close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Регуляторный потенциал эмбриональных стадий развития актинии Nematostella vectensis выявленный в экспериментах по диссоциации-реагрегации клеток

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Кириллова Анастасия Олеговна
РЕГУЛЯТОРНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТАДИЙ
РАЗВИТИЯ АКТИНИИ NEMATOSTELLA VECTENSIS, ВЫЯВЛЕННЫЙ В
ЭКСПЕРИМЕНТАХ ПО ДИССОЦИАЦИИ-РЕАГРЕГАЦИИ КЛЕТОК
Специальность 03.03.05 – биология развития, эмбриология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва 2018
Работа выполнена на кафедре биологической эволюции биологического
факультета Федерального государственного бюджетного образовательного
учреждения высшего образования «Московский государственный университет
имени М.В.Ломоносова» и в лаборатории молекулярной эволюции и развития
университета Вены (Австрия)
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор
ЧЕРДАНЦЕВ Владимир Георгиевич
Федеральное государственное бюджетное
образовательное
учреждение
высшего
образования «Московский государственный
университет имени М.В.Ломоносова»
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор
ИСАЕВА Валерия Васильевна
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт проблем экологии
и эволюции имени А.Н. Северцова Российской
академии наук, ведущий научный сотрудник
доктор биологических наук, доцент
ЕРЕСКОВСКИЙ Александр Вадимович
Федеральное государственное бюджетное
образовательное учреждение высшего
образования «Санкт-Петербургский
государственный университет», профессор
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт биоорганической
химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.
Овчинникова Российской академии наук
Защита диссертации состоится «06» июня 2018 г. в 15.30 часов на заседании
диссертационного совета Д 002.238.02 при Федеральном государственном
бюджетном учреждении науки Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова
РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26.
Сайт: http://idbras.comcor.ru/; e-mail: idbras@bk.ru
С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте
Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.
Автореферат разослан «___» апреля 2018 года.
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат медицинских наук
А.В. Кузнецова
avkuzn@idbras.ru
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Вопрос о реализации спектра проспективных потенций
эмбриональными клетками является одним из фундаментальных в биологии
развития.
Изучение этой проблемы позволяет лучше понять общие
закономерности эмбриогенеза, а также выявить “скрытые” механимы
регуляции развития.
Метод диссоциации-реагрегации [Wilson, 1907; 1911] позволяет оценить
регуляторный потенциал эмбрионов в условиях, когда первичный план
строения полностью разрушен и формируется заново. Особый интерес
представляет вопрос о том, сохраняют ли отдельные клетки информацию о
своём изначальном положении в организме или они способны изменить свою
судьбу под действием регионов-организаторов.
Nematostella vectensis - представитель типа книдарий, сестринской группы
билатерально симметричных животных. Этот вид является модельным
объектом биологии развития. N. vectensis легко культивируется в лаборатории
[Fritzenwanker, Technau, 2002], её геном полностью отсеквенирован,
многочисленные работы посвящены молекулярным и морфогенетическим
аспектам её развития [Finnerty et al.2004; Fritzenwanker et al. 2004; Extavour et al.
2005; Kusserow et al. 2005; Torras, Gonzales-Crespo, 2005; Kraus, Technau, 2006;
Saina et al., Layden et al.2016]. Несмотря на то, что для эмбрионов Nematostella
была выявлена высокая способность к регуляции развития [Fritzenwanker et al.,
2002], спектр проспективных потенций отдельных клеток эмбрионов все еще
остается неисследованным.
Исследование регуляторного потенциала на модельном виде книдарий
имеет большой интерес для эволюционной биологии развития, так как
позволяет глубже понять механизмы регуляции развития низших
многоклеточных животных, а также способен пролить свет на раннюю
эволюцию эмбрионального развития.
Степень разработанности темы. Восстановление организма из
диссоциированных клеток является довольно редким явлением, описанным
только для нескольких групп животных: губок, книдарий, иглокожих и
хвостатых амфибий [Wilson, 1907; Wilson, 1911; Dan-Sohkawa et al., 1986;
Nieuwkoop, 1992]. Кроме того, работы, посвященные этому процессу, касаются
только морфологических аспектов, и молекулярные механизмы этого явления
остаются не изученными. Нормальный эмбриогенез Nematostella vectensis
довольно подробно описан, тем не менее, регуляционный потенций
эмбриональных клеток данного вида не был изучен.
3
Цель и задачи исследования.
Цель диссертационной работы - охарактеризовать регуляторный потенциал
эмбриональных клеток актинии Nematostella vectensis с помощью
экспериментов по диссоциации-реагрегации.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие
задачи:
1. Изучить морфогенетические процессы, обеспечивающие регуляцию
развития агрегированных эмбриональных клеток N. vectensis;
2. Сравнить развитие агрегатов N. vectensis с нормальным развитием этого
вида и с развитием других представителей типа стрекающих;
3. Выявить молекулярные механизмы формирования полярности в агрегатах;
4. Изучить проспективные потенции разных регионов эмбриона,
расположенных вдоль орально-аборальной оси тела в экспериментах по
диссоциации-реагрегации;
5. Изучить проспективные потенции клеток двух зародышевых листков в
экспериментах по диссоциации-реагрегации;
Научная новизна полученных результатов. В результате проделанной
работы была впервые показана способность агрегированных эмбриональных
клеток N. vectensis к восстановлению первичного плана строения и
формированию зародышевых листков. С помощью методов иммуноцитохими,
конфокальной микроскопии, сканирующей электронной микроскопии и
цейтраферной съемки было подробно изучено развитие агрегатов на
молекулярном, клеточном и тканевом уровнях. Были выявлены морфогенезы и
основные сигнальные пути, вовлеченные в формирование орально-аборальной
полярности de novo. Благодаря использованию трансгенных линий, в
развивающемся агрегате удалось проследить за судьбой эндодермальных
клеток, а также впервые на молекулярном уровне показать способность
эктодермальных клеток к трансдифференцировке в клетки эндодермы. Был
проведён сравнительный анализ развития агрегатов N. vectensis и нормального
эмбриогенеза этого вида и других представителей книдарий.
Теоретическое и практическое значение. Агрегаты N. vectensis являются
удобной моделью для изучения регуляторного потенциала эмбриональных
клеток. В ходе диссоциации эмбрионов разметка тела полностью
''сбрасывается'' и ее формирование начинается de novo. Это позволяет в полной
мере описать спектр проспективных потенций клеток эмбрионов. Исследование
4
альтернативных морфогенезов, вовлеченных в развитие агрегатов, и сравнение
их с нормальным развитием этого и других видов книдарий, помогает лучше
понять эволюцию эмбрионального развития многоклеточных животных.
Предложенная модель агрегированных эмбриональных клеток N. vectensis
может быть в дальнейшем использована для исследования спектра
проспективных
потенций
эмбриональных
клеток.
Полученные
в
диссертационной работе результаты могут быть использованы в рамках лекций
по эмбриологии в высших учебных заведениях.
Личный вклад автора. Личный вклад автора состоял в анализе
литературных данных, планировании и выполнении экспериментов, анализе и
интерпретации полученных результатов, подготовке данных для публикаций и
представлении результатов исследований на международных конференциях
соответствующей тематики. Основные результаты работы получены лично
автором. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность
полученных данных обеспечивается корректным использованием современных
методов исследования. Особи Nematostella vectensis содержались в
оптимальных условиях на всех стадиях онтогенеза. При фиксации и подготовке
образцов для исследования методами иммуноцитохими, конфокальной и
электронной микроскопии были использованы корректные протоколы. Все
эксперименты были проведены в достаточном количестве повторностей.
Полученные фото- и видеоизображения подвергались лишь незначительной
корректеровке, затрагивающей все пикселы изображения.
Результаты проделанной работы были представлены автором форме
устных (4) и стендовых (4) докладов в ряде международных конференций: 1)
Международная конференция The fourth meeting of the European Society for
Evolutionary Developmental Biology (EED) (Лиссабон, Португалия 2012); 2)
Международная научная школа Summer School in Evolutionary Developmental
Biology. Conceptual and Methodological Foundations, 3rd Edition. From Gene
Networks to Organismal Systems (Венеция, Италия, 2013); 3) Международная
конференция The fifth meeting of the European Society for Evolutionary
Developmental Biology (Вена, Австрия, 2014); 4) Международная научная школа
OIST Winter Course "Evolution of Complex Systems" (Онна-Сон, Окинава,
Япония, 2014); 5) Международная научная школа EMBO Practical Course: Multilevel Modelling of Morphogenesis (Норидж, Великобритания, 2015); 6).
Международная научная школа 3D developmental imaging (Оэйраш,
Португалия, 2016); 7) Международная конференция The sixth meeting of the
5
European Society for Evolutionary Developmental Biology (EED) (Уппсала,
Швеция. 2016); 8) Международная научная школа International Workshop. The
diversification of early emerging Metazoans: a window into animal evolution?
(Тутцинг, Германия 2017)
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных
работ, из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК 1, статей в
иностранных рецензируемых журналах 1, тезисов докладов и материалов
конференций 3.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на
116 страницах, содержит 17 рисунков, 2 таблицы и состоит из следующих
разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты,
обсуждение, выводы и список литературы. Библиография включает 160
источников.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объект исследования. Объектом исследования были полученные в
лабораторных условиях эмбрионы актинии Nematostella vectensis (Cnidaria,
Anthozoa)
Культивирование, индукция гаметогенеза и эксперименты по
диссоциации эмбрионов и последующей̆ агрегации их клеток.
Культивирование животных и индукция гаметогенеза были осуществлены
согласно стандартной для этого вида методике [Fritzenwanker и Technau, 2002;
Genikhovich и Technau, 2009a]. Диссоциация эмбрионов на клетки
производилась в морской воде, лишённой ионов магния и кальция, согласно
протоколу Фримана [Freeman, 1981]. В данных экспериментах использовались
зародыши на стадии гаструлы (22 часов после оплодотворения). Совместной
диссоциации подвергались группы эмбрионов количеством 100-200 штук. Для
облегчения процесса диссоциации эмбрионы пипетировались при помощи
автоматической пипетки на 200 мкл. Для агрегации клетки помещались на дно
пробирок Eppendorf объемом 1,5 мл, пробирки заливались морской водой и
центрифугировались 30 минут со скорость 800 оборотов в минуту (что
соответствует относительной силе центрифугирования 730rcf) на центрифуге
Eppendorf Minispin. Полученные агрегаты помещались в чашки Петри и
развивались в инкубаторе при 21oС в морской воде с солёностью 12 ‰.
6
Микрохирургические манипуляции с эмбрионами
Для получения оральных и аборальных половинок эмбрионы на стадии 22
чпо разрезались пополам с помощью микрохирургического ножа (MicroFeather,
угол лезвия 30o или 45o), и отдельно подвергались диссоциации.
Для получения эктодермальных и эндодермальных агрегатов, эмбрионы на
стадии 22 чпо эндодерма отделялась от эктодермы с помощью
микрохирургического ножа.
В экспериментах с мечением отдельных
областей эмбрионов
использовалась трансгенная линия EF1α::lifeact-mOrange2 (EF1α – мембранный
белок), полученной Е. А. Пухляковой в лаборатории молекулярной эволюции и
развития университета Вены. У животных этой линии цитоплазматические
мембраны флюоресцируют (длина волны = 562нм) при облучении светом с
длиной волны 548нм.
В первом эксперименте совместно диссоциировали аборальные половины
гаструл линии EF1α::lifeact-mOrange2 и оральные половины гаструл дикого
типа. Далее совместной диссоциации и последующей реагрегации подверглись
эндодермальные клетки линии EF1α::lifeact-mOrange2 и эктодермальные клетки
гаструл дикого типа.
Для исследования судьбы эндодермальых клеток в агрегатах была
использована трансгенная линия SnailA::mCherry(SnailA-/-). Данная линия была
создана А. Демили в лаборатории молекулярной эволюции и развития
университета Вены. Транскрипционный фактор snailA экспрессируется только
в эндодерме [Martindale et al., 2004], что делает его очень удобным маркером
этого зародышего листка.
Все эксперименты проводили с использованием флюоресцентного
стереомикроскопа Nikon SMZ745 в трех повторностях. Полученные агрегаты
культивировали в 24-луночных планшетах Costar, по одному в лунке, и
фотографировали каждый день до достижения стадии первичных полипов с
использованием микроскопа Nikon TS 100.
Цейтраферная съёмка живых агрегатов
Для цейтраферной съемки были использованы гаструлы трансгенной
линии EF1α::lifeact-mOrange2. После диссоциации на клетки, полученные
агрегаты были помещены в пробирки, заполненные 1% раствором агарозы,
приготовленном на морской воде. Агрегаты, окруженные агаром, помещались в
центр чашки Петри и заливались еще одним слоем агара, и по затвердению
последнего - морской водой. Съемка объектов велась на конфокальном
микроскопе Leica TCS SP5 DM-6000 CS (CLSM 2) в течение 24 часов.
7
Конфокальная микроскопия
Для описания морфологии агрегатов и составляющих их клеток были
использованы фаллоидин Alexa Fluor® 488 (окраска F-актина) и
флуоресцентный краситель 4′,6- диамидино-2-фенилиндол (DAPI, Sigma,
D8417), связывающийся с АТ регионом ДНК. Для исследования локализации
кадгерина-3 были использованы антитела, разработанные Е.А. Пухляковой в
лаборатории молекулярной эволюции и развития университета Вены. Фиксация
и подготовка образцов проводилась согласно стандартному протоколу
[Genikhovich G. и Technau U. 2009]. Все изображения были получены на
конфокальном микроскопе Leica TCS SP5 DM-6000 CS (CLSM 2)
In situ гибридизация
Для исследования в агрегатах паттернов экспрессии генов, вовлеченных в
регуляцию раннего развития Nematostella, был использован метод in situ
гибридизации, следуя протоколу [Genikhovich и Technau 2009]. Во всех
исследованиях была использована РНК-проба с дигоксигениновой меткой.
Также была проведена двойная in situ гибридизация для выявления зон
экспрессии генов fgfa1 (РНК-проба с дигоксигениновой меткой) и bra (РНКпроба с флуоресцеин – изо-тиоцианатной меткой) для агрегатов на пятые сутки
развития. Пробы были синтезированы с кДНК полной длины в лаборатории
молекулярной
эволюции
и
развития
университета
Вены
(http://cnidbase.org/index.cgi).
Эксперименты с использованием морфантов
В первом эксперименте для исследования роли гена brachyury (bra) в
развитии агрегатов был проведен его нокдаун при помощи морфолино (ATGморфолино и сплайсинг-морфолино). Иньекции морфолино были проведены Г.
Е. Гениховичем в лаборатории молекулярной эволюции и развития
университета Вены.
Во втором эксперименте был произведен нокдаун гена кадгенирина -3 при
помощи ATG морфолино. Иньекции морфолино были проведены Е. А.
Пухляковой в лаборатории молекулярной эволюции и развития университета
Вены.
В качестве контроля в обоих экспериментах было использовано морфолино
к mef2, инъекция которых не вызывает изменений в развитии и фенотипе
зародышей. Все инъекции были произведены в оплодотворенные ооциты с
использованием микроскопа Nikon TS 100 и инъекционной установки Narishige.
Методы световой и электронной микроскопии
Для проведения электронной микроскопии агрегаты и эмбрионы были
8
зафиксированы и обработаны согласно разработанной методике как в статье
Фритценванкера и соавторов [Fritzenwanker 2007]. Полученные образцаы
изучались на сканирующих электронных микроскопах CamScan или JSM6380LA (JEOL) и на трансмиссионном микроскопе JEM-1011 (JEOL),
оснащенном цифровой камерой Gatan ES500W в общефакультетской
лаборатории
электронной
микроскопии
биологического
факультета
Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения
высшего образования «Московский государственный университет имени
М.В.Ломоносова».
Цифровые изображения всех препаратов обрабатывали в программах Adobe
Photoshop, Adobe Illustrator, Helicon Focus 3.2 и Image J.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Морфологическое развитие агрегатов N. vectensis
В ходе работы была разработана методика диссоциации эмбрионов
Nematostella vectensis в воде, лишенной ионов кальция и магния. В данных
исследованиях были использованы эмбрионы на стадии гаструлы, так как на
этой стадии можно четко дифференцировать оральный и аборальный полюс
эмбриона, а так же легко идентифицируются два зародышевых листка – экто –
и эндодерма (рис. 1Б, В). Сразу после реагрегации (30 мин пд) агрегаты были
неправильной формы и не имели каких – либо признаков орально-аборальной
полярности и разделения на зародышевые листки (рис. 1Е, Ж). Разделение
клеток агрегата на экто- и эндодерму начиналось через 6 чпд и заканчиволось к
24 чпд. Вначале формировался эктодермальный слой, в то время как
внутренний слой клеток оставался неупорядоченным (рис. 1Г, Д). К 24 чпд
гаструляция завершилась (рис. 1Е, Ж), и формировалось одно или несколько
ротовых отверстий (рис. 1И). Через 2 дпд агрегаты приобретали способность
активно плавать и напоминали по морфологии нормальную планулу (рис. 1К).
Глотка формировались в течение следующих двух дней (рис. 1Л, М), через 6
дпд формировался гипостом (рис. 1Н), а через 7-10 дней агрегаты достигали
стадии первичного полипа (рис. 1П). В зависимости от размера исходного
агрегата первичный полип мог иметь одну или несколько орально-аборальных
осей тела (рис. 1Т). В отличие от развития агрегатов, полученных из клеток
взрослой гидры [Technau et. al., 2000], ротовые отверстия у агрегатов в данных
экспериментах могли располагаться близко друг другу и даже соприкасаться
(рис. 1Х, Ц), что указывает на то, что латеральное ингибирование не играет
значимой роли в регуляции развития N. vectensis.
9
Рис1. Развитие агрегатов. А – схематическое изображение
экспериментов; Б–П – последовательные стадии развития агрегатов,
проанализированные с помощью конфокальной и электронной
микроскопии; Р - двойная ISH для орального маркера foxA (красный) и
аборального маркера fgfa1 (синий); С - первичный полип с одной
орально-аборальной осью; Т - первичный полип с множеством оральноаборальных осей; У–Х – разнообразие морфологии оральных полюсов
первичных полипов, полученных из агрегатов. Масштабный отрезок 100
μm.
2. Сравнительный анализ развития агрегатов N. vectensis.
В ходе экспериментов было показано, что агрегаты Nematostella
достигают дефинитивной стадии первичного полипа. Тем не менее, в ходе
развития не формируется характерная для этого вида инвагинационная
гаструла. Отсутствие у агрегатов Nematostella инвагинационных морфогенезов
вполне ожидаемо, так как в нормальном эмбриогенезе данного вида стадии
инвагинации предшествует стадия однослойной сферической бластулы.
10
Напротив, ранние агрегаты представляют собой плотные структуры
неправильной формы без полости и больше всего напоминают морулу.
Вследствие этого инвагинация становится физически невозможной для
агрегатов, и они используют в своем развитии альтернативные морфогенезы
(морульную деламинацию и мультиполярную иммиграцию) для достижения
сегрегации на два зародышевых листка.
Большой интерес представляет то, что развитие агрегатов Nematostella
морфологически очень сходно с нормальным развитием Dynamena pumila,
представителя класса Hydrozoa (рис. 2). Таким образом, в развитие агрегатов
Nematostella включается альтернативный способ гаструляции, аналогичный
представителям типа с неупорядоченным дроблением.
Рис 2. Сравнение развития агрегатов Nematostella vectensis и
нормального развития эмбрионов Dynamena pumila. А, В –
поверхность и конфокальный оптический срез агрегата Nematostella на
стадии 6 чпд; В, Г – поверхность и конфокальный оптический срез
гаструлы Dynamena (Cnidaria, Hydrozoa).
3. Молекулярные механизмы формирования полярности агрегатов.
В ходе работы на агрегатах было произведен анализ динамики экспрессии
генов, маркирующих орально-аборальную полярность у эмбрионов в
нормальном развитии. В качестве маркеров орального полюса эмбриона были
выбраны foxA, wnt1, wnt3, wnt4 и bra, в качестве маркера аборального полюса –
fgfA1, и wnt2 как маркер средней части эмбриона. Было выявлено, что сразу
после реагрегации клетки, экспрессирующие выбранные маркеры, разбросаны
случайным образом по всему агрегату (рис. 3А–Ж). Через 24 чпд оральноаборальная полярность восстанавливалась: паттерны экспрессии foxA, bra, wnt1,
wnt2, wnt3 и wnt4 были представлены в виде колец на одном из полюсов
агрегата (рис. 3И–П), а fgfA1 - точечно на противоположном полюсе (рис. 3Р).
Через 48 чпд паттерн экспрессии wnt2 сдвинулся на середину агрегата (рис.
3Ц). В то время как небольшие агрегаты имели всего одну орально-аборальную
ось (рис. 3Щ–В’), большие агрегаты очень часто состояли из нескольких
11
модулей, и каждый модуль независимо формировал орально-аборальную ось
тела (рис. 3Г’– Л’).
Рис. 3. Динамика экспресси генов во время восстановления оральноаборальной полярности агрегатов. foxA и bra, wnt1, wnt3 и wnt4 маркеры орального полюса, fgfA1 – аборального полюса, и wnt2 средней части эмбриона; А–Ж – агрегаты 30 мин пд; И–Р – агрегаты 1
дпд; С–Ш – агрегаты 2 дпд; Щ–В’ – агрегаты 3 дпд с одной оральноаборальной осью тела; Г'–Л' – агрегаты 3 дпд с несколькими оральноаборальными осями тела. Метод ISH. Масштабный отрезок 100 µm.
Также было выявлено, что одну из ключевых ролей в формировании
орально-аборальной полярности de novo играет ген bra. Эксперименты по
нокдауну этого гена показали, что агрегаты, полученные из клеток таких
эмбрионов, не были способны восстанавливать первичную полярность,
формировали только реснитчатый шар (рис 4А) и погибали на 6 дпд. Кроме
того, у таких агрегатов нарушалось формирование орально-аборальной оси тела
из-за гипертрофии развития аборальных производных. Исследование
экспрессии brachyury и маркера аборального полюса тела fgfA1 показало, что у
12
таких агрегатов, почти полностью исчезала экспрессия bra (рис. 4Б), и
появлялась эктопическая экспрессия fgfA1 по всему периметру агрегата (рис
4В). Сходным образом в развитии гидры большую роль в формировании
полярности играет hybra1. Этот ген детерминируют место формирования
гипостома еще до появления каких-либо морфологических признаков орального
конуса во время эмбрионального развития, во время почкования и регенерации
головы [Technau Bode 1999; Technau 2001].
Рис. 4. Развитие агрегатов, полученных из эмбрионов с нокдауном
гена bra. А - шарообразный агрегат на 6дпд; Б - отсутствие экспрессии
гена bra; В - оверэкспрессия fgfa1. Масштабный отрезок 100 µm.
4. Проспективные потенции разных регионов эмбриона.
Для оценки спектра проспективных потенций регионов эмбриона вдоль
орально-аборальной оси тела, были получены агрегаты, состоящие только из
клеток оральных или аборальных половинок гаструлы. Агрегаты, полученные
из клеток оральных половинок гаструл, были способны к развитию и
формировали первичных полипов (рис. 5А). Напротив, агрегаты, полученные
из клеток аборальных половинок, не имели такой способности и формировали
только шарообразные структуры (рис. 5Б).
Тем не менее, при смешивании светящихся клеток, полученных из
аборальных половинок гаструл трансгенной линии Ef1α::lifeact-Orange2, и
клеток из оральных половинок эмбрионов дикого типа, светящиеся клетки
принимали участие в формировании оральных структур первичного полипа
(рис. 5В). Таким образом, было показано, что клетки из аборальной части
эмбриона способны менять свою судьбу в присутствии клеток регионаорганизатора из аборальных половинок.
Для исследования поведения клеток эндодермального происхождения в
агрегатах светящиеся клетки эндодермы, полученные из гаструл линии
13
Ef1α::lifeact-Orange2, были совместно диссоциированы с эктодермальными
клетками эмбрионов дикого типа. Несмотря на то, что сразу после реагрегации
эндодермальные клетки были разбросаны случайным образом по поверхности
агрегата, через 24 чпд все эндодермальные светящиеся клетки локализовались
исключительно внутри агрегата и занимали большую часть внутреннего слоя.
Е. А. Пухлякова и Г. Е. Генихович показали с помощью цейтраферной съемки,
что клетки эндодермального происхождения активно мигрируют внутрь в
течение первых суток развития агрегата [Kirillova et. al. 2018]. Через 8 дпд из
таких агрегатов формировались первичные полипы со светящимися клетками,
находившимися исключительно в эндодерме (рис. 5Г). Эти данные указывают
на то, что клетки эндодермы “помнят” свое исходное положение в эмбрионе и
способны к сортировке.
Далее было проведено исследование потенций к развитию двух
зародышевых листков. Для этого были получены агрегаты, состоящие только
из клеток эндо- или эктодермы. В то время как агрегаты, состоящие только из
эндодермальных клеток, не были способны к развитию и распадались на
отдельные клетки, агрегаты, полученные из клеток презумптивной эктодермы,
формировали двуслойных первичных полипов (рис. 5Д). Таким образом, было
показано, что спектр проспективных потенций эктодермальных клеток
значительно шире, чем эндодермальных. В агрегатах, состоящих из клеток
эктодермы,
происходит
компенсация
отсутствия
эндодермы,
т.е.
эктодермальные клетки способны к трансдифференцировке.
Для
определения
точного
времени
трансдифференцировки
эктодермальных клеток была использована трансгенная линия SnailA::mCherry.
Сразу после реагрегации и образования агрегатов из эктодермальных клеток
светящиеся клетки не были обнаружены (рис. 5Л), в отличие от контроля, в
котором эктодермальные и светящиеся эндодермальные клетки были
перемешаны (рис. 5Р). Первая транскрипция snailA в «эктодермальных»
агрегатах появилась только через 14 чпд: в агрегатах можно было заметить
несколько маленьких независимых кластеров светящихся клеток (рис. 5М).
Через 48 чпд в «эктодермальных» агрегатах, клетки, транскрибирующие snailA,
занимали большую часть внутреннего слоя агрегата (рис. 5Н). Через 10 - 17
дней из таких агрегатов формировались первичные полипы с хорошо
сформированной эндодермой.
14
рис 5. Исследование проспективных потенций клеток в
экспериментах Nematostella по диссоциации-реагрегации. А –
агрегаты, полученные из оральных половинок гаструл, формируют
первичный полип; Б – агрегаты, полученные из аборальных половинок
гаструл, не восстанавливают план строения; В – клетки из аборальных
половинок гаструл принимают усатие в формировании оральных
структур первичного полипа при совместной диссоциации их с
клетками аобрального происхождения; Г– клетки эндодермы занимают
внутреннее положение в агрегатах; Д – агрегаты, полученные из
клеток эктодермы, способны формировать первичный полип. Е–И –
Иотсутствие экспрессии гена snailA в эктодермальных фрагментах и
“эктодермальных” агрегатах сразу после центрифугирования
15
подтверждает отсутствие контаминации эндодермальными клетками в
ходе эксперимента. Метод ISH. К–Н – развитие агрегатов, полученных
из ткани эктодермы эмбрионов линии SnailA::mCherry(SnailA-/-). Мпервая транскрипция snailA в «эктодермальных» агрегатах через 14
чпд, что свидетельствует о появлении эндодермальных клеток в
составе агрегата. П–Т – развитие контрольных агрегатов линии
SnailA::mCherry(SnailA-/-). Масштабный отрезок 100 µm.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В ходе данной работы, было показано, что эмбриональные клетки
Nematostella обладают высокой степенью пластичности. Агрегированные
клетки, полученные при диссоциации гаструл данного вида, способны достичь
дефинитивной стадии, регулируя свое развитие из почти гомогенных условий.
В данной работе был описан процесс регуляции развития клеточных агрегатах
на молекулярном, клеточном и тканевом уровнях. Это позволило лучше понять
механизмы работы такого мало изученного феномена, как регенерация целого
организма из диссоциированных клеток.
Первичная полярность в агрегате восстанавливается благодаря сигналам
клеток оральной эктодермы, в состав которой входят клетки регионаорганизатора. Было продемонстрировано, что одну из ключевых ролей в
восстановлении орально-аборальной оси тела у агрегатов играет ген brachyury.
Тем не менее, этот ген, скорее всего, является лишь одним из компонентов
сложно устроенной генетической регуляционной сети. Данные по изучению
деятельность региона-организатора указывают на то, что его работу
обеспечивает Wnt сигнальный путь [Kraus et.al 2016]. В настоящее время
взаимоотношения между этим генетическим каскадом и другими генами,
ассоциированными с область региона - организаторами Nematostella не ясны.
Мы полагаем, что дальнейшие функциональные эксперименты по изучению
молекулярных механизмов восстановления плана строения в экспериментах по
диссоциации – реагрегации помогут пролить свет на проблему формирования
полярности у низших многоклеточных животных, а также прояснить эволюцию
механизмов регуляции развития и происхождение регионов–организаторов.
В данной работе также было показано, что в клеточном агрегате N.
vectensis эндодермальные клетки не теряют свою идентичность внутреннего
зародышего листка, в то время как эктодермальные клетки способны
трансдифференцироваться при отсутствии в агрегате клеток эндодермы. Эта
способность эмбриональных клеток изменять свою судьбу в зависимости от
своего окружения является ярким примером пластичности развития.
16
К сожалению, область биологии развития, изучающая пластичность
развития все еще остается мало изученной. Очень часто пластичность развития
воспринимают как аберрацию эмбриогенеза, а не как тонкую работу организма,
позволяющую оптимизировать развитие в соответствии с внешними и
внутренними условиями. Мы считаем, что дальнейшее экспериментальное
изучение пластичности эмбрионального развития может внести большой вклад
в понимании механизмов онтогенеза. Этот феномен можно обнаружить на всех
уровнях организации животных, и он является неотъемлемым свойством
организма. “Развиваться – значит быть пластичным” [Moczek, 2015].
ВЫВОДЫ
1. Эмбриональные клетки диссоциированных эмбрионов Nematostella
vectensis способны успешно формировать клеточные агрегаты.
2. Агрегаты N. vectensis способны восстановить двусложное строение
(разделение на экто- и эндодерму). В отличие от нормального развития
этого вида, для которого основным гаструляционным морфогенезом
является инвагинация, у агрегатов сегрегация зародышевых листков
проходит за счет вторичной деламинации и мультиполярной иммиграции.
3. Разделение агрегатов N. vectensis на два зародышевых листка
морфогенетически сходно с нормальной гаструляцией представителей
класса Hydrozoa.
4. Агрегаты N. vectensis способны восстанавливать орально-аборальную
полярность на морфологическом и молекулярном уровнях с
формированием первичного полипа. Ген brachyury играет важную роль в
становлении орально-аборальной полярности de novo.
5. Проспективные потенции эмбриональных клеток N. vectensis
определяются их положением вдоль орально-аборальной оси тела.
Агрегаты, состоящие только из клеток оральной половины гаструлы,
способны к регуляции первичного плана строения. Напротив, клетки
аборального происхождения способны принимать участие в
формировании первичного полипа только в присутствии оральных клеток
в составе агрегата.
6. Эктодермальные эмбриональные клетки N. vectensis имеют широкий
спектр проспективных потенций и способны трансдифференцироваться в
клетки эндодермы. Клетки эндодермального происхождения N. vectensis
не имеют широкого спектр проспективных потенция. В присутствии
эктодермальных клеток они способны к сортировке - перемещению
внутрь агрегата и формированию внутреннего эпителиального слоя.
17
Список публикаций по теме диссертации
Статьи в журналах, соответствующих Перечню ВАК
1.
Кириллова А. О. Диссоциация – реагрегация клеток книдарий как
экспериментальная система для изучения регуляции развития Metazoa / А. О.
Кириллова, Ю. А. Краус, А. В. Марков // Журнал общей биологии. -2016. т. 77. -№ 6. - с. 442–455.
2.
Kirillova A. Germ layer commitment and axis formation in sea anemone
embryonic cell aggregates / A. Kirillova, G. Genikhovich, A. Demilly E.
Pukhlyakova, Y. Kraus, U. Technau // Proceedings of the National Academy of
Sciences. -2018. -V 115. -№ 8. - P. 1813–1818.
Статьи и тезисы в других изданиях
1.
Kozyreva A. Unexpected capacity for the primary body plan regeneration in
Nematostella vectensis embryos dissociated into single cells / A. Kozyreva, G.
Genikhovich, U. Technau // The fifth meeting of the European Society for
Evolutionary Developmental Biology (EED)- Vienna, 2014. - P. 233- 234.
2.
Pukhlyakova E. Role of a classical Cadherin in epithelialization and germ layer
formation of Nematostella vectensis / E. Pukhlyakova, A. Kirillova, Y. Kraus, U.
Technau // The sixth meeting of the European Society for Evolutionary
Developmental Biology (EED).- Uppsala, 2016.- P.330-331.
3.
Pukhlyakova E. Role of classical cadherins in morphogenesis of sea anemone
Nematostella vectensis / E. Pukhlyakova, A. Kirillova, Y. Kraus, U. Technau //
International Workshop. The diversification of early emerging Metazoans: a window
into animal evolution? –Tutzing, 2017. - P. 99.
Список сокращений
N. vectensis -– Nematostella vectensis
rcf – relative centrifuge force (относительное ускорение центрифуги)
аб – аборальный
дис–диссоциация
дпд – дней после диссоциации
мин. пд.– минут после диссоциации
ор – оральный
реаг – реагрегация
чпд – часов после диссоциации
18
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа