close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Клиническое значение определения наивных Т- и В- клеток у больных с опухолями иммунной системы

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
ОБРАЗЦОВ
Игорь Владимирович
КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАИВНЫХ Т- И В-КЛЕТОК
У БОЛЬНЫХ С ОПУХОЛЯМИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ
14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология
Автореферат
диссертации на соискание учёной степени
кандидата медицинских наук
Москва 2017
1
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении
«Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии,
онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачёва» Министерства
здравоохранения Российской Федерации
Научный руководитель:
Доктор медицинских наук, профессор,
академик РАН
Румянцев Александр Григорьевич
Научный консультант:
Доктор медицинских наук, профессор
Продеус Андрей Петрович
Официальные оппоненты:
Доктор медицинских наук, профессор
Резников Юрий Петрович
Доктор медицинских наук, профессор
Гариб Фируз Юсупович
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный
центр «институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства
России
Защита состоится «___»__________2018 г. в 14-00 часов на заседании
диссертационного совета Д 208.072.05 на базе ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И.
Пирогова Минздрава России по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И.
Пирогова Минздрава России по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1 и
на сайте www.rsmu.ru
Автореферат разослан «___» ______________2018 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
кандидат медицинских наук, доцент
Т. Е. Кузнецова
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования
Опухоли иммунной системы, в частности, опухоли из клеток-предшественников Т- и Влимфоцитов являются наиболее распространенными среди гемобластозов детей и взрослых.
Острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) является наиболее частой формой лейкемии у пациентов
детского возраста - на долю ОЛЛ приходится 75-80% всех опухолевых заболеваний иммунной
системы у детей (3-4 случая на 100 тысяч детей в год) [Масчан, Мякова, 2006]. Современные
химиотерапевтические подходы обеспечивают высокую вероятность достижения ремиссии,
однако недостаточная иммунная реконституция становится причиной развития стойких и
рецидивирующих инфекционных осложнений после окончания интенсивной фазы лечения. У
взрослых удельный вес ОЛЛ в структуре опухолей иммунной системы составляет не более 20%,
при этом основной патологией взрослых является хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ).
Заболеваемость ХЛЛ составляет в среднем 3–3,5 случая на 100000 человек в год, увеличиваясь для
лиц старше 65 лет до 20, старше 70 — до 50 случаев на 100000 человек [Никитин, 2014; Северина
и др., 2014].
Формирующиеся в процессе лимфопоэза зрелые Т- и В-лимфоциты экспрессируют
уникальную специфичность Т- или В-клеточного рецептора (ТКР и ВКР, соответственно).
Гармоничный адаптивный иммунный ответ развивается за счёт клональной пролиферации Т- и Вклеток в ответ на антигенную стимуляцию через ТКР и ВКР. Колоссальное разнообразие
специфичностей ТКР и ВКР достигается благодаря процессам соматического мутагенеза,
включающим V(D)J рекомбинацию и соматическую гипермутацию [Cohn, 2016]. В редких случаях
эти процессы способствуют появлению мутаций в неприспособленных для того локусах генома:
активация
онкогена
или
подавление
опухолевого
супрессора
приводят
к
аномальной
пролиферации и/или блоку дифференцировки [Chen, Mellman, 2017]. В результате происходит
формирование и персистирование злокачественного клона, представленного фенотипически
зрелыми клетками, обладающими чертами активированных В-лимфоцитов в случае ХЛЛ, или
незрелыми лимфобластами при ОЛЛ [Porwit, Bene, 2015; Schmäh и др., 2017]. В обоих случаях
патологический клон обладает эволюционным преимуществом по сравнению с нормальными
лимфоцитами за счёт избыточной активации транскрипционных факторов, ответственных за
выживание и пролиферацию опухолевой стволовой клетки. Наличие патологического клона
приводит к непрерывной стимуляции антигенами опухолевых клеток, вызывающей ответное
формирование клонов нормальных Т- и В-лимфоцитов. Такие клоны обычно оказываются
функционально неполноценными; кроме того сужение антигенного репертуара Т- и В-клеток у
больных опухолями иммунной системы в результате избыточной клональной пролиферации
3
приводит к высокому риску инфекционных осложнений [Eyrich и др., 2009; Gutierrez, Armstrong,
Look, 2013].
Поэтому для определения глубины иммунологического дефекта при ОЛЛ и ХЛЛ
представляется целесообразной оценка антигенного репертуара Т- и В-лимфоцитов. Одним из
перспективных подходов для решения этой задачи является количественное определение
содержания эксцизионных колец Т-клеточного рецептора (ТРЭКов) и рекомбинационных колец κделеционного элемента (КРЭКов) В-клеток [Mensen и др., 2013; Sottini и др., 2014]. ТРЭКи
представляют собой внехромосомные эксцизионные продукты реаранжировки гена ТКР в
процессе V(D)J рекомбинации, которая происходит по мере созревания Т-лимфоцита в тимусе.
Аналогичен механизм формирования КРЭКов; они являются продуктом делеции Jκ-Cκ-интрона
при образовании нефункционального локуса IGK гена лёгких цепей иммуноглобулина.
Количественная
оценка
содержания
ТРЭКов
и
КРЭКов
в
лимфоцитах
позволяет
идентифицировать наивные Т- и В-клетки, покинувшие тимус или костный мозг, соответственно.
ТРЭКи и КРЭКи достаточно стабильны, они не реплицируются в процессе митоза, что позволяет
использовать их в качестве показателя пролиферативного потенциала тимуса и костного мозга, а
также широты антигенного репертуара Т- и В-лимфоцитов [Borte и др., 2014; Kanda и др., 2012;
Zelm и др., 2011].
Определение ТРЭКов и КРЭКов полуколичественными и качественными методами нашло
широкое применение в области диагностики и скрининга первичных иммунодефицитов; ведутся
работы по внедрению методологии в качестве мониторинга иммунной реконституции после
пересадки гематопоэтических стволовых клеток [Гордукова и др., 2015; Deripapa и др., 2017; Zelm
и др., 2011]. При этом на сегодняшний день отсутствуют данные по оценке иммунной
реконституции до и после интенсивных режимов химиотерапии при ОЛЛ, а также глубины
иммунного дефекта при ХЛЛ перед стартом специфического лечения. Кроме того, в работе
впервые используется отечественная тест-система, пригодная для симультанного определения
ТРЭКов и КРЭКов в образце, способная единовременно охарактеризовать содержание наивных Ти В-клеток прямым количественным образом.
Цель исследования: определить содержание и прогностическую значимость определения
наивных Т- и В-клеток у больных острым лимфобластным и хроническим лимфоцитарным
лейкозом.
Задачи исследования
1.
Построить референсные значения ТРЭКов и КРЭКов для детей и лиц старшего возраста
2.
Определить динамику содержания ТРЭКов и КРЭКов у детей с ОЛЛ в процессе лечения по
протоколу МВ-2015
4
3.
Определить содержание ТРЭКов и КРЭКов и оценить влияние различных режимов ПХТ на
Т- и В-клеточный неогенез у реконвалесцентов ОЛЛ на отдалённых сроках после проведения
протокола ОЛЛ-МВ-2008
4.
Определить содержание ТРЭКов и КРЭКов у пациентов с ХЛЛ, имеющих показания к
режиму ФЦР (флударабин, циклофосфамид, ритуксимаб), перед началом специфического
лечения
5.
Исследовать влияние цитогенетических и молекулярно-генетических перестроек на
созревание наивных Т- и В-клеток и оценить прогностическую значимость ТРЭКов и
КРЭКов у пациентов с ХЛЛ в контексте ответа на специфическую терапию
Научная новизна
Впервые проведена количественная оценка содержания ТРЭКов и КРЭКов у больных ОЛЛ и
ХЛЛ
с
помощью
отечественного
набора
БиТ-тест,
позволяющего
проводить
прямую
количественную оценку Т- и В-клеточного неогенеза. Построена динамика содержания ТРЭКов и
КРЭКов у больных ОЛЛ на фоне лечения. Показано усиление В-клеточного неогенеза после
проведения циторедукции у пациентов с ОЛЛ с последующим подавлением в процессе
цитостатической терапии. Впервые показано влияние L-аспарагиназы и краниального облучения
на иммунную реконституцию после констатации ремиссии у реконвалесцентов ОЛЛ.
Определён уровень ТРЭКов и КРЭКов у лиц старшего возраста; у больных ХЛЛ выявлено
значимое снижение содержания КРЭКов. Также у пациентов с ХЛЛ показано повышенное
содержание
ТРЭКов
в
группе
с
мутированными
генами
вариабельного
региона
иммуноглобулинов. Определено повышенное содержание КРЭКов у носителей мутации NOTCH1
по сравнению с пациентами, не имеющими мутаций NOTCH1. Выявлена ассоциация между
высоким уровнем ТРЭКов и наступлением полной ремиссии ХЛЛ.
Практическая значимость
Предложен способ оценки содержания ТРЭКов и КРЭКов у больных с пролиферативными
гематологическими
заболеваниями.
Подтверждена
нецелесообразность
использования
высокодозного метотрексата и выполнения краниального облучения у больных ОЛЛ из-за
подавления иммунной реконституции в долгосрочном периоде. Построенные референсные
значения для содержания ТРЭКов и КРЭКов пригодны к использованию при оценке Т- и Вклеточного неогенеза у иммунологически скомпрометированных лиц старшего возраста.
Исследование уровня ТРЭКов у больных ХЛЛ перед началом режима ФЦР даёт возможность
прогнозирования наступления полной ремиссии.
5
Положения, выносимые на защиту
1.
Тест-система для определения эксцизионных колец ТКР и ВКР, используемая в работе,
применима для оценки компартмента наивных Т- и В-клеток у детей и взрослых. Построены
референсные интервалы содержания ТРЭКов и КРЭКов: для детей норма содержания
ТРЭКов и КРЭКов составляет, соответственно 8100 – 23600 и 10000 – 26000 копий / 105
клеток у детей и 200 – 600 и 12000 – 26000 копий / 105 клеток у взрослых (р = 0,95). Эти
значения пригодны для использования в качестве нормативных параметров при определении
количества наивных лимфоцитов у детей и взрослых с различными нозологиями.
Подтверждено снижение содержания ТРЭКов, обусловленное возрастной инволюцией
тимуса и характеризующее сокращение пула наивных Т-клеток по мере взросления и
старения организма.
2.
На клинической модели ОЛЛ показана динамика неогенеза Т- и В-клеток у детей на фоне
выполнения терапевтических протоколов ОЛЛ МВ 2008 и 2015. Назначение специфического
лечения способствует повышению интенсивности созревания наивных В- и Т-клеток на
стадии индукции ремиссии, обусловленному подавлением активно пролиферирующего
опухолевого клона. Первичное восстановление неогенеза наивных лимфоцитов сменяется
его угнетением, связанным с воздействием антиметаболитов на лимфопоэтические
предшественники.
При
этом
костномозговое
созревание
В-клеток
полностью
восстанавливается в течение трёх лет после констатации ремиссии, в то время как дефицит
наивных Т-клеток сохраняется. Кроме того, снижение интенсивности долгосрочного
восстановления пула наивных Т-клеток выявлено в группе детей, получавших краниальное
облучение. Применение ПЭГ-аспарагиназы в индукционном блоке, напротив, способствует
усилению созревания наивных В-лимфоцитов у реконвалесцентов ОЛЛ.
3.
Обследование пациентов с ХЛЛ выявило у них значительное подавление костномозгового
созревания наивных В-клеток. Кроме того, определено снижение содержания ТРЭКов у
больных ХЛЛ с немутированными генами тяжёлых цепей иммуноглобулинов, а также у
носителей гомозиготного полиморфизма p53 Arg72Pro. Мутации NOTCH1 способствуют
повышению интенсивности созревания В-клеток в костном мозге. Показана ассоциация
между содержанием ТРЭКов и достижением полной ремиссии ХЛЛ после выполнения
протокола ФЦР. Доказанная предиктивная ценность показателя даёт возможность
клинического использования предлагаемого анализа для раннего прогнозирования эффекта
терапии.
6
Внедрение результатов исследования
Результаты, полученные в ходе исследования, внедрены в практическую деятельность отдела
научного проектирования и контролируемых клинических исследований ФГБУ НМИЦ ДГОИ им.
Д. Рогачёва МЗ РФ, консультативно-диагностического центра детской иммунологии и
аллергологии ГБУЗ «ДГКБ №9 им. Г. Н. Сперанского» ДЗМ и отделения клинической
иммунологии и ревматологии ФГБУ «РДКБ» МЗ РФ.
Апробация работы
Результаты работы были представлены в виде устных сообщений и тезисов конференций:
10th ENII EFIS EJI Immunology Summer School, 12 – 19 мая 2015 года, Порто Черво, Италия; 5th
Translational Immunology School, 25 – 27 февраля 2016 года, Потсдам, Германия; III конгресс
гематологов России, 14 – 16 апреля 2016 года, Москва, Россия; 10th SIOP Asia Congress, 25 – 28
мая 2016 года, Москва, Россия. Апробация работы состоялась на объединённой научнопрактической
конференции
клинической
онкологии,
отделений
иммунологии,
детской
гематологии/онкологии,
клинической
физиологии;
отдела
оптимизации
лечения
иммунодефицитов, отдела трансляционных и клеточных исследований, лаборатории цитогенетики
и молекулярной генетики, лаборатории молекулярной биологии федерального государственного
бюджетного
учреждения
«Национальный медицинский исследовательский центр детской
гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачёва» 06 июля 2017, протокол заседания
№ 2/17-18 от "06" июля 2017 г.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них 3 статьи в рецензируемых
научных журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства
образования и науки РФ для публикаций основных результатов диссертаций на соискание ученой
степени кандидата медицинских наук.
Структура и объём диссертации
Диссертация изложена на 169 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора
литературы, описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных
исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка
использованной литературы и приложения. Работа иллюстрирована 6 таблицами и 26 рисунками.
Список литературы содержит 289 библиографических источников, в том числе 21 отечественную
и 268 иностранных публикаций.
7
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Клиническая характеристика больных
Всего обследовано 507 проб крови, полученных от 213 пациентов, и 90 проб от 90 условноздоровых индивидов. В исследовании участвовали 104 ребёнка с ОЛЛ (55 на стадии ремиссии и 49
в первом остром периоде) и 109 пациентов с В-ХЛЛ, а также 35 условно-здоровых взрослых
индивидов и 55 детей в качестве контрольной группы. Общая характеристика пациентов
представлена в таблицах 1-2.
Таблица 1
Общая характеристика пациентов с ОЛЛ
Группа
Показатель
Средний возраст (коэфф. вариации),
диапазон, лет
Мальчики / девочки
Длительность
ремиссии
(коэфф.
вариации), диапазон, мес.
Иммунофенотип
В1
В2
В3
В2 / В3
Т2
Т3
Т4
Цитогенетические
Отсутствуют
аномалии
t(12;21)
t(1;19)
t(9;22)
Другие
ПЭГ-аспарагиназа в 3 Есть
день индукции
Нет
Высокие
дозы Есть
метотрексата в первой Нет
фазе консолидации
Краниальное облучение Есть
Нет
Реконвалесценты
(n = 55)
n
%
6,8 (47%), 2 - 12
Первый острый
период (n = 49)
n
%
5,5 (83%), 2 - 17
28 / 27
33,4 (48,8%), 7 - 70
23 / 26
-
0
30
6
6
3
9
1
41
11
3
0
0
37
18
21
34
0
54,5
10,9
10,9
5,5
16,4
1,8
74,5
20
5,5
0
0
67,3
32,7
38,2
61,8
1
36
3
1
0
1
1
25
11
1
2
10
49
0
0
49
2
73,5
6,1
2
0
2
2
51
22,4
2
4
20,4
100
0
0
100
22
33
40
60
0
49
0
100
8
Таблица 2
Общая характеристика пациентов с ХЛЛ (n = 109)
Показатель
Средний возраст (коэфф. вариации), диапазон, лет
Мужчины / женщины
A
Стадия по Binet
B
C
Среднее количество блоков ФЦР (коэфф. вариации), диапазон
Отсутствие ответа
Частичная ремиссия
Исход
Частичная ремиссия с МОБ
Полная ремиссия
Полная ремиссия с МОБ
Смерть до старта терапии
Мутационный статус генов Мутированный
тяжёлых
цепей Немутированный
иммуноглобулинов
Не определялся
del 13q14
Цитогенетические
del 11q23
аномалии
tris 12
del 17p
Отсутствуют
Молекулярные перестройки SF3B1
NOТCH1
TP53
Отсутствуют
Однонуклеотидный
Arg / Arg
полиморфизм 72 кодона Arg / Pro
P53
Pro / Pro
Не определялся
n
%
58,2 (16%), 33 - 79
71 / 38
11
10,1
76
69,7
22
20,2
5 (30%), 1 - 6
16
14,7
29
26,6
11
10,2
36
33
4
3,7
2
1,8
28
32,5
58
67,5
23
53
48,6
20
18,3
13
11,9
9
8,3
14
12,8
14
12,8
17
15,6
11
10
67
61,5
56
59,6
34
36,2
4
4,2
16
-
Характеристика терапии по протоколам МВ-2008 и МВ-2015 у детей с ОЛЛ
Все больные-реконвалесценты ОЛЛ получили лечение по протоколу ОЛЛ МВ-2008,
включающее интенсивный цикл индукции, три блока консолидации и поддерживающую терапию.
Индукционный блок (рисунок 1) состоит из предварительной фазы (дни 1 - 7), подразумевающей
начало терапии дексаметазоном с постепенным наращиванием дозы и однократное введение ПЭГаспарагиназы на 3 день терапии. При этом часть пациентов, включённых в исследование МВ-2008,
не получает ПЭГ-аспарагиназу в рамках рандомизации. Основная фаза (дни 8 - 28) индукционного
блока включает продолжение дексаметазона; струйные внутривенные введения винкристина в 8,
15, 22, 29 и 36-ой дни, рубомицина на 8 и 22 дни терапии, а также интратекальные инъекции
метотрексата, цитозара и преднизолона в 0/1, 8, 15, 22, 29 и 36-ой дни лечения. Доза дексаметазона
постепенно снижается, начиная с 29 дня.
9
Консолидация состоит из 3-х фаз и
представляет собой 6-ти недельную терапию 6меркаптопурином,
метотрексатом
и
L-
аспарагиназой, с последующей 2-х недельной
реиндукцией – дексаметазон, винкристин и
интратекальные
введения
трёх
препаратов
(рисунок 2).
Часть больных-реконвалесцентов ОЛЛ,
лечившихся по протоколу МВ-2008, получили 3
введения
высоких
доз
(2000
мг/м2)
метотрексата в первую фазу консолидации в
рамках рандомизации 2; а также краниальное
облучение в дозе 12 Гр на 31 – 32 неделе
протокола вместо шести интратекальных введений в рамках рандомизации 3. Все пациенты в
первом остром периоде ОЛЛ, включённые в исследование МВ-2015, получили низкие дозы
метотрексата и подверглись люмбальным пункциям.
Следует отметить высокую эффективность описанных протоколов лечения (показатели
общей и бессобытийной выживаемости для исследования МВ-2008 составляют, соответственно,
86 ± 1 % и 81 ± 1 %); все обследованные пациенты в первом остром периоде ОЛЛ, получившие
лечение по протоколу МВ-2015 достигли ремиссии к окончанию цикла индукции. К основным
осложнениям
можно
относятся
инфекционные эпизоды различной природы,
развивающиеся на всех этапах лечения. Эти
осложнения развиваются у 62,4 % больных
(по данным исследования МВ-2008), причём
45,8
%
инфекции,
представляют
собой
включающие
тяжёлые
пневмонии,
энтероколиты, менингиты, а также грибковые
инфекции. Развитие тяжёлой инфекции не
только увеличивает риск для пациента, но и
может привести к нарушению временных
рамок
выполнения
элементов
протокола
терапии, что ухудшает долгосрочный прогноз
по основному заболеванию. Среди детей в
10
первом остром периоде ОЛЛ у 20 из 49 (40,8 %) обследованных в течение индукционного блока
развились инфекционные эпизоды, представленные мукозитами и энтероколитами в первой
половине индукции и тяжёлыми инфекциями во второй половине блока. Кроме того, у 19 больных
(38,7 %) инфекционные эпизоды отмечались в течение первой консолидации, у 11 (22,4 %) – во
второй и у 6 (12,2 %) – в третьей.
Исследование уровня ТРЭКов и КРЭКов выполнялось однократно при контрольном
обследовании у пациентов в ремиссии ОЛЛ и для семи контрольных моментов наблюдения у
больных в первом остром периоде: при поступлении перед началом терапии (день 0), в дни
индукции 8, 15 и 36, а также перед началом трёх циклов реиндукции.
Характеристика терапии по схеме ФЦР у взрослых с ХЛЛ
Пациенты с ХЛЛ группы высокого риска (стадии III и IV по Rai) получали специфическое
лечение по схеме:

Ритуксимаб 375 мг/м2 в день 1 с увеличением дозы до 500 мг/м2 в последующих циклах

Циклофосфамид 250 мг/м2 в дни 1 – 3

Флударабин 25 мг/м2 в дни 1 - 3
Характеристика групп сравнения
В качестве контрольных групп для взрослых и детей, в исследовании участвовали 35
взрослых
индивидов
без
острых
воспалительных,
аутоиммунных,
гематологических
и
онкологических заболеваний (средний возраст 68 ± 9 лет) и 55 условно-здоровых детей (средний
возраст 9 ± 2 года).
Определение уровня эксцизионных колец
Количественная оценка ТРЭКов и КРЭКов выполнена методом ПЦР в реальном времени
(БиТ-тест, Новосибирск, РФ). Экстракцию ДНК из цельной крови проводили с помощью
комплекта реагентов "АмплиПрайм РИБО-преп" (ООО НекстБио). Объем клинического материала
для экстракции ДНК составлял 100 мкл, элюцию также проводили в 100 мкл РНК-буфера. Для
количественной оценки молекул TREC и KREC использовали ПЦР в режиме реального времени с
условиями, описанными в инструкции к набору реагентов; в качестве эндогенного внутреннего
контроля используется ген человека IL17RA. Программа амплификации включала стадию
активации Taq-полимеразы в течение 15 мин при 95° С, затем 45 циклов: 95 °С - 10 сек, 61° С - 30
сек, 72° С - 15 сек с детекцией флуоресцентного сигнала на стадии гибридизации праймеров.
Амплификацию проводили на приборе CFX-96 (Bio-rad).
11
Количественную оценку содержания эксцизионных колец оценивали по формулам:
Для реконвалесцентов ОЛЛ и лиц контрольной группы:
Кол-во ТРЭК (КРЭК) = (кол-во копий ТРЭК (КРЭК) на мл / кол-во копий IL17RA) ∙ 200000
Для больных в первом остром периоде ОЛЛ:
Кол-во ТРЭК (КРЭК) = (кол-во копий ТРЭК (КРЭК) на мл / (кол-во копий IL17RA ∙(1 - доля клеток
ОЛЛ – доля гранулоцитов) ) ∙ 200000
Для больных ХЛЛ:
Кол-во ТРЭК (КРЭК) = (кол-во копий ТРЭК (КРЭК) на мл / (кол-во копий IL17RA ∙(1 - доля клеток
ХЛЛ) ) ∙ 200000
Статистические методы исследования
Статистическая обработка результатов проведена в пакете SPSS 19 (IBM, США). Для
обработки, систематизации и визуализации данных построены описательные статистики (среднее,
медиана, 95% и 99% доверительные интервалы, интерквартильный размах). Для сравнения
средних и медиан использованы, соответственно, t-критерий Стьюдента с преобразованием БоксаКокса (для распределений, отличающихся от нормального), и непараметрические статистики
Уилкоксона, Манна-Уитни и Краскела-Уоллеса. Важность факторов для содержания ТРЭКов и
КРЭКов в группах реконвалесцентов ОЛЛ, получивших разные терапевтические опции, оценена
методом ближайшего соседа. Корреляционный анализ проведён с использованием коэффициентов
корреляции Пирсона, при этом тесноту связи между признаками оценивали по шкале Чеддока
(слабая при 0 < η ≤ 0,33; умеренная при 0,33 < η ≤ 0,66; сильная при 0,66 < η < 1). Значимость
содержания эксцизионных колец для прогнозирования ответа на терапию оценивали методом
ROC-анализа.
12
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При исследовании уровня ТРЭКов в общих
группах ремиссии и первого острого периода ОЛЛ на
инициальном
этапе
терапии
(день
0)
выявлено
отсутствие значимых различий между содержанием
колец в контрольной группе условно здоровых детей и
в группе первого острого периода ОЛЛ. Пациенты в
ремиссии ОЛЛ характеризуются значимым (р < 0,001)
снижением уровня ТРЭКов как по сравнению с
группой больных на инициальном этапе терапии, так и
по сравнению с контрольной группой (рис. 3). Эти
данные свидетельствуют о значительном токсическом воздействии интенсивной фазы ПХТ на
созревание наивных Т-лимфоцитов в тимусе на фоне отсутствия явного подавляющего
воздействия опухолевого клона, причём дефект неогенеза Т-клеток сохраняется не менее трёх лет
после констатации ремиссии. Поэтому можно предположить, что сокращение антигенного
репертуара ТКР является одним из факторов восприимчивости к вирусным инфекциям детейреконвалесцентов ОЛЛ.
Исследование динамики содержания ТРЭКов у больных ОЛЛ на фоне лечения выявило
значимое (p < 0,05) нарастание уровня эксцизионных колец, выходящего на плато после 15 дня
индукции и прогрессивно снижающегося после начала первой реиндукции (рис. 4, А). Такая
динамика
интенсивности
созревания
наивных
Т-клеток
может
быть
обусловлена
последовательностью воздействия цитостатиков в процессе индукции. Повышение содержания
ТРЭКов к 15 дню индукции вероятно связано с элиминацией бластной нагрузки в процессе
циторедуктивной фазы и подавлением пролиферации опухолевого клона введением Lаспарагиназы на третий день. При этом отсутствие ингибирующего действия L-аспарагиназы на Тклеточный неогенез объясняется селективностью воздействия препарата на опухолевые клетки,
лишённые в отличие от нормальных предшественников лимфоцитов системы синтеза
собственного аспарагина.
13
Позитивное влияние
элиминации бластов ОЛЛ
на созревание наивных Тклеток
косвенно
подтверждается
достоверным (p < 0,05)
значительным
содержания
снижением
ТРЭКов
у
пациентов
с
гиперлейкоцитозом (рис. 4, Б). При этом значимые корреляции между уровнем ТРЭКов и
бластозом периферической крови либо костного мозга не получены. Следовательно, только случаи
ОЛЛ,
характеризующиеся
избыточным
пролиферативным
потенциалом
опухолевого
предшественника, сопровождаются угнетением Т-клеточного неогенеза в тимусе. Дальнейшее
проведение терапии по протоколу МВ-2015 приводит к постепенному снижению продукции
наивных Т-клеток тимусом, связанному с воздействием винкристина и даунорубицина,
неспецифически подавляющих митоз и синтез нуклеиновых кислот.
Исследование содержания КРЭКов выявило значимое (p < 0,01) повышение их содержания у
первичных пациентов с ОЛЛ, как по сравнению с контрольной группой, так и по сравнению с
группой реконвалесцентов. При этом различия в уровне КРЭКов между контрольной группой и
группой реконвалесцентов не выявлены (рис. 5, А), что свидетельствует о восстановлении Вклеточного неогенеза в долгосрочном периоде после достижения ремиссии и выполнения
протокола МВ-2015. Увеличение содержания КРЭКов у больных в первом остром периоде ОЛЛ
может характеризовать повышенную пролиферативную активность В-клеточного ростка,
спровоцированную как стимуляцией антигенами клеток ОЛЛ, так и факторами микроокружения.
Анализ изменения содержания КРЭКов в процессе интенсивной фазы лечения выявил
незначительное увеличение их
количества
после
начала
циторедукции и введения Lаспарагиназы,
получения
однако
для
достоверных
данных требуется дальнейшее
расширение выборки. Начало
терапии
винкристином
даунорубицином
и
в
14
индукционном цикле приводит к развитию значимого (р < 0,05) дефекта созревания наивных Вклеток (рис. 5, Б), наиболее выраженного в начале первой реиндукции.
Исследование содержания ТРЭКов и КРЭКов у пациентов в ремиссии выявило значимую (р
< 0,01) сильную (η = 0,81) корреляцию между их уровнями, свидетельствующую о координации
темпов созревания наивных Т- и В-клеток у этих больных. Кроме того, установлена значимая (р <
0,01) корреляция η = 0,57 между ТРЭКами и КРЭКами, исчезающая к окончанию индукционного
цикла, у больных в первом остром периоде. Таким образом, воздействие цитостатических
препаратов не только подавляет Т- и В-клеточный неогенез, но и вызывает дискордантность
созревания наивных Т- и В-лимфоцитов.
Исследование ТРЭКов и КРЭКов выявило различное влияние терапевтических ветвей
рандомизации
на
иммунологическую
реконституцию
у
реконвалесцентов.
Так,
первая
рандомизация разделяет больных на группы получающих и не получающих пегилированную
(ПЭГ) L-аспарагиназу на третий день цикла индукции. Анализ уровня эксцизионных колец выявил
повышение среднего содержания КРЭКов (р < 0,05, соответственно, рис. 6, А) у пациентов,
получивших ПЭГ-аспарагиназу. При этом медиана содержания эксцизионных колец не
различалась
в
обследуемых
совокупностях.
Поэтому
применение
ПЭГ-аспарагиназы
целесообразно не только для уменьшения риска рецидива, но и для увеличения темпов
восстановления созревания наивных В-клеток.
Введение высокодозного метотрексата (2000 мг/м2) в цикле первой консолидации оказалось
ассоциировано с подавлением как Т-, так и В-клеточного неогенеза в отдалённом периоде после
наступления ремиссии. Это обстоятельство может быть причиной сокращения безрецидивной
выживаемости и увеличения смертности в ремиссии, связанного, согласно результатам
исследования МВ-2008, с применением высоких доз метатрексата – однако для достоверности
вывода требуется расширение обследуемой совокупности. Применение краниального облучения
также негативно влияет на долгосрочную иммунологическую реконституцию у больных ОЛЛ. В
группе
получивших
пациентов,
лучевую
терапию, было достоверно
(р < 0,05) снижено среднее
содержание
Т-клеточных
эксцизионных колец (рис.
6, Б). Примечательно, что
при долгосрочном периоде
наблюдения, по данным
15
МВ-2008, лучевая терапия способствует меньшему риску развития рецидива основного
заболевания, вероятно, за счёт воздействия на клетку-предшественника опухоли. В связи с этим
можно констатировать значительный неспецифический супрессорный системный эффект
краниального облучения, реализующийся как в предшественниках ОЛЛ, так и в созревающих Тлимфоцитах.
Подавляющее воздействие облучения на иммунореконституцию было подтверждено
методом ближайшего соседа: при исследовании вклада каждой из терапевтических опций и
длительности ремиссии в распределение уровня эксцизионных колец выявлено, что уровень
КРЭКов определяется, в первую очередь, лучевой терапией, а также длительностью ремиссии.
Уровень ТРЭКов, с другой стороны, определяется всеми указанными факторами в равной мере
(таб. 3)
Таблица 3
Важность клинических факторов для содержания эксцизионных колец
ТРЭКи
КРЭКи
Рандомизация 1
0,27
0,00
Рандомизация 2
0,26
0,00
Рандомизация 3 Длительность ремиссии
0,23
0,23
0,80
0,20
16
Исследование влияния возраста испытуемых на
уровень ТРЭКов подтвердило литературные данные о
сокращении пула наивных Т-клеток в течение жизни по
мере инволюции тимуса. Так, содержание ТРЭКов в
группе здоровых детей (средний возраст 9 лет) оказалось
значимо (р < 0,001) выше по сравнению с контрольной
группой условно-здоровых взрослых (средний возраст 68
лет, рис. 7, А). При этом совокупность здоровых детей
умеренно неоднородна по возрасту (размах вариации 18
лет, CV = 52,3 %); совокупность условно здоровых
взрослых по возрасту однородна (размах вариации 18 лет,
CV = 26,3 %). Выявлена слабая обратная взаимосвязь между количеством ТРЭКов и возрастом у
детей (η = –0,22). Различия в функциональной активности тимуса показаны для группы взрослых
больных ХЛЛ. Средний возраст больных в этой группе составил 58 ± 2 года. Корреляционный
анализ показал ассоциацию умеренной силы между сниженным содержанием ТРЭКов и возрастом
больных (η = -0,40, р < 0,05, рис. 7, Б).Сопоставление содержания эксцизионных колец у больных
ХЛЛ и в контрольной группе условно-здоровых взрослых выявило отсутствие статистически
значимых различий между уровнями ТРЭКов на фоне значительного достоверного (р < 0,001)
уменьшения содержания КРЭКов в группе пациентов с ХЛЛ (рис. 8). Референсные значения
содержания ТРЭКов и КРЭКов в контрольной группе условно-здоровых взрослых составили,
соответственно, 200 – 600 копий / 105 клеток и 12000 – 26000 копий / 105 клеток. Таким образом,
подтверждается подавление клоном ХЛЛ созревания наивных В-клеток в костном мозге, в
отличие от ОЛЛ, при котором наблюдается некоторое повышение содержания КРЭКов в первом
остром периоде заболевания на инициальном этапе лечения. Однако ни та, ни другая патология не
оказывает достоверного влияния на Т-клеточный неогенез в тимусе. Определено влияние
различных цитогенетических и молекулярно-генетических
факторов ХЛЛ на формирование наивных Т- и В-клеток. У
больных
с
мутациями
иммуноглобулинов
(M-ХЛЛ)
генов
тяжёлых
содержание
цепей
ТРЭКов
статистически значимо (р < 0,05) выше по сравнению с
группой больных без мутаций (рис. 9), при этом значимые
различия в уровне КРЭКов не выявлены. Делеция 13q14
выявлена у 53 больных (48,6 %) из 109 обследованных;
сочетаний с делецией 11q23 из них – 8 (15,1 %), с трисомией
17
12 – 1 (1,9 %), с делецией 17р – 4 (7,5 %). Кроме того, делеция 13q14 сочеталась с мутацией SF3B1
и NOTCH1 в 7 случаях (13,2 %) каждая, с мутацией ТР53 – в 6 случаях (11,3 %). Среднее
содержание ТРЭКов и КРЭКов у больных с делецией 13q14 статистически значимо не отличалось
от такового у пациентов без аномалии. Доля клеток ХЛЛ с делецией составила 80,5 ± 5,4 %,
причём выявлена статистически значимая (р < 0,05) слабая обратная взаимосвязь (η = - 0,21)
между уровнем делеции и количеством ТРЭКов, что говорит о сокращении антигенного
репертуара ТКР при увеличении содержания делеции 13q14. В обследованной совокупности
пациентов с ХЛЛ делеция 17р определена у 9 больных из 109 (8,3 %); содержание делеции
составило 67,7 ± 22,6 %. При этом выявлена отрицательная корреляция средней силы между
содержанием делеции и уровнем ТРЭКов (η = –0,38), что свидетельствует о возможном
подавлении продукции наивных Т-клеток в тимусе и сокращении антигенного репертуара ТКР при
повышении количества делеции 17р в клетках ХЛЛ. 8 из 9 (88,9 %) случаев делеции 17р
сопровождались мутацией ТР53, в одном случае (11,1 %) делеция 17р сочеталась с мутацией
NOTCH1. Среднее содержание КРЭКов значимо (р < 0,05) выше по сравнению с группой
пациентов без мутаций NOTCH1 (рис. 10, А). Один случай (5,9 %) мутации NOTCH1
сопровождался мутацией ТР53. Однонуклеотидный полиморфизм 72 кодона экзона 4 ТР53
проявляется в замене CGC на CCC и, как следствие, в замене аргинина на пролин (Arg72Pro) в
положении 72 белка р53. Вариант дикого типа (Arg) является более мощным индуктором
апоптоза, в то время как мутантный вариант (Pro) способствует блоку клеточного цикла и
репарации ДНК, оказывая таким образом протективное влияние на опухолевую клетку. Уровень
ТРЭКов оказался статистически значимо (р < 0,05) выше в группах с гетерозиготными заменами и
с геном дикого типа (рис. 10, Б), что свидетельствует о сужении антигенного репертуара ТКР при
наличии гомозиготного полиморфизма p53 Arg72Pro. Оценили содержание эксцизионных колец
при различных клинических исходах после выполнения специфического лечения. Все пациенты
получили в среднем 5 циклов по протоколу ФЦР. Полная ремиссия сопровождалась значимо более
высоким уровнем ТРЭКов по сравнению со значением показателя в группах отсутствия ответа (р <
0,01) и частичной ремиссии (р <
0,05). Наличие МОБ на фоне
полной
ремиссии,
зарегистрированное
у четырёх
пациентов, также ассоциировано
со
значимым
(р
<
0,001)
снижением содержания ТРЭКов.
Двое
пациентов
погибли
до
18
начала
специфической
терапии от пневмонии; у
одного из них эксцизионные
кольца отсутствовали вовсе,
у второго уровень ТРЭКов
составил 17 копий, КРЭКов
– 219 копий. Таким образом,
у
пациентов,
достигших
полной ремиссии основного
заболевания в результате лечения, перед стартом терапии определялся более высокий уровень
ТРЭКов (p < 0,05) по сравнению с другими исходами (рис. 11, А). ROC анализ (рис. 11, Б)
подтвердил
высокую
прогностическую
значимость
ТРЭКов
в
контексте
наступления
благоприятного исхода в виде полной ремиссии без МОБ (площадь под кривой для ТРЭКов равна
0,713); уровень чувствительности составил 72%, уровень специфичности – 70% (р = 0,001).
Резюмируя данные, полученные в группе больных с ХЛЛ, можно выделить две группы
факторов, ассоциированных с количеством эксцизионных колец ТКР и ВКР как индикаторов их
антигенного репертуара. Эти факторы характеризуют функциональную активность тимуса и
костного мозга с одной стороны и воздействие лейкемических клеток с другой. Со стороны клеток
ХЛЛ к таким факторам, согласно нашим данным, относятся мутационный статус IGHV и мутации
NOTCH1. Вариант ХЛЛ с мутациями VH-генов, напротив, характеризует более высокий уровень
ТРЭКов, что свидетельствует о меньшей степени дисфункции Т-клеток и большем антигенном
репертуаре ТКР при прогностически более благоприятном варианте ХЛЛ. Полученные данные
доказывают роль дисфункции Т-клеточного звена в патогенетическом эффекте обозначенных
внутриклеточных событий при ХЛЛ, эта дисфункция может быть обусловлена формированием
патологических клонов Т-клеток. Вторая группа факторов, воздействующих на функциональную
активность тимуса, объединяет возраст и коморбидность. Пожилой возраст сам по себе является
неблагоприятным прогностическим фактором ХЛЛ; пожилые пациенты обычно страдают
бóльшим количеством сопутствующих заболеваний, препятствующих проведению интенсивного
лечения. Доказано снижение количества ТРЭКов, сопровождающее снижение разнообразия
репертуара Т-клеток, по мере увеличения возраста здоровых испытуемых. В обследованной нами
общей выборке больных ХЛЛ подтверждена обратная взаимосвязь между содержанием ТРЭКов и
возрастом пациентов (η = -0,35, р < 0,01), которая оказалась ещё сильнее в однородной группе
пациентов со стадией В (η = -0,41, р < 0,01). Поэтому правомерно утверждать, что сокращение
широты репертуара ТКР с возрастом является одним из неблагоприятных факторов у пациентов с
ХЛЛ.
19
Полученные
позволяют
результаты
предложить
концептуальную
схему
патологического
взаимодействия
лейкемического клона с Т- и Вклетками организма-хозяина (рис.
12). Так, согласно литературным
данным, выживание и пролиферация
клетки ХЛЛ реализуется благодаря клеткам ниши, обменивающимся с опухолевой клеткой
сигналами в форме цитокинов и хемокинов. Контроль заболевания и достижение стойкой
ремиссии реализуется благодаря уничтожению клеток ХЛЛ Т-цитотоксическими лимфоцитами и
подавлению протективного влияния клеток ниши Т-хелперами, при этом эффективная работа Тклеточного звена возможна только при наличии широкого антигенного репертуара ТКР. Сужение
антигенного репертуара происходит как из-за дефицита функции тимуса, обусловленного
возрастом, так и вследствие формирования патологических функционально неполноценных Тклеточных клонов за счёт воздействия лейкемических клеток, несущих немутированные гены
IGHV или однонуклеотидные замены ТР53 Arg72Pro. В результате происходит ослабление
противоопухолевого иммунного надзора, и, как следствие, иммунная эвазия лейкемического
клона, проявляющаяся в виде полной или частичной рефрактерности к лечению или
персистирования остаточной болезни. Подавление созревания полноценных наивных В-клеток в
костном мозге вносит дополнительный вклад в развитие инфекционных осложнений у больных
ХЛЛ, также способствующих сужению антигенного репертуара ТКР.
Таким образом, антигенный репертуар Т-клеток важен как прогностический фактор при
ХЛЛ, поскольку является комплексным индикатором воздействия лейкемических клеток и
факторов пациента. Это подтверждается нашими данными о повышенном количестве ТРЭКов у
больных, достигших полной ремиссии после прохождения режима ФЦР, а также результатами
ROC анализа.
Возможность прогностического использования КРЭКов пока находится под вопросом. Не
выявлены взаимосвязи ни с клиническими, ни с большинством лабораторных показателей;
выявленное расширение репертуара ВКР при наличии мутаций NOTCH1 требует дальнейшего
исследования. Однако, обнаруженное значительное сужение репертуара В-клеток у больных ХЛЛ
в общей группе, что может быть следствием как подавления продукции нормальных В-клеток, так
и их клональной периферической пролиферации.
20
Выводы
1. Построены референсные значения ТРЭКов и КРЭКов для детей и лиц старшего возраста.
Для детей нормативные показатели ТРЭКов и КРЭКов составляют, соответственно, 8100 –
23600 и 10000 – 26000 копий / 105 клеток; для взрослых - 200 – 600 и 12000 – 26000 копий /
105 клеток.
2. Определена динамика содержания ТРЭКов и КРЭКов у детей с ОЛЛ в процессе лечения по
протоколу МВ-2015. Показано нарастание уровня ТРЭКов, который выходит на плато
после 15 дня индукции и прогрессивно снижается
после начала первой реиндукции;
пониженный уровень ТРЭКов сохраняется у детей-реконвалесцентов ОЛЛ в долгосрочном
периоде после наступления ремиссии. В процессе индукции также наблюдается увеличение
интенсивности созревания наивных В-клеток после начала циторедукции и введения Lаспарагиназы; дальнейшее выполнение протокола приводит к практически полному
подавлению костномозгового В-клеточного неогенеза, который восстанавливается до
нормального уровня в течение трёх лет после констатации ремиссии.
3. У детей-реконвалесцентов ОЛЛ, получивших терапию МВ-2008, показано нормальное
содержание КРЭКов и пониженное содержанием ТРЭКов, причём уровень КРЭКов
определяется, в первую очередь, лучевой терапией, а также длительностью ремиссии.
Уровень ТРЭКов, с другой стороны, определяется длительностью ремиссии и всеми
терапевтическими опциями исследования МВ-2008 в равной мере. Выявлено снижение
содержания КРЭКов у детей, не получавших ПЭГ-аспарагиназу в цикле индукции, а также
снижение уровня ТРЭКов в группе пациентов, получавших краниальное облучение.
4. Определено значительное снижение уровня КРЭКов на фоне неизменного содержания
ТРЭКов у пациентов с ХЛЛ высокого риска, имеющих показания к режиму ФЦР.
5. Доказано повышенное содержание ТРЭКов в группе пациентов с мутированными генами
вариабельного региона иммуноглобулинов по сравнению с немутированными, повышенное
содержание КРЭКов у носителей мутации NOTCH1 по сравнению с её отсутствием, а также
сниженный уровень ТРЭКов в группе с гомозиготным полиморфизмом p53 Arg72Pro.
Исследование исходов терапии показало ассоциацию между высоким уровнем ТРЭКов и
наступлением полной ремиссии основного заболевания.
Практические рекомендации
1. Определение уровня ТРЭКов и КРЭКов показано у детей в первом остром периоде ОЛЛ в
дни 0, 8 , 15 и 36, а также перед каждым блоком реиндукции для оценки тяжести
иммуносупрессии, вызванной проведением специфической терапии. При этом снижение
21
уровня эксцизионных колец свидетельствует о повышенном риске развития инфекционных
осложнений.
2. Выполнение исследования уровня эксцизионных колец рекомендуется для оценки
иммунологической реконституции у детей в ремиссии ОЛЛ. При этом снижение
содержания КРЭКов в отдалённых сроках ремиссии является признаком неполноценного
восстановления созревания наивных В-клеток в костном мозге.
3. Для оценки вероятности достижения ремиссии у больных ХЛЛ группы высокого риска
целесообразно определение уровня ТРЭКов: снижение показателя ассоциировано с худшим
прогнозом.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Эксцизионные кольца V(D)J рекомбинации B- и T-клеток как прогностический маркер при Вклеточном хроническом лимфоцитарном лейкозе / И.В. Образцов, М.А. Гордукова, Н.А.
Северина, Б.В. Бидерман, С.Ю. Смирнова, А.Б. Судариков, Е.А. Никитин, А.Г. Румянцев //
Клиническая онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика.
2017. Т. 10. № 2. С. 131-140.
2. Разнообразие антигенного репертуара В- и Т-клеток как прогностический маркер при
хроническом лимфоцитарном лейкозе / И.В. Образцов, М.А. Гордукова, Н.А. Северина, Б.В.
Бидерман, С.Ю. Смирнова, А.И. Карачунский, В.Н. Касаткин, А.Б. Судариков, Е.А. Никитин //
Гематология и трансфузиология. 2016. № 61 (1). Приложение 1 С. 154
3. Эксцизионные кольца V(D)J рекомбинации b- и t-клеток как показатели иммунологической
реконституции у детей с острым лимфобластным лейкозом / И.В. Образцов, М.А. Гордукова,
Е.В. Цветкова, Е.В. Кононова, И.Я. Томилин, К.Л. Кондратчик, А.Ф. Карелин, А.П. Продеус,
А.И. Карачунский, А.Г. Румянцев // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в
педиатрии .— 2016 .— №4. — С. 43-51
4. V(D)J recombination excision circles as markers of T- and B-cell immune reconstitution in patients
with acute lymphoblastic leukaemia / I.V. Obraztsov, M. A. Gordukova, E.V. Kononova, I.Y.
Tomilin, A.P. Prodeus, A.G. Rumyantsev // 10th SIOP Asia Abstract book. 2016. P. 16
5. Эксцизионные кольца Т-клеточного рецептора и рекомбинационные кольца κ-делеционного
элемента: иммунобиология, подходы к оценке, применение в клинической практике / И.В.
Образцов, А.П. Продеус, А.Г. Румянцев // Российский иммунологический журнал. - 2015. - Т.
9. № 3 (18). - С. 251-260.
22
Список сокращений
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота
МОБ – минимальная остаточная болезнь
мяРНК – малая ядерная рибонуклеиновая кислота
ОЛЛ – острый лимфобластный лейкоз
ПХТ – полихимиотерапия
РНК – рибонуклеиновая кислота
ТРЭК – эксцизионное кольцо ТКР
КРЭК – эксцизионное кольцо κ-делеционного элемента
ХЛЛ – хронический лимфоцитарный лейкоз
ПХТ – полихимиотерапия
ПЦР – полимеразная цепная реакция
ПЭГ – полиэтиленгликоль
ФЦР – флударабин, циклофосфамид, ритуксимаб
AUC – площадь под кривой (area under the curve)
CV – коэффициент вариации
ВКР – В-клеточный рецептор
ТКР – Т-клеточный рецептор
NS – не значимо (not significant)
23
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
6
Размер файла
1 552 Кб
Теги
клеток, иммунной, клинические, система, больных, опухолями, определение, значение, наивных
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа