close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Влияние 24-гидроксихолестерина на нервно-мышечную синаптическую передачу

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Касимов Марат Ринатович
ВЛИЯНИЕ 24-ГИДРОКСИХОЛЕСТЕРИНА НА НЕРВНО-МЫШЕЧНУЮ
СИНАПТИЧЕСКУЮ ПЕРЕДАЧУ
03.03.01 – физиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Самара – 2017
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном
учреждении высшего образования «Казанский государственный медицинский университет»
Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Научный руководитель:
Официальные оппоненты:
Петров Алексей Михайлович доктор биологических
наук, доцент кафедры нормальной физиологии Каз
ГМУ, ведущий научный сотрудник лаборатории
биофизики синаптических процессов Казанского ИББ
РАН
биологических
наук,
профессор,
заведующая
кафедрой физиологии и фармакологии ФГБОУ ВО
«Казанская государственная академия ветеринарной
медицины им. Н. Э. Баумана», г. Казань
Маслюков Петр Михайлович – доктор медицинских
наук, профессор, заведующий кафедрой нормальной
физиологии с биофизикой ФГБОУ ВО ЯГМУ
Минздрава России, г. Ярославль
Каримова
Руфия
Габдельхаевна – доктор
Ведущее научное учреждение:
ФГБОУ
ВО
«Московский
государственный
университет имени М.В. Ломоносова», кафедра
физиологии человека и животных биологического
факультета, г. Москва
Защита диссертации состоится «12» сентября 2018 г. в 12.00 часов на заседании
диссертационного совета Д 208.085.03 при Федеральном государственном бюджетном
образовательном учреждении высшего образования «Самарский государственный
медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (443079,
г. Самара, пр. К. Маркса, 165 Б).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке (443001, г. Самара, ул.
Арцыбушевская, 171) и на сайте (http://www.samsmu.ru/science/referats) Федерального
государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования
«Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения
Российской Федерации.
Автореферат разослан «___» __________ 2018 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор медицинских наук, профессор
Бабанов С.А.
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования
Химическая синаптическая передача происходит в результате освобождения
нейромедиатора из пресинаптического нервного окончания. Молекулы нейромедиатора
упакованы в синаптические везикулы, которые сливаются со специализированными
областями на пресинаптической мембране (активными зонами) для высвобождения
нейромедиатора. После обнажения участков мембраны везикул внеклеточной среде
механизм эндоцитоза возвращает специфичные для везикул компоненты во вновь
образованные везикулы, которые затем заполняются нейромедиатором для следующего
этапа экзоцитоза. В нервно-мышечном синапсе только малое количество синаптических
везикул прикреплены к активной зоне, тогда как основная часть везикул сосредоточена в
цитоплазме (Slater, 2015). Везикулы, не прикрепленные к активной зоне, имеют различные
свойства: 10-20% везикул легко участвует в нейропередаче благодаря повторному
рециклированию (рециклирующий пул); 80-90% везикул составляют резервный пул
(Richards et al., 2000). Эффективность освобождения нейромедиатора в течение длительной
и/или интенсивной активности зависит от вероятности экзоцитоза в ответ на потенциал
действия, повторного использования везикул и вовлечения новых синаптических везикул
(Betz and Bewick, 1993; Petrov et al, 2008; Richards et al., 2000). Таким образом, вследствие
синаптической активности везикулярная мембрана проходит цикл «перемещения» в нервном
окончании.
Везикулярный цикл строго регулируемый процесс, который сильно зависит от наличия
холестерина. Холестерин участвует в везикулярных процессах в пресинаптической области
различными путями, и снижение количества холестерина приводит к угнетению вызванного
экзоцитоза, эндоциоза и везикулярного транспорта (Petrov et al., 2011, 2014; Zamir and
Charlton, 2006). При физиологических условиях основным механизмом снижения
мембранного холестерина в мозге является его окисление (ферментом CYP46A1) в 24гидроксихолестерин (24(S)-гидроксихолестерин, 24-ГХ), что потом может усилить транспорт
мозгового холестерина путем активации цитоплазматических Liver X-рецепторов (Lütjohann
et al., 1996). Возможность влияния 24-ГХ на физиологические процессы за пределами мозга
до сих пор плохо изучена. Хотя выглядит интересным предположение, что выведенный из
мозга 24-ГХ способен вносить изменения в функционирование периферических тканей.
В целом, вопрос о роли оксисленных производных холестерина в регуляции
синаптической передачи и, в частности, пресинаптического везикулярного траффика
остается слабо изученным. Хотя повышение продукции определенных оксистеринов может
происходить в ходе усиленной синаптической активности, а также развитии патологических
процессов. Учитывая наличие ткане-специфичных окисленных форм холестерина, большое
разнообразие оксистеринов, а также их высокую проникающую способность, можно
предположить значение оксистеринов во вне- и внутриклеточной сигнализации.
Степень еѐ разработанности
Образование 24-ГХ происходит в основном нейронах в области синапсов и
увеличивается вследствие повышенной глутаматергической передачи (Sodero et al., 2012).
24-ГХ может способствовать началу длительной потенциации путем положительной
аллостерической модуляции глутаматных NMDA-рецепторов (Linsenbardt et al., 2014; Paul et
al., 2013). Однако неизвестно может ли 24-ГХ изменять пресинаптические процессы.
Уровень 24-ГХ в мозге варьирует в пределах 10-30 мкМ (Lütjohann et al., 1996) и может
4
значительно изменяться при патологических состояниях. 24-ГХ способен проходить через
гематоэнцефалический барьер, попадая в кровоток, где его концентрация определяется
разницей между синтезом в мозге и выведением печенью (Bretillon et al., 2000; Leoni and
Caccia, 2013; Petrov et al., 2016). Влияние 24-ГХ на нейропередачу и функционирование
синапса за пределами ЦНС до сих пор слабо изучено. Принимая во внимания, что активные
двигательные нейроны могут быть важными продуцентами 24-ГХ, гипотетическое влияние
плазматического 24-ГХ на нервно-мышечные синапсы способно обеспечить
дополнительную гуморальную связь между мотонейронами и периферическим синапсом.
Цели и задачи
Цель данной работы – изучить влияние 24-гидроксихолестерина на синаптическую
передачу в нервно-мышечных соединениях.
Для достижения этой цели были выдвинуты следующие задачи:
1. Исследовать эффект 24-гидроксихолестерина на спонтанное и вызванное освобождение
нейромедиатора в нервно-мышечном синапсе мыши
2. Оценить влияние 24-гидроксихолестерина на экзо- и эндоцитоз синаптических везикул в
двигательном нервном окончании мыши при высокочастотной активности
3. Выявить зависимость эффектов 24-гидроксихолестерина от глутаматных NMDA
рецепторов в нервно-мышечном соединении мыши
4. Оценить зависимость эффектов 24-гидроксихолестерина от продукции оксида азота II
(NO) в нервно-мышечном синапсе мыши
Научная новизна
Проведенное нами исследование позволило выявить высокую чувствительность
нервно-мышечной передачи (в частности, пресинаптического везикулярного цикла) к 24-ГХ.
Впервые обнаружено, что в субмикромолярных концентрациях 24-ГХ усиливает нервномышечную передачу, ускоряя пресинаптический везикулярный цикл. Расшифрован
механизм этого феномена, который оказался связан со снижением продукции оксида азота
эндотелиальной изоформой NO-синтазы, которая в условиях активации синапса
ограничивает экзоцитоз синаптических везикул. Также впервые получены данные о том, что
активация глутаматных NMDA рецепторов в нервно-мышечном синапсе препятствует
развитию эффектов 24-ГХ.
Теоретическая и практическая значимость работы
В работе получены новые данные существенно расширяющие представления о
регуляции синаптической передачи, в частности пресинаптических везикулярных процессов,
окисленным производным холестерина. Учитывая, что усиленное окисление холестерина
наблюдается при патологических состояниях (Leoni and Caccia, 2011), а также локально
происходит при синаптической активности (Sodero et al., 2011, 2012), полученные данные
указывают на возможную роль оксистеринов в развитии, с одной стороны, синаптической
дисфункции, а с другой – синаптической пластичности. 24-ГХ вырабатывается
преимущественно нейронами ЦНС, проникая в кровоток (Björkhem et al., 1997, 2006;
Lütjohann et al., 2000). Открытие его влияния на нервно-мышечную передачу и зависимую от
оксида азота (II) сигнализацию порождают гипотезу о наличии у 24-ГХ нейрогормональной
роли. Возможно, представленная работа будет полезна для будущих молекулярных
исследований по выявлению оксистерин связывающих сайтов в синапсах. Таким образом,
представленное исследование вносит существенный вклад в развивающуюся концепцию о
производных холестерина как мощных регуляторов физиологических функций, на основе
которых возможно конструирование новых фармакологических подходов.
5
Методология и методы исследования
Исследование синаптической нервно-мышечной передачи проводилось на
изолированной мышце диафрагмы самцов половозрелых мышей массой тела 22-25 г.
Использовали флуоресцентный метод с применением красителей FM1-43 и DAF-FM для
оценки везикулярных процессов и продукции оксида азота, а также электрофизиологический
одномикроэлектродный метод фиксации потенциалов концевой пластинки с помощью
внутриклеточных стеклянных микроэлектродов. Для обработки экспериментов
использовалось программное обеспечение Cell^P и ImagePro. Статистический анализ
проводился на программном обеспечении Origin 9.2 (OriginLab Corp.).
Связь темы диссертации с планом основных научно-исследовательских работ
университета
Работа выполнена в рамках комплексной научной темы кафедры нормальной
физиологии ФГБОУ ВО «Казанский ГМУ» Минздрава России. Номер государственной
регистрации темы А16-116012910018-6.
Работа поддержана грантом РФФИ №16-34-00127 мол_а.
Положения, выносимые на защиту
1.
Нервно-мышечная передача в диафрагмальной мышце обладает выской
чувствительностью к 24-гидроксихолестерину. 24-гидроксихолестерин способствует
вовлечению синаптических везикул в экзоцитоз и ускоряет их рециклирование.
2.
Эффект 24-гидроксихолестерина на экзоцитоз синаптических везикул связан с
ослаблением зависимой от NO сигнализации и модулируется активацией глутаматных
NMDA рецепторов.
Степень достоверности и апробация результатов
Достоверность результатов подтверждена достаточным количеством проведеных
экспериментов, решением поставленных задач, статистической обработкой полученных
данных.
Основные данные и результаты диссертации представлены и доложены на следующих
конференциях: на международной конференции молодых ученых «Экспериментальная и
теоретическая биофизика» (Пущино, 2013, 2015), 88, 89, 90-ой всероссийской научнопрактической конференции студентов и молодых ученых (Казань, 2014, 2015, 2016),
международном симпозиуме «Biological motility» (Пущино, 2016), российской конференции
с международным участием памяти профессора В.С. Маркашина «Experimental and
computational biomedicine» (Екатеринбург, 2016), на заседании кафедры нормальной
физиологии Казанского государственного медицинского университета.
Публикации
По теме диссертации 43 публикации, среди которых 7 статей в журналах, включенных
в список ВАК и реферативную базу SCOPUS.
Личный вклад диссертанта в исследования
Составление плана исследования, схем экспериментов, проведение экспериментов,
обработка, анализ, интерпретация полученных данных, оформление публикаций
осуществлены при личном участии соискателя.
Структура диссертации
Диссертационная работа включает введение, обзор литературы, описание материалов и
методов исследования, результаты, их обсуждение, выводы и список использованной
литературы. Работа изложена на 116 страницах машинописного текста, включает 15
6
рисунков и одну таблицу. Список использованной литературы содержит 277 источников, из
них 274 иностранных авторов.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты и растворы. Эксперименты проведены на изолированной мышце диафрагмы
самцов половозрелых мышей массой тела 22-25 г. После предварительной анестезии –
внутрибрюшинной инъекции пентобарбитала натрия (40 мг/кг) – животным проведена
декапитация гильотиной и через торакальный доступ осуществлено извлечение мышцы.
Всего использовано 645 животных. Протоколы экспериментов отвечают требованиям EU
Directive 2010/63/EU и одобрены локальным этическим комитетом Казанского
государственного медицинского университета.
Электрофизиологические исследования. Запись потенциалов концевой пластинки
(ПКП) и миниатюрных потенциалов концевой пластинки (МПКП) проводилась
стандартными внутриклеточными стеклянными микроэлектродами (диаметр кончика ~1
мкм, сопротивление 10-30 МΩ), заполненные 2.5 М KCl. Установка для записи сигналов
включала усилитель Model 1600 (A-M System) и LA II digital I/O board (Пущино, Россия) с
использованием локального записывающего программного обеспечения. Нервы раздражали
всасывающим электродом, соединенным с внеклеточным стимулятором (DS3 Digitimer Ltd.,
UK) сверхпороговыми электрическими импульсами длительностью 0.1 мс. С целью
предотвращения мышечных сокращений за 20 минут до записи в основной раствор
добавлялся 0.5 мкМ μ-конотоксина GIIIB.
Флуоресцентная микроскопия. Изображения были получены с помощью
конфокального Disk Speed Unit микроскопа Olympus BX51WI и объективов UPLANSapo
60хw, LumPlanPF 100xw. Снимки сделаны с помощью камер DP71 (Olympus) и Orca R2
(Hamamatsu) CCD. Анализ изображений произведѐн с помощью программного обеспечения
Cell^P (Olympus) и ImagePro software (Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA). Анализ
интенсивности флуоресценции в интересующих областях проводился в относительных
единицах (о.е.), которые затем конвертировались в проценты. Регистрировались только
поверхностно расположенные нервные окончания.
Загрузка и выгрузка красителя FM. Флуоресцентный маркер FM1-43 использовали
для измерения скорости экзо- и эндоцитоза синаптических везикул. Данный маркер
обратимо связывается с плазматической мембраной и захватывается синаптическими
везикулами во время процесса эндоцитоза (Betz and Bewick, 1993). Для регистрации
интенсивности флуоресценции FM1-43 использовали фильтр возбуждения 480/20 нм,
дихроичное зеркало и эмиссионный фильтр 535/40 нм. Фоновое свечение рассчитывали как
среднюю интенсивность флуоресценции в области (4х20 мкм2) за пределами нервного
окончания. Интенсивность свечения нервного окончания была определена как средняя
интенсивность свечения пиксела в интересующих областях за вычетом фонового свечения
(Petrov et al., 2008). Для анализа динамики выгрузки уровень первоначальной флуоресценции
нервного окончания (до стимуляции) был принят за 1.0.
Измерение продукции оксида азота (NO). Продукты окисления оксида азота были
обнаружены благодаря использованию проникающего через клетку красителя DAF-FMдиацетата, который возбуждается светом с длиной волны 495 нм. Для записи свечения DAFFM был использован эмиссионный фильтр, который пропускает свет с длиной волны между
505-560 нм.
7
Статистический анализ. Результаты экспериментов представлены как среднее
значение ± стандартная ошибка среднего, где n – это количество независимых экспериментов
(различные животные), статистическая достоверность оценивалась критерием Стьюдента
или ANOVA (для параметрических данных) с последующей коррекцией Бонферрони или
теста Манна-Уитни (для непараметрических данных).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Эффекты 24-ГХ на спонтанную и вызванную секрецию нейромедиатора.
Во время аппликации 0.4 или 4 мкМ 24-ГХ не наблюдалось изменений амплитуды,
времени нарастания и времени спада миниатюрных ПКП (n=8 /8) (Рис. 1). Также не отмечено
изменений частоты миниатюрных ПКП (Рис. 1). С другой стороны, 24-ГХ повышает
амплитуду ПКП на 18±4% (0.4 мкМ, n=8, p˂0.05 парный t-тест) и 12±3% (4 мкМ, n=7, p˂0.05
парный t-тест), не действуя на время нарастания и спада ПКП в ответ на одиночные стимулы
(при частоте 0.02 Гц) (Рис. 1Б). Повышение амплитуды ПКП свидетельствует об усилении
освобождения нейромедиатора, вызванного низкочастотной активностью. Следует отметить,
что кривая зависимости ответа от концентрации для стимулирующего действия 24-ГХ на
амплитуду ПКП, вызванного одиночным стимулом, оказалась достаточно крутой (Рис. 1В),
что указывает на то, что эффект данного оксистерина может зависеть от механизма,
обладающего высоким сродством и быстрым насыщением.
*
Контр.
15 мин
4 мкМ
0.0
AМПКП
ЧМПКП
В
0.4 мкМ
10
мВ
25
0
4 м кМ 24 -ГХ
0.4 мкМ
*
Кон трол ь
4 м кМ
0.4 мкМ
4 м кМ
0.5
0.4 мкМ
Э ф ф ект 24-Г Х
1.0
Кон трол ь
Контр.
15 мин
0.5
мВ
2 мс
А м пл ит уд а ПК П , м В
50
15 мин
Контр.
5 мс
15 мин
Контр.
4 мкМ
*
20
Увеличение AПКП в %
Б
0.4 мкМ 2 4-Г Х
А
*
10
*
0
0.01 0.1
1
[24-ГХ ], мкМ
Рис. 1. Эффекты 24-ГХ на спонтанную и вызванную одиночным стимулом секрецию
нейромедиатора. А – Гистограммы показывают эффект 24-ГХ (0.4 и 4 мкМ) на
максимальную амплитуду (АМПКП) и частоту (ЧМПКП) МПКП. Справа, стандартные сигналы
миниатюрных ПКП до и через 15 мин после добавления 24-ГХ. Б – Гистограммы
показывают среднюю амплитуду ПКП (в мВ) вызванную низкочастотной стимуляцией (0.02
Гц) в контроле и после 15 минут действия 0.4 или 4 мкМ 24-ГХ. Звездочка показывает
значимость различий (*p˂0.05). В – кривая зависимости ответа от концентрации для
опосредованного 24-ГХ увеличения средней амплитуды ПКП (АПКП, в %), вызванный
одиночным стимулом.
Высокочастотная стимуляция с частотой 20 Гц более близко отражает ситуацию in vivo
(Funk and Parkis, 2002; Slater, 2015) и эффективность нейропередачи сильно зависит от
трафика неприкрепленных синаптических везикул к активным зонам и рециклирования
везикул (Petrov et al., 2008; Reid et al., 1999; Richards et al., 2000). Высокочастотная
стимуляция в контрольном растворе привела к двухфазному снижению амплитуды ПКП
8
(Рис. 2А): первичный быстрый спад с последующим медленным длительным снижением до
51±3% (p˂0.001, n=9) к 3 мин активности.
После предварительной аппликации 24-ГХ вторая фаза спада амплитуды ПКП была
значительно медленнее. Амплитуда снизилась только до 61±3% (p*˂0.05 в сравнении с
контрольной кривой, n=9) или до 63±4% (p*˂0.05, n=9) к 3 мин стимуляции в случаях
предварительной обработки 0.4 и 4 мкМ 24-ГХ, соответственно. Суммирование амплитуд
ПКП позволяет измерить общее вызванное освобождение нейромедиатора пачкой стимулов
с частотой 20 Гц в течение 3 мин (Рис. 2Б). Предварительная аппликация 0.4 или 4 мкМ 24ГХ значительно повышает кумулятивную амплитуду ПКП до 31.1±2.1% (p*˂0.01) или
30.7±2.9% (p*˂0.01), соответственно.
100
Амплитуда ПКП, %
Контр.
60
180
24-ГХ
0.4 мкМ
4 мкМ
80
5 мс
10
мВ
0
60
24-ГХ
0.4 мкМ
180
60
0
Контроль
60
180
40
0
60
120
Время, с
180
24-ГХ
4 мкМ
Б 120000
 амплитуд ПКП, мВ
0
А
24-ГХ
0.4 мкМ
4 мкМ
80000
Контроль
40000
0
0
60
120
Время, с
180
Рис. 2. Эффекты 24-гидроксихолестерина на вызванную высокочастотной стимуляцией
секрецию нейромедиатора. А – Изменения амплитуды ПКП (в %) во время пачки стимулов в
контроле и предварительно обработанных 24-ГХ препаратах. Справа характерные примеры
сигналов ПКП на 0, 60, 180 с стимуляции двигательного нерва с частотой 20 Гц. Б –
Кумулятивные кривые амплитуд ПКП (в мВ) при стимуляции с частотой 20 Гц. Среднее
значение ± стандартная ошибка среднего.
Эффекты 24-ГХ на загрузку и выгрузку красителя, вызванную высокочастотной
стимуляцией.
Двигательные нервные окончания были загружены маркером FM1-43 стимуляцией с
частотой 20 Гц в течение 1 мин. Одновременно зарегистрированы ПКП. В контрольных
условиях средняя интенсивность свечения нервных окончаний 31.0±1.8 о.е. (n=8, мышечные
волокна - 75). При концентрации 0.4 и 4 мкМ 24-ГХ увеличивает среднюю интенсивность
свечения на 18±6% (n=9, p*˂0.05) и 11±4% (n=9, p*˂0.05), соответственно (Рис. 3А). При
данных условиях в конце пачки стимулов суммарная амплитуда ПКП была больше, чем в
контроле, на 29±1.8% (0.4 мкМ 24-ГХ, p*˂0.01) и на 23±2.1% (4 мкМ 24-ГХ, p*˂0.01).
Принимая во внимание, что среднее время рециклирования в нервно-мышечном синапсе
мыши при стимуляции с частотой 20 Гц составляет около 1 мин при контрольных условиях
(Zefirov et al., 2008), различия между величинами загрузки маркера FM1-43 и общим
освобождением нейромедиатора в препаратах, обработанных 24-ГХ согласуются с
предположением, что некоторые синаптические везикулы повторно участвуют в
рециклировании в течение 1 мин стимуляции (Kasimov et al., 2015). Полученные результаты
9
24-ГХ
A
Б
*
*
Интенсивность, отн.ед.
40
24-ГХ
1.0
Контроль
Контроль
0,4 мкМ
И/Имакс
0.8
4 мкМ 24-ГХ
10
0,4 мкМ 24-ГХ
20
Контроль
30
24-ГХ
4 мкM 0,4 мкM Контроль
показывают, что 24-ГХ увеличивает загрузку маркера путем процесса эндоцитоза и
рециклирования синаптических везикул в течение высокочастотной активности.
Снижение интенсивности свечения FM1-43 в ответ на стимуляцию (выгрузка) отражает
высвобождение маркера из синаптических везикул во время процесса экзоцитоза. После 3
мин стимуляции с частотой 20 Гц интенсивность свечения FM1-43 снизилась до 65.6±2.4%
(n=11, p˂0.001 в сравнении со значением до стимуляции). Обработка препаратов 0.4 или 4
мкМ 24-ГХ увеличивала скорость выгрузки красителя (Рис. 3Б). Интенсивность свечения к 3
мин высокочастотной стимуляции снизилась до 52.3±3.2% (0.4 мкМ 24-ГХ n=12, p*˂0.05) /
48.7±3.1% (4 мкМ 24-ГХ; n=11, p˂0.05). Таким образом, 24-ГХ потенцирует участие
синаптических везикул, содержащих FM1-43, в ответ на высокочастотную стимуляцию.
0
60
180
400
500
600
600с
0.6
24-ГХ
0.4
4 мкM
4 мкМ
0
0
100
200
300
Время , с
Рис. 3. Эффекты 24-ГХ на загрузку и выгрузку красителя FM1-43. А – Сверху
представлена схема экспериментов: краситель был добавлен (аппликация FM1-43 – верхняя
горизонтальная серая линия) в ванночку с раствором во время и после 1 мин тетанической
стимуляции (черный прямоугольник). 15-минутная обработка 24-гидроскихолестерином
обозначена светлым прямоугольником. Загрузка FM1-43 (в о. е.), вызванная
высокочастотной стимуляцией (20 Гц, 1 мин) в контроле и после предварительной
аппликации 24-ГХ (0.4 и 4 мкМ). Звездочка показывает значимость различий (p<0.05).
Справа, характерные изображения со светящимися нервными окончаниями. Б – Сверху,
схема экспериментов: после загрузки FM1-43 тетанической стимуляцией в течение 1 мин,
препараты выдерживались в нормальном или содержащем 24-ГХ растворе и затем повторно
стимулировались (20 Гц, второй черный прямоугольник) во время перфузии раствора, не
содержащего FM. Снижение интенсивности свечения FM1-43 (кривые выгрузки) во время
высокочастотной стимуляции в контрольных условиях и после предварительной аппликации
24-ГХ (0.4 или 4 мкМ). Справа, изображения со светящимися нервными окончаниями
непосредственно до стимуляции (0) и в различные временные точки во время стимуляции.
Шкала – 15 мкм.
Было оценено время рециклирования синаптических везикул путем сравнения
кумулятивной кривой амплитуд ПКП и перевернутой кривой выгрузки красителя (Рис. 4).
Точка явного расхождения кривых была на 50-60 с в контроле и 20-30 с в препаратах,
предварительно обработанных 24-ГХ. Это говорит о том, что 24-ГХ (0.4 и 4 мкМ) уменьшает
среднее время рециклирования синаптических везикул.
10
Рис. 4. Эффекты 24-ГХ на время рециклирования синаптических везикул.
Перевернутые кривые выгрузки красителя FM (серые линии из Рис. 3Б) были
масштабированы в соответствии с кумулятивными кривыми амплитуд ПКП (черные линии,
из Рис. 2Б) в ближайшее время после начала стимуляции.
Влияние холестерол-24-гидролазы на загрузку и выгрузку красителя FM.
С целью исключения возможности локального синтеза 24-ГХ мы использовали
противогрибковый препарат, вориконазол, который эффективно ингибирует холестерол-24гидролазу (CYP46A1) с константой ингибирования 11 нМ (Shafaati et al., 2010). Вориконазол
(0.2 и 1 мкМ) был добавлен в ванночку за 1 час до загрузки или выгрузки FM1-43 и оставался
в растворе до конца эксперимента. Никаких изменений в свечении FM1-43 не наблюдалось
при любой концентрации, которую мы использовали (Рис. 5А, Б) Дальнейшее увеличение
концентрации вориконазола до 10 мкМ также не влияло на выгрузку красителя FM1-43.
Данные результаты позволяют предположить, что не существует значимого CYP46A1опосредованного локального синтеза 24-ГХ в нервно-мышечном синапсе.
Рис. 5. Загрузка и выгрузка FM1-43 в предварительно обработанных вориконазолом
нервно-мышечных препаратах. А – Гистограмма иллюстрирует эффект вориконазола (0.2 и 1
мкМ) на загрузку красителя FM1-43, вызванную тетанической стимуляцией (20 Гц, 1 мин). Б
– Скорость снижения интенсивности свечения FM1-43 в течение длительной стимуляции с
частотой 20 Гц в нервно-мышечных препаратах, предварительно обработанных
вориконазолом (0.2, 1 или 10 мкM).
Роль NMDA рецепторов в эффектах 24-ГХ.
В субмикромолярных концентрациях 24-ГХ является очень мощным, прямым и
избирательным позитивным аллостерическим модулятором NMDA рецепторов с
11
механизмом действия, который не пересекается с другими аллостерическими модуляторами
(Paul et al., 2013). Субъединицы NMDA рецептора специфически расположены на
постсинаптической мембране нервно-мышечного синапса у мышей и крыс, но совпадают с
рецепторами ацетилхолина (Malomouzh et al., 2011; Mays et al., 2009). Для проверки
возможной роли NMDA рецепторов в эффектах 24-ГХ (0.4 мкМ) мы использовали 2
селективных антагониста AP-5 и MK-801, которые обладают различными механизмами
действия (Рис. 6А, Б). Оба антагониста усиливают выгрузку красителя FM1-43 при
стимуляции с частотой 20 Гц. Интенсивность свечения нервного окончания после 3 мин
стимуляции снизилась до 53±3% (n=9, p*˂0.05) или 48±4% (n=9, p*˂0.05) в нервномышечных препаратах, предварительно обработанных AP-5 или MK-801, соответственно.
Антагонисты NMDA рецепторов усиливают выгрузку красителя FM1-43 схожим с 24-ГХ
образом (p#>0.05 в сравнении с кривой выгрузки в нервно-мышечных препаратах,
обработанных 24-ГХ). Кроме того, при ингибировании NMDA рецепторов аппликация 24-ГХ
снижает интенсивность свечения после 3 мин стимуляции до 40±3% (в обработанных AP-5
препаратах, n=9, p#˂0.05) и 35±3% (в обработанных MK-801 препаратах, n=9, p#˂0.05). Для
исключения возможности применения антагониста NMDA рецептора и 24-ГХ в
ненасыщающих концентрациях, мы применили AP-5 и 24-ГХ в различных концентрациях (от
1 до 250 мМ для AP-5; от 0.04 до 4 мМ для 24-ГХ) для построения кривых зависимости
ответа от концентрации (Рис. 6В, Г). Эффекты представленных концетраций 24гидроксихолестерина (в мкМ): 0.04 (n=7 животных), 0.1 (n=6 животных), 0.2 (n=7 животных),
0.4 (n=12 животных), 4 (n=11 животных). Использованные концентрации АР-5 (в мкМ): 1.0
(n=5 животных), 6.25 (n=5 животных), 12.5 (n=6 животных), 25 (n=9 животных), 250 (n=6
животных). Полученные данные указывают на существенную зависимость ответа от
концентрации, особенно для 24-ГХ, и что использование 0,4 мкМ 24-ГХ и 25 мкМ АР-5
являются достаточными для получения почти максимального эффекта данных соединений на
выгрузку красителя. Отметим, что совместное действие 0,4 мкМ 24-ГХ и 25 мкМ АР-5
вызывала более глубокую выгрузку красителя (см. Рис. 6А, процент обесцвечивания
красителя FM1-43 после 3 мин стимуляции с частотой 20 Гц составлял 60±3%, n=6), что не
достигалось обработкой каждым веществом по отдельности даже при увеличении
концентрации в 10 раз (4 мкМ для 24-ГХ и 250 мкМ для АР-5).
С другой стороны активация глутаматных рецепторов экзогенным глутаматом (в
присутствии глицина) ведет к небольшому снижению скорости выгрузки FM1-43 и
значительному ослаблению эффектов 24-ГХ на динамику выгрузки FM1-43 (Рис. 6Д).
Интенсивность свечения нервных окончаний снижалась до 70.8±1.3% (n=8, p*˂0.05) или
62.4±2.1% (n=8, p#˂0.05, p*>0.05) после 3 мин стимуляции нервно-мышечных препаратов,
выдержанных только в глутамате или в глутамате вместе с 24-ГХ, соответственно.
Содержащийся в синаптических везикулах позвоночных пептид-котрансмиттер Nацетиласпартилглутамат после освобождения в синаптическую щель подвергается гидролизу
до N-ацетиласпартата и L-глутамата ферментом глутамат карбоксипептидазой II (Walder et
al., 2013). Таким образом, длительная активность нерва должна вести к увеличению
концентрации глутамата в синаптической щели и дальнейшей стимуляции
постсинаптических глутаматных рецепторов. Низкочастотная стимуляция нерва (0.2 Гц; 240
стимулов за 20 мин) до пачки стимулов для выгрузки незначительно уменьшала исходную
интенсивность свечения FM1-43 (около ~5%) и не изменяла скорость выгрузки красителя во
время стимуляции с частотой 20 Гц. Интенсивность свечения FM1-43 после 3 мин
стимуляции с частотой 20 Гц снизилась до 67±2.4% (n=8, p*>0.05). С другой стороны,
12
предварительная низкочастотная стимуляция подавляет увеличение выгрузки FM1-43,
вызванное воздействием AP-5 или самого 24-ГХ (Рис. 6Е). При данных условиях
интенсивность свечения нервного окончания после 3 мин высокочастотной стимуляции
снижалась до 66±3% (прекондиционирующая стимуляция совместно с AP-5, n=8, p*>0.05)
или 64±3% (прекондиционирующая стимуляция совместно 24-ГХ; n=8, p*>0.05). Только
совместное воздействие AP-5 и 24-ГХ в сочетании с прекондиционирующей низкочастотной
стимуляцией увеличивало скорость выгрузки FM1-43 по сравнению с контролем. После 3
мин стимуляции с частотой 20 Гц интенсивность свечения снижалась до 58±2% (n=8,
p*˂0.05). В итоге, полученные данные свидетельствуют о том, что выделение эндогенного
глутамата может противодействовать влиянию 24-ГХ на экзоцитоз синаптических везикул и
это, по крайней мере частично, зависит от NMDA рецепторов.
13
Б
A
1.0
1.0
Контроль
24-ГХ
AР-5
AР-5 + 24-ГХ
0.8
И/Имакс
И/Имакс
0.8
Контроль
24-ГХ
MK 801
MK 801+ 24-ГХ
0.6
0.6
0.4
0.4
0.2
0.2
200
В
400
Время, с
600
Процент
обесцвечивания FM1-43
*
*
50
*
0
200
Г
Процент
обесцвечивания FM1-43
0
400
40
*
*
50
0.4
600
Время, с
*
25
40
Контроль
30
0.01
0.1
[24-ГХ], мк M
Контроль
30
1
Д
1
10
[AP-5], мк M
100
Е
1.0
1.0
Контроль
24-ГХ
Глутамат
Глут + 24-ГХ
0.8
И/Имакс
И/Имакс
0.8
Стимуляция
Стим + 24-ГХ
Стим + AP-5
Стим + 24-ГХ + AP-5
0.6
0.6
0.4
0.4
0.2
24-ГХ / AP-5
24-ГХ+AP-5
20 Гц
0.2
0
200
400
Время, с
600
0
0,2 Гц
240 стимулов
200
400
20 Гц
Время, с
600
Рис. 6. Участие глутаматного NMDA рецептора в 24-ГХ-опосредованном усиленном
экзоцитозе синаптических везикул. А, Б – Сравнение кривых выгрузки FM1-43 в нервномышечных синапсах после манипуляций с глутаматэргической сигнализацией с
применением ингибиторов NMDA рецепторов (AP-5 и MK 801). Мы использовали тот же
протокол загрузки и выгрузки описанный в Рис. 3.5. Динамика выгрузки в контроле
(незакрашенные кружки) и в нервно-мышечных препаратах, обработанных только 24-ГХ
(серые кружки), показаны в А, Б, Д, Е как тонкие пунктирные кривые. В, Г – Эффекты 24-ГХ
и AP-5 на выгрузку красителя FM1-43 в зависимости от концентрации. Кривая ответконцентрация показывает средний процент снижения интенсивности свечения FM1-43 (ось
ординат) в нервно-мышечных препаратах под действием 24-гидроксихолестерина (В) или
14
AP-5 (Г) при 3-хминутной стимуляции с частотой 20 Гц. Линии соответствуют уравнению
Хилла. Звездочка показывает значимость различий (*p<0.05) в сравнении с контролем
(обозначен серым квадратом на оси ординат). Д – Сравнение кривых выгрузки красителя при
обработке отдельно глутаматом и совместно с 24-ГХ. Е – Сравнение кривых выгрузки
красителя с применением низкочастотной стимуляции нерва (0,2 Гц, 20 мин,
«прекондиционирование»). Протокол эксперимента показан во вставке.
0.0
Aмпкп Aпкп
10
4
*
Контроль
Глут
Глут + 24-ГХ
80
60
40
0
60
120
Время, с
5
180
Глут+24-ГХ
Глут+24S-ГХ
Глут+24-ГХ
Глут
Глут
0.5
10
мВ
5 мс
Глут
100
1.0
Глут В
+ 24-ГХ
Глут
Контроль
5 мс
Амплитуда ПКП, %
Эффект на амплитуду
2 мс
Б
10
мВ
0.5
мВ
#
А1.5
амплитуд ПКП,х10 мВ
Подавляющее действие экзогенного глутамата и глутамат-опосредованного ослабления
эффекта 24-ГХ было подтверждено регистрацией ПКП с помощью микроэлектродов (Рис.
7А-В). Применение только лишь глутамата или совместно с 24-ГХ незначительно изменяло
амплитуду МПКП. Хотя собственно глутамат не оказывал какого-либо влияния на
амплитуду изолированных ПКП, он предотвращает увеличение амплитуды ПКП, вызванное
24-ГХ (Рис. 7А). Глутамат ускоряет развитие депрессии амплитуды ПКП во время
высокочастотной активности. Амплитуда снизилась до 37±3% (p*˂0.05, n=10) через 3 мин
стимуляции. Кроме того, способность 24-ГХ ослаблять снижение амплитуды полностью
устраналась в присутствии глутамата. При данных условиях амплитуда снизилась до 47±3%
(n=10, p*>0.05, p#˂0.05) к 3 мин стимуляции. Анализ кумулятивных амплитуд позволяет
предположить, что глутамат уменьшает количество освобожденных квантов медиатора во
время 3 мин стимуляции с частотой 20 Гц на 16.3±2.6 % (p*˂0.05) в сравнении с контролем.
При условии совместного применения глутамата и 24-ГХ общая секреция была такой же, как
в контроле, но снижалась (на 25.7±2.2 %, p#˂0.05) по сравнению с применением только лишь
24-ГХ (Рис. 7В).
к 3 мин
Рис. 7. L-глутамат препятствует действию 24-ГХ на секрецию нейромедиатора. А –
Гистограммы показывают эффект отдельного применения глутамата (в присутствии
глицина) и совместного с 24-ГХ на амплитуду МПКП (АМПКП) и ПКП (АПКП), вызванных
единичным стимулом. Б – Снижение амплитуды ПКП при продолжающейся стимуляции с
частотой 20 Гц под действием отдельно глутамата и глутамата совместно с 24-ГХ. А, Б –
Сверху серии сигналов, иллюстрирующих изменения в постсинаптических потенциалах. В –
Сумма амплитуд ПКП (в мВ) во время пачки стимулов с частотой 20 Гц, продолжающаяся 3
мин (из Рис. 7Б). Звездочка показывает значимость различий (p<0.05) в сравнении с
контролем (*) или под действием только глутамата (#).
Регуляция образования оксида азота под действием 24-ГХ и глутамата
15
Для оценки продукции оксида азота в синаптической области мы использовали
флуоресцентный индикатор DAF-FM. Высокочастотная стимуляция приводила к
небольшому повышению интенсивности свечения DAF-FM на 4.1±1.0% (n=12, p^˂0.05 в
сранении с кривой фотобличинга, где интенсивность свечения снизилась на 2.0±0.6% за тот
же период времени, n=10; Рис. 8A). Данное увеличение интенсивности свечения было
подавлено 24-ГХ (0.4 мкМ, p*˂0.05, n=12), но усилено под действием L-глутамата (в
присутствии глицина), интенсивность свечения выросла на 7.8±1% (n=12, p*˂0.05).
Одновременное действие 24-ГХ и глутамата не влияло на изменения интенсивности
свечения DAF-FM в ответ на стимуляцию (n=10, интенсивность свечения выросла на
3.7±0.6%, p*>0.05). Полученные данные указывают, что 24-ГХ угнетает образование оксида
азота во время синаптической активности, тогда как глутамат имеет противоположный
эффект и может конкурировать с 24-ГХ в регулировании уровня оксида азота. Следует
отметить, пока мы наблюдали относительно небольшие изменения в интенсивности свечения
DAF-FM, подобное небольшое увеличение уровня оксида азота может существенно повлиять
на синаптическую передачу в результате активации каскадов сигнальных путей
(Odnoshivkina et al., 2017). С целью определения источника оксида азота мы использовали
два изоформ-специфичных ингибитора NO-синтазы: кавтратин (ингибитор эндотелиальной
NO-синтазы) и 1-(2-трифлуорометилфенил)имидазол (TRIM, ингибитор нейрональной и
индуцибельной NO-синтазы). Предварительная обработка любым из этих ингибиторов
частично подавляла рост интенсивности свечения DAF-FM во время высокочастотной
активности (Рис. 8В). В присутствии кавтратина или TRIM интенсивность свечения возросла
только лишь на 1.5±0.2% (n=12, p^˂0.05 в сравнении с кривой фотобличинга, p*˂0.05 в
сравнении с контрольной кривой) или 0.9±0.3% (n=12, p^˂0.05, p*˂0.05), соответственно.
Совместное действие кавтратина и 24-ГХ не имело дополнительного эффекта на
интенсивность свечения DAF-FM при стимуляции с частотой 20 Гц и наблюдаемые
изменения флуоресценции были аналогичными с теми изменениями, происходящими под
действием только лишь 24-ГХ (n=12, p#>0.05 в сравнении с кривой в нервно-мышечных
препаратах, обработанных 24-ГХ). Совместное воздействие TRIM и 24-ГХ имеет
кумулятивный эффект и увеличение интенсивности свечения DAF-FM, во время стимуляции
с частотой 20 Гц было полностью нивелировано (n=12, p^>0.05). Следовательно,
высокочастотная активность нерва повышает эффект эндотелиальной и нейрональной
изоформ NO-синтазы; и что 24-ГХ способен снизить образование оксида азота, вызванное
эндотелиальной изоформой.
16
Рис. 8. Динамика интенсивности свечения DAF-FM во время высокочастотной
стимуляции. А – Кривые изменения интенсивности свечения DAF-FM в течение времени: в
условиях покоя (кривая фотобличинга, обозначена «без стимуляции»), при высокочастотной
стимуляции (обозначена «Контроль»), при высокочастотной стимуляции и предварительной
обработке 24-ГХ (обозначена «24-ГХ»). Справа изображения в псевдоцвете в области
синапса зарегистрированы на 0 и 180 с стимуляции. Соответствующая шкала интенсивности
представлена справа (относительные единицы). Шкала – 15 мкм. Б – Кривые изменения
интенсивности свечения DAF-FM под действием отдельно L-глутамата (в присутствии
глицина) и L-глутамата совместно с 24-ГХ. В – Сравнение кривых изменения интенсивности
свечения DAF-FM под действием ингибиторов эндотелиальной NO-синтазы (кавтратин) и
нейрональной NO-синтазы (TRIM) по отдельности и совместной обработке с 24-ГХ.
Связь эффектов 24-ГХ на экзоцитоз с продукцией оксида азота.
Синаптическая передача как правило зависит от локального образования оксида азота.
С целью проверки способности 24-ГХ усиливать экзоцитоз через снижение образования
оксида азота, мы заблокировали сопряженный с NO сигнальный путь с помощью L-NAME
(ингибитор всех изоформ NO-синтазы), кавтратина, TRIM и гемоглобина (акцептора
внеклеточного оксида азота) (Рис. 9А-В). Мы обнаружили, что L-NAME, кавтратин и
гемоглобин значительно увеличивает скорость выгрузки красителя FM1-43 и в течение 3-х
минутной пачки стимулов с частотой 20 Гц интенсивность свечения снижается до 50.1±2.1%
(n=10, p*˂0.05), 50.9±3.0% (n=11, p*˂0.05) и 53.2±2.2% (n=8, p*˂0.05), соответственно. В
условиях ингибирования сигнального пути оксида азота (с помощью L-NAME, кавтратина
или гемоглобина), 24-ГХ практически не имел никакого дополнительного эффекта на
динамику выгрузки FM1-43 и интенсивность свечения нервного окончания после 3 мин
стимуляции снизилась до 51.1±3.0% (+L-NAME, n=11, p*˂0.05, p#>0.05), 48.5±2.8%
17
#
(+кавтратин, n=12, p*˂0.05, p >0.05) и 51.0±3.2% (+гемоглобин n=8, p*˂0.05, p#>0.05). В
противоположность этому, TRIM не влияет на выгрузку FM1-43, как в контроле, так и после
обработки 24-ГХ (Рис. 9Г). Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том,
что механизм, благодаря которому 24-ГХ потенцирует экзоцитоз синаптических везикул во
время высокочастотной активности связан со снижением активности эндотелиальной NOсинтазы, которая расположена на постсинаптической мембране (или на Шванновской
клетке) вместе с кавеолином-1.
Оксид азота может регулировать синаптическую передачу, действуя через сигнальный
путь: растворимая гуанилатциклаза – протеинкиназа G. Ингибитор протеинкиназы G (KT
5823), подобным образом, как было описано ранее для фармакологических манипуляций с
сигнальным путем оксида азота (L-NAME, кавтратин, и гемоглобин), изменяет выгрузку
красителя FM1-43 и эффекты 24-ГХ (Рис. 9Д). В нервно-мышечных препаратах,
обработанных KT 5823, после 3 мин стимуляции интенсивность свечения снизилась до
51.8±3.0% (n=8, p*˂0.05, p#>0.05) и, в условиях совместного применения 24-ГХ до 52±2.8%
(n=9, p*˂0.05, p#>0.05).
Рис. 9. Вовлечение NO-зависимой сигнализации в эффект 24-ГХ на динамику выгрузки
красителя FM1-43. А, Б, В – Кривые выгрузки красителя FM1-43 после обработки отдельно
L-NAME, или кавтратином, или гемоглобином и совместно с 24-ГХ. Г – Кривая выгрузки
красителя FM1-43 после обработки отдельно ингибитором нейрональной NO-синтазы
(TRIM) и совместно TRIM и 24-ГХ. Д – Кривая выгрузки красителя FM1-43 после обработки
отдельно ингибитором протеинкиназы G (KT 5823), и совместно KT 5823 и 24-ГХ. Е –
Гистограмма показывает средний процент выгрузки FM1-43 (ось ординат) после 3 мин
стимуляции нерва с частотой 20 Гц. Звездочка означает достоверные различия в сравнении с
процентом выгрузки в контроле (*p<0.05).
Возможность того, что NO-синтаза вовлечена в эффекты 24-ГХ было подтверждено
электрофизиологическим методом (Рис. 10). Аппликация только L-NAME или в сочетании с
18
24-ГХ не влияет на амплитуду МПКП, но увеличивает амплитуду ПКП во время стимуляции
с частотой 0.02 Гц на 17±4% (n=8, p˂0.05) и 19±5% (n=8, p˂0.05), соответственно (Рис. 10A).
Это свидетельствует о том, что подобно 24-ГХ, L-NAME увеличивает вызванную секрецию
нейромедиатора и может маскировать эффекты 24-ГХ. Аналогичным образом, L-NAME
замедляет спад секреции нейромедиатора во время высокочастотной стимуляции. Кроме
того, в условиях сниженного синтеза оксида азота депрессия секреции нейромедиатора
дополнительно не снижается при действии 24-ГХ (Рис. 10Б). После 3 мин стимуляции с
частотой 20 Гц амплитуда ПКП снижается до 63.0±2.4% (n=8, p*˂0.05) или 65.7±3.0% (n=8,
p*˂0.05) в нервно-мышечных препаратах, обработанных только L-NAME или в сочетании с
24-ГХ. Анализ кумулятивных амплитуд ПКП свидетельствует, что L-NAME повышает
секрецию нейромедиатора на 29.8±4.4% (p*˂0.05), в такой же степени как и 24-ГХ один
(p#>0.05). Кроме того, в нервно-мышечных препаратах, обработанных L-NAME, 24-ГХ терял
способность дальнейшего увеличения секреции нейромедиатора при высокочастотной
стимуляции. Кумулятивная амплитуда ПКП оставалась практически неизменной по
сравнению с препаратами, которые выдерживались только в L-NAME. (Рис. 10Б).
Полученные результаты согласуются с предположением о том, что L-NAME и 24-ГХ
приводит к увеличению вызванной секреции нейромедиатора при низко- и высокочастотной
активности пересекаясь с общими сигнальными путями.
*
L-NAME+24-ГХ
L-NAME
L-NAME+24-ГХ
0.5
L-NAME
1.0
0.0
AМПКП AПКП
5 мс
100
12
Контроль
L-NAME
L-NAME + 24-ГХ
80
х104 мВ
40
0
60
120
Время, с
180
*
8
4
60
*
L-NAME+24-ГХ
*
В
10
мВ
L-NAME
Б
5 мс
L-NAME +
24-ГХ
Контроль
2 мс
Амплитуда ПКП, %
Эффекты на амплитуду
A 1.5
L-NAME
10
мВ
 амплитуд ПКП
0 .5
мВ
к 3 мин
Рис. 10. Участие NO-синтазы в эффектах 24-ГХ на секрецию нейромедиатора. А –
Амплитуда МПКП и ПКП в ответ на одиночные стимулы. Сверху характерные сигналы
МПКП и ПКП до и после применения вещества. Б – Динамика снижения амплитуды ПКП (в
%) в течение непрерывной высокочастотной стимуляции. Сверху характерные сигналы ПКП
на 0, 1 и 3 мин стимуляции. В – Суммарная амплитуда ПКП (в мВ) в течение 3 мин
стимуляции с частотой 20 Гц.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Продукты окисления холестерина часто обладают высокой биологической
активностью. 24-ГХ является основным производным в липидном обмене выделяемым
мозгом в системный кровоток, где его уровень может значительно изменяться в ответ на
физиологические или патофизиологические условия. Однако мало известно о его влиянии на
19
периферические ткани и процессы в пресинаптической области. Используя
электрофизиологический и оптический подходы, мы обнаружили высокую чувствительность
синаптического везикулярного цикла к 24-ГХ в нервно-мышечном синапсе мыши. Обработка
24-ГХ препаратов не влияла на амплитуду и частоту миниатюрных токов концевой
пластинки, но увеличивала амплитуду тока концевой пластинки в ответ на одиночные
стимулы и уменьшала снижение амплитуды ПКП в течение высокочастотной активности.
Последнее было объединено с повышенной загрузкой и выгрузкой маркера FM1-43 путем
эндо- и экзоцитоза. Сопоставление данных электрофизиологического и оптического метода
выявило увеличение скорости везикулярного цикла. Влияние 24-ГХ было устранено или
усилено путем стимуляции или угнетения NMDA рецепторов, соответственно. Кроме того,
24-ГХ, действуя схожим с ингибитором эндотелиальной NO-синтазы (кавтратином) образом,
угнетает повышение флуоресценции чувствительного к оксиду азота маркера во время
высокочастотной стимуляции, тогда как L-глутамат имеет противоположный эффект.
Ингибитор NO-синтазы (L-NAME и кавтратин, но не ингибитор нейрональной NO-синтазы,
TRIM), акцептор внеклеточного оксида азота и блокатор протеинкиназы G имеет подобный с
24-ГХ стимулирующий эффект на экзоцитоз под действием высокочастотной стимуляции и
полностью имитирует влияние 24-ГХ. Таким образом, мы полагаем, что 24-ГХ ускоряет цикл
синатических везикул в результате ослабления ретроградной NO сигнализации, что зависит
от эндотелиальной NO-синтазы и ограничивает вызванную секрецию. В такой ситуации 24ГХ играет роль функционального конкурента стимуляции NMDA рецепторов в нервномышечном синапсе мыши.
Таким образом, можно рассматривать производные холестерина, в частности 24-ГХ,
как новый класс регуляторов нервно-мышечной передачи в периферическом синапсе.
ВЫВОДЫ:
 24-гидроксихолестерин усиливает освобождение нейромедиатора в ответ на одиночные
раздражения и, особенно выраженно, на высокочастотную активность, не влияя на
спонтанную секрецию в нервно-мышечном синапсе мыши.
 24-гидроксихолестерин увеличивает скорость экзо-эндоцитозного цикла синаптических
везикул при высокочастотной активности, а также увеличивает популяцию везикул,
участвующих в экзоцитозе.
 Эффект 24-гидроксихолестерина на экзоцитоз модулируется активацией глутаматных
NMDA рецепторов.
 24-гидроксихолестерин влияет на экзоцитоз синаптических везикул за счет снижения
продукции оксида азота (II) эндотелиальной изоформой NO-синтазы.
РЕКОМЕНДАЦИИ:
Полученные в диссертационном исследовании данные могут представлять интерес для
научных коллективов, занятых в области физиологии синаптических и мебранных
процессов, в частности, это: кафедра физиологии человека и животных (Московский
государственный университет им. М.В. Ломоносова, г. Москва); лаборатория
функциональной синаптологии (ФГБНУ «Научный центр неврологии», г. Москва);
лаборатория клеточной биологии рецепторов, отдел молекулярной нейробиологии (Институт
биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, г. Москва);
лаборатория биофизики синаптических процессов (Институт эволюционной физиологии и
биохимии им. И.М. Сеченова РАН, г. Санкт-Петербург).
ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ:
20
В соответствии с данной работой планируется дальнейшее изучение роли 24гидроксихолестерина на нервно-мышечную передачу. Остается неизученным и интересным
вопрос длительного воздействия данного оксистерина. Также остается не изученным вопрос
о действии эндогенного 24-гидроксихолестерина на периферические процессы, в том числе
на нервно-мышечную передачу, что важно для выяснения потенциальной нейрогуморальной
роли
24-гидроксихолестерина.
Планируется
применение
экзогенного
24гидроксихолестерина на моделях болезни бокового амиотрофического склероза с
терапевтической целью, где данный оксистерин может проявить нейропротекторные
свойства, а также оказать положительный эффект на нервно-мышечную передачу.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи в научных журналах, включенных в систему цитирования
Web of Science и SCOPUS и рекомендованных ВАК
1.
Петров, А. М. Роль холестерина в процессах экзо- и эндоцитоза в двигательном
нервном окончании лягушки / А. М. Петров, М. Р. Касимов, А. Р. Гиниатуллин, О. И.
Тараканова, А. Л. Зефиров // Росс. физиол. журнал им. И.М. Сеченова. – 2009. – Т. 95. – № 7.
– С.762-772. (лично соискателем – 0,1) Переведена: Neurosci. and Behav. Physiol. – 2010. – V.
40. – № 8. – P.894-901.
2.
Петров, А. М. Эффекты окисления мембранного холестерина на везикулярный цикл в
двигательном нервном окончании лягушки rana ridibunda / А. М. Петров, М. Р. Касимов, А.
Р. Гиниатуллин, А. Л. Зефиров // Росс. физиол. журнал им. И.М. Сеченова. – 2013. – Т. 99. –
№ 2. – С.93-108. (лично соискателем – 0,25)
Переведена: Neurosci. and Behav. Physiol. –
2014. – V. 44. – № 9. – P.1020-1030.
3.
Kasimov, M. R. Effects of 5α-cholestan-3-one on the synaptic vesicle cycle at the mouse
neuromuscular junction
/ M. R. Kasimov, A. R. Giniatullin, A. L. Zefirov, A. M. Petrov //
Biochimica et Biophysica Acta. – 2015. – V. 1851. – P. 674–685. (лично соискателем – 0,55)
4.
Kasimov, M. R. Similar oxysterols may lead to opposite effects on synaptic transmission:
Olesoxime versus 5α-cholestan-3-one at the frog neuromuscular junction / M. R. Kasimov, G. F.
Zakyrjanova, A. R. Giniatullin, A. L. Zefirov, A. M. Petrov // Biochimica et Biophysica Acta. –
2016. – V. 1861. – P. 606–616. (лично соискателем – 0,45)
5.
Petrov, A. M. Brain Cholesterol Metabolism and Its Defects: Linkage to Neurodegenerative
Diseases and Synaptic Dysfunction / A. M. Petrov, M. R. Kasimov, A. L. Zefirov // Acta naturae. –
2016. – V. 8. – № 1(28). – P. 58-73. (лично соискателем – 0,15)
6.
Kasimov, M. R. 24S-Hydroxycholesterol enhances synaptic vesicle cycling in the mouse
neuromuscular junction: Implication of glutamate NMDA receptors and nitric oxide / M. R.
Kasimov, M. R. Fatkhrakhmanova, K. A. Mukhutdinova, A. M. Petrov // Neuropharmacology. –
2017. – V. 117. – P. 61-73. (лично соискателем – 0,65)
7.
Petrov, A. M. Cholesterol in the Pathogenesis of Alzheimer's, Parkinson's Diseases and
Autism: Link to Synaptic Dysfunction /
A. M. Petrov, M. R. Kasimov, A. L. Zefirov // Acta
naturae. – 2017. – V. 9. – № 1. – P. 26-37. (лично соискателем – 0,15)
Тезисы в сборниках материалов конференций
1.
Петров, А.М. Оксистеролы как регуляторы цикла синаптических везикул в нервномышечных синапсах лягушки / А.М. Петров, М.Р. Касимов, Г.Ф. Закирьянова // Материалы
XII международной научной конференции «Адаптация растущего организма». – Казань. –
2014. – С.85.
21
2.
Петров, А.М. Удаление холестерина усиливает спонтанный экзоцитоз в нервномышечном синапсе мыши через механизм зависимый от НАДФН-оксидазы / А.М. Петров,
М.Р. Касимов, В.И. Сычев, А.Л. Зефиров // Четвертая Международная междисциплинарная
конференция «Современные проблемы системной регуляции физиологических функций». –
Москва. – 2015. – С.544-547.
3.
Мухутдинова, К.А. Влияние 24-гидроксихолестерина на экзоцитоз синаптических
везикул в двигательных терминалях мыши / К.А. Мухутдинова, М.Р. Касимов // 89-я
всероссийская научно-практическая конференция студентов и молодых ученых. – Казань. –
2015. – С.448-449.
4.
Петров, А.М. Экзогенный 24-гидроксихолестерин стимулирует экзо-эндоцитоз
синаптических везикул в нервно-мышечном контакте / А.М. Петров, М.Р. Касимов, М.Р.
Фатхрахманова, К.А. Мухутдинова // Молодежная школа-конференция «Молекулярные
механизмы регуляции физиологических функций» – Москва. – 2015. – С.27-28.
5.
Петров, А.М. Цереброхолестерин как потенциальный регулятор экзо-эндоцитоза в
двигательном нервном окончании / А.М. Петров, М.Р. Касимов, М.Р. Фатхрахманова, К.А.
Мухутдинова // Международная конференция молодых ученых «Экспериментальная и
теоретическая биофизика». – Пущино. – 2015. – С.110.
6.
Mukhutdinova, K.A. Cerebrocholesterol enhances synaptic vesicle cycle acting as an
antagonist of NMDA-receptor-NO synthase pathway at the mouse neuromuscular junction / K.A.
Mukhutdinova, M.R. Kasimov, M.R. Fathrahmanova, A.M. Petrov // Material of International
Symposium “Biological motility”. – Phushchino. – 2016. – P.162-165. Mukhutdinova K.A.,
Fathrahmanova M.R., Petrov A.M.
7.
Fatkhrakhmanova, M.R. The role of glutamate NMDA-receptor-NO synthase axis in the
effect of 24-hydroxycholesterol on synaptic vesicle exocytosis at the mouse neuromuscular
junctions / M.R. Fathrahmanova, K.A. Mukhutdinova, M.R. Kasimov, A.M. Petrov // Russian
Conference with International Participation in memory of Professor Vladimir S. Markhasin,
“Experimental and computational biomedicine”. – Ekaterinburg. – 2016. – P.50.
8.
Мухутдинова, К.А. Цереброхолестерин NO-зависимым путем усиливает экзоцитоз в
нервно-мышечном синапсе мыши / К.А. Мухутдинова, М.Р. Касимов, М.Р. Фатхрахманова //
Материалы 90-ой Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых
ученых. – Казань. – 2016. – С.375-376.
9.
Фатхрахманова, М.Р. Роль глутаматных рецепторов в эффектах 24гидроксихолестерина в нервно-мышечном синапсе мыши / М.Р. Фатхрахманова, К.А.
Мухутдинова, М.Р. Касимов // Материалы 90-ой Всероссийской научно-практической
конференции студентов и молодых ученых. – Казань. – 2016. – С.373.
10.
Мухутдинова, К.А. 24S-гидроксихолестерин усиливает везикулярный цикл в нервных
окончаниях аксонов мотонейронов мыши: роль оксида азота (II) / К.А. Мухутдинова, М.Р.
Касимов, М.Р. Фатхрахманова // Материалы 91-ой Всероссийской научно-практической
конференции студентов и молодых ученых. – Казань. – 2017. – С.463.
11.
Фатхрахманова, М.Р. NMDA-рецепторы в эффекте 24S-гидроксихолестерина на
экзоцитоз в двигательных нервных окончаниях / М.Р. Фатхрахманова, К.А. Мухутдинова,
22
М.Р. Касимов // Материалы 90-ой Всероссийской научно-практической конференции
студентов и молодых ученых. – Казань. – 2016. – С.455.
E-mail адрес автора: morv@yandex.ru
Отзывы на автореферат просим высылать по адресу:
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
2
Размер файла
1 510 Кб
Теги
мышечную, гидроксихолестерина, влияние, передача, синаптической, нервной
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа