close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Создание и оценка исходного материала для селекции на гетерозис моркови столовой (Daucus carota L) с использованием методов биотехнологии

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Вюртц Татьяна Сергеевна
УДК 635.132:631.527.52:573.6
Создание и оценка исходного материала для селекции на
гетерозис моркови столовой (Daucus carota L.)
с использованием методов биотехнологии
Специальность: 06.01.05 – селекция и семеноводство
сельскохозяйственных растений
03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии).
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата сельскохозяйственных наук
Москва – 2018
2
Работа выполнена в лаборатории селекции и семеноводства столовых
корнеплодов и в лаборатории биотехнологии на базе ФГБНУ «Федеральный
научный центр овощеводства» 2014-2017 годах.
Научные руководители:
доктор сельскохозяйственных наук,
профессор
Федорова Маргарита Ивановна
доктор сельскохозяйственных наук,
профессор
Шмыкова Наталья Анатольевна
Официальные оппоненты:
доктор сельскохозяйственных наук
профессор, Брянского ГАУ
кандидат биологических наук, доцент
кафедры генетики, биотехнологии,
селекции и семеноводства
Сычёв Сергей Михайлович
Киракосян Рима Нориковна
Ведущая организация: ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр
Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н. И. Вавилова»
(ВИР)
Защита диссертации состоится « » июля 2018 года в « » часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220.019.02 созданного на базе ФГБНУ «Федеральный научный центр овощеводства» по адресу: 143080, Московская обл., Одинцовский р-н, п/о Лесной городок,
ВНИИССОК, сектор защиты диссертаций.
Факс: (495) 599-22-77
Е-mail: vniissok@mail.ru
aspirantura@vniissok.ru
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБНУ ФНЦО
Автореферат разослан « »
2018 года
Ученый секретарь совета
по защите докторских и
кандидатских диссертаций Д 220.019.02
доктор с.-х. наук, старший научный сотрудник
Бондарева Л.Л.
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. В настоящее время одним из приоритетных направлений селекции моркови столовой является создание гетерозисных гибридов. В государственном реестре селекционных достижений на 2018 год зарегистрировано 148
сортов и 143 гибрида моркови столовой. Гибриды зарубежной селекции по результатам госсортоиспытания рекомендованы для возделывания в различных регионах нашей страны, отличаются высокой урожайностью, товарностью, выравненностью корнеплодов, однако уступают сортам и гибридам отечественной селекции по биохимическому составу, вкусовым качествам, лежкости и другим параметрам. Для достижения высокого гетерозиса используют различные генетические системы размножения растений. В России гибриды моркови столовой созданы на основе цитоплазматической мужской стерильности (ЦМС), исследования в
этом направлении продолжаются и в настоящее время. Селекция на гетерозис требует привлечения нового исходного материала – гомозиготных инбредных линий
и новых методических подходов. В связи с этим большое значение имеет всестороннее изучение новых разнообразных популяций моркови столовой, выделение
селекционно ценных биотипов и использование биотехнологических методов при
создании на их основе mf и ms линий для получения гетерозисных гибридов.
Цель исследований – создание и оценка исходного материала, разработка и
усовершенствование биотехнологических методов для селекции на гетерозис моркови столовой.
Задачи исследований:
1. Получить инбредные потомства на основе сортопопуляций Марлинка и
Минор и изучить изменчивость основных морфо-биологических и селекционно ценных признаков инбредных потомств
2. Оценить комбинации ms х mf по степени проявления ЦМС и селекционно
ценным признакам и выделить перспективные ms- и mf- линии как исходный
материал для создания гибридов F1
3. Усовершенствовать элементы технологии получения удвоенных гаплоидов моркови столовой в культуре микроспор: определить параметры бутонов,
4
содержащих микроспоры на оптимальной для андрогенеза стадии развития;
изучить влияние компонентов питательной среды; выявить оптимальный состав питательной среды для получения эмбриоидов в культуре микроспор in
vitro.
4. Оптимизировать технологию получения удвоенных гаплоидов в культуре
неопыленных семяпочек для растений с мужской стерильностью и фертильных слабоотзывчивых в культуре микроспор сортообразцов моркови столовой.
Научная новизна результатов исследований. Сортопопуляции (с/п) Минор
и Марлинка являются новыми источниками ms-форм типа петалоид для создания
линейного материла при селекции на гетерозис. Установлена тесная взаимосвязь
между признаком ЦМС и параметрами семенного растения: высокая прямая зависимость (r = 0,91) между степенью стерильности и числом стеблей и обратная – с
высотой семенных растений (r = - 0,92). Изменчивость морфобиологических параметров инбредных потомств на первых этапах инбридинга является показателем
для отбора выравненных форм. Впервые изучены и показаны стадии прямого эмбриогенеза в культуре микроспор моркови столовой. Оптимизированы элементы
технологии культуры изолированных микроспор: выявлено положительное влияние на эмбриогенез добавки в питательную среду активированного угля в агарозе
и введение в индукционную питательную среду цефотаксима в концентрации 200
мг/л; усовершенствована технология получения удвоенных гаплоидов в культуре
неопыленных семяпочек. Расширен спектр отзывчивых генотипов разных сортообразцов моркови для использования в культуре неопыленных семяпочек и микроспор.
Практическая значимость. Создан перспективный линейный материал с
комплексом хозяйственно ценных признаков: №№ – 119mf, 541mf, 105mf, 107mf,
153mf, 258mf, 142mf, 573mf, 559mf, 577mf, 144mf, 253mf, 588mf , 120ms, 115ms,
247ms; 104ms, 156ms, 572ms, 574ms, как исходный, для создания ms и mf линий
для селекции моркови столовой на гетерозис. Выделены линии со 100% стерильностью - №№ 551-2, 528-1, 103, 106, 120, 572, 585, 580, 563-6. Выделены фертильные потомства как перспективные закрепители ЦМС: №№ 153, 637,119,107.
5
Предложены технологии получения удвоенных гаплоидов в культуре микроспор и
неопыленных семяпочек in vitro. Получены удвоенные гаплоиды 12 сортообразцов
различных морфотипов, которые включены в селекционный процесс для создания
линейного материала моркови столовой.
Положения, выносимые на защиту:
1. Степень проявления ЦМС и изменчивость селекционно ценных признаков инбредных потомств на основе с/п Марлинка и Минор и комбинаций скрещивания ms х mf форм; характеристика полученных перспективных ms- и mfлиний как исходного материала для селекции на гетерозис.
2. Усовершенствованные элементы технологии культуры микроспор и технологии получения удвоенных гаплоидов в культуре неопыленных семяпочек моркови столовой.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на Международной научной конференции во Всероссийском НИИ защиты
растений (2016 год), на VIII International Scientific Agriculture Symposium «Agrosym
2017», Jahorina, на Международной научно-практической конференции «Методология селекции и семеноводства овощных корнеплодных растений» ВНИИССОК,
на XVIII научной конференции молодых ученых «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеренарии» (Москва, 2018 год), на отчетных сессиях аспирантов, а также на заседаниях научно-методического совета ВНИИССОК (20142017 годы).
Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе две в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 135
страницах, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, рекомендаций, списка литературы и приложения; содержит 29 таблиц, 28
рисунков, 7 приложений. Список использованной литературы включает 163
наименования, в том числе 36 иностранных авторов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Исследования проведены в ФГБНУ «Федеральный научный центр овощеводства» в лаборатории селекции и семеноводства столовых корнеплодов и в лаборатории биотехнологии в 2014-2017 годах. Материал для исследований – ин-
6
бредные потомства(I1-I2), комбинации скрещивания, полученные на основе с/п
Минор и Марлинка; фертильные и стерильные линии; коллекционные образцы
лаборатории генетики и цитологии. Всего изучено более трех тысяч растений 87
инбредных потомств и 187 комбинаций скрещивания.
Изучение селекционных образцов и линий моркови столовой проводили в соответствии с «Методическими указаниями ВИР по изучению и поддержанию мировой коллекции корнеплодов» (1981). В селекционном питомнике площадь делянки составляла 0,5-10 м2 в зависимости от наличия семян. Во время вегетации
растений проводили фенологические наблюдения и биометрические исследования. При уборке проводили качественный и количественный учет урожая; изучали
основные морфо-биологические признаки листовой розетки и корнеплода. На
хранение закладывали товарные корнеплоды. Лежкость определяли при весеннем
анализе подсчетом сохранившихся корнеплодов, в процентах от числа заложенных.
Семенные растения выращивали в защищенном грунте и изучали по следующим признакам: число стеблей, высота растения, семенная продуктивность.
Степень стерильности (%) определяли визуально во время цветения, подсчетом
стерильных форм в общем количестве растений. Для получения инбредных
потомств семенные растения в фазу бутонизации изолировали индивидуальными
изоляторами. Для поиска закрепителей ЦМС стерильные растения скрещивали с
фертильными путем ручного опыления в изоляторах.
При введении в культуру in vitro крайние бутоны зонтичков на оптимальной
стадии развития стерилизовали в течение 15 минут в 50% водном растворе коммерческого препарата «Белизна» с добавлением Твина-20 (1 капля на 100 мл), с
последующим трехкратным промыванием в стерильной дистиллированной воде.
Для индукции эмбриогенеза в культуре микроспор использовали пять вариантов питательных сред: №1 – NLN-13 рекомендованная Сusters J.B.M. (2003) для
культуры микроспор рапса, №2 - на основе NLN-13 с добавлением мальтозы 1% и
маннита 1%, №3 – на основе NLN-13 с добавлением 2% глюкозы, №4 - NLN-13 с
0,1мг/л 2,4Д и 0,1 мг/л НУК рекомендованная для микроспор моркови Gorecka
7
К. с соавт. (2010), №5 – на основе среды МС с 13% сахарозой и гидролизатом казеина 0,5г/л. Культивирование завязей и неопыленных семяпочек in vitro проводили на агаризованной питательной среде МСм (Masuda et al., 1981) c 0,2 мг/л 2,4Д и
0,2 мг/л кинетина. Во все питательные среды добавляли цефотаксим 200мг/л.
Математическую обработку результатов проводили методом дисперсионного
анализа по Б.А. Доспехову (1985) с помощью пакета Microsoft Exel.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Для создания ms и mf линий моркови столовой использовали с/п Мар-
линка и Минор. Сорт Марлинка является источником ms-растений; сорт сорт
среднеспелый, характеризуется корнеплодом конической формы с тупым основанием и гладкой поверхностью. Сорт Минор – позднеспелый, корнеплоды
веретеновидной формы с заостренным основанием и гладкой поверхностью.
Оба сорта характеризуются высокой выравненностью.
Оценка инбредных потомств по признакам семенного растения
Сравнение стерильных и фертильных растений разных инбредных
потомств показало, что ms-растения формируют преимущественно 4-11 стеблей, в то время как mf-растения - до 15. Стерильные растения почти на 3040 см выше, чем фертильные, хотя пределы варьирования признака у них
шире (рис.1).
10
180
8
160
6
140
120
4
высота растений
число стеблей
100
2
0
10-50% 51-70% 71-99%
100%
степень стерильности, %
Марлинка
12
10
8
6
4
высота …
число стеблей
2
0
Число стеблей, шт
Высота растений, см
200
190
180
170
160
150
140
130
120
110
100
Высота растений, см
12
МИНОР
Число стеблей, шт
220
10-50% 51-70% 71-99% 100%
степень стерильности, %
Рис. 1 Характеристика семенных растений инбредных потомств с/п Минор и Марлинка с
разной степенью выраженности признака ЦМС (2014-2017 годы)
Изучение взаимозависимостей между признаком ЦМС и параметрами
семенного растения показало высокую прямую зависимость (r = 0,91) между
степенью стерильности и числом стеблей и обратную – с высотой семенных
8
растений (r = - 0,92). То есть, растения с цитоплазматичекой мужской стерильностью отличаются большей высотой и меньшим числом стеблей по
сравнению с mf-растениями.
Исследование структуры семенных растений инбредных потомств с/п
Минор показало, что одним из наиболее вариабельных признаков является
число стеблей (Сv=9-30%). Значительной вариабельностью по данному признаку отличалось потомство № 633(Сv=30 %). Наибольшая выравненность
по числу стеблей отмечена в потомстве № 242 – Сv=9%,, растения которой
характеризовались многостебельностью с числом стеблей 10-12. Высота семенных растений большинства изученных потомств достигала 160 см и более
(рис. 2). По высоте семенные растения характеризовались выровненностью
(Сv=1-5 %). В инбредных потомствах №№ 241, 242 и 622 высота семенных
растений не превышала 160 см.
12
число стеблей, шт.
200
10
высота растений, см
160
8
120
6
80
4
40
2
0
0
I1
I2
Минор
I1
I2
Марлинка
I1
I2
Минор
I1
I2
Марлинка
Рис. 2. Параметры семенных растений инбредных потомств
с/п Минор и Марлинка (2014-2017 годы)
Среди изученных семенных растений потомств, в которых все растения
были стерильны, наблюдалась средняя изменчивость по
числу стеблей
(Сv=12-29 %). Наибольшей выравненностью по изучаемому признаку обладали растения № 632 - Сv=12% которые формировали 8-11 стеблей. Высокая
изменчивость (Сv=29 %) наблюдалась в потомстве № 103, семенные растения имели 4-8 стеблей. Большая часть (67 %) растений изученных потомств
формировали до 7 стеблей.
9
По высоте семенные растения полностью стерильных потомств отличались выравненностью (Сv=2-3 %). Высота большинства семенных растений
достигала 190 см и более. При этом растения потомств первого инбридинга
отличались большим числом стеблей, чем растения второго инбридинга, хотя
по высоте растений они были сопоставимы (рис. 2).
Таким образом, изучение морфобиологических параметров семенных
растений инбредных потомств выявило их фенотипическое разнообразие,
обусловленное не только генотипическими особенностями исходных сортопопуляций, но и в первую очередь, характером проявления признака ЦМС,
ввиду тесной его взаимосвязи с количественными признаками семенного
растения.
Оценка инбредных потомств по семенной продуктивности
В селекции моркови на гетерозис большое значение имеет семенная
продуктивность исходного материала. Установлено, что в потомстве первого
поколения инбридинга около половины составляли растения с семенной
продуктивностью более пяти грамм. Часть растений (23%) при инбридинге
семена не завязали (рис. 3).
Рис. 3. Соотношение растений с разным уровнем семенной продуктивности в инбредных потомствах I1-I2 с/п Минор (2015-2017 годы)
Во втором инбредном потомстве семенная продуктивность растений составляла 0,3-2,4 грамма. При этом 47 % растений относились к среднепродуктивным и формировали 0,3-0,5 грамма семян. В то же время, растений, не
завязавших семена, в потомстве I2 не отмечено. Возможно, это результат от-
10
бора в первом поколении растений с высокой способностью завязывать семена.
В отличие от инбредных потомств с/п Минор, в с/п Марлинка в первом и
втором потомствах инбридинга соотношение групп растений с разной семенной продуктивностью сопоставимо (рис.4).
Отмечено только некоторое увеличение в I2 процента растений со
средним уровнем семенной продуктивности, тогда как доля высокопродуктивных растений в обоих поколениях инбридинга составляла около 35%, а
доля самонесовместимых растений – около 30% от общего числа изученных
семенных растений с/п Марлинка.
0
I2
I1
37%
35%
<0,3
0,3-0,5
>0,5
28%
33%
10%
18%
17%
22%
Рис. 4. Соотношение растений с разным уровнем семенной продуктивности в инбредных
потомствах поколений I1-I2 с/п Марлинка (2015-2017 годы)
В итоге, среди инбредных потомств с/п Марлинка выделилось большее
число биотипов с высокой семенной продуктивностью при инбридинге, чем в
с/п Минор. При этом значимых корреляционных связей между семенной
продуктивностью и биометрическими параметрами инбредных семенных
растений не выявлено.
Это свидетельствует о необходимости постоянного контроля за данным признаком в ряду последующих поколений, причем на ранних этапах
селекционного процесса нельзя исключать растения с низкой семенной продуктивностью, поскольку в их потомстве могут появляться биотипы с высокой способностью завязывать семена при инбридинге.
11
Изменчивость морфобиологических признаков растений инбредных
потомств на стадии корнеплода
Потомства с/п Минор. Изменчивость листовой розетки растений инбредных потомств показал, что как по всей совокупности, так и в разрезе отдельных потомств, наиболее стабильными признаками (Cv <10%) растений
являются высота розетки и длина листовой пластинки (рис.5).
100%
13
21
Минор, инбредные потомства
4
12
17
21
21
3
13
22
46
75%
V>20%
38
42
33
100
71
96
10<V<20%
88
83
79
42
50
13
лист
корнеплод
индекс формы
диаметр min
диаметр max
длина
число
длина черешка
ширина
длина
V<10%
46
8
0%
высота розетки
75
46
индекс сбега
25%
корне- плода
100
растения
50%
признаки
масса
Рис.5. Распределение инбредных потомств моркови столовой сортопопуляции
Минор по коэффициенту изменчивости признаков растений в пределах
индивидуальных потомств (2015-2017 годы)
По другим признакам листовой розетки отдельные потомства отличались по степени изменчивости, при невысоком значении коэффициента вариабельности средних значений между потомствами. Высокой степенью изменчивости (Cv >20%) по ширине листовой пластинки характеризовалось
13% потомств; по признакам длина черешка и число листьев в розетке - 21%
от всей совокупности изученных потомств. В то же время, по признакам ширина листовой пластинки и длина черешка почти половина потомств имели
слабую степень изменчивости.
Большинство изученных потомств характеризовались невысокой изменчивостью массы растения с листовой розеткой, из них 75% потомств характеризовалось низким уровнем изменчивости. Анализ варьирования признаков корнеплода инбредных потомств показал, что наиболее стабильной явля-
12
ется длина корнеплода:
только 4% потомств характеризовалось средней
степенью изменчивости по данному признаку – остальные были выровненны
(Cv=2-9%). По признакам «диаметр корнеплода» и «индекс формы» инбредные потомства в основном также были выровнены и только 12% и 21 % соответственно характеризовались средним уровнем варьирования (рис.5).
Изменчивость признака «индекс сбега» в 46% потомств характеризовалась как значительная, при этом диапазон варьирования в пределах отдельных инбредных потомств этой группы составил 21-58%. По изменчивости
массы корнеплода отмечены различия между отдельными потомствами. Низкой вариабельностью по данному признаку характеризовалось 46% инбредных потомств; средней - 42% инбредных потомства (Cv=12-20%).
Потомства с/п Марлинка. При оценке признаков листовой розетки
корнеплодов в с/п Марлинка также, как и у с/п Минор, отмечена высокая
выравненность инбредных потомств по высоте листовой розетки (рис. 6).
Рис.6. Распределение инбредных потомств моркови столовой сортопопуляции
Марлинка по коэффициенту изменчивости признаков растений в пределах
индивидуальных потомств (2015-2017 годы)
По вариабельности
признака «длина
листовой пластинки» 38%
потомств с/п Марлинка обладали низкой изменчивостью, в то время как в
инбредных потомствах с/п Минор все потомства были выровнены по данному признаку. Средняя степень вариации отмечена у 62 % потомств. Как видно на рисунке 6, высокой степенью изменчивости (Cv >20%) по ширине ли-
13
стовой пластинки и длине черешка характеризовалось 12% изученных инбредных потомств с/п Марлинка.
Анализ варьирования признаков корнеплода показал, что наиболее стабильными являются диаметры корнеплода – максимальный и минимальный.
По длине корнеплода только 4% инбредных потомств характеризовались
средней степенью вариабельности этих признаков.
Распределение потомств с/п Марлинка по уровню варьирования индекса
сбега отличалось от распределения потомств с/п Минор, хотя средней степенью изменчивости в потомствах обоих с/п характеризовалось 42% инбредных потомств. Большинство изученных потомств с/п Марлинка (77%) характеризовались низкой изменчивостью массы корнеплода с листовой розеткой;
средней вариабельностью – 27% инбредных потомств (рис. 6).
Оценка признаков семенных растений комбинаций скрещивания
В результате оценки степени стерильности полученных комбинаций
скрещивания (КС), выделены 16 потомств с/п Минор и 18 потомств с/п Марлинка со 100% ЦМС, что составило 28% и 18% от из числа изученных КС
(рис.7).
Марлинка
Минор
13%
32%
16%
32%
37%
24%
28%
10-50%
51-70%
71-99%
18%
100%
10-50%
51-70%
71-99%
100%
Рис. 7. Соотношение растений с разным уровнем ЦМС в комбинациях скрещивания
(2015-2017 годы)
Выделенные комбинации являются перспективным селекционным материалом для поиска закрепителей стерильности. Из числа проанализированных КС потомств с/п Минор большинство характеризовалось средней степе-
14
нью стерильностью(51-70%), тогда как потомства с/п Марлинка– низкой
(<50%) и высокой (>70%) (рис. 7).
По проявлению признаков семенных растений в комбинациях скрещивания прослеживались аналогичные взаимосвязи, как и в инбредных потомствах. В КС всех потомств, характеризующихся 100%-ой степенью ЦМС, семенные растения отличались меньшим числом стеблей, при средней вариабельности данного признака (Cv=14-19%) и большей высотой. При этом изменчивость по высоте семенного растения не зависимо от КС не превышала
Cv=2-3%. Тогда как в потомствах с низким проявлением признака ЦМС
наблюдалась высокая вариабельность по числу стеблей - Сv=24-47%.
Оценка морфобиологических признаков растений
комбинаций скрещивания на стадии корнеплода
По комплексу селекционных признаков растений наибольшая выравненность отмечена в КС №№ 101, 104, 109, 114, 632. Корнеплоды КС №№ 104 и
247 отличались высокой сохранностью (до 100%), выравненностью, интенсивно-оранжевой окраской и гладкой поверхностью (табл. 1 и 2).
В комбинациях скрещиваний с высокой степенью стерильности
потомств с/п Марлинка, так же как и потомств с/п Минор корнеплоды со
100% сохранностью характеризовались оранжевой и интенсивно-оранжевой
окраской с гладкой поверхностью. Выделены КС № №136, 155 в качестве
перспективных закрепителей стерильности (табл. 2).
Следует отметить, что изученные комбинации скрещивания с/п Марлинка характеризовались высокой сохранностью корнеплодов после хранения, большая часть которых сохранялась на уровне 95-100. Высокая сохранность является очень важным признаком в селекционном процессе, так как
корнеплоды моркови хранятся в течение длительного периода (>200 суток),
особенно для с/п Марлинка (исходной) сохранность которой не более 7580%.
15
Таблица 1 - Характеристика хозяйственно ценных признаков корнеплода выделенных комбинаций скрещивания
с/п Минор (2015-2016 годы)
Корнеплод
Потомства
Доля от массы
растения
Масса
Индекс
формы
Длина,
см
Диаметр,
см
Окраска,
балл
Поверхность
Сохранность,
%
Растений с
ЦМС, %
г
Cv %
%
Cv %
с/п
167
9
86
4
6,5
17,6
3,2
5
Г
95
-
101
170
7
85
4
7,8
20,3
3,1
4
СР
100
80
104
182
9
84
4
7,9
20,9
3,1
5
Г
85
83
109
159
9
82
7
7,9
20
3
4
СР
100
83
100
133
13
78
12
7,9
21
3,1
4
СР
100
83
122
159
12
78
8
7,3
19,6
3,2
4
Р
100
83
247
188
24
96
12
6,9
20,2
3,46
5
Г
100
92
103
164
19
82
30
7,9
21
3,1
4
СР
80
100
106
181
17
85
6
7,7
21,2
3,2
4
Г
90
100
120
151
13
86
10
7,6
20,1
3,1
4
СР
100
100
632
168
6
81
5
7,3
19,1
3,09
4
СР
95
100
НСР05
12
0,2
0,4
0,1
11
Примечание: Р – ребристая, СР – слаборебристая, Г – гладкая поверхность.
5
16
Таблица 2 - Характеристика хозяйственно ценных признаков корнеплода выделенных комбинаций скрещивания
с/п Марлинка (2015-2016 годы)
Корнеплод
Потомства
Масса
Доля от массы
растения
%
Cv %
Индекс
формы
Длина
см
Диаметр
см
Окраска
балл
Поверхность
Сохранность,
%
Растений с ЦМС,
%
г
Cv %
с/п
191
10
78
6
4
16,2
5,6
3-4
Г,СР
78
-
641
163
13
75
8
4,1
17,1
5,1
4
СР
100
83
154
172
9
78
7
3,8
15,8
5
4
СР
100
89
146
172
5
78
5
3,6
15,6
5,3
4
СР
95
91
129
172
15
76
8
3,6
15,9
5,5
4
СР
100
92
131
177
8
74
5
3,7
15,7
5,2
4
СР
100
100
136
178
12
76
6
3,7
16,4
5,6
4
Г
100
100
138
189
5
76
2
3,9
16,9
5,5
4
СР
82
100
152
182
9
72
5
3,6
15,9
5,5
5
Г
100
100
155
151
9
67
7
3,5
15,8
5,5
4
Г
100
100
634
198
2
77
3
3,7
16,1
5,4
4
СР
100
100
636
208
8
78
2
3,7
16,6
5,6
4
СР
100
100
638
214
5
80
2
3,7
16,9
5,7
4
СР
100
100
НСР05
10
0,1
0,4
0,1
2
Примечание: СР – слаборебристая, Г – гладкая поверхность.
5
17
Характеристика полученных ms- и mf- линий моркови столовой
комплексу хозяйственно ценных признаков
На основании комплексной оценки количественных и качественных признаков корнеплода и степени проявления признака ЦМС выделены 20 наиболее выровненных инбредных потомства в качестве перспективных источников ms- и mf-форм с наиболее оптимальным сочетанием селекционно ценных признаков: I1-2 mf - 119, 541, 105, 107, 153, 258, 142, 573, 577, 559, 144, 253,
588; ms - 115, 247, 104, 156, 572, 574, краткая характеристика которых приведена в
таблице 3.
Таблица 3 - Характеристика хозяйственно ценных признаков корнеплода
выделенных инбредных потомств с/п Минор и Марлинка (2015-2017 годы)
Потомство
№
Диаметр
корнеплода
Источники mf-форм
153
5,2
258
5,2
142
5,1
573
5,2
559
5,1
577
5,2
144
5,2
253
4,5
588
5,1
Источники ms-форм
156
5,2
572
5,1
574
5,1
Индекс
формы
Головка
Окраска
Сердцевина
Поверхность
с/п Марлинка
3,5
3,7
4
3,6
3,7
3,6
3,8
3,9
3,7
М
С
С
М
С
С
М
М
С
5
5
5
4
4
4
4
5
4
М
М
М
С
М
М
С
М
М
СР
СР
СР
СР
СР
СР
СР
Г
СР
3,6
3,7
3,7
С
С
С
4
4
4
С
С
С
Г
СР
СР
с/п Минор
Источники mf-форм
119
3,1
541
3,2
105
3,3
107
3,1
Источники ms-форм
120
3,1
115
3,2
247
3,5
104
3,1
7,6
7,6
7,6
7,7
М
С
М
М
5
4
4
4
С
М
М
М
СР
СР
Г
Г
7,6
6,9
6,9
7,9
М
М
С
М
4
5
5
5
С
С
С
М
СР
СР
Г
Г
Примечание: С – средняя, М – маленькая, СР – слаборебристая, Г – гладкая.
18
Таким образом, на основе с/п Минор и Марлинка уже во втором поколении
инбридинга выделен перспективный селекционный материал для создания
линейного матераиала при селекции моркови столовой на гетерозис. При создании гетерозисных гибридов моркови столовой на основе ЦМС одним из
наиболее важных звеньев является поиск и выделение mf-форм - закрепителей стерильности (линия В). Среди выделенных инбредных потомств наиболее перспективными с этой точки зрения являются №№ mf 119, 107 (с/п
Минор) 153, 637, 142 (с/п Марлинка).
Разработка элементов биотехнологии для создания удвоенных
гаплоидов моркови столовой
Эффективных протоколов получения удвоенных гаплоидов моркови
ограниченное количество и существует необходимость модифицировать существующие и создавать новые. Элементы технологии получения удвоенных
гаплоидов (DH-растения) разрабатывали с использованием 12 сортообразцов
различных морфотипов (сортотипов).
Культура микроспор
Влияние фазы развития микроспор на эффективность эмбриогенеза.
На донорных растениях сорта Шантенэ проведена серия опытов по определению оптимальной стадии развития микроспор и пыльцы для индукции эмбриогенеза в культуре изолированных микроспор моркови. В результате эксперимента подтверждено, что наибольший выход эмбриоидов наблюдается у
растений моркови, находящихся в начале цветения из бутонов, в которых
наибольшая часть микроспор находится на поздней стадии развития. Из бутонов содержащих тетрады и микроспоры на ранней стадии развития, а также из бутонов с двухклеточной и зрелой пыльцой эмбриоидов не получено.
Этапы прямого эмбриогенеза в культуре микроспор моркови столовой.
Цитологическое изучение показало, что первые деления в культуре микроспор наблюдается на третьи-четвертые сутки после начала культивирования.
Чаще микроспоры претерпевают равный тип деления, но у высокоотзывчивых генотипов могут присутствовать делящиеся микроспоры сферической
19
формы (рис. 8А). На 10 сутки культивирования образуются многоклеточные
эмбриоидные структуры (рис. 8Б), которые к 18 суткам достигают глобулярной, а на 24 сутки - торпедовидной стадии развития (рис. 8Г). Эмбриоиды
представляют собой вытянутые палочковидные образования молочного цвета
и после 30-45 суток культивирования хорошо видны невооруженным глазом
(рис. 8Е).
А. Деления в микроспорах элипсоидной и
сферической формы – 3 суток культивирования
Б. Многоклеточные эмбриоидные структуры –
10 суток культивирования
В. Глобулярный эмбриоид – 18 суток культивирования
Г. Торпедовидный эмбриоид – 24 сутки культивирования
Е.Эмбриоиды в культуре микроспор на
40сутки культивирования
Рисунок 8 - Эмбриогенез в культуре микроспор моркови
Д. Эмбриоид на семядольной стадии развития - 30
суток культивирования
20
Отмечено, что при культивирования эмбриоидов на индукционной питательной среде более 60 суток, начинается активный процесс образования
вторичных эмбриоидов (рис. 9). В связи с этим, мы рекомендуем эмбриоиды
на сердцевидной стадии развития
сразу же переносить в отдельные
пробирки на регенерационную среду
с 2% сахарозой, чтобы достоверно
провести оценку отзывчивости генотипов. Перенос эмбриоидов на регенерационную среду следует проводить несколько раз, поскольку эмбриоиды в культуре микроспор моркови столовой находятся на разных
Рис. 9. Образование многочисленных
вторичных
эмбриоидов–
70
суток
культивирования
стадиях развития.
Влияние активированного угля в составе питательной среды на эффективность эмбриогенеза. В процессе культивирования органов и тканей
моркови выделяются фенольные соединения, являющиеся токсическими веществами, угнетающими рост растения in vitro. Активированный уголь (АУ)
обладает способностью адсорбировать эти соединения (Fridborg et al., 1978).
Положительное влияние АУ в питательной среде на образование и развитие
эмбриоидов в культуре микроспор моркови показаны в таблице 5 - эффективность эмбриогенеза возрастала почти в два раза.
Таблица 4 - Образование эмбриоидов моркови столовой на питательной
среде с добавлением активированного угля и без активированного угля
Сортообразец
Cubic sperlings
Rubra Vitamina
Шантенэ
среднее число эмбриоидов в чашке Петри
с активированным
без добавления активированного
углем
угля
27,6± 4,2
13±1,8
7,3± 2,7
5,5±0,3
6,3± 1,5
3,5±0,6
Влияние генотипа донорного растения и состава питательной среды
на эффективность эмбриогенеза в культуре микроспор. Известно, что важнейшими факторами, влияющими на эффективность эмбриогенеза являются
21
генотип и питательная среда (Тюкавин и др., 1999; Gorecka К. et al. 2010; Чистова, 2015). Из десяти изученных сортообразцов получены эмбриоиды у
восьми (табл. 4). Для большинства образцов из пяти вариантов питательных
сред, лучшей оказалась среда №2 на основе модифицированной NLN-13 с добавлением мальтозы 1% и маннита 1%. Наибольший выход эмбриоидов (84 эмбриоида на чашку Петри диаметром 6 см) наблюдался у селекционного образца 7 кт на среде №4.
Поскольку морковь столовая является двулетней культурой, корнеплод
часто накапливает внутреннюю инфекцию, от которой очень трудно избавиться поверхностной стерилизацией бутонов при введении в культуру in
vitro. В ряде работ показано, что добавление антибиотика цефотаксима в питательную среду помогает снизить потери от инфекции, а также благоприятно влияет на эмбриогенез в культуре микроспор и на регенерацию растений у
различных
культур
(Данилова,
Долгих,
2004;
Ahmadi
B.
et
al.,
2014). Введение в индукционные питательные среды цефотаксима в концентрации 200 мг/л позволило нам полностью избавиться от развития бактериальной и грибной микрофлоры в культуре микроспор.
Таблица 5- Количество образовавшихся эмбриоидов* на различных
вариантах питательной среды**
Сортообразец
Cubic sperlings
7 кт
De Luc
Nutri-Red
Rubra Vitamina
Saint Valery
Нантская 4
Шантене
НСР05
число
чашек
6
6
6
6
6
6
6
6
Среда 1
Среда 2
Среда 3
Среда 4
Среда 5
0
0
0
0
0
4±0,8
0
5,4±0,5
0,92
13±1,8
0
2,4±0,7
4,4±0,7
5,5±0,3
0
2,2±0,7
3,5±0,6
2,26
10± 2,7
0
0
0
0
0
0
0
13±1,1
72 ± 5,4
0
0
0
0
0
0
4,95
2±0,4
0
0
0
0
0
0
19±0,9
0,93
Примечание: * - среднее количество образовавшихся эмбриоидов в одной чашке Петри d=6 см на
45 сутки культивирования, **- во все питательные среды был добавлен цефотаксим 200 мг/л
Проведенный двухфакторый дисперсионный анализ, показал, что на
образование эмбриоидов из микроспор доля влияния генотипа выше, чем
среды (14% и 8%), и определяющим количество образовавшихся эмбриоидов является совместное действие обоих факторов (65%). Для успешного по-
22
лучения эмбриоидов у новых образцов следует испытывать набор питательных сред с различными сочетаниями источников углеводов и регуляторов
роста. В результате проведенной работы получены удвоенные гаплоиды
(DH-растения) в культуре изолированных микроспор in vitro, в количестве
115 шт., относящихся к различным морфотипам, что расширяет генетическое
разнообразие линейного материала моркови столовой для селекции.
Культура неопыленных семяпочек
Культивирование неопыленных семяпочек in vitro проводили, модифицируя методику, разработанную ранее для моркови (Тюкавин, 2007). Модификация заключалась в одновременном использовании сочетания регуляторов роста (0,2 мг/л 2,4Д и 0,2 мг/л кинетина) и добавлении цефотаксима
200мг/л в среду. Образование эмбриогенного каллуса наблюдалось со стороны микропилярного конца семяпочек через 5-7 недель от начала культивирования. Процент отозвавшихся семяпочек варьировал и зависел как от сортообразца, так и от генотипа индивидуального растения (рис. 10).
Индукции гиногенеза удалось
% 70
добиться у 10 сортообразцов. Наибо-
60
лее отзывчивыми в культуре неопы-
40
семяпочки ср
семяпочки мин
семяпочки макс
50
30
соответственно. У образца Maestro F1
вместо каллуса происходило образование эмбриоидов, а из семяпочек,
Berlicum
Амстердамская
Шантанe
Нантская
Император
ных структур составил 65%, 63%, 47%
0
Late Half-long
Horn
Dragon, у которых выход эмбриоген-
10
Валерия
разцы Марлинка, Император и Purple
20
Long orange
ленных семяпочек оказались сортооб-
Рис. 10. Процент выхода эмбриогенных структур в культуре неопыленных семяпочек в пределах совокупности разных сортотипов моркови
столовой (2015-2017 годы)
выделенных из растений сорта Нант-
.
ская-4 развитие могло происходить как по пути прямого эмбриогенеза, так и
по пути каллусогенеза. В результате использования данной технологии были
получены удвоенные гаплоидные растения из коллекционных образцов, относящихся к разным морфотипам, а также ценных инбредных форм с муж-
23
ской стерильностью и фертильных растений, не отзывчивых в культуре микроспор или с пониженной жизнеспособностью пыльцы.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
1. Источником получения ценных ms и mf линий для селекции на гетерозис
моркови столовой являются сортопопуляции Минор и Марлинка, инбредные
потомства которых характеризуются выравненностью и высоким выходом
стерильных растений типа петалоид.
2. Установлена тесная взаимосвязь между признаком ЦМС и параметрами
семенного растения: высокая прямая зависимость (r = 0,91) между степенью
стерильности и числом стеблей и обратная – с высотой семенных растений (r
= - 0,92).
3. На основе оценки изменчивости морфобиологических параметров растений инбредных потомств показана возможность отбора выравненных форм
на первых этапах инбридинга.
4. Получен перспективный селекционный материал с комплексом ценных
признаков - инбредные потомства: I1-2 mf - 119, 541, 105, 107, 153, 258, 142,
573, 559 , 577, 144, 253, 588; ms - 120, 115, 247, 104,156, 572, 574, как исходные формы для создания ms- и mf- линий при селекции моркови столовой на
гетерозис.
5. Выделены потомства со 100% стерильностью №№551-2, 528-1, 103, №106,
120, 572, 585, 580, 563-6 и фертильные формы с высокой способностью закреплять признак ЦМС(№107, 153, 119, 637), как исходные линии для создания закрепителя стерильности.
6. Введение в индукционную питательную среду суспензии активированного
угля в агарозе и цефотаксима 200 мг/л позволило усовершенствовать технологию получения удвоенных гаплоидов моркови в культуре микроспор и получить растения-регенеранты у восьми сортообразцов.
7. Оптимизирована технология получения удвоенных гаплоидов в культуре
неопыленных семяпочек для различных сортообразцов моркови столовой путем внесения в индукционную среду цефотаксима в концентрации 200 мг/л,
24
что позволило получить удвоенные гаплоиды у слабоотзывчивых сортообразцов и селекционных ценных форм различного происхождения с признаком
ЦМС.
8. Выявлен уровень отзывчивости генотипов разных морфотипов моркови
столовой в культуре микроспор и неопыленных семяпочек. На их основе получены удвоенные гаплоиды (DH-растения) из 12 сортообразцов моркови
столовой, относящихся к разным морфотипам; растения-регенеранты из msи mf- линий перспективных инбредных потомств.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Переданы ms- и mf- линии (ms-120, 115, 247, 104,156, 572, 574; mf-119,
541, 105, 107, 153, 258, 142, 573, 559 , 577, 144, 253, 588) в лабораторию селекции и семеноводства столовых корнеплодов для продолжения исследований.
2. В качестве источников для создания ms- и mf- линий использовать сортопопуляции Марлинка и Минор.
3. Для получения удвоенных гаплоидов и растений регенерантов рекомендуется использовать усовершенствованные технологии культуры микроспор и
неопыленных семяпочек и сортообразцы с высокой отзывчивостью.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ
Публикации в изданиях, рекомендованных в ВАК РФ
1. Вюртц Т.С. Создание удвоенных гаплоидных линий моркови столовой
(Daucus carota L.) с использованием биотехнологических методов /
Т.С. Вюртц, Н.А. Шмыкова, М.И. Федорова, Т.В. Заячковская, Е.А.
Домблидес // Материалы международной конференции «Экологогенетические основы современных агротехнологий», - Вестник защиты
растений, - 2016.- 3(89).- С.43-44.
2. Вюртц Т.С. Получение DH-растений в культуре микроспор моркови /
Т.С.Вюртц, Е.А. Домблидес, Н.А. Шмыкова, М.И. Федорова, Л.Ю. Кан,
А.С. Домблидес // Овощи России. – 2017. - №5. – С. 25-30.
25
Научные статьи, опубликованные в иных изданиях
3. Вюртц Т.С. Использование биотехнологических методов для селекции
овощных культур во ВНИИССОК / Е.А. Домблидес, Н.А. Шмыкова,
Д.В. Шумилина, Т.В. Заячковская, Е.В. Козарь, Т.С. Вюртц, Л.Ю. Кан,
В.С. Романов, В.А. Ахраменко // Научная конференция «Инновационные методы селекции овощных культур», - Селекционносеменоводческий центр «Гавриш» г. Крымск, Краснодарский край. 2017. – С. 19-20.
4. Вюртц Т.С. Овощные корнеплоды: с чего начинается импортозамещени / С.М. Сирота, В.А. Степанов, Т.С. Вюртц // Селекция, семеноводство и генетика, - 2017. - №6(18). – С. 48-51.
5. Vjurtts T.S. Biotechnological approaches for breeding programs in vegetable
crops / E. Domblides, N. Shmykova, D. Shumilina, T. Zayachkovskaya,
T.S.Vjurtts, E.V. Kozar, L. Kan, V. Romanov, A. Domblides, V. Pivovarov,
A. Soldatenko // Book of Abstracts (Elektronski izvor) / VIII International
Scientific Agriculture Symposium «Agrosym 2017», Jahorina. – 2017.
6. Vjurtts T.S. Biotechnological approaches for breeding programs in vegetable
crops / E. Domblides, N. Shmykova, D. Shumilina, T. Zayachkovskaya,
T.S.Vjurtts, E.V. Kozar, L. Kan, V. Romanov, A. Domblides, V. Pivovarov,
A. Soldatenko // Proceedings of the VIII International Scientific Agriculture
Symposium «Agrosym 2017», Jahorina. – 2017. – P. 452-459.
7. Вюртц Т.С. Использование культуры изолированных микроспор и
неопыленных семяпочек in vitro для получения гомозиготных линий
моркови столовой / Т.С.Вюртц, Е.А. Домблидес, А.С. Домблидес /
XVIII научная конференция молодых ученых «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеренарии»,- Москва. – 2018.
26
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа