close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

bd000100947

код для вставкиСкачать
САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
На правах рукописи
ДМИТРИЕВА ЮЛИЯ ВЛАДИМИРОВНА
ВОЗРАСТНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЭНЗИМАТИЧЕСКОГО БАРЬЕРА ТОНКОЙ КИШКИ
ПРИ ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ.
Специальность 03.00.13-физиология
Автореферат
диссерташш на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2005
//
Работа выполнена в лаборатории физиологии питания Института физиологии им. И.П.
Павлова РАН и на кафедре физиологии Санкт-Петербургской Госуд^хпвенной Академии
Ветеринарной Медицины.
Научный руководитель:
доктор медицинских наук,
профессор Тимофеева Нина Михайловна
Официальные оппоненты: доктс^ биологических наук,
профессор Маслова М|фина Николаевна
доктор медицинских наук.
профессор Овсянников Владимир Иванович
Ведущее учреждение: Санкт-Петербургская Медицинская академия им. И.И. Мечникова
Защита диссертации состоится " /^
" / ^ - ^ ^ А / 2005 г. в /Учас. на заседании
Диссертационного совета Д. 1\1.1У1.\^ по защите диссертаций на соискание ученой
степени доктора биологических наук щ>и Санкт-Петербургском Государственном
университете (199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. А.М. Горького СанктПетербургского Госуд^ктвенного унив^митета.
Автореферат разослан у / "Ojtfjt^oPlWiS
г.
Ученый се1фетфь Диссертационного совета
Доктор биологических наук
/^i^,^^
Н.П- Алексеев
ig^lO
3
^^^<^^Ji^
О Б Щ А Я ХАРАКТЕРИСТИКА Р А Б О Т Ы
Актуальность
проблемы.
В
тонкой
кишке
существуют
многочисленные
и
взаимосвязанные системы защиты организма от поступления во внутреннюю среду
чужеродных веществ, особенно белковой природы. Энзиматический барьер тонкой кишки
представлен
ферментными
системами,
осуществляющими
последовательную
деполимеризацию пищевьк поли- и олигомеров до мономеров, способных к утилизации Он
состоит из ряда пространственно разделенных барьеров, образованных ферментами полости
тонкой кишки, пристеночной слизи, гликокаликса, а также энтероцитов - мембранными,
внутриклеточными и лизосомальнъпии
В лаборатории физиологии питания Института
физиологии им. И.П. Павлова РАН под руководством академика A.M. Уголева впервые бьшо
осуществлено препаративное разделение стенки тонкой кишки у белых крыс линии Вистар на
три слоя- эпителиальный, стромальный и мьппечно-серозный, что было документировано
морфологически. В этих слоях были выявлены три группы ферментов, активность которых
максимальна
в
эпителиальном
(мембранные
ферменты), в
стромальном
(глидил-L-
лейциндипептидаза), и в мьппечно-серозном слое (глицилглициндипептилаза). Это привело к
обнаружению неизвестных ранее фундаментальных характеристик тонкой кишки как
структуры, реализующей не только пишеварительно-транспортные (что бьшо известно ранее),
но и барьерные функции. На основании данных о распределении пищеварительных ферментов
между слоями тонкой кишки A.M. Уголевым была выдвинута гипотеза о существовании наряду
с эпителиальным ферментным барьером
субэпителиального
энзиматического барьера,
осуществляемого за счет ферментов субэпителиапьных слоев и повьппающего надежность
трансформациошюй системы тонкой кишки (Громова и др., 1991; Уголев и др., 1992;
Тимофеева, 1993; Тимофеева и др., 1996; Иезуитова, Тимофеева, 1996; 1999 и др.).
С
возрастом существенно меняются структурно-функциональные характеристики
тонкой кишки (Адапт.-комп. процессы, 1991). Доказано влияние различных стрессорных
факторов на активность ферментов эпителиального слоя (Koldovsky, 1969; Уголев, 1963, 1967,
1985, 1991, Уголев и др, 1992; Тимофеева, 1995; Henning, 1981; 1987). Известно, что
пищеварительные ферментные системы способны к значительным перестройкам при
изменении условий функционирования (голодание, иммобилизация, высокая и низкая
температура и др.) (Егорова и др., 1992; Timofeeva et al., 1993; Ватаева и др., 1994; Никитина и
др., 1994; Тимофеева, и др., 1994; Мальпиев, Манухина, 1998; Кассиль и др, 2000). Ранее бьшо
показано участие ферментов постэпителиальных слоев, особенно пептидазного пула,
в
ответной реакции на то или иное экстремальное воздействие (оперативные вмешательства на
тонкой кишке, голодание, нитратная интоксикация) (Иезуитова и др., 1993; Тимофеева, 1995,
1996) Было продемонстрировано, что совершеннос_л_1|ааежное^ выполнение барьерных
ф\нкций структурами тонкой кишки вьшолняется
.,
„
-4БЛИОТЕМ.,
, ферментных
]
^^"SSLM
4
систем ее эпителиального и субэпителиальных слоев
Однако
возрастные
особенности
ферментных систем субэпителиальных слоев тонкой кишки, также как и их функциональная
роль при различных воздействиях (иммобилизация, белковое голодание) у животных разных
возрастных групп не изучались
Изучение функций субэпителиального энзиматического
барьера у животных разного возраста может быть полезным при рассмотрении мношх форм
патологии желудочно-кишечного тракта, при которых часто нарушается проницаемость
мембран щеточной каймы эптероцитов Постэпителиальиый энзиматический барьер способен
выполнять в этих условиях защитпуго роль за счет повышения активности ферментов
пептидазного пула, способных гидролизовать нерастепленные пептиды, предотврапшя их
поступление в кровеносную систему вследствие снижения мембранного гидролиза белков
Цель и задачи исследования.
Целью
работы было
изучение
возрастных
особенностей
ферментных
систем
субэпителиального барьера тонкой кишки и их участие в адаптивных реакциях на различные
стрессорные воздейсгвия (иммобилизацию и белковую депривацию)
Были поставлены следующие задачи:
1
Выявить
различия в уровне активности аминопептидазы М
и глицил-L-
лейциндипептидазы в эпителиальном, стромальном и мьппечно-серозном слоях тощей и
ПОЛВЗДОП7НОЙ кишки у молодых, зрелых и старых животных.
2.
Сопоставить
изменения активности ферментов
пептидгидролазного
пула
в
эпителиальном и субэпителиальных слоях тощей и подвздошной кишки спустя 24 и 72 часа
после иммобилизационного стресса у животных трех возрастных групп (молодые, зрелые,
старые).
3. Изучить влишше белковой депривации молодых, зрелых и старых крыс на активность
пептидгидролаз (аминопептидазы М и глицил-Ь-лейииндипептидазы) эпителиального и
субэпителиалъньк слоев тощей и подвздошной кишки.
Научная новизна. 1. Впервые обнаружены различия в уровне активности ферментов
пептидгидролазного пула на примере аминопептидазы М и глицил-Ь-лейшшдипептидазы в
субэпителиальных слоях тощей и подвздошной кишки у крыс разного возраста (молодые,
зрелые, ст^ые). Наиболее высокая активность ферментов отмечена в слоях тощей и
подвздошной кишки у молодых крыс по сравнению со зрелыми и старыми животными, что, повидимому, важно для увеличения мо1цности энзиматического барьера тонкой кишки у молодых
неполовозрелых животных, у которых еще не завершено формирование структурных элементов
тонкой кишки 2 Впервые обнаружены изменения активности ферментов пептидшдролазного
пула не только эпителиального, что бьшо ранее известно, но также стромального и мьппечносерозного слоев тонкой кишки на стрессорное воздействие (иммобилизащи в течение 3 ч)
Гакие реакции ферментных систем слоев тонкой кишки
позволяют судить об участии
субэпителиальных слоев в реализации адаптивных возможностей организма. 3. К белковой
5
депривании оказались наиболее устойчивыми ферментные
системы
молодых
и
зрелых
животпьтх. У старых крыс в условиях белкового голодания резко увеличивалась активность
ферметггов пептидгидролазного пула в слоях тонкой кишки, что, по-видимому, является
способом защиты организма от проникновения чужеродных белков, которые могут привести к
патологическим последствиям.
Таким образом, нами
получены новые данные,
расширяющие представление
об
чнзиматическом барьере не только эпителиального, но и субэпителиальных (стромального и
мытпечно-серозного) слоев тонкой кишки Показана различная чувствительность ферментных
систем пептидгадролазного пула в слоях (особенно субэпителиальных) тонкой кишки у этих
ipynn животных при стрессорных воздействиях.
Научно-практическая
распределении
ферментов,
цепность
особенно
работы. Выяснение возрастньк особенностей в
пептидгидролазного
пула,
между
эпителиальным,
стромальным и мышечно-серозным слоями тонкой кишки, а также их ответных реакций на
стрессорпые
воздействия
(иммобилизации,
белкового
гололаггия)
важно
для
развития
фундаментальных представлений о барьерных и адаптивных функциях тонкой кишки Наши
данные впервые позволяют приблизиться к пониманию роли энзиматического барьера разных
слоев
тонкой
кишки
при
экстремальных
субэпителиальпого
энзиматического
пищеварительной
системы,
воздействиях.
С
нарушением
барьера, возможно, связаны некоторые
которые
сопровождаются
увеличением
функций
заболевания
проницаемости
энзиматического барьера для белков и пептидов (болезнь Крона, маддигестия, целиакия,
хирургические травмы кишечника и др), Полученные данш.1е могут быть полезными в
разработке лечебного питания и в создании новых сбалансировшшых полноценных диет при
патологии желудочно-кишечного тракта, особенно в
молодом и пожилом возрасте Наши
результаты могут быть использованы в научно-исследовательской работе, курсах лекций на
кафедрах физиологаи и патфизиологии
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались на: 52ой конференции молодых ученьк и студентов С П Г А В М , посвященной 190-летиго высшего
ветеринарного образования в России и 100-летто со дня организации первого научнопроизводственного учреждения в Петербурге (1998); всероссийской научной конференции с
международным участием, посвященной 150-летию со дня рождения акад
И П.Павлова,
(Санкт-Петербург 1999), научно-практической конференции «Приоритеты культуры и экологии
в образовании», (Ставрополь 2003), восьмом
международном конгрессе «Парентеральное и
энтеральное питание», (Москва 2004).
Публикация результатов исследования. Основные материалы диссертации опуб-такованы
в 8 научных работах
Структура и объем работы. Диссертация изложена на
182 страницах машинописного
текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований.
6
общего
заключения,
вьшодов,
списка литературы Она иллюстрирована 31 таблицей
и 46 рисунками.
Список литературы включает 196 источников, в том числе 102 на иностранных язьжах
Основные положения, выносимые на защиту:
1 Распределигае
активности
пептидгидролаз
(аминопептидазы
М
и
ГЛИЦЙЛ-L-
лейциндипептидазы) между эпителиальным, стромальным и мышечно-серозным слоями
топкой кишки у крыс изменяется в зависимости от возраста (молодые, зрелые, старые).
?
Реакпия ферментных систем пептидгидролазного пула эпителиального, стромального и
мышечно-серозного слоев тонкой кишки на стрессорное воздействие (иммобилизация в
течение 3 ч на фоне голодания в течение 12 ч) различна у молодых, зрельк и старых
крыс.
3
Белковое голодание (в течение 10 сут) животных вьвывает существенное изменение
уровня активности пептидгидролаз не только эпителиального, но и субэпителиальных
слоев тонкой кишки, особенно у старых крыс.
М А Т Е Р И А Л Ы И М Е Т О Д Ы ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследования проводились в лаборатории физиологии питания Института физиологии
им И П Павлова РАН. В качестве экспериментальных животных были взяты крысы-самцы
Вистар трех возрастных групп - молодые (2 мес), зрелые (6 мес ) и старые (1 5 года) массой 80,
200 и 450 г соответственно. Всего 105 крыс. Контрольная группа включала 18 животных по 6
крыс каждого возраст-а, голодавших в течение 12 ч до взятия в опыт. Для изучения
иммобилизацинного стресса использовано 36 крыс разного возраста (молодые,
зрелые,
старые), также голодавших перед опытом в течение 12 ч. Для создания условий иммобилизашш
были использованы специальные клетки, ограничивающие подвижность животных в течение 3
ч После прекращения иммобилизации животных помещали в клетки, где они имели доступ к
пише и воде. После 1а4Мобилизации животных забивали с помощью гильотины После чего
вскрывали брюшную полость, извлекали тонкую кишку, препаративно разделяли слои по
описанной методике (Громова и др , 199!) У отдельной группы животных трех возрастных
групп (15 крыс) после иммобилизации и декапитации собирали кровь из сосудов туловища и
проводили определение кортикостерона в плазме крови флюориметрическим микрометодом
Ю Г Балашова (1990). Исследование влияния безбелковой диеты на ферментативные функции
слоев тонкой кишки проведено на 36 крысах разного возраста, из которых 18 содержались на
полноценной ко1ггрольной диете и 18 - на безбелковой
Контрольная диета содержала 20 %
казеина, 67,2% крахмала, 5% подсолнечного масла, 7,8% минеральных солей и витаминов,
6e36ejiK0BaH - 87,2% крахмала и остальные компоненты диеты (кроме казеина) в том же
количестве (Тимофеева и др., 1994; Rouanet et al., 1990) Каждое животное получало ежедневно
[юрцию пищи из расчета ПО г на 1 кг массы тела, что составляло 95 ккал на одну крысу (при
.массе живошого 200 г) Спустя 10 сут животных декапитировали, вскрывали брюшную
110 юсть. извлекали тонкую кишку, препаративно разделяли слои по описанной
методике
7
(Громова и др.,1991). В качестве критерия чистоты разделения слоев тонкой кишки,
определяли активность сахаразы (КФ 3 2 148), которая является маркерным ферментом
эпителиального слоя, по методу Нельсона в модификации A.M. Уголева и Н.Н Иезуитовой
(1969)) В слоях тонкой кишки (эпителиальный, стромальный, мьппечно-серозный) определяли
активность
ферментов, осуществляющих
заключительные
стадии
гидролиза
белков'
аминопептидазы М (КФ 3.4.11.2), по методу Фарра и др. (Farr W. et al., 1968) и глицил-Lлейциндипептидазы (КФ 3.4.13.2), по методу A.M. Уголева и Н.М. Тимофеевой (1969)
Активность ферментов вьфажали в мкмолях продуктов гидролиза за 1 мин в расчете на 1 г
белка, который определяли по методу Лоури и др. (Lowry et al., 1951).
Экспериментальные данные обработаны статистически с использованием
t-критерия
Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Активность ферментов в эпителиальном, стромальном и мышечно-серозном
слоях тонкой кишки у крыс различных возрастных групп
Для вьшолнения задач исследования были препаративно изолированы эпителиальный (Э),
стромальный (С) и мьппечно-серозный (М) слои тощей и подвздошной кишки у животных трех
возрастных групп (молодые, зрелые, старые). Активность сахаразы обнаружена
только в
1Г1ителиальном слое, а ее отсутствие в постэпителиальных слоях спилетельствует о чистоте
разделения слоев тонкой кишки. У молодых животных бьш отмечен самый высокий уровень
активности фермента в тощей и подвздошной кишке, в 4.1 и 4.6 раза соответственно
превьппающий таковой у зрелых крыс, и в 2 7 и 2 раза у старых (Р< О 05) У старых животных
также бьша обнаружена достаточно высокая активность фермента как в тощей (в 1.5 раза), так и
в подвздошной кишке (в 2.5 раза) по отношению к активности у зрелых крыс (табл 1) Нами
было обнаружено, что наибольшая активность аминопептидазы М (57.5-75.2 % ) приходится на
эпителиальный слой - как тощей, так и подвздошной кишки у крыс всех возрастных групп. Но
следует отметить, что активность аминопептидазы М
в стромальном и мышечно-серозном
слоях также бьша достаточно высока. Так, в стромальном слое тощей кишки она составляла
13 4-23.4% от суммарной активности всех слоев, а в подвздошной кишке 12 8-17.5 %
соответственно, у животных разных возрастных групп. В мышечно-серозном слое активность
фермента составляла в тощей 11.4-18.9 %
и подвздошной кийке 12 8-17.5 % от суммарной
активности всех слоев также у крыс исследованных возрастных групп. Для всех групп
животных характерно одинаковое распределение активности аминопептидазы М вдоль тонкой
кишки между слоями,
за исключением более высокой активности в стромальном слое
подвздошной кишки по сравнению с тощей у молодых крыс. У молодых крыс нами была
обнаружена самая высокая активность фермента в эпителиальном слое тощей и подвздошной
s
кигаки
(в
2 7 раз вьппе по
сравнению
с активностью у зрелых
крыс и в 1.5 раза - у
старых (Р< О 05)) В стромальном и мьш1ечно-серозном слоях тощей кишки молодых крыс
активность фермента не отличалась от активности в этих слоях у зрелых животных Однако в
стромальном и мышечно-серозном слоях подвздошной ктшси она в 1 9 и 1.7 раза превьштала
таковую у зрелых крыс (Р< 0.05). У старых крыс в эпителиальном слое тощей и подвздошной
кишки обнаружен высокий уровень активности аминопептидазы М , в 1.7 раза превьппающий
активность у зрелых животных как в тощей, так и в подвздошной кишке (табл 1)
У крыс разных возрастных групп (молодых, зрелых, старых) имеются различия в уровне
активности
глицил-1>-лейнии;шпептидазы
различных
слоев
тонкой
кишки
(табл 1)
Обращает на себя внимание более низкий уровень активности дипептидазы в эпителиальном
слое по сравнению со стромальпым у крыс всех возрастных групп. Так, у молодых крыс
активность фермента в стромальном слое тощей кишки прсвьппала в 1 5 раза уровень
активности в эпизелиальном слое (Р< 0 05) и составляла
41 2 % активности от суммарной
активности всех слоев, принятой за 100 % . В мъппечио-серозном слое тощей кишки мы также
обнаружили
более
высокую
активность
глицил-Ь-лейциндипептидазы
по сравнению
с
активностью в эпителиальном слое (Р< О 05). На долю мыгаечно-серозного слоя приходилось
32 2 % от суммарной активности всех слоев
У молодых крыс фермент распределялся между
слоями равномерно вдоль тонкой кишки, тогда как у зрелых и старых крыс в эпителиальном и
сфомальном слоях подвздошной кишки уровень активности бьш вьппе по сравнению с
dKi явностью в тощей (табл.1). У молодых животньтх активность фермента во всех слоях тощей
и подвздошной кишки бьша вьппе в 1 5-3 раза по сравнению с активностью у зрелых крыс Но
при
этом
бьша
отмечена
более
низкая
активность
глицил-Ь-лейциндепиптидазы
в
эпителиальном и мьппечно-серозпом слоях тощей кишки (в 2 раза) и в стромальном слое обоих
отделов тонкой кишки (в 2 3 и 15 раза соответственно) у старых крыс по отношению к
молодым (Р< 0.05). Итак, самая высокая активность пептидаз бьша обнаружена у молодых
Kpbic, причем аминопептидазы М - в эпите;шальном слое, а глицил-1,-лейциндепиптидазы - как
в эпителиальном, так и в стромальном и мышечно-серозном слоях.
Из полученных нами данных видно, что самая большая активность аминопептидазы М и
дипептидазы наблюдается в эпителиальном, стромальном и мышечно-серозном слоях тощей и
подвздошной кишки у молодых животных. У крыс всех возрастных групп разные слои тощей и
подвздошной кишки существенно не отличались по содержатпо белка Однако было отмечено
более высокое содержание белка в каждом из слоев тонкой кишки у зрелых крыс по сравнению
с молодыми и старыми (Р<0.05).
Таблица 1.
Активность
(мкмоль/мин
на
г
белка)
сахаразы,
аминопептидазы
М,
глицил-L-
лейциндипептидазы в эпителиальном (Э), стромальном (С) и мышечно-серозном (М) слоях
тощей и подвздошной кишки молодьк, зрелых и старых крыс
Фермент
Тонкая кишка
Группа
живот­
слои тощей кишки
ных
Молодые
Сахараза
Амино-
Э
С
слои п о д в з д о ш н о й к и ш к и
э
М
С
М
132.0±10 0*
0
0
60 0±10 0*
0
0
Зрелые
52.0±5.0
0
0
13.0±1.0
0
0
Старые
48.0±9.0«'
0
0
32.0*4.0', **
0
0
Молодые
95.0±10.0*
17.0±1.0
14 4±1.0
100 а±2о.о*
29 0±5 0*
19 0±2.0*
петидаза
Зрелые
33 0±8 0
14 2±1.0
115±1 0
37 0±4 8
149±20
11 0±2 0
М
Старые
61 0±б 0', *•
1б6±1 0
12 3±1 0
65 0±5 0*
18 0±2 0
140±1 0
[ лицил-
Молодые
262±10*
407±30*
317±20*
271±Ш*
364±30*
279±30"
L-
Зрелые
80±10
155±10
110±15
156±20§
240±20§
И3±30
126±10*,**
170±20«»
1ба±20**
213+30§
240±20**§
220±30
лейцинди
пептидаза
Старые
Примечание; * - Р<0.05 по сравнению со зрелыми животными, ** - с молодыми;
§ - Р<0.05 по сравнению с тощей кишкой; п=6 для каждой группы животных
Активность ферментов в эпителиальном, стромальном и мышечно-серозном слоях
тонкой кишки у крыс различных возрастных групп после иммобилизацнонного стресса
Для
изучения
возрастных
особенностей
реакции
пептидаз
эпителиального
и
субэпителиальных слоев тонкой кишки крыс на стрессорные воздействия в качестве
стрессорного фактора использовали иммобилизацию крыс.
У крыс после иммобилизации
наблюдались геморрагии, иногда эрозии слизистой оболочки желудка, а также повьппение
уровня кортикостерона в плазме крови в 4-7 раз (от 180 до 1300 пмолъ/мл) по сравнению с
контрольными крысами, то есть имели место признаки стрессорной реакции. Было обнаружено,
что только у
молодых крыс активность сахаразы значительно снижалась в эпителиальном
слое тощей и подвздошной кишки после экстремального воздействия в оба срока исследования
(через 24 и 72 ч)
У зрелых крыс, наоборот, можно было отметить существенный рост
активности фермента, особенно через трое суток после иммобилизации А у старых животных
наблюдалось снижение активности сахаразы спустя сутки после
с 1-рессорного фактора Нами
прекращения действия
бьшо показано, что для всех групп животных
характерна
максимальная активность аминопептидазы М в эпителиальном слое гощей и подвздошной
10
кишки (в среднем 60-70 %
от суммарной активности
всех
слоев).
Иммобилизация
животных разного возраста в наших опытах вызьшала существенные, но неидентичные
изменения активности фермента в разных слоях тощей и подвздошной кишки У молодых
крыс через сутки после иммобилизации на фоне 12 ч голодания существенных изменений
активности аминопептидазы М в разных слоях тощей и подвздошной кишки не наблюдалось
Можно отметить лишь увеличение активности фермента (в 1 8 раза) в мышечно-серозном слое
тощей кишки по отношению к контрольным крысам (Р<0.05). Через трое суток после
стрессирования мы наблюдали достоверное снижение (в два раза) активности фермента в
эпителиальном слое тощей кишки. Также некоторое снижение активности фермента нами
было отмечено в
эпителиальном, стромальном, мышечно-серозном
слоях подвздошной
кишки Активность фермента в этих слоях составляла при этом 58-78 % от активности у
контрольных крыс. У зрелых крыс через сутки после иммобилизации нами не обнаружено
достоверных изменений активности аминопептидазы М, хотя наблюдался некоторый рост
активности фермента в эпителиальном слое тощей и подвздошной кишки Значительные
изменения были обнаружены у зрелых крыс спустя 72 часа после прекращения действия
стрсссорного фактора Так, увеличение активности фермента в 2 раза было обнаружено в
стромальном и мьппечно-серозном слоях тощей кишки, а также в 3 раза в мышечно-серозном
слое подвздошной кишки (Р<0.0.5). Можно отметить более высокую долю активности фермента
в субэпителиальных слоях тонкой кишки через 72 часа после действия стресса. В стромальном
слое тощей кишки активность составляла 26.5 %, в подвздошной -17.1 % ; в мьппечно-серозном
слое - 22.6 % в тощей и 31.5 % в подвздошной от суммарной активности всех слоев У старых
крыс, подвергнутых иммобилизационному стрессу, мы также наблюдали изменение уровня
акшвности аминопептидазы М в каждом из слоев тонкой кишки. Так, через сутки имело место
достоверное снижение активности фермента на 40 - 50 % в эпителиальном, стромальном и
мышечно-серозном слоях тошей и подвздошной кишки. Спустя 72 ч изменений активности
аминопептидазы М по сравнению с активностью у контрольных крыс в каждом слое тощей и
подвздошной кишки не бьшо обнаружено, за
исключением мышечно-серозного слоя
подвздошной КИ1ПКИ, в котором наблюдалось увеличение активности в 1.4 раза (Р-^О 05, табл.2).
Активность преимущественно внутриклеточной глицил-Ь-лейциндипептидазы была
достаточно высока в субэпителиальных слоях тонкой кишки у крыс разных возрастных групп,
подвергнутых иммобилизации. У молодых животных через сутки после иммобилизации было
обнаружено снижение активности фермента лишь в эпителиальном слое тощей кишки, в
стромальном и мышечно-серозном слоях тощей кишки активность оставалась на уровне у
кон грольных крыс. В стромальном слое подвздошной кишки наблюдалось увеличение
активности фермента, примерно в 1.5 раза по сравнению с контрольными животными
(Р<0 05) Через 72 часа после стрессирования в эпителиальном и мышечно-серозном слоях
тощей кишки наблюдалось достоверное снижение (в 1.5 раза) активности фермента, тогда как в
слоях подвздошной кишки активность глицил-
11
L-лейциндипептидазы существенно не
отличалась от активности у контрольной группы молодых крыс.
Таблица 2.
Активность аминопептидазы М,
глицил-Ь-лейциндипептидазы
(мкмоль/мин на г белка)
в
эпителиальном ( Э ) , стромальном (С) и мьппсчно-серозном (М) слоях тощей и подвздошной
кишки у контрольных молодых, зрелых и старьтх крыс ( К ) и после иммобилизации
X
(-я
а>
S
а.
ij
■е
5
1
ч
f-
с:
V
с
о
X
X
Z
<
с4
а
3
п
S
S
с
>>
1?
11
11
Тонкая кшшса
слои тощей кишки
Э
С
М
слои подвздошной кишки
э
С
м
к
93.0*10.0
170*10
14.4±1.0
100 0*200
29 0*5 0
19 0*2 0
§
24 ч
105.0±10 0
19.0±1 0
26 8+2 0*
97 0*9 1
19 5*2 0
16 8*10
5
72 ч
50 0±6 5*
15 0±16
16.0±10
76 8*12.5
17 0*3 0
15 0*2 0
110*2 0
О
К
35 0±8 0
14 2±10
11.5±10
37.0*4 8
14 9±2 0
24 ч
56.3±9 6
13.7±3 9
13.6±2 0
51 0*100
10.8*1 0
13 5*2 0
ГО
72 ч
59.0±13.0
30.6±5.0*
26.1±3.0'
53.8*8 0
18.0*3.0
33 0*7.0*
а>
X
CL
се
К
61.0±6.0
16.б±1.0
12.5±1.0
65.0*3.0
18.0*2.0
14.0+1 0
24 ч
310±3 0*
9 3±0 6*
6 5±0 5*
32.0*7 0*
10 3±1 2*
7 6±10*
72 ч
53О±1О0
19 4±3 5
16 9*2.5
51.2*124
19 1*5 0
19 6*2 0*
2б2±10
407±30
317*20
271*10
364*30
279+30
24ч
172±27*
406±16
351470
324460
554*50*
376*70
72 ч
179±20»
370±40
200*20*
221±30
284±30
253*45
U
G.
5
3
g
К
н
с
V
с
з:
s
SOilO
155±10
110*15
156±20
240*20
153*30
X
3
24 ч
166±20*
223±25*
230*36*
235*23*
240*29
279*45*
1
72 ч
=(
я
=1
>2
<=;
_Ь
с;
X
::J
з:
=1
L.
u
u
3
a.
p
<j
К
338*50*
572±95*
450*40*
377*33*
633*113*
752*110*
К
126.0±10 0
170.0±20.0
1600*20.0
215 0±30 0
240 0*20 0
220 0±30 0
24 ч
76.0*15.0*
168 0±19.0
159 0*16.0
112.7*13.7*
210 0*310
224.0+15 0
72 ч
183 7±38.8
515.9±84.5»
474.0*80 0*
319 5*39 4
516.6+62 8*
507 0*20 0*
Примечание: * - Р<0.05 по сравнению с контролем в своей возрастной группе.
У зрелых крыс через сутки после иммобилизации было обнаружено увеличение активности
глицил-Ь-лейщ1ндипептидазы в эпителиальиом слое тощей и подвздошной кишки в 2 и 1 5 раза
соответственно (Р<0.05). Также
бьшо обнаружено увеличение активности фермента в 1 5-2
раза в стромальном и мьппсчно-серозном слоях тощей кишки (Р<0.05) и в 1.8 раза в мьппечносерозном слое подвздоптой кишки (Р^О.05). Самые значительные изменения активности
фермента
имели место через 72 часа после прекращения иммобилизации Так.
увеличение
активности фермента в 2 - 5 раз было обнаружено во всех слоях тощей и подвздошной кишки
(табл.2') У старых крыс через сутки после иммобилизации можно было отметить
снижение
12
уровня
активности
дипептидазы
в
эпителиальном
слое
как
тощей,
так
и
подвздошной кишки, в 1.6 и 1.9 раз соответственно (Р<0.05). Спустя трое суток наблюдалось
увеличение активности фермента в 2-3 раза в субэпителиальньк слоях тощей и подвздошной
кишки (Р<0 05). Таким
образом, активность
глипил-Ь-лейциндипептидазы
по-разному
менялась у трех возрастных групп крыс через 24 и 72 ч после иммобилизащ™.
Через 24 ч
у
молодых животных
паблюдалось
снижение
активности
фермента в
эпителиальном слое тощей кишки, у зрелых - увеличение активности практически во всех
слоях тонкой кишки, у старых - снижение активности фермента в эпителиальном слое обоих
0ТДС10В тонкой кишки Через 72 ч после прекращения действия стресс-фактора
животных
наблюдалось
снижение
активности
фермента,
наиболее
у молодых
выраженное
в
эпителиальном и мьппечно-серозном слоях тощей кишки, у зрелых - увеличение активности
фермента во всех слоях тонкой кишки, а у
субэпителиальных
слоях тонкой кигаки
старых -
рост активности фермента в
По нашим данным также через сутки
после
им.чобилизационного стресса наблюдалось значительное снижение содержания белка в каждом
HJ слоев обоих отделов тонкой киптки у зрелых крыс. Причем надо отметить, что спустя трое
суток после прекращения действия стрессирующего фактора это снижение бьио выражено в
еще большей степени. У молодых животных через одни сутки после прекращения действия
стресса снижение уровня белка имело место в
эпителиальном и
мьппечно-серозном слое тощей кишки и в
мышечно-серозном слоях подвздошной кишки. Через трое суток после
иммобилизационного стресса
имело место полное восстановление содержания белка
У
старых крыс не бьио обнаружено изменения в содержании белка во всех трех слоях по всей
длине тонкой кишки.
Л|С1Ивность ферментов в эпителнальном, стромальном и мышечно-серозном слоях
гоикий к и ш к и у крыс разных возрастных групп после белковой депривации
Масса тела после белковой депривации у зрелых животных снизилась - на 33 % , у молодых
и старых не изменялась по сравнению с массой у контрольных животных После белкового
голодания у молодых зкивотных активность сахаразы в эпителиальном слое тощей и
подвздошной кшшш возрасгала в среднем в 2 раза, у зрелых - в 2-6.4 раза, у старых - в 4.7-6 3
paw по сравнению с
активностью соответствующего слоя у контрольных крыс (Р<0 05)
Увеличение активности фермента, вероятно, связано с тем, что в безбелковой диете повышен
углеводный компонент (табл.3).
11еобходимо отметить, что наибольшая активность аминопептрщазы М наблюдалась в
эпителиальном
слое обоих отделов тонкой кишки у всех возрастных групп, получавших
контрольную или безбелковую диеты. Активность фермента постэпителиальных слоев также
была достаточно высока. На долю эпителиального слоя приходилось около 60 % , стромального
- 20 % . мышечно-серозного - 20 %
от суммарной активности всех слоев, принятой за 100 %
Существенных
изменений в распределении
13
активности фермента между слоями тонкой
кишки у контрольных и опытных крыс не происходило
У молодых крыс, получавших
безбелковую диету, активность аминопептидазы М существенно не изменялась по сравнению с
активностью у контрольных крыс. У зрелых опытных крыс в эпителиальном слое как тощей,
гак и подвздошной кишки было обнаружено увеличение активности фермента в 2 5 и 2 раза
соответственно, а в стромальном слое подвздошной кишки - в 2 раза по отношению к
активности у котггрольных крыс (Р<0 05) Существенное увеличение активности фермента
наблюдалось в каждом слое тощей и подвздошной кишки
у старых крыс, получавших
безбелковую диету Так, активность аминопептидазы М в эпителиальном и стромальном слоях
тощей и подвздошной кишки выросла по отношению к активности у контрольных животных
примерно в 4 раза, а в мышечно-серозном слое - в 2 6 раз (Р<0 05)
В наших исследованиях бьшо обнаружено, что безбелковая диета вызывала увеличение
активности аминопептидазы М в эпителиальном слое тощей и подвздошной кишки у зрелых и
старых животных, а у старых крыс наблюдалось также существенное увеличение ее активности
в субэпителиальных слоях.
Белковое
голодание
приводило
также
к
значительным
изменениям
преимущественно цитозольного фермента глицил-Ь-лейцинднпептидазы
активности
в тонкой кишке
крыс разного возраста Высокий уровень активности глшшл-Ь-лейциндипептидазы наблюдался
не только в эпителиальном слое, но и в стромальном и мьппечно-серозном слоях тощей и
подвздошной кишки у крыс всех возрастных групп, получавших контрольную и безбелковую
диеты (табл 3)
У старых зкивотных видно, что на долю эпителиального слоя в среднем
приходилось не более 30 % активности, тогда как на долю субэпителиальных слоев - около 40
% от суммарной активности всех слоев
У молодых крыс активность фермента в слоях обоих
олделов тонкой кишки практически не изменялась после белковой депривации. У зрелых крыс,
получавигах безбелковую диету, активность дипептидазы повьппалась в эпителиальном слое
тощей и подв-злоганой кишки в 1.7 и 1.9 раза (Р<0 05), в стромальном слое подвздошной в 1 7
раза (Р<0.05), а в мышещго-серозном слое изменений активности фермента не бьшо У старых
животных активность глшщл-Ь-лейциндипептидазы увеличивалась в каждом из слоев обоих
отделов тонкой кишки в 3.7-7 6 раз по сравнению с активностью фермента у крыс, получавших
полноценный рацион {Р<0.05) У молодых крыс, получавших контрольную диету, фермент
распределялся равномерно между тощей и подвздошной кишкой в каждом из слоев После
нахождения на безбелковой диете было обнаружено, что в эпителиальном слое подвздошной
кишки уровень активности глицил-Ь-лейциндипептидазы в 2 2 раза вьппе, чем в тощей
Таблица 3
Активность сахаразы,
белка) в
аминопептидазы М, глицил-Ь-лейпиндипептидазы (мкмоль/мин на г
эпителиальном (Э), стромальном (С) и мьппечно-серозпом (М) слоях тощей и
подвздошной кишки молодых, зрелых и
старых крыс, получавших контрольную ( К ) и
безбелков!!© (ББ) диеты
1
группа
Тонкая кишка
живот­
ных
Молодые
}
Зрелые
Старые
5
Молодые
зрелые
старые
1
Молодые
зрелые
1
старые
слои тощей кишки
Э
Диета
К
С
слои подвздошной кишки
э
М
С
М
66.0±4.0
0
0
33.0*7 0
142.7±30 7'
0
0
61 6*7
К
38 0+9.0
0
0
40.0*8 0
ББ
24б.0±40.0*
0
0
89.0*7.0»
0
0
К
21.6±1.б
0
0
11.0+2.0
0
0
102.0±17.0*
0
0
70.0*6.0»
0
0
15 0±2.0
16 0±2 0
16 0±3 0
52 0+7.0
21Of-2 0
21 0+2 0
ББ
66 0*10 0
14 0±2 5
15 3+3.3
72.4+9.5
23.0*5.0
23 7*4 0
К
60 0±12 0
19±3 0
15 0*3 0
710*15 0
19 0*2 0
18 0*2 0
ББ
157 0i9 0*
27 0±2 0
18 0±.3 0
139 0*6 0*
40 0*2 0*
18 0*3 0
К
23О±3 0
9 0±10
8.0*1 0
20 0*2 0
90*10
9 0*2 0
93.0±15.0*
410±7 0*
21 0*5 0*
80 0± 10.0*
39 0±3 0 '
24 0*4.0*
234±39
34б±44
388*49
315*31
375±5П
466*49
ББ
165-tll
278±39
244*40
377*74
340*20
378+70
К
236±30
276±35
269*46
282*41
353*57
485*61
ББ
404±20'
391±50
287*27
554±20'
603*78*
519*90
93±10
150±16
161*22
80*9
142*17
156*32
600*110»
614*48*
695*58*
583*75*
ББ
ББ
К
ББ
К
К
ББ
548*105'
759*121'
с
0
0
0
0
0
0
U11римечанис: * - Р<0.05 по сравнению с контролем в своей возрастной группе
В
субэпителиальных
слоях
подв.здошной кишки можно
отметить лишь
тенденцию
к
увеличению активности дипептидазы по отношению к соответствующим слоям тощей кишки
У зрелых крыс контрольной и опытной групп активность фермента в эпителиальном
и
сфомальном слоях гюдвздошной кишки бьша несколько вьшхе, а в мышечно-серозном в 1 8
раза превышала таковую в этих же слоях тощей кишки У старых животных мы не наблюдали
ра5личий в распределении дшюптидазы между слоями тощей и подвздошной кишки. Обращает
на себя внимание более высокое содержание белка (в 2-3 раза) во всех слоях тощей и
подвзаошной кишки у старых крыс кшггрольной группы по сравнению с молодыми и зрелыми
животными, получавшими также контрольную диету.
15
После
белкового
голодания
было
обнаружено
резкое
снижение
количества
белка в различных слоях тонкой кишки, более выраженное у старых крыс Так, у молодых
животных в эпителиальном и стромальном слоях тощей и подвздошной кишки, а также в
мытечно-серозном слое тощей кишки наблюдалось снижение количества белка в среднем на
40-50 % по 0Т1ГОшению к контрольным крысам У зрелых опьггаых крыс также наблюдалось
снижение содержания белка в каждом из слоев тонкой кишки в среднем на 30-40 % У старьк
крыс, получавших безбелковую диету, содержание белка снижалось в эпителиальном
и
стромальном слоях тощей и подвздошной кишки более чем на 70 % , а в мьш1ечно-серозном
слое обоих отделов тонкой кишки - на 60% по сравнению с количеством белка у контрольных
крыс.
ЗАКЛЮЧЕШП;
в результате проведенных исследований показано, что активность ферментов пептидазного
пула
(на
примере
аминопептидазы М
и глицил-Ь-лейциндипептидазы)
неодинакова
в
различных слоях тонкой кишки у крыс разньк возрастных групп. Кроме того, различна
чувствительность ферментных систем слоев к стрессорному воздействию, в том числе к
белковой депривации. Повышение пептидгидролазной активносга в субэпителиальных слоях
юнкой кишки
является следствием адаптационно-компенсаторных перестроек в организме
животньк.
Полученные данные расширяют гипотезу, вьшвинутую академиком А.М.Уголевым о
существовании постэпи1елиального энзиматического барьера в тонкой кишке. Наши данные
продемонстрировали, что совершенное и надежное вьшолнение функций физиологического
барьера структурами тонкой кишки достигается, во многом, благодаря взаимодействию
ферментных систем эпителиального, стромалыюю и мышечно-серозною слоев и в большой
мере зависит от возрастных особенностей организма.
ВЫВОДЫ
1
Обнаружена активность ферментов, осуществляющих гидролиз белков и пептидов
(аминопептидаза М и глиш1Л-Ь-лейциндш1ептидаза), не только в эпителиальном слое, что было
известно ранее, но и в стромальном и мьппечно-серозном слоях тонкой кишки у крыс Вистар
разных возрастных групп (молодые, зрелые, старые). Показано, что сахараза присутствует
только в эш1теяиальном слое тонкой кишки, что позволило использовать ее в качестве маркера
для оценки чистоты разделения этих слоев
2
Активность аминопептидазы М в эпителиальном слое тощей и подвздошной кишки значи­
тельно выше у молодых (в 2.7 раза, Р<0.05) и старых (в 1.7 раза, Р<0.05) животных по сравне­
нию со зрелыми. В стромальном и мытечно-серозном слоях активность фермента составляла
16
10-20 % от суммарной активности всех слоев.
В подвздошной кишке у молодых животных
она была выше (в 2 раза, Р<0 05), чем у зрелых Более высокий уровень активности глицил-Т 1ейциндипептидазы у молодых животных по сравнению со зрельши и старыми
прог(емонстрирован не только в эпителиальном слое тошей и подвздошной кишки, но также в
стромальном и мышечно-серозном слоях
3
Иммобилизация в течение 3 ч
вызывала у зрелых животных увеличение активности
ами1юпептидазы М в субэпителиальных слоях тошей (в 2 раза, Р<0 05) и подвздошной (в 3
раза. Р<0 05) кишки через трое суток, а глицил-Ь-лейциндипептидазы - в каждом из слоев
обоих отделов тонкой кишки через одни (в 1.5 - 2 раза, Р<0.05) и трое (в 2 - 5 раз, P-^O.OS)
су ГОК после прекращения действия стрессорного фактора. У старых крыс активность аминопептидазы М снижалась (на 40-50 % , Р<0 05) в каждом из слоев обоих отделов тонкой кишки
сг1ус1Я сутки и полностью восстанавливалась до уровня активности у контрольных крыс через
трое суток после стрессорного воздействия Активность дипептидазы уменьшалась (почти в 2
раза, Р<0 05) в эпителиальном слое тощей и подвздошной кишки через сутки, но существенно
^'величивалась (в 2-3 раза, Р<0 05) в субэпителиальньк слоях через трое суток после действия
иммобилизационного стресса Реакция ферментных систем слоев тонкой кишки молодых
животных была менее выраженной по сравнению со зрелыми и старыми
4
В условиях 10-суточной белковой депривапии наблюдалось увеличение активности
аминопептидазы М (в 2.5 - 4 раза, Р<0.05) и глицил-Ь-лейциндипептидазы (в 4 - 8 раз, Р<0 05)
у ciapbix крыс по всех слоях тощей и подвздошной кишки. У зрелых животных реакция
пептидгидролаз была менее выражена, а у молодых - отсутствовала.
5
Полученные данные свидетельствуют, что энзиматический барьер тонкой кишки включает
ферментные системы не только эпителиального слоя, но и субэпителиалъных (стромального и
мышечно-сероэного) слоев, что подтверждается их неоднозначной реакцией на стрессорные
воадействия Благодаря этому увеличивается мощность кишечного энзиматического барьера и
затрудняется проникновение во внутреннюю среду веществ белковой и пешидной природы,
обладающих гормональной и антигенной активностью
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1 ИГевмывак Ю В Возрастные особенности энзиматического барьера тонкой кишки крыс //
X V I I Всероссийский съезд физиологов - Ростов-на -Дону,1998.-С. 211
2 Невмывак Ю В , Николаева М К. Пип[еварительные ферменты различных слоев тонкой
кишки // Материалы 52-й конференции молодых ученых и студентов. - СПб, 1998.-С 47-48
3 Невмывак Ю. В., Скопичев В.Г Активность пептидгидролаз эпителиального и
постэпителиальных слоев топкой кишки у крыс разного возраста после кратковременной
иммобилизации // Всеросс. научн. конф. с межд. участием, поев. 150-летию со дня рожд. И.П
Павлова. Санкт-Петербург, 15-17 сентября 1999г - СПб ,1999.-С 234.
17
4 Невмывак Ю В , Тимофеева Н.М.
Особенности распределения пептидаз в
разных слоях тонкой кишки крыс в зависимости от возраста // Журн. эволгоц биохимии и
физоилогии.- 1999.-Т.35.-№4.-С. 330-331.
5 Невмывак Ю В., Тимофеева Н.М. Активность амино- и дипептидаз эпителиального и
субэпителиальных слоев тонкой кишки у крыс разного возраста после иммобилизационного
стресса // Росс физиол. журн. им И.М. Сеченова -1999 -Т85->Г»12-С1574-1581
fi Невмывак Ю В., Тимофеева Н М Активность пептидгидролаз эпителиального и
субэпи гелиальных слоев тонкой кишки крыс разного возраста после белковой лепривации //
Журн эволюц. биохимии и физиологии - 2002 - Т.38 -№ 3 - С 214-219
7
ГимофееваН М , Неямьгеак Ю В
Иммобилизационный стресс изменяет функционирование
ферментных систем эпителиального и субэпителиального слоев тонкой кишки у крыс разного
возраста // Материалы научно-практической конференции «Приоритеты культуры и экологии в
образовании».- Ставрополь, 2003.- С. 46-47.
8 Тимофеева Н М., Дмитриева Ю В. Возрастные особенности энзиматического барьера тонкой
кишки при стрессе // Современные проблемы физиологии и санокреатологии.- Кишинев, 2005 С 202-207.
Отпечатано в типографии «Микроматикс»,
Санкт-Петербург, Большой пр. В. О., д.55, тел. 328-52-63
Подписано в печать 03.10.2005, тираж 100 экз., объем 0,92 усл.изд.л.
«818601
РНБ Русский фонд
2006-4
19810
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
825 Кб
Теги
bd000100947
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа