close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Механизмы эксайтотоксичности при повторном действии глутамата роль нарушения Са2+ и Na+ гомеостаза и функционального состояния митохондрий

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Шарипов
Ринат Рашидович
МЕХАНИЗМЫ ЭКСАЙТОТОКСИЧНОСТИ
ПРИ ПОВТОРНОМ ДЕЙСТВИИ ГЛУТАМАТА:
РОЛЬ НАРУШЕНИЯ Ca2+ И Na+ ГОМЕОСТАЗА И
ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ МИТОХОНДРИЙ
14.03.03 – Патологическая физиология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва – 2018
Работа выполнена в лаборатории функциональных и прикладных проблем
боли Федерального государственного бюджетного научного учреждения
«Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии»
и в лаборатории нейробиологии и фундаментальных основ развития мозга
Федерального государственного автономного учреждения "Национальный
медицинский исследовательский центр здоровья детей" Министерства
здравоохранения Российской Федерации.
Научный Руководитель:
Сурин Александр Михайлович,
доктор биологических наук, главный научный сотрудник лаборатории
фундаментальных и прикладных проблем боли Федерального государственного
бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт общей
патологии и патофизиологии»; Заведующий лабораторией нейробиологии и
фундаментальных основ развития мозга Федеральное государственное
автономное учреждение " Национальный медицинский исследовательский центр
здоровья детей" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Официальные оппоненты:
Хаспеков Леонид Георгиевич - доктор биологических наук, заведующий
лабораторией экспериментальной нейроцитологии, Отдел исследований мозга
Федерального государственного бюджетного научного учреждения "Научный
центр неврологии".
Максимов Георгий Владимирович - доктор биологических наук, профессор
кафедры
биофизики
биологического
факультета
Федерального
государственного бюджетного образовательного учреждения высшего
образования
«Московский
государственный
университет
имени
М.В.Ломоносова».
Ведущая организация:
Академия биологии и биотехнологии Федерального государственного
автономного образовательного учреждения высшего образования "Южный
федеральный университет"», г.Ростов-на-Дону.
Защита состоится 20 декабря 2018 года в 14.00 часов на заседании
диссертационного совета Д 001.003.01 Федерального государственного
бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт общей
патологии и патофизиологии», по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, 8.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального
государственного
бюджетного
научного
учреждения
«Научноисследовательский институт общей патологии и патофизиологии» (адрес сайта
www.niiopp.ru)
Автореферат разослан «___» __________ 2018 года.
Ученый секретарь Диссертационного совета,
кандидат медицинских наук Л.Н. Скуратовская
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
посвящается памяти Ходорова Бориса Израилевича (1922-2014),
под руководством которого я начинал данную работу.
Актуальность темы исследования.
Согласно информационному бюллетеню ВОЗ из 56,4 млн. случаев смерти
во всем мире в 2015 г. ишемическая болезнь сердца и инсульт уносят больше
всего человеческих жизней – в общей сложности 15 миллионов
(http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/ru/). Последние 15 лет эти
заболевания остаются ведущими причинами смерти в мире.
По данным Министерства здравоохранения Российской Федерации за
2015г в России перенесли инсульт 420000 человек. Показатели смертности
населения в России в 4 раза выше, чем в США и Канаде: 84–87% больных
умирают или остаются инвалидами и только 16–13% пациентов полностью
выздоравливают. Среди выживших у 50% наступает повторный инсульт.
Патофизиология инсульта изучается не первый десяток лет, и было
выявлено много вариантов развития событий при снижении или полном
прекращении кровотока в мозге. Каскады реакций, протекающие на клеточном
уровне, отличаются в различных областях мозга, и поэтому процедуры,
требуемые для нейропротекции, могут отличаться при поражении разных
структур [Catanese et al., 2017].
При возникновении ишемии образуется область сниженного или
отсутствующего кровотока. Поражённые безвозвратно ткани образуют, так
называемое, ишемическое ядро, вокруг которого развивается зона
энергозависимого нарушения метаболизма клеток, в первую очередь, нейронов
(так называемая «ишемическая полутень» или «пенумбра» (penumbra)) [Dirnagl
et al., 1999; Catanese et al., 2017]. Без терапевтического вмешательства большая
часть пенумбры постепенно поглощается некротическим ядром. Этот процесс
может длится до нескольких недель.
Наши
исследования
направлены
на
выяснение
механизмов
патологических изменений ЦНС в пенумбре, которые могли бы послужить
основой для более углубленной разработки методов уменьшения зоны
поражения. Такой подход требует учета многих параметров, влияющих на
способность нейронов к выживанию. Первичные культуры нейронов,
полученные из различных отделов мозга млекопитающих (в основном крыс и
мышей), являются общепризнанной и часто незаменимой моделью исследования
процессов, происходящих в мозге в норме и при патологии [Choi, 1987; Choi,
1992; Millet, Gillette, 2012; Gordon et al., 2013].
3
Нейроны взаимодействуют друг с другом и с окружающими их
глиальными клетками посредством специализированных структур, называемых
синапсами. В синапсах нейронов, оказавшихся в зоне пенумбры, происходит
неконтролируемое высвобождение глутамата (Glu) – основного возбуждающего
нейромедиатора ЦНС. Избыточная стимуляция глутаматных рецепторов, прежде
всего ионотропных рецепторов NMDA-типа, находящихся на теле нейронов,
приводит к перегрузке нейронов ионами Са2+ и Na+, нарушению сигнальных,
метаболических и энергетических процессов и, в итоге, к увеличению области
поражения мозга в результате отсроченной гибели нейронов [Sattler et al., 1998;
Orrenius et al., 2003; Mattson, 2007].
Предшествующие исследования, выполненные, в том числе, с участием
нашего коллектива (см. обзор [Khodorov, 2004]), показали, что длительное
воздействие высоких доз Glu в нейрональных культурах вызывает двухфазное
увеличение [Ca2+]i. Вторая фаза подъема [Ca2+]i, так называемая отсроченная
кальциевая дизрегуляция (ОКД), всегда сопровождается значительным
падением трансмембранного потенциала внутренней мембраны митохондрий
(далее «митохондриального потенциала», ΔΨm) [Keelan et al., 1999; Vergun et al.,
1999; Khodorov, 2004; Abramov, Duchen, 2010; !Сурин et al., 2014; Safina et al.,
2015]. Исследования на сестринских культурах показывают, что доля нейронов,
в которых возникает ОКД, почти линейно соотносится с долей нейронов,
погибающих через несколько часов после окончания Glu-воздействия [Limbrick
et al., 1995; !Сурин et al., 2014]. По этой причине, а также потому, что Са2+
является вторичным мессенджером во всех типах клеток и регулирует мириады
внутриклеточных процессов [!Авдонин, Ткачук, 1994; Berridge et al., 2000;
Gellerich et al., 2013], неизменно сохраняется интерес к выяснению деталей
механизмов возникновения ОКД и тестированию возможных нейротропных
свойств различных агентов.
Выполненные за последние годы исследования выявили ряд возможных
причин развития ОКД и сохранения последующего высокого [Ca 2+]i плато. Эти
исследования можно разделить на два направления, в зависимости от того, какой
из механизмов развития ОКД считается основным: (1) возникновение
неспецифической поры высокой проводимости во внутренней мембране
митохондрий (mitochondrial permeability transition pore, РТР) [Schinder et al.,
1996; Liu et al., 2015]; (2) развитие энергетического кризиса, приводящего к
дисбалансу ионного гомеостаза, кульминацией которого является ОКД [Nicholls,
Budd, 2000; Abramov, Duchen, 2010; Rousset et al., 2012]. Центральная роль
4
митохондрий не подвергается сомнению в любой из гипотез развития ОКД и
последующей гибели нейронов.
Несмотря на тестирование более 1000 терапевтических стратегий в
моделях ишемического инсульта и более 100 терапий при ишемическом
инсульте человека, только tPA (tissue plasminogen activator) успешно переведен в
клиническую практику при лечении инсульта [Ginsberg, 2008; Jeyaseelan et al.,
2008; Jickling, Sharp, 2015]. Поэтому более углублённое исследование
молекулярных клеточных механизмов развития патологий ЦНС при ишемии,
инсульте, черепно-мозговой травме, безусловно, является актуальной задачей,
решение которой позволит улучшить методы терапии поражений,
обусловленных глутаматной эксайтотоксичностью.
Цель исследования
Выяснить роль митохондрий в нарушениях гомеостаза ионов Ca2+ и Na+ в
первичных культурах из головного мозга крысы при двукратном действии Glu,
моделирующем повторный эпизод ишемии/гипоксии мозга и приводящем к
гибели нейронов.
Задачи исследования
1. Выяснить отличия параметров ионного гомеостаза при первом и повторном
воздействии токсических доз Glu:
А. Роль усиления протонной проводимости митохондриальной мембраны или
ингибирования дыхания
Б. ОКД в условиях блокады высокопроницаемой митохондриальной поры
(PTP) с помощью замены Ca2+ на его суррогат, Sr2+
В. Вклад изменений [NADH] и [АТФ] в сенситизацию нейронов к
повторному действию Glu
Г. Роль Na+/Ca2+-обмена и Na+/K+-АТФазы
2. Оценить активность звеньев дыхательной цепи митохондрий и дегидрогеназ
цикла трикарбоновых кислот, используя кинетику восстановления тетразолия
до формазана.
Научная новизна
1. Обнаружено ускоренное наступление ОКД при повторном воздействии Glu
(сенситизация нейронов).
2. Впервые продемонстрировано, что сенситизация проявляется при увеличении
протонной проводимости внутренней мембраны митохондрий или при
понижении внеклеточной [Na+].
3. Впервые получена и проанализирована динамика восстановления [АТФ]с и
pHc в индивидуальных нейронах после удаления Glu.
5
4. Впервые показано, что для оценки функциональной активности митохондрий
индивидуальных нейронов может быть использована динамика изменений
оптических сигналов (флуоресценции и поглощения проходящего света) при
восстановлении тетразолия (МТТ) до формазана.
Теоретическое и практическое значение работы.
Результаты работы показывают, что в развитии ОКД как при первом, так
и при повторном воздействии Glu принимают участие разнообразные факторы.
Доминирующая роль какого-то из них определяется условиями эксперимента и
индивидуальными особенностями нейрона. Отслеживания [Ca2+]i и ΔΨm не
всегда достаточно для адекватной оценки состояния нейронов. Для более
полного описания функционального состояния этих клеток следует также
учитывать такие параметры, как степень набухания нейронов, количество Ca2+,
захваченного митохондриями, pH цитозоля и митохондрий, [Na+]i , [АТФ]c и
[NADH].
При тестировании биологически активных веществ потенциально
нейропротекторного действия следует учитывать не только их влияние на
развитие ОКД, но также на восстановление функционального состояния
митохондрий, баланса ионов, соотношения внутри- и внеклеточного
пространства после прекращения эксайтотоксического действия Glu. Вещества,
способствующие быстрому восстановлению [Na+]i и [АТФ]c после прекращения
действия Glu, могут быть перспективными при разработке препаратов
нейропротекторного действия. Обнаружено, что изменения концентрации
внутриклеточного Na+ способны служить косвенной оценкой изменений уровня
АТФ в цитозоле.
Показано, что МТТ-тест, широко используемый для анализа
выживаемости клеток, может, при совместном применении оптической
трансмиссионной и флуоресцентной микроскопии, дать информацию об
активности отдельных комплексов дыхательной цепи митохондрий в
индивидуальных клетках.
Положения, выносимые на защиту:
1. Воздействия, способствующие увеличению протонной проводимости
внутренней мембраны митохондрий или частичное ингибирование дыхания,
ускоряют дизрегуляцию кальциевого гомеостаза.
2. Истощение запасов АТФ и NADH в нейронах не является единственным
условием развития отсроченной кальциевой дизрегуляции (ОКД).
3. Для развития ОКД формирование PTP не является обязательным условием.
6
4. При анализе механизмов глутаматной эксайтотоксичности следует учитывать
как внутри-, так и внеклеточную концентрацию Na+.
5. Сочетание методов флуоресцентной и трансмиссионной оптической
микроскопии позволяет использовать МТТ-анализ для количественной
оценки активности дегидрогеназ ферментов гликолиза, цикла Креббса и
комплексов дыхательной цепи митохондрий.
Апробация работы.
Основные результаты работы доложены на межлабораторной
конференции ФГБНУ «НИИ общей патологии и патофизиологии» 26 октября
2017г, Москва, Россия; Международной конференции “Рецепторы и
внутриклеточная сигнализация”, Пущино, 2013г; XI международной научнотехнической конференции Актуальные вопросы биологической физики и химии.
БФФХ-2016, Севастополь; Международной конференции “Рецепторы и
внутриклеточная сигнализация” Пущино, 2017 г; Международной школе
ADFLIM, Саратов, 2018; Международной конференции 9th World Congress on
Targeting Mitochondria, Berlin, 2018.
Публикации и личный вклад автора.
По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3
статьи в рецензируемых журналах (из перечня ВАК) и 6 тезисов в сборниках
материалов научных конференций.
Личный вклад автора состоит в выполнении экспериментов, обработке
данных, представлении результатов в докладах, участие в обсуждении и
подготовке результатов к публикации. Все основные экспериментальные данные
диссертационного исследования получены автором лично.
Структура и объем работы.
Диссертационная работа содержит: список сокращений, введение, обзор
литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных
исследований и их обсуждение, заключение, выводы и библиографический
указатель, включающий работы на русском (17) и иностранном (318) языках.
Диссертация изложена на 166 страницах машинописного текста и содержит 1
таблицу и 41 рисунок.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Приготовление первичных культур нейронов. Культуры готовили из
мозжечка 7-9 дневных крыс и гиппокампа 1-2 дневных крыс линии Wistar как
описано в работах [!Сурин et al., 2006; Surin et al., 2014]. Эксперименты с
животными выполняли в соответствии с этическими принципами и
7
нормативными документами, рекомендованными Европейским научным фондом
(ESF) и декларацией о гуманном отношении к животным.
Крыс анестезировали, декапитировали, извлекали мозжечок или
гиппокамп. Извлечённые ткани промывали в растворе Хенкса, измельчали и
помещали в раствор трипсина, после чего отмывали стандартным раствором
Хенкса. Затем клетки диспергировали в свежей среде МЕМ (Minimal Essential
Medium), которую двукратно осаждали в центрифуге. Осаждённые клетки
ресуспендировали до концентрации 106 клеток/мл в NBM (Neurobasal Medium) с
добавлением Supplement B-27, GlutaMax, пенициллин/ стрептомицин и 20mM
KCl. Суспензию (200 мкл) переносили на покровные стекла, прикрепленные к
лункам 35 мм пластиковых чашек Петри. Стекла предварительно покрывали
полиэтиленимином (10 мг/мл). Через час добавляли 1,5 мл нейробазальной
среды, содержащей 2%ный Supplement B27 и 0,5 мМ L-глутамина. Клетки
содержались в инкубаторе при 370С, 95% воздуха + 5% СО2, отн. вл. 100%. На 34 сутки в среду добавляли арабинозинмоноцитозид (AraC, 10 мкМ) для
предупреждения пролиферации не нейрональных клеток. Культуры
использовали на 7-21 день после посадки (7-21 ДВК).
Трансфекция нейрональных культур. Трансфекцию культур выполняли
на 4-7 день после посадки. Плазмиду (1-2мкгДНК / 100мкл) смешивали с
Lipofectamin-2000 (LF-2000, 2мкл/100мкл) для образования комплекса ДНК с
LF-2000. Клеточную среду заменяли на Transfect Medium (200мкл в лунке) и
вносили по 50мкл комплекса ДНК с LF-2000, после чего помещали клетки в
СО2-инкубатор. Через 2 часа удаляли Transfect Medium, ополаскивали
нейробазальной средой и возвращали среду, в которой клетки находились до
трансфекции.
Микрофлуориметрические исследования. Перед экспериментом клетки
загружали в культуральной среде соответствующим зондом для измерения
[Ca2+]i, [Na+]i или M. После этого клетки промывали солевым раствором
следующего состава (в мМ): NaCl – 135 , KCl - 5, СаCl2 - 2, MgCl2 - 1, HEPES 20, глюкоза - 5, pH 7.4. Измерения выполняли при комнатной температуре. В
без-Na+ буфере NaCl заменяли на N-метил-D-глюкамин (130 мМ).
Бескальциевые растворы вместо CaCl2 содержали 0,1 мМ EGTA и 2 мМ MgCl2.
В Glu-содержащие растворы MgCl2 не добавляли.
Измерения выполнены на установке, включающей инвертированный
микроскоп Olympus IX-71, оснащенный 20х и 40х флюоритовыми объективами,
систему освещения Sutter Labmda 10-2 со 175Вт ксеноновой лампой (Sutter
Instruments) и CCD-камеру CoolSNAP HQ2 (Photometrics), управляемую через
8
компьютерную программу MetaFluor (Molecular Devices). Для каждого
красителя
использовались
подходящие
пары
светофильтров
возбуждения/эмиссии. Запись флуоресцентных изображений производилась
каждые 30с. Интервалы возбуждающего освещения варьировались в пределах
20-1000 мс.
В экспериментах использовались различные комбинации зондов с
непересекающимися парами длин волн возбуждения и эмиссии. Для измерения
[Ca2+]i клетки загружали в присутствии детергента Pluronic F-127 (0,02%) одним
из низкоаффинных Ca2+-чувствительных зондов: Fura-FF, Fluo-5N, Rhod-5N или
X-Rhod-FF. Изменения разности потенциалов на внутренней мембране
митохондрий (ΔΨm) оценивали с помощью Rhodamine 123 (Rh123) или TMRM.
Измерение относительного уровня трансмембранной разности потенциалов
плазматической мембраны оценивали с помощью DiBAC4(3) (bis(1,3dibutylbarbituric acid)trimethine oxonol), как описано в работе [Kiedrowski, 1999].
Расположение митохондрий в клетке определяли с помощью Митотрекера
зеленого (MitoTracker Green, MTG). Для окрашивания ядерной ДНК
использовали Hoechst 33342. Для измерения [АТФ]с производили трансфекцию
плазмидой, экспрессирующей белковый сенсор AT1.03 [Imamura et al., 2009].
Относительные изменения флуоресценции белка-акцептора в AT1.03
использованы для мониторинга относительных изменений рН цитозоля. Помимо
этого
была
возможность
измерять
автофлуоресценцию
NADH.
Светопропускание определяли при длинах волн выше 610 нм как отношение I/I o
(%), где I – интенсивность света, прошедшего сквозь клетки, Io – интенсивность
света, прошедшего через поверхность покровного стекла, не содержащую сомы
и нейриты (Io).
Обработка результатов. Данные записывали программой Metafluor
(Universal Imaging Corp., USA) в виде изображений всего наблюдаемого участка
и в виде таблицы Microsoft Excel для отдельно выбранных областей. Данные об
интенсивности излучения (F), полученные после вычитания фонового свечения,
нормировали относительно исходной флуоресценции покоящихся нейронов (F0).
В случае двухволновых зондов, бралось отношение сигналов связанной и
свободной форм индикатора. Изображения культур обрабатывались в программе
ImageJ для получения дополнительной информации (например, площадь
клеток). Оформление и представление индивидуальных и статистических
данных производилось с помощью компьютерной программы GraphPad PRIZM.
Статистические данные всегда упоминаются как среднее ± стандартная ошибка
среднего (Mean±SEM).
9
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Сенситизация нейронов к повторному действию Glu
Развитие Са2+-дизрегуляции при действии Glu подразделяют на три фазы
[Keelan et al., 1999]. На Рис. 1 приведены типичные изменения [Ca2+]i и
митохондриального потенциала (ΔΨm) индивидуальных нейронов. В первую
фазу [Ca2+]i повышается незначительно, деполяризация митохондрий мала. По
прошествии латентного периода происходит вторичное повышение [Ca2+]i,
которое обозначают термином «отсроченная кальциевая дизрегуляция» (ОКД).
Латентный период ОКД, который определяли как время от момента добавления
Glu до начала вторичного подъема [Ca2+]i, составлял 488±26 с (96 клеток). ОКД
сопровождает сильная митохондриальная деполяризация (сильные изменения
ΔΨm), которая развивается синхронно с повышением [Ca2+]i. Далее следует
третья фаза (фаза высокого Са2+-плато).
Рис. 1. При повторном воздействии глутамата (Glu) латентные периоды
кальциевой дизрегуляции становятся значительно короче. Изменения [Ca2+]i
представлены как отношение сигналов Са2+ индикатора Fura-FF (F340/F380) в
индивидуальных нейронах при воздействии Glu (100мкМ, 10мкМ Gly, 2 мМ Ca2+,
0 Mg2+), в постглутаматный период (0 Ca2+, 0 Glu, 100мкМ EGTA, 2 мМ Mg2+) и
при повторном воздействии Glu.
Зависимость между продолжительностью латентного периода ОКД и
временем восстановления исходных значений [Ca2+]i и ΔΨm в постглутаматный
период (Рис. 2А) имела невысокую, но значимую корреляцию (Pearson’s
coefficient ρ= -0,66±0,13; R2=0,43; p<0,01) свидетельствует о том, что
индивидуальность клеток проявляется не только в длительности латентных
периодов ОКД, но и в особенностях процессов, происходящих в клетках в
период высокого Ca2+-плато (Рис. 2А).
10
Индивидуальность нейронов нивелировалась при повторном действии Glu
– Ca дизрегуляция развивалась практически в том же количестве нейронов, но
с укороченными латентными периодами (96 нейронов с ОКД при первой
добавке Glu, 109 при повторной; 2 эксперимента). Длительность латентного
периода при повторной дизрегуляции составляла в среднем 123±7 с (96
нейронов, 2 эксперимента), то есть ОКД наступала в 4 раза быстрее, причём
длительность латентных периодов при повторном воздействии Glu не зависела
от длительности латентных периодов при первой аппликации Glu (ρ
недостоверно отлично от 0) (Рис. 2Б). Это явление повышенной
чувствительности нейронов к повторному действию Glu мы в дальнейшем
обозначили термином «сенситизация».
2+
Рис. 2. (А) Чем позже наступает ОКД, тем меньше времени требуется для
восстановления после удаления Glu и Ca2+ из буфера. (Б) При повторном
воздействии Glu нейроны теряют индивидуальность поведения.
Латентным периодом считали время от добавления Glu до начала развития
второй фазы Ca2+-ответа. Условия измерений как на Рис.1.
Построение фазовых диаграмм (графиков взаимосвязи двух меняющихся
параметров [Ca2+]i и ΔΨm) показало, что митохондриальная деполяризация во
время повторной аппликации Glu развивается быстрее, чем во время первичной
аппликации Glu.
Если кальциевую дизрегуляцию прерывали только удалением Ca2+,
оставляя Glu, то при возвращении Ca2+ в буфер, количество клеток с ОКД
увеличивалось в 1,5-5 раз (4 эксперимента, 30 нейронов с ОКД при первой
11
добавке Glu, 74 при повторной из общего количества n=132 нейрона в 4-х
экспериментах) и сокращались латентные периоды ОКД.
Общая площадь нейронов при воздействии Glu увеличилась на ~40% (Рис.
3 А, Б). Оказалось, что дальнейшие изменения площади при удалении Ca2+
зависели от того, оставляли мы Glu в растворе или нет. Если Glu отсутствовал,
набухание постепенно спадало (Рис. 3 А). Если Glu оставляли в растворе, то
после удаления Ca2+ наблюдалось ещё большее набухание клеток (Рис. 3 Б).
Рис. 3. Осмотическое набухание при воздействии Glu. При действии Glu и
Ca2+ суммарная площадь клеток увеличивается на ~40% (увеличение объёма на
~65%). В без-Ca2+ буфере и отсутствии Glu клетки постепенно возвращаются
к нормальному объёму (А). В без-Ca2+ буфере с Glu объём клеток возрастает
ещё больше (Б). Площадь оценивали с помощью программы ImageJ.
Рис. 4. Повторное воздействие Glu вызывает Са2+ дизрегуляцию даже при
пониженной концентрации внеклеточного Са2+. Изменения [Ca2+]i в
индивидуальных нейронах (серые линии, приведены 13 клеток) и усредненные
сигналы всех нейронов в поле зрения (чёрная линия, n= 55, Mean±SEM).
12
Для проверки того, в какой мере сенситизация зависит от поступления
Са снаружи по Glu-активируемым каналам, повторное воздействие Glu
осуществляли при концентрации Са2+ во внеклеточном буфере ([Ca2+]o),
пониженной в 8 раз по сравнению с обычным буфером. Первая добавка Glu при
[Ca2+]o = 0,25 мМ не вызвала ОКД ни в одном нейроне (n=104) (Рис. 4).
Увеличение [Ca2+]o до 2 мМ привело к развитию ОКД в 49 нейронах. После
отмывания Glu безкальциевым буфером и последующего повторного
воздействия Glu при [Ca2+]o = 0,25 мМ ОКД произошла в 22 из 104 нейронов.
Редукция индивидуальности в Ca2+-ответах нейронов при повторном
воздействии Glu позволяет предположить существование какого-то
доминирующего фактора(ов), сохраняющегося в промежутке между Glu
воздействиями и способствующего сенситизации.
2. Роль проницаемости внутренней мембраны митохондрий в
сенситизации нейронов при повторном действии Glu.
Одной из основных причин возникновения ОКД считают образование во
внутренней
мембране
митохондрий
неспецифической
циклоспоринчувствительной поры высокой проводимости (PTP). Накопление Sr2+ в матриксе
митохондрий не индуцирует PTP [Bernardi, 1999]. Для проверки роли PTP в
сенситизации мы проверили действие Glu в присутствии Са2+ или Sr2+ на одной
и той же культуре. Это позволило сопоставить изменения [Ca2+]i , [Sr2+]i и ΔΨm в
одних и тех же клетках при последовательных добавках Glu.
Замена Са2+ на Sr2+ не устраняла возникновения фазы Са2+/Sr2+
дизрегуляции (Рис. 5). Стоит отметить, что подъем [Sr2+]i происходил заметно
медленнее, чем подъём [Ca2+]i в аналогичных протоколах (Рис. 1). Различия в
скорости роста [Ca2+]i и [Sr2+]i при индуцированной Glu дизрегуляции в одних и
тех же клетках указывает на то, что имеет место именно Sr2+ дизрегуляция, а не
рост [Ca2+]i за счет вытеснения из каких-либо внутриклеточных депо. Эти
наблюдения подтверждают результаты работы [Wabnitz et al., 2005; Bolshakov et
al., 2008] о том, что ОКД не обязательно является следствием PTP.
Имеются данные, что при действии Glu образуются свободные жирные
кислоты [Lazarewicz et al., 1990], обладающие свойствами эндогенных
протонофоров [!Сурин et al., 2006; Belosludtsev et al., 2014; Mironova et al., 2015].
Возможно, накопление свободных жирных кислот способствует проявлению
сенситизации нейронов к токсическому действию глутамата в присутствии Ca2+.
Мы
использовали
протонофор
карбонил-р-(трифлуорометокси)
фенилгидразон (FCCP). В концентрации 50 нМ FCCP не индуцировал
деполяризации митохондрий в покоящихся нейронах (не показано). Низкая
2+
13
концентрация Glu (10 мкМ) вызывала очень слабый [Ca2+]i ответ и не
индуцировала развитие ОКД (Рис. 6). Добавление 50 нМ FCCP вызывало
быструю деполяризацию митохондрий и сильный подъем [Ca2+]i. Отмывание Glu
буфером без Ca2+ и FCCP приводило к быстрому восстановлению [Ca2+]i и ∆Ψm,
возвращая эти параметры к почти базальному уровню.
Рис. 5. Открывание неспецифической поры высокой проводимости (PTP) не
является обязательным условием развития ОКД. Серые линии – изменения
[Ca2+]i и [Sr2+]i в индивидуальных нейронах; чёрная линия – среднее значение.
Рис. 6. Glu (10мкМ) и FCCP (50 нМ) вызывают Ca2+-дизрегуляцию и сильную
деполяризацию митохондрий только при совместном действии. (А)
Динамика изменений [Ca2+]i в группе нейронов и (Б) динамика изменений [Ca2+]i
и ΔΨm в представительном нейроне. Изменения [Ca2+]i приведены, как на Рис. 1;
рост сигнала Rh123 (Ex485/Em525; F/F0) соответствует падению ΔΨm.
Повторное воздействие FCCP и Glu производили в ином порядке: в буфер
добавляли 2 мМ Ca2+ и 50 нМ FCCP без Glu. Это не вызывало роста [Ca2+]i, но
14
приводило к заметной деполяризации (Рис. 6Б). Последующее добавление 10
мкМ Glu приводило к резкому падению ΔΨm и сильному повышению [Ca2+]i.
У всех наблюдаемых нейронов изменения [Ca2+]i и ΔΨm были обратимыми
– отмывание Glu и FCCP безкальциевым буфером возвращало [Ca2+]i и ΔΨm к
низким значениям (Рис. 6). Данная серия экспериментов показала, что даже
небольшая утечка протонов сквозь внутреннюю мембрану митохондрий сильно
снижает способность митохондрий поддерживать низкую [Ca2+]i при
воздействии Glu.
3. Роль энергетики митохондрий в сенситизации нейронов к
повторному действию Glu.
Митохондриям для выполнения своих функций необходимо поддерживать
высокую ΔΨm, которая генерируется электрон-транспортной цепью (ЭТЦ).
Основным донором электронов для ЭТЦ служит NADH, производимый в цикле
трикарбоновых кислот. Во время действия Glu [NADH] прогрессивно
снижалась, причём ОКД наступала не всегда при минимальных значениях
[NADH] (Рис. 7А), что согласуется с данными [!Сурин et al., 2010]. При
удалении Glu и Ca2+ [NADH] медленно восстанавливается (Рис. 7). До сих пор не
ясны причины плохого восстановления [NADH] при прекращении Ca2+воздействия. Повторное действие Glu обычно происходит при сниженной
[NADH]. Таким образом, недостаток NADH может быть ещё одной из причин
сенситизации нейронов к повторному действию Glu.
Рис. 7. [NADH] прогрессивно снижается во время действия Glu и медленно
восстанавливается после его удаления. (А) Изменения [NADH] и ΔΨm в
представительном нейроне и (Б) изменения [NADH] во всех нейронах в поле
зрения (n=26). [NADH] оценивали по автофлуоресценции (365/460 нм),
изменения ΔΨm регистрировали как на Рис. 6.
15
Относительно недавно появились белковые флуоресцентные сенсоры для
измерения [АТФ] непосредственно в цитозоле и других внутриклеточных
компартментах [Imamura et al., 2009; Yoshida et al., 2017]. Благодаря тому, что
флуоресцентные белки чувствительны к изменениям pH, АТФ-сенсор можно
использовать для оценки изменений pH, возбуждая только белок-акцептор
[Markova et al., 2008; Surin et al., 2013].
На Рис. 8 показаны типичные изменения [Ca2+]i, pHc и [АТФ]с в
представительном нейроне. В начале эксперимента было произведено короткое
воздействие Glu в отсутствии Ca2+. Снижение АТФ в этот период было
незначительно. Далее в раствор добавляли Ca2+. Оказалось, что для
возникновения ОКД АТФ не обязательно должно снижаться до уровня, близкого
к минимальному значению. В среднем ОКД наступала, когда [АТФ]с составляла
около 15,9 ± 3,2% (n = 15) от уровня [АТФ]с в покоящихся нейронах.
Под действием Glu наблюдался значительный ацидоз цитозоля, который
сменялся алкалозом при развитии II фазы Ca2+-ответа или при удалении Glu и
Ca2+, если ОКД не проявлялась. Похожие изменения рНс были получены на
кортикальных нейронах, экспрессировавших в цитозоле рН-чувствительный
флуоресцентный белок YFP [Bolshakov et al., 2008].
Рис. 8. Индуцированные глутаматом изменения [АТФ]с, pHc и [Ca2+]i в одном
из культивируемых гиппокампальных нейронов крысы, экспрессирующих
АТФ-сенсор. Изменения [ATP] представлены как отношение сигналов ATPсенсора при возбуждении на 440 и 485 нм (F440/F485) и регистрации в полосе
испускания акцептора энергии (525 нм). [Ca2+]i измеряли с помощью XRhodFF
(565/610), рНс оценивали по изменению флуоресценции белка-акцептора АТФсенсора (485/520). Все сигналы нормированы на исходные значения.
16
Отмывание Glu вскоре после достижения [Ca2+]i плато приводило к
восстановлению низкой [Ca2+]i (Рис. 8). Выше было показано, что в постглутаматный период одновременно со снижением [Ca2+]i происходит
восстановление высокой ΔΨm.
Против ожидания, восстановление [АТФ]с не предшествовало снижению
2+
[Ca ]i и даже не происходило с ним одновременно. Возможно, (1) митохондрии
захватывают излишки цитозольного Са2+ и/или (2) насосам плазматической
мембраны для удаления избыточного Са2+ достаточно [АТФ]с, лежащей ниже
предела обнаружения с помощью АТФ-сенсора (~0,3мМ; [Imamura et al., 2009]).
Рис. 9. Время до восстановления [АТФ]с индивидуально для каждого
нейрона. Измерения [АТФ]с проводили как описано на Рис. 8.
Промежуток времени, через который восстанавливалась [АТФ]с в постглутаматный период, зависел от того, на какой стадии развития ОКД
происходило удаление Glu (Рис. 9). В среднем [АТФ]с полностью
восстанавливалась через 3765±221 с (n=4). В некоторых случаях восстановления
[АТФ]с за время эксперимента не наблюдалось (~3800с, см. клетку 4 на Рис. 9),
даже если нейрон был способен восстановить [Ca2+]i и ΔΨm.
Вероятно, задержка в росте [АТФ]c относительно начала восстановления
2+
[Ca ]i в пост-глутаматный период Glu вызвана не тем, что ΔΨm была низкой и
недостаточной для синтеза АТФ, а тем, что, несмотря на удаление Glu, все еще
сохранялась высокая скорость потребления АТФ. В мозге самый существенный
потребитель АТФ – это Na+/K+-АТФаза. Поэтому была исследована динамика
изменений внутриклеточной концентрации Na+ ([Na+]i) при повторных
воздействиях Glu.
17
4. Роль Na+ в сенситизации нейронов при повторном действии Glu.
При добавлении Glu [Na+]i быстро повышается и остается высокой на
протяжении всего действия Glu (Рис. 10), что согласуется с ранее
опубликованными данными [Kiedrowski, 1999; Brittain et al., 2012].
Возникновение ОКД не приводит к дополнительному росту [Na+]i независимо от
того, развивается ОКД при первой аппликации Glu или при повторном
воздействии Glu.
В нейронах, в которых ОКД не успела развиться, величина [Na+]i
возвращалась к исходным значениям после удаления Glu (62 клетки, 5
экспериментов) (Рис. 10). По-видимому, в таких нейронах [АТФ]с оставалась
достаточно высокой для удаления избытка Na+.
Рис. 10. Изменения [Na+]i и [Ca2+]i во время действия Glu и в
постглутаматный период не синхронны. Изменения [Na+]i показаны как
отношения интенсивности SBFI при возбуждении на 340 и 380 нм (F340/F380)
и регистрации при 525 нм. Для измерения [Ca 2+]i использовали Rhod-5N (565/620
нм). Сигналы Rhod-5N нормированы относительно исходной величины (F/Fo).
Если ОКД успевала развиться в течение первого воздействия Glu, то [Na+]i
оставалась высокой продолжительное время (более 30 мин) даже после
восстановления [Ca2+]i в пост-глутаматный период (86 клеток, 5 экспериментов).
Другими словами, это состояние Na+ гомеостаза является доминирующим, если
первое воздействие Glu смогло вызвать ОКД.
Высокая [Na+]i является косвенным показателем того, что митохондрии
производят мало АТФ и [АТФ]с всё ещё низкая. Кроме того, высокая [Na+]i
затрудняет Na+/Са2+-обмен в постглутаматный период. Другими словами,
повышенную [Na+]i в период между двумя воздействиями Glu также необходимо
учитывать как фактор, препятствующий поддержанию Са2+ гомеостаза и
ведущий к сенситизации.
18
С целью уменьшить затраты АТФ на откачивание Na+, мы заблокировали
работу Na+/K+-АТФазы, заменив Na+ в буфере на непроникающий органический
катион N-метил-D-глюкамин (NMG). Замена Na+ на NMG практически не
повлияла на уровень [Ca2+]i и ΔΨm покоящихся нейронов. Добавление Glu
вызвало в без-Na+ буфере настолько быстрые рост [Ca2+]i и падение ΔΨm, что
практически отсутствовала стабилизация [Ca2+]i и ΔΨm на промежуточном
уровне (Рис. 11Б). В контрольном опыте на сестринской культуре лишь
небольшое число клеток продемонстрировало ОКД (Рис. 11А).
Рис. 11. Замена Nа+ в буфере на непроникающий органический катион NMG
усиливает индуцированный глутаматом рост [Ca2+]i. (А) Изменения [Ca2+]i в
буфере с обычным содержанием Na+ и (Б) в без-Na+ растворе в первичной
культуре гранулярных нейронов мозжечка крысы. Для измерения [Ca2+]i
применяли XRhodFF (565/620).
Рис. 12. Частичная замена Na+ на NMG приводит к значительному
сокращению латентного периода ОКД. [Ca2+]i при воздействии Glu (А) в
обычном буфере и (Б) при замене в буфере 70% Na+ на NMG.
Замена 70% Na+ на NMG вызывала заметное уменьшение латентных
периодов ОКД (Рис. 12). Измерения [Na+]i в сестринской культуре показали, что
19
в этих условиях Glu индуцирует рост [Na+]i, больший, чем ожидалось на
основании 70% замены Na+. Кроме того, [Na+]i возвращалась к исходным
значениям после удаления Glu только в тех нейронах, в которых ОКД не успела
развиться. Если ОКД возникала при действии Glu, то [Na+]i оставалась высокой
не менее 20 мин после удаления Glu, как в буфере с нормальной [Na+].
Это показывает важную роль Na+ в гомеостазе Ca2+ и процессах
поддержания pH. В физиологических условиях объём внеклеточного
пространства в ~3 раза меньше объема цитозоля клеток [Madelin et al., 2015].
Поэтому при гиперстимуляции рецепторов Glu в области пенумбры может
сильно снижаться концентрация внеклеточного Na+ и, в тоже время, повышается
[Na+]i, нарушая способность клеток контролировать pH и гомеостаз Ca2+.
5. Исследование активности дегидрогеназ нейронов с помощью
восстановления МТТ до формазана
Одним из наиболее популярных методов определения активности
дегидрогеназ служит МТТ-анализ, который основан на восстановлении МТТ
(3-(4,5-диметилтиазол-2-)ил)-2,5-дифенил тетразолий бромида) до сильно
поглощающего в видимой области спектра, нерастворимого в воде формазана
[Mosmann, 1983; Denizot, Lang, 1986] (Рис. 13).
Рис. 13. (A) Схема перехода МТТ в формазан под влиянием дегидрогеназ
клетки и (Б) спектры поглощения этих веществ.
Гранулы формазана, образующиеся в процессе восстановления МТТ в
культуре нейронов, поглощают в широком диапазоне. Мы отслеживали
образование формазана в индивидуальных нейронах, регистрируя параллельно
флуоресценцию ядерного и/или митохондриальных зондов.
Сопоставление флуоресцентных изображений ΔΨm-зависимого зонда Rh123
с изображениями в проходящем свете показывает, что хотя агрегаты формазана
и расположены в тех же зонах нейронов, в которых сконцентрированы
20
митохондрии, полного совпадения флуоресцентного изображения Rh123 и
изображения в проходящем свете не наблюдается (Рис. 14).
Рис. 14 Тушение флуоресценции Rh123 и образование зерен формазана при
действии МТТ (0,1 мг/мл) в культуре гранулярных нейронов мозжечка крысы
(7 DIV).
Небольшая деполяризация митохондрий с помощью цианида (NaCN, 1 мМ)
вызывала частичный выход Rh123 из митохондрий (Рис. 15А), рост NADHавтофлуоресценции (Рис. 15Б), но не влияла на интенсивность проходящего
света (Рис. 15В). Добавление МТТ вызывало быстрое тушение флуоресценции
Rh123 (Рис. 15А) и автофлуоресценции NADH (Рис. 15Б). В это время
светопропускание ещё не меняется. По-видимому, МТТ нарушает работу ЭТЦ
и/или NADH расходуется на восстановление МТТ до формазана.
Дальнейшая инкубация с МТТ вызывает выход Rh123 из митохондрий, что
свидетельствует о снижении ΔΨm, которая удерживала этот зонд в матриксе. В
это время начинается снижение интенсивности проходящего света.
Рис. 15 Индуцированное МТТ падение ΔΨm связано с потреблением NADH на
восстановление МТТ до формазана. (А) Изменения флуоресценции зонда
Rh123, (Б) автофлуоресценции клеток, обусловленной NADH и (В) снижения
светопропускания в результате образования формазана.
Мы проверили участие комплексов дыхательной цепи и АТФ-синтазы, а
также гликолиза в образовании формазана. Для этого сравнили начальную
скорость снижения интенсивности проходящего света в присутствии
21
соответствующих ингибиторов ферментных комплексов (Рис. 16А). Действие
ингибиторов дыхания было различным. По сравнению с контролем, блокада
дыхания ингибитором комплекса I ротеноном (20 мкМ) вызвала достоверное
падение скорости образования формазана (р< 0,001). Ингибирование комплекса
IV цианидом (NaCN, 1mM), напротив, привело к росту скорости образования
формазана (р<0,001).
Рис. 16 Скорости образования формазана (А) при избирательной блокаде
комплексов дыхательной цепи и (Б) в условиях блокады гликолиза.
Сокращения: Rot – ротенон (20мкМ); Ant – антимицин А (1,8 мкМ); CN – цианид
натрия (1мМ); Oligo – олигомицин (3мкМ); 2DG – 2-дезокси-D-глюкоза (5мМ);
Pyr – пируват (5 и 10 мМ). Точки соответствуют скорости образования
формазана (усл.ед./сек) в индивидуальных клетках.
Ингибирование гликолиза с помощью 2-дезокси-D-глюкозы (2DG, 5 мМ),
подавляло скорость образования формазана на 85-90% (Рис. 16Б). Добавление
Pyr в буфер, в котором гликолиз был ингибирован, увеличивало скорость
образования формазана тем больше, чем выше была концентрация Pyr.
То, что в культивируемых нейронах в присутствии Pyr в буфере скорость
образования формазана может превышать контрольный уровень при блокаде
гликолиза, указывает на основной вклад митохондрий в восстановление МТТ.
22
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Выполненные нами исследования показывают, что в развитии ОКД как при
первом, так и при повторном воздействии Glu принимают участие
разнообразные факторы. Доминирующая роль какого-то из них определяется
условиями эксперимента и индивидуальными особенностями нейрона.
Одним из факторов, способствующих сенситизации, может являться Ca2+,
накопившийся в митохондриях во время первого Glu. В пользу этого
свидетельствует то, что даже многократно пониженная [Ca2+]o способна вызвать
повторную ОКД (Рис. 4). Замена Ca2+ на Sr2+ показывает, что ОКД не
обязательно
является
следствием
открывания
PTP,
подтверждая
предшествующие работы группы Б.И. Ходорова и В.Г. Пинелиса [Wabnitz et al.,
2005; Bolshakov et al., 2008].
Сопоставление формы нейронов в покое и в фазе высокого [Ca2+]i плато
(Рис. 3) показало, что важным аспектом функционального состояния клеток,
вовлеченным в явление сенситизации, может быть набухание сомы нейронов.
Во время высокого [Ca2+]i плато наступает истощение запасов NADH (Рис.
7). Наступление ОКД при первом воздействии Glu может происходить при
относительно высоких [NADH] (~50%) (Рис. 7). Повторное действие Glu
происходит, как правило, при [NADH], сниженной относительно состояния
покоя.
При первом воздействии Glu ОКД развивалась при [АТФ]c 15,9 ± 3,2%
(n=15). В большинстве нейронов, имевших ОКД, [АТФ]с оставалась в
постглутаматный период сниженной продолжительное время (Рис. 9), даже если
[Ca2+]i падала до уровня I фазы Ca2+-ответа на Glu (Рис. 8). Очевидно,
сенситизация нейронов к повторному действию Glu возникает на фоне низкой
[АТФ]с. Повторная аппликация Glu может происходить также в условиях
смещённого pH (Рис. 8), когда ферментные системы клетки работают при pH, не
соответствующему оптимуму.
Имитация накопления эндогенных протонофоров, например, свободных
жирных кислот [!Сурин et al., 2006] с помощью низкой концентрации
протонофора FCCP, которая не влияла на [Ca2+]i и ΔΨm покоящихся нейронов,
вызывала Ca2+-дизрегуляцию даже при низкой концентрации Glu (Рис. 6).
[Na+]i оставалась стабильно высокой за время отмывания Glu
безкальциевым буфером в нейронах, проявивших ОКД. Это означает, что
повторное воздействие Glu происходит при повышенной [Na+]i.
Одновременное измерение [Na+]i , [Ca2+]i и [АТФ]с чрезвычайно
затруднительно по причине перекрывания спектров возбуждения и
23
флуоресценции синтетических индикаторов катионов и АТФ-сенсора. Принимая
во внимание, что Na+/K+-АТФаза является основным потребителем АТФ в
нейронах [Ames, 2000], измерение [Na+]i можно использовать как косвенный
метод оценки изменений [АТФ]с в индивидуальных нейронах.
Различная кинетика восстановления [Ca2+]i и [Na+]i в постглутаматный
период может объясняться тем, что захват Ca2+ митохондриями может
происходить при значениях ∆Ψm, недостаточных для синтеза АТФ [KovacsBogdan et al., 2014], тогда как для восстановления [Na+]i нужны значительные
затраты АТФ, синтез которого начинается только при ∆Ψm выше ~100-110 мВ
[Cortassa et al., 2003; Cortassa, Aon, 2012].
Частичная замена внеклеточного Na+ на непроникающий NMG, отчасти
имитирующая снижение Na+ в межклеточном пространстве живого мозга,
приводила к сильному сокращению латентных периодов ОКД (Рис. 12). Повидимому, неполная деполяризация плазматической мембраны при пониженном
Na+ вызывает гораздо больший приток Са2+ в цитозоль и, соответственно, захват
его митохондриями и ускорение развития ОКД. Кроме того, снижение
концентрации внеклеточного Na+ должно ухудшать эффективность работы
прямой моды Na+/Ca2+-обменника (NCX). Эти обстоятельства следует учитывать
при моделировании динамики нарушений иного гомеостаза в мозге.
Динамика [Na+]i (Рис. 10) и изменения потенциала плазматической
мембраны указывают на то, что условия для реверсии NCX возникают в самом
начале действия Glu. По нашим данным, ОКД во многих клетках развивается
спустя десятки минут после реверсии. Реверсия NCX, несомненно, оказывает
влияние на Ca2+-дизрегуляцию, но является решающим фактором возникновения
ОКД лишь для некоторых нейронов.
В интактных клетках основным поставщиком электронов в дыхательную
цепь митохондрий является комплекс I, окисляющий NADH. Поэтому
информация о его активности является важным показателем функционального
состояния митохондрий. Сочетанием микроскопии проходящего света и
флуоресцентной микроскопии с привлечением различных митохондриальных и
ядерных красителей (Рис. 14), а также применяя ингибиторы разных звеньев
дыхательной цепи (Рис. 16), мы показали, что скорость восстановления МТТ до
формазана может служить показателем активности комплекса I. Восстановление
МТТ до формазана происходит, предположительно, в сайте восстановления
убихинона до убихинола. Показано, что МТТ и/или формазан частично
ингибируют дыхание, снижая ΔΨm, что необходимо учитывать при проведении
МТТ-анализа.
24
ВЫВОДЫ
1) [NADH] и [АТФ]с восстанавливаются в пост-глутаматный период
медленнее, чем [Ca2+]i и ΔΨm, указывая на то, что основными причинами
сенситизации нейронов к повторному действию Glu являются недостаток
субстрата дыхательной цепи и [АТФ]с.
2) [NADH] и [АТФ]с прогрессивно снижаются во время глутаматного
воздействия, однако развитие отсроченной кальциевой дизрегуляции (ОКД)
не сопряжено с полным коллапсом энергетических ресурсов клетки или
образованием PTP, поскольку ОКД возникает прежде, чем [NADH] и [АТФ]с
достигают своего минимума, а замена Ca2+ на Sr2+ не препятствует ОКД.
3) Воздействия, препятствующие поддержанию ΔΨm, в том числе, небольшое
увеличение проводимости митохондриальной мембраны, приводят к
немедленной кальциевой дизрегуляции, как при первом, так и при повторном
применении Glu.
4) Динамика изменений [Na+]i позволяет судить об изменениях [АТФ]с. Одной
из основных причин сенситизации является длительное сохранение высокой
[Na+]i после первого воздействия Glu, ведущее к задержке восстановления
[АТФ]с и нарушению осмотического равновесия в соме нейрона.
5) Применение методов трансмиссионной оптической микроскопии и
флуоресцентной микроскопии в сочетании с селективными ингибиторами
дыхательной цепи, позволяет оценивать активность комплекса I
митохондрий.
ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи в журналах:
1. Сурин А.М., Горбачева Л.Р., Савинкова И.Г., Шарипов Р.Р., Ходоров Б.И.,
Пинелис В.Г. Исследование изменений [АТФ] в цитозоле индивидуальных
нейронов при развитии глутамат-индуцированной дизрегуляции кальциевого
гомеостаза. // Биохимия.- 2014.- Т. 79. - № 2. - С. 196-208 (Eng pp. 146-157).
2. Сурин А.М., Шарипов Р.Р., Красильникова И.А., Бояркин Д.П., Лисина
О.Ю., Горбачева Л.Р., Аветисян А.В., Пинелис В.Г. Нарушение
функциональной активности митохондрий при МТТ-анализе выживаемости
культивируемых нейронов. // Биохимия.- 2017, Т. 82, №6, С. 970-984 (Eng pp.
737-749).
25
3. Шарипов Р.Р., Красильникова И.А., Пинелис В.Г., Горбачева Л.Р., Сурин
А.М. Исследование механизма сенситизации нейронов к повторному
действию глутамата. Биологические мембраны.-2018, Т.35, №5, с. 384-397.
Публикации в сборниках статей, с выступлениями на конференциях:
1. Сурин А.М., Горбачева Л.Р., Савинкова И.Г., Шарипов Р.Р., Ходоров Б.И.,
Пинелис В.Г. Флуоресцентно-микроскопические измерения [АТФ] в
цитозоле культивируемых нейронов при токсическом действии глутамата. //
Сборник
статей
Международной
Конференции
“Рецепторы
и
внутриклеточная сигнализация”, г. Пущино. - 2013 г. - Т.2. - С. 718-723.
2. А.М.Львов, Р.Р.Шарипов. Нейропротекторные свойства новых производных
пептида Pro-Gly-Pro на клеточной модели эксайтотоксического повреждения
нейронов. // XXVII зимняя молодежная научная школа «Перспективные
направления физико-химической биологии и биотехнологии». Сборник
тезисов. - Москва. -2015 г. - С.25.
3. Шарипов Р.Р., Лисина О.Ю., Красильникова И.А., Вышенская Т.В., Пинелис
В.Г., Сурин А.М. MTT деполяризует митохондрии в культивируемых
нейронах. // Материалы XI международной научно-технической конференции
Актуальные вопросы биологической физики и химии. БФФХ-2016, г.
Севастополь. - 2016 г. - Т. 2. - С. 218-223.
4. Шарипов Р.Р., Красильникова И.А., Бояркин Д.П., Лисина О.Ю., Горбачева
Л.Р., Пинелис В.Г., Сурин А.М. Влияние МТТ на функциональную
активность митохондрий культивируемых нейронов. // Сборник статей
Международной
Конференции
“Рецепторы
и
внутриклеточная
сигнализация”, г. Пущино. – 2017 г. – Т.2 – С. 649-654.
5. R.R. Sharipov, A.V. Galachova, I. Akutin, I.A. Krasilnikova, D.P. Boyarkin, L.R.
Gorbacheva, A.M. Surin, V.G. Pinelis. Study of ATP and chlorine-ion
concentration changes in the cytosol of individual cultured neurons during
glutamate-induced deregulation of calcium homeostasis. // 3-я школа ADFLIM
2018. Сборник тезисов. Саратов – 2018, с. 48.
6. R.R. Sharipov, I.A. Krasilnikova, L.R. Gorbacheva, V.G. Pinelis, A.M. Surin.
The neuronal sensitization to the repeated glutamate challenge: the role of
mitochondria. // 9th World Congress on Targeting Mitochondria. Berlin, Germany,
October 23-25, 2018, abstract was accepted for a poster presentation.
26
БЛАГОДАРНОСТИ
Автор чрезвычайно благодарен Ходорову Борису Израилевичу за чуткое
руководство и помощь в процессе работы. Автор благодарит Сурина Александра
Михайловича за неоценимую помощь в завершении этой работы, за дружескую
опеку в освоении методов и обработке данных, за понимание и терпение. Автор
глубоко признателен Пинелису Всеволоду Григорьевичу за оказание помощи в
написании диссертации, практическую помощь в проведении экспериментов,
ценные указания и критические замечания. Автор благодарит Горбачеву Любовь
Руфельевну за помощь в приготовлении гиппокампальных культур при
трансфекции и содействие в написании статей. Автор также благодарен
Красильниковой Ирине Александровне, Савинковой Ирине Григорьевне,
Бакаевой Занде Валерьевне, Тимофеевой Анжелике, Лизуновой Наталье и
Бояркину Дмитрию за приготовление нейрональных культур и помощь в
проведении и обработке экспериментов.
27
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа