close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

bd000100803

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Кирилина Евгения Петровна
Д И Н А М И К А М О Л Е К У Л В НЕУПОРЯДОЧЕННЫХ С Р Е Д А Х
ПО Д А Н Н Ы М ЭХО-ДЕТЕКТИРУЕМОГО ЭПР
нитроксильных СПИНОВЫХ зондов
01.04.17 -химическая физика, в том числе физика горения и взрыва
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата физико-математических наук
Новосибирск, 2005
Работа выполнена в Институте Химической Кинетики и Горения Сибирскою Отделения
Российской Академии Наук.
Научный руководитель:
доктор физико-математических наук, профессор Сергей Андреевич Дзюба
Официальные оппоненты:
доктор физико-математических наук, Александр Анатольевич Дубинский
доктор физико-математических наук, профессор Петр Александрович Пуртов
Ведущая организация:
Казанский физико-технический институт РАН
Защита состоится 30
ноября
2005 г. в 16:30 часов
на заседании диссертационного Совета К 003.014.01 в
Институте химической кинетики и горения СО РАН
по адресу: 630090, Новосибирск-90, ул. Институтская, 3.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке
Института химической кинетики и горения СО РАН.
Автореферат разослан
28
октября
2005 г.
Ученый секретарь диссертационного Совета,
доктор химических наук,
^>?^*:****'''^^^^^^^^
^- ^- Онищук
.л/-/-»
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Динамика молекул в неупорядоченных средах - стеклах и
полимерах имеет иерархический характер и происходит в широком диапазоне времен
корреляции. Построение полной картины молекулярных движений в неупорядоченных
средах необходимо для решения фундаментальной задачи статистической физики построения
теории
фазового
перехода
стекло-жидкость.
Кроме
того,
понимание
закономерностей молекулярной динамики в стеклах и полимерах имеет большое значение
для решения практических задач материаловедения. Детальное исследование динамики
молекул в неупорядоченных средах требует развития физических методов специфически
чувствительных к молекулярным движениям в различных временных диапазонах.
Работа посвящена развитию и применению метода детектирования молекулярных
движений при noMonw эхо-детектированого электронного парамагнитного резонанса (ЭД
ЭПР) нитроксильных спиновых зондов. Метод ЭД ЭПР обладает большим потенциалом для
исследования ориентационной динамики молекул в диапазоне времен корреляции 10"* 10'" с и позволяет исследовать движение радикальных примесных частиц, иммобилизованых
в стеклах. В комбинации с методом спинового зонда позволяет получать уникальную
информацию о локальной молекуляриой подвижности спин меченых молекул белков и
биополимеров.
Информация о молекулярных движениях извлекается на основании анализа
вызванной движением спиновой релаксации. Интерпретация данных ЭД ЭПР требует
развития теории спиновой релаксации вызванной движением и разработки способов
определения параметров молекулярных движений.
Многочисленные
данные
нейтронного рассеяния, рамановской
инфракрасной
спектроскопии указьшают на наличие в стеклах и полимерах коллективных мод движения одновременных смещений большого количества молекул. Теория фазового перехода,
разработанная
Адамом
и
Гиббсом,
также
использует
концепцию
одновременно
перестраивающихся кластеров для описания фазового перехода стекло жидкость'. Большой
интерес представляет развитие экспериментальных методик позволяющих детектировать
коллективные движения, определять их корреляционную длину.
Особый интерес представляет применение метода ЭД ЭПР для исследования
динамики молекул в пептидах и белках. Развитие методов детектирования молекулярных
движений в белках и белковых комплексах необходимо для понимания механизмов действия
и каталитических функции белков в живых организмах'.
—————__
'WI-. Н.АЦНОНАЛЬЦАЯ!
I
i
6И6ЛИОТЕМ
I
«"^Kl^f/j
СПетмСпг Q (П \
^
Основные цели работы:
1. Определение времен корреляции ориентационных движений молекул нитроксильных
радикалов в органических стеклах при помощи метода ЭД ЭПР. Предполагалось определить
масштаб времен корреляции и амплитуд, а также геометрию молекулярных движений
методом сравнения экспериментальных ЭД ЭПР спектров с теоретическим расчетом.
2. Выявление связи между молекулярной динамикой спиновых зондов и движением
молекул стеклообразной матрицы. Выявление зависимости параметров молекулярных
движений от размеров и структуры нитроксильных спиновых зондов, стекла растворителя и
температуры. Исследование коллективного характера молекулярных движений.
3. Применение метода ЭД ЭПР для исследования молекулярной динамики пептидов и
белков. Изучение молекулярной динамики пептида трихогин при помощи ЭД ЭПР
однократно и дважды меченых пептидов.
Научная
новизна
работы. Предложен метод определения масштаба времен
корреляции ориентационных движений, который основан на сравнительно.м анализе
спектров ЭД ЭПР различных ЭПР диапазонов. Впервые при использовании современных
методов импульсного ЭПР в высоких полях определен масштаб времен корреляции
ориентационных движений нитроксильного спинового зоида (соли Фреми в глицерине
вблизи температуры стеклования), равный 10'^ - 10''° с. При помощи разработанной
программы для расчета и подгонки спектров ЭД ЭПР нитроксильных радикалов для ряда
моделей ориентационных движений проведен расчет формы спектров ЭД ЭПР. Достигнуто
согласие экспериментов и теоретических расчетов.
Впервые
при
помощи
ЭД
ЭПР
продемонстрирован
коллективный
характер
ориентационных движений молекул в стеклах. Исследована зависимость c^copocти
анизотропной поперечной релаксации нитроксильных спиновых зондов от размера и свойств
зонда, структуры нитроксильного кольца, размера и структуры заместителей, а также
свойств стекла растворителя и темпертуры.
Исследованы молекулярные движения пептида трихогин GA IV однократно и
двукратно меченого нитроксильной спиновой меткой. Впервые продемонстрирована
возможность исследования локальных и коллективных мод движе}П1Я пептидов при помощи
ЭД ЭПР однократно и дважды меченных пептидов.
Практическая ценность работы. Разработаный метод может быть использован для
исследования молекулярной подвижности в стеклах и полимерах различного состава, а также
при исследовании динамики белковых молекул. Созданная программа расчета и подгонки
спектров ЭД ЭПР может быть применена для анализа экспериментальных данных
импульсного ЭПР различных диапазонов и позволяет определять параметры молекулярных
движений и геометрию молекулярных движений. Полученные результаты о коллективном
характере молекулярных движений в стеклах могут иметь большое значение при сравнении с
теоретическими предсказаниями.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на следующих российских и
международных конференциях и симпозиумах: V I International Voevodsky Conference
«Physics and Chemistry of Elementary Chemical Processes», (Новосибирск, Россия, 21-25 июля
2002), Intemational School on EPR spectroscopy and Free Radical Research (Мумбай, Индия, 1720 ноября, 2004) Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft fur Biophysik (Фрайбург, Германия,
12-15 ссвтяря, 2004), 5* Meeting of the European Federation of EPR Groups (Лисабон,
Португалия, 7-11 сентября, 2003), 9Й1 Chianti workshop, (Тиррения (Пиза), Италия 26 мая -1
июня, 2001), Specialized CoUoque AMPERE: «EPR and ENDOR Spectroscopy of Metal Proteins
and Spin-Labelled Proteins» (Лейден, Нидерланды 29 июня ~ 1 июля, 2005), EUROMAR
conference EENC 2005 «Magnetic Resonance for the Future»( Вельтхофен, Нидерланды, 3-8
июля 2005), Final report clloquiura of the DFG Priority Programme SPP 1051 High-field EPR in
Biology and Physics (Хюнельд, Германия, 16-18 февраля, 2005), Euro-Summer School « Modern
EPR Spectroscopy methodology and application in Physics, Chemistry and Biology?) (Рити,
Бе;гьгия, 1-7 декабря, 2002), симпозиум «Современная химическая физика», (Туапсе, Россия,
18-29 сентября, 2000), Молодежная научная школа «Актуальные проблемы магнитного
резонанса и его приложений», (Казань, 20-22 ноября, 2002).
Публикапии. Основное содержание диссертации изложено в 4 статьях и 10 тезисах
научных конференций и симпозиумов.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав,
результатов и выводов и списка цитируемой литературы, включающего 70 наименований.
Работа изложена на 104 страницах, содержит 5 таблиц и 29 рисунков.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цели, и задачи работы, а
также дано краткое описание структуры диссерггации.
В
первой главе представлен обзор лвпературы по проявлению молекулярных
движений в спектрах электронного парамагнитного резонанса. Рассмотрены описанные в
литературе
экспериментальные
методики
исследования
молекулярных
движений,
основанные на анализе вызванной движением продольной и поперечной спиновой
5
релаксации. Проведен обзор теоретических методов расчета кинетики затухания спинового
эха для различных моделей молекулярных движений. Подробно рассмотрены соотношения
между параметрами молекулярных движений и скоростью, вызванной ими спиновой
релаксации для случая быстрых и медленных молекулярных движений.
?
X
Вторая
+Б
— 200нс
1/7'2А>1/Г2Б
5
— 400нс
— 800нс
А
— 1000нс
i
анизотропной
посвящена
спиновой
описанию
релаксации,
феномена
вызванной
ориентационным молекулярным движением, а также
метода расчета спектров ЭД ЭПР нитроксильных
радикалов в рамках модели быстрых ограниченных
ориентационных движений. Вследствие сверхтонкого
взаимодействия со спином ядра азота и анизотропии
^--^
S
0.332
0.334
0.336
ВоГТ
Рисунок
I
Спектры
ЭД
ЭПР
нитроксильного радикала стекле. Спектры
записаны при помощи последовательно­
сти спинового эха я/2-т-.я. Спектры,
-записанные при разных значениях т,
нормированы на максимум амплитуды.
Изменение формы спектра при увели­
чении времени т - следствие анизотропии
поперечной релаксации
(AfuTt) « 1
глава
спин-орбитального
взаимодействия,
ларморовская
частота неспареного электрона зависит от ориентации
молекулы нитроксильного радикала относительно
внешнего
магнитного
поля.
Молекулярные
ориентационные движения приводят к флуктуациям
ларморовской частоты и как следствие к спиновой
р е л а к с а ц и и . Е с л и а м п л и т у д а ф л у к т у а ц и и Дщ и в р е м я
корреляции движения Тс удовлетворяют условию:
и 1/Т2»1/Т|, то скорость вызванной движением поперечной релаксации
описывается следующим соотношением^:
-^ = До)Ч
Т,
(1)
Для малых углов отклонения а, Дсо^=Р(в,<р)а\ где Р(9,ф) фактор, зависящий от ориентации
радикала относительно внешнего магнитного поля. Вид функции F(0,(p) задается типом
движения и определяет зависимость скорости релаксации от положения в спектре - т.е.
анизотропию скорости релаксации. Во второй главе диссертации приведены аналитические
выражения для функции F(9,cp) для следующих моделей ориентационных движений: (i)
ориентационные колебания вокруг определенной оси в молекулярной системе координат; (ii)
модель изотропных ориентационных флуктуации; (Hi) модель скачков между двумя
положениями. Кроме того, рассмотрен механизм релаксации за счет флуктуации компонент
g-тензора. Полученые выражения применимы для расчета спектров ЭПР в магнитных полях
от 1 до 10 Тл.
6
в
третьей главе описан метод определения временной шкалы и геометрии
молекулярных движений, использующий возможности современного мультнчастотного ЭД
ЭПР. Показано, что в молекулярных стеклах вблизи температуры стеклования преобладают
изотропные ограниченные ориентациоиные колебания с характерными временами в
диапазоне 10"' - 10'"* с.
В методе ЭД ЭПР характерные времена движения извлекаются из анализа скорости
релаксации, вызванной молекулярными движениями. При этом зависимость скорости
релаксации от времени корреляции движения немонотонна. Скорость релаксации мала для
очень быстрых движений (Тс«1/Д(») и возрастает с ростом времени корреляции. Максимум
достигается для случая
Да)Тс~1, и при дальнейшем увеличении времени корреляции
(Тс>1/Дю) скорюсть релаксации падает. Такое поведение приводит к тому, что скорости
анизотропной релаксации, измеренные экспериментально, допускают
неоднозначную
интерпретацию и могут быть объяснены как медленными, так и быстрыми ориентациовшлми
движениями.
Таблица 1 Результаты теоретических расчетов кинетик спадов сигнала
двухимпульсного 7I/2-T-IC спинового эха для нескольких моделей медленных
ориенгационных движений молекулы со спином Vi и анизотропным gтензором. Те время корряляции движения, параметры А , В, С зависит от
величины внешнего магнитного поля Но: А=2уе(МН/Мв)'П/3, у, электронное гиромагнитное отношение, D - коэффицент ориентацнонной
дифузии, МН/М9осНо угловой градиент Гамильнониана; В " 2 (F/Tt)'",and С
=2(F/T,^)''', соответственно, где F=2 yeHo(g„-g„)/3
Модель движения
Функция спада эха
Ссылки
Броуновская диффузия
(г< MF)
ехр(-у<г'),,4осЛ„^
3,4,5
БроуновС1£ая диффузия
(г> MF)
е1р(-Дг),г=сЯ„"
3
Свободная диффузия
e4>(-Cr),Coc/V
3
Скачки нехоу двумя
полозкениями, случайные
скачки
""(-f)
3,4,6
Нами был развит критерий определения временного масштаба движения: экспоненциальный
спад сигнала эха я квадратичная зависимость скорости релаксации l/T: от амплитуды
флуктуации ларморовской частоты Дсо могут служить доказательством режима быстрых
движений Д(10Тс«1.
Действительно, в случае быстрых движений (Дй)Тс«1) в соответствии с теорией
магнитной релаксации Редфилда спад сигнала эха экспоненциально зависит от времени, и
скорость поперечной релаксации определяется соотношением (1), т.е. скорость релаксации
прямо пропорциональна квадрату флуктуации ларморовской частоты. В случае медленных
движений кинетика затухания сигнала эха часто не описывается экспонентой, время фазовой
памяти определяется типом случайного процесса. Хотя общее выражение, определяющее
зависимость времени фазовой релаксации от времени корреляции и амплитуды движения, не
может быть получено, медленные движения никогда не приводят одновременно к
экспоненциальной кинетике спада эха и квадратичной зависимосги времени фазовой памяти
от Дш. Такой вывод может быть сделан на основании анализа имеющихся в литературе
теоретических расчетов кинетики спада сигнала эха для медленных процессов (см. таблицу
1).
Для нитроксильных радикалов анизотропия ларморовской частоты определяется
суперпозицией анизотропии зсемановского и сверхтонкого взаимодействия. При изенении
резонансной частоты и магнитного поля спектрометра, изменяется в соответствующее число
раз анизотропия связаная с анизотропией g-тензора. Вследствии этого, ориентационные
движения одной и той же амплитуды а приводят к различной величине Дсо при
детектирования
спектров
ЭПР
различных
диапазонов. Это
позволяет исследовать
зависимость скорости релаксации от амплитуды флуктуации ларморовской частоты на
основании сравнительного анализа кинетик спада сигнала эха при различных значениях
внеппгего магнитного поля.
Были проведены эксперименты ЭД ЭПР для нитрокснльного радикала соль Фреми в
стекле глицерина в S-(0.12 Т/3 ГГц), Х-(0.35 Т/9.5 ГГц), W-(3.5 Т/95 ГГц) и G-(6 Т/180 1Тц)
диапазонах ЭПР при температуре 185 К (см. рисунок 2).
Было обнаружено, что кинетики спада эха экспоненциальны во всех использованых
диапазонах. Квадратичность зависимости скорости анизотропной релаксации от амплитуды
флуктуации ларморовской частоты была проверена одновременной симуляцией спектров ЭД
ЭПР, записаных в различных диапазонах в рамках модели быстрых движений.
Эксперимеиально полученые спектры и результаты расчета приведены на рисунке 2.
Достигнутое согласие расчета и эксперимента показывает, что анизотропная релаксация
вызвана быстрыми движениями, времена корреляции которых удовлетворяют соотношению
Да)Тс«1.
Х-диапаэон
S-диапзэш
С-дишяэон
W-дИапаэон
X А.
6370
0330
ВоГГ
ВоП-
0335
3380
В(/Т
3390
6380
в»
6.370
6.390 6400
Д
Sjx
6 380
6.390 6/400
ВоЛ-
Рисунок 2 Спеиры Э Д Э П Р нитроксвльного радикала соль Фреми в глицерине, записанные в различных
диапазоиах Э П Р (S40.12 Т/3 ГГц), ХЧ0.35 Т/9 5 ГГц), W-(3.5 Т/95 Г Г ц ) и G-(6 Т/180 Г Г ц ) ) при температуре
185 К и расчет в рамках модели быстрых ограниченных итотропных ориентационных движений радикалов
Спектры соответсвующие разным значениям времени задержки между импульсами т, нормированы на
максимум амплитуды.
Было обнаружено, что ЭД ЭПР в высоких полях позволяет существенно увеличить
чувствительность
метода
к
геометрии
ориентационного
движения.
Для
молекул,
обладающих анизотропным g-тензором спектры ЭПР W- и G- диапазонов обеспечивают
высокое ориентациониое разрешение, позволяющее точно определить оси, вокруг которых
происходит
ориентациониое
движение.
Сравнение
формы
спектров
ЭД
ЭПР,
зарегистрированных в глицерине, с расчетом показало, что молекулы спинового зонда
совершают изотропные ориентационные флуктуации. Было также обнаружено проявление
дополнительного релаксационного механизма за счет флуктуации компонент g-тензора в
спектрах ЭД ЭПР W- и G- диапазонов.
Четвертая глава посвящена исследованию механизмов ориентационных движений
молекул в стеклах.
Анизотропная релаксация, наблюдаемая в спектрах ЭД .ЭПР нитроксильных радикалов,
является следствием стохастических переориентации нитроксильного фрагмента NO-. А
priory переориентация фрагмента N0- может быть результатом следующих процессов: (i)
внутримолекулярных
движений
нитроксильного
радикала; (ii)
движений
молекулы
нитроксильного радиката как целого относительно клетки растворителя; (iii) коллективных
ориентационных движений всей клетки, включая нитроксильный радикал.
Для того чтобы определить, какой из указанных видов молекулярных движений
приводит к анизотропной релаксации, была исследована зависимость скорости анизотропной
релаксации от характеристик спинового зонда и исследуемого стекла. Характеристикой,
определяющей
параметры
внутримолекулярных
движений,
является
структура
нитроксильного радикала, поскольку характер конформационных переходов зависит от
строения
нитроксильного
цикла.
Для
индивидуальных
движений
зонда
в
клетке
растворителя определяющим фактором является соотношение размеров радикала и клетки
растворителя. В
отличие от этого для коллективных
движений амплитуда и время
корреляции определяются свойствами стекла и межмолекулярными взаимодействиями в
стекле-растворителе.
Из
этих
соображений
была
исследована
зависимость
скорости
анизотропной релаксации от следующих факторов: (i) структура нитроксильного цикла;
(ii) размер нитроксильного радикала; (iii) стекло-растворитель. Были проведены три серии
экспериментов, в каждой из которых варьировался один из факторов, тогда как остальные
оставались неизменными.
Для того чтобы количественно охарактеризовать скорость анизотропией релаксации м ы
использовали величину \/Т2т - разность скоростей релаксации между двумя позициями в
спектре Э П Р (см. рис. 1)
1
1
1
Величина 1/Т2ап~а Тс бьша измерена для нитроксильных радикалов различного строения и
размера, представленных в таблице 2 и помещенных в ряд стеклующихся органических
растворителей.
0.30
1
025
У^о.го
t
*
0.15
гЬ
величины
3
-
6.
На
1/Т2ап для
рисунке
приведены
3
на
представлены
нитроксильных
радикалов
при 77 К. Исследованы нитроксильные радикалы,
имеющие шестичленные и пятичленные циклы, а
0.05
0.00
рисунках
экспериментов
различной структуры, помешенных в стекло этанола
*
0.10
Результаты
II
V
VH
VIII
IX
X
Xi
Ншроксильный радикал
Рисунок
3
Скорость
анизотропной
релаксации Ш^
тя
нитроксильных
радикалов различного строения в стекле
этанола при 77К. Нумерация радикалов
согласно-таблице 2.
также
смежные
конформационные
различия
в
циклы
твист-переходы.
строении
затрудняющие
Несмотря
радикалов
на
скорость
анизогропной релаксации меняется ЛИШЬ в пределах
20%.
На рисунке 4 представлены скорости анизотропной
релаксации для нитроксильных радикалов различного размера в стеклах этанола (рис. 4а) и
толуола (рис. 46) при 77К. Была изучена серия нитроксильных радикалов, отличающихся
10
Таблица 2. Структура нитроксильных спиновых зондов
KSO,^
I
,К80з
О*
II
\
О
vn
VIII
Ph
HOOC
-TSV
ш
о.
-fiv
ноос
,о
N
I
О
IX
.?Vад,
с»
о.
IV
ОН
о.
XI
^ v
VI
XIII
J^PtiO
^.v
о.
ГЛ-^
XII
^V
11
лишь размером заместителя в третьем положении нитроксильного цикла. Изменение размера
радикалов от 3 до 50 А приводит лишь к незначительному измерению 1/Т2^ в пределах 10%.
ш
Зависимость скорости анизотропной релаксации 1ЛГ2ап от свойств стекла-растворителя
проиллюстрирована на рисунке 5. Величина 1/Т2ап измерена в ряде стекол-растворителей для
а25
ого
"bois
t o 10
oos
flfl
■
000
и
радикала Темпов ( X I ) при 77К.
-j-l
"
IV
V
и
- д—
005 004
003 •
Г^
гЬп
г^
Различие скоростей релаксации
более
параметры
000 -
«1
определяющее
конформационных
переходов
как
ориентационного
движения
Нитроксильный радикал
молекул
Полученные
Рисунок 4 Скорость анизотропной релаксации 1/Т2а„ для
нитроксильных радикалов различного строения в стекле этанола
(слева) и стекле толуола(спрзва) при 77К. Нумерация радикалов
согласно таблице 7.
молекулярных
порядок
влияние свойств матрицы на
0 01
IX
на
демонстрирует
002 ■
Нитроксильный радикал
чем
ные
факты
исключить
причину
зонда.
эксперименталь­
позволяют
процессы
анизотропии
внутри­
поперечной
релаксации. Шестичлеииые и пятичленные нитроксильные радикалы, отличаюищеся как
жесткостью цикла, так и амплитудой переориентации NO- фрагмента при твист
конформационных
0 30
0 25
тем
ril
0 10
0 05
g §
I
I
a
i S
1Ш1
IQ
o.
5
o.
с
^ 1
1t
Ч
Скорость
I/Tz^
для
аннэотротшой
нитроксильного
радикала Темпом в стеклах
состава при 77К
i ^
ID
с
Рисунок
в
rS^
i § 11
gI i §
S
можно
заключить,
спектрах Э Д
близкие
параметры
что
ориентационные
Э П Р , не являются колебаниями
молекул зонда в
п
a.
Ч
релаксации
демонстрируют
движения, вызьшающие анизотропную релаксацию
J-
гЩ
a
менее
Также
■
000
ни
ориентационных движений в эксперименте.
:гь
^ 0 20-
5 016
переходах,
-
различного
клетке
молекул растворителя.
Действительно, наличие массивных заместителей,
увеличивающих размер молекулы зонда в несколько
раз, должно приводить к заметному ограничению
амплитуды колебаний в клетке, что противоречит
экспериментальным наблюдениям.
Таким
образом,
на
основании
полученых
результатов можно заключить, что анизотропная
релаксация вызвана коллективными движениями,
включающими
одновременную
переориентацию
молекулярного кластера размером несколько нанометров. Модель коллективных движений
наилучшим образом согласуется с экспериментальными данными, объясняет независимость
12
параметров движения от структуры и размера спинового зонда и чувствительность к
свойствам стекла-растворителя.
Сделанный
вьшод
согласуется
с
многочисленными
экспериментальными
доказательствами существования коллективных мод движения в стеклах, получеными при
помощи методов нейтронного и светового рассеяния.'
В пятой главе метод ЭД ЭПР применен для исследования молекулярной динамики
пептида трихогин,
Трихогин, выделенный из организма Trichogerma longrachiatum, является линейньш!
пептабоилом длиной 10 аминокислотньк остатков и обладает антибиотическим действием.
Предполагаемы!! механизм действия состоит в изменении проницаемости биологических
мембран
при
л.
IV
растворении
в
ней трихогина за
счет
образования
каналов
или
тетрамолекулярных кластеров*.
к
FTOAC4,8
'.Л
1
FTOAC4
Ч
^' V
1
0
"^
ВоЛ-
2
^ ^ 3.
т, цС
атомов
аминокислотных
аминокислот
в
белках
является
внутримолекулярных
остатков,
движений
флукгуаций
вокруг
положения
равновесия,
движения
белкового
скелета,
флуктуации
вторичной
структуры
движений
под
белка
и
влиянием
коллективных
окружающего
растворителя. В связи с этим для исследования
Чя
1
Движение
суперпозицией
4
Рисунок 6 Спад сигнала эха однократно
(FTOAC^)
и
дважды
( F T O A C ■A,i)
меченного пептида трихогин в стекле
хлороформ 3 0 % ' толуол 7 0 % при 77К. Спады
записаны
для
спешральных
позиций
указаных стрелками на врезке.
! динамики молекул в белках необ.ходимы методы,
позволяющие
отличать
различные
моды
молекулярных движений.
Для того чтобы исследовать одновременно и
локальные движения в
молекулах пептида и
коллективные движения белкового остова были проведены эксперименты ЭД ЭПР с
однократно и дважды мечеными пептидами. В дважды меченом пептиде нитроксильные
метки располагались на расстоянии трех аминокислотных остатков друг от друга.
Для однократно меченого пептида аналогично спиновым меткам в стеках анизотропную
релаксахдаю
вьвьшают
ориентационные
флуктуации
анизотропного
сверхтонкого
взаимодействия и анизотропного g-тепзора В дважды меченом пептиде неспареные
электроны связаны диполь-дипольным взаимодействием, которое зависит от расстояния
между радикалами, их взаимной ориентации, а также ориентации нитроксильной пары (т.е. к
13
ориентации всего белкового фрагмента содержащего пару меток) во внешнем магнитном
поле.
В
связи
дополнительной
с
этим
спектры
ЭД
чувствительностью
к
ЭПР
нитроксильньк
движениям
бирадикалов
белкового
остова,
обладают
изменяющим
расстояние между метками или ориентация всего пептида.
Экспериментально обнаружено, что скорость релаксации в спектрах дважды меченого
пептида существенно вьпие, чем скорость релаксации однократно меченого аналога (см.
рисунок
6), что
свидетельствует
о
наличии
молекулярных
движений,
изменяющих
расстояние между метками или их ориентацию.
/ \
/ \
*
?п
1
01
\
—
Был
бирадикал
монорадикал
проведен
ческий
0^ цС
^J2^л
анализ
теорети­
проявления
различных типов движений в
згцс
спектрах Э Д Э П Р однократно и
к
g
дважды
меченого
пептида.
Проведен расчет спектров Э Д
0 335
1
0 34
/ \
/ 1
/
\
0 345
0 325
0 335 0 345
0 2 цс
line
0 355
02iiC
12ис
3 2(ic
^
ЭПР
I
для нескольких моделей
движения (i) независимые лока-
а. льные
ориентационные
туации
034
воЯ
0 325
0 33S
0^45
ВоП
0 355
Рисунок 4 Спектры ЭД ЭПР пептида трихогин однократно
(FT0AC-4) и дважды (FTOAC-4,8) меченого ншроксильной
спиновой меткой. Верх: эксперимент в смеси хлороформ:толуол,
77К
Спектры
записаны
при
помощи
импульсной
последовательности я/2-т-л.(спектры записаные при при разных
временах задержки между импульсами т нормированы на
максимум ампитуды) Низ: расчет в рамках модели
ориентационных движений белкового остова, содержащих обе
каждой
из
свободном
объеме,
вленном
окружением;
ориентационные
флук­
меток
в
предоста­
(ii)
движения
молекулы трихогина как целого
ИЛИ переориентация фрагмента
.
белкового
"•-'*""•'" « остова,
>'~i»'«~, содержащего
"«v^/» «i^^w^
^gg метки: (iii) относительное
Трансляционное движение меток.
Показано, что рассмотренные типы движений приводят к различной зависимости скорости
релаксации от положения в спектре Э П Р , проявляются по-разному в спектрах Э Д Э П Р .
Наилучшее согласие теории и эксперимента обнаружено для модели переориентации
белкового остова, содержащего обе метки. Таким образом, продемонстрирован потенциал
метода Э Д Э П Р для изучения молекулярной подвижности белков.
14
выводы
1. Проведены расчеты спектров Э Д Э П Р нитроксильных моно- и бирадикалов в
неупорядоченных средах в условиях быстрого ориентационного движения в диапазоне
частот
ЭПР
1-180
ориентационных
молекулярной
ГГц
для
следующих
флуктуации, модель
системе
моделей
движения:
переориентации
координат, модель скачков
вокруг
между
модель
изотропных
фиксированной
оси
двумя положениями.
в
Для
бирдикалов рассмотрены модели независимых ориентационных движений нитроксильных
фрагментов,
ориентационное
движение
бирадикала
как
целого
и
трансляционное
относительное движение нитроксильных фрагментов.
2. Методом мультичастотного Э Д Э П Р нитроксильных спиновых зондов исследована
анизотропная
парамагнитная
релаксация,
вызванная
ориентационным
молекулярным
движением в стеклах. Получены оценки для времени корреляции движения 10"' - 10"'° с.
Достигнуто количественное согласие между экспериментальными спектрами Э Д
ЭПР
нитроксильных спиновых зондов в стекле глицерин и расчетом в рамках модели быстрых
ограниченных ориентационных движений.
3. Исследована зависимость параметров ориентационного движения от структуры и
размера нигроксильного зонда, стеклующегося растворителя. Обнаружено, что скорость
анизотропной релаксации, вызванной ориентационным движением, не зависит от структуры
и размера зонда и определяется свойствами стекла растворителя и температурой. Сделан
вывод что, анизотропная релаксация вызвана коллективными переориентациями в стекле
включающими одновременное движение кластера размером свыше 1 нм.
4. Метод Э Д Э П Р
спиновых зондов применен для исследования молекулярной
динамики пептида трихогин меченного в одном и двух положениях нитроксильной спиновой
меткой. Показано, что скорость анизотропной релаксации для дважды меченого пептида на
порядок больше чем для однократно меченного. Показано, что анизотропная релаксация
вызвана ориентационным движением белкового остова.
Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах
1. Е.Р. Kirilina, T.F. Prisner, М. Bennati, В. Endeward, S. Dzuba, M.R. Fuchs, K. Mobius and A.
Schnegg. Molecular dynamics of nitroxides in glasses studied by multi-frequency EPR.// Magnetic
Resonance in Chemistry. -2005.- V. 43. -P.19-129.
2. S.A. Dzuba, E.P. Kirilina, E.S. Salnikov, and L.V. Kulik. Restricted orientational motion of spin
probes in molecular glasses: Comparative study of anisotropic relaxation in primary and stimulated
E S E decays. // Journal of Chemical Physics. 20O5.-V. 122. - P. 94702-94709.
15
3. E.P. Kirilina, L A
Grigoriev, and S.A. Dzuba. Orientational motion of nitroxides in molecular
glasses: Dependence on the chemical structure, on the molecular size of the probe, and on the type
of the matrix. // Journal of Chemical Physics.-V 121. - P. 12465-12471.
4. E.P. Kirilina, S.A. Dzuba, A . G . Maryasov and Yu.D. Tsvetkov. Librational dynamics of
nitroxide in molecular glasses studied by echo-detected EPR.// Applied Magnetic Resonance.2001.-V. 21.-P. 203-221.
5. E.P. Kirilina, S.A. Dzuba, I. A . Grigoriev and Yu.D. Tsvetkov. Properties of librational motion of
guest spin probe molecules in molecular glasses as revealed with E D EPR.// Book of Abstracts of
bitemational V I Voevodsky conference Physics and Chemistry of Elementary Chemical processes,
Novosibirsk, Russia, 21-25 July, 2002. -P. 160.
6. E.P. Kirilina, A. Schnegg, S.A. Dzuba, T.F. Prisner, K. Mobius. Molecular Dynamics in Glasses
Studied by Pulsed Multi-Frequency EPR.// Book of Abstracts of International School on E P R
spectroscopy and Free Radical Research.- Mumbai, India, 17-20 November, 2004.- P. 23
7. E.P. Kirilina, S A. Dzuba. Cooperative orientational motion in trichogin peptide studied by E D
E P R of nitroxide spin probes.//Book of Abstracts of Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft fur
Biophysik Freiburg, Germany, 12-15 September, 2004, -P. 119.
8. E.P. Kirilina, E V. Salnikov, S.A. Dzuba. Orientational molecular motion in glasses by means of
pulse E P R : comparison of different glasses.// Book of Abstracts of 5th Meeting of the European
Federation of E P R Groups, Lisbon, Portugal, 7-11 September, 2003,- P. 42
9. E.P
Bagryanskaya, S.A. Dzuba. Orientational molecular motion in glasses.// 9"" Chianti
workshop, Tirrenia (Pisa), Italy, May 26- June 1,2001, -P. 45.
10. Е.П. Бапзянская. Изучение механизма ограниченых движений спиновых зондов в
молекулярных стеклах.// Тезисы докладов Х П симпозиума «Современная химическая
физика», Туапсе, Россия, 18-29 сентября, 2000,- Стр.11.
11. Е.П. Кирилина, Исследование коллективных ориентационных колебаний молекул в
стеклах
методом
молодежной
эхо-детектированного
научной
школы
ЭПР
«Актуальные
спиновых
проблемы
зондов.
магнитного
Труды
Российской
резонанса
и
его
приложений», Казань, 20-22 ноября, 2002, сгр. 196-200
12. Е.Р Kirilina, S.A. Dzuba. А molecular dynamics study on mono and doubly labeled Trichogin
G A I V . // Book of Abstracts of Specialized Colloque A M P E R E : E P R and E N D O R Spectroscopy of
Metal Proteins and Spin-Labeled Proteins, Leiden, The Netherlands, June 29 - July 1,2005, -P. 9
13. E.P. Kirilina, A. Schnegg, S.A. Dzuba, T. Prisner, K. MSbius. Orientational molecular
Dynamics in glasses studied by pulsed multi-frequency E P R of Spin Probes.// Book of Abstracts of
16
EUROMAR conference EENC 2005 Magnetic Resonance for the Future, Veldhoven, The
Netherlands, 3-8 July 2005. - P. 296.
14. Е.П. Кирилина. Свойства ограниченных ориентационных движений молекул в
молекулярных стеклах методом ЭД ЭПР.// Материалы XLI Международной студенческой
конференции «Студент и научно-технический прогресс», 15-19 апреля, 2003.- Стр.18-19.
Дополнительная цитируемая литература.
' G. Adam, J . Gibbs.// Journal Chemical Physics, 1965.-V.43.-P.139.
^ A. G. Redfield.// Academic Press: London, 1965; Vol. 1. Advan.Magn.Reson., P. 1-32.
' L.J. Schwartz, A.E. Stillman, J . H Freed.// J . Chem. Phys. 1982 - V.77,- P. 5410-5425..
" G.M. Zhidomirov, K.M. Salhikov. //Soviet Physics JETP, 1969.-V.29.- P.1037-1040.
' J.R Klauder, P.W. Anderson, Physical Review, 1962.-V.12.-P. 912-932.
* P. Hu, S.R. Hartmann.//Physical Review B, 1974.-V.9. P. 1-13.
' J Onuchic, Z. Luthey-Schulten, Annual Review of Physical Chemistry, 48, 545-600, (1997)
A. Milov, Y. Tsvetkov, F. Formaggio, S. Oancea, C. Tomolo, J . Raap.// Journal of Physical
Chemistry B, 2003. -V. 49,- P.13719-3727.
17
■i
Подписано к печати 25 октября 2005г.
Тираж 100 экз. Заказ № 1683.
Отпечатано "Документ-Сервис", 630090,
Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 335-66-00
«21024
РНБ Русский фонд
2006-4
19662
с-
</
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
729 Кб
Теги
bd000100803
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа