close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Разработка и изучение новых противоопухолевых препаратов на основе полимерных наночастиц для терапии экспериментальных неоплазий

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Заборовский Андрей Владимирович
РАЗРАБОТКА И ИЗУЧЕНИЕ НОВЫХ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ
ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ ПОЛИМЕРНЫХ НАНОЧАСТИЦ ДЛЯ
ТЕРАПИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ НЕОПЛАЗИЙ
14.03.06 – «Фармакология, клиническая фармакология»
(медицинские науки)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
Москва – 2018
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном
учреждении высшего образования «Московский государственный медикостоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Министерства
здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО МГМСУ им. А.И.
Евдокимова Минздрава России) и в Федеральном государственном бюджетном
образовательном
учреждении
высшего
образования
«Национальный
исследовательский Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева»
Министерства образования и науки Российской Федерации (ФГБОУ ВО «МГУ
им. Н.П. Огарева» Минобрнауки России)
Научные консультанты:
Доктор медицинских наук, профессор,
профессор РАН Гуревич Константин Георгиевич
Доктор медицинских наук, доцент Пятаев Николай Анатольевич
Официальные оппоненты:
Корман Давид Борисович – доктор медицинских наук, профессор, Федеральное
государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимической физики
им. Н.М. Эмануэля Российской Академии наук ФАНО России, лаборатория
количественной онкологии, заведующий лабораторией
Ших Евгения Валерьевна – доктор медицинских наук, профессор, Федеральное
государственное автономное образовательное учреждение высшего образования
Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М.
Сеченова (Сеченовский Университет) Министерства здравоохранения
Российской Федерации, кафедра клинической фармакологии и пропедевтики
внутренних болезней лечебного факультета, заведующая кафедрой
Арзамасцев Евгений Вениаминович – доктор медицинских наук, профессор,
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный
медицинский
исследовательский
центр
кардиологии»
Министерства
здравоохранения Российской Федерации, лаборатория лекарственной
токсикологии Института экспериментальной кардиологии, заведующий
лабораторией
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
дополнительного профессионального образования «Российская медицинская
академия непрерывного профессионального образования» Министерства
здравоохранения Российской Федерации
Защита состоится «____» ___________ 2018 г. в ___ часов на заседании
диссертационного совета Д 208.041.01, созданного на базе ФГБОУ ВО МГМСУ
имени А.И. Евдокимова Минздрава России, по адресу: 127473, Москва, ул.
Делегатская д.20 стр.1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВО МГМСУ
имени А.И. Евдокимова Минздрава России (127206, г. Москва, ул. Вучетича, д.
10а) и на сайте http:// dissov.msmsu.ru/.
Автореферат разослан ______________ 2018 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук, профессор
Лобанова Елена Георгиевна
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
Несмотря на совершенствование методов профилактики и ранней
диагностики, количество онкологических
больных постоянно
растет.
Согласно ретроспективному анализу данных с 1990 по 2015 гг., за период
2005-2015 гг. число случаев заболеваемости раком выросло на 33%
(Fitzmaurice C. et al., 2017). Смертность от новообразований в РФ занимает 2
место (15,4%), существенно уступая лишь сердечно-сосудистым заболеваниям
(Калабеков И.Г., 2016). По данным IARC, Россия в 2012 г. заняла 5-е место в
мире по смертности онкологических больных (после Китая, Индии, США и
Японии). Однако при нормализации числа смертей на возраст наша страна
занимает первое место в мире (Jakab Z. et al., 2014), при этом существенную
роль некоторые исследователи уделяют наследственному фактору (Притуло
О.А. и соавт., 2016). На Индию, Китай и Россию приходится примерно 50%
случаев онкологических заболеваний в мире (Collingridge D., 2014).
В настоящее время существует несколько подходов к лечению
онкологических
заболеваний:
хирургический,
радиотерапевтический,
фотодинамический, химиотерапевтический. Часто используется сочетание
нескольких методов лечения (Гельфанд И.М., 2016; Кропотов М.А. и соавт .,
2016; Gozzo L. et al., 2016; Vrdoljak E. еt al., 2016). Несмотря на развитие
различных технологий, противоопухолевая терапия не теряет своей
актуальности (Гафанов Р.А., 2016; Кожанов А.Л., 2016). До 80%
онкологических пациентов получают химиотерапию в качестве основного
лечения или в сочетании с другими методами (Хвастунов Р.А., 2014).
Имеющийся арсенал противоопухолевых препаратов не обеспечивает
эффективное консервативное лечение всех новообразований (Malik S.M. et al.,
2011; Lu D.Y. et al., 2015). Кроме того, большинство препаратов имеют
механизм действия, связанный с подавлением быстро делящихся клеток, что
обусловливает развитие их побочных эффектов (Юркин А.К. и соавт., 2016; de
Alencar N.M. et al., 2016). Поэтому задача поиска новых противоопухолевых
3
средств является актуальной задачей современной фармакологии (Gad A. et al.,
2016; Fathi S., Oyelere A.K., 2016; Terada T., 2016). Отметим, что примерно 1/3
продаж противоопухолевых препаратов приходится на компанию Roche, а
75% рынка принадлежит 10 зарубежным фармкомпаниям (Широкова И.,
2004). Не случайно принято постановление Правительства Российской
Федерации от 15 апреля 2014 г. N 305 г. Москва «Об утверждении
государственной
программы
Российской
Федерации
«Развитие
фармацевтической и медицинской промышленности» на 2013 - 2020 годы».
В рамках программы предполагается развитие производства инновационных
ЛС, в т.ч. для лечения социально значимых заболеваний, к которым относятся
онкологические.
Одним
из
направлений
исследований
в
экспериментальной
химиотерапии является поиск противоопухолевых компонентов в препаратах
растительного происхождения, входящих в арсенал традиционной, например,
китайской медицины (Mandrekar S. et al., 2004; Ma L. et al., 2016; Popoola T.D.
et al., 2016). Также исследуются биологически активные вещества,
выделяемые экзотическими организмами, например, моллюсками (Taguchi T.,
2003; Singh R. et.al., 2008; Blunt J.W. et al., 2013). После обнаружения подобных
веществ отдельно встает задача их выделения или синтеза в количествах и по
стоимости, приемлемых для практического применения (Ahmed H.H. et al.,
2015; Chen X.P. et al., 2015).
Ограничения возможностей синтеза обусловливают другое направление
поиска противоопухолевых препаратов. При этом методами химического
синтеза модифицируются известные молекулы, что придает им новые
свойства (Ghaly P.E. et al., 2016; Yang J. et al., 2016). Проводятся попытки
компьютерного моделирования свойств соединений до их синтеза, это
позволяет в десятки раз сократить объемы исследований (Погодин П.В. и
соавт., 2013; Раевский О.А. и соавт., 2014; Qin.Y. et al., 2015). Также
проводится компьютерная оценка наличия противоопухолевой активности у
соединений, выделяемых из фитопрепаратов (Лагунин А.А. и соавт., 2015;
4
Berlow N. et al., 2013). То есть компьютерные методы позволяют проводить
направленный синтез соединений, для которых заранее предполагают наличие
тех или иных свойств, например, противоопухолевой активности (Фильц О.А.,
Поройков В.В., 2012; Anusevicius K. et al., 2015). Однако даже при
использовании
этого
подхода
стоимость
разработки
новых
противоопухолевых препаратов остается крайне высокой. Менее 0,1% новых
препаратов доходят даже до I фазы клинических исследований (Maure l.J.,
Postigo A., 2015; Wang S. et al., 2016).
Исходя из этого, ряд исследователей обращается к «старым»
противоопухолевым средствам, пытаясь модифицировать их так, чтобы они
приобрели новые свойства. В первую очередь пытаются повысить
эффективность проводимой терапии и снизить вероятность развития
побочных реакций путем направленной доставки в ткань-мишень (Cheng Y. et
al., 2016; Zhong T. et al., 2016). В этом направлении наиболее перспективной
представляется конъюгация ЛВ с антителами. Однако стоимость такой
терапии крайне высока (Bromley E. et al., 2011; Rosen L.S. et al., 2011). Кроме
того, антитела получены лишь для некоторых опухолевых линий (Bristo .J.A.
et al., 2011; di Bari.M. et al., 2011). Из-за того, что антитела являются
высокомолекулярными
соединениями,
встает
проблема
их
тканевой
проницаемости (Cilliers C. et al., 2016; Ruoslahti E., 2016). Не исключено и
развитие аллергических реакций на вводимые комплексы антитела с ЛВ
(Jensen-Jarolim E. et al., 2008; Jensen-Jarolim E. et al., 2016).
Поэтому во многих работах пытаются использовать средства доставки
ЛВ, не столь избирательные, как антитела, но не обладающие недостатками,
присущими антителам (Трещалин И.Д. и соавт., 2005; Iyer A.K., 2013). В
частности, активно разрабатываются возможности включения ЛВ в липосомы
или мицеллы, или же применяются коньюгаты ЛВ с биополимерами. В
последнем случае предполагают, что носитель может придавать новые
свойства модифицированному ЛВ, в частности, противовоспалительный
эффект (Kirtane A.R. et al., 2013; Rezaee M. et al., 2016).
5
FDA в настоящее время зарегистрировано 6 ЛВ для клинического
применения в качестве таргетной терапии в онкологии (Dawidczyk C.M. et al.,
2014). Все они основаны на включении ЛВ в липосомы. На территории РФ
разрешена только пегилированная форма липосомального доксорубицина –
Келикс (Рукавицын О.А., Поп В.П., 2008; Крысанов И.С., 2016), которая
наиболее широко используется и в большинстве других стран. В Израиле,
Японии зарегистрирован препарат Gliadel на специальном носителе, который
медленно и постоянно высвобождает действующее вещество (Domb A.J. et al.
1995; Aoki T. et al., 2014). Порядка 10 препаратов находятся на разных стадиях
доклинических исследований, большинство из которых основаны на
включении ЛВ в липосомы или мицеллы (Gabizon A.A., et al., 2016; Piktel E. et
al., 2016). Все это обусловливает актуальность поиска новых препаратов для
таргетной терапии, в т.ч. для целей импортзамещения.
Цель исследования
Разработка и научное обоснование стратегии создания и применения
противоопухолевых препаратов на основе полимерных наночастиц.
Задачи исследования
1.
Оптимизировать
методику
получения
модифицированных
противоопухолевых химиопрепаратов путем применения ультрафильтрации
для очистки от несвязанной фракции препарата.
2. Изучить острую токсичность и противоопухолевую эффективность
конъюгированных
с
ДНК
противоопухолевых
химиопрепаратов
(доксорубицина, проспидина, цисплатина).
3.
Исследовать
острую
токсичность
и
противоопухолевую
эффективность конъюгированных с ФД противоопухолевых химиопрепаратов
(доксорубицина, проспидина, цисплатина).
4. Исследовать фармакокинетику МЛ-доксорубицина.
5. Изучить противоопухолевую эффективность МЛ-доксорубицина.
6
6. Разработать фармакокинетическую модель направленного транспорта
противоопухолевых
препаратов.
Провести
первичный
скрининг
ряда
модифицированных противоопухолевых соединений.
7.
Спрогнозировать
возможности
клинического
применения
модифицированной формы доксорубицина.
Научная новизна исследования
Впервые предложен алгоритм поиска соединений (противоопухолевых
химиопрепаратов и полимеров) – потенциальных кандидатов для синтеза
наноструктурированных форм химиопрепаратов, а также созданы и
экспериментально
конъюгаты
обоснованы
композиции,
химиотерапевтических
представляющие
агентов
с
собой
нетоксичными
биодеградируемыми полимерами и липосомами. Изучены физико-химические
свойства полимерсвязанных форм доксорубицина, цисплатина и проспидина.
Впервые разработаны методы стандартизации полученных препаратов.
Впервые
получены
новые
данные
о
кинетике
высвобождения
химиопрепаратов из полимерных наночастиц и исследовано влияние на этот
процесс параметров среды, а также возможность управления скоростью
высвобождения при изменении параметров среды. Изучена токсичность
полимерсвязанных форм доксорубицина на культурах клеток, а также их
острая токсичность in vivo в моделях на животных. Произведена оценка
противоопухолевой активности полимерсвязанных форм доксорубицина in
vivo на моделях опухолевого роста. Впервые отобрана липосомальная форма
доксорубицина,
которая
является
перспективной
для
дальнейшего
клинического изучения.
Теоретическая и практическая значимость работы
Показано, что применение ультрафильтрации при синтезе полимерконъюгированных
химиопрепаратов,
позволяет
получать
продукты
с
улучшенными (по сравнению с полученными традиционными методами
диализа и гель-фильтрации) фармацевтическими характеристиками (более
гомогенные дисперсии частиц, более концентрированные коллоидные
7
системы). Установлено, что конъюгация с полимерами снижает токсичность
изученных химиопрепаратов, при этом их противоопухолевая активность
может как снижаться, так и возрастать. В связи этим, подбор доз на основе
данных о режимах дозирования водорастворимых форм этих препаратов
невозможен, необходимы индивидуальные токсикологические исследования
для каждой из новых форм препаратов. Показана целесообразность
использования золеобразных форм полимерсвязанных химиопрепаратов для
терапии солидных опухолей, а гелеобразующих – для терапии опухолей
серозных полостей. Установлено, что применение МЛ-доксорубицина в
условиях создания в области локализации опухоли градиента МП позволяет
концентрировать липосомы и инкорпорированный в них химиопрепарат в
опухолевой ткани. Это повышает эффективность противоопухолевой
химиотерапии и создает возможность разработки более щадящих режимов
химиотерапии в клинике. Проведенный фармакоэкономический анализ
позволил определить условия, при которых экономически целесообразно
производство и внедрение в широкую клиническую практику разработанных
модифицированных химиопрепаратов.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Разработана усовершенствованная система ультрафильтрации,
позволяющая оптимизировать получение носителей для модифицированных
ЛВ.
2. Предварительный скрининг модифицированных противоопухолевых
препаратов (цисплатин, проспидин, доксорубицин) показал, что последний
наиболее перспективен для дальнейшего изучения. Исследование носителей
ЛВ доказало, что МЛ наиболее перспективны для целей направленного
транспорта.
В
противоопухолевая
доклинических
активность
исследованиях
и
широкий
выявлена
спектр
высокая
терапевтической
безопасности модифицированного доксорубицина, включенного в липосомы.
8
3. Создана фармакокинетическая модель направленного транспорта
противоопухолевых препаратов, позволяющая осуществлять их первичный
скрининг и оптимизировать курсовое назначение.
4. Обоснованы перспективы использования созданной липосомальной
формы доксорубицина с экономических позиций.
Апробация работы
Апробация
диссертации
проведена
24
апреля
2018
г.
на
межучережденческом межкафедральном заседании кафедры фармакологии;
кафедры терапии, клинической фармакологии и скорой медицинской помощи;
кафедры ЮНЕСКО «Здоровый образ жизни – залог успешного развития»;
кафедры медицины катастроф и безопасности жизнедеятельности ФГБОУ ВО
«МГМСУ им. А.И. Евдокимова» Минздрава РФ; кафедры анестезиологии и
реаниматологии с курсами валеологии, безопасности жизнедеятельности и
медицины катастроф ФГБОУ ВО «МГУ им. Н.П. Огарева» Минобрнауки РФ.
Основные положения диссертации доложены на V съезде фармакологов
России «Научные основы поиска и создания новых лекарств» (Ярославль, 2018
г.); XX научно-практической конференции молодых ученых, аспирантов и
студентов Национального исследовательского Мордовского государственного
университета им. Н. П. Огарёва (Саранск, 2016); международной научнопрактической конференции научного центра «Диспут» (Вологда, 2015); на
XXIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва,
2016); на Всероссийской научной конференции студентов и молодых
специалистов «Актуальные вопросы современной медицины: взгляд молодого
специалиста» (Рязань, 2015); на XXIV Российском национальном конгрессе
«Человек и лекарство» (Москва, 2017); на конференции с международным
участием «Научно-методические проблемы нормальной физиологии и
медицинской физики» (Москва, 2017).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 20 печатных работ в ведущих
рецензируемых научных тематических изданиях, рекомендованных ВАК
9
Минобрнауки РФ для изложения основных результатов диссертационных
работ. В ходе выполнения диссертации получено 2 патента на изобретение:
патент №154660 «Устройство для ультрафильтрации жидкостей»; патент
№2629608 «Противоопухолевый химиопрепарат». Получено Государственное
свидетельство на регистрацию программы для ЭВМ «Расчет фармакокинетики
препарата при его направленном введении» № 2017616379 РФ.
Личный вклад
Автором
лично
исследований:
синтез
проведено
и
большинство
характеризация
экспериментальных
модифицированных
форм
химиопрепаратов, токсикологический анализ и исследование эффективности
противоопухолевой терапии, фармакокинетические исследования (анализ
концентраций и моделирование), фармакоэкономические исследования.
Автор
лично
провел
статистическую
обработку
и
интерпретацию
экспериментальных данных, а также анализ литературных источников. Доля
автора в статьях, написанных в соавторстве, не менее 90%.
Внедрение результатов исследования
Результаты исследований используются в научно-исследовательской
работе Центра перспективных исследований инновационных лекарственных
препаратов Медицинского института ФГБОУ ВО «МГУ им. Н.П. Огарева»; в
научно-исследовательской работе кафедры фармакологии и клинической
фармакологии
с
курсом
фармацевтической
технологии,
а
также
в
послевузовском профессиональном образовании при подготовке аспирантов и
клинических ординаторов по фармакологии в ФГБОУ ВО «МГУ им. Н.П.
Огарева»; в учебном процессе при подготовке врачей на циклах повышения
квалификации,
профессиональной
переподготовки
и
при
обучении
клинических ординаторов кафедры онкологии ФГБУ ДПО «Центральная
государственная медицинская академия Управления делами президента
Российской Федерации»; результаты внедрены в научный, лечебный и
учебный процессы в ФГБУ «Клиническая больница №1»; в педагогический
процесс на кафедре онкологии ФГБОУ ВО МГМСУ им. А.И. Евдокимова
10
Минздрава РФ, а именно при проведении практических занятий со студентами
6 курса лечебного факультета и с клиническими ординаторами.
Объем и структура работы
Материалы диссертации изложены на 303 страницах машинописного
текста и включают введение, обзор литературы, 8 основных глав с описанием
материалов и методов исследования, результаты исследования; отдельно
имеются:
заключение,
выводы,
практические
рекомендации,
список
литературы, включающих 193 отечественных и 237 зарубежный источников,
Работа иллюстрирована 74 таблицами и 52 рисунками.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследование
наноструктурированных
форм
химиопрепаратов
проводили по определенному алгоритму:

Синтез и исследование физико-химических свойств,

Исследование острой токсичности,

Исследование специфической противоопухолевой активности.
В ходе выполнения работы были синтезированы и изучены следующие
наноструктурированные формы химиопрепаратов:

конъюгат ДНК-доксорубицин,

конъюгат ДНК-цисплатин,

конъюгат ДНК-проспидин,

конъюгат декстранфосфат-доксорубицин,

конъюгат декстранфосфат-проспидин,

наночастицы декстрансульфат-доксорубицин,

магнитоуправляемые липосомы с доксорубицином,

липосомы с апротинином.
Кроме того, для синтеза и исследования был использованы ряд
химических субстанций и коммерческих химиопрепататов:

«Деринат», ЗАО Техномедсервис, Россия;

Доксорубицина гидрохлорид (Sigma-Aldrich, США);
11

Цисплатин («Teva», Израиль);

Проспидин
(лиофилизат
для
приготовления
раствора
для
инъекций, УНТ РУП «Унитехпром БГУ»).
Исследование физико-химических свойств наноструктуриророванных
форм химиопрепаратов включало исследование их следующих характеристик:
1.
Определение размера частиц;
2.
Исследование степени связывания препарата и носителя;
3.
Определение концентрации препарата в коллоидной системе.
Исследование размеров частиц проводили методом динамического
светорассеяния на установке Nanoflex (Malvern, США).
Таблица 1. Алгоритм исследования синтезированных композиций in vivo
Препарат
Конъюгация с ДНК
Доксорубицин
Цисплатин Проспидин
Токсичность острая
+
+
+
(определение LD50)
Противоопухолевая эффективность
+
+
+
Морфологические исследования
+
+
+
Показатели крови
+
+
+
(общий анализ + биохимия)
Конъюгация с фосфатом
декстрана
Доксорубицин
Препарат
Цисплатин
Проспидин
+
NA
+
+
+
NA
NA
+
+
+
NA
+
Доксорубицин
Препарат
Цисплатин
Проспидин
+
NA
NA
+
+
NA
NA
NA
NA
+
NA
NA
Токсичность острая
(определение LD50)
Противоопухолевая эффективность
Морфологические исследования
Показатели крови
(общий анализ + биохимия)
Включение в липосомы
Токсичность острая
(определение LD50)
Противоопухолевая эффективность
Морфологические исследования
Показатели крови
(общий анализ + биохимия)
Примечание: NA – not applicable
Исследование степени связывания препарата и носителя, а также
определение концентрации препарата в коллоидной системе, проводили путем
определения концентрации препарата в ультрафильтрате/диализате после
12
проведения
процедуры
спектрофотомерии
в
ультрафильтрации/диализа
ультрафиолетовой
или
видимой
методом
области
по
предварительно построенному калибровочному графику (спектрофотометр
Shimadzu, Япония). Схема биологического этапа исследований приведена в
таблице 1.
Общая характеристика экспериментов на животных
В работе использованы следующие виды животных: мыши линии BALB;
мыши линии С57Вl/6; крысы белые нелинейные; кролики породы
«Шиншилла». Все животные были получены из питомника «Столбовая» и
содержались в стандартных условиях вивария.
Эксперименты на животных выполнены с соблюдением норм биоэтики
после одобрения локальным этическим комитетом при ФГБОУ ВО «МГМСУ
им. А.И. Евдокимова» Минздрава России.
Исследования конъюгатов химиопрепаратов с ДНК
Острая токсичность конъюгатов препаратов с ДНК. Исследование
выполнено в соответствии с «Руководством по проведению доклинических
исследований лекарственных средств» (Миронов А.Н., 2012). Всего в
исследовании было задействовано 380 белых мышей линии BALB. Были
проведены 3 серии экспериментов: по исследованию конъюгатов ДНКдоксорубицин, ДНК-цисплатин и ДНК-проспидин. Исследуемая доза каждого
из препаратов растворялась в 0,2 мл изотонического раствора хлорида натрия
и однократно вводилась животным в хвостовую вену. Каждая доза
исследовалась на 10 животных (5 самцов и 5 самок). Для оценки фоновой
летальности была создана контрольная группа из 10 животных, которым
вместо химиопрепаратов внутривенно вводили 0,2 мл изотонического
раствора хлорида натрия. После введения каждого из препаратов животные
наблюдались в течение 30 дней, ежедневно фиксировалась летальность.
Определение показателей токсичности проводилось методом probit-analisys.
Для каждого из соединений строились кривые доза-эффект и рассчитывались
LD10, LD50 и LD84, а также их 95%-ные доверительные интервалы.
13
Противоопухолевая эффективность конъюгатов препаратов с ДНК.
Исследование цитостатической эффективности конъюгатов ДНКдоксорубицин и ДНК-цисплатин проводилось на 200 мышах C57Bl/6 с
трансплантированной LLC. Выбор модели обусловлен тем, что опухоль
проявляет достаточную чувствительность к исследуемым препаратам
(доксорубицин и цисплатин), особенно при раннем лечении.
Сравнивались эквимолярные и эквитоксические дозы водорастворимых
препаратов и их конъюгатов с ДНК. Расчет доз конъюгатов проводился по
чистому цитостатику. Было исследовано 2 уровня доз – 0,5 МПД и 1 МПД.
Изучаемые субстанции вводили через 6 дней после перевивки опухоли
однократно внутривенно. Для каждой дозы была сформирована группа из 10
животных, кроме того, было выделено 2 контрольные группы, в первой из
которых животным вводили 0,9% раствор хлорида натрия, во второй – 15%
ДНК.
Исследованные препараты вводили внутривенно однократно на 7-е
сутки после перевивки опухоли. Животных выводили из эксперимента на 22е сутки после трансплантации опухоли. В каждой группе определяли
показатели эффективности химиотерапии, рассчитывали летальность на фоне
терапии; а также проводили морфологические исследования внутренних
органов и определение клеточного состава и биохимических показателей
крови.
Эффективность
химиотерапии
оценивалась
показателям:

Объем и масса первичного опухолевого узла;

TWI;

TGII;

Частота метастазирования опухоли;

Среднего числа метастазов на одно животное;

Индекс ингибирования метастазирования.
14
по
следующим
Гематологические и биохимические исследования. Общий анализ
крови, включавший подсчет количества эритроцитов, лейкоцитов и
тромбоцитов, а также определение гематокрита и концентрации гемоглобина,
выполняли на гематологическом анализаторе ABX Micros 60 (Horiba ABX
DiagnosticsInc, Франция).
Биохимический анализ крови включал определение общего белка,
глюкозы, мочевины, креатинина, билирубина, аланиновой и аспарагиновой
трансаминаз (АлТ и АсТ) и щелочной фосфатазы (ЩФ). Биохимические
показатели определяли на анализаторе Humalyzer 3000 (HumanGmbH,
Германия) с помощью специализированных наборов.
Гистологические
исследования.
Органы
для
гистологического
исследования фиксировали в нейтральном 10% формалине, после чего
заливали в парафин и делали гистологические срезы толщиной 5 мкм. Срезы
окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике (Luna, Lee
G., 1960).
Исследования конъюгатов химиопрепаратов с ФД
Острая
токсичность
конъюгатов
химиопрепаратов
с
ФД.
Поскольку применение конъюгатов химиопрепаратов с декстран-фосфатом
планировалось при опухолях серозных полостей (на модели АГЗ), то и
токсичность была изучена на данном виде животных (белых лабораторных
крысах)
при
методе
введения,
планируемом
в
эксперименте
(внутрибрюшинно).
Были проведены 2 серии экспериментов: по исследованию конъюгатов
ФД-проспидин и ФД-доксорубицин. В каждой серии животные были
разделены на 2 группы (для официнальной формы химиопрепарата и для его
конъюгата с ФД). В свою очередь, в каждой из групп было выделено по 6
подгрупп (по 10 животных на 1 дозу препарата).
Проспидин и конъюгат ФД-проспидин вводили в дозах 450, 600, 900,
1200, 1800, и 2700 мг/кг в пересчете на проспидин. Доксорубицин и конъюгат
ДНК-доксорубицин вводили в дозах 2, 4, 8, 16, 24, и 32 мг/кг в пересчете на
15
доксорубицин. Контролем служили 2 группы по 10 животных. В 1-й
контрольной группе животным вводили 0,9% раствор NaCl в объеме 3,0 мл, во
2-й – 3,0 мл 10% раствора ФД. Эта доза соответствовала дозе ФД в подгруппе
с максимальными дозами химиопрепарата. Животные наблюдались в течение
30 дней, ежедневно фиксировалась летальность. Определение показателей
токсичности проводилось с помощью probit-analisys. Рассчитаны LD10, LD50 и
LD84 исследуемых субстанций, а также их 95%-ные доверительные интервалы.
Противоопухолевая эффективность конъюгатов химиопрепаратов
с ФД. Исследование противоопухолевой эффективности конъюгатов ФДпроспидин и ФД-доксорубицин выполнено на нелинейных белых крысах с
перевитой АГЗ.
В данное исследование было включено 180 животных (15 групп по 12
животных, по 90 животных обоего пола). Исследованные препараты вводили
внутрибрюшинно однократно через 24 часа после перевивки опухоли.
Животных выводили из эксперимента на 22-е сутки после трансплантации
опухоли. При асцитной гепатоме у крыс определяли: летальность на фоне
терапии; показатели эффективности химиотерапии; клеточный состав и
биохимические показателей крови (по вышеописанной методике). Данные
показатели определяли перед началом лечения, а также на 5-е и 10-е сутки
терапии.
Показатели эффективности химиотерапии отличались от таковых при
исследовании LLC, поскольку АГЗ имеет асцитный, а не солидный тип роста.
Были определены: объем асцита, индекс массы асцитической жидкости,
количество опухолевых клеток, общее количество клеток в асцитической
жидкости, содержание белка. Объем асцита определяли прямым измерением
после вскрытия павших или эвтаназированных животных; ИМА рассчитывали
по формуле: ИМА=Mа/Mж, где Mа – масса асцитической жидкости, Mж –
масса животного.
16
Исследования МЛ-доксорубицина
Синтез магнитоуправляемых липосом с доксорубицином. Для синтеза
магнитных липосом предварительно синтезировали коллоидный раствор
магнетита. Его получали путем соосаждения из водного раствора хлоридов
железа (II) и железа (III) в мольном соотношении 1:2 раствором аммиака
(реакция Элмора) в атмосфере азота с последующей стабилизацией лимонной
кислотой.
Для синтеза магнитных липосом использовали метод тонкоплёночной
гидратации, в основе которого лежит получение липидной плёнки путём
испарения органического растворителя из раствора исходных компонентов с
последующей её гидратацией водным раствором. Определение количества
доксорубицина,
включенного
в
липосомы,
проводили
методом
спектрофотометрии. Концентрация доксорубицина в суспензии была равна
18,2±2,1 мг/мл. Эффективность включения доксорубицина в липосомы
составила 36,4%.
Методика
магнитоуправляемой
доставки
доксорубицина.
Магнитоуправляемая доставка доксорубицина была реализована путем
внутривенного введения МЛ-доксорубицина и одновременного создания
градиента МП в заданной области (в данном исследовании – к опухоли,
трансплантированной в области бедра). В группах, где использовалась данная
методика, мышей фиксировали в специальном устройстве, обеспечивающем
контакт области бедра с постоянным магнитом. В исследовании использовали
постоянный магнит NdFeB N38 цилиндрической формы (d=50, h=30 мм) с
индукцией 0,4 Тл.
Исследование фармакокинетики и тканевого распределения МЛдоксорубицина. Исследование фармакокинетики и тканевого распределения
МЛ-доксорубицина проводилось на мышах линии С57Bl/6 с перевитой LLC.
Для получения достаточного количества опухолевой ткани исследования
выполнялись через 10 дней после перевивки, по достижению опухолью
минимум
1
см
в
наименьшем
измерении.
17
Всего
в
исследование
фармакокинетики было включено 144 животных (3 группы по 48 мышей, всего
72 самца и 72 самки).
В первой группе внутривенно вводился водный раствор доксорубицина;
во второй и третей – доксорубицин, помещенный в нагруженные
наночастицами магнетита липосомы (МЛ–доксорубицин). В 3-ей группе сразу
после внутривенной инфузии МЛ–доксорубицина над опухолью создавалось
постоянное МП по вышеописанной методике. Продолжительность действия
МП составляла 3 часа.
Для
каждой
из
исследуемых
лекарственных
форм
уровень
доксорубицина в плазме крови и гомогенатах органов определялся в
следующих временных точках: 0,5; 1; 2; 4; 6; 8; 12; 24 часа. Для каждой точки
концентрацию препарата определяли у 6 животных. Исследуемые препараты
вводились животным внутривенно (в хвостовую вену) однократно. По
истечении необходимого времени животных эвтаназировали методом
мгновенной цервикальной дислокации, после чего собирали кровь из сосудов
шеи в пробирки с ЭДТА К3.
Количественное определение доксорубицина в плазме и тканях
проводили методом ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием (Andersen
А., et al. 1993. Нижний предел количественного определения доксорубицина
составил 10 нг/мл в плазме, диапазон линейности 10-100000 нг/мл. Для
построения
фармакокинетической
кривой
проводили
определение
концентраций лекарственного препарата не менее чем в 8 временных точках,
c таким расчетом, чтобы для характеризации каждой фазы выведения было не
менее 3-х точек. Расчет AUC внемодельным методом (методом трапеций), а
также фармакокинетическое моделирование и расчет других кинетических
констант проводились с помощью программы Kinetica V2.0 (Thermo Electron
Corporation, USA).
Исследование противоопухолевой эффективности магнитолипосомального доксорубицина.
18
Этот эксперимент был проведен на той же модели, что и
фармакокинетическое
исследование
–
на
мышах
С57Bl/6
с
трансплантированной LLC. Всего в исследовании было задействовано 50
мышей (25 самцов и 25 самок), которые были разделены на 5 групп по 10
особей в каждой. В первой (контроль) лечения не проводилось. Во второй
группе внутривенно вводился водный раствор доксорубицина; в 3-й и 4-й –
МЛ – доксорубицин, в 5-ой воздействовали МП без введения доксорубицина.
В 4-й группе сразу после внутривенной инфузии МЛ – доксорубицина, над
опухолью создавалось постоянное МП при помощи магнита NdFeB N38 с
индукцией 0,4 Тл, для чего мышей фиксировали в специальном устройстве.
Продолжительность действия МП составила 3 часа. На животных 5-ой группы
воздействовали МП с такими же характеристиками. Все исследованные
формы доксорубицина вводились однократно внутривенно в дозе 4 мг/кг (в
пересчете на доксорубицин) на 7-е сутки после перевивки опухоли. Каждые 2
дня после начала лечения измеряли размеры опухоли и рассчитывали ее
объем. Животных выводили из эксперимента на 22-е сутки после
трансплантации опухоли и определяли показатели, характеризующие
эффективность химиотерапии (описаны выше).
Фармакоэкономическое моделирование
Для фармакоэкономического моделирования были адаптированы
модели «Дерево решений» и Маркова, разработанные в рамках проекта по
фармакоэкономической
оценке
эффективности
пегилированного
липосомального доксорубицина (коммерческое наименование – Келикс)
(Крысанов И.С., 2016).
Анализ результатов проведенных нами доклинических исследований
позволил сделать ряд допущений о равной эффективности и безопасности
разработанной липосомальной формы доксорубицина по сравнению с
оригинальным ЛП (Келикс) (Заборовский А.В. и соавт., 2016). В качестве
критерия эффективности в модели использовался LYG.
19
В основу расчета равновесной цены разработанного нами препарата
доксорубицина
легла
математическая
формула
определения
инкрементального показателя «затраты/эффективность» (ГОСТ Р 560442014):
ICER = (∑CostПЛД – ∑CostДОКСО) / (EfПЛД - EfДОКСО)
Равновесная цена определялась по верхнему значению ПГП, который,
согласно рекомендациям ВОЗ определяется, исходя из утроенного значения
ВВП на душу населения. Источником информации по ВВП за 2015 г. явилась
официальная база данных федеральной службы государственной статистики
Росстат (Зинчук И.Ю., 2016). ПГП в 2015 г. составил 1 648 924 руб. для
системы российского здравоохранения.
На следующем этапе была рассчитана сумма общих затрат для
отечественного дженерика ПЛД, при которых ICER не превышает ПГП,
удвоенного ПГП и утроенного ПГП. Далее были рассчитаны затраты на курс
химиотерапии ПЛД (из расчета 5,3 цикла в среднем) - CostЛП, равновесная
цена за 1 мг и за упаковку ЛП по следующим формулам:
CostЛП (ПЛД) = ∑CostПЛД – Costв/в введение ЛП – Costгоспитализация
ССО – Costфармакотерапия ССО,
Цена1 мг ПЛД = CostЛП (ПЛД) / Кол-во мгПЛД на курс лечения,
Цена за упаковку ЛП = Цена 1 мг ПЛД * Дозировка * форма выпуска.
Расчеты выполнялись в сравнении со стандартным доксорубицином,
средняя стоимость оригинального ЛП составила 27,10 руб. за 1 мг
действующего вещества.
Статистический анализ данных
Статистическую обработку данных осуществляли с использованием Fкритерия
Фишера
для
расчета
дисперсий.
Законы
распределения
устанавливали на основании λ-критерия Колмогорова-Смирнова. При
непротиворечии гипотезы о нормальном законе распределения использовали
t-критерий Стьюдента, или Т-критерий Уэлча, для сравнения средних
показателей.
Для
величин,
имеющих
20
распределение,
отличное
от
нормального, применяли U-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни. Частоты
встречаемости признаков устанавливали на основании критерия хи-квадрат.
Расчет коэффициента корреляции осуществляли методом Пирсона.
Критический уровень значимости различий принимался равным 5% (р<0,05).
Для расчетов статистических различий использованы программы Excel
for Windows 2015 и Statistica for Windows 8.0.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Оптимизация синтеза наноструктурированных химиопрепаратов
На первом этапе работы нами были синтезированы и изучены ряд
конъюгатов химиопрепаратов с полимерами (ДНК и производными
декстрана).
Первой
задачей
работы
была
оптимизация
синтеза
химиопрепаратов путём применения ультрафильтрации.
Ультрафильтрация является перспективным методом для очистки
макромолекулярных компонентов от низкомолекулярных примесей. При
синтезе наноструктурированных объектов она обладает рядом преимуществ, а
именно:
•
Позволяет сохранить структуру наночастиц;
•
Позволяет получать более концентрированные растворы;
•
Более проста и технологична по сравнению с гель-фильтрацией и
диализом.
Однако широкое применение метода в нанофармацевтике сдерживается
тем, что современные устройства для ультрафильтрации имеют определённые
недостатки, а именно:
•
Могут быть использованы только для относительно больших
объёмов растворов;
•
При фильтрации происходит быстрое загрязнение мембраны, что
снижает эффективность процесса;
•
Не во всех устройствах возможен одновременный сбор фильтрата
и супернатанта.
21
Нами было предложено устройство для ультрафильтрации жидкости
(Патент РФ N 154660), в котором вышеописанные недостатки были
устранены. Разработанное устройство имеет более широкие функциональные
возможности при проведении ультрафильтрации за счет создания на
поверхности
ультрафильтрационной
мембраны
турбулентных
потоков
фильтруемой жидкости путем постоянного перемещения по поверхности
мембраны перемешивающего элемента в процессе шейкирования, что
приводит к снижению концентрационной поляризации загрязнений и очистке
мембраны в процессе фильтрации. Схема устройства приведена на рис. 1.
Устройство
состоит
поддерживающей
из
сетки,
корпуса,
ультрафильтрационной
ультрафильтрационной
ячейки,
мембраны,
перемешивающего элемента, собирательной воронки, уплотнительной втулки
с патрубком, держателя емкости для сбора фильтрата. В фильтрационную
камеру устройства вносится раствор для фильтрации и перемешивающий
элемент, соприкасающийся с поверхностью мембраны. К фильтрационной
камере с помощью гибкого шланга подключен источник сжатого газа, а само
устройство в процессе проведения фильтрации подвергается шейкированию в
горизонтальной плоскости.
Рисунок
1.
Схема
устройства
для
ультрафильтрации жидкости:
1-корпус,
2-ультрафильтрационная ячейка,
3-поддерживающая сетка,
4-ультрафильтрационная мембрана,
5-собирательная воронка,
6-уплотнительная втулка с патрубком,
7-уплотнительные прокладки,
8-держатель емкости для сбора фильтрата,
9-емкость для сбора фильтрата,
10-перемешивающий элемент.
22
Для фильтрации раствора осуществляются следующие действия. В
корпус
последовательно
вставляются:
собирательная
воронка,
поддерживающая сетка, фильтрационная мембрана, фильтрационная ячейка с
уплотнительными прокладками, уплотнительная втулка с патрубком. После
этого уплотнительная втулка фиксируется прижимной гайкой. На корпусе
закрепляется держатель с емкостью для сбора фильтрата. Устройство
закрепляется в вертикальном положении, после чего в фильтрационную
камеру через патрубок уплотнительной втулки вводится разделяемый раствор
или смесь и вносится перемешивающий элемент. К патрубку уплотнительной
втулки с помощью гибкого шланга герметично присоединяется источник
сжатого газа (азот или аргон) с давлением до 4 атмосфер. Устройство
закрепляется
вертикально
на
платформе
вортекса
и
подвергается
шейкированию в горизонтальной плоскости с частотой 100-200 Гц и
амплитудой 2-5 мм в течение времени, необходимого для проведения
ультрафильтрации. По окончании процедуры фильтрации последовательно
отключается источник колебаний, источник сжатого газа, отсоединяется
держатель емкости с фильтратом, и из него извлекается емкость содержащая
фильтрат.
Разработанное устройство для ультрафильтрации было использовано
при синтезе следующих композиций, которые использовались в дальнейшей
работе:

конъюгат ДНК-доксорубицин;

конъюгат ДНК-цисплатин;

наночастицы декстрансульфат-доксорубицин;

магнитоуправляемые липосомы с доксорубицином;

липосомы с апротинином;

липосомы с гипертоническим раствором хлорида натрия.
Синтез конъюгатов химиопрепаратов с ДНК включал следующие этапы:

Смешивание раствора химиопрепарата с коллоидом ДНК.
Вариабельные параметры: температура, рН, массовое соотношение.
23

Инкубация при непрерывном шейкировании в течение 24 часов.
Вариабельный параметр: температура.

Очистка
от
несвязанного
химиопрепарата.
Вариабельный
параметр: метод очистки (ультрафильтрация или диализ).
Были подобраны условия, обеспечивающие максимально эффективное
связывание химиопрепарата с полимером.
Результаты исследования физико-химических свойств синтезированных
конъюгатов (при оптимальных параметрах синтеза) приведены в табл. 2. Мы
можем видеть, что при очистке ультрафильтрацией образовывались
гомогенные частицы меньшего размера, при диализе – более крупные частицы
с большей степенью дисперсности.
Таблица 2. Физико-химические свойства синтезированных конъюгатов в зависимости
от метода очистки.
Химиопрепарат
Метод очистки
Показатель
Ультрафильтрация
Диализ
Доксорубицин Размер частиц, нм
314±36
377±33
Степень конъюгации, %
71±5
74±5
Содержание химиопрепарата, мг на
0,47±0,02
0,39±0,04
1 мг ДНК
Концентрация химиопрепарата в
3,6±0,4
2,1±0,4
коллоиде, мг/мл
Цисплатин
Размер частиц, нм
344±21
396±44
Степень конъюгации, %
88±2
85±4
Содержание химиопрепарата, мг на
41,2±3,1
23,3±4,0
1 мг ДНК
Концентрация химиопрепарата в
28,0±3,9
17,9±2,0
коллоиде, мг/мл
Проспидин
Размер частиц, нм
258±22
321±35
Степень конъюгации, %
85,3±3,2
83,2±3,9
Содержание химиопрепарата, мг на
2,13±0,02
2,08±0,05
1 мг ДНК
Концентрация химиопрепарата в
64,1±1,7
40,7±3,1
коллоиде, мг/мл
Кроме того, при ультрафильтрации имеется возможность получения
систем с более высокой концентрацией химиопрепарата. Объяснением этого
может служить большая степень гидратации коллоидных частиц в
гипоонкотическом диализующем растворе.
24
На основании проведенных экспериментов были выбраны следующие
условия
для
синтеза
конъюгатов,
использованных
в
дальнейших
исследованиях:

Конъюгат ДНК-доксорубицин: рН=7,0, температура 4оС, массовое
соотношение
ДНК/доксорубицин
=
3/2,
очистка
с
помощью
ультрафильтрации.

Конъюгат ДНК-цисплатин: рН=7,0, температура 4оС, массовое
соотношение ДНК/цисплатин = 30/1, концентрация раствора цисплатина 0,5%,
очистка с помощью ультрафильтрации.

Конъюгат ДНК-проспидин: рН=5,0, температура 21 оС, массовое
соотношение ДНК/проспидин = 1/1, концентрация раствора проспидина 15%,
очистка с помощью ультрафильтрации.
Исследование конъюгатов химиопрепаратов с ДНК
Острая токсичность
конъюгатов химиопрепаратов
с
ДНК.
Исследование острой токсичности конъюгатов химиопрепаратов с ДНК имело
целью сопоставление их токсичности с таковой у водорастворимого
препарата, а также поиск доз для исследования противоопухолевой
эффективности. Методом пробит-анализа были определены параметры
токсичности для каждой из синтезированных композиций. Результаты
представлены
в
табл.
3.
Расчет
токсикологических
показателей
продемонстрировал снижение острой токсичности конъюгированных форм
цитостатиков (доксорубицина, цисплатина и проспидинa) в среднем в 1,5 раза
по сравнению с водорастворимыми формами препаратов.
Таблица 3. Параметры острой токсичности синтезированных конъюгатов с ДНК
Водорастворимая форма
Конъюгат с ДНК
Базовый
химиопрепарат
LD50, мг/кг
U95*
LD50, мг/кг
U95*
Доксорубицин
9,9
7,1 - 13,4
Цисплатин
17,8
13,4 - 19,2
Проспидин
2150
1760 - 2640
Примечание: U95 – 95%-ный доверительный интервал.
14,6
26,4
2720
10,5 - 19,9
21,5 - 31,7
2480 - 3450
Возможными причинами меньшей токсичности конъюгатов может быть
неполная диссоциация конъюгата в соматических клетках, ингибирование
25
прооксидантного эффекта доксорубицина и цисплатина нуклеиновой
кислотой. В связи с этим закономерно возник вопрос, не будет ли снижение
токсичности сопровождаться уменьшением основного цитостатического
эффекта конъюгированных форм, и в достаточной ли степени сохранится их
антипролиферативный эффект? Получение ответа на этот вопрос стало
предметом следующего этапа настоящего исследования.
Противоопухолевая эффективность конъюгатов цитостатиков с
ДНК. На рис.2 приведены значения ИТРО на точках максимального
относительного ингибирования роста опухоли для всех исследованных
препаратов, а в табл. 4 - частота проявления побочных и токсических
эффектов.
70
60
ИТРО, %
50
40
30
20
10
0
Рис.2. Значения индекса торможения роста опухоли на фоне различных схем
химиотерапии LLC.
Сопоставление
результатов
исследования
противоопухолевой
эффективности и токсичности конъюгатов химиопрепаратов с ДНК в
эквимолярных
конъюгация
и
эквитоксических
цитостатиков
токсикологический
профиль
с
дозах
молекулой
препаратов
антибластомной активности.
26
позволяют
ДНК
без
заключить,
позволяет
потери
что
улучшить
специфической
Более
того,
установлена
более
высокая
противоопухолевая
эффективность конъюгатов ДНК с доксорубицином, цисплатином и
проспидином
в
эквитоксических
дозах
относительно
прогрессии
и
метастазирования LLC.
Можно предположить, что наиболее вероятным механизмом увеличения
противоопухолевой активности цитостатиков при конъюгации с ДНК является
повышенное накопление химиопрепарата в опухолевой ткани, обусловленное
эндоцитозом комплекса ДНК с цитостатиком.
Таблица 4. Летальность и побочные эффекты на фоне различных схем терапии
конъюгатами химиопрепаратов с ДНК в максимально переносимой дозе
Токсиче
Токсиче
Язвенн
Токсиче
ская
ская
Летальнос
ый
ская
миокар
дистроф
Группы сравнения
ть,
энтерок
нефроп
диодист
ия
абс. (%)
олит,
атия,
рофия,
печени,
абс. (%)
абс. (%)
абс. (%)
абс. (%)
Контрольная
0
2 (20)
0
1 (10)
2 (20)
Доксорубицин 4 мг/кг
6 (60)
10 (100)
10 (100)
1 (10)
10 (100)
Конъюгат ДНК-доксорубицин
4 мг/кг
2 (20)
4 (40)
4 (40)
0
1 (10)
Конъюгат ДНК-доксорубицин
6 мг/кг
5 (50)
8 (80)
3 (30)
0
8 (80)
ДНК (Препарат «Деринат») 6,5
мг/кг
0
1 (10)
0
1 (10)
2 (20)
Водорастворимый цисплатин
10 мг/кг (МПД)
7 (70)
6 (60)
2 (20)
10 (100)
8 (80)
Конъюгат ДНК- цисплатин 10
мг/кг (доза, эквимолярная
МПД водного цисплатина)
3 (30)
2 (20)
1 (10)
3 (30)
2 (20)
Конъюгат ДНК-цисплатин 17
мг/кг (доза, эквитоксическая
МПД водного цисплатин)
6 (60)
7 (70)
1 (10)
9 (90)
8 (80)
Водорастворимый проспидин
900 мг/кг (МПД)
1 (10)
2 (20)
1 (10)
3 (20)
3 (30)
Конъюгат ДНК- проспидин
900 мг/кг (доза, эквимолярная
водному проспидину)
1 (10)
1 (10)
1 (10)
1 (10)
1 (10)
27
Группы сравнения
Летальнос
ть,
абс. (%)
Язвенн
ый
энтерок
олит,
абс. (%)
Конъюгат ДНК- проспидин
1350 мг/кг (доза,
эквитоксическая МПД водного
проспидина)
1 (10)
2 (20)
Токсиче
ская
миокар
диодист
рофия,
абс. (%)
Токсиче
ская
нефроп
атия,
абс. (%)
Токсиче
ская
дистроф
ия
печени,
абс. (%)
0
1 (10)
1 (10)
Одним из косвенных подтверждений этого предположения является
факт
повышения
пролиферирующих
токсичности
тканей
конъюгатов
и
в
отношении
снижение
в
быстро
отношении
высокодифференцированных и не обладающих высокой пролиферативной
активностью.
Исследование конъюгатов химиопрепаратов с ФД
Второй группой макромолекулярных матриц для создания новых форм
противоопухолевых химиопрепаратов стал ФД. Преимуществами ФД с
медицинской точки зрения являются его полная биосовместимость, низкая
токсичность и отсутствие антигенных свойств (Юркштович Т.Л. и соавт.,
2010). Макромолекулы ФД содержат функциональные группы (PO(OH)2,
CO(NH)2)2, способные связывать химиопрепараты путем ионных и донорноакцепторных взаимодействий. При взаимодействии сухого ФД с водными
растворами
химиопрепаратов
проникновение
молекул
происходит
растворителя
и
набухание
полимера
химиопрепарата
в
и
его
пространственную структуру с образованием гидрогеля. Данная форма
является
нетекучей,
но
деградирует
в
организме
под
действием
амилолитических ферментов тканей и фагоцитов. Эти свойства весьма
привлекательны для создания препаратов, применяемых при лечении
опухолей серозных полостей. Такие виды опухолей малодоступны для
проникновения препаратов из кровотока, поэтому плохо поддаются системной
химиотерапии, и имеют плохой прогноз (Сельчук В.Ю. и соавт., 2011;
Hiddinga B.I. et al., 2013). Основным методом лечения данного вида опухолей
28
является внутриполостная химиотерапия. Однако она имеет свои ограничения,
ведущее из которых – недостаточная эффективность из-за быстрого
всасывания лекарства в системный кровоток (Сельчук. В.Ю., 2011).
Использование полимер-иммобилизованных препаратов позволяет увеличить
концентрацию и пролонгировать время нахождения препарата в полости, а
также избегать резкого повышения концентрации в плазме крови,
являющегося причиной многих побочных эффектов (Ohgaki M. et al., 2004).
Работы, в которых исследована эффективность гидрогелевых форм
химиопрепаратов in vivo, на сегодняшний день малочисленны (Бычковский
П.П. и соавт., 2012; Кладиев А.А. и соавт., 2012; Пятаев Н.А. и соавт., 2013),
поэтому имеется потребность в более подробном их изучении. В качестве
цитостатических агентов нами были использованы уже исследованные ранее
доксорубицин и проспидин. Исследования цисплатина в данном разделе
работы не проводилось, поскольку при внутриполостном введении этот
препарат часто вызывает некроз контактирующих с ним тканей.
Острая токсичности конъюгатов химиопрепаратов с фосфатом
декстрана. Результаты данного исследования приведены в табл. 5.
Таблица 5. Параметры острой токсичности синтезированных конъюгатов с
фосфатом декстрана
Базовый
Водорастворимая форма
Конъюгат с ДНК
химиопрепарат
LD50, мг/кг
U95*
LD50, мг/кг
U95*
Доксорубицин
15,8
9,3 - 19,4
18,9
14,6- 27,9
Проспидин
1570
1380-2420
2520
1850-2690
Примечание: U95 – 95%-ный доверительный интервал.
Конъюгирование с ФД снижало токсичность как проспидина, так и
доксорубицина, причем последнего - в меньшей степени. LD50 конъюгата ФДпроспидин в 1,5 раза превышала таковую для водорастворимого препарата,
для доксрубцина это различие составило 19%. Наиболее вероятным
механизмом снижения токсичности цитостатиков может быть уменьшение
скорости и степени их поступления в системный кровоток, приводящее к
снижению их пиковой концентрации.
29
Противоопухолевая эффективность конъюгатов химиопрепаратов
с ФД. Результаты применения синтезированных конъюгатов химиопрепаратов
(проспидина и доксорубицина) с производными декстрана (ФД) при АГЗ по
ключевому параметру – выживаемости животных – приведены на рис.3.
Анализируя эти результаты, можно отметить следующее. Во-первых, в
целом эффективность проспидина и его модифицированных форм была выше,
чем у доксорубицина. Во-вторых, конъюгаты химиопрепаратов с ФД были
более эффективными, чем их водорастворимые формы. Так, при введении
водного раствора проспидина в дозе, половинной от максимально
Выживаемость %
переносимой, погибли все животные.
80
70
60
50
40
30
20
10
0
67
58
58
50
42
42
42
33
33
25
17
0
0
Рис. 3. Выживаемость животных с АГЗ на фоне химиотерапии конъюгатами
химиопрепаратов с фосфатом декстрана.
Введение же конъюгата проспидина с ФД в этой же дозе приводило к
излечению опухоли в 33% случаев. При использовании конъюгатов ФДдоксорубицин выживаемость была выше в 2-2,5 раза по сравнению с нативным
препаратом.
Исследование липосомальных форм химиопрепаратов
В
настоящее
время
помимо
полимерных
носителей,
широкое
распространение получили липосомальные системы доставки лекарств.
30
Каждый из этих типов носителей имеет свои преимущества и недостатки,
поэтому в рамках данной работы мы сочли необходимым провести
сравнительный анализ этих систем. Следует отметить, что пассивный
транспорт, реализуемый за счет механизма EPR-эффекта, не всегда
обеспечивает необходимую избирательность накопления химиопрепарата в
опухолевой ткани. В связи с этим предпринимаются попытки создания
механизмов активного нацеливания, которые позволяют концентрировать
носитель с препаратом непосредственно в очаге. Одним из таких механизмов
является нацеливание с помощью внешнего МП. Для включения в липосомы
нами были апробированы несколько химиопрепаратов, исследованные ранее
в виде конъюгатов с полимерными носителями (доксорубицин, цисплатин и
проспидин). Синтезировать магнитоуправляемые липосомы с цисплатином не
удалось, так как при взаимодействии с магнетитом происходила инактивация
этого препарата. Исследование же липосом с проспидином показалось нам
нецелесообразным, поскольку проспидин проявил низкую активность в
отношении солидных опухолей, таких как LLC. Наиболее перспективным
проектом с точки зрения фармацевтических и фармакологических свойств
полученного
продукта
оказались
магнитоуправляемые
липосомы
с
доксорубицином, которые и были изучены в данной работе. Было проведено
исследование
фармакокинетики
включенного
в
и
фармакодинамики
магнитоуправляемые
липосомы,
доксорубицина,
у
мышей
с
трансплантированной LLC.
Особенности биораспределения и кинетики доксорубицина при его
введении в магнитоуправляемых липосомах. На рис 4 приведены кривые
концентрация - время для плазмы, а на рис. 5 – для опухолевой ткани.
Результаты оценки тканевого распределения по ключевому параметру
фармакокинетики – AUC – представлены на рис. 6.
31
Рис. 4. Кривые «концентрация-время» для доксорубицина в плазме крови при
введении в различных лекарственных формах.
Рис. 5. Кривые «концентрация-время» для доксорубицина в опухолевой ткани при
введении в различных лекарственных формах.
32
Рис. 6. Значения площади под кривой «концентрация-время» доксорубицина для
исследованных тканей.
Полученные результаты по фармакокинетике водного раствора
доксорубицина хорошо согласуются с данными большого количества
исследований по этой тематике и подтверждают наличие двух фаз выведения
доксорубицина из крови: первая фаза элиминации – быстрая, описывает выход
препарата из сосудистого русла и распределение его во внутриклеточном
пространстве; вторая – медленная, описывает экскрецию почками. Высокий
уровень кажущегося объема распределения свидетельствует о внесосудистом
(внутриклеточном) распределении доксорубицина.
Величины
исследовании,
кинетических
соответствуют
констант,
ранее
полученные
опубликованным.
в
данном
Тканевое
распределение доксорубицина при введении его водорастворимой формы
также соответствовало описанному в литературе (Terasaki T., Iga T., Sugiyama
Y., 1984). В случае введения водной формы препарата максимальная AUC
регистрировалась в почечной ткани, затем ткани располагались в следующей
последовательности (по убыванию значения AUC): печень, селезенка,
опухоль, сердце¸ легкие, кровь. Для данной формы концентрации препарата в
33
тканях превышали плазменные в 5-25 раз. Эти результаты могут быть
объяснены следующим образом.
Известно, что доксорубицин быстро проникает через мембраны клеток,
а затем встраивается между петлями ДНК, нарушая процесс ее репликации или
повреждая матрицу и изменяя ее пространственную структуру. В работе
(Terasaki T., Iga T., Sugiyama Y., 1984) было доказано, что уровень кумуляции
препарата в тканях соответствует содержанию ДНК и числу транзитноамплифицирующихся клеток (находящихся в состоянии митоза или
способных
к
распределение
митозу).
по
Приведенное
уровню
содержания
в
цитируемом
ДНК
исследовании
практически
повторяет
рассмотренное здесь распределение доксорубицина по концентрации.
Исключением является фармакокинетика в почках, где более высокое, чем в
плазме крови, содержание препарата обусловлено почечным механизмом
выведения доксорубицина.
Фармакокинетика доксорубицина, инкорпорированного в липосомы,
содержащие частицы магнетита, характеризовалась специфичными для
липосомальных препаратов свойствами. При введении липосомального
доксорубицина в соответствующих дозах создавались значительно большие
концентрации препарата в плазме, чем при введении его водного раствора.
Распределение доксорубицина имело в этом случае абсолютно иную
структуру. В тканевых гомогенатах сердца, почек и легких концентрация
препарата (как AUC, так и Сmax) оказались ниже, а в ткани опухоли, селезенке
и печени - выше, чем в случае введения водного раствора. Эти результаты
объясняются
особенностями
циркуляции
и
межтканевого
обмена
доксорубицина. В случае введения препарата в виде липосом большая часть
доксорубицина содержится внутри циркулирующих в сосудистом русле
везикул, размер которых не превышает 200 нм. В межклеточном, а потом и в
интрацеллюлярном
пространстве
оказывается
образующаяся
при
самостоятельном выходе из липосом часть препарата, которая составляет 10 –
20 % от суммарной дозы (Kousba А., Underbrink R., Kruppa D., 2007).
34
Небольшое
содержание
свободной
фракции
определяет
уменьшение
накопления доксорубицина в тканях сердца, легких и почек (в случае почечной
ткани – на ранних этапах после введения). Увеличение содержания препарата
в тканях печени и селезенки при использовании липосомальной формы
доксорубицина объясняется тем, что клетки ретикулярноэндотелиальной
системы, хорошо развитой в этих тканях, активно поглощают липосомы.
Механизм аккумуляции липосомальной формы доксорубицина в
опухолевой ткани также довольно тщательно исследован. В классической
работе G. Gregoriadis, опубликованной в 1986 году, было установлено, что
накопление в опухолевой ткани липосом, диаметр которых составляет 50-200
нм, происходит из-за того, что стенки ее капилляров становятся более
пористыми и в ней нарушается циркуляция лимфы (EPR-эффект). Результаты,
полученные в нашем исследовании, хорошо согласуются с современными
взглядами на фармакокинетику препаратов, вводимых в липосомальной
форме.
МП индукцией 0,4 Тл, созданное над областью опухоли, позволяет
аккумулировать в ней липосомы, нагруженные наночастицами магнетита и
доксорубицином, однако при этом оно не влияет на системное и тканевое
распределение препарата. В той группе, где применялось МП, были выявлены
те же особенности распределения препарата, что и при применении МЛдоксорубицина без МП. Единственным исключением стала опухолевая ткань,
где содержание доксорубицина было больше в сравнении с другими
исследуемыми
группами.
Различия
с
группой
водного
раствора
доксорубицина по значению пиковой концентрации достигали 400% (р<0,01),
с группой липосомальной формы препарата – 250 % (р<0,05). В случае AUC
разница составила соответственно 500% и 190%. Отсутствие влияния МП на
системную кинетику МЛ-доксорубицина, может быть сопряжено с малым
(относительно всего организма) объемом ткани, где накапливаются частицы.
35
Противоопухолевая
эффективность
магнитолипосомального
доксорубицина. Результаты оценки противоопухолевой эффективности МЛдоксорубицина представлены в табл. 6.
Таблица 6. Эффективность противоопухолевой химиотерапии МЛ-доксорубицином
Показат
Группы
ель
1 (Контроль)
2
3 (МЛ4 (МЛМЛ в/в
(Доксорубиц доксорубицин в/в доксорубицин
ин в/в)
без МП)
в/в + МП)
TWI
35,3±1,7 2,3,4
22,5±2,8 1,4,5
16,8±2,3 1,3,4,5
7,3±1,1 1,2,3,5
32,4±1,3 2,3,4
TGII
-
36,3
52,4
79,3
8,2
Примечание: 1 – статистически достоверные (р<0,05) различия между показателями
опытной и контрольной группы; 2- показатель статистически достоверно (р<0,05)
отличается от аналогичного во 2-й опытной группе; 3 - показатель статистически
достоверно (р<0,05) отличается от аналогичного в 3-й опытной группе; 4 - показатель
статистически достоверно (р<0,05) отличается от аналогичного в 4-й опытной группе; 5 показатель статистически достоверно (р<0,05) отличается от аналогичного в 5-й опытной
группе.
Мы
можем
видеть,
что
проводимая
химиотерапия
оказывала
определенный эффект во всех исследуемых группах. ИТРО на фоне
применения водорастворимого доксорубицина был равен 36,3%, что
свидетельствовало о чувствительности исследуемого штамма к этому
химиопрепарату. В группе, получавшей МЛ-доксорубицин, эффективность
химиотерапии была большей. TWI был достоверно ниже, чем в контроле и
группе водорастворимого доксорубицина TGII был равен 52,4%.
Наиболее эффективной оказалась химиотерапия в группе животных,
которым МЛ-доксорубицин вводился на фоне создания над опухолью МП. В
данной группе TWI был наименьшим (7,3±1,1), а TGII составлял 79,3%
превышая данный показатель 1-й группы в два, а 2-й опытной - в 1,5 раза.
Отметим, что МЛ без химиопрепарата не обладали противоопухолевой
активностью. Механизм увеличения эффективности, скорее всего связан с
повышением концентрации препарата в опухоли, что было подтверждено в
фармакокинетических исследованиях.
36
Фармакоэкономические перспективы клинического применения
разработанного липосомального доксорубицина
Разработанная
нами
липосомальная
магнитоуправляемая
форма
доксорубицина перспективна для внедрения в онкологическую практику.
Понятно, что модификация препарата приведет к увеличению его стоимости.
Соответственно, встает вопрос о том, насколько экономически оправдано
использование модифицированной формы доксорубицина.
В настоящее время на фармацевтическом рынке РФ есть только один
липосомальный препарат, созданный также на основе доксорубицина –
Келикс. Основным показанием к его применению является РМЖ. Несмотря на
то, что стоимость препарата практически в 1000 раз превосходит нативный
доксорубицин, применение Келикса экономически оправдано, т.к. снижается
риск развития антрациклиновой кардиомиопатии и других ССО. Результаты
расчета суммы моделируемых затрат для разработанного нами МЛдоксорубицина представлены в таблице 7. Видно, что при суммарных затратах
на лечение РМЖ разработанным нами МЛ- доксорубицином не превышающих
2 218 438 руб., ICER ПЛД будет являться приемлемым с точки зрения ПГП, а
лекарственная технология будет экономически эффективной.
Таблица 7. Расчет равновесных суммарных затрат на лечение РМЖ и ССО
разработанным нами МЛ-докорубицином в сравнении с доксорубицином
стандартным
Исследуемый
ПГП
2 х ПГП
3 х ПГП
показатель
1 648 924 руб.
3 297 848 руб.
4 946 772 руб.
∆ LYG, годы жизни
1,21
1,21
1,21
ICER, руб.
1 648 924
3 297 848
4 946 772
∑CostПЛД, руб.
2 218 438
4 213 636
6 208 834
На следующем этапе были рассчитаны затраты на химиотерапию
больных из расчета средней продолжительности курса химиотерапии 5,3
цикла (табл. 8, выделено полужирным курсивом).
37
Таблица 8. Затраты на различные схемы химиотерапии
МЛДоксоруб
доксорубицин
Доля, %
ицин
(разработанн
ый нами)
Виды затрат
Доля,
%
Стоимость лекарственной
терапии за курс, руб.
17 929
8,0
2 196 646
99,0
Затраты на введение ЛП, руб.
9 354
4,2
7 869
0,4
178 954
80,2
12 715
0,5
17 003
7,6
1 208
0,1
223 240
100,0
2 218 438
100,0
Затраты на госпитализацию из-за
ССО за 6 лет, руб.
Затраты на терапию ССО ЛП за 6 лет,
руб.
Суммарные затраты, руб.
Мы можем видеть, что наибольший удельный вес в общей сумме затрат
в группе доксорубицина приходится на терапию ССО на госпитальном и
амбулаторном этапе (почти 99% всех затрат). На этом фоне, доля затрат на
терапию ССО для ПЛД практически в 15 раз меньше и составляет менее 1%.
Далее была рассчитана цена за 1 мг и упаковку ПЛД, разработанного
нами (дозировка 25 мг и 50 мг). Результаты представлены в таблице 9. Из
таблицы
видно,
что
в
случае
равной
клинической
эффективности
разработанного нами липосомального магнитоуправляемого доксорубицина и
оригинального ПЛД (Келикс), выживаемость пациентов по сравнению с
терапией доксорубицином стандартным в среднем на 1,21 года выше за счет
снижения
рисков
ССО
на
фоне
применения
химиопрепаратов
антрациклиновой группы.
Таблица 9. Равновесная цена за 1 мг и за упаковку нового разработанного нами МЛдоксорубицина
Приемлемость для
Цена за уп.
Цена за уп.
Цена 1 мг, руб.
здравоохранения РФ
(20 мг/уп.)*
(50 мг/уп.)**
CERПЛД<CERДОКСО
620
12 400
31 000
ICER ниже ПГП
4 784
95 680
239 200
ICER ниже 2хПГП
9 086
181 720
454 300
ICER ниже 3хПГП
13 388
267 760
669 400
Примечание: *эквивалентно форме выпуска оригинального ЛП (Келикс) –
концентрата для приготовления раствора для в/в введения 2 мг/мл, 10 мл, № 1 (с учетом
НДС 10%), **эквивалентно форме выпуска оригинального ЛП (Келикс) концентрат для
приготовления раствора для в/в введения 2 мг/мл, 25 мл, № 1 (с учетом НДС 10%).
38
В случае, если стоимость разработанного нами МЛД за 1 мг будет ниже
620 руб., то МЛД будет являться предпочтительной лекарственной
технологией по сравнению со стандартным доксорубицином – стоимость 1
года продленной жизни (CERПЛД) будет ниже, чем для доксорубицина. При
цене за 1 мг до 4 784 руб. (95 680 руб. и 239 200 руб. за упаковку концентрата
для приготовления раствора для в/в введения 2 мг/мл, 10 мл, № 1 и
концентрата для приготовления раствора для в/в введения 2 мг/мл, 25 мл, № 1
соответственно) ПЛД будет являться экономически эффективным, т.к. ICER в
расчете на 1 дополнительный год жизни (LYG) не будет превышать ПГП
(1 648 924 руб./1 LYG). При цене за 1 мг от 4 784 руб. до 9 086 руб. ПЛД будет
являться приемлемым для российского здравоохранения, ICER не превышает
двойного ПГП (3 297 848 руб./1 LYG), при цене за 1 мг от 9 086 руб. до 13 388
руб. ПЛД будет являться погранично приемлемым с точки зрения ПГП
(утроенный ПГП –4 946 772 руб. /1 LYG). При цене за 1 мг более 13 388 руб.
ПЛД будет являться дорогостоящей лекарственной технологией.
Стоит отметить, что в настоящее время оригинальный лекарственный
препарат пегилированного липосомального доксорубицина (Келикс) входит в
перечень ЖНВЛП, зарегистрированная цена производителя составляет
33 981,6 руб. и 84 954 руб. для форм выпуска концентрата для приготовления
раствора для в/в введения 2 мг/мл, 10 мл, № 1и концентрата для приготовления
раствора для в/в введения 2 мг/мл, 25 мл, № 1 соответственно. Средняя
стоимость 1 мг действующего вещества с учетом НДС составляет 1869 руб.,
что
существенно
ниже
ПГП.
Таким
образом,
для
конкурентного
преимущества, созданного нами МЛ-доксорубицина по сравнению с
оригинальным лекарственным препаратом стоимость за 1 мг действующего
вещества должна быть менее 1869 руб. (с учетом НДС).
ВЫВОДЫ
1.
С
целью
оптимизации
методики
получения
модифицированных
химиопрепаратов разработано устройство для ультрафильтрации жидкости.
39
Усовершенствованный метод ультрафильтрации с помощью предложенного
устройства позволяет эффективно осуществлять: очистку конъюгатов
химиопрепаратов с полимерами и липосом от свободного препарата;
выделение ультрафильтрата из плазмы крови и гомогенатов органов для
определения концентрации препарата.
2. По результатам исследования острой токсичности и противоопухолевой
эффективности конъюгированных с ДНК протиовоопухолевых препаратов
выявлено, что конъюгация цитостатиков (доксорубицина, цисплатина и
проспидина) с ДНК позволяет улучшить токсикологический профиль
препаратов без потери специфической антибластомной активности; у мышей
с LLC конъюгаты ДНК с доксорубицином, цисплатином и проспидином в
эквитоксических
дозах
обладают
более
высокой
противоопухолевой
эффективностью в отношении прогрессирования и метастазирования данной
опухоли по сравнению с водорастворимыми формами этих препаратов; при
LLC проспидин как в водорастворимой, так и в конъюгированной с ДНК
форме уступает по противоопухолевой эффективности доксорубицину и
цисплатину и их конъюгатам с ДНК.
3. По результатам исследования острой токсичности и противоопухолевой
эффективности конъюгированных противоопухолевых препаратов с ФД
выявлено, что при АГЗ активность конъюгатов с ФД (проспидина и
доксорубицина) выше таковой их водорастворимых форм. Как для
проспидина, так и для доксорубицина характерно повышение частоты
элиминации опухоли и уменьшение показателей, ассоциированных с
опухолевым ростом (объем асцита, количество опухолевых клеток в
асцитической
жидкости).
Системные
токсические
эффекты
противоопухолевой терапии при применении конъюгатов химиопрепаратов с
ФД выражены в меньшей степени, чем при применении их водорастворимых
форм.
4. Особенностью фармакокинетики МЛ-доксорубицина по сравнению с
водорастворимой
формой
препарата
40
является
значимое
повышение
концентрации в плазме, печени и опухолевой ткани. Одновременное введение
препарата и создание над областью опухоли МП приводит к увеличению
концентрации препарата в опухолевой ткани, но не меняет остальные
параметры фармакокинетики и биораспределения препарата. Разработана
методика получения МЛ с наночастицами оксида железа и доксорубицином.
Отличительной
особенностью
методики
является
использование
ультрафильтрации с помощью разработанного устройства на этапе очистки
липосомальной суспензии.
5. МЛ-доксорубицин, вводимый на фоне создания в зоне опухоли МП,
обладает наиболее выраженным антинеопластическим эффектом в отношении
LLC у мышей. Его эффективность по ИТРО в 2 раза выше, чем у
водорастворимого доксорубицина и в полтора – чем МЛ-формы препарата,
вводимой без создания МП.
6.
Создана
фармакокинетическая
модель
изменения
концентрации
противоопухолевого препарата в крови и тканях организма при их
конъюгации с носителем. Данная модель позволяет осуществлять первичный
скрининг действующих веществ, потенциально пригодных для модификации
и дальнейшего использования в системах направленного транспорта. Кроме
того,
модель
дает
модифицированного
возможность
оптимизировать
противоопухолевого
средства
схему
при
назначения
его
курсовом
применении.
7. Созданная МЛ- форма доксорубицина и метод лечения опухолей на ее
основе с точки зрения фармакоэкономического моделирования перспективны
для внедрения в практику российского здравоохранения. Для обеспечения
конкурентных преимуществ препарата стоимость за 1 грамм с учетом НДС не
должна превышать1869 руб.
ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
ИССЛЕДОВАНИЯ
Устройство
для
ультрафильтрации,
созданное
нами,
может
использоваться для экспериментального синтеза небольших количеств
41
противоопухолевых препаратов. Кроме того, оно может применяться для
изучения их фармакокинетики в экспериментах на животных. Особенно это
актуально для определения концентрации ЛВ в тканях.
Отработанная методика получения липосом с включенным в них
лекарственным препаратом, может также использоваться для получения
других модифицированных лекарственных средств, что позволит расширить
показания к их применению. Так же мы полагаем, что это позволит увеличить
диапазон их терапевтической безопасности.
Наиболее перспективными в настоящем исследовании оказались
модификации
доксорубицина.
Получены
комбинации
препарата
с
полисахарами, ДНК и в виде липосом. С целью создания липосомального
доксорубицина для направленной доставки, были синтезированы липосомы с
ферромагнитными свойствами, которые обладают низкой токсичностью и
высокой
активностью
против
исследуемых
опухолей.
Изучена
фармакокинетика этих липосом.
Полученные данные позволяют предположить, что разработанные
композиции являются перспективными для дальнейшего клинического
изучения. Мы надеемся, что их внедрение в широкую практику позволит
повысить эффективность терапии онкологических заболеваний и снизить
вероятность развития побочных эффектов.
Фармакокинетическая модель, разработанная нами, может применяться
для научных исследований и клинической оптимизации проводимой терапии,
если речь идет о направленном транспорте ЛВ. Кроме того, представляется
целесообразным включение информации о направленном транспорте
химиопрепаратов,
о
том,
как
меняется
их
фармакокинетика
и
фармакодинамика, в курсы общей фармакологии, клинической фармакологии
и онкологии.
Кроме того, полученные в работе данные позволяют рассчитывать на то,
что по одному из направлений в фармакологии может быть реализована задача
импортозамещения, поставленная Президентом РФ. Однако при этом
42
необходима отработка промышленных условий производства липосом и их
постмаркентинговое исследование.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1.
Гуревич
К.Г.
Онкологическая
боль,
трехступенчатая
схема
противоболевой фармакотерапии и локальная температура / К.Г. Гуревич, А.Л.
Ураков, Л.В. Ловцова, Н.А. Пятаев, А.В. Заборовский // Анестезиология и
реаниматология. – 2016. – Т. 61. – № 5S. – С. 92.
2.
Заборовский А.В. Использование носителей лекарственных средств для
доставки противоопухолевых препаратов / А.В. Заборовский, Н.А. Пятаев,
Л.А. Тарарина, К.Г. Гуревич, И.В. Маев, И.С. Крысанов, Д.В. Юнина //
Молекулярная медицина. – 2017. – Т.15. – № 4. – С. 8-13.
3.
Заборовский
А.В.
Моделирование
направленного
транспорта
лекарственных веществ. Часть I. Однократное введение / А.В. Заборовский,
К.Г. Гуревич // Сибирский онкологический журнал. – 2017. – № 1 (16). – С. 5965.
4.
Заборовский
А.В.
Моделирование
направленного
транспорта
лекарственных веществ. Часть II. Многократное введение / А.В. Заборовский,
К.Г. Гуревич // Сибирский онкологический журнал. – 2017. – № 2 (16). – С. 3641.
5.
Заборовский А.В. Модифицированные способы доставки лекарственных
средств в современной онкологии / А.В. Заборовский, К.Г. Гуревич, Е.Г.
Лобанова, И.C. Крысанов, Л.А. Тарарина, Д.В. Юнина // Врач. – 2017. – N. 3.
– С. 30-32.
6.
Заборовский А.В. Направленная доставка доксорубицина с помощью
экзогенных
биосовместимых
нановекторов
при
экспериментальных
неоплазиях / А.В. Заборовский, А.В. Кокорев, Е.П. Бродовская, С.А. Фирстов,
О.В. Минаева, О.А. Куликов, Н.Н. Червякова, В.Ю. Медвежонков // Вестник
Мордовского университета. – 2017. – Т. 27. – № 1. – С. 93-107.
7.
Заборовский А.В. Разработка новых противоопухолевых препаратов на
основе полимерных наночастиц для терапии неоплазий / А.В. Заборовский,
43
Л.А. Тарарина, А.Г. Муляр, Н.А. Пятаев, К.Г. Гуревич // Системный анализ и
управление в биомедицинских системах. – 2016. – Т. 15. – № 3. – С. 401-403.
8.
Заборовский А.В. Современные противоопухолевые средства / А.В.
Заборовский, А.Г. Муляр, И.В. Маев, Л.А. Тарарина, Н.Г. Игнатов, К.Г.
Гуревич, Е.Г. Лобанова // Фарматека. – 2016. – № 20 (333). – С. 39-42.
9.
Заборовский
А.В.
Фармакокинетическая
оптимизация
терапии
разработанным новым отечественным противоопухолевым препаратом / А.В.
Заборовский, К.Г. Гуревич, С.А. Фирстов, Е.П. Бродовская, Н.Н. Червякова,
Н.Г. Игнатов, Н.А. Пятаев // Вопросы обеспечения качества лекарственных
средств. – 2017. – N. 1(15). – С. 4-10.
10.
Зырняева Н.Н. Сравнительная эффективность некоторых методов
таргетной химиотерапии при экспериментальной карциноме / Н.Н. Зырняева,
О.В. Минаева, Е.П. Бродовская, Г.С. Столяров, С.А. Фирстов, А.В.
Заборовский, Е.Э. Шемсутдинова // Современные проблемы науки и
образования. – 2015. – № 6-0. – С. 76.
11.
Крысанов И.С. Использование фармакоэкономического моделирования
при экономической оценке новых лекарственных препаратов / И.С. Крысанов,
В.Ю. Ермакова, А.В. Заборовский, К.Г. Гуревич // Кубанский научный
медицинский вестник. – 2017. – N 1(162). – С. 78-83.
12.
Куликов О.А. Разработка наносомальной формы апротинина / О.А.
Куликов, Н.А. Пятаев, А.В. Заборовский, И.В. Маев, В.П. Агеев, Е.Э.
Марочкина, И.С. Долгачёва, И.С. Авдюшкина, А.В. Кокорев, К.Г. Гуревич,
Л.А. Тарарина, Д.В. Юнина // Бюллетень экспериментальной биологии и
медицины. – 2017. – Т. 163. – № 6. – С. 707-709.
13.
Куликов О.А. Сравнительный анализ эффективности дексаметазона,
гидроксиэтилкрахмала и гипертонического раствора хлорида натрия при
остром респираторном дистресс-синдроме в эксперименте / О.А. Куликов,
Н.А. Пятаев, В.И. Инчина, К.Г. Гуревич, А.В. Заборовский, О.В. Минаева, А.В.
Кокорев // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2015. – Т. 78. –
№ 10. – С. 7-11.
44
14.
Патент 154660 U1 РФ, МПК B01D 61/14, B01D 63/16, B01D 61/18.
Устройство для ультрафильтрации жидкостей / Н. А. Пятаев, О. В. Минаева,
П. С. Петров, А. В. Кокорев, К. Г. Гуревич, А. В. Заборовский;
патентообладатель ФГБОУ ВО «МГУ им. Н.П. Огарева». –№ 2014147713;
заявл. 26.11.2014, опубл. 27.08.2015. Бюл. 24.
15.
Патент 2629608 С1 РФ, МПК А61К 31/704, А61К 9/10, А61Р 35/00.
Противоопухолевый химиопрепарат / Н.А. Пятаев, А.В. Заборовский, К.Г.
Гуревич и др.; патентообладатель ФГБОУ ВО «МГУ им. Н.П. Огарева». –
№2016119268; заявл. 18.05.2016; опубл. 30.08.2017, Бюл №25.
16.
Пятаев Н.А. Липосомы в современной противоопухолевой терапии /
Н.А. Пятаев, О.В. Минаева, А.В. Кокорев, А.В. Заборовский, К.Г. Гуревич //
Системный анализ и управление в биомедицинских системах. – 2017. – Т. 16.
– № 1. – С. 8-14.
17.
Пятаев
Н.А.
Оптимизация
получения
модифицированных
противоопухолевых препаратов для направленного транспорта методом
ультрафильтрации / Н.А. Пятаев, А.В. Заборовский, К.Г. Гуревич, П.С. Петров,
А.В. Кокорев, С.А. Фирстов, Е.П. Бродовская, Л.А. Тарарина, Д.В. Юнина //
Вестник новых медицинских технологий. – 2017. – Т. 24. – № 1. – С. 152-157.
18.
Пятаев
ормустина
Н.А.
в
Разработка
биологических
метода
средах
количественного
с
помощью
определения
ВЭЖХ
с
масс-
спектрометрическим детектированием / Н.А. Пятаев, П.С. Петров, А.А.
Буртасов, О.В. Минаева, О.А. Куликов, К.Г. Гуревич, А.В. Заборовский, В.П.
Краснов, А.В. Кокорев, Г.С. Столяров, Н.Н. Зырняева // Химикофармацевтический журнал. – 2015. – Т. 49. – № 12. – С. 42-46.
19.
Пятаев
Н.А.
Эффективность
ДНК-конъюгированных
форм
доксорубицина и цисплатина при холангиоцеллюлярной карциноме у крыс /
Н.А. Пятаев, О.В. Минаева, Н.Н. Зырняева, А.В. Кокорев, К.Г. Гуревич, А.В.
Заборовский, С.А. Щукин // Фундаментальные исследования. – 2014. – № 105. – С. 959-963.
45
20.
Пятаев Н.А. Эффективность комбинации свободной и полимер-
связанной форм проспидина с доксорубицином у крыс с асцитной гепатомой
Зайдела/ Н.А. Пятаев, К.Г. Гуревич, А.В. Заборовский, А.В. Кокорев, О.В.
Минаева, Н.А. Зырняева, А.А. Кладиев, П.П. Бычковский, М.Ю. Ревтович //
Химико-фармацевтический журнал. – 2014. – Т. 48. – № 11. – С. 18-22.
21.
Свидетельство о госрегистрации программы для ЭВМ № 2017616379
РФ. Расчет фармакокинетики препарата при его направленном введении / А.В.
Заборовский,
М.В.
Бирюков,
К.Г.
Гуревич;
правообладатели
А.В.
Заборовский, М.В. Бирюков, К.Г. Гуревич. – №2017616379; заявл. 11.04.2017;
зарег. 06.06.2017 г.
22.
Pyataev N.A. Efficiency of combining free and polymer-immobilized
prospidin with doxorubicin for treatment of Zajdel ascites hepatoma in rats / N.A.
Pyataev, A.V. Kokorev, O.V. Minaeva, N.N. Zyrnyaeva, K.G. Gurevich, A.V.
Zaborovskii, A.A. Kladiev, P.P. Bychkovskii, M.Y. Revtovich // Pharmaceutical
Chemistry Journal. – 2015. – Т. 48. – № 11. – С. 714-717.
23.
Pyataev N.A. Method development for quantitative determination of
Ormustine in biological fluids by high performance liquid chromatography with
mass-spectrometric detection / N.A. Pyataev, P.S. Petrov, A.A. Burtasov, O.V.
Minaeva, O.A. Kulikov, A.V. Kokorev, G.S. Stolyarov, N.N. Zyrnyaeva, K.G.
Gurevich, A.V. Zaborovskii, V.P. Krasnov // Pharmaceutical Chemistry Journal. –
2016. – Т. 49. – № 12. – С. 838-842.
46
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
AUC – area under curve – площадь под фармакокинетической кривой
Сmax – пиковая концентрация
EPR-эффект – эффект повышенной проницаемости и ретенции
FDA – food and drug administration
IARC – международное агентство по изучению рака
ICER – инкрементальный коэффициент «затраты-эффективность»
LLC – lung Lewis carcinoma - карцинома легкого Льюис
LYG – life years gained
TGII – tumor grown inhibition index – индекс торможения роста опухоли
TWI – tumor weight index – индекс массы опухоли
АГЗ – асцитная гепатома Зайдела
ВВП – валовый внутренний продукт
ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота
ЖНВЛП – жизненно необходимые и важнейшие лекарственные препараты
НДС – налог на добавочную стоимость
ИТРО – индекс торможения роста опухоли
ЛВ – лекарственное вещество
ЛП – лекарственный препарат
МЛ – магнитные липосомы
МП – магнитное поле
МПД – максимально переносимая доза
ПГП – порог готовности платить
ПЛД – пегилированный липосомальный доксорубицин
РМЖ – рак молочной железы
ССО – сердечно-сосудистые осложнения
ФД – фосфат декстрана
ЭВМ – электронно-вычислительная машина
ЭДТА - этилендиаминтератацетат
47
Подписано в печать: 21.06.2018
Тираж: 100 экз. Заказ №179
Отпечатано в РИО МГМСУ
127473, г. Москва, ул. Делегатская, д. 20, стр. 1.
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа