close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Кинетические характеристики восстановления иоднитротетразолия хлорида как индикатора диффузии реагента в бактериальные клетки и коррозионной активности

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
МАКЕДОШИН АЛЕКСАНДР СЕРГЕЕВИЧ
КИНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ВОССТАНОВЛЕНИЯ
ИОДНИТРОТЕТРАЗОЛИЯ ХЛОРИДА КАК ИНДИКАТОРА
ДИФФУЗИИ РЕАГЕНТА В БАКТЕРИАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ
И КОРРОЗИОННОЙ АКТИВНОСТИ
02.00.04 – Физическая химия (химические науки)
03.02.08  Экология (химические науки)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата химических наук
Нижний Новгород – 2018 г.
Работа выполнена в Нижегородском государственном техническом университете
им. Р.Е. Алексеева и Национальном исследовательском Нижегородском государственном университете им. Н.И. Лобачевского
Научный руководитель:
доктор химических наук, профессор
Соколова Татьяна Николаевна
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор
Смирнов Василий Филиппович
Официальные оппоненты:
Кыдралиева Камиля Асылбековна
доктор химических наук, доцент, Федеральное
государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский авиационный институт (национальный исследовательский
университет)», профессор кафедры «Технология
конструкционных материалов»
Федосеев Виктор Борисович
доктор химических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение
науки Институт металлоорганической химии
им. Г.А. Разуваева Российской академии наук,
ведущий научный сотрудник лаборатории нелинейной оптики и полимеризующихся сред
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
Институт проблем химической физики Российской академии наук, г. Черноголовка.
Защита состоится «21» сентября 2018 г. в 1300 часов на заседании диссертационного
совета Д. 212.165.06, созданного на базе Нижегородского государственного технического университета им. Р.Е. Алексеева, по адресу: 603950, г. Нижний Новгород,
ул. Минина, 24.
С
диссертацией
можно
ознакомиться
в
библиотеке
Нижегородского
государственного технического университета им. Р.Е. Алексеева и на сайте
http://www.nntu.ru/content/aspirantura-i-doktorantura/dissertacii
Автореферат разослан 10 августа 2018г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
Соколова Т.Н.
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Использование солей тетразолия в научных и практических целях основано на их способности к неселективному восстановлению с
раскрытием цикла и образованием окрашенных продуктов  формазанов.
В экологических исследованиях через интенсивность восстановления солей
тетразолия оценивается в целом жизнеспособность микроорганизмов и их сообществ: при оценке негативных последствий в окружающей среде вследствие промышленных и бытовых загрязнений; при анализе активного ила; при выявлении
воздействия на металлоконструкции и корпуса судов обрастания микроорганизмами; при проведении скрининга и мониторинга состояния почв и др.
Возможности солей тетразолия могли бы быть использованы и при оценке
коррозионной активности аэробных бактерий-органотрофов и выявлении стимулирующих коррозию факторов биогенной природы. По оценочным данным коррозия наносит ущерб в масштабе национальных экономик до четырех процентов
ВВП. Если потери металла предсказуемы, то можно превентивными мерами их
сократить, предотвратить аварийные ситуации, например, за счет своевременной
замены отдельных металлических узлов и деталей. Это часто позволяет избежать
техногенных катастроф с негативными последствиями для окружающей среды и
человека, решить такую важную экологическую проблему, как ресурсосбереженение. Однако, если металлы и металлоконструкции эксплуатируются в условиях,
благоприятных для жизнедеятельности микроорганизмов, коррозионный процесс
развивается существенно активнее, чем следовало бы ожидать, исходя из закономерностей электрохимической или химической коррозии. Коррозия металлов,
опосредованная продуктами жизнедеятельности микроорганизмов, в настоящее
время рассматривается в самостоятельный вид повреждения металлов – биологическая коррозия. В связи с чем важными являются не только поиск ингибиторов
коррозии и мер по защите поверхности металла, но и разработка мероприятий
превентивного характера, основанных на принципах жизнедеятельности микроорганизмов. В частности, за индикатор коррозионной активности бактерий можно
было бы принять реакции солей тетразолия. Однако, как известно, через восста3
новление солей тетразолия регистрируется отклик не всего микробного сообщества, а только его части, способной активно восстанавливать соль тетразолия.
Определение соответствия между восстановительной способностью бактерий к тетразолиевым реагентам и их активностью позволит, на наш взгляд, повысить точность индикаторных методов на основе солей тетразолия в решении
экологических задач.
Целью диссертационной работы является выявление методами химической кинетики причин различной восстановительной способности бактерий к
иоднитротетразолия хлориду (ИНТ) и определение на этой основе возможностей
ИНТ как индикаторов коррозионной активности бактерий по отношению к стали.
В соответствии с поставленной целью решаются следующие задачи:
- выявление роли транспорта ИНТ в клетки на эффективные кинетические
характеристики восстановления тетразолия хлорида клеточными компонентами
бактерий, суспензированных в физиологическом растворе через:
• экспериментальное определение зависимости начальной скорости восстановления ИНТ от исходной концентрации реагента при участии бактерий, различающихся строением клеточной стенки;
• экспериментальное установление влияния на зависимость
температуры и осмолярности дисперсионной среды в суспензии бактерий;
• уточнение эффективных кинетических характеристик (общий порядок, kэф)
восстановления
ИНТ
клеточными
компонентами
бактерий
Pseudomonas
fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli;
- выявление способности бактерий-органотрофов к формированию на поверхности низкоуглеродистой стали биопленок и образованию пероксида водорода как факторов коррозионной активности бактерий и их роли в негативных
последствиях для экологии окружающей среды.
Научная новизна работы:
- Впервые методами химической кинетики показано, что на восстановление
ИНТ оказывает влияние строение клеточной стенки бактерий, определяющее
диффузию соли тетразолия в клетку и эффективную скорость ее восстановления.
4
- На основании количественных кинетических характеристик установлено,
что отклик микроорганизмов на соль тетразолия как индикатор в решении экологических задач определяется соотношением в сообществе грамположительных (с
высокой восстановительной способностью) и грамотрицательных (с низкой восстановительной способностью) бактерий.
- Установлена линейная зависимость начальной скорости восстановления
ИНТ с участием бактерий от исходной концентрации реагента, что является критерием пассивной диффузии вещества в клетку.
- Показано, что бактерии, вне зависимости от их восстановительной способности к ИНТ, активно заселяют поверхность стали в условиях, благоприятных
для их жизнедеятельности, выделяют пероксид водорода как продукт биотрансформации кислорода и оказывают стимулирующее воздействие на коррозию низкоуглеродистой стали до сопряжения ее с электрохимическими и химическими
факторами.
Теоретическая и практическая значимость работы состоит в определении взаимосвязи между скоростью восстановления ИНТ химическими компонентами бактерий, суспензированных в физиологическом растворе, и строением
клеточной стенки, определяющей диффузию реагента в клетки. В связи с чем количественная оценка восстановительной способности бактерий-органотрофов по
отношению к ИНТ делает возможным повышение точности индикаторных методов на основе солей тетразолия в решении целого ряда экологических проблем,
включая прогнозирование и регулирование антропогенного воздействия на экологию окружающей среды, исследование коррозионной активности бактерийорганотрофов.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Определение начальной скорости восстановления ИНТ в зависимости от
исходной концентрации соли тетразолия.
2. Выявление влияния на зависимость
лярности дисперсионной среды в суспензии бактерий.
5
температуры и осмо-
3. Определение и уточнение эффективных кинетических характеристик восстановления ИНТ клеточными компонентами бактерий Pseudomonas aeruginosa,
Pseudomonas fluorescens, Escherichia coli.
4.
Заселение
поверхности
низкоуглеродистой
стали
бактериями-
органотрофами и формирование биопленки.
5. Образование коррозионно-активного пероксида водорода как одного из
стимулирующих факторов бактериальной коррозии стали.
Методология и методы исследования. Методология исследований основана на общепринятых понятиях и математическом аппарате химической кинетики с учетом принципов жизнедеятельности микроорганизмов. В качестве
источников информации использованы научные публикации, монографии, справочная литература. Кинетические характеристики получены спектрофотометрическим
методом
(спектрофотометр
2802
UV/Vis
Unico).
При
изучении
поверхности металлов и дефектов, возникающих при воздействии бактерий, использована микроскопия: атомно-силовая (микроскоп SPM-9700, Shimadzu), сканирующая электронная (микроскоп Tescam Vega II, Чехия), цифровая оптическая
(микроскоп Keyence VHX-1000).
Степень достоверности. Достоверность полученных в работе данных обеспечивается высоким теоретическим и экспериментальным уровнем исследований,
воспроизводимостью результатов, использованием комплекса современных физико-химических методов анализа.
Личный вклад автора. Автор непосредственно проводил весь комплекс
экспериментальной работы по кинетике восстановления ИНТ при участии бактерий, осуществлял статистическую и математическую обработку результатов, принимал участие в обсуждении экспериментальных данных, в том числе на
конференциях различного уровня, в подготовке к публикации научных статей.
Биологические эксперименты проводились при участии к.х.н. Калининой А.А.;
исследования поверхности стали АСМ-методом  при участии аспиранта Сазановой Т.С., методом сканирующей электронной микроскопии  при участии к.т.н.
Разова Е.Н. (Институт проблем машиностроения РАН, г. Нижний Новгород); ис6
пытания на растяжение стали проводились на кафедре «Материаловедение, технологии материалов и термическая обработка металлов» под руководством д.т.н.
профессора Хлыбова А.А.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы представлены на XV и XVI Международной молодежной научно-технической конференции «Будущее технической науки» (Нижний Новгород, 2016, 2017 гг.), IX
Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития»
(Москва, 2017 г.), III Российском конгрессе по катализу «РОСКАТАЛИЗ» (Нижний Новгород, 2017 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ,
в том числе 4 статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендованных
Высшей аттестационной комиссией РФ.
Структура и объем диссертации: Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов,
выводов и списка цитируемой литературы из 139 наименований. Работа изложена
на 105 страницах машинописного текста, включает 32 рисунка и 8 таблиц.
В первой главе рассмотрены имеющиеся в литературе данные о строении,
свойствах и применении солей тетразолия в экологических исследованиях. Вторая
глава содержит описание методик и методов исследования, а также характеристику объектов изучения. В третьей главе представлены экспериментальные данные
и проведено их обсуждение.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Кинетика восстановления иоднитротетразолия хлорида химическими компонентами бактерий
Критериями при выборе соли иоднитротетразолия хлорида (2-(4-йодфенил)3-(4-нитрофенил)-5-фенил-2Н-тетразолия хлорид) (I) были: способность к восстановлению без образования промежуточных полупродуктов, хорошее сродство к
клеткам бактерий и возможность количественного выделения из клеток методом
экстракции продукта восстановления.
7
В качестве тест-организмов использовали: грамположительную бактерию
Bacillus
subtilis,
грамотрицательные
бактерии
Pseudomonas
aeruginosa,
Pseudomonas fluorescens (Всероссийская коллекция микроорганизмов, г. Пущино,
Московская обл.), Escherichia coli (препарат «БИФИКОЛ», ФГБУЗ «Нижегородское предприятие по производству бактерийных препаратов «ИмБио») и E. сoli
(источник  почва г. Н.Новгорода) как наиболее распространенные в природе и
сохраняющие свою идентичность длительное время.
Методика кинетического эксперимента: смыв суточной бактериальной
культуры со скошенного мясопептонного агара (МПА) физиологическим раствором (0,9 % водный раствор хлорида натрия) доводили до оптической плотности
0,45±0,05 (670 нм), что обеспечивало в пределах ошибки одинаковое количество
клеток в единице физиологического раствора. После чего к 32 мл бактериальной
суспензии в стерильных условиях добавляли 2 мл 1,0 мМ водного раствора ИНТ и
выдерживали в термостате при температуре эксперимента. По истечении определенного времени 5 мл реакционной смеси отбирали в пробирку, содержащую
0,1 мл раствора лизоцима (С = 0,2 мг/л). Обработка реакционной смеси после завершения восстановления связана с необходимостью разрушить клеточную стенку бактерий для облегчения извлечения продукта иодмоноформазана (ИМФ).
Спустя 30 с смесь экстрагировали этилацетатом. К экстракту добавляли 0,1 мл
10%-ого раствора гидроксида натрия, чтобы избежать ошибки спектрофотометрического определения концентрации ИМФ вследствие явления таутомерии.
Только после добавления NaOH максимум в спектре оптического поглощения
достигался при характерной длине волны 490 нм. Через 20 с в реакционную смесь
добавляли свежепрокаленный хлорид кальция в количестве 2 – 3 г и выдерживали
в течение 1 мин, после фильтрования анализировали спектрофотометрически в
кюветах толщиной 1 см при длине волны 490 нм, характерной для продукта восстановления ИМФ.
Коэффициент экстинкции определяли экспериментально по линейной зависимости оптической плотности от концентрации ИМФ. Его величина, равная
1,9·104 л·моль-1·см-1, согласуется с литературными данными.
8
Восстановление ИНТ (I) протекает по известной реакции1:
n-NO2C6H4
N
- N+
Cl
n-NO2C6H4
N
HN
+H2O
C6H5 + Dred
N
N
+ Dox2+ + Cl + OH
N
n-IC6H4
N
n-IC6H4
(I)
C6H5
(II)
Здесь D – донор электронов биогенной природы в восстановленной (Dred) и
окисленной (Dox) формах соответственно.
Ранее
было
установлено,
что
восстановление
ИНТ
клеточными
компонентами бактерий, суспензированных в физиологическом растворе, может
быть описано с позиций химической кинетики 2. В настоящей работе проведено
уточнение и расширение кинетических данных исследуемого процесса.
На рис. 1 а – 3 а представлены кинетические кривые накопления ИМФ при
участии бактерий, анализируя которые, можно видеть, что при увеличении
времени экспозиции в условиях эксперимента графические
зависимости
переходят в плато. Это может свидетельствовать о том, что 100 %-ого
восстановления ИНТ в этих системах не происходит. Возможно, что основной
причиной наблюдаемого явления может быть влияние продукта ИМФ, связанного
с мембранными компонентами клетки, на доставку реагента к сайтам
восстановления. В этом случае эффективная константа скорости восстановления
ИНТ определяется при использовании линейной анаморфозы кинетики первого
порядка следующего вида:
, или
где
значение
[ИМФ]∞
определяли
,
графически
при
(1)
экстраполяции
кинетической кривой к горизонтальному участку.
1
Seidler E. The Tetrazolium-Fonnazan System: Design and Histochemistry / E. Seidler – ISBN
3-437-11366-6. NewYork: G.Fischer. Stuttgart. 1991. 79 p.
2
Радостин С.Ю. Кинетика восстановления иоднитротетразолия хлорида в индуцированной биотрансформации кислорода в коррозионно-активные формы / Диссертация на соискание
ученой степени кандидата химических наук. Н.Новгород. 2015 г.
9
7
6
1,8
1,6
ИМФ
ИМФ
ИМФ
[ИМФ]·105, М
5
4
3
2
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
1
0,2
0
0
0
5
10
15
0
20
5
10
15
20
-3
t·10 , с
t·10-3, с
а
б
Рис. 1. Кинетическая кривая накопления иодмоноформазана под воздействием Ps. aeruginosa (t = 37°C ( ), t = 33°C ( ), t = 41°C ( ) (а); анаморфоза кинетики первого порядка реакции восстановления ИНТ клеточными компонентами бактерий Ps. aeruginosa (б)
(
= 10,0.10-5 моль/л;
= 7,4.10-5 моль/л; t = 37°C, y = 8,9.10-5x)
Как видно из зависимостей, представленных на рис. 1 б – 3 б, линейные
анаморфозы кинетики первого порядка (1) выполняются удовлетворительно.
Средние значения эффективных констант скоростей по результатам шести
экспериментов представлены в табл. 1.
4,5
3,5
а
3
[ИМФ]·105, М
3,5
2,5
3
б
а
2,5
2
2
1,5
1,5
1
ИМФ
ИМФ
ИМФ
4
1
0,5
0,5
0
0
0
5
10
15
20
-3
t·10 , с
10
Рис. 2. Кинетическая кривая
накопления ИМФ в присутствии клеток бактерий Ps.
fluorescens (а); анаморфоза
кинетики первого порядка
реакции (б)
( ИНТ = 5,88·10-5 моль/л;
ИМФ = 4,20·10-5 моль/л;
t = 27°C, y = 1,06·10-4x)
7
Рис. 3. Кинетическая кривая
накопления ИМФ под воздействием E. coli (а); анаморфоза
кинетики первого порядка реакции (б)
(
= 1,0.10-4 моль/л;
= 7,6.10-5 моль/л;
t = 37°C, y = 1,18.10-4x)
5
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
а
6
б
а
[ИМФ]·105, М
5
4
3
2
1
0
0
10
20
t·
10-3,
ИМФ
ИМФ
ИМФ
8
30
c
Следует отметить, что ранее на основе продолжительного линейного
участка (30 % конверсии в течении 1,5  2 часов) на кинетических кривых
восстановления ИНТ при участии бактерий Ps. fluorescens и E. сoli («БИФИКОЛ»)
был сделан вывод о нулевом порядке реакции2. При доведении процесса до степени конверсии 65 – 75% было показано, что удовлетворительно выполняется кинетическое уравнение (1), рис. 2 а, б и рис. 3 а, б.
Обработка
данных
работы2
восстановления
ИНТ
с
участием
грамположительной бактерии Bacillus subtillis по линейной анаморфозе кинетики
первого порядка (1) дает значение эффективной константы скорости, в 8 – 11 раз
превышающее
при участии грамотрицательных бактерий Ps. aeruginosa, Ps.
fluorescens и E. coli (препарат «БИФИКОЛ»), табл. 1.
Таблица 1. Эффективные константы скорости восстановления ИНТ клеточными компонентами бактерий, рассчитанные по уравнению (1)
Бактерия
Условия
kэф, с-1
t = 33°С, t = 37°C, t = 41°С (8,58±0,89)·10-5
t = 27°С, t = 31°С
(1,12±0,19)·10-4
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas fluorescens
(1,36±0,16)·10-4
Escherichia coli (источник«БИФИКОЛ») t = 37°C
Bacillus subtilis*
*
t = 31°С, t = 37°C, t = 41°C (9,58±1,24)·10-4
По данным работы 2
Для выявления роли транспорта в кинетике восстановления ИНТ изучено
влияние
на
начальную
скорость
восстановления
11
ИНТ
его
исходной
концентрации, рис. 4 и рис. 5. При условии, что в начальный момент времени
выполняется первый закон Фика, можно предположить, что начальная скорость
восстановления ИНТ должна линейно зависеть от концентрации реагента и
отражать скорость транспорта реагента в клетку. В частности, линейная
зависимость в координатах V0 = f(C0) широко используется в биологических экспериментах как признак пассивной диффузии. На рис. 4 а и рис. 5 а в качестве
примера представлены линейные зависимости начальной скорости восстановления ИНТ от исходной концентрации субстрата при использовании суспензии в
физиологическом растворе бактерий B. subtilis и Ps. fluorescens.
б
V0 · 108, моль·л-1с-1
14
Рис. 4. Зависимость начальной скорости восстановления ИНТ от его исходной концентрации: а  восстановление
ИНТ суспензией бактерий B. subtilis в физиологическом растворе (t=37°C ( ),
t=41°C ( )); б  восстановление ИНТ суспензией бактерий B. subtilis в среде на
основе физиологического раствора (0,25
Осмоль/л)
12
a
10
8
6
4
2
0
0
5
10
[ИНТ]0 ·
15
105,
20
25
моль·л-1
9
а
V0 · 109, моль·л-1с-1
8
7
б
6
5
4
3
2
1
0
0
5
10
15
20
25
[ИНТ]0 · 105, моль·л-1
12
Рис. 5. Зависимость начальной
скорости восстановления ИНТ от
его исходной концентрации: а 
восстановление ИНТ суспензией
бактерий Ps. fluorescens в физиологическом растворе(t = 27°C ( ), t =
31°C ( )); б – восстановление ИНТ
суспензией бактерий Ps. fluorescens
в среде на основе физиологического
раствора (0,25 Осмоль/л)
В табл. 2 приведены эффективные константы скорости, вычисленные по
уравнению реакции первого порядка следующего вида:
V0 = kэф[ИНТ]0.
(2)
Косвенным подтверждением определяющей роли диффузии ИНТ в его восстановлении могут быть, на наш взгляд, результаты исследования влияния осмолярности среды, в которой суспензированы бактерии, на начальную скорость. При
снижении осмолярности на 17% (с 0,3 до 0,25 Осмоль/л) эффективная константа
скорости восстановления ИНТ бактериями B. subtilis возрастает в ≈ 1,5 раза,
рис. 4 а, б и табл. 2. В то время как при тех же условиях, скорость восстановления
суспензией бактерий Ps. fluorescens уменьшается примерно в 1,4 раза, рис. 5 а, б и
табл. 2.
Таблица 2. Эффективные константы скорости восстановления ИНТ
клеточными компонентами бактерий, рассчитанные по уравнению (2)
Бактерия
Условия
kэф., с-1
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas fluorescens
Pseudomonas fluorescens
Bacillus subtilis
Bacillus subtilis
t = 37°C, 0,3 Осмоль/л
t =27°С, t = 31°С, 0,3 Осмоль/л
t = 27°С, 0,25 Осмоль/л
t = 37°C, t = 41°C, 0,3 Осмоль/л
t = 37°C, 0,25 Осмоль/л
(5,8±0,75)10-5
(3,50±0,45) 10-5
(2,51±0,33) 10-5
(3,98±0,52) 10-4
(6,11±0,79)10-4
Обращают внимание данные по восстановлению ИНТ в рамках одного вида
грамотрицательных бактерий E.coli. Бактерии, подвергшиеся лиофилизации
(препарат «БИФИКОЛ»), с явно измененной вследствие этого структурной
организацией липопротеиновой мембраны, достаточно активны, рис. 3, табл. 1.
Бактерии, выделенные из природного источника – почвы, практически не
способны к восстановлению ИНТ. В условиях эксперимента реакция протекает в
течение 4 – 5 часов до степени конверсии реагента не более 9 – 10%. После чего
реакция останавливается, в связи с чем, полную кинетическую кривую получить
не удается. Для сравнения за этот же период экспозиции E. coli (препарат
«БИФИКОЛ») восстанавливают ИНТ на 60%, рис. 3.
Данные, представленные на рис. 1 а, 4 а, 5 а, свидетельствуют о низкой
чувствительности скорости восстановления ИНТ к температуре, а также неприменимости уравнения Аррениуса.
13
При анализе кинетических данных сделано приближение, что сложный
процесс транспорта ИНТ к клеточным сайтам восстановления, включающий
физическую адсорбцию реагента на клеточной стенке, диффузию через
клеточную стенку, периплазматическое пространство, плазмалемму, можно
охарактеризовать некоторыми условными константами k1 и k-1. При достижении
реагентом сайтов восстановления быстро протекает непосредственно химическая
реакция. Тогда можно предложить следующую схему:
k1
медленно,
k-1
,
быстро,
где
 количество реагента, которое транспортировано из внеклеточной
среды к цитозольной стороне биомембраны, на которой локализованы
восстановители
;  константа скорости быстрой стадии, которая равна
, считая, что
поддерживается на постоянном уровне в
функционирующей клетке.
При
условии,
что
применяем
к
метод
квазистационарных концентраций:
Откуда
Тогда
Введя обозначение
, в терминах начальной скорости, имеем
.
Полученное соотношение согласуется с линейными зависимостями,
представленными на рис. 4 и рис. 5, и подтверждает возможность описания
экспериментальных данных по линейной анаморфозе кинетики первого порядка,
при этом лимитирующим процессом является диффузия реагента в клетку
бактерии.
14
Противоположный эффект, наблюдаемый при изменении осмолярности
среды, в которой суспензированы бактерии, в скорости восстановления ИНТ
грамположительными и грамотрицательными бактериями, также иллюстрирует
роль диффузии в этом процессе. Как видно из структуры (I), ИНТ  высокополярная молекула, которая в водной среде хорошо сольватируется, в том числе с образованием сольватированного катиона. Клеточная стенка грамположительных
бактерий, содержащая отрицательно заряженные тейховые кислоты, способна
электростатически взаимодействовать с катионом тетразолия. При добавлении
воды к физиологическому раствору за счет усиления сольватационного эффекта и
экранированяи заряда наблюдается увеличение скорости восстановления ИНТ,
рис. 4 б, табл. 2.
Клеточная стенка грамотрицательных бактерий включает липопротеиновую
мембрану, в связи с чем, увеличение размера сольватированного катиона
тетразолия затрудняет его транспорт к сайтам восстановления, что и наблюдается
в действительности, рис. 5 б, табл. 2.
2. Стимулированная бактериями-органотрофами коррозия низкоуглеродистой стали
Взаимосвязь между скоростью восстановления ИНТ и активностью бактерий выявлялась на стадии стимулирования бактериями коррозии низкоуглеродистой стали (Q-panel тип QD), рекомендованной стандартами ИСО 9223-2012 для
проведения биокоррозионных исследований.
На рис. 6 и рис. 7 показано, что уже через 2 суток экспозиции образца стали
на
плотной
питательной
среде
(МПА),
инокулированной
бактериями
Ps. аeruginosa в оптимальных условиях их жизнедеятельности, начинается активная колонизация поверхности. Зафиксированы отдельные бактерии, рис. 6 а; колонии бактерий, рис. 6 б, а на отдельных участках определяется морфология
формирующейся биопленки, рис. 6 в.
Заселение поверхности бактериями с образованием биопленки было также
установлено методом атомно-силовой микроскопии (АСМ). Следует отметить,
что из-за большого и резкого перепада высот анализируемых топографических
15
структур АСМ-сканирование в подобных исследованиях используется достаточно
редко и нами впервые, когда образец стали находится не в жидкой среде, а в условиях, приближенных к естественным: металл – атмосфера.
а
б
в
Рис. 6. Микрофотографии поверхности стали после 2 суток экспозиции под воздействием бактерий Ps. aeruginosa
Как видно из рис. 7, поверхность контрольного образца имеет однородную
слоистую структуру с небольшими перепадами высот, значения Ra и Rz равны
0,054, 0,37 мкм соответственно. На рис. 8 представлены результаты АСМ-анализа
образца стали после экспозиции в течение 1 и 3 суток на плотной питательной
среде, инокулированной бактериями Ps. aeruginosa.
Рис. 7. АСМ-изображение поверхности контрольного
образца низкоуглеродистой стали
16
Как следует из рис. 8, уже через 1 и 3 суток экспозиции на анализируемом
участке поверхности стали четко проявляется морфология биопленки, состоящей
из внеклеточных биополимерных веществ и характерных пустот. Морфологические признаки отдельных бактериальных клеток не проявляются, хотя, имея в виду результаты, представленные на рис. 6 а, определенная доля их в биопленке
имеется. После удаления биопленки в образцах стали проявляется коррозия виде
неоднородных углублений, рис. 8.
а
б
Рис. 8. АСМ-изображение поверхности и профиль поверхности образца низкоуглеродистой стали после экспозиции под воздействием бактерий Ps.aeruginosa в течение одних суток (а), трех суток (б)
Ранее, в том числе с участием автора настоящей работы, была предпринята
попытка проанализировать факторы, влияющие на коррозионную активность бактерий. В числе одного из стимулирующих факторов обсуждался пероксид водорода.
17
В работе3 способность бактерий-органотрофов выделять пероксид водорода
определялась по его накоплению в экссудате на поверхности цинка. При использовании в качестве объекта исследования стали при ее экспозиции на среде мясопептонный агар были выявлены общие визуальные признаки бактериального
воздействия: на поверхности металла локально появляется экссудат в жидкокапельном состоянии, хотя и в меньшем количестве, чем на поверхности цинка, с
рН > 7, в котором также обнаруживается Н2О2, рис. 9.
Рис. 9. Состояние поверхности
стали через 2 суток экспозиции
на среде МПА, инокулированной
бактериями Ps. aeruginosa
На рис. 10 а, б представлены данные по максимальной концентрации пероксида водорода в экссудате на поверхности цинка и стали, образцы которых помещены в чашку Петри на плотную среду МПА, инокулированную бактериями, при
температуре 37±2°С и влажности 90%.
Рис. 10. Максимальная концентрация
пероксида водорода (мкмоль/л) в экссудате
на поверхности цинка (а) и стали (б):
1 – B. subtillis; 2 – Ps. аeruginosa;
3 – Ps. fluorescens;
4 – E. coli (источник «БИФИКОЛ»)
800
600
400
200
1
2
а
3
1
2
3
4
б
3
Калинина, А.А. Моделирование условий биотрансформации кислорода бактериямиорганотрофами в пероксид водорода, стимулирующий коррозию цинка / А.А. Калинина, С.Ю.
Радостин, А.С. Македошин, Т.Н. Соколова, В.Ф. Смирнов, В.Р. Карташов // Известия ВУЗов.
Прикладная химия и биотехнология. 2017. Т. 7. № 2 (21). С. 80-88.
18
Как видно из данных, представленных на рис. 10, корреляция между скоростью восстановления ИНТ и накоплением Н2О2 отсутствует. Более того, при
экспозиции цинка и стали на среде МПА максимальная концентрация пероксида
водорода
под
воздействием
грамотрицательных
бактерий
существенно
превышает таковую под воздействием B. subtillis с высокой восстановительной
способностью к ИНТ.
Из литературных данных известно, что одним из источников пероксида водорода является побочный процесс «случайного» переноса электронов компонентами электронно-транспортной цепи клеток на кислород: О2 + е = О2-.
Впоследствии супероксидный анион при участии фермента супероксиддисмутазы переходит в более устойчивую форму – пероксид водорода:
О2– + е + 2Н+ = Н2О2.
Поскольку восстановление ИНТ протекает также с участием компонентов
электронного транспорта (флавиновые коферменты, промежуточные переносчики
хиноновой природы, супероксидный анион), можно предположить, что чем больше выделяется из клетки пероксида водорода, тем выше дыхательная активность
клетки. Соответственно должна быть высокой и ее восстановительная способность к ИНТ, но при условии, что организация электронно-транспортной цепи является в кинетике определяющей. Если за отклик активности бактерий при
равных условиях культивирования считать пероксид водорода, то грамотрицательные бактерии должны проявлять большую восстановительную способность к
солям тетразолия, чем грамположительная бактерия B. subtillis, что не согласуется
с кинетическими данными.
Вместе с тем Н2О2 – это коррозионно-активное вещество по отношению к
стали. Во-первых, он может непосредственно проявлять окислительные свойства:
Fe – 2e = Fe2+, Н2О2 + 2e = 2OH–.
Во-вторых, ион Fe2+ является эффективным катализатором разложения пероксида водорода по суммарному уравнению: 2Н2О2 = 2Н2О + О2. Более того, качественно в экссудате определена каталаза, расщепляющая пероксид водорода
19
более активно, чем при катализе Fe2+. Дополнительное образование кислорода в
зоне контакта бактерий с металлом приводит к усилению коррозии стали.
Как видно из рис. 11 и рис. 12 разрушение стали идет по типу питтинговой
и язвенной коррозии.
Рис. 11. Состояние поверхности
стали после воздействия бактерий Ps. аeruginosa в течение
3 суток экспозиции с признаками
питтинговой и язвенной
коррозии (x200)
Рис.12. Поверхность образца стали
после
воздействия
бактерий
Ps. fluorescens с очагом питтинговой
коррозии на поверхности (фотография
получены с помощью оптического
микроскопа «Keyence VHX-1000»,
работающего в режиме трехмерного
сканирования (х1000)
Образующиеся продукты коррозии уже на ранних стадиях экспозиции могут привести, особенно по краям образца, к коррозионному растрескиванию,
рис. 13. При увеличении времени экспозиции до 12 суток на поверхности исследуемых образцов, наряду с питтингами и язвами, видны очаги межкристаллитной
коррозии, рис. 14 (участок «а»).
За счет неравномерного заселения поверхности металла бактериями и постоянного образования в зоне контакта коррозионно-активных метаболитов разрушение стали идет, таким образом, по смешанному типу.
20
Рис. 13. Состояние поверхности
стали после воздействия бактерий
Ps. аeruginosa в течение 3 суток
экспозиции с признаками коррозионного растрескивания (x2000)
Рис. 14. Микрофотография
участка образца стали, находящегося под воздействием
бактерий Ps. fluorescens в течение 12 суток, с очагом межкристаллитной коррозии (а)
(x2000)
а
Как следует из проведенных исследований, грамотрицательные бактерии на
этапе стимулирования проявляют высокую коррозионную активность, проявляющуюся в заселении поверхности металла и образовании пероксида водорода. Вместе с тем выявлено, что скорость восстановления ИНТ этим типом бактерий
меньше на порядок и более (вплоть до отсутствия восстановительной способности
у бактерии E.coli, выделенной из почвы), чем у грамположительных бактерий.
Кинетическими методами установлено, что на взаимосвязь между восстановительной способностью бактерий и их активностью влияет строение клеточной
стенки, которая определяет диффузию соли тетразолия к сайтам восстановления
клетки. В связи с чем количественные данные по скорости восстановления соли
тетразолия грамположительными и грамотрицательными бактериями дают воз-
21
можность повысить объективность индикаторных методов оценки в решении целого ряда экологических проблем.
Выводы:
1. Методами химической кинетики выявлена взаимосвязь между строением
клеточной стенки бактерий и их восстановительной способностью к иоднитротетразолия хлориду (ИНТ). Установлено, что отклик микроорганизмов на соль тетразолия
как
индикатора
в
решении
экологических
задач
определяется
соотношением в сообществе грамположительных и грамотрицательных бактерий.
2. Впервые выявлена роль диффузии ИНТ в кинетике восстановления ИНТ
клетками бактерий, суспензированных в физиологическом растворе. Показано,
что скорость восстановления ИНТ в клетках грамположительных бактерий более
чем на порядок превышает скорость восстановления в клетках грамотрицательных бактерий.
3. Установлено, что начальная скорость восстановления ИНТ линейно зависит от его исходной концентрации для всего ряда исследуемых бактерий.
4. Показано, что понижение осмолярности дисперсионной среды суспензии
бактерий ускоряет начальную скорость восстановления ИНТ при участии грамположительных бактерий и замедляет при воздействии грамотрицательных бактерий. Выявлена низкая чувствительность реакции восстановления ИНТ к
температуре для всего ряда исследуемых бактерий.
5. Уточнены эффективные кинетические характеристики восстановления
ИНТ клеточными компонентами бактерий. Показано, что для всего ряда исследуемых бактерий удовлетворительно выполняется линейность анаморфозы кинетики первого порядка с
равными (8,58±0,89)·10-5, (1,12±0,19)·10-4 и
(1,36±0,16)·10-4 с-1соответственно для Ps. aeruginosa, Ps. fluorescens и E. coli (препарат «БИФИКОЛ»).
6. Установлено, что грамотрицательные бактерии с низкой восстановительной способностью к ИНТ оказывают активное стимулирующее воздействие на
коррозию стали:
22
- выявлено активное заселение поверхности стали и образование экссудата,
содержащего пероксид водорода, на начальном этапе экспозиции образца на среде мясопептонный агар, инокулированной бактериями в оптимальных условиях
их жизнедеятельности;
- методом атомно-силовой микроскопии на первые и третьи сутки экспозиции выявлены дефекты поверхности стали под воздействием Ps. аeruginosa и обнаружены морфологические признаки биопленки.
Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:
1. Македошин А.С. Микроструктурное исследование микробиологической коррозии
низкоуглеродистой стали под воздействием бактерии Pseudomonas aeruginosa /
А.С. Македошин, Т.С. Сазанова, В.М. Воротынцев, А.А. Калинина, Т.Н. Соколова // Коррозия:
материалы, защита. 2018. № 6. С. 35-41.
2. Калинина, А.А. Кинетическое исследование восстановления иоднитротетразолия хлорида суспензией в физиологическом растворе бактерий Pseudomonas aeruginosa/
А.А. Калинина, А.С. Македошин, Н.В. Гурский, Т.Н. Соколова, В.Ф. Смирнов // Теоретическая
и прикладная экология. 2018. №1. C. 25-32.
3. Калинина, А.А. Моделирование условий биотрансформации кислорода бактериямиорганотрофами в пероксид водорода, стимулирующий коррозию цинка / А.А. Калинина,
С.Ю. Радостин, А.С. Македошин, Т.Н. Соколова, В.Ф. Смирнов, В.Р. Карташов // Известия
ВУЗов. Прикладная химия и биотехнология. 2017. Т. 7. № 2 (21). С. 80-88.
4. Радостин, С.Ю. Восстановление йоднитротетразолия клетками бактерий как метод
оценки их коррозионной активности / С.Ю. Радостин, А.А. Калинина, А.С. Македошин,
Т.Н. Соколова, О.В. Кузина, В.Р. Карташов // Коррозия: материалы, защита. 2015. № 11.
С. 45-48.
5. Македошин, А.С. Кинетика восстановления INT (2-(4-йодфенил)-3(4-нитрофенил)-5фенилтетразолия хлорид) бактериями / А.С. Македошин, Н.В. Гурский, А.А. Калинина, Т.Н.
Соколова, С.Ю. Радостин, В.Ф. Смирнов, В.Р. Карташов // Сборник материалов IX Международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития. 2017. С. 68-69.
6. Македошин, А.С. Применение методов неформальной химической кинетики в изучении восстановления йоднитротетразолия хлорида суспензией бактериальных клеток /
А.С. Македошин, Н.В. Гурский, А.А. Калинина, Т.Н. Соколова, В.Р. Карташов // Сборник материалов XVI Международной молодежной научно-технической конференции «Будущее технической науки». 2017. С. 550.
7. Радостин, С.Ю. Новый взгляд на роль биокатализа в коррозии металлов / С.Ю. Радостин, А.А. Калинина, А.С. Македошин, Т.Н. Соколова, В.Р. Карташов // Тезисы докладов III
Российского конгресса по катализу «РОСКАТАЛИЗ» (г. Нижний Новгород). 2017. С. 396.
8. Кадыров, В.Н. Сравнительная характеристика биологической и электрохимической
коррозии цинка в хлоридных растворах / В.Н. Кадыров, А.С. Македошин, В.В. Исаев // Сборник материалов XV Международной молодежной научно-технической конференции «Будущее
технической науки». 2016. С. 447.
23
9. Македошин, А.С. Кинетика бактериального восстановления иоднитротетразолия /
А.С. Македошин, С.Ю. Радостин,А.А. Калинина, Т.Н. Соколова, В.Р. Карташов, В.Ф. // Сборник материалов XIII Международной молодежной научно-технической конференции «Будущее
технической науки». 2014. С. 368-369.
10. Радостин, С.Ю. Влияние состава питательной среды на экзометаболитный состав
бактерии Bacillus subtilis в ходе биокоррозии цинка / С.Ю. Радостин, А.С. Македошин, А.А.
Калинина, Т.Н. Соколова, В.Р. Карташов // Сборник материалов XIII Международной молодежной научно-технической конференции «Будущее технической науки». 2014. С. 373-374.
24
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа