close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

bd000100020

код для вставкиСкачать
На праваж рукописн
Пикуленко Марина Маиловна
Фотоиндуцированная генерация электрических
потенциалов в мембранаж растительной клетки
Специальность: 03.00.02 - биофизика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидапга биологических наук
Москва-2005
Работа выполнена на кафедре биофизики Биологического факультета
Московского Государственного Университета имени М В Ломоносова
доктор биологических наук, профессор
Научный руководитель:
Булычев Александр Александрович
Оффициапьные оппоненты
доктор биологических наук, профессор
Балнокин Юрий Владимирович
доктор биологических наук
Мамедов Махир Джафарович
Институт фундаментальных проблем биологии
Ведущее учреждение
Р А Н г. Пущино Московская область
Защита состоится
8 декабря 2005 г. 15ч 30 м на заседании
Совета Д 501.001.96 в Московском государственном Университете по
адресу 119992, г. Москва, Ленинские Горы, М Г У им М В Ломоносова,
Биологический факультет, кафедра биофизики. Новая аудитория
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического
факультета М Г У
Автореферат разослан ^^
"^г'^/^//^ 2005 г
Ученый секретарь
Диссертационного Совета
доктор биологических наук,
профессор
Т Е Кренделева
Q^^u^H
т-^^'^ч
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.
Актуальность проблемы. Преобразование световой энергии в хлоропластах
зеленых растений происходит в условиях непрерывно меняющейся внешней среды
Возможности адаптации растений связаны с существованием систем регуляции,
действующих на разных зфовнях, включая первичные процессы фотосинтеза
(Рубин,
Кренделева,
хлорофилла,
2004; Бухов, 2004)
отражающие
состояние
Изменения
флуоресценции
фотосинтетического
аппарата,
(Фл)
находят
широкое применение в прикладных исследованиях и экологическом мошпорннге
Однако, современные представления о регуляторных механизмах, за редкими
исключениями, не учитывают возможное влияние мембранных электрохимических
процессов, которые развиваются на разных структурных уровнях: в тилахоидах и
строме хлоропласта, в цитоплазме и на плазматических мембранах клетки
Первичное запасание энергии света при фотосинтезе связано с образованием
мембранного электрического (эл ) потешдаала (Лф) в тилакоидах хлоропластов,
который участвует в регуляции трансмембранных ионных потоков и механизмах
энергетического сопряжения (Witt, 1979; Булычев, 1972, 1997) Известно, что
фотогенераиия Аф в хлоропласте обусловлена совместным функционированием
фотосистемы 2 (ФС2), Ф С 1 и цитохромного b^/f комплекса Фотохимические
процессы в Ф С 1 и ФС2 включают первичное разделение зарядов в реакционных
центрах (между Р680 и феофнгином в ФС2 и между Р700 и акцептором До в ФС1) и
дальнейшие стадии стабилизации разделенных зарядов, при которых электрон
переходит на последующие переносчики (хинонный акцептор Qa в ФС2; железосерные белки Fx, FA, F B в ФС1)
В образование Аф могут вносить вклад
конфо1»»ационные изменения заряженных аминокислотных остатков и редоксцентров, сопровождающие трансмембранный перенос заряда (Семенов и др, 2004)
Источником генерации Аф может служить и обратимая Н*-АТРаза, способная
транспортировать протоны за счет гидролиза АТР и синтезировать АТР за счет
энергии электрохимического градиента протонов
Генерируемый на свету Лф по принципу обратной связи регулирует скорость
электронотранспортных
стадий, в которых перенос электрона ориентирован
I,
перпендикулярно или под углом к плоскости мембраны Изменения напряженности
POC НАЦИОНАЛЬНАЯ|
БИБЛИОТЕКА
I
^'is^5i
■■-—
г
эл. поля в энергосопрягающих мембранах хлоропластов оказывают существенное
влияние
на
обратный
проявляющийся
в
перенос
электронов
в
реакционных
центрах ФС2,
замедленной Фл. Создание положительного
Лф внутри
тилакоидов с использованием различных экспериментальных приемов понижает
энергетический барьер для рекомбинации разделенных зарядов, связанной с
образованием возбужденных молекул хлорофилла, и приводит к усилению
замедленной Ф л Однако механизм влияния Аф на процессы в реакционном центре
ФС2 изучен недостаточно.
Опыты на изолированных тилакоидах (блебах) вьнвили эффекты внешнего эл
поля на интенсивность быстрой Ф л хлорофилла (Meiburg et a l , 1983; Dau, Sauer,
1991) Становится очевидным, что Аф следует учитывать при моделировании
индукционных кривых Ф л зеленых растений (Лебедева и др., 2002) Однако
одновременное
измерение
индукционных
изменений
Аф
и
флуоресценции
хлорофилла а на одном объекте не проводилось. Вопрос о взаимосвязи эл.
мембранных процессов и индукционных изменений Ф л несомненно требует
прямого экспериментального изучения Один из подходов к исследованию влияния
мембранного потенциала на электронный транспорт в области ФС2 заключается в
измерении Ф л хлорофилла а при искусственных смещениях Аф на тилакоидной
мембране путем пропускания тока через микроэлектрод, введенный в отдельный
крупный хлоропласт.
Функционирование хлоропластов и выход Ф л хлорофилла могут зависеть
также от изменений эл потенциала на плазматической мембране клетки. Сдвиги
потенциала клетки сопряжены с трансмембранными потоками ионов и могут
сопровождаться
изменениями
ионного
состава
цитоплазмы. Для
проверки
представлений о вовлечении мембранных процессов целой клетки в регуляцию
фотосинтеза удобно использовать способность нексггорых мхов генерировать
фотоиндуцированные потенциалы действия. Экспериментальное изучение влияния
мембранного потенциала тилакоидов и плазмалеммы клетки на фотосинтетические
процессы
зависит
от
возможности
четкого
разграничения
эл
процессов,
протекающих на этих пространственно разделенных мембранах. Перечисленные
вопросы рассмотрены в данной работе.
Цели и задача работы.
Цепь работы состояла в исследовании механизмов и функциональной роли
фотогенерации эл потенциала на тилакоидных мембранах и вызываемых светом
изменений эл. потенциала плазмалеммы путем сочетания микроэлектродных
методов и микрофлуориметрии в опытах с целыми клетками и одиночными
хлоропластами.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи•
Разработать метод одновременной регистрации индукционных изменений
Аф и флуоресценции Х л а в хлоропласте растительной клетки in situ и изучить
фотоиндуцированные изменения Лф и Фл в норме и при различных физикохимических воздействиях.
•
Исследовать прямое влияние мембранного потенциала Аф на выход Фл Х л а
путем искусственного смещения эл. потенциала на тилакоидных мембранах
хлоропласта при различных состояниях ЭТЦ (при разном уровне вооггановления
хинонного акцептора Ф С 2 Qa).
•
Исследовать
мембранного
связи
потенциала
индукционных
изменений
на плазматической
Фл
с
изменениями
мембране, запускаемыми
при
освещении различной длительности.
Научная вовизва. Впервые выявлены коррелирующие стадии в индукционных
изменениях Дф и Ф л Х л а, обусловленные ускорением потока электронов в
акцепторной части Ф С 1 . Впервые показано прямое влияние фотоиндуцированного
Аф тилакоидных мембран на Фл хлорофилла ФС2 в целой ристительной клетке.
Впервые установлено, что пропускание биполярных импульсов тока, через
хлоропласт может вызывать симметричные или асимметричные сдвиги Ф л Х л а в
зависимости от редокс состояния акцептора Qa. На основе представлений об
обратимой радикальной паре в ФС2 (Климов, 1986; Qrondelle, 1985; Trissl, 2002)
создана модель потенциалозависимых изменений Ф л , учитываюищя влияние Аф на
процессы разделения, рекомбинации зарядов и стабилизации состояний в РЦ ФС2
Практическая зяачимость. Результаты работы послужили основой для
развития теоретических моделей процессов разделения и рекомбинации зарядов во
внешнем эл. поле (Беляева, 2004, Vredenberg, 2002-2005) и подтверяодены
экспериментально в раде лабораторий (Dau et al.,1991; Dau, Sauer, 1991, 1992).
Полученные результаты нашли практическое применение на кафедре биофизики
Биологического
факультете
МГУ
им
M B Ломоносова
для
построения
обобщенной модели индукционных стадий фотосинтеза с учетом генерации
мембранного
потенциала
хлоропластов
(Беляева,
2004).
Одновременная
регистрация индукционных изменений Ф л и эл. потенциала мембран в нативной
растительной клетке в различных условиях представляет практическое значение
для экологического мониторинга
Аиробаиия работы. Материалы диссертации были представлены на IV
Всесоюзн. межуниверситетской конференции по биологии клетки (Тбилиси, 1985),
научных конференциях молодых ученых биологического ф-та М Г У (Москва, 1986,
1987), Ш-съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), Межд научно-практической
конференции МГУ-СУНИ «Человечество и окружающая среда» (Москва, 2004),
12-ой Межд
конференции «Математика. Компьютер Образование» (Пущине,
2005), семинарах кафедры биофизики биологического факультета и Экоцентра
М Г У им. М. В. Ломоносова, Х У Ш Пущинских чтениях по фотосинтезу (2005)
Публикаднн. По материалам диссертации опубликовано 19 работ, из них: 5 в
реферируемых научных российских журналах, 2 в зарубежных журналах, 5 в
сборниках научных трудов , 2 в книгах, 1 в тезисах биофизического съезда, 4 в
тезисах конференций.
Структура ш объем днссеитадан Диссертация состоит из введения, четьфех
глав, содержащих описание методов исследования, результаты, обсуждение,
выводы и список литературы Материалы изложены на 148 страницах текста и
включают 2 фотографии и 43 рисунка Список литературы включает 235 работ (из
них 175 на иностранных языках)
ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Растительный
материал.
Основным
объектом
исследования
служили
хлоропласты и клетки слоевища печеночного мха Anthoceros sp, собранные в
районе
г
Е1атуми,
Вышнего
I
Серпухова
Волочка,
а
и
также
изолированные хлоропласты высшего
растения Ререготш
Piperaceae)
»*вн -^'iififiss**' ■ "igij^x*^/
растений
metaUica (сем.
Хлоропласты
отличаются
этих
уникально
крупными размерами (20-50 мкм), и
предсгавляют
•яч, - jS*. .-ijt-
удобный
объект для
одновременных микроэлектродных и
микрофлуориметрических измерений
Рис. 1. Срез слоевища у4иЛосего5 sp. с
подводимым микроэлектродом
Препараты Anthoceros помещали
в среду с 0.1 м М K C I , 1 мМ NaCl, О 5
мМ Са(НОз)2 и 5 мМ Hepes-NaOH (рН 7.0). Среда для выделения хлоропластов Р.
metallica содержала О 25 М сахарозу, 25 мМ трис-НС1 буфер (рН 7 5-7 8), фиколл
(25 мг/мл) и БСА (0.1 мгЛил). При измерении потенциала действия в клетках
Anthoceros экспериментальным растворюм служила среда, содержащая КС1, NaCl и
СаСМОз)2 в концентрациях 01,1.0 и 0.5 мМ, соответственно Хлоропласты и клетки
в
препаратах Anthoceros сохраняли
мор>фологическую
и
функциональную
целостность в течение 4 часов.
Мнкроэлектродные измерения. Установка для одновременных измерений
мембранного потенциала и флуоресценции одиночных клеток бьша собрана на
основе микроскопа Люмам И-3 (ЛОМО) и микроманирулятора КМ-1. Разность
электрических
потенциалов
Дф между
хлоропластом
и
средой
измеряли
капиллярными микроэлектродами (диаметр кончика < 0.5 мкм) с временным
разрешением 1 мс. Сигналы регистрировали на осциллографе и потенциометре или
на компьютере с помощью АЦП CED-1401 (Cambridge Electronic Design) и
программы WinWCP (Strathclyde Electrophysmlogy Software)
Генерацию ИД вызывали освещением препарата слоевища проходящим
белым светом микроскопа
препарата
составляла
Интенсивность возбуждающего света на уровне
около
500 Дж-м~^-с~'
В
ряде опытов
источником
действующего света, вызывающего генерацию потенциала действия, служил
верхний осветитель микроскопа Axiovert 25 CFL Свет напртвляли на препарат
слоевища через синий светофильтр СЗС-22 (X, < 580 нм).
Измерения
флуоресценции хлорофилла. Для измерений использовали
люминесцентный
ФМЭЛ-1А
микроскоп
Люмам-ИЗ
с
микрофотометрической
насадкой
Флуоресценцию возбуждали светом галогенной лампы накаливания,
питаемой от стабилизированного источника Возбуждающий свет проходил через
водный тепловой фильтр и стеклянный светофильтр СЗС-22 (спектральный
диапазон от 400 нм до 530 нм) и был сфокусирован на участок размером одной
клетки
Метод ямпульсво-модулнрованно! мнкрофлуорвмгтрвя. Установка была
собрана на базе инвертированного флуоресцентного микроскопа Axiovert 25 (Zeiss,
Германия) с приставкой Microscopy-PAM fWab, Германия) для измерений
флуоресценции хлорофилла в режиме модулированного освещения с воздействием
насыщающих
возбуждающего
импульсов.
синего
Для
света
отделения
флуоресценции
использовали
комбинацию
хлорофилла
от
светофильтров,
поставляемую с прибором Интенсивность фотосинтетически активной радиации
составляла
30-150 мкмольм^^с"'
Для регистрации и обработки сигналов
флуоресценции использовали программу WinControl (Walz, Германия).
Изменения абсорбции окисленной формы пвгмента Р Ц Ф С 1 (РТОО*^
измеряли по разности оптического пропускания препаратов на длине волны 810 нм
и 870 нм с помощью флуориметра РАМ-101 ( W a k ) и эмиттер-детекторного блока
ED-P700DW (Walz). Действующий свет получали от источника насыщающих
импульсов KL-1500 (Schott, Германия). Для подведения измерительного и
действующего света к объему, а также для отведения пропущенного И К света на
детектор использовали разветвленный оптоволоконный кабель. Сигнал ЛАвю с
выхода усилителя PAM-1G1 записывали на быстродействующем самопишущем
потенциометре.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Электрогеиные процессы в хлоропластах, обусловленные фотоактивацией
переноса электронов в области Ф С 1 .
Генерация мембранного потенциала (^).
На рис 2 показаны кинетики
генерации Дф у адаптированнвых к темноте хлоропластов Anthoceros и Р. metalhca.
Индукционные кривые фотогенерации Лф
у Anthoceros включают две волны, причем
вторая волна сдвигается в зависимости от
длительности темповой адаптации (рис. 2,
вставка). После снижения в течение 2-10 с
Лф выходит на стационарный уровень
10-25 мВ. Потенциал, наблюдаемый
в
первые моменты после выключения света,
♦
{
Рис. 2. Фотогенерация Лф в
милбранах
изолированного
хлоропласта Р. metallica (а) и
хлоропласта Anthoceros in situ, (б)
V - стационарный потенциал; Va
- электрогенная составляющая;
Vd - диффузионный потенциал.
На вставке - сигналы Аф при
действии 1-е светового импульса
после 3 мин темноты и через 5 с
после 1-го освещения.
отражает диффузионный потенциал (Vd).
Изменения
модификациям
Аф
чувствительны
ЭТЦ.
к
Стимуляция
транспорта электронов за счет снятия ДрН
в присутствии нигерицина или солей N H /
с акцептором (метилвиологен) значительно
повышала Аф в индукционный период, а
обработка диуроном -почти
полностью
устраняла фотогенерацию Лф. Характерная
фаза вторичного нарастания Аф ранее не
была выявлена другими методами М ы попытались прояснить природу этой стадии
на основе параллельных измерений Аф и флуоресценции хлорофилла.
Одновременные измерения Aip и флуоресценции хлорофилла. Индукционные
кривые флуоресценции Anthoceros в целом типичны для зеленых растений
В
кривой индукции Ф л выделяются 0-J-I-P переходы (по Strasser et al., 1995) и
последующее снижение Ф л , включающее промежуточную стадию PSi (Satoh,1981)
Стадия втсфичного нарастания Дф совпадает по времени с переходным снижением
флуоресценции P S i (Рис. 3). Ранее эта стадия индукционной кривой Ф л бьша
интерпретирована как результат ускорения оттока электронов от Ф С 2 и ФС1 за
счет активации ферредоксин-НАДФ редуктазы
и ферментов цикла Кальвина (Satcrii, 1983). В
соответствии
с
этими
представлениями,
повторное освещение сдвигало эту стадию в
более короткие времена, причем корреляция эл.
и флуоресцентного сигналов сохранялась.
ISire
Модификация свойств фотосинтетической
'£>
/
«J /
2
мембраны путем изотопного замещения воды
на D2O замедляло процессы генерации Дф и
нарастания Ф л , но не нарушало корреляцию
указанных стадий в индукционных кривых Дф
и Ф л хлорофилла. Стадии PS] и вторичного
Рис.
3.
Одновременные
измерения
Дф
(1)
и
флуоресценции хлорофилла (2)
в хлоропласте мха Anihoceros,
•^
,
вызванные
повторным
нарастания потенциала исчезали при действии
ингибиторов,
прерывающих ФС2
поток электронов
Сдиурон,
ФС1
между
дибромтимохинон) и при добавлении в среду
.
феррицианида в качестве искусственного
1-е
световым
импульсом
после
темпового интервала различной
у\^
^ ^ ч . ^
длительности: (а) 2 мин; (б) 15 с;
акцептора
ФС2
(в) 5 с.
снижения флуоресценции PS1 и активации
кинетическую
Результаты
связь
стадии
показывают
временного
"^
электрогенных процессов, ответственных за
появление второй волны Дф Активация оттока электронов от Ф С 1 проявлялась
также по сигналам AAgio, отражающим рсдокс состояние пигмента Р700*.
Влняняе мембранного потенциала на флуоресценцию хлорофилла.
Изменения флуоресценции при пропускании эл. тока через хлоропласт.
Ранее показано, что кончик введенного в хлоропласт микроэлектрода
попадает во внутренний объем тилакоидов, причем тилакоиды связаны в единую
10
сеть и щзедставляют собой складчатую мембранную систему (Bulychev et al, 1972)
Поэтому измерения фотогенерации Дф дают возможность убедиться в том, что
кончик микроэлекгрода находится в люмене
тилаковдной системы.
На
рис.
4
представлены
изменения
флусфесценции Х л , вызываемые пропусканием
чфез микроэлектрод импульсов тока разной
полярности (30 нА). Положительный сдвиг Дф
усиливал
Фл
освещенных
хлоропластов,
а
отрицательный называл 1фимерно равное по
амплитуде
ослабление
Фл.
Такое
влияние
потенциала проявляется как на хлсфопласгах
Anthoceros
внутри
изолированных
клетки,
так
хлоропластах
и
на
Ререготш
тешШса.
п_п_гиг;
0,«»
{
При небольшой силе тока, вызывающего
сдвиг
Дф,
полярности (а, б). 1 - Ф л ; 2 эл. ток, протекающий через
хлоропласт. Стрелки в начале
записи
отмечают
момент
элекгроиндущфуемых
изменений Ф л имеет экспоненциальный ввд с
постоянной
Рис. 4. (А) Изменения Ф л
хлоропласта при щюпускании
импульсов тока (30 нА) разной
кинетика
времени
около
100
мс,
что
соответствует времени зарядки электрической
емкости талакоидной мембраны. Амплитуда
сигнала
свечения.
_.
достигает
15%
от
интенсивности
^
освещения. (Б) Изменения Ф л
Электроивдущфуемые изменения Ф л
тшароплясп Anthoceros {\)т1ря подавлялись после обработки хлоропластов
шопускании
биполярных
^
импульсов тх)ка (напряжение 1 фамицвдином D; в этих условиях резко
В ) (2).
возрастает
проводимость
мембран
и,
соогаетственно, снижается Дф, создаваемый протеканием эл тока через мембрану.
Установлено также, что напряжения, вызывающие сдвиги Ф л , лежат в
физиологически допустимом диапазоне нескольких сотен мВ. На изолированных
хлоропластах Ререттга
тюказано, что ощутимые сдвиги Ф л можно вызвать
11
приложением потенциала порядка 100 мВ
Это означает, что потенциал Дф,
генерируемый на свету, может вносить заметный вклад в ход индукционной
кривой Фл.
Результаты опытов показали, что влияние сдвигов Дф разной полярности
зависит от редокс состояния ЭТЦ (состояние переносчиков между Ф С 1 и ФС2)
При офаботке диуроном, подавляющим перенос электронов между Qa и Qb в
акцептфиой части ФС2, стационарный уровень Фл значительно возрастал. При
этом отрицательные сдвиги Дф вызывали сильное тушение Фл, а положительные
не оказывали эффекта (Рис. 4А) Двухфазная 1фивая с резким минимумом в
изменениях Ф л при сравнительно большой силе тока возможно обусловлена
обратимым
электрическим
1фо6оем
мембраны,
т.е.
резким
понижением
сопротивления тилаковдной мембраны, и соответствующим уменьшением падения
натфяжения на мембране.
ЮмхМ диурон
1мМГА
30 нА
Рис.5. Изменения Фл хлоропласта Anthoceros, вызванные пропусканием импульсов
тока разной полярности силой 30 нА. (А) В присутствии 10 мкМ диурона; (Б) в
присутствии 1 м М гифоксиламина. Начало записей тока соответствует моменту
включения света (В) Диаграмма, отражающая влияние импульсов тока разной
полярности на Ф л в контроле без ингибиторов, а также в присутствии диурона и
гидроксиламииа (ГА)
М ы также использовали гидроксиламин, который прерывает поток электронов
в донорной части ФС2 мезвду Ог-выделяющим комплексом и донором для Р680 12
Yz (Рис 5Б) В этом случае Qa при освещении остается преимущественно в
окисленном состоянии, индукционное нарастание Фл вьфажено незначительно, а
стационфный уровень Ф л остается низким. В этих условиях положительные
сдвиги Дф вызывали сильное увеличение Фл, а отрицательные сдвиги были
малоэффективными. На рис. SB суммированы результаты опытов по действию
сдвигов Дф на Ф л хлсюофилла В отсутствие ингибигс^юв уровень Фл занимает
гфомежуточное положение между уровнями, отмечаемыми в щ)исутствии ди^рона
и гидроксиламина. Биполярные импульсы тока вызывают 1фимерно равные
изменения Ф л разной полярности, В тфисутствии диурона можно вызвать только
тушение при отрицательных сдвигах Дф, а в прис>'тствии гидроксиламина сильное усиление Ф л под действием положительных сдвигов Дф.
Модель потенциалозависимых изменений флуоресценции ФС2
Для интерпретации полученных результатов была щждложена модель
влияния эл. поля на первичные фотопроцессы в ФС2 (Рис 6). Эта модель основана
на представлениях об о<!^атимой радикальной паре и экситонном взаимодействии
между пигментами антенны и пигментом РЦ - Р680. В антенне происходит
миграция возбужденных состояний, которые, попадая на хлорофилл Р680
А
Свет
сы»
^ол^^^
Г" ,
Лшенна
РЦ
РбМ*
РФоо"
ку+к.Л-кп+к^
Рис 6. Схема процессов фоторазделения, стабилизации и рекомбинации зарядов в
ФС2. (А) Основные процессы в антенне и РЦ ФС2, (Б) Энергетические уровни
возбужденного хлорофилла и радикальной п^ы Р*Фео".
преобразуются в энергию разделенных зфядов Р*Фео (рис 6А). Это состояние в
свою очередь может рекомбишфовать с образованием возб^-жденной молекулы
13
Р680*
или
перейти
в
более
устойчивое
состояние
за
счет
стабилизации
разделенных зарядов путем переноса электрона на акцептор Qa
представлена
энергетическая
схема
рассмотренных
переходов
Н а рис
и
6Б
обозначены
соответствующие константы скорости. Разность энергий между состояниями Р* и
Р*Фео" составляет 40-50 м э В и поэтому равновесие между радикальной парой и
возбужденной молекулой Р680* оказывается весьма чувствительным к изменениям
Дф. Положительный потенциал внутри тилакоида препятствует уходу электрона на
феофигин
и, тем
расходуются
на
самым, возбужденные
Фл.
И
наоборот,
состояния
отрицательный
остаются
в
потенциал
антенне
и
способствует
разделению и стабилизации зарядов, что вызывает ослабление Ф л .
На основе этих гредставлений была получена аналитическая зависимость
выхода переменной Ф л от величины Дф для разных редокс состояний акцептора Qa
(рис.
7).
Окисленному
состоянию
Qa
соответствует
пфаметр
в=1,
а
восстановленному состоянию, когда перенос электронов на Q a невозможен, - в= 0.
Полученные графики хсрошо объясняют наблюдаемые эксперименты. В норме на
свету, когда в имеет некоторое щюмежуточное значение, сдвиги потенциала
разной полярности должны вызывать примерно симметричные изменения Ф л .
1,1
Г'
Оавосст
6=0
X
/
& 0,7
S. 0,5
S
0,3
0.1
-0,1
■
/л
1/
Qa
1
ОКИСЛ
1
J — .
-
_ kj
у
к_1
Ффп
=
ехр
,
l^f
kf + к,
]
9> -<Ро
RT /F
Л^ у
ко
X
N
У
" - <
,
,
5
3
1
1
3
5
Разность потенциалов ч> (1ед.= 25 мВ)
Рис. 7 Расчетные 1фивые зависимости переменной Ф л от мембранного потенциала
на участке мембраны между Р680 и Ф е о при различных значениях ^ (О, О 1 , О 5 я
1.0). Разность потенциалов представлена в безразмерных единицах {ЩУР).
14
Ч-1
^фл =
У
kf
kfN
kfN
Согласно предсказаниям модели в присутствии диурона (0=0,
верхняя кривая)
положительные сдвиги Аф оказьгеают слабый эффект, а отрицательные вызывают
существенное понижение вькода Фл. Обработке гидроксиламнном соответствует
нижняя кривая. В этих условиях модель предсказывает, что положительные сдвиги
Лф должны повышать выход Ф л , а отрицательные будут малоэффективными. Эти
предсказания модели соответствуют экспериментальным данным.
Модель прогнозирует также, что уровень Ф л
ФС2
m
о
должен
быть
чувствителен
к
Дф,
создаваемому за счет активности Ф С 1 , даже в
том случае, когда поток электронов в ФС2
в^
VO
подавлен в ее донориой части.
II
Для проверки этого предположения мы
обработали
слоевище
гидроксиламнном и
0.5 с
\
Anthoceros
добавили кофакторы,
активирующие работу ФС1 В этом случае Дф
и уровень Ф л претерпевали индукционные
„
„ „
Рис. 8. Индукционные кривые Ф л
изменения,
щшчеы
оба
(1) и Дф (2), измеренные на одном
обнаруживали
хлоропласте ^и<Лсн:его* при
сходсш) (Рис. 8). Величина Дф достигала
выраженное
сигнала
кинетическое
функционировании Ф С 1 (среда с
добавлением гидроксиламина, 5
150 мВ, а изменения Ф л - 15%. Исходя из
мМметалвиологенаиШмкМ
восст феназинмсгосульфата.
^ ^
^^^
предпола.^, то
сдвиг Ф л
составляет около 10% при смещении Дф на
100 мВ. Добавление в среду протонофора FCCP (10 мкМ) совместно с 1 мкМ
валиномицинт! приводило к подавлению фотоиндуцированных изменений Дф и
соответствующих фаз индукционной кривой Фл. Эти результаты подтверждают,
что Лф является одним из факторов, определяющих ход индукционных изменений
Фл.
15
Запускаемые светом изменения мембранного потеяцяала клеток и их связь с
энергозявисниым тушением флуоресценции
Для исследования регуляторных функций мембранных потенциалов (МП),
генерируемых в хлоропластах (Аф) и на клеточной мембране было необходимо
найти способ разделения эл. процессов, локализованных на плазмалемме и в
тилакоидах. В
описанных вьпые экспериментах по регистрации потенциала
хлоропласта Аф, было важно устранить влияние изменений М П клегки Для этого
свет фокусировали на измеряемый хлоропласт и несколько окружающих клеток. За
счет наличия межклеточных электрических связей такое освещение не вызывает
изменений М П клетки Однако при расширении зоны освещения изменения М П
клетки становятся все более заметными, а при освещении всего препарата
фотоиндуцированные
изменения
МП
клетки достигают
полной амплитуды
(Рис. 9А). Как видно из рисунка, эти сигналы развиваются в темноте после
запускающего
светового
импульса
и
проявляют
тем
самым
сходство
с
потенциалами действия (ПД)
4
_ ^ Переход от локального к
общему освещению
С
Рис. 9. (А) Фотоответы хлоропласта и плазмалеммы в системе клеток,
объединенных межклеточными эл. связями. Записи сделаны при разной площади
освещения препарата 3-се1огндными импульсами белого света (разрывы на прямой
под эл. сигвалами). (Б) Зависимость фотоэлектрических ответов клетки от
длительности освещения (цифры у кривых - время освещения в секундах).
Такие же изменения М П , сходные с ПД, наблюдаются и при нахождении
кончика микроэлектрода в прозрачной части клетки - цитоплазме; в этом случае
эл ответ хлоропласта (Аф) в суммарном сигнале отсутствует На рис 9Б показаны
16
зависимости эл. ответов клетки от длительности освещения Амплитуда ответов
возрастает с увеличением продолжительности фотостимула в интервале до 1-2 с, а
дальнейшее увеличение длительности импульса не оказывало эффекта Эл ответы
существенно
усиливались
при
действии
разобщителей
энергетического
сопряжения, таких как ионы > Ш / и ионофоры нигерицин и моненсин
При измерениях Ф л в аналогичных опытах установлено, что в темноте после
короткого инициирующего светового импульса развивается тушение Фл подобное
изменениям М П после фотостимуляции В последнее время тушение максимальной
Ф л Fm' при переходах от освещения к темноте или после короткого светового
стимула обнаружено и в других лабораториях (Field et a l , 1998, Delphin et a l ,
1998) Однако возможная связь между изменениями Фл и М П не анализировалась
Аф.мВ
ДфмВ
F. отн. вд.
-120.
AF/F_
о.т
-«ф-
ел
-МО-
-0.S
-1»0
к\
>i>.
•250
qN.q.
о.в
i
^ NS>
0.2
^6»НЛ
"S^
1
2
3
4
0.0
5
Время, мин
Рис. 10 Изменения М П клетки (1), а также флуоресценции и производных
параметров (2, 3), происходящие в темноте после короткого светового стимула
длительностью 3 с. (а) Максимальная Ф л F^; (б) фоновая Фл Fo; (в) квантовый
выход потока электронов в ФС2, AF/F„^ (г) коэффициенты нефотохимического
тушения qN (2) и qo (3). Стрелкой отмечен момент светового воздействия,
вызывающий ПД.
17
Нами проведены одновременные измерения М П и Фл клеток Anthoceros с
использованием микрофлуориметра с импульсно-модулированным освещением.
Полученные результаты представлены на рис 10. В этих опытах объект освещали в
течение 3 с интенсивным светом, а затем на протяжении нескольких минут следили
за изменениями М П , максимальной флуоресценции Fm, уровня Fo, квантового
выхода
первичных
фотопроцессов
в
ФС2
AF/Fm,
и
коэффициентов
нефотохмнческого тушения qN и qo. Из рисунка видно, что изменения М П , Fm и
AF/Fm ФС2 развиваются в темноте после запускающего светового импульса
Уменьшения Fm не наблюдали в присутствии протонофорного разобщителя
нигсрицина Очевидно, что тушение Fm отражает образование градиента рН на
тилакоидной мембране Формирование и поддержание АрН на мембране тилакоида
в темноте после инициирующего светового импульса может быть связано либо с
функционированием запускаемой светом Н*-АТФазы, либо с активацией темновых
Н*-транспортирующих
путей
переноса
электронов
в
мембране
тилакоида
Параллельное )гменьшение значений Fm и Ро свидетельствует о том, что тушение
Ф л происходит в антенне (Бухов и др. 2001).
Полученные результаты указывают на тесную связь мембранных процессов
клетки
и
процессов
преобразования энергии
при фотосинтезе
Снижение
отношения AF/Fm говорит о том, что генеравди! ПД на свету сопровождается
замедлением фотопереноса электронов в ФС2 и, соответственно, торможением
всего нециклического потока электронов С другой стороны, генерация ПД связана
как правило с повышением уровня Са^* в цитозоле, что может модифицировать
протекание светозависимых и темновых процессов в хлоропласте
Представления о механизме запускаемых светом ПД отражены на схеме
(рис. 11). В рассмотрение включены, по крайней мере, три фактора, которые
влияют на Фл и на активность электрогенного Н* -насоса плазмалеммы. Это изменения концентрации А Т Ф , изменения рН цитоплазмы и изменения уровня
свободного Са'^ в цитозоле В итоге вырисовываются сложные взаимодействия
между фопгопроцессами в хлоропластах и изменениями М П плазмалеммы Запуск
фотосинтеза вызывает отток И* и АТР из цитоплазмы, что проявляется в
торможении электрргенного Н* -насоса плазмалеммы, деполяризации мембраны и
18
генерации
ПД
Возникающие
потоки
Са^*
и
Н*
могут
существенно
модифицировать процессы преобразования световой энергии
оболочка Хп
Н* насос ПМ
f^^r^
Д-
—1 Д
Разобщители:
понижают [АТР] ц
i
r^ADP
—4—>. свет
АТР
АТР,
t
\АТР
ADP.,
Б
плазмалемма
О
Мегилвиологен
повышает [АТР]ц
Рис. 11, ( А ) Схема запускаемых светом процессов генерации ПД, изменений
квантового выхода потока электронов в ФС2 и нефотохимического тушения Фл
Отражены конкурентные отношения меяеду Н* -насосом плазмалеммы и
активируемой светом ЛТФазы хлоропластов за потребление ЛТФ Электрогенный
Н* -насос плазмалеммы )"1аствует в поддержании М П , а его торможение при
снижении уровня Л Т Ф или концентрации Н^ приводит к деполяризации ,
открытию потенциалозависимых Са'^* каналов и вызывает поступление Са^^ в
цитоплазму и строму хлоропласта. Изменения АрН на мембране тилакоида находят
отражение в изменениях флуоресценции хлорофюша. (Б) Роль [АТФ]ц в процессах,
приводящих к запускаемому светом тушению флуоресценции Fm и изменению
мембранного потенциала плазмалеммы
Заключевне
Полученные результаты ]^азывают на важную роль в регуляции фотосинтеза
электрических процессов, развивающихся на тилакоидных и плазматических
мембранах под действием вспышек света и в последующий темновой период
Выявленные регуляторные изменения затрагивают стадии первичного разделения
зарядов и диссипацию поглощенной энергии на флуоресценцию и в тепло Эти
изменения обусловлены как прямым влиянием электрического поля на перенос
электрона в реакционных центрах, так и изменением ионного состава цитоплазмы в
связи с торможением элекгрогенного Н* -насоса плазмалеммы и открыванием
потенциал-чуствительных ионных каналов
19
Выводы
1.
Одновременные
измерения
индукционных
изменений
мембранного
потенциала Аф и Фл хлорофилла а на хлоропластах Anthoceros выявили вторичное
нарастание Лф после лаг-периода 0.2-0 4 с, которое коррелирует по времени и
чувствительности к ингибиторам с фазой PSi снижения Ф л
Эти синхронные
изменения Дф и Ф л обусловлены фотоактивацией переноса электронов на
акцепторной стороне ФС1 и находят отражение в сигнале AAg,o хлорофилла Р700
2. На хлоропластах Anthoceros in situ и изолированных хлоропластах Р.
metallica показано, что пропускание эл. тока через тилакоидные мембраны
повышает или снижает Ф л в зависимости от полярности создаваемого мембранного
потенциала Аф. Амплитуда изменений Ф л возрастает с увеличением силы тока, а
их кинетика примерно соответствует зарядке эл. емкости мембраны.
3. Чувствительность Ф л к сдвигам Аф зависит от редокс состояния первичного
акцептора ФС2 Qa. При подавлении донорной части ФС2 гидроксиламнном
положительные сдвиги Лф повышают Фл на 10-15%, а отрицательные — оказывают
слабое влияние. При подавлении акцепторной части ФС2 положительные сдвиги
Аф не сказываются на Фл, а отрицательные вызывают ее тушение
4 В условиях фотогенерации Аф за счет изолированной активности Ф С 1 ,
фотоиндуцированные изменения Аф и Ф л Х л а проявляют кинетическое сходство,
что
подтверждает
возможность
прямого
влияния
фотоиндуцированного
мембранного потенциала тилакоидов на выход флуоресценции Х л а Ф С 2
5. Предложена модель потенциалозависимых изменений флуоресценции Х л а
ФС2 Показано, что симметричные и асимметричные сдвиги Ф л под действием
биполярных импульсов тока мож1ГО объяснить, учитывая влияние мембранного
потенциала на процессы разделения, рекомбинации и стабилизации зарядов в РЦ
6. Запуск фотосинтеза у Anthoceros вспышкой длительностью > 1-3 с
вызывает на плазматической мембране генерацию потенциала действия (ПД),
которая развивается сходным образом в темноте и на свету Генерация ПД
сопровождается снижением квантового выхода первичных фотопроцессов в ФС2 и
усилением тепловой диссипации энергии поглощенных квантов. Результаты
раскрывают наличие сложных регуляторных связей между фотосинтезом и
мембранными процессами в растительной клетке
20
Список основных публикаций Пикуленко (НияювоМ) по теме диссертации
1.
Булычев А А , Ниязова М.М., Туровецкий В.Б. Влияние дейтерирования на
чувствительность электронотранспортных реакций в хлоропластах к действию
грамицидина. Биохимии, 1983, т. 48, X» 5, с. 857-860.
2
Bulychev А.А., Niyazova M M . , Turovetsky V.B. Evidence for delayed
photoactivation of electrogenic electron transport in chloroplast membranes Biochim.
Biophys. Acta, 1985, 808, X2l, 186-191.
3
Булычев Л A., Ниязова М . М , Рубин А Б., Туровецкий В Б. Индукция
флуоресценции хлорофилла и изменения электрического потенциала на мембранах
хлоропласта. Доклады А Н СССР, 1986,286, № 1,253-256.
4
Bulychev А А , Niyazova М М , Turovetsky V В
Electro-induced changes of
chlorophyll fluorescence in individual intact chloroplasts Biocfaim. Biophys. Acta,
1986, 850, N2,218-225.
5
Булычев A . A , Ниязова M M , Туровецкий В Б Задержанная фотоактивация
электрогенных редокс-процессов в хлоропластах Anthoceros. Биоэлектрогенез и
транспорт веществ у растений Горький Изд-во ГТУ, 1986,28-33
6
Булычев А А ,
Ниязова М М ,
Рубин А Б
Изменения флуоресценции
хлоропластов при сдвигах мембранного потенциала
окислительно-восстановительного
состояния
и их зависимость от
акцептора
фотосистемы
II
Биологвческне мембраны, 1987,4, N 3,262-269.
7.
Булычев А.А., Ниязова М.М. О связи инлукционвых кривых флуоресценции
хлоропластов с изменениями электрического потенциала тилакоидных мембран
Мембранный транспорт н биоэлектрогенез у растений. Горький' Изд-во Г Г У ,
1987,50-55.
8
Ниязова
М.М.,
Булычев
А.А
Потенциалозависимые
изменения
флуоресценции хлорофилла фотосистемы П в одиночном интактном хлоропласте
Труды 18 научной конф. мол ученых биол фак МГУ. Москва, 20-24 апреля 1987,
Проблемы совр. биологии, ч. 2, М Г У , 44-48: Деп в ВИНИТИ 14 09.87 N 6653-В87
9,
Булычев А.А., Ниязова М.М. Влияние мембранного потенциала на реакции
переноса
электрона
в
фотосистеме
П.
Бяоэлскгрнческая
активность
мембранный транспорт у растений Горький: 1{зд-во Г Г У , 1988,12-17.
21
и
10
Булычев
А А,
Ниязова
М.М,
1989
Модель
потенциалозависимых
изменений флуоресценции хлорофилла фотосистемы II. Биофизика, 34, N 1,63-67
11.
Ниязова, М.М., Булычев А.А, Обратимое снижение выхода флуор)есценции
хлорофилла а при генерации потенциала действия в клетках мха Anthoceros.
Биофизика, 1989,34, N 2,272-274.
12
Булычев А.А., Пикуленко М.М
Фотогенерация потенциала действия в
клетках Anthoceros и ее связь с нефотохимическим тушением флуоресценции
хлорофилла Ш
Съезд Биофизиков России, 24-29 июня 2004 г. Российская
Академия Наук, Воронеж, Тезисы докладов. Том П. 402-403.
13
Пикуленко
ММ,
Булычев
А.А.
Микрометоды
оценки
состояния
растительных объектов и возможности использования Anthoceros для тестирования
биоэнергетических характеристик. Международная научн-практич конференция
МГУ-СУНИ «Человечество и окружающая среда» 26-28 октября 2004 г. Россия,
Москва, М Г У им М.В.Ломоносова. Сборник материалов. С. 56-57.
14
Пикуленко М.М., Булычев А А. Оценка состояния растительных объектов
микрометодами
на
биоэнергетических
примере
использования
характеристик.
Anthoceros для
12-я Межд.
конференция
тестирования
«Математика.
Компьютер. Образование» Пущино 17-22 января 2005 г. Сборник научных
тезисов. Математика - Компьютер - Образование. Выпуск 12. Изд-во: Регулярная и
хаотическая динамика (РХД), Москва - Ижевск 2005. с. 205.
15
Bulychev А.А., Pikulenko М.М. Micromethods for evaluating the quality of water
environment: suitability of Anthoceros for analysis of clilorophyll fluorescence and
electric events at the thylakoid and plasma membrane. 3rd Symposium "Quality and
Management of Water Resonrces" St.Petersburg, Russia, June 16-18, 2005. St
Petersburg 2005 Book of abstracts. 30-31.
16.
Пикуленко M.M., Булычев A A Запускаемые светом потенциалы действия и
изменения квантовой эффективности фотосистемы П в клетках Anthoceros
Физиологии растений, 2005,52, № 5,660-666
17 Пикуленко М.М., Булычев А.А. Изменения квантовой эффективности Ф С U и
запускаемые светом потенциалы действия в клетках Anthoceros X V U I Пущинские
чтения по фотосинтезу и Всероссийская конференция «Преобразование энергии
света при фотосинтезе» М НИА - Природа, 2005, с 42-43
22
Отпечатано в копицентре « СТ ПРИНТ»
Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус.
www.stprint.ru e-mail: zakaz(a).stprint.ru тел: 939-33-38
Тираж 100 экз. Подписано в печать 12. 10. 2005 г.
112 0 809
РНБ Русский фонд
2006-4
19376
V
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
902 Кб
Теги
bd000100020
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа