close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Технология получения наночастиц селена и его биодоступных форм биотрансформацией Saccharomyces cerevisiae из селенорганических соединений

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Осина Татьяна Сергеевна
Технология получения наночастиц селена и его биодоступных форм
биотрансформацией Saccharomyces cerevisiae из
селенорганических соединений
03.01.06 – биотехнология
(в том числе бионанотехнологии)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата технических наук
Щелково – 2018
Диссертация выполнена на кафедре «Микробиология, биотехнология и химия»
Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего
образования «Саратовский государственный аграрный университет имени
Н.И. Вавилова»
Научный руководитель:
Древко Борис Иванович – доктор химических наук, профессор кафедры
«Микробиология, биотехнология и химия» Федерального государственного
бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Саратовский
государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова»
Официальные оппоненты:
Похиленко Виктор Данилович – доктор технических наук, ведущий научный
сотрудник Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный центр
прикладной микробиологии и биотехнологии», отдел биологической технологии
Панкратов Алексей Николаевич– доктор химических наук, профессор кафедры
«Аналитическая химия и химическая экология» Федерального государственного
бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Саратовский
национальный исследовательский университет имени Н.Г. Чернышевского».
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт биохимии и
физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук»
Защита диссертации состоится «___» _____________ 2018 г. в _______ часов на
заседании диссертационного совета Д 006.069.01 при Федеральном государственном
бюджетном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский и
технологический институт биологической промышленности» (ФГБНУ ВНИТИБП) по
адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, п. Биокомбината, д.17,
ФГБНУ ВНИТИБП т/факс: (495) 567-32-63; e-mail: vnitibp@mail.ru.
С диссертацией можно ознакомиться в научно-технической библиотеке
ФГБНУ ВНИТИБП.
Автореферат разослан «___» ______________ 2018 г.
Автореферат «___» ______________ 2018 г. размещен на сайте ФГБНУ ВНИТИБП
www.vnitibp.ru и на официальном сайте ВАК http:/www.vak…….
Ученый секретарь
диссертационного совета,
кандидат биологических наук
Фролов Ю.Д.
2
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Селен является незаменимым микроэлементом в жизнедеятельности животных и человека, поэтому поиск новых форм его доставки в организм
является актуальной задачей. Недостаток селена в питании животных и человека может привести к ряду заболеваний. Наиболее исследовано положительное влияние селена при лечении рака, гепатита С, диабета, церебро-васкулярной недостаточности,
болезни Альцгеймера, отравлений солями тяжелых металлов, болезней щитовидной
железы, сердечно-сосудистых заболеваний, астмы и других заболеваний. Также соединения селена могут быть использованы в качестве стимуляторов роста, антиоксидантов, восстановителей ферментативных функций печени и мозга. (Тутельян В.А. и
др., 2002; Ермаков В.В., 2004; Stadtman Thressa C., 2005; Weekley Claire M. and Harris
Hugh H., 2013).
Соли селенопирилия и селенопираны, субстратами для которых служат диоксосоединения, нашли применение в качестве компонентов оптических записывающих
сред, фотогальванических элементов, инициаторов фотополимеризации, быстрорелаксирующих затворов лазеров и для фотодинамического лечения (Gibson Scott L. et
аl., 2005).
В настоящее время в медицине и ветеринарии для восполнения дефицита селена в
основном используются его неорганические соединения: селенит и селенат натрия
(Galbraith M.L. et al., 2016). Используются и препараты, которые получены биотехнологическим методом из селенита натрия, в которых селен представлен чаще всего в
виде селенметионина и селенцистеина (Fisinin Vladimir I. еt al., 2009; Schrauzer Gerhard N., Surai Peter F., 2009). Применяемые в России менее токсичные синтетические
селенорганические соединения представлены препаратами Селен-Актив (9-фенилсимм.октагидроселеноксантен, «Селенопиран», «Селенес», «Селексен») и ДАФС-25
(«Селенобел», «Селенолин», «ДАФС-25к»), активная часть которых относится соответственно к гетероциклическому селенсодержащему соединению (А.с. СССР №
782343, 1981) и селенсодержащему дикетону (Пат. РФ 2051681; Пат. РФ 2171110).
В последние годы было установлено, что наночастицы селена могут усваиваться
живыми организмами и могут быть использованы в ветеринарии и медицине (Bangjun
Z. аnd Xiaoyu L., 2010; Chaudhary Savita et аl., 2014; Fernandes A.P., Gandin V., 2015;
Bhattacharjee A. et аl., 2017), поэтому изучение биологической активности впервые
синтезированных селенорганических соединений, их биотрансформации для получения натуральных селенсодержащих продуктов и исследование влияния микроорганизмов на данные соединения с целью более широкого их применения является актуальной задачей. Кроме того, актуальной является проблема создания инъекционных
селенсодержащих препаратов.
Степень разработанности проблемы. В настоящее время для восполнения дефицита селена в основном используются его неорганические соединения (Galbraith M.L.
et al., 2016) или продукты переработки селенита натрия Saccharomyces сerevisiae
(Fisinin Vladimir I. еt al., 2009; Schrauzer Gerhard N., Surai Peter F., 2009). Исследование
биологической активности органических соединений селена и использование последних для получения биологических форм селенсодержащих соединений интенсивно
ведутся в последние 10-15 лет, однако практического применения пока не нашли
(Tsivileva O., Perfileva A., 2017; Lazard M. еt al., 2017; Chalissery J. еt al., 2017).
Цель и задачи исследований: исследовать возможность создания новой технологии получения наночастиц селена и его биодоступных форм из селенорганических
соединений под воздействием Saccharomyces cerevisiaе; разработать методики синтеза
3
селенорганических соединений и создания на их основе мицеллярных форм препаратов.
Исходя из цели, были поставлены следующие задачи:
1. Провести анализ существующих методов и технологий создания селенсодержащих препаратов и кормовых добавок.
2. Разработать методы анализа селенорганических соединений и продуктов их биотехнологической переработки, чтобы установить фрагменты механизма их усвоения.
3. Исследовать влияние Saccharomyces cerevisiae в различных питательных средах
на селенорганические соединения арилалифатического и гетероциклического рядов.
4. Установить строение продуктов биотехнологической переработки селенорганических соединений в различных питательных средах и определить пути биотрансформации селенорганических соединений в изучаемых системах.
5. Определить влияние питательной среды (природной и искусственной) на протекание исследуемого биотехнологического процесса.
6. Разработать способы получения селенорганическихсоединений и синтезировать
на их основе конкретные субстраты, для создания мицеллярной (инъекционной) формы селенсодержащего препарата.
Научная новизна. Разработаны методы анализа при помощи газовой хроматографии с масс-селективным детектором (ГХ/МС) селенсодержащих соединений и продуктов их биотехнологической переработки за счет использования изотопного состава элементов, которые могут быть использованы при контроле технологических процессов по производству селенсодержащих лекарственных субстанций и кормовых добавок.
Впервые обнаружено образование наночастиц селена в результате воздействия
Saccharomyces cerevisiae на селенорганические соединения.
Установлено образование ацетофенона в качестве побочного продукта при биотрансформации под воздействием Saccharomyces cerevisiae из диацетофенонилселенида, что свидетельствует о его восстановлении при его преобразовании. Аналогичные результаты получены для 2,4-диарил-7,8-бензо-5,6-дигидро-4Н-селенохроменов,
9-фенил-симм.октагидроселеноксантенов и тетрагидроселенохроменов.
Впервые проведены реакции восстановления ряда селенсодержащих гетероциклических соединений, что было необходимо для изучения процесса их биотрансформации микроорганизмами.
Установлена возможность создания водорастворимых композиций за счет нерасворимых в воде селенорганических соединений.
Теоретическая и практическая значимость. Установлено преобразование селенорганических соединений и их отличие от неорганических форм селена под воздействием Saccharomyces cerevisiaе в различных питательных средах. Преобразование
идет в наночастицы селена и остальные продукты биотрансформации, которые не характерны для метаболизма дрожжей.
Разработаны основы технологических процессов получения новых водорастворимых мицеллярных форм для их наиболее эффективного введения в питательные среды и использования в качестве инъекционной формы препарата (Пат. РФ № 2572716).
Синтезированы новые селенорганические соединения, пригодные по своей структуре для введения в питательные среды.
Методология и методы исследования. Методологической базой послужили труды отечественных и зарубежных исследователей по вопросам синтеза селенорганических соединений, наночастиц и их биотрасформации (Блинохватов А.Ф., Цивиле4
ва О.М., Панкратов А.Н. – Россия; Detty Michael R. – USA; Comasseto
Valdir –
Brazil и Engman Lars – Sweden и др.).
Для установления структуры и состава полученных веществ и наночастиц использовалась газовая хроматография с масс-селективным детектором, высокоэффективная
жидкостная хроматография со спектрофотометрическим детектором, ядерный магнитный резонанс и электронно-просвечивающая микроскопия.
Для установления достоверности полученных результатов каждый эксперимент
проводился минимум в трех повторностях.
Оборудование и методы. Размер и элементный состав нано- и микрочастиц определяли на просвечивающем электронном микроскопе Zeiss марки Libra 120 на базе
Центра коллективного пользования научным оборудованием в области физикохимической биологии и нанобиотехнологии «Симбиоз» Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (г. Саратов).
Процесс протекания реакций и индивидуальность полученных соединений на первоначальном этапе контролировали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ).
Идентификацию соединений производили при помощи элементного анализа и ЯМРспектрометрии. ЯМР 1Н спектры получены на спектрометре Varian FT-400.
Качественный и количественный анализ состава реакционных смесей, а также
определение индивидуальности и идентификация получаемых соединений осуществляли с помощью метода ГХ/МС и ВЭЖХ с УФ детектором. Анализ методом ГХ/МС
проводили на приборе HP – SMS 5890/5972 при условиях: температура инжектора
хроматографа – 200 оС; время действия начальной температуры термостата колонки –
3 мин.; начальная температура термостата колонки – 50 оС; конечная температура
термостата колонки, при которой проводится анализ, – 280 оС; скорость повышения
температуры термостата после удаления легкокипящих компонентов – 10 оС/мин.;
газ-носитель – гелий, скорость подачи  = 1 мл/мин., а также путем ВЭЖХ на приборе
Стайер Аквилон с УФ детектором UV-104(колонка Луна С-18; элюент – 0,1 н раствор
H2SO4-ацетонитрил (3:2); скорость потока – 1,2 мл/мин.; объем пробы – 20 мкл; длина
волны света – 254 нм).
Для определения концентрации методом ВЭЖХ предварительно строяли градуировочный график по стандартным растворам, содержащим 50, 100 и 200 мкг/мл исследуемого соединения.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Методы анализа селенорганических соединений и продуктов их биотехнологического превращения в биологических объектах.
2. Данные экспериментов по биотрансформации под воздействием Saccharomyces
cerevisiae в различных питательных средах: диацетофенонилселенида; 2,4-дифенил7,8-бензо-5,6-дигидроселенохромена; 9-фенил-симм.октагидроселеноксантена; перхлоратов 2,4-диарил-7,8-бензо-5,6-дигидроселенохромилия и 2-(п-метоксифенил)-4фенил-7,8-бензо-5,6-дигидроселенохромилия; 2-фенил-4-(4-п-бромфенил)-5,6,7,8-тетрагидро-4Н-селенохромена; (3-(4-бромфенил)-4,5,6,7-тетрагидробензо-[b]селенофен2-ил)-(фенил)-метанона и (3-фенил-4,5,6,7-тетрагидробензо-[b]селенофен-2-ил) (пхлорфенил)-метанона.
3. Строение продуктов, образующихся при биотрансформации исследованных селенорганических соединений.
4. Строение органических соединений, образующихся в качестве промежуточных
продуктов при биотрансформации исследованных селенорганических соединений.
5. Методики синтеза новых селенорганических соединений.
5
6. Способ получения оптимальной водорастворимой формы 2,4-дифенил-7,8-бензо5,6-дигидроселенохромена для введения в питательную среду селенорганического соединения и создания инъекционной формы препарата.
Степень достоверности и апробация результатов исследования. Достоверность
выводов основывается на значительном объеме полученных экспериментальных данных. Статистическую обработку результатов экспериментов проводили общепринятым методом (Лакин Г.Ф., Биометрия, 1990). Расчеты и построение технологических
таблиц и схем осуществляли с помощью программы «Micr s ft Office Excel 2010»,
входящей в пакет программ «Micr s ft Office 2010».
Результаты, полученные в ходе выполнения данной работы, были представлены на
Международной научно-практической конференции «Биотехнология: реальность и
перспективы в сельском хозяйстве» (Саратов, 2013 г.); Конференции профессорскопреподавательского состава и аспирантов по итогам научно-исследовательской, учебно-методической и воспитательной работы за 2012, 2013, 2014, 2016 годы (Саратов,
2013, 2014, 2015, 2017 г.г.); Конкурсе научно-инновационных работ молодых ученых,
посвященном 100-летию университета (Саратов, 2013 г.);VIII Саратовском салоне
изобретений, инноваций и инвестиций (Саратов, 2013 г.); Конкурсе научных работ в
рамках Всероссийской молодежной научной конференции «Новые материалы и технологии: состояние вопроса и перспективы развития» (Саратов, 2014 г.); Всероссийской молодежной научной конференции «Современные биоинженерные и ядернофизические технологии в медицине» (Саратов, 2014 г.); Международной научнопрактической конференции «Биотехнология: реальность и перспективы" (Саратов,
2014 г.); Конкурсе молодых ученых «Грант Ректора» (Саратов, 2015 г.); УМНИКе
(Участник молодежного научно-инновационного конкурса; Саратов, 2015 г.).
Публикации. По теме диссертационной работы подготовлено и опубликовано
15 научных работ, из них 1 статья в журналах, рецензируемых в БД Scopus и Web of
Science, 2 статьи в журналах, рекомендованных перечнем ВАК, 1 патент РФ на изобретение.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Результаты научных исследований соответствуют пунктам 7 и 11 паспорта специальности 03.01.06.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора
литературы, описания материалов и методов исследований, описания результатов исследований, обсуждения результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 181 источник. Диссертация изложена на 163
страницах, включает 52 рисунка и 10 таблиц.
Личный вклад автора. Автор принимал непосредственное участие в планировании и проведении экспериментов, обсуждении полученных результатов и их интерпретации, формулировке выводов, подготовке публикаций. Отдельные эксперименты
или их этапы проводились совместно с коллегами из Федерального государственного
бюджетного учреждения науки «Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН» (г. Саратов).
Благодарности. Автор выражает благодарность директору ФГБНУ ВНИТИБП,
академику РАН, академику НААН Украины А.Я. Самуйленко; научному руководителю д.х.н., профессору Б.И. Древко; начальнику управления научно-технического центра при федеральном управлении по безопасному хранению и уничтожению химического оружия И.Н. Исаеву; начальнику лаборатории при федеральном управлении по
безопасному хранению и уничтожению химического оружия Д.Ю. Диренко; научному сотруднику Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН
6
А.М. Бурову.
Работа выполнена в 2012-2016 гг. на кафедре «Микробиология, биотехнология и
химия» ФГБОУ ВО «Саратовский государственный аграрный университет им.
Н.И. Вавилова». Часть опытов проводились в лаборатории «Молекулярная биология»
кафедры «Терапия, акушерство и фармакология» ФГБОУ ВО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова», в лаборатории федерального
управления по безопасному хранению и уничтожению химического оружия, в лаборатории Института биологии физиологии растениеводства микроорганизмов РАН.
2. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
2.1 Разработка методики определения диацетофенонилселенида и продуктов
его преобразования в биологических объектах, образующихся
в присутствии Saccharomyces cerevisiae
Первоначально мы провели анализ бензольных растворов препарата ДАФС-25 методом газовой хроматографии (рисунок 2.1). При анализе хроматограмм было обнаружено, что препарат разлагается при испарении на инжекторе хроматографа, и кроме
препарата ДАФС-25 (рисунок 2.2) был обнаружен продукт элиминирования селеноводорода из молекулы диацетофенонилселенида – 1,4-дифенилбут-2-ен-1,4-дион и
продукты неустановленного строения. Указанный процесс при высоких температурах
является хорошо изученным, классическим процессом.
Следует отметить, что селенсодержащие фрагменты в масс-спектрах должны проявляться в виде щести сигналов, пропорциональных естественному содержанию селена в природе: Se74 – 0,87 %; Se76 – 9,02 %; Se77 – 7,58 %; Se78 – 23,52 %; Se80 –
49,82 %; Se82 – 9,19 %.
Abundance
Abundance
TIC: DAFS10_1.D\ data.ms
S c a n 1 7 6 3 ( 2 4 . 0 0 2 m in ) : D A F S 1 0 _ 1 . D \ d a t a . m s
105
1300000
1200000
3500000
1100000
3000000
1000000
900000
2500000
800000
77
700000
2000000
600000
1500000
500000
400000
1000000
300000
500000
91
237
200000
120
100000
63
8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00
Time-->
Рисунок 2.1 – Хроматограммабензольного раствора
препарата ДАФС-25
133
0
60
80
1 5 71 7 1 1 9 12 0 5 2 1 9
251
276
318
349
100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340
m / z -->
Рисунок 2.2 – Масс-спектр препарата ДАФС-25
Молекулярный ион препарата ДАФС-25 в масс-спектре имеет очень малую интенсивность, поэтому было решено применить программу “Extract Ion Chromatograms”.
Молекулярный ион препарата должен проявляться в виде шести сигналов с m/z = 312,
314, 315, 316, 318, 320 (рисунок 2.3).
Полученное экспериментальное соотношение площадей хроматограмм точно совпадает с соотношением изотопов селена в природе.
7
A b u n d a n c e
Io n 3 2 0 .0 0 (3 1 9 .7 0 to 3 2 0 .7 0 ): D A F S 1 0 _ 1 .D \ d a ta .m s
1 0 0 0 0
0
T im e - - >
A b u n d a n c e
1 0 .0 0
1 5 .0 0
2 0 .0 0
2 5 .0 0
3 0 .0 0
3 5 .0 0
4 0 .0 0
4 5 .0 0
5 0 .0 0
Io n 3 1 8 .0 0 (3 1 7 .7 0 to 3 1 8 .7 0 ): D A F S 1 0 _ 1 .D \ d a ta .m s
1 0 .0 0
1 5 .0 0
2 0 .0 0
2 5 .0 0
3 0 .0 0 3 5 .0 0
4 0 .0 0
4 5 .0 0
5 0 .0 0
Io n 3 1 6 .0 0 (3 1 5 .7 0 to 3 1 6 .7 0 ): D A F S 1 0 _ 1 .D \ d a ta .m s
1 0 .0 0
1 5 .0 0
2 0 .0 0
2 5 .0 0
3 0 .0 0 3 5 .0 0
4 0 .0 0
4 5 .0 0
5 0 .0 0
Io n 3 1 5 .0 0 (3 1 4 .7 0 to 3 1 5 .7 0 ): D A F S 1 0 _ 1 .D \ d a ta .m s
1 0 .0 0
1 5 .0 0
2 0 .0 0
2 5 .0 0
3 0 .0 0
3 5 .0 0
4 0 .0 0
4 5 .0 0
5 0 .0 0
Io n 3 1 4 .0 0 (3 1 3 .7 0 to 3 1 4 .7 0 ): D A F S 1 0 _ 1 .D \ d a ta .m s
1 0 .0 0
1 5 .0 0
2 0 .0 0
2 5 .0 0
3 0 .0 0
3 5 .0 0
4 0 .0 0
4 5 .0 0
5 0 .0 0
Io n 3 1 2 .0 0 (3 1 1 .7 0 to 3 1 2 .7 0 ): D A F S 1 0 _ 1 .D \ d a ta .m s
1 0 0 0 0
0
T im e - - >
A b u n d a n c e
1 0 0 0 0
0
T im e - - >
A b u n d a n c e
1 0 0 0 0
0
T im e - - >
A b u n d a n c e
1 0 0 0 0
0
T im e - - >
A b u n d a n c e
1 0 0 0 0
T im e - - >
0
1 0 .0 0
1 5 .0 0
2 0 .0 0
2 5 .0 0
3 0 .0 0
3 5 .0 0
4 0 .0 0
4 5 .0 0
5 0 .0 0
Рисунок 2.3 – Хроматограммы раствора ДАФС-25 в хлороформе, записанные по ионам с m/z = 320, 318,
316, 315, 314, 312 (концентрация – 1 мг/мл)
Известно, что в присутствии некоторых многоклеточных грибов из препарата
ДАФС-25 может образовываться ацетофенон, который может получиться только при
восстановлении исходного субстрата, поэтому мы решили разработать способ определения указанного вещества в биологических объектах. Наиболее характерными
ионами в масс-спектрах ацетофенона являются ионы с m/z = 77, 105 и 120. Однако
ион 77 характерен для многих других соединений, поэтому мы решили записать хроматограммы по ионам 105 и 120 и сравнить их интенсивности. В результате было доказано образование ацетофенона (рисунок 2.4).
Однако метод ГХ/МС не позволяет определить количественное содержание
ДАФС-25 и его микроколичества в исследуемой смеси из-за слабой интенсивности
сигналов, поэтому для установления его концентрации был проведен анализ бензольных вытяжек и среды методом ВЭЖХ с УФ детектором (рисунок 2.5). Первоначально
был построен калибровочный график.
8
Abundance
I o n 1 0 5 . 0 0 ( 1 0 4 . 7 0 t o 1 0 5 . 7 0 ): 1 2 0 2 D R _ 2 . D \ d a t a . m s
4000
3000
2000
1000
0
5 .0 0
6 .0 0
7 .0 0
8 .0 0
9 .0 0
1 0 .0 0
1 1 .0 0
1 2 .0 0
1 3 .0 0
1 4 .0 0
1 5 .0 0
1 6 .0 0
1 7 .0 0
1 8 .0 0
1 6 .0 0
1 7 .0 0
1 8 .0 0
T im e -- >
Abundance
I o n 1 2 0 . 0 0 ( 1 1 9 . 7 0 t o 1 2 0 . 7 0 ): 1 2 0 2 D R _ 2 . D \ d a t a . m s
4000
3000
2000
1000
0
5 .0 0
T im e -- >
6 .0 0
7 .0 0
8 .0 0
9 .0 0
1 0 .0 0
1 1 .0 0
1 2 .0 0
1 3 .0 0
1 4 .0 0
1 5 .0 0
Рисунок 2.4 – Хроматограммы на основе ионов с m/z = 105 и 120
бензольных вытяжек из среды RPMI-1640 с ДАФС-25 после 30 минут брожения
Анализ питательной среды методом ВЭЖХ с УФ детектором показал наличие
ДАФС-25 (рисунок 2.5).
Рисунок 2.5 – Хроматограмма среды RPMI-1640 с ДАФС-25 в присутствии Saccharomyces cerevisiaе
через 30 минут
Рисунок 2.7 – Образование наночастиц селена
Рисунок 2.6 – Образование микро- и наночастиц
селена
9
Для выявления образования элементарного селена было решено использовать электронную микроскопию.После экстракции бензольные вытяжки, полученные из продукта, подвергались анализу при помощи электронной микроскопии на приборе Zeiss
марки Libra 120. В результате установлено образование микро- и наночастиц, содержащих селен (рисунки 2.6, 2.7).
В результате удалось точно идентифицировать ацетофенон и элементарный селен в
виде микро- и наночастиц.
2.2 Разработка методики определения «Селенохромена» и продуктов его
преобразования в биологических объектах, образующихся
в присутствии Saccharomyces cerevisiae
Методы контроля протекания процессов мы решили использовать такие же, как и в
предыдущем подразделе. Однако «Селенохромен» при анализе методом ГХ/МС разлагается на инжекторе хроматографа с образованием сложной смеси продуктов (рисунок 2.8). Основным продуктом при этом на хроматограмме является соединение,
полученное при элиминировании элементарного селена. При этом сигналы молекулярного иона имеют довольно слабую интенсивность по сравнению с ионами фрагментов (рисунок 2.9).
A bundance
S c a n 1 4 4 7 ( 2 0 . 8 9 4 m in ) : D R _ 8 . D
320
50000
45000
40000
35000
30000
25000
241
20000
91
207
15000
151
10000
191
115
400
281
51
5000
73
131
167
224
302
265
336 355
0
40
60
80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400
m /z - - >
Рисунок 2.8 – Хроматограмма «Селенохромена»
Рисунок 2.9 – Масс-спектр «Селенохромена»
Мы предположили, что в данной серии экспериментов будут образовываться продукты восстановления исходного соединения следующего строения:
Ph
Ph
Se
ì .â.
404 äëÿ Se80
Ph
Ph
Ph
ì .â.
324
Ph
ì .â.
326
Карбоциклические соединения в сложной смеси продуктов идентифицировать не
удалось. Соединение с молекулярным весом 324 не было представлено на хроматограмме, а соединение с молекулярным весом 326 ретушировалось большим количеством сигналов (рисунок 2.10) (аналогичное явление наблюдалось на всех хроматограммах).
Abundance
I o n 3 2 6 . 0 0 (3 2 5 . 7 0 t o 3 2 6 . 7 0 ): O T _ 4 6 . D \ d a t a . m s
400
300
200
100
0
5 .0 0
1 0 .0 0
1 5 .0 0
2 0 .0 0
2 5 .0 0
3 0 .0 0
3 5 .0 0
4 0 .0 0
4 5 .0 0
5 0 .0 0
5 5 .0 0
5 0 .0 0
5 5 .0 0
T im e -->
Abundance
I o n 3 2 4 . 0 0 (3 2 3 . 7 0 t o 3 2 4 . 7 0 ): O T _ 4 6 . D \ d a t a . m s
400
300
200
100
0
5 .0 0
T im e -->
1 0 .0 0
1 5 .0 0
2 0 .0 0
2 5 .0 0
3 0 .0 0
3 5 .0 0
4 0 .0 0
4 5 .0 0
Рисунок 2.10 – Хроматограммы, записанные по ионам с m/z 326 и 324
Одним из вероятных продуктов может быть 2,4-дифенил-7,8-бензо-3,4,4а,5,6,10bгексагидро-2Н-селенохромен, поэтому было решено синтезировать указанное соединение из «Селенохромена» в качестве свидетеля.
При анализе данных ГХ/МС было решено записывать хроматограммы с использованием программы “Extract Ion Chromatograms” по молекулярным ионам
2,4-дифенил-7,8-бензо-5,6-дигидроселенохромена с m/z 404 и 402 (для изотопов Se80 и
Se78), интенсивность которых должна соотноситься как 2:1. Спустя 60 мин. после
начала эксперимента, были обнаружены сигналы гексагидроселенохромена (рисунки
2.11, 2.12).
A b u n d a n c e
A bundanc e
Io n 4 0 2 .0 0 (4 0 1 .7 0 to 4 0 2 .7 0 ): O T _ 4 9 .D \ d a ta .m s
Io n 4 0 2 .0 0 (4 0 1 .7 0 to 4 0 2 .7 0 ): O T _ 4 9 .D \ d a ta .m s
250
2 5 0
200
2 0 0
150
1 5 0
1 0 0
100
5 0
50
0
0
2 7 .6 5
2 7 .2 0 2 7 .4 0 2 7 .6 0 2 7 .8 0 2 8 .0 0 2 8 .2 0 2 8 .4 0 2 8 .6 0 2 8 .8 0 2 9 .0 0 2 9 .2 0 2 9 .4 0 2 9 .6 0 2 9 .8 0
2 7 .7 0
2 7 .7 5
2 7 .8 0
2 7 .8 5
2 7 .9 0
2 7 .9 5
T im e - - >
A bundanc e
T im e - - >
A b u n d a n c e
Io n 4 0 4 .0 0 (4 0 3 .7 0 to 4 0 4 .7 0 ): O T _ 4 9 .D \ d a ta .m s
Io n 4 0 4 .0 0 (4 0 3 .7 0 to 4 0 4 .7 0 ): O T _ 4 9 .D \ d a ta .m s
250
2 5 0
200
2 0 0
150
1 5 0
1 0 0
100
5 0
50
0
0
2 7 .6 5
2 7 .2 0 2 7 .4 0 2 7 .6 0 2 7 .8 0 2 8 .0 0 2 8 .2 0 2 8 .4 0 2 8 .6 0 2 8 .8 0 2 9 .0 0 2 9 .2 0 2 9 .4 0 2 9 .6 0 2 9 .8 0
T im e - - >
Рисунок 2.11 – Хроматограммы, записанные по ионам
с m/z 402 и 404 через 60 минут
после начала эксперимента
2 7 .7 0
2 7 .7 5
2 7 .8 0
2 7 .8 5
2 7 .9 0
2 7 .9 5
T im e - - >
Рисунок 2.12 – Фрагмент хроматограммы,
записанный по ионам с m/z 402 и 404 через 60 минут
после начала эксперимента
Через 120 мин. гексагидроселенохромен в пробе не был обнаружен. Это можно
объяснить либо слабой общей интенсивностью сигнала данной пробы, вызванной
сбоем в ее подаче, которые характеризуют общую интенсивность сигнала либо тем,
что данное соединение расходуется при протекании эксперимента.
Однако метод ГХ/МС не позволяет определить количественное содержание селенсодержащих соединений в исследуемой смеси, поэтому для установления данных параметров был проведен анализ бензольных вытяжек и самой питательной среды методом ВЭЖХ с УФ детектором (рисунок 2.13).
11
Рисунок 2.13 - Хроматограмма бензольных вытяжек гексагидроселенохромена в присутствии
Saccharomyces cerevisiaе
Для подтверждения полученных результатов нами были предприняты попытки
провести аналогичный эксперимент с 2,4-дифенил-7,8-бензо-3,4,4а,5,6,10bгексагидро-2Н-селенохроменом, однако достоверных результатов в данном случае
получить не удалось из-за низкой чувствительности приборов.
Аналогичные результаты получены при проведении экспериментов с перхлоратами
2,4-дифенил-7,8-бензо-5,6-дигидроселенохромилия и 2-(п-метоксифенил)-4-фенил7,8-бензо-5,6-дигидроселенохромилия.
Таким образом, показано, что усвоение селенсодержащих соединений в присутствии Saccharomyces cerevisiaе происходит при восстановлении органической части
молекулы.
2.3 Разработка методики определения 9-фенил-симм.октагидроселеноксантена
и продуктов его преобразования в биологических объектах, образующихся
в присутствии Saccharomyces cerevisiae
Для исследования трансформации 9-фенил-симм.октагидроселеноксантена (препараты: «СеленАктив», «Селенес») в присутствии Saccharomyces cerevisiae необходимо
было разработать методики определения его и продуктов его переработки.
Ph
Se
При анализе 9-фенил-симм.октагидроселеноксантена методом ГХ/МС (рисунки 2.14, 2.15) было обнаружено, что молекулярный ион имеет значительно меньшую
интенсивность, чем его фрагмент, полученный после элиминирования фенильного
заместителя.
Следует отметить, что в определенных условиях может происходить изомеризация
селеноксантена с миграцией двойной связи, о чем свидетельствует масс-спектр одной
из микропримесей действующего вещества. Об этом говорит и несколько иная фрагментация субстрата, которая осуществляется с отрывом SeH радикала и образованием
катиона с m/z = 249 (рисунок 2.16).
12
A bunda nc e
Abundanc e
T IC : I_ 0 0 3 1 .D \ d a ta .m s
Sc an 1585 (24.251 min): I_0031.D \ data.ms
253
2e+0 7
2000000
1 .9 e + 0 7
1 .8 e + 0 7
1800000
1 .7 e + 0 7
1 .6 e + 0 7
1600000
1 .5 e + 0 7
1 .4 e + 0 7
1400000
1 .3 e + 0 7
1200000
1 .2 e + 0 7
1 .1 e + 0 7
1000000
1e+0 7
900 0000
800000
800 0000
330
700 0000
600000
600 0000
500 0000
400000
400 0000
91
77
300 0000
115 129
165
51
200000
152
200 0000
100 0000
0
1 0 .0 0
1 5 .0 0
2 0 .0 0
2 5 .0 0
3 0 .0 0
3 5 .0 0
40
4 0 .0 0
m/ z-->
T im e - - >
178
191 207
64
60
80
301
221 239
273 287
315
100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320
Рисунок 2.15 – Масс-спектр
9-фенил-симм.октагидроселеноксантена
Рисунок 2.14 – Хроматограмма
9-фенил-симм.октагидроселеноксантена
A b u n d a n c e
Abundance
Io n
S c a n 1 6 2 6 (2 4 . 7 4 8 m in ): I _ 0 0 3 1 . D \ d a t a . m s
249
3 3 4 .0 0
(3 3 3 .7 0
to
3 3 4 .7 0 ): O T _ 4 4 .D \ d a ta .m s
2 4 .9 0
2 4 .9 2
2 4 .9 4
2 5 2 .0 0
(2 5 1 .7 0
to
2 4 .9 0
2 4 .9 2
2 4 .9 4
3 0 0
45000
2 5 0
2 0 0
40000
1 5 0
35000
1 0 0
5 0
30000
0
2 4 .8 4
25000
2 4 .8 6
2 4 .8 8
2 4 .9 6
2 4 .9 8
2 5 .0 0
2 5 .0 2
2 5 .0 4
2 5 .0 6
2 5 .0 2
2 5 .0 4
2 5 .0 6
T im e - - >
A b u n d a n c e
91
Io n
20000
2 5 2 .7 0 ): O T _ 4 4 .D \ d a ta .m s
3 0 0
141
115
330
2 5 0
15000
128
77
207
2 0 0
165
10000
1 5 0
179
51
5000
1 0 0
193
221
235
64
273
0
40
m / z -->
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
287
280
5 0
301
300
320
0
2 4 .8 4
T im e - - >
Рисунок 2.16 – Масс-спектр изомера
9-фенил.октагидроселеноксантена
2 4 .8 6
2 4 .8 8
2 4 .9 6
2 4 .9 8
2 5 .0 0
Рисунок 2.17 – Хроматограммы, записанные по
ионам: 334 и 252 (время процесса – 120 мин.)
Как видно из рисунка 2.17, соединение с молекулярной массой 252 практически
невозможно обнаружить из-за очень больших шумов, связанных с биологическим
объектом, поэтому было решено искать соединение с молекулярным весом 256. Молекулярный ион данного соединения должен подвергаться фрагментации с отрывом
циклогексанового радикала и образованием иона с m/z 173. Однако согласно правилу
Мак-Лаферти дополнительно должен образовываться ион с m/z=174. Совпадение по
времени удерживания наблюдается для ионов с m/z: 256, 174, 173 при 25,52 мин. (рисунок 2.18). При времени процесса 10, 30 и 60 мин. данного соединения обнаружить
не удалось.
При проведении процесса в среде молока наличие продуктов восстановления субстрата можно только предполагать из-за значительных шумовых сигналов, которые
не дают возможности выделить индивидуальные сигналы соединений.
Таким образом, была разработана методика определения 9-фенил-симм.октагидроселеноксантена и 9-фенил-пергидроселеноксантена.
A
b
u
n
d
a
n
c
e
I o
4
5
0
4
0
0
3
5
0
3
0
0
2
5
0
2
0
0
1
5
0
1
0
0
5
0
n
2
5
6
. 0
0
( 2
5
5
. 7
0
t o
2
5
6
. 7
0
) :
O
T
_
4
4
. D
\
d
a
t a
. m
s
5
. 8
. m
s
5
. 8
. m
s
5
. 8
0
2
T
A
im e - - >
b u n d a
n
c
4
. 4
0
2
4
. 6
0
2
4
. 8
0
2
5
. 0
0
2
5
. 2
0
2
5
. 4
0
2
5
. 6
0
2
0
2
6
. 0
0
2
6
. 2
0
0
2
6
. 0
0
2
6
. 2
0
0
2
6
. 0
0
2
6
. 2
0
e
I o
4
5
0
4
0
0
3
5
0
3
0
0
2
5
0
2
0
0
1
5
1
0
0
5
0
n
1
7
4
. 0
0
( 1
7
3
. 7
0
t o
1
7
4
. 7
0
) :
O
T
_
4
4
. D
\
d
a
t a
0
0
2
T
A
im e - - >
b u n d a
n
c
4
. 4
0
2
4
. 6
0
2
4
. 8
0
2
5
. 0
0
2
5
. 2
0
2
5
. 4
0
2
5
. 6
0
2
e
I o
4
5
0
4
0
0
3
5
0
3
0
0
2
5
0
2
0
0
1
5
0
1
0
0
5
0
n
1
7
3
. 0
0
( 1
7
2
. 7
0
t o
1
7
3
. 7
0
) :
O
T
_
4
4
. D
\
d
a
t a
0
2
T
im
e
- - >
4
. 4
0
2
4
. 6
0
2
4
. 8
0
2
5
. 0
0
2
5
. 2
0
2
5
. 4
0
2
5
. 6
0
2
Рисунок 2.18 – Хроматограммы записанные по ионам: 226, 174 и 173 (время процесса – 120 мин.)
2.4 Разработка методики определения селенорганических соединений
с двумя атомами, имеющими изотопный состав, и продуктов их преобразования
в биологических объектах
Нами в качестве объектов исследования были выбраны: 2-фенил-4-(п-бромфенил)5,6,7,8-тетрагидро-4Н-селенохромен 1 - (3-(4-бромфенил)-4,5,6, 7-тетрагидробензо[b]селенофен-2-ил)(фенил)метанон 2 и (3-фенил-4,5,6,7-тетрагидробензо-[b]селенофен-2-ил)(п-хлорфенил)метанон 3, которые содержат комбинации: селен-бром и
селен-хлор.
C6H4Br-p
Ph
C6H4Br-p
Se
1
Ph
Se
COPh
Se
COC6H4Cl-p
3
2
Так, природные элементы имеют различный изотопный состав: селен содержит
6 изотопов с содержанием: Se74 – 0,87 %, Se76 – 9,02 %, Se77 – 7,58 %, Se78 – 23,52 %,
Se80 – 49,82 %, Se82 – 9,19 %; бром содержит два изотопа – Br79 – 50,56 %, Br81 –
49,44 % и хлор также содержит два изотопа – Cl35 – 75,77 %, Cl37 – 24,23 %.
Первоначально исследовалось соединение 1 в трех питательных средах:
RPMI-1640, молоко и раствор глюкозы. Наиболее достоверной была информация, полученная из экспериментов в растворе глюкозы, из-за меньшего количества дополнительных сигналов на хроматограммах и в масс-спектрах.
Так, через 10 и 30 мин. после начала эксперимента удалось обнаружить исходный
селенохромен по сигналам максимальной интенсивности молекулярных ионов (рисунок 2.19) и их соотношению.
При восстановлении селенохромена 1 наиболее вероятно могут образоваться следующие соединения:
14
C6H4Br-p
Ph
Se
m/z = 428, 430, 431, 432,
433, 434, 436, 438
C6H4Br-p
C6H4Br-p
Ph
Ph
m/z = 354, 356
m/z = 356, 358
A b u n d a n c e
Io n
4 3 2 .0 0
(4 3 1 .7 0
to
4 3 2 .7 0 ): O T _ 1 3 .D \ d a ta .m s
2 0 0 0
1 5 0 0
1 0 0 0
5 0 0
0
1 8 .5 0
1 9 .0 0
1 9 .5 0
2 0 .0 0
2 0 .5 0
2 1 .0 0
2 1 .5 0
2 2 .0 0
2 2 .5 0
2 3 .0 0
2 3 .5 0
2 4 .0 0
2 4 .5 0
2 4 .0 0
2 4 .5 0
T im e - - >
A b u n d a n c e
Io n
4 3 0 .0 0
(4 2 9 .7 0
to
4 3 0 .7 0 ): O T _ 1 3 .D \ d a ta .m s
2 0 0 0
1 5 0 0
1 0 0 0
5 0 0
0
1 8 .5 0
1 9 .0 0
1 9 .5 0
2 0 .0 0
2 0 .5 0
2 1 .0 0
2 1 .5 0
2 2 .0 0
2 2 .5 0
2 3 .0 0
2 3 .5 0
T im e - - >
Рисунок 2.19 – Хроматограммы, записанные по молекулярным ионам: 430 и 432 (время процесса – 30 мин.)
При этом даже при потере атома селена в молекуле будет оставаться изотопная
метка брома. Указанные выше продукты реакции не были обнаружены после 60 мин.
эксперимента. И только через 120 мин. в растворе глюкозы был достоверно идентифицирован продукт с двойным молекулярным ионом с m/z = 354 и 356 (рисунок 2.20).
Abundance
Io n 3 5 4 .0 0 (3 5 3 .7 0 t o 3 5 4 . 7 0 ): O T _ 1 5 .D \ d a ta .m s
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
2 6 .7 5
T im e - - >
Abundance
2 6 .8 0
2 6 .8 5
2 6 .9 0
2 6 .9 5
2 7 .0 0
2 7 .0 5
2 7 .1 0
2 7 .0 5
2 7 .1 0
Io n 3 5 6 .0 0 (3 5 5 .7 0 t o 3 5 6 . 7 0 ): O T _ 1 5 .D \ d a ta .m s
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
T im e - - >
2 6 .7 5
2 6 .8 0
2 6 .8 5
2 6 .9 0
2 6 .9 5
2 7 .0 0
Рисунок 2.20 – Хроматограммы, записанные по молекулярным ионам: 354 и 356 (время процесса – 120 мин.)
15
При исследовании биотрансформации соединений 2 и 3 следовало учитывать, что
селенофеновый фрагмент является ароматическим, поэтому должен трудно терять
атом селена, а атом галогена у фенильного фрагмента трудно поддается восстановлению.
В результате проведенных экспериментов подтверждена трудность проведения подобных процессов.
2.5 Трансформация диацетофенонилселенида (препарата ДАФС-25)
в присутствии культуры Saccharomyces cerevisiae
На данный момент установлено, что ветеринарный препарат ДАФС-25 (диацетофенонилселенид) может применяться не только для восполнения дефицита селена в
организме человека и животных, но и как добавка к различным продуктам питания,
часто включающим в свой состав микроорганизмы (кефир, ряженка и т.д.). Однако в
литературных источниках отсутствуют данные о продуктах взаимодействия препарата ДАФС-25 с микроорганизмами, что может привести к тяжелым последствиям, так
как продукты биотехнологической переработки препарата могут обладать высокой
токсичностью (в том числе генетической). Поэтому в качестве объекта исследования
были выбраны: препарат ДАФС-25 в присутствии Saccharomyces cerevisiaе в различных питательных средах (молоко, RPMI-1640, виноградный сок) для дальнейшего
установления продуктов взаимодействия данного соединения с модельными микроорганизмами.
Кроме того, в последние годы внимание исследователей привлекают проблемы переработки селенита натрия при помощи Saccharomyces cerevisiaе. Однако высокая
токсичность данного неорганического соединения селена оказывает негативное влияние на биотехнологический процесс, поэтому использование малотоксичных органических соединений селена в данном аспекте является весьма актуальной задачей.
Для получения более достоверных результатов в качестве питательных сред было
решено использовать две стандартные питательные среды – RPMI-1640 и раствор
глюкозы, и две природные – молоко и виноградный сок.
2.5.1 Трансформация диацетофенонилселенида в присутствии культуры
Saccharomyces cerevisiae в питательной среде RPMI-1640
В соответствии с целью исследования нами была предпринята попытка установления продуктов взаимодействия диацетофенонилселенида с Saccharomyces cerevisiaе.
В качестве среды использовалась RPMI-1640. В результате проведенных исследований установлено, что препарат ДАФС-25 под воздействием Saccharomyces cerevisiaе в
среде RPMI-1640 преобразуется в наночастицы селена размером 15 - 50 нм (и микрочастицы). Методом ГХ/МС определено присутствие ацетофенона, который отсутствует в продуктах метаболизма микроорганизмов и изначальной питательной среде.
Выше изложенное позволяет сделать вывод о восстановлении препарата ДАФС-25 в
данных условиях до ацетофенона и наночастиц селена.
Анализ ВЭЖХ с УФ детектором показал снижение концентрации исходного диацетофенонилселенида (ДАФС-25) в реакционной среде через 30 мин. после добавления
Saccharomyces cerevisiaе на 87 %, что позволяет говорить о высокой скорости переработки препарата ДАФС-25.
2.5.2 Трансформация диацетофенонилселенида в присутствии культуры
Saccharomyces cerevisiae в питательной среде молока
Для установления влияния среды на преобразование ДАФС-25 Saccharomyces cere16
visiaе нами была заменена питательная среда на молоко. Это позволяет исключить
влияние питательной среды на процесс преобразования ДАФС-25 в наночастицы селена и ацетофенон.
В результате анализа электронной микроскопии Zeiss марки Libra 120 установлено
образование наночастиц, содержащих селен (рисунок 2.21). При анализе бензольных
вытяжек методом ГХ/МС установлено, что в молоке уже через 30 мин. данный препарат был переработан микроорганизмами в ацетофенон, что подтверждено соответствующими хроматограммами (рисунок 2.22).
A
b
u
n
d
a
n
c
e
6
5
0
0
6
0
0
0
5
5
0
0
5
0
0
0
4
5
0
0
4
0
0
0
3
5
0
0
3
0
0
0
2
5
0
0
2
0
0
0
1
5
0
0
1
0
0
0
5
0
I o
n
1
0
I o
n
1
2
5
. 0
0
( 1
0
4
. 7
( 1
1
9
. 7
0
t o
1
0
5
. 7
0
) :
D
2
5
. 0
0
1
2
0
. 7
0
) :
D
2
5
. 0
0
R
_
1
. D
R
_
1
. D
\
d
a
. 0
0
d
a
. 0
0
t a
. m
s
t a
. m
s
0
0
5
T
A
im e - - >
b u n d a
n
c
. 0
0
1
0
. 0
0
1
5
. 0
0
2
0
. 0
0
3
0
3
5
. 0
0
3
5
. 0
0
e
6
5
0
0
6
0
0
0
5
5
0
0
5
0
0
0
4
5
0
0
4
0
0
0
3
5
0
0
3
0
0
0
2
5
0
0
2
0
0
0
1
5
0
0
1
0
0
0
5
0
0
. 0
0
0
t o
\
0
0
Рисунок 2.21 – Образование наночастиц селена
5
T
im
e
. 0
0
1
0
. 0
0
1
5
. 0
0
2
0
. 0
0
3
0
- - >
Рисунок 2.22 – Хроматограммы на основе молекулярных ионов с m/z=105,120 бензольных вытяжек из молочной среды с ДАФС-25 после 30 мин брожения
Следует отметить, что при всей идентичности переработки препарата ДАФС-25 в
присутствии культуры Saccharomyces cerevisiae в питательных средах RPMI-1640 и
молоко имеются и некоторые отличия. Так, в среде молока образуются наночастицы
несколько меньших размеров, чем в среде RPMI-1640.
Однако метод ГХ/МС не позволяет определить количественное содержание
ДАФС-25 в исследуемой смеси, в связи с чем были записаны хроматограммы методом ВЭЖХ с УФ детектором, которые показали, что скорость превращения препарата
в молоке приблизительно равна скорости его переработки в среде RPMI-1640.
В результате проведенных исследований установлено, что ДАФС-25 под воздействием Saccharomyces cerevisiaе в среде молока также преобразуется с образованием
наночастиц селена и ацетофенона, что подтверждено ГХ/МС и ВЭЖХ с УФ детектором.
2.5.3 Трансформация диацетофенонилселенида в присутствии культуры
Saccharomyces cerevisiae в виноградном соке
Для установления влияния на преобразование ДАФС-25 Saccharomyces cerevisiaе
нами была предложена такая питательная среда как виноградный сок, который представляет собой более сложную смесь аминокислот и белков.
При анализе бензольных вытяжек при помощи электронной микроскопии были обнаружены наночастицы селена, а при помощи ГХ/МС – ацетофенона.
В данном случае основными продуктами переработки препарата ДАФС-25 также
являются продукты его восстановления: ацетофенон и наночастицы, содержащие селен, которые по размерам уступали наночастицам, полученным в среде RPMI-1640.
При этом образования микрочастиц не наблюдалось.
17
2.5.4 Трансформация диацетофенонилселенида в присутствии культуры
Saccharomyces cerevisiae в растворе глюкозы
Для выявления влияния среды на преобразование препарата ДАФС-25 Saccharomyces cerevisiaе использовалась еще одна питательная среда – раствор глюкозы.
При анализе бензольных вытяжек при помощи электронной микроскопии были
также обнаружены наночастицы селена. При анализе указанных вытяжек методом
ГХ/МС получены хроматограммы, которые показывали на наличие сложной смеси
продуктов, содержащей ацетофенон (доказано при применении программы “Extract
Ion Chromatograms”).
Таким образом, установлено, что продуктами переработки ДАФС-25, являются
ацетофенон и наночастицы селена, что подтверждает восстановление указанного селенорганического соединения в различных питательных средах. При этом размеры
наночастиц были приблизительно равны размерам частиц, полученных в среде виноградного сока.
2.6 Трансформация «Селенохромена» в присутствии культуры
Saccharomyces cerevisiae
После того, как было выяснено, что при трансформации препарата ДАФС-25 в
присутствии Saccharomyces cerevisiae происходит его восстановление, было решено
подвергнуть подобной процедуре другие селенорганические соединения. Мы решили
исследовать аналогичным образом новое соединение – 2,4-диарил-7,8-бензо-5,6дигид-ро-4Н-селенохромен («Селенохромен»), которое проявило себя как средство
для снижения тяжести отравления тяжелыми металлами и антиоксидант. Кроме того,
для этого соединения нами разработан способ получения его мицеллярных растворов,
которые можно использовать как в качестве инъекционных форм в медицине и ветеринарии, так и для биотехнологической трансформации препарата.
Следует отметить, что соответствующий гексагидроселенохромен был обнаружен
только на 60-й минуте после начала эксперимента. На 10-, 30- и 120-й минутах эксперимента данное соединение обнаружить не удалось. Указанное свидетельствует о
том, что первоначально идет восстановление органической части молекулы, однако
одновременно происходит усвоение гексагидроселенохромена, причем скорость его
усвоения несколько ниже, чем скорость восстановления органической части молекулы.
Аналогичные результаты получены при проведении экспериментов с перхлоратами
2,4-дифенил-7,8-бензо-5,6-дигидроселенохромилия 2-(п-метоксифенил)-4-фенил-7,8бензо-5,6-дигидроселенохромилия.
Таким образом, показано, что усвоение селенсодержащих соединений в присутствии Saccharomyces cerevisiaе происходит одновременно с процессом восстановлении органической части молекулы.
2.7 Трансформация 9-фенил-симм.октагидроселеноксантена в присутствии
культуры Saccharomyces cerevisiae
После исследования трансформации препаратов ДАФС-25 и «Селенохромен» в
присутствии Saccharomyces cerevisiae мы решили провести подобные эксперименты с
9-фенил-симм.октагидроселеноксантеном («Селен-Актив», «Селенес», «Селенопиран»). Эксперименты проводили в двух средах: молоке и RPMI-1640. Бензольные вытяжки после 10-, 30-, 60- и 120-й минут анализировали при помощи метода ГХ/МС.
По данным ГХ/МС октагидроселеноксантен удалость обнаружить в пробах биотехнологической переработки, только через 10 и 30 мин. после начала эксперимента.
18
При биотехнологической переработке 9-фенил-симм.октагидроселеноксантена (по
аналогии с препаратом «Селенохромен») можно было ожидать протекание процесса
его восстановления с образованием соответствующего пергидроселеноксантена. Через 120 мин. после начала эксперимента методом ГХ/МС нами был обнаружен пергидроселеноксантен в виде двух изомеров.
Следует отметить, что указанный процесс отличается и меньшей стереоселективностью по сравнению с процессом восстановления «Селенохромена», о чем свидетельствует образование двух, а не одного изомеров.
Из вышеизложенного следует, что разница в скорости процесса восстановления
9-фенил-симм.октагидроселеноксантена и процеса усвоения пергидроселеноксантена
гораздо больше, чем в случае «Селенохромена».
При анализе хроматограмм и масс-спектров пробы через 120 мин. после начала
эксперимента был обнаружен дициклогексилфенилметан – продукт элиминирования
селена и полного восстановления органической части молекулы пергидроселеноксантена:
Ph
При проведении процесса в среде молока наличие продуктов восстановления субстрата можно только предполагать из-за значительных шумовых сигналов, которые
не дают возможности выделить индивидуальные сигналы соединений.
Таким образом, показано, что при усвоении 9-фенил-симм.октагидроселеноксантена происходит восстановление его до пергидроселеноксантена и затем до фенилдициклогексилметана, то есть продукта элиминирования селена и полного восстановления органической части молекулы.
2.8 Трансформация тетрагидроселенохроменов и их производных
в присутствии культуры Saccharomyces cerevisiae
До 2015 г. селенадекалины (октагидроселенохромены) и их дегидрированые по
гетероциклическому фрагменту производные (5,6,7,8-тетрагидро-4Н-селенохромены)
известны не были, поэтому представлялось интересным изучить их трансформацию в
присутствии Saccharomyces cerevisiae.
В качестве объектов исследования выбраны: 2-фенил-4-(п-бромфенил)-5,6,7,8-тетрагидро-4Н-селенохромен 1 и продукты их окисления – (3-(4-бромфенил)-4,5,6,7-тетрагидробензо-[b]селенофен-2-ил)(фенил)метанон 2 и (3-фенил-4,5,6,7-тетрагидробензо-[b]селенофен-2-ил)(п-хлорфенил)метанон 3:
C6H4Br-p
C6H4Br-p
Se
Ph
1
Se
Ph
COPh
2
Se
COC6H4Cl-p
3
Следует отметить, что соединение 2 является продуктом окисления соединения 1.
При исследовании биотрансформации соединений 2 и 3 следовало учитывать, что
селенофеновый фрагмент является ароматическим, поэтому должен трудно терять
атом селена, а атом галогена у фенильного фрагмента трудно поддается восстановлению. В результате проведенных экспериментов подтверждена трудность проведения
19
подобных процессов.
При исследовании биотрансформации соединения 1 использованы три питательных среды: RPMI-1640, молоко и раствор глюкозы. Наиболее достоверной была информация, полученная из экспериментов в растворе глюкозы, из-за меньшего количества дополнительных сигналов на хроматограммах и в масс-спектрах.Так, через 10 и
30 мин. после начала эксперимента удалось обнаружить исходный селенохромен по
сигналам максимальной интенсивности молекулярных ионов и их соотношению.
При биотрансформации соединения 1 могли возникнуть различные продукты восстановления органической части молекулы: селенадекалин (полностью восстановленный продукт) и бицикло[4.3.0]нонан. В реакционной среде через 120 мин. после начала эксперимента был обнаружен только соответствующий бицикло[4.3.0]нонан, что
может говорить как о различиях в механизмах восстановления, так и о недостаточной
эффективности используемых приборов.
Таким образом, доказано, что биотрансформация селенорганических соединений в
присутствии Saccharomyces cerevisiaе сопровождается восстановлением органической
части молекулы.
2.9 Трансформация селенита натрия в присутствии культуры
Saccharomyces cerevisiae
Для получения более детальной картины преобразования селенорганических соединений в нано- и микрочастицы нами были проведены аналогичные эксперименты
с селенитом натрия в средах RPMI и молока. Методом ГХ/МС было продемонстрировано ожидаемое отсутствие ацетофенона (для сравнения с препаратом ДАФС-25), а
при исследовании бензольных вытяжек на просвечивающем электронном микроскопе
Zeiss Libra 120 установлено образование частиц, более всего похожих на вытянутые
кристаллы селена размером около 500 нм (среда RPMI-1640).
Таким образом, показано, что селенит натрия может восстанавливаться в присутствии Saccharomyces cerevisiae, однако его восстановление протекает по несколько
другому механизму с образованием частиц селена, имеющих другую форму и размеры.
Разработка технологии получения растворимой в воде формы препарата
«Селенохромен»
В качестве удобной для применения формы селенорганического соединения
2,4-дифенил-7,8-бензо-5,6-дигидроселенохромена (в качестве добавки в корма, что
дает хорошее распределение малых количеств селенорганического препарата в большом объеме, питьевую воду и в виде инъекционной формы) является его водорастворимая форма. Известно, что «Селенохромен» может использоваться как средство для
лечения и профилактики отравлений соединениями тяжелых металлов. Применение
растворимого в воде селенита натрия осложнено его высокой токсичностью (LD50 =
7 - 9 мг/кг).
Нами разработан инъекционный препарат на основе 2,4-дифенил-7,8-бензо-5,6дигидроселенохромена, который обладает высокой биологической активностью и
низкой токсичностью. В данном препарате применяются фармакопейные растворители и ПАВ, что позволило создать стабильную мицеллярную форму на водной основе.
Препарат «Селенохромен» – гомогенный прозрачный раствор от бледно- до темножелтого цвета со слабым специфическим запахом, растворим в воде. Относительная
вязкость составляет 112,4; плотность – 1,071 г/мл; pH – 6,73.
20
Исследована острая токсичнось препарата. Было сформировано 36 групп по 10 голов нелинейных белых мышей, которым вводили внутрибрюшинно с помощью одноразовых шприцев для инъекций четыре комбинации формообразующих веществ в
следующих дозах: 14000; 13000; 12000; 11000; 10000; 9000; 7000; 6000 и 5000 мг/кг.
Схема опыта представлена в таблице 2.1.
Таблица 2.1 – Схема опыта острой токсичности компонентов различных
комбинаций
Группа
Вид, пол Кол-во животживотных ных в группе
1
мышисамцы
10
2
мышисамцы
10
3
мышисамцы
10
4
мышисамцы
10
Комбинация компонентов
Солюфор – 50 %; ТВИН-80 – 5 %,
бензиловый спирт – 1 %,
дистиллированная вода – до 100 %
Солюфор – 50 %, бензиловый спирт – 1 %,
дистиллированная вода – до 100 %
Дозы,
Объем,
кол-во мл/животное
Режим
введения
9
0,2 - 1
в/б,
однократно
9
0,2 - 1
в/б,
однократно
ТВИН-80 – 5 %,бензиловый спирт – 1 %,
дистиллированная вода – до 100 %
9
0,2 - 1
в/б,
однократно
Солюфор – 25 %, ТВИН-80 – 10 %,
бензиловый спирт – 1 %,
дистиллированная вода – до 100 %
9
0,2 - 1
в/б,
однократно
Также была изучена острая токсичность компонентов изучаемых комбинаций прототипа препарата.
На основании полученных данных статистически пробит-анализом (метод Прозоровского) определили значения LD50 и других параметров острого токсического действия компонентов всех четырех комбинаций прототипа препарата «Селенохромен».
Результаты представлены в таблице 2.2.
Результаты статистической обработки значений LD50 компонентов четырех комбинаций прототипа препарата «Селенохромен» свидетельствуют о том, что они достоверно различаются и составляют для первой комбинации компонентов –
6580,18 ± 598,13; для второй – 8192,84 ± 499,99; для третьей – 12426,19 ± 526,26 и для
четвертой комбинации – 17813,06 ± 1211,12 мг/кг массы тела. В результате указанные
комбинации можно отнести к IV классу опасности.
Таблица 2.2 – Летальные дозы компонентов комбинаций прототипа препарата
«Селенохромен»
Комбинации компонентов
LD10
LD16
LD50
LD84
LD90
LD100
препарата
(мг/кг)
(мг/кг)
(мг/кг)
(мг/кг)
(мг/кг)
(мг/кг)
Солюфор – 50 %; ТВИН-80 – 5 %,
бензиловый спирт – 1 %,
3151,65
3905,26
6580,18 ± 598,13
9255,11 10008,71 10592,57
дистиллированная вода – до 100 %
Солюфор – 50 %, бензиловый
спирт – 1 %, дистиллированная
5710,84
6256,39 8192,84 ± 499,99*
10129,28 10674,83 11097,50
вода – до 100 %
ТВИН-80 – 5 %,
бензиловый спирт – 1 %,
9053,61
9794,92 12426,19 ± 526,26*
15057,47 15798,78 16373,11
дистиллированная вода – до 100 %
Солюфор – 25 %, ТВИН-80 – 10 %,
бензиловый спирт – 1 %,
10870,80 12396,77 17813,06 ± 1211,12* 23229,35 24755,28 25937,50
дистиллированная вода – до 100 %
* тест линейности Р = 0,00987; тест параллелизма Р = 0,0121; тест равенства дисперсий Р = 0,00957,
т.е во всех случаях Р ≤ 0,05
21
Исходя из полученных результатов разработана технологическая схема получения
растворимой в воде формы препарата «Селенохромен» (рисунок 2.23).
Действующее вещество:
2,4-дифенил-7,8-бензо-5,6-дигидроселенохромен
Поверхностно-активные вещества:
ТВИН 80 (5 - 30 %)
Органический растворитель:
солюфор (10 - 50 %)
Перемешивание (10 мин при tкомн)
Бактериостатик:
бензиловый спирт (1 %)
Перемешивание (10 мин при tкомн)
Дистиллированная вода
Перемешивание (15 мин при tкомн)
Фасование и маркировка
Рисунок 2.23 – Технологическая схема основных стадий получения растворимой в воде
формы препарата «Селенохромен»
На основании полученных данных можно утверждать, что полученные мицеллярные растворы могут быть использованы в качестве селенсодержащих ветеринарных
препаратов.
3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате выполненной научно-практической работы решены все поставленные
задачи и достигнута поставленная цель. Разработаны методы анализа селенсодержащих соединений в биологических объектах. Данные методы использованы для исследования биотехнологических процессов преобразования селенорганических соединений при воздействии Saccharomyces cerevisiae. Полученные результаты исследования
положены в основу разработки современного способа получения водорастворимой
формы «Селенохромена», которая может быть использована не только в биотехнологических процессах, но и в виде препарата для инъекций.
3.1 Выводы
1. Разработаны основы анализа селенсодержащих соединений и продуктов их биотехнологической переработки методом ГХ/МС, использующие данные изотопного
состава селена (в том числе в присутствии элементов, имеющих свой изотопный состав – брома и хлора).
2. Доказано,что селенорганические соединения в процессе биотрансформации в
присутствии микроорганизмов могут претерпевать процесс гидрирования субстрата и
образовывать наночастицы селена.
22
3. Изучено влияние Saccharomyces cerevisiae на некоторые селенорганические соединения (на примере: диацетофенонилселенида; 2,4-дифенил-7,8-бензо-5,6дигидроселенохромена;
9-фенил-симм.октагидроселеноксантена;
перхлоратов
2,4-диарил-7,8-бензо-5,6-дигидроселенохромилия и 2-(п-метоксифенил)-4-фенил-7,8бензо-5,6-дигидроселенохромилия;
2-фенил-4-(4-п-бромфенил)-5,6,7,8-тетрагидро4Н-селенохромена; (3-(4-бромфенил)-4,5,6,7-тетрагидробензо-[b]селенофен-2-ил)(фенил)метанона и (3-фенил-4,5,6,7-тетрагидробензо-[b]селенофен-2-ил)(п-хлор-фенил)
метанона) в различных питательных средах).
4. Определено, что при воздействии Saccharomyces cerevisiae на 2,4-дифенил-7,8бензо-5,6-дигидроселенохромен в качестве промежуточного продукта образуется
2,4-дифенил-7,8-бензо-3,4,4а,5,6,10b-гексагидро-2Н-селенохромен, для чего впервые
осуществлен синтез данного вида соединений и установлено, что он существует в основном в виде двух изомеров. Аналогичные результаты получены при использовании
перхлоратов 2,4-диарил-7,8-бензо-5,6-дигидроселенохромилия и 2-(п-метоксифенил)4-фенил-7,8-бензо-5,6-дигидроселенохромилия.
5. Установлено, что в присутствии Saccharomyces cerevisiae 9-фенил-симм.октагидроселеноксантен в качестве промежуточного продукта образует соответствующий
пергидроселеноксантен в виде двух изомеров.
6. Установлено, что в присутствии микроорганизмов тетрагидроселенохромены
образуют продукты их восстановления по двойным связям гетероциклического кольца и элиминируют атом селена.
7. Разработана технология получения водорастворимой формы 2,4-дифенил-7,8бензо-5,6-дигидроселенохромена, которая может быть использована в биотехнологических процессах для получения новых форм селенсодержащих препаратов и в качестве инъекционной формы исходного препарата.
3.2 Рекомендации и перспективы дальнейшей разработки темы
Созданный препарат «Селенохромен» может быть рекомендован для использования в биотехнологических процессах, а также после проведения доклинических и
клинических исследований в качестве инъекционной формы препарата медицинского
и ветеринарного назначения.
3.3 Практические предложения
Результаты диссертационной работы могут быть использованы в различных отраслях промышленности, в частности, в биотехнологической, в процессе трансформации
селенорганических соединений в присутствии микроорганизмов в удобные для практического примения формы, а также в учебном процессе при подготовке студентов
соответствующих специальностей и направлений подготовки.
Для практического использования предложены следующие документы:
- Методические положения «Определение препарата 9-фенил-симм. октагидроселеноксантена и продуктов его биотехнологической переработки» (утверждено проректором по научной и инновационной работе ФГБОУ ВО Саратовский ГАУ
И.Л. Воротниковым; дата утверждения – 04.09.2017 г.).
- Методические положения «Определение препарата селенохромена и продуктов
его биотехнологической переработки» (утверждено проректором по научной и инновационной работе ФГБОУ ВО Саратовский ГАУ И.Л. Воротниковым; дата утверждения – 04.09.2017 г.).
- Методические положения «Определение сложного изотопного состава и продуктов его биотехнологической переработки» (утверждено проректором по научной и
23
инновационной работе ФГБОУ ВО Саратовский ГАУ И.Л. Воротниковым; дата
утверждения – 04.09.2017 г.).
- Методические положения «Определение препарата ДАФС-25 и продуктов его
биотехнологической переработки» (утверждено проректором по научной и инновационной работе ФГБОУ ВО Саратовский ГАУ И.Л. Воротниковым; дата утверждения –
04.09.2017 г.).
- Стандарт СТО 34.21.47.29.3121 - 2016 Инъекционный препарат «Селенохромен»
(утверждено проректором по научной и инновационной работе ФГБОУ ВО Саратовский ГАУ И.Л. Воротниковым; дата утверждения – 08.06.2016 г.).
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК РФ
для публикации результатов диссертационных исследований:
1. Древко, Я.Б. Восстановление диацетофенонилселенида (препарат ДАФС-25) до
ацетофенона с образованием микро- и наночастиц селена в присутствии Saccharomyces cerevisiaе / Я.Б. Древко, Т.С. Ситникова (Т.С. Осина), А.М. Буров, Б.И. Древко,
С.Ю. Щеголев // Биотехнология. – 2015. – вып. 6. – С. 65 - 71.
2. Древко, Я.Б. Реакция восстановления 2,4-диарил-7,8-бензо-5,6-дигидроселенохроменов / Я.Б. Древко, Т.С. Ситникова (Т.С. Осина), О.В. Федотова,
Б.И. Древко // Известия Саратовского университета. Новая серия. Серия Химия. Биология. Экология. – 2015. – Т. 15. – вып. 2. – С. 5 - 7.
3. Drevko, Y.B. Reduction of diacetophenonylselenide (DAPS-25 formulation) to acetophenone with the formation of selenium micro- and nanoparticles in the presence of Saccharomyces cerevisiaе culture / Y.B. Drevko, T.S. Sitnikova (T.S. Osina), A.M. Burov,
B.I. Drevko, S.Y. Shchegolev // Applied Biochemistry and Microbiology. – 2016. –
Vol. 52. – No. 8. – Р. 776 - 781.
Патенты
4. Пат. 2572716 Российская Федерация. RUS 2572716 С1 20.01.2016. Способ получения растворимой в воде формы 2,4-дифенил-7,8-бензо-5,6-дигидроселенохромена /
Я.Б. Древко, Б.И. Древко, О.С. Ларионова, Т.С. Осина, С.В. Козлов; Саратов. –
№ 2014129338/15; заявл. 16.07.2014 ; опубл. 20.01.2016, Бюл. № 2.
Публикации в российских и международных журналах, а также
сборниках трудов научных конференций:
5. Ситникова, Т.С. (Осина Т.С.) Трансформация препарата ДАФС-25 в присутствии культуры Saccharomyces cerevisiae в питательной среде молока / Т.С. Ситникова (Т.С. Осина), Я.Б. Древко, А.М. Буров, Б.И. Древко // Специалисты АПК нового
поколения: Материалы VI Всероссийской научно-практической конференции. – Саратов: Изд-во «Кубик», 2012. – С. 251 - 254.
6. Ситникова, Т.С. (Осина Т.С.) Образование нано- и микрочастиц селена из препарата ДАФС-25 в присутствии культуры Saccharomyces cerevisiae в питательной
среде RPMI-1640 / Т.С. Ситникова (Т.С. Осина), Я.Б. Древко, А.М. Буров,
Б.И. Древко // Биотехнология: реальность и перспективы в сельском хозяйстве: Материалы Международной научно-практической конференции 100-летию СГАУ им.
Н.И. Вавилова. – Саратов: Изд-во «Кубик», 2013. – С. 207 - 208.
7. Осина, Т.С. Биотехнологическое формирование наночастиц селена / Т.С. Осина,
Я.Б. Древко, А.М. Буров, Б.И. Древко // Аграрная наука в XXI веке: проблемы и пер24
спективы: Сборник статей VIII Всероссийской научно-практической конференции. –
Саратов: Буква, 2014. – С. 278 - 281.
8. Хаджу, А. Изучение новых антигенов кишечноиерсинизного микроба /А. Хаджу,
Т.С. Осина, Я.Б. Древко, С.В. Иващенко, С.А. Староверов // Аграрная наука в XXI веке: проблемы и перспективы: Сборник статей VIII Всероссийской научнопрактической конференции. – Саратов: Буква, 2014. – С. 286 - 289.
9. Осина, Т.С. Перспектива использования мицелярной формы нового селенорганического соединения / Т.С. Осина, Я.Б. Древко, Б.И. Древко, О.С. Ларионова,
С.В. Козлов // Биотехнология: реальность и перспективы: Материалы Международной научно-практической конференции. – Саратов: ИЦ «Наука», 2014. – С. 149 - 151.
10. Осина, Т.С. Реакция восстановления диацетофенонилселенида в присутствии
микроорганизмов / Т.С. Осина, Я.Б. Древко, Б.И. Древко // Биотехнология: реальность и перспективы: Материалы Международной научно-практической конференции. – Саратов: ИЦ «Наука», 2014. – С. 184 - 185.
11. Direnko, D.Yu. The preparation of 4-(4-bromo-phenyl)-2-phenyl-5,6,7,8-tetrahydro4H-selenochromene in conditions of acid catalysis / D.Yu. Direnko, Ya.B. Drevko,
B.I. Drevko, T.S. Osina // Internati nal C ngress n Heter cyclic Chemistry “K st-2015”
Book of Abstracts. Moscow, Russia. – 2015. – P. 282.
12. Direnko, D.Yu. The synthesis of 4-(4-bromo-phenyl)-2-phenyloctahydroselenochromene due to the reaction of electrovalent hydrogenization / D.Yu.Direnko, Ya.B. Drevko, B.I. Drevko, T.S. Osina // Internati nal C ngress n Heter cyclic Chemistry “K st2015” M sc w, Russia. – 2015. – P. 283.
13. Осина, Т.С. Разработка нового инъекционного препарата на основе мицеллярной формы селенорганического соединения / Т.С. Осина, Я.Б. Древко, Б.И. Древко,
С.В. Козлов // Школа молодых ученых «Научная волна 2016». Современные проблемы и перспективы развития агропромышленного комплекса России: Сборник статей
Всероссийской конференции. – Саратов: ИЦ «Саратовский источник», 2016. – С. 35 36.
14. Калинина, О.Р. Способ определения антибиотика тилозина методом ВЭЖХ с
УФ детектором / О.Р. Калинина, Я.Б. Древко, Т.С. Осина, М.С. Богданова // Актуальные вопросы биомедицинской инженерии: Сборник материалов VI Всероссийской
научной конференции для молодых ученых, студентов и школьников. – Саратов,
2017. – С. 103 - 107.
15. Колышкина, А.С. Метод определения триметоприма с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ детектором / А.С. Колышкина, Т.С. Осина,
Я.Б. Древко // Актуальные вопросы биомедицинской инженерии: Сборник материалов VI Всероссийской научной конференции для молодых ученых, студентов и
школьников. – Саратов, 2017. – С. 109 - 113.
Основные сокращения:
ГХ/МС – газовая хроматография с масс-селективным детектором.
ВЭЖХ УФ – высокоэффективная жидкостная хроматография с УФ детектором.
ЯМР – ядерный магнитный резонанс.
RPMI-1640 – стерильная питательная среда.
ДАФС-25 –диацетофенилселенид; бис-(бензоилметил)селенид; 1,5-дифенил-3-селенапентандион-1,5; этанон-2,2I-селенобис-[1-фенил];«Селенолин», «Селенобел».
Селен-Актив – 9-фенил-симм.октагидроселеноксантен, «Селенес», «Селенопиран».
Cеленохромен – 2,4-дифенил-7,8-бензо-5,6-дигидроселенохромен.
25
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа