/shpagilev_n.i._-_dissertaciya.pdf
Автореферат разослан «___» ____________ 2018 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
Д 212.063.06
Егорова Елена Владимировна
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность и степень разработанности темы. Ежегодно в мире публикуется более 900 статей, посвященных химии и биохимии витамина B12, а также его использованию в питании и медицине, причем число работ с каждым годом растет. Регулярно проводятся специальные конференции, на которых собираются химики, биохимики, медики, нутрициологи, исследующие свойства и применение витамина B 12
(кобаламина). Последний такой симпозиум состоялся в 2017 г. в Дании. Специальный микросимпозиум по витамину B12 проводится в рамках Международных конференций по порфиринам и фталоцианинам. Все возрастающий интерес к витамину B 12
(кобаламину, Cbl) связан с тем, что этот витамин обладает целым рядом уникальных
свойств, выделяющих его среди других витаминов. Хотя синтезировать его способны
только прокариоты, необходим он очень многим организмам. В связи с этим природа
выработала сложные механизмы поступления и ассимиляции этого микронутриента.
В организме человека кобаламинсодержащий фермент метионин синтаза играет важную роль в синтезе метионина в цитозоле. Другой фермент, имеющий в составе кобаламин – метилмалонил-CoA мутаза - катализирует превращение метилмалонил-CoA в
сукцинил-CoA в митохондриях. В указанных реакциях участвуют три формы кобаламина (Cbl(III), Cbl(II), Cbl(I)), различающиеся степенью окисления центрального иона
кобальта. Транспорт и утилизация кобаламина происходят как внутри, так и вне клетки, причем эти процессы проходят в разных «редокс условиях»: внутри клетки они
«восстановительные», а в межклеточном пространстве – «окислительные». К биологическим окислителям относятся многие галогенокислородные соединения, важнейшим из которых является гипохлорит – одна из активных форм кислорода. Хотя реакции гипохлорита со многими биомолекулами хорошо изучены, его влияние на свойства кобаламинов, особенно на корриновый лиганд в витамине B12, исследовано недостаточно. Малоизученными остаются и процессы взаимодействия кобаламинов с
другими галогенокислородными окислителями.
В связи с вышеизложенным определена цель исследования.
Цель работы – определение кинетических параметров и механизмов процессов
взаимодействия кобаламинов (III) и кобаламина (II) с гипохлоритом, хлоритом, диоксидом хлора и периодатом, а также состава продуктов, образующихся при модификации корринового лиганда кобаламинов указанными галогенокислородными соединениями.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Исследовать кинетику реакций аквакобаламина и кобаламина (II) с гипохлоритом, хлоритом, диоксидом хлора и периодатом, а также реакции глутатионилкобаламина с гипохлоритом.
2. Исследовать кинетику реакции глутатионилкобаламина с гипохлоритом.
3. Выявить влияние добавок тиоцианата, иодида и бромида на кинетику и механизмы реакций кобаламинов с гипохлоритом.
4. Выявить влияние степени окисления кобальта в кобаламинах на состав продуктов их реакций с галогенокислородными соединениями.
Научная новизна. Впервые определены кинетические параметры реакций аквакобаламина с диоксидом хлора и периодатом в водных растворах. Показано, что
гипохлорит модифицирует корриновое кольцо кобаламина; определен состав моди-
4
фицированных продуктов. Впервые изучена кинетика реакции глутатионилкобаламина с гипохлоритом. Показано, что образование комплекса кобаламина с глутатионом
способствует повышению стабильности корринового кольца в окислительных процессах. Установлено, что добавки тиоцианата и иодида стабилизируют корриновые
комплексы кобальта, в присутствии же бромида скорость процессов модификации
кобаламинов увеличивается.
Теоретическая и практическая ценность. Предложены или уточнены механизмы редокс реакций Cbl(III)/Cbl(II) с гипохлоритом, хлоритом, диоксидом хлора и
периодатом. Установлено, что при окислении кобаламина (II) гипохлоритом и хлоритом образуются гидроксилированные модифицированные кобаламины («стабильные
желтые корриноиды»), а при окислении аквакобаламина гипохлоритом и гипобромитом – хлорированные и бромированные продукты, соответственно; реакция же аквакобаламина с диоксидом хлора сопровождается образованием оксигенированных
продуктов, строение которых отличается от строения «стабильных желтых корриноидов». Выявлена и объяснена роль тиоцианата как протектора кобаламинов при их
окислении гипохлоритом и гипобромитом.
Работа выполнена в соответствии с «Основными направлениями научных исследований Ивановского государственного химико-технологического университета»
по теме «Термодинамика, строение растворов и кинетика жидкофазных реакций», а
также в соответствии с научной программой гранта Российского научного фонда, соглашение № 14-23-00204.
Методология и методы диссертационного исследования. Методологической
основой исследования являются синтез, эксперимент, анализ и сравнение. Для достижения цели работы использовались современные методы исследования – спектрофотометрия, в том числе использующая метод остановленной струи (stopped-flow), матрично-активированная лазерная десорбционно-ионизационная-масс-спектрометрия
(MALDI-MS), ионометрия, хроматография.
Для обоснования результатов исследований использованы обзорные и оригинальные статьи отечественных и зарубежных авторов в области координационной
химии кобаламинов и их аналогов, а также химии галогенокислородных соединений.
Положения, выносимые на защиту:
1. Результаты исследования кинетики реакций аквакобаламина и кобаламина
(II) с гипохлоритом, хлоритом, диоксидом хлора и периодатом.
2. Результаты исследования влияния глутатиона, бромида и иодида на процессы модификации кобаламинов.
3. Механизмы реакций аквакобаламина и кобаламина (II) с хлоритом, диоксидом хлора, периодатом, а также гипохлоритом в отсутствие и в присутствии глутатиона, тиоцианата, бромида и иодида.
Степень достоверности полученных результатов обеспечивается использованием комплекса независимых методов исследования, подтверждается воспроизводимостью экспериментальных данных, полученных на современном высокоточном
оборудовании и публикациями в журналах из Перечня рецензируемых научных изданий.
Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы были
представлены и обсуждены на следующих конференциях: IV Всероссийской конференции по органической химии (Москва, 2015); XVIII конференции молодых ученыххимиков Нижегородской области (Нижний Новгород, 2015); XII Международной
конференции «Синтез и применение порфиринов и их аналогов» (ICPC-12) (Иваново,
5
2016); XIX Молодѐжной конференции-школе по органической химии (Репино, СанктПетербург, 2016); Всероссийской школе-конференции «Фундаментальные науки –
специалисту нового века» (студенческая научная конференция «Дни науки в ИГХТУ
2017») (Иваново, 2017); 27th International Chugaev Conference on Coordination
Chemistry (Nizhny Novgorod, 2017); Всероссийской школе-конференции молодых
ученых «Фундаментальные науки – специалисту нового века» (студенческая научная
конференция «Дни науки в ИГХТУ 2018») (Иваново, 2018).
Личный вклад автора. Заключается в изучении и анализе источников литературы, разработке и подборе оптимальных условий проведения эксперимента, проведении экспериментальных исследований, анализе и интерпретации полученных результатов, формулировке выводов. Общее планирование работы, постановка цели и
задач исследования и обсуждение результатов проводилось под руководством д.х.н.,
профессора Макарова С.В.
Публикации. Основные результаты диссертационной работы полностью отражены в 9 научных работах: 2-х статьях в журналах из Перечня рецензируемых научных изданий и в тезисах 7 докладов, представленных на конференциях различного
уровня.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов и заключения, а также списка цитируемой литературы (293 ссылки). Общий объем работы составляет 129 страниц, включая 21 схему и 61 рисунок.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Глава 1 представляет собой обзор литературы. В ней описаны строение и важнейшие свойства кобаламинов и их производных, гипохлорита, хлорита, диоксида
хлора, периодата, а также имеющиеся данные о взаимодействии кобаламинов с галогенокислородными соединениями.
В разделе 2.1 Главы 2 приведены характеристики использованных в работе
реактивов и приборов, методики спектрофотометрических, масс-спектрометрических,
хроматографических и ионометрических экспериментов и математической обработки
данных. В Разделе 2.2 обсуждаются полученные в работе экспериментальные данные. В параграфе 2.2.1 рассмотрены результаты исследования взаимодействия аквакобаламина и кобаламина (II) с гипохлоритом, хлоритом и диоксидом хлора. Установлено, что реакция H2О–Cbl(III) с ClO‒/HOCl протекает в две стадии. В ходе первой
быстрой стадии происходит накопление продукта реакции, электронный спектр поглощения (ЭСП) которого имеет максимумы при 357 и 560 нм. В ходе более медленной стадии происходит обесцвечивание раствора, что свидетельствует о разрушении
корринового макроцикла (рис. 1). Установлено, что при окислении H2О–Cbl(III) гипохлоритом ClO-/HOCl образуется продукт, MALDI-масс спектр которого имеет максимум при m/z = 1364.37, соответствующий [Cbl + Cl]+ (для кобаламина m/z = 1329).
Максимум при m/z = 1396.22 отвечает ионам [Cbl + 2Cl - 4H]+ (рис. 2).
6
A
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
300
400
500
600
700
, нм
Рис. 1. Спектральные изменения в ходе
реакции Н2O–Cbl(III) и гипохлорита
и электронный спектр поглощения Н2O–
Cbl(III) (пунктирная линия) при pH
7.3,[H2O–Cbl(III)] = 4×10−5 моль/л,
[ClO‒/HOCl] = 3×10−4 моль/л, 25 °C
Рис. 2. MALDI-масс-спектр продукта реакции H2О–Cbl(III) и ClO‒/HOCl, [H2O–
Cbl(III)]0 = 5×10-5 моль/л, [ClO‒/HOCl]0 =
1×10−4 моль/л, небуферированный водный раствор
Показано, что скорость образования модифицированных корриноидов в ходе
реакции между H2О–Cbl(III) и гипохлоритом увеличивается в кислой среде, что объясняется увеличением концентрации хлорноватистой кислоты (pKa(HOCl) = 7.40 при
25 °C), обладающей более сильными окислительными свойствами, чем ClO−. При
проведении реакции в щелочных средах продукты модификации корринового кольца
обнаружить не удалось; наблюдалось лишь обесцвечивание раствора, свидетельствующее о разрушении хромофорной системы. Это объясняется значительно более
слабыми окислительными свойствами гипохлорит-иона по сравнению с хлорноватистой кислотой, т.е. в щелочной среде стадия распада модифицированного продукта
протекает значительно быстрее, чем его образование.
В отличие от гипохлорита, хлорит не реагирует с аквакобаламином при pH 413, однако взаимодействует с Cbl(II). Хроматографическое разделение смеси продуктов реакции показало, что основным продуктом взаимодействия Cbl(II) и хлорита является аквакобаламин (выход 90%). Побочный продукт имеет максимум при 460 нм
(рис. 3), типичный для «стабильных желтых корриноидов» (те же корриноиды получены при взаимодействии Cbl(II) с гипохлоритом). Данные MALDI-массспектрометрии подтверждают образование желтых корриноидов: наблюдаемые пики
при 1345.49 и 1383.43 соответствуют [Cbl+O]+ и [Cbl+O–H++K+]+ ионам.
Установлено, что порядки по обоим реагентам (кобаламину (II) и хлориту) равны единице. Показано, что значения наблюдаемой константы скорости увеличиваются при уменьшении pH. Рассчитаны константы скорости реакции Cbl(II) c HClO2 ((5.3
± 0.3)×106 л/(моль×c)) и ClO2- (21 ± 2 л/(моль×c) при 25°C.
7
1,0
А
A
0,8
0,8
0,6
0,6
2
0,4
0,4
1
0,2
0,2
0,0
0,0
300
400
500
, нм
600
700
800
Рис. 3. ЭСП продуктов, образующихся в результате реакции Cbl(II) (2×10−4 моль/л) и
ClO2‒/HO2Cl (2×10−4моль/л) при рН 5.7:
H2O–Cbl(III) (основной продукт, спектр 1) и
побочный продукт, спектр 2
450
500
550
, нм
600
650
Рис. 4. Спектральные изменения, сопровождающие первую стадию взаимодействия H2O–Cbl(III) с ClO2 при рН
4.5, [H2O–Cbl(III)] = 6×10-5 моль/л,
[ClO2] = 1×10-3 моль/л, 25 °C
Определены активационные параметры реакции: ∆H≠ = 22.6±1.8 кДж/моль, ∆S≠
= -143.76±5.1 Дж/(моль× К). Знак ∆S≠ указывает на ассоциативный механизм реакции,
скоростьопределяющей стадией которой является реакция 1. Продукт этой стадии радикал ClO• быстро окисляет ClO2− (реакция 2).
Cbl(II) + ClO2− (или HClO2) (+ Н+) → Н2О−Cbl(III)/HO−−Cbl(III) + ClO•
ClO• + ClO2− → ClО− + ClO2
Cbl(II) + ClO• → Н2О−Cbl(III)/HO−−Cbl(III) + ClО−
Cbl(II) + ClО−/HOCl (+ Н+) → Н2О−Cbl(III)/HO−−Cbl(III) + Cl− + HO•
Н2О−Cbl(III)/HO−−Cbl(III) + HO• → «стабильные желтые корриноиды» (гидроксилированные продукты)
Cbl(II) + ClO2 → Н2О−Cbl(III)/HO−−Cbl(III) + ClO2−
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
Быстрое восстановление ClO• кобаламином(II) (реакция 3) также приводит к
образованию гипохлорита. В ходе последующих реакций 4 и 5 происходит частичная
модификация коррина с образованием «стабильных желтых корриноидов». Диоксид
хлора ClO2 также способен окислять Cbl(II) (реакция 6). Специальными исследованиями показано, что продуктом ее является аквакобаламин.
Установлено, что взаимодействие аквакобаламина с диоксидом хлора протекает в две стадии. Спектр продукта первой стадии имеет максимумы при 537 и 560 нм
(рис. 4). Вторая более медленная стадия сопровождается обесцвечиванием раствора.
Максимумы в MALDI-масс-спектре при 1361.80 и 1394.76 свидетельствуют о наличии ионов [Cbl + 2O]+ и [Cbl + 4O + H]+. Следовательно, можно полагать, что при
взаимодействии аквакобаламина с диоксидом хлора образуются оксигенированные
корриноиды, строение которых отличается от строения «стабильных желтых корриноидов» (характерный для них максимум при 460 нм отсутствует в спектре, представ-
8
ленном на рис. 4). Для их возникновения необходимо наличие радикалов HO•, которые в растворах Cbl(III) не образуются.
Влияние рН на скорость взаимодействия H2O–Cbl(III) c ClO2 изучено в диапазоне рН 4.5–7.2, поскольку в щелочных средах диоксид хлора диспропорционирует с
образованием хлорита и хлората. Показано, что в этом диапазоне скорость реакции
практически не зависит от pH, значения констант скорости двух стадий реакции равны соответственно (3.0 ± 0.1) × 10-1 и (2.9 ± 0.1) × 10−2 л/(моль×с) (25 °C).
Определена стехиометрия первой стадии реакции Cbl(II) : ClO2 = 1:1 Основываясь на полученных данных, можно сделать вывод об одноэлектронном восстановлении ClO2 с образованием ClO2– (см. реакцию 6).
Таким образом, в настоящей работе установлено, что основным продуктом
взаимодействия Cbl(II) с хлоритом является аквакобаламин, однако в ходе этой реакции образуются также комплексы с модифицированным корриновым кольцом. Предложенный механизм восстановления ClO2‒/HO2Cl включает стадии образования гипохлорита/хлорноватистой кислоты, модифицирующих коррин. Разрушение витамина
В12 хлоритом возможно только в тех случаях, когда кобаламин присутствует в восстановленной форме. При этом, в отличие от реакции гипохлорита с аквакобаламином, на начальных стадиях распада корринового кольца образуются не хлорированные, а гидроксилированные продукты, что связано с образованием при взаимодействии Cbl(II) с продуктом восстановления хлорита - гипохлоритом (хлорноватистой кислотой) активного гидроксилирующего агента – гидроксильного радикала. Разрушение аквакобаламина диоксидом хлора протекает относительно медленно. ClO2 быстро
окисляет Cbl(II) до H2O–Cbl(III). Модификация и разрушение витамина В12 диоксидом хлора происходит сравнительно медленно.
В параграфе 2.2.2 рассматриваются результаты исследований взаимодействия
глутатионилкобаламина GSCbl и гипохлорита. Спектрофотометрическим методом
показано, что первичным продуктом этой реакции в нейтральной среде является аквакобаламин. Затем, при избытке гипохлорита, наблюдается обесцвечивание раствора. MALDI-масс-спектры продуктов окисления GSCbl двукратным избытком
ClO−/HOCl имеют максимумы при m/z =1329.63 и 1351.66, которые соответствуют
ионам [Cbl]+ и [Cbl – H + Na]+. В аналогичных условиях продуктами реакций гипохлорита с аква- и цианокобаламинами являются хлорированные кобаламины. Следовательно, можно сделать вывод о том, что глутатион защищает корриновый макроцикл от модификации.
Титрованием GSCbl гипохлоритом при рН 7.2 определена стехиометрия реакции. Обнаружено, что полное превращение GSCbl в H2O–Cbl(III) происходит при соотношении концентраций [ClO–/HOCl]0 : [GSCbl]0, равном 2 : 1. Такая же стехиометрия наблюдается и при рН 11.0. При варьировании соотношения [ClO–/HOCl]0 :
[GSCbl]0 от 2:1 до 3:1 электронный спектр H2O–Cbl(III) не меняется. Дальнейшее увеличение соотношения [ClO–/HOCl]0:[GSCbl]0 приводит к красному смещению полос в
интервале 450-600 нм в спектре кобаламина и постепенному обесцвечиванию хромофора. Изучена кинетика реакции между ClO–/HOCl и избытком GSCbl (в присутствии
избытка ClO-/HOCl скорость реакции была слишком высока для ее определения даже
с помощью метода остановленного потока). Аналогичный подход для исследования
быстрых реакций с участием кобаламинов был применен ранее при исследовании
взаимодействия Cbl(II) с пероксинитритом и нитроксилкобаламина с O2. В случае реакции ClO–/HOCl с избытком GSCbl уменьшение концентрации гипохлорита соответствует убыли концентрации GSCbl, т.е. кинетические кривые эквивалентны. Концен-
9
трация гипохлорита для проведения кинетических экспериментов выбиралась таким
образом, чтобы убыль концентрации GSCbl не превышала 10 % от еѐ начальной величины (т.е. изменением концентрации GSCbl в ходе реакции можно пренебречь). Кинетическая кривая представлена на рис. 5.
Рис. 5. Кинетическая кривая, соответствующая реакции GSCbl с гипохлоритом
при рН 11.1, [GSCbl] =1×10-4 моль/л, [ClO–
/HOCl]0= 3×10-5 моль/л, 25°C
Рис. 6. Зависимость наблюдаемой константы скорости (kнабл.1) от концентрации GSCbl при pH 11.1, [ClO–/HOCl]0=
3×10-5 моль/л, 25 °C
Она описывается уравнением экспоненты, что свидетельствует о первом порядке реакции по гипохлориту, т.е. r= kнабл.1 [ClO–/HOCl]. Установлено, что порядок
по глутатионилкобаламину также равен единице (рис. 6). Скорость реакции существенно возрастает при уменьшении pH раствора, что объясняется увеличением концентрации хлорноватистой кислоты. Протонирование атома серы в глутатионильном
лиганде происходит только в сильнокислых средах и не влияет на кинетику реакции.
C учетом того, что активными частицами окислителя являются HOCl и ClO−, получено уравнение 7, хорошо описывающее экспериментальные данные (pKa(HOCl) = 7.40,
25 °C). Показано, что константа скорости реакции GSCbl и ClO– (k12) практически
равна нулю, а константа скорости реакции GSCbl и HOCl (k11) равняется (6.6 ±
0.4)×108 л/(моль×с) (25 °C).
k11 10 pH  k12 10 pKa
k 
10pH  10pKa
/
1
(7)
Кинетика окисления серосодержащих аминокислот и пептидов подробно изучена ранее. Установлено, что константы скорости окисления глутатиона и цистеина
гипохлоритом при рН 7.4 равняются 1.2×108 и 3.6×108 л/(моль×с), соответственно.
Используя уравнение 7, было рассчитано значение константы скорости реакции между GSCbl и HOCl при рН 7.4 равное 3.3×108 л/(моль×с) (25 °C), которое близко к значениям констант скорости окисления глутатиона и цистеина гипохлоритом. Таким
образом, реакционная способность глутатиона по отношению к хлорноватистой кислоте практически не зависит от его связывания с Cbl(III).
10
Известно, что реакции HOCl могут протекать через механизмы переноса атомов O‒ или Cl+. HOCl взаимодействует с тиольной группой при соотношении реагентов 1:1 с образованием сульфеновой кислоты (RSOH). Аминогруппа глутатиона также может реагировать с HOCl, образуя хлорамин. Взаимодействие GSH и HOCl протекает по более сложному механизму и приводит к образованию глутатион сульфонамида (основной продукт), глутатион дисульфида и дегидроглутатиона (побочные
продукты).
В настоящей работе предложен следующий механизм реакции между GSCbl и
HOCl (схема 1), включающий образование RSCl, который в дальнейшем быстро гидролизуется в сульфеновую кислоту.
Схема 1. Механизм реакции глутатионилкобаламина и гипохлорита
Окисление аминогруппы также протекает очень быстро и приводит к образованию хлорамина. Так как тиолы по сравнению с аминами более реакционноспособны
по отношению к HOCl, образование хлораминов происходит после окисления атома
серы. Поскольку для образования H2O– Cbl(III) требуется двукратный избыток ClO–
/HOCl по сравнению с GSCbl, можно полагать, что для отщепления β-лиганда необходимо окисление обеих (тиольной и амино) групп: в ходе этих реакций один эквивалент HOCl расходуется на образование сульфеновой кислоты, а второй – на получение хлорамина. Этот факт может быть объяснен внутримолекулярной циклизацией
между атомами серы и азота, которая приводит к образованию более лабильного лиганда, замещающегося молекулой воды. Внутримолекулярная циклизация обнаружена ранее при изучении реакции окисления свободного GSH хлорноватистой кислотой,
в ходе которой образовывался сульфонамид. Так как модификация и разрушение коррина наблюдались только при соотношении [ClO–/HOCl]0/[GSCbl]0 > 3:1, можно утверждать, что после выделения окисленный глутатион далее реагирует с третьей молекулой HOCl, образуя сульфонамид. Реакции GSH и HOCl с образованием глутатион
11
сульфонамида имеет стехиометрию [GSH]0 : [HOCl]0 = 3:1, что соответствует полученным в настоящей работе данным для окисления GSCbl. Таким образом, модификация корринового кольца протекает только после образования аквакобаламина и несвязанного сульфонамида.
Основываясь на полученных данных, можно сделать вывод о том, что значительно более сильные антиоксидантные свойства GSCbl по сравнению с другими кобаламинами обусловлены присутствием глутатионильного лиганда, который повышает устойчивость коррина в условиях окислительного стресса.
В параграфе 2.2.3 обсуждаются результаты исследований влияния тиоцианата,
бромида и иодида на реакцию аквакобаламина с гипохлоритом. MALDI-масс-спектр
продукта реакции H2O–Cbl(III) с ClO–/HOCl в присутствии избытка SCN‒ включает
пики при m/z = 1329.25 и 1368.23, которые соответствуют ионам [Cbl] + и [Cbl + K]+,
что указывает на отсутствие модификации корринового кольца. Аналогичный вывод
сделан также на основании спектрофотометрических данных. При [ClO–/HOCl]0 :
[SCN‒]0 = 1:1, однако, модифицированные корриноиды образуются (зафиксированы
максимумы при 357 и 560 нм). Кинетические кривые реакции образования модифицированных корриноидов при взаимодействии H2O–Cbl(III) с ClO–/HOCl в присутствии тиоцианата ([SCN-] < [ClO-/HOCl]) описываются уравнением экспоненты что
свидетельствует о первом порядке реакции по H2О–Cbl(III). В присутствии тиоцианата скорость образования модифицированных корриноидов при взаимодействии H2О–
Cbl(III) и ClO–/HOCl уменьшается. Константа скорости процесса модификации H2О–
Cbl(III) практически равна нулю при больших избытках тиоцианата по отношению к
ClO–/HOCl. Известно, что HOCl с высокой скоростью (k = 2.34×107 M-1 c-1) окисляет
SCN‒ до гипотиоцианита (OSCN‒) (реакция 8).
HOCl + SCN‒ → Cl‒ + OSCN‒ + H+
(8)
При [HOCl] > [SCN-] хлорноватистая кислота окисляет и гипотиоцианит. Ранее
показано, что при обратном соотношении концентраций реагентов в плазме крови
тиоцианат “нейтрализует” практически всю хлорноватистую кислоту (99.93 %). Полученные в настоящей работе данные свидетельствуют о том, что SCN‒ является редокс буфером, который предотвращает модификацию корриновой структуры аквакобаламина и его дальнейшее разрушение хлорноватистой кислотой. Хотя при взаимодействии хлорноватистой кислоты и тиоцианата также образуется сильный окислитель – гипотиоцианит, его деструктивное действие на аквакобаламин намного слабее,
чем действие хлорноватистой кислоты.
Методами спектрофотометрии и MALDI-масс-спектрометрии показано, что в
нейтральных средах добавки иодида ([ClO–/HOCl]0 : [I‒]0 = 1:1) практически не влияют на взаимодействие гипохлорита с аквакобаламином – продуктами, как и в отсутствие иодида, являются хлорированные кобаламины. Протекторные свойства иодида
проявляются только при его избытке. Установлено также, что другое иодсодержащее
соединение – иодат не реагирует с аквакобаламином в нейтральной и щелочной среде
и не влияет на реакцию аквакобаламина с гипохлоритом.
В MALDI-масс-спектре продукта реакции H2O–Cbl(III) с ClO–/HOCl в присутствии избытка бромида калия зафиксированы максимумы при m/z = 1409.53 и
1447.92, которые соответствуют ионам [Cbl + Br]+ и [Cbl ‒ H + K + Br]+. Полученные
результаты дают основание полагать, что реакция H2O–Cbl(III) с ClO–/HOCl в присут-
12
ствии Br‒ протекает через образование монобромированного производного кобаламина.
Добавление избытка бромида к смеси H2O‒Cbl(III) – ClO–/HOCl приводит к
значительному увеличению скорости накопления модифицированных корриноидов,
очевидно, вследствие окисления бромида до бромноватистой кислоты (k = 1.55 ×103
л/(моль×с), реакция 9).
HOCl + Br‒ → HOBr + Cl‒
(9)
Кинетика реакции H2O‒Cbl(III) с BrO–/HOBr изучена методом остановленного
потока. Кинетические кривые описываются уравнением экспоненты, что свидетельствует о первом порядке реакции по аквакобаламину. Анализ зависимости ln(kнабл.7) –
ln([BrO–/HOBr]) показал, что частный порядок реакции по гипобромиту равен 1.28.
Очевидно, в ходе быстрой реакции между H2О–Cbl(III) и BrO–/HOBr образуется
бромсодержащий интермедиат, который модифицирует аквакобаламин более медленно, чем HOBr. Скорость реакции возрастает при уменьшении pH, что обусловлено
образованием реакционноспособной бромноватистой кислоты. При добавлении тиоцианата в раствор, содержащий H2О–Cbl(III) и HOBr, наблюдаются незначительные
спектральные изменения, сопровождающиеся ростом оптической плотности при 560
нм и уменьшением максимума при 350 нм. Следовательно, тиоцианат, как и в случае
с HOCl, защищает H2О–Cbl(III) и от модификации корринового кольца бромноватистой кислотой. Тиоцианат замедляет скорость образования монобромированных производных кобаламина в ходе реакции H2О–Cbl(III) и BrO–/HOBr. Константа скорости
модификации H2О–Cbl(III) практически равна нулю при соотношении концентраций
[BrO–/HOBr]0 : [SCN‒]0 = 1:1. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о
сильных антиоксидантных свойствах тиоцианата. Его защитное действие в реакциях
модификации аквакобаламина хлорноватистой и бромноватистой кислотами основано
на образовании менее реакционноспособного, чем HOCl и HOBr, гипотиоцианита.
Эти взаимодействия играют важную физиологическую роль и позволяют контролировать уровень витамина В12 при различных патологических состояниях, возникновение которых сопровождается повышением концентраций HOCl и HOBr. Отметим
также, что введение добавок всех исследованных соединений не приводит к образованию «стабильных желтых корриноидов» (гидроксилированных продуктов). Это
подтверждает сделанный выше вывод о том, что кобаламины (III) не образуют эти
модифицированные продукты, и для их возникновения необходимо присутствие кобаламина (II).
В параграфе 2.2.4 рассматриваются результаты исследований взаимодействия
кобаламина (II) с периодатом. Спектрофотометрические и масс-спектрометрические
данные показали, что в результате реакции образуется аквакобаламин, модификация
корринового кольца не наблюдается. Титрованием Cbl(II) периодатом при рН 7.4 определена стехиометрия реакции. Установлено, что полное окисление Cbl(II) происходит при соотношении [IO4‒]0 : [Cbl(II)]0= 1 : 2.
Изучена кинетика взаимодействия Cbl(II) с периодатом. В присутствии избытка
периодата скорость реакции слишком высока для ее определения методом остановленного потока во всем диапазоне рН. Поэтому измерения проводились с использованием избытка кобаламина(II) по отношению к периодату (реализуемый в данном разделе подход к обработке кинетических данных был описан ранее в разделе, в котором
рассматриваются данные по кинетике реакции глутатионилкобаламина и гипохлори-
13
та). Кинетические кривые в диапазоне рН 10.1–12.3 описываются уравнением экспоненты (рис. 7), что свидетельствует о первом порядке реакции по периодату.
A535
k'210- 4, л/(моль  с)
0,455
30
0,450
25
0,445
20
0,440
15
0,435
10
0,430
0,425
5
0,0
0,2
0,4
, с
0,6
0,8
Рис. 7. Кинетическая кривая реакции
Cbl(II) и периодата при рН 10.8,
[Cbl(II)]=1×10-4 моль/л, [IO4−]0 = 5×10-6
моль/л, 25 °C
0
10,0
10,5
11,0
рН
11,5
12,0
12,5
Рис. 8. Зависимость наблюдаемой константы скорости реакции (k′2) от рН,
25°C
Зависимость наблюдаемой константы скорости от концентрации Cbl(II) линейна, что указывает на первый порядок реакции по кобаламину.
По значениям тангенсов угла наклона зависимости kнабл. от [Cbl(II)] рассчитана
наблюдаемая константа скорости реакции (k′2) при различных pH. Установлено, что
скорость реакции Cbl(II) с IO4‒ возрастает при уменьшении pH (рис. 8). Это объясняется участием периодата в кислотно-основных равновесиях и образованием в более
кислых средах форм, обладающих сильными окислительными свойствами. Известно,
что периодат принимает участие в реакциях 10-12, значения pKa для которых составляют 0.98, 7.42 и 10.99, соответственно. Сопоставление значений pKa реакций 10-12
показывает, что при анализе pH зависимости констант скорости реакции в щелочной
среде можно принимать во внимание только равновесия (11) и (12).
H5IO6 ↔ H4IO6- + H+ (pKa1 = 0.98)
H4IO6- ↔ H3IO62- + H+ (pKa2 = 7.42)
H3IO62- ↔ H2IO63- + H+ (pKa3 = 10.99)
(10)
(11)
(12)
Исходя из предположения, что активными частицами в реакции с Cbl(II) в щелочной среде являются H4IO6−, H3IO62− и H2IO63−, получено уравнение 13, которое хорошо описывает экспериментальные данные.
С использованием этого уравнения определены константы скорости реакции
Cbl(II) с H4IO6− (k21) и H3IO62− (k22): k21 = (1.2 ± 0.1)×108 и k22 = (7.9 ± 1.3)×104
л/(моль×с) (25 °C). Константа скорости с участием H2IO63− (k23) близка к нулю.
14
10 pH
k '2  k21  pH

10  10 pKa 2
10( pHpKa 2 )
 k22  ( pKa 2 pH)

( pK a 2  pK a 3 )
2( pH)
10
 10
 10
10pKa 3
 k23  pH
10  10pKa 3
(13)
На основании полученных данных предложен механизм окисления Cbl(II) периодатом. На первой стадии происходит одноэлектронное восстановление H4IO6− и
H3IO62− с образованием радикалов I(VI) (реакция 14).
Cbl(II) + H4IO6− (или H3IO62−) → Н2ОCbl(III)/HO‒‒Cbl(III) + H2IO5•2‒
Cbl(II) + H2IO5• 2‒ → Н2ОCbl(III)/HO‒‒Cbl(III) + IO3‒
(14)
(15)
Известно, что в ходе импульсного фотолиза и радиолиза возможно образование
различных форм иода (VI), которые медленно трансформируются друг в друга, вследствие процессов гидратации-дегидратации. Показано, что в диапазоне 8 < рН < 11
наиболее стабильными радикалами I(VI) в растворах являются H2IO52•‒ и H5IO6•‒. В
ходе второй стадии реакции Cbl(II) с периодатом происходит более быстрое восстановление образовавшихся радикалов кобаламином(II) с образованием иодата (реакция
15) (установлено, что реакция между Cbl(II) и иодатом в нейтральной и щелочной
среде не протекает).
Таким образом, результаты исследования реакции кобаламина (III) и его восстановленной формы – кобаламина (II) с периодатом показывают, что IO4- практически «безопасен» для витамина B12, т.к. в его присутствии модифицированные кобаламины не образуются.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Основные результаты и выводы
1. Определены кинетические параметры реакций аквакобаламина и кобаламина
(II) с гипохлоритом, хлоритом, диоксидом хлора и периодатом, а также реакции глутатионилкобаламина с гипохлоритом в водных растворах.
2. Определен состав промежуточных и конечных продуктов реакций аквакобаламина и кобаламина (II) с галогенокислородными соединениями. Показано, что
взаимодействие корринового лиганда аквакобаламина с гипохлоритом в водных растворах включает стадии образования хлорированных продуктов и их последующего
разрушения. При взаимодействии кобаламина (II) с гипохлоритом и хлоритом на
промежуточных стадиях процесса модификации корринового кольца образуются гидроксилированные продукты. Установлено, что продуктами процесса модификации
корринового кольца аквакобаламина диоксидом хлора являются оксигенированные
корриноиды. Предложены механизмы реакций окисления кобаламинов галогенокислородными соединениями.
15
3. Показано, что наличие глутатионильного лиганда в кобаламине приводит к
стабилизации корринового кольца в окислительных условиях.
4. Показано, что, в отличие от хлорокислородных соединений, периодат не
взаимодействует с корриновым лигандом восстановленного кобаламина (Cbl(II)).
5. Установлено, что добавки тиоцианата и иодида стабилизируют корриновые
комплексы кобальта в присутствии гипохлорита (хлорноватистой кислоты); в присутствии же бромида скорость процессов модификации кобаламинов гипохлоритом увеличивается. Указанные эффекты объяснены образованием в системе кобаламингипохлорит-тиоцианат (иодид, бромид) промежуточных соединений – HOSCN, HOClI
и HOBr, соответственно.
Рекомендации по использованию результатов работы
Выявленная в настоящей работе роль тиоцианата как протектора витамина B12
при его окислении позволяет по-новому взглянуть на взаимодействие этих важных
биологически активных веществ. Обнаруженная новая функция компонента лактопероксидазной системы - тиоцианата будет способствовать более полному пониманию
его роли в организме.
Перспективы разработки темы исследования
Обнаруженный в настоящей работе эффект стабилизации кобаламина в присутствии глутатиона указывает на необходимость дальнейшего исследования влияния
тиолов на стабильность витамина B12 в окислительных условиях.
Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:
1. Dereven'kov, I.A. Reactions of aquacobalamin and cob(II)alamin with chlorite and chlorine dioxide / I.A. Dereven'kov, N.I. Shpagilev, L. Valkai, D.S. Salnikov, A.K. Horváth,
S.V. Makarov // J. Biol. Inorg. Chem. – 2017. – V. 22. – P. 453-459.
2. Dereven'kov, I.A. Studies on reaction of glutathionylcobalamin with hypochlorite. Evidence of protective action of glutathionyl-ligand against corrin modification by hypochlorite
/ I.A. Dereven'kov, S.V. Makarov, N.I. Shpagilev, D.S. Salnikov, O.I. Koifman // Biometals. – 2017. – V. 5. – P. 757-764.
3. Шпагилев, Н.И. Взаимодействие кобаламина (II) с хлоритом и диоксидом хлора /
Н.И. Шпагилев, И.А. Деревеньков, Д.С. Сальников, С.В. Макаров // В сб. тезисов IV
Всероссийской конференции по органической химии. – Москва. – 2015. – C. 292.
4. Шпагилев, Н.И. Взаимодействие кобаламина (II) и нитроксилкобаламина с хлоритом / Н.И. Шпагилев, И.А. Деревеньков, С.В. Макаров // В сб. тезисов XVIII конференции молодых ученых-химиков Нижегородской области. – Нижний Новгород. –
2015. – C. 98.
5. Шпагилев, Н.И. Взаимодействие кобаламина с гипохлоритом / Н.И. Шпагилев,
И.А. Деревеньков, Д.С. Сальников, С.В. Макаров // В сб. тезисов XII Международной
конференции «Синтез и применение порфиринов и их аналогов» (ICPC-12). – Иваново. – 2016. – C. 175.
6. Шпагилев, Н.И. Взаимодействие кобаламина с хлоритом, гипохлоритом и диоксидом хлора / Н.И. Шпагилев, И.А. Деревеньков, С.В. Макаров // В сб. тезисов XIX Мо-
16
лодѐжной конференции-школы по органической химии. – Репино, Санкт-Петербург. –
2016. – C. 324.
7. Шпагилев, Н.И. Взаимодействие кобаламина(II) и нитроксилкобаламина с хлоритом / Н.И. Шпагилев // В сб. тезисов Всероссийской школе-конференции «Фундаментальные науки – специалисту нового века» (студенческая научная конференция «Дни
науки в ИГХТУ»). – Иваново. – 2017. – C. 197.
8. Shpagilev, N.I. Reaction of glutathionylcobalamin with hypochlorite / N.I. Shpagilev,
I.A. Dereven’kov, S.V. Makarov // In the Book of Abstracts of 27th International Chugaev
Conference on Coordination Chemistry. – Nizhny Novgorod. – 2017. – P. 164.
9. Шпагилев, Н.И. Влияние тиоцианата, иодида и бромида на реакцию аквакобаламина с гипохлоритом / Н.И. Шпагилев // В сб. тезисов Всероссийской школеконференции «Фундаментальные науки – специалисту нового века» (студенческая
научная конференция «Дни науки в ИГХТУ»). – Иваново. – 2018. – C. 35.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
6
Размер файла
1 144 Кб
Теги
кобаламинов, соединения, взаимодействия, галогенокислородными
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа