close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

bd000101055

код для вставкиСкачать
на правах рукописи
БАРЫШНИКОВА ЕКАТЕРИНА НИКОЛАЕВНА
ИССЛЕДОВАНИЕ ЯДРА СВОРАЧИВАНИЯ АПОМИОГЛОБИНА
03.00.02. - биофизика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата физико-математических наук
ПУЩИНО-2005
Pdooia выпотнена в Института бетка Р А Н
Н а у ч н ы е руководители:
доктор физико-математических наук
Бычкова Валентина Егоровна
Официальные оппоненты:
доктор физико-математических наук
Пермяков Евгений Анатольевич
доктор физико-математических наук
Потехин Сергей Александрович
Ведущая органи!ация
ИНСТИТУТ ЦИ ГОЛОГИИ
РАН
Защита состоится
13 час 30 мин на заседании диссертационного
совета Д002 093 01 в Институ те 1еоретической и экспериментальной биофизики Р Л Н по
адресу 142290. г Пущино Московской области. Инсти1утская ут . 3
С диссертацией можно ознакомиться в Центра.1Ьной библиотеке Путинского Н Ц Б И Р А Н
Автореферат раюслан « /f
■>■: OUf $itf
2005 i
Ученый секретарь
диссертационного совета
кандидат физико-математических наук
-^ ■ i C C t
й
j j ф Ланина
^тг
^^^'^
IJJUC-
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность
проблемы.
Выяснение
механизма
спонтанного
сворачивания белков является одной из важнейших задач биофизики. Известно,
что многае болезни связаны с агрегацией или неправильным сворачиванием
белка. Оба этих процесса могут быть следствием не только завязывания
боковыми группами белка ненативных контактов в результате мутаций, но и
изменения скорости сворачивания белка. Путь сворачивания белков проходит
через формирование нестабильных переходных состояний и, в большинстве
случаев,
также
через
формирование
метастабильиых
промежуточных
состояний. В связи с этим, для понимания механизма сворачивания белков
необходимо исследование структурных и энергетических характеристик как
промежуточных, так и переходных состояний. Такого рода исследования
осложняются тем, что формирование ранних промежуточных
состояний
происходит в миллисекундном временном интервале, и, зачастую, скорости их
формирования не могут быть измерены экспериментально, хотя их присутствие
влияет на видимую скорость формирования нативного состояния белка. Для
исследования структуры нестабильных переходных состояний необходимо
знание скоростей всех этапов сворачивания и разворачивания белка в широком
диапазоне концентраций денатуранта. Только в этом случае возможно оценить
вклад отдельных остатков в процесс сворачивания белка, в частности, в
формирование ядра сворачивания белка, т.е. структуры белка в переходном
состоянии, обеспечивающей последующее быстрое и правильное сворачивание
белка в нативную
структуру. В результате интенсивных исследований
небольших белков, сворачивание и разворачивание которых происходит по
одностадийному механизму (т.е. без накопления промежуточных состояний),
разработан подход (Ф-анализ
термодинамики
переходного
Фёршта)
состояния,
для исследования структуры и
формирующегося
на барьере,
разделяющем нативное и развернутое состояние, путем введения точечных
мутаций и выявления аминокислотных остяткон- замена которых
сильно
Р О С НАЦИОНАЛЬН
меняет скорость сворачивания белка. Одна! о Aii%ttiJSf^g^^SP^ структурных и
>1
II
1.1
i
термодинамических характеристик переходных и промежуточных состояний в
более крупных белках, сворачивание которых происходит по многостадийному
механизму, этот подход нуждается в дальнейшем усовершенствовании.
Данная работа посвящена разработке подхода, с помощью которого было
бы возможно определять скорости отдельных переходов в белках с тремя
состояниями (т.е. сворачивание
которых
проходит по
двухстадийному
механизму, с накоплением одного промежуточного состояния), а также
изучению, с помощью этого подхода, ядра сворачивания апомиоглобина.
Исследование структуры ядра сворачивания апомиоглобина проводили путем
введения точечных замен аминокислотных (а/к) остатков и изучения влияния
данных замен на стабильность промежуточного и нативного состояний белка и
на скорость его сворачивания и разворачивания.
Цель н задачи исследования. 1. Разработать подход для анализа
кинетических данных по сворачиванию/разворачиванию белков, имеющих три
состояния: нативное (N), промежуточное (I) и развернутое (U) (на примере
апомиоглобина).
2. Исследовать влияние а/к остатков, теоретически предсказанных как
входящих в ядро сворачивания, на стабильность промежуточного и нативного
состояний, а также на скорость сворачивания и разворачивания апомиоглобина.
Научная новизна работы. Разработан метод анализа кинетических
данных для белков, сворачивающихся через формирование промежуточного
состояния. Метод позволяет также изучать структуру переходного состояния на
пути
сворачивания
таких
белков.
Использование
этого
подхода
для
исследования сворачивания и разворачивания апомиоглобина позволило найти
а/к остатки, ответственные за его стабильность и скорость сворачивания в
нативную структуру. Впервые получена зависимость доли кинетического
промежуточного
состояния, формирующегося
в
процессе
сворачивания
апомиоглобина, от концентрации денатуранта. Это позволило разделить вклады
различных состояний в кинетику' процесса сворачивания апомиоглобина.
Показана возможность оценки кинетических и энергетических параметров для
случаев с не полностью-заверщенным1)[ переходами U'f-^N.
2
Практическая значимость работы. Понимание процесса сворачивания
сложных белков, каким является апомиоглобин, может быть использовано в
рациональном
конструировании
de novo белков
с
заранее
заданными
свойствами для нужд промышленности и медицины.
Оценка
энергетических
параметров
равновесных
и
кинетических
процессов сворачивания/разворачивания белковой молекулы позволяет выявить
наиболее дестабилизирующие мутации, замедляющие процесс сворачивания
белка. Получение такой информации является важным для
выявления
конформационных изменений в структуре белков, приводящих к амилоидным
образованиям, и для разработки подходов к конструированию лекарственных
средств, предотвращающих формирование амилоидных депозитов.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены
на
международных конференциях: International Conference in Honour of Alexander
Spirin "Protein Synthesis" (Пущино, Россия,, 2001); International Summer School
"Understanding Protein Stability"( Huddinge, Sweden, 2004); 49* Annual Meeting
of Biophysical Society (Long Beach, С A, USA, 2005), 6* European Symposium of
the Protein Society (Barcelona, Spain, 2005), 30* F E B S Congress "The Protein
World" (Budapest, Hungary, 2005), Annual Meeting of International Research
Scholars of the Howard Hughes Medical Institute (Mexico, 2005); на российских
конференциях:
щкола-конференция
«Горизонты
физико-химической
биологии» (Пущино, Московская область, 2000), 5-ая Пущинская конференция
молодых ученых. (Пущино, Московская область, 2001), Открытый семинар
кафедры Молекулярной биофизики физического факультета СПБГУ (СанктПетербург, 2001), Третий Всероссийский Биохимический Съезд (СанктПетербург, 2002), I I I Съезд Биофизиков России (Воронеж, 2004), 17*" зимняя
молодежная
школа
"Перспективные
Направления
Физико-Химической
Биологии и Биотехнологии" (Москва, 2005), ежегодные научные конференции
Института белка Р А Н (Пущино, Московская область, 2000, 2001, 2002, 2003,
2004,2005).
Публикации. Основные результаты диссертации опубликованы в 16
печатных работах, в том числе 3 статьях.
Структура
диссертации.
Диссертация
"Материалов
и методов", четырех
обсуждению
экспериментальных
состоит
из '^Bвeдeнuя",
глав, посвященных
данных,
описанию
"Заключения"
и
и
"Списка
цитируемой литературы". Работу иллюстрируют 22 рисунка и 4 таблицы.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Апомиоглобин сворачивается довольно быстро при физиологической и
комнатной температурах,
но^ для детального
исследования необходимо
замедлить скорость его сворачивания путем использования области более
низких
температур.
Однако
апомиоглобин
претерпевает
холодовую
денатурацию, температура перехода которой зависит от рН, и при рН 5.0 она
начинается с З^С. Поэтому, чтобы структура апомиоглобина не подвергалась
холодовой денатурации, была выбрана температура 11°С [Барышникова и др.,
2005]. Выбор рН 6.2 обусловлен тем, что при этом рН даже наиболее
дестабилизированная мутантная форма апомиоглобина с заменой Тгр 14 на Ala
сохраняет «нативную» структуру и не агрегирует.
Равновесное разворачивание апомиоглобина мочевиной. На рис. 1
представлен
денатурационный
переход
апомиоглобина
под
действием
мочевины, наблюдаемый методом КД в дальней У Ф области. Переход хорошо
описывается наличием двух состояний с серединой перехода при 2.9 М
*'»
,Е! у.
{ш
§ 140
IIЖ
ш rffk '
ш\
о. 80
Г
i *
■
S
РисЛ. Равновесное разворачивание
апомиоглобина
мочевиной,
регистрируемое по изменению
спектра КД в дальней У Ф области
f т/^* '
ш/
Ш
\
иЛяМ
Vi
'■•JIW >
w^
^
^
»
о
хм ЗМ Э» ЭМ Э4« 3» 3« Э7» ЭМ ЗМ 4М 410 43* 43в 4« 4Я
Д л п и нлны,ни
р^^.г. Спектры Тгр флуоресценции апомиоглобина при
разных концентрациях мочевины. Пунктирная линия
указывает длину волны 335 нм, на которой проводились
кинетические эксперименты. Вставка - зависимость Тгр
флуоресценции на 335 нм от концентрации мочевины.
мочевины. Однако, изменение спектра триптофановой (Тгр) флуоресценции
при увеличении концентрации мочевины (рис. 2) указывает на накопление
термодинамически стабильного промежуточного состояния апомиоглобина
(появление максимума I335 от концентрации мочевины), интенсивность Тгр
флуоресценции которого заметно выше интенсивности нативного (N)
и
развернутого (U) конформационных состояний белка (рис. 2, вставка). Повидимому, промежуточное состояние имеет содержание вторичной структуры
близкое к нативному, но сильно отличается по флуоресцентным свойствам.
Последнее
подтверждается дальнейшими
кинетическими
исследованиями
процессов сворачивания и разворачивания апомиоглобина.
Исследование
кинетических
процессов
сворачивания
и
разворачивания апомиоглобина. На рис. 3 представлены кинетические
кривые
сворачивания
мочевины),
апомиоглобина
зарегистрированные
из
по
развернутого
изменению
состояния
(5М
интенсивности
Тф
флуоресценции на 335 нм. Видно, что при конечных концентрациях мочевины
ниже ЗМ существуют две последовательные фазы сворачивания: 1-ая фаза
протекает за мертвое время прибора и видна только по скачкообразному
увеличению интенсивности флуоресценции, и 2-ая фаза, которая проявляется
т
1.0
\
1' \
ИХ
•*
Ш,
v.
IV
0.5
\
^l^^M^Vw^'^^A*^^^ ■^^1/■
Д' ^VWvv-'^^.n^^'^'W^A'VSMi^ V*^VA*yvWV"^>W''A'
0.0
OJ
0.4
0.6
0.8
.0
Время, сек.
Р и с З . Кинетические кривые ренатурации
апомиоглобина, регистрируемые с помощью
метода Тгр флуоресценции. Цифры рядом с
кривыми
соответствуют
концентрациям
мочевины в растворе после смешения.
Длина волны регистрации флуоресценции
(I335) составляла 335 нм.
«««ь
0.0
0
1
2
,
г ,
vmm
"'"'
, :
^е55§
б
3
5
4
Концентрация мочевины, М
Рис.4. Зависимость доли (fi) кинетического
промежуточного состояния, рассчитанной из
амплитуды первой фазы сворачивания (когда
нативное состояние еще не успело образоваться),
от концентрации мочевины. Вставка- Изменение
амплитуды первой фазы сворачивания при
уменьшении концентрадаи мочевины.
как
относительно
концентрациях
медленное
мочевины
падение
выше
ЗМ
интенсивности.
наблюдается
При
только
конечных
1-ая
фаза,
проявляющаяся как скачкообразное увеличение интенсивности флуоресценции.
Таким образом, за мертвое время прибора происходит переход апомиоглобина
из развернутого состояния (U) в кинетическое промежуточное состояние (I), а
затем переход из промежуточного состояния в нативное (N). По возрастанию
амплитуды первой фазы сворачивания (переход U->I)
можно
оценить
увеличение доли промежуточного состояния (fi) при уменьпхении конечной
концентрации мочевины в процессе сворачивания белка (рис. 4). Населенность
промежуточного
состояния
пропорциональна
амплитуде
первой
фазы
сворачивания А(М). Параметр fr(M), соответствующий доле молекул в
промежуточном состоянии перед началом перехода в N, можно рассчитать по
формуле:
Ару^-А,^
А,(М)-А„(М)
где Аи(М)
(1)
и Ai(M) - значения данного параметра для развернутого и
промежуточного
состояний, соответственно, полученные
экстраполяцией
базовых линий в область перехода (вставка на рис. 4). Отметим, что величина
есть доля молекул в развернутом (U) состоянии, перед началом образования
нативного состояния (N) составляет (1- fi(M)). Из рис. 4 видно, что амплитуда
первой фазы перестает увеличиваться при конечных концентрациях мочевины
ниже 1.2М мочевины. Можно предположить, что при концентрациях мочевины
меньших, чем 1.2 М, все молекулы белка на момент начала перехода в нативное
состояние уже находятся в промежуточном состоянии. При 2.2 М мочевины
доля промежуточного состояния составляет 0.5 (см. рис. 4). Это означает, что
при этой концентрации мочевины промежуточное и развернутое состояния
равны по стабильности, т.е. имеют одинаковую свободную энергию. Вместе с
тем, из рис. 2 видно, что равновесное промежуточное состояние максимально
населено в районе 3 М мочевины, и эта населенность (как следует из графика
зависимости fi(M) от концентрации мочевины на рис.4) не превышает 10%.
На
рис.
5
представлены
кинетические
кривые
разворачивания,
регистрируемые по изменению интенсивности флуоресценции на длине волны
335 нм. При конечных концентрациях мочевины ниже 3.5 М наблюдается
возрастание интенсивности кинетических кривых, а затем, с увеличением
конечной концентрации денатуранта, кинетические кривые разворачивания
меняют знак. Это может быть объяснено следующим образом. Пока (при низких
концентрациях
мочевины) развернутое состояние менее стабильно,
чем
промежуточное, наблюдается рост интенсивности в ходе денатурации, так как I
характеризуется большей интенсивностью Т ф флуоресценции. По мере того,
Рис.5.
Кинетические кривые разворачивания
апомиоглобина, регистрируемые методом
триптофановой флуоресценции. Цифры
рядом
с
кривыми соответствуют
концентрациям мочевины в растворе
после
смешения.
Длина
волны
регистрации флуоресценции составляла
335 нм.
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
1.4
1.6 1.8 2.0
как с ростом концентрации денатуранта состояние U становится более
стабильным, чем I, U начинает доминировать в денатурированном состоянии
белка, и, так как его интенсивность меньше, чем в нативном состоянии (рис. 2,
вставка), происходит смена знака кинетических кривых. Однако константа
скорости
процесса
энергетическим
определяется
барьером
между
исключительно
N
и
I.
первым,
Последующее
большим
быстрое
перераспределение молекул между I и U практически не дает вклада в
константу скорости разворачивания из N в I (RNI) ИЛИ из N в U (кми), и, таким
образом, кщ = ICNU- Следует отметить, что, поскольку до 3.5 М мочевины
наблюдается процесс увеличения интенсивности флуоресценции (напомним,
что интенсивность флуоресценции на 335 нм у промежуточного состояния
выше, чем у нативного), процесс разворачивания, по крайней мере, до 3.5 М
мочевины, проходит через промежуточное состояние.
Построение и анализ зависимости константы скорости сворачивания
и разворачивания апомиоглобина от концентрации денатуранта.
Необходимым условием исследовшгая структуры белка в переходном состоянии
(ядра сворачивания белка) является построение зависимости констант скоростей
сворачивания и разворачивания от концентрации денатуранта (так называемого
шевронного
фафика). На рис. 6 представлена такая зависимость для
апомиоглобина. При детальном рассмотрении этой зависимости можно
заметить, что она (рис. 6) отличается от шевронньпс графиков белков,
сворачивающихся по одностадийному механизму. Во-первых, в области малых
концентраций мочевины (< 1.5 М) наблюдается загиб ветви сворачивания,
который обычно объясняют наличием промежуточного состояния [Matouschek
et al. 1990] или широким переходньпи состоянием [Temstonn et al. 1999]. Вовторых, константы скорости в области минимума шевронного графика заметно
занижены по сравнению с тем, что должно было бы наблюдаться в случае
перехода между двумя состояниями. Действительно, как известно, константа
скорости сворачивания/разворачивания (ком) является эффективной величиной
и представляет собой сумму двух составляющих - константы скорости
сворачивания (kf) и константы скорости разворачивания (кц) белка (kobs = kf + кц
для одностадийных белков) [Fersht 2000]. Если предположить, что шевронный
график на рис. 6 описывает одностадийный процесс, то в точке полуперехода (в
Аг
д
^ст;' /7
в
\2
"
"
...•^1
"
■
-
25<1п2
Л\
д^^ГГЕ»
1уГ
2
\3
4
S
-г Концентрация
."' мочевины, М
-
^
Рис.6. Зависимость наблюдаемой скорости
сворачивания/разворачивания kobs (■) и
рассчитанных скоростей, относящихся к
переходу между двумя состояниями (кш, kw,
kuN^ кыи) от концентрации мочевины: расчет
скорости сворачивания для I—>N перехода
кш (о), дня U-^N перехода кци (Д),
экстраполяция kiN в область больших
концентраций
мочевины
(—
),
экстраполяция кцм (
\ шевронный
график, рассчитанный для I<-»N перехода
(
). Сплошная линия соответствует
линейной
аппроксимации
ветви
разворачивания.
Пунктирная
линия
соответствует линейной аппроксимации
линейного участка ветви сворачивания.
Другие пояснения - в тексте.
точке пересечения экстраполяции ветвей сворачивания и разворачивания)
константы скорости сворачивания и разворачивания должны быть равны kf = кц
т. е. kobs = 2-ku и In(kobs) = ln(2) + In(ku). Значит, минимум шевронного графика
должен быть поднят на величину 1п(2) = 0.7 относительно точки пересечения
экстраполяции ветвей сворачивания и разворачивания. В нашем же случае эта
величина составляет примерно 0.25. Это позволяет сделать вывод о наличии
всех трех состояний (N, I, U) в этой области концентраций мочевины, а не
только N и и, как это наблюдалось бы для одностадийного перехода. Из всего
вышесказанного следует, что на протяжении всей ветви сворачивания (до 3 М
мочевины) присутствуют все три состояния. Принимая во внимание тот факт,
что кк| и kiN «
kui и kuj (в нашем случае характерные времена переходов U<-^I и
I<->N порядка 10" сек. и 1сек., соответственно), то для белков, сворачивание
которых
происходит
по
двухстадийному
механизму,
экспериментально
определяемая константа скорости будет соответствовать уравнению [Baldwin
1996, Parker, 1995]:
kobs = км + fi * k|N,
(2)
где f) - доля промежуточного состояния при переходе белка из развернутого в
промежуточное состояние, рассчитанная из амплитуды первой фазы кинетических
кривых сворачивания (рис,4). Учитьшая выше сказанное, для kiN получаем:
k,^MdiM(M)
где kobs, кн1 и fi взяты напрямую из экспериментальных данных [Baryshnikova et al.,
2005]. Необходимо отметить, что формула (3) применима на практике только в
той области, где коЬь(М) значительно больше, чем кмСМ), и fi(M) надежно отлична
от нуля. Эти условия (рис. 4) вьшолняются при конечных концентрациях
мочевины ниже 2.6-2.7 М.
Наиболее точные расчеты могут быть сделаны при
fi(M) = 1, то есть при концентрации мочевины ниже 1.2М, когда все молекулы
после первой фазы сворачивания находятся в промежуточном состоянии. В этих
условиях развернутое состояние сильно дестабилизировано по сравнению с
промежуточным и не оказьгеает влияния на переход I+-+N. Однако эта линейная
часть шеврона (соответствующая fi(M) =1) для апомиоглобина очень короткая, а
9
для многих мутантных форм она практически отсутствует. Для того чтобы
рассчитать
kns<(M) более
аккуратно, мы
использовали
экспериментальные
зависимости kobs(M), k^iCM), fi(M) и уравнение (3). Результат расчета показан на
рис. 6 (открытые кружочки). Полученные величины In(kiN(M)) хорошо ложатся на
прямую линию (рис. 6). Точка пересечения экстраполяции данной прямой с
ветвью разворачивания шевронного графика соответствует 4.2 М мочевины. При
данной концентрации мочевины свободные энергии нативного и промежуточного
состояний равны. Используя kiN(M), рассчитанные во всём используемом
интервале концентраций мочевины, мы можем построить шевронный график,
описываюшзий энергетический барьер между I и N состояниями (рис. 6).
Когда fi близко к 1, эффективная константа скорости сворачивания kobs
близка к kiN, и тогда скорость-лимитирующая стадия сворачивания определяется
переходом между I и N состояниями, то есть высотой барьера между этими
состояниями. Высота барьера в данном случае равна GTS-GI, где GTS И G J свободные
энергии
соответственно.
переходного
(TS)
и
промежуточного
Однако, при более высоких
(I)
концентрациях
состояний,
денатуранта,
промежуточное состояние населено незначительно ( f i « l ) , и kobs отличается от км.
Однако во всех случаях скорость-лимитирующей стадией сворачивания является
формирование того же самого переходного состояния (TS). Высота данного
барьера равна GTS-GU (где Gu - свободная энергия развернутого состояния U, а GTS
- переходного состояния TS). Согласно формуле Крамерса, константу скорости
для перехода U->N
можно представить как ku>r=K(,-exp[-(GTs-Gu)/RT], где R -
газовая постоянная, Т - температура,
Ко - константа скорости выхода из
переходного состояния. В то же время константа скорости для сворачивания I->N
равна kDr=Ko-exp[-(GTs-Gi)/RTl, где Gj - свободная энергая состояния I. Подставляя
kiN в предыдущее соотношение, получаем kuN=kiN-exp[-(Gi-Gu)/RT]. Отсюда
J'UN ^''iN ' i f
.
(4)
Таким образом, уравнение 2 может быть переписано в виде:
kobs=kNi+(l-ft)-kuN.
(5)
10
Принимая во внимание, что kni = к-ци (т.к. они определяются переходом через одно
и то же T S ) :
к^(М)='^°ь.(М)-кк.(М)
l-f,(M)
(6)
уравнение (6) на практике применимо в той области сворачивания, когда l-f, не
мала, то есть при конечных концентрациях мочевины между ].5М и З.ОМ.
Результат расчета кик(М) показан на рис. 6 (открытые треугольники). Полученные
величины 1п(кщ((М)) хорошо ложатся на прямую линию. Скорости переходов
N->U и U->N равны при 2.7М мочевины (свободные энергии состояний U и N
равны), а зависимости kiN(M) и кик(М) пересекаются при 2.2 М мочевины, что
соответствует fj = 0.5 (см. рис. 6 и рис. 4).
Анализ шевронного графика в случае отсутствия загиба на ветви
сворачивания. Описанный выше метод позволяет рассчитать скорости отдельных
фаз сворачивания в случае белка с тремя состояниями. Случай апомиоглобина
относительно простой, поскольку шевронный график имеет довольно выраженный
загиб ветви сворачивания. Довольно часто белки не имеют выраженного загиба,
что может означать, что перед началом перехода в N, накапливается менее 100%
1
2
3
4
5
0
1
2
3
4
5
6
Концентрация мочевины, М
Концентрация мочевины, М
Рис. 7. Анализ кинетических данных в случае, когда кинетическое промежуточное состояние
не населяется на 100% в ходе сворачивания белка. А(М) и шевронный график обрезан в 2.1 М
мочевины. Черные квадратики, открытые кружочки и открытые треугольники обозначают то
же, чго и на рис. 6. (а) Населенность промежуточного кинетического состояния (fi). {Вставка)
Зависимость амплитуды первой фазы сворачивания от концентрации мочевины. Пунктирной
линией показана аппроксимация А(М) по модели двух состояний, (б) Расчет km (квадратики) и
кщч (перевернутые треугольники). Сплошная линия соответствует экстраполяции kiN к
большим концентрациям мочевины. Пунктирная линия обозначает то же, что (
) на рис. 6.
11
кинетического промежуточного состояния в измеряемой области концентраций
денатуранта. Для того чтобы проверить, как вышеприведенный подход работает в
таких случаях, А(М) и шевронный график были обрезаны на 2.1М мочевины. В
этих условиях промежуточное состояние накапливается только лишь на 50%.
Поскольку после первой фазы сворачивания присутствуют только два состояния (I
и U), А(М) была аппроксимирована моделью двух состояний, чтобы достроить
А(М) до 100%, а затем были проведены все расчеты, описанные выше. Как видно
из рис. 7, даже в случае, когда I накапливается не больше 50%, мы можем с
достаточной точностью рассчитать константы скорости kjx и кц».
Построение зависимостей свободной энергии состояний апомиоглобина
от концентрации денатуранта. Константы скорости, относящиеся к быстрым
переходам (кщ и кщ), не могут быть измерены экспериментально, поскольку эти
процессы проходят за «мертвое время» stopped-flow прибора. Тем не менее, можно
оценить взаимное расположение энергетических уровней различных состояний U,
I, N и TS (Gu, Gi, G N и GTS, соответственно) во всем диапазоне концентраций
мочевины,
используя
экспериментально
измеренные
константы
скорости
сворачивания/разворачивания (kobs) и процент населенности промежуточного
состояния (fi).
Во-первых, значение (GpGu)
может
быть
получено
при
различных
концентрациях денатуранта как:
G , ( M ) - G u ( M ) = -RT-ln
^'^^^
(7)
Во-вторых, (G:,i-Gi) может быть получено из перехода N<->I, как:
G^(M)-G.(M) = -RT-ln'^'^^
(S)
где kNi(M) - значение константы скорости разворачивания, экстраполированное к
данной концентрации мочевины М, а кгк(М) - скорость сворачивания из
промежуточного состояния, рассчитанная по формуле (3).
Поскольку
принято
отсчитывать
свободные
энергии
всех
состояний
развернутого состояния, уравнения (7) и (8) могут быть переписаны в виде:
12
от
G„(M)-Gu(M) = -RT. lnMM)^,^_f,(M)
k„(M)
l-f,(M)_
kw(M)
= -RTln
"ksuCM)
(9)
В данном уравнении мы воспользовались уравнением (4) и равенством кщ = ICNUПо определению константа скорости разворачивания определяется высотой
барьера
между
N
и
I
состояниями,
то
RT
кы1 = к — • ехр(-(От, - G N )/RT),
есть
величиной
(GTS-GN):
(10)
где h - постоянная Планка, к - коэффициент трансмиссии, который может быть
принят за 1.0 (Fersht 2000, параграф 18), тогда
G „ ( M ) - G N ( M ) = - R T - 1п[к^,(М)]-1пГкН1
(11)
и, используя уравнение (9), получаем:
G T S ( M ) - G U ( M ) =- R T
1п[к^я,(М)]-1п
RT
(12)
RT
где R T - l n - ^ = 69.4kJ/mol при 1 Г С ( 2 8 4 К ) .
а
На рис. 8 представлена зависимость свободной энергии всех трех состояний от
концентрации мочевины в растворе. При низких концентрациях мочевины (ниже
1.2М) состояния N и I более стабильны, чем состояние U, и наблюдаемая скорость
сворачивания соответствует переходу I->N. При более высоких концентрациях
мочевины (выше 2.1М) состояние I становится менее стабильным, чем состояние
и. Вместе с тем нативное состояние еще остается стабильнее развернутого (до 2.7
М), и, поэтому, сворачивание белка все еще вероятно. Быстрое перераспределение
I.
€100
60 T S ^ ^ ^ -
.-*=
' 20
к
Iя
U
-20 i - "
1
2
3
4
Рис. 8. Зависимость свободной энергии
трех стабильных состояний ( N , I, U ) и
переходного состояния (TS) на скоростьлимитирующем барьере апомиоглобина от
концентрации мочевины в растворе.
Свободная
энергия
всех
уровней
отсчитьшалась от уровня развернутого
состояния.
5
Коицентрапия мочевины, М
13
молекул между I и U состояниями приводит к уменьшению населенности
состояния I и, соответственно, уменьшению вероятности I->N перехода. Это
приводит к уменьшению наблюдаемой скорости сворачивания и к занижению
минимума шевронного графика. При концентрациях мочевины выше
2.7М
разворачивание белка становится более выгодным, но N остается все еще
стабильнее, чем I, вплоть до 4.2М мочевины.
Знание свободных энергий U, I, N и TS состояний позволяет изучать
структуру переходного состояния (исследовать ядро сворачивания)' и структуру
кинетического промежуточного состояния при помощи "Ф-анализа", используя
точечные замены в а/к последовательности белка.
Выбор аминокислотных замен для исследований ядра сворачивания
апомиоглобина. Для того, чтобы выбрать положения а/к остатков, которые
могут участвовать в формировании ядра сворачивания апомиоглобина, были
использованы результаты двух ранее предложенных теоретических подходов.
Первый
[Shakhnovich
подход
et.
был
al.,
разработан
1996].
О.Б.
Птицыным
Проанализировав
и
728
соавторами
глобиновых
последовательностей [Ptitsyn and Ting, 1999], обнаружили, что во всех глобинах
имеется только 6 консервативных нефункциональных а/к остатков в А, G и Н
спиралях: VallO, Тгр14, I l e l l l , Leull5, Metl31, Leul35. Бьшо предположено,
что именно эти остатки входят в ядро сворачивания апомиоглобина.
Второй, «ландшафтный», подход к предсказанию а/к остатков, входящих
в ядро сворачивания белка, состоит в поиске самых низких энергетических
барьеров, отделяющих развёрнутое состояние от нативной структуры на
ландшафте свободной энергии белковой цепи [Galzitskaya and Finkeistein, 1999].
Сравнение
результатов
расчёта
с
экспериментальными
данными
по
определению ядер сворачивания показывает, что с помощью этого подхода
можно удовлетворительно предсказывать ядра сворачивания белков в точке
термодинамического равновесия нативного и развернутого состояний. Расчеты,
сделанные О.В. Галзитской для апомиоглобина, показали, что
в ядро
сворачивания должны входить остатки, расположенные в В, С, D и Е спиралях.
Для экспериментальной проверки данного метода предсказания были выбраны
14
6 таких остатков, достаточно глубоко погруженных в структуру белка, - 11е28,
РЬеЗЗ (В спираль), Leu40 (С спираль), Met55, (D спираль), Leu61 и Leu76 (Е
спираль). Для того чтобы предсказания можно было сравнивать с опытом, все
выбранные остатки поочередно заменили на Ala. Плазмиды, содержащие гены
мутантных белков, были сконструированы Долгих Д.А. (ИБХ РАН).
Исследование равновесного процесса разворачивания мутантных
форм
апомиоглобина.
конформационную
С
целью
стабильность
определения
влияния
апомиоглобина
мутаций
были
на
проведены
эксперименты по равновесному разворачиванию мутантных белков мочевиной
с помощью методов
Тгр флуоресценции и КД в области поглощения
пептидных связей. В качестве параметров, отражающих изменения на разных
уровнях структурной организации белка, были выбраны интенсивность Тгр
флуоресценции на длине волны 335нм и молярная эллиптичность на длине
волны 222 им.
SSS5SS
-2
1 ■"
•ь ^
i "
у:
я
2
-14
-16
-к
^
.„x^vV
'•''Z'i>[y
2Л
1Л 1
1"
1.4 '
-
L6U
MSSA
•
г
••
J™*
•«
j^^'^'^^i
U
1
2
3
4
Кояцеитрвцна мочсвняы, М
1Д1
2
3
4
КойцеятряцнА иочевяны, М
5
Рис.9. Равновесное разворачивание апомиоглобина дикого типа и его мутантных форм,
регистрируемое по изменению спектров КД в дальней У Ф области (а, в) и по изменению
интенсивности Тф флуоресценции на длине 335 нм (б, ?\ нормированной на интенсивность
Tqj флуоресцеюдаи развернутого состояния.
15
Изменение молярной эллиптичности, характеризующей
содержание
вторичной структуры в белке, в зависимости от концентрации мочевины
представлено на рис. 9а,в. Видно, что изменения в спектрах КД, а,
следовательно, и во вторичной структуре мутантных белков начинаются при
более низких концентрациях мочевины, чем для белка дикого типа (WT), т.е.
их структуры дестабилизированы мутациями по отношению к действию
мочевины. При этом денатурационные переходы из нативного состояния в
развернутое для мутантньрс белков становятся более широкими, т.е. менее
кооперативными, чем для белка WT, особенно в мутантных белках с заменами
Leu76Ala и Тгр14А1а. Сопоставление молярной эллиптичности на 222 нм в О М
мочевины (где белки находятся в свернутом состоянии) показывает, что часть
мутантных белков имеет меньшее содержание вторичной структуры по
сравнению с белком WT. Если же посмотреть на зависимость интенсивности
Тгр флуоресценции на выбранной длине волны (335 нм) от концентрации
мочевины (рис. 96, г), то для всех мутантных белков, аналогично белку WT,
наблюдается максимум этой зависимости, свидетельствующий о накоплении
промежуточного состояния на пути разворачивания белка. При этом, у
мутантных белков этот максимум более выражен, чем у белка WT, что может
свидетельствовать
о
том,
что
разворачивание
мутантных
белков
характеризуются более высокой населенностью промежуточного состояния по
сравнению с разворачиванием белка WT.
Кинетическое
разворачивания
эксперименты
по
исследование
мутантных
процессов
форм
сворачиванию
и
сворачивания
апомиоглобина.
разворачиванию
и
Кинетические
мутантных
форм
апомиоглобина с заменами а/к остатков в консервативных нефункциональных
положениях (спирали А, G и И) и в положениях, предсказанных с помощью
«ландшафтного» подхода (спирали В, С, D, и Е), проводились с целью оценки
включения
этих
а/к
остатков
в
предполагаемое
ядро
сворачивания
апомиоглобина в переходе l*-*N. Для всех мутантных белков получены
шевронные графики и оценена доля промежуточного состояния.
16
А-спира.1ь
WMA
0
1
у
VIOAA'"
2
3
4
Комментряиня мочевины» М
^гъ\_у^' В-спираль
3
5
6
I28A
О
4,
G-ciiHpajibLUSA,''
1
2
3
СО-спирали
М55А •'
^'
3 •
2
3
4
1Сонцен1-р]1пия чочевнны, М
5
6
4
Коиикитраиня мочевины, М
tf'
.
,''
5
«•
,
;
,'"'
-'■ . J P L 4 0 A
О
I
-1 -l-0
1
2
3
4
5
«
2
3
4
5
6
Коииентрвтш чючевнкы, М
Н-С11ираль L U S A ^ ' i ' '
■ 'М131А
,
2
3
~>.
4
Коииеитрацин чочевнны, М
I
S
6
Концентрация чочевнны, М
Рис.10. Шевронные графики для всех мутантных белков. Для каждого белка показаны
экспериментальные
зависимости
скоростей
сворачивания/разворачивания
от
концентрации мочевины, экстраполяция ветви разворачивания, а также экстраполяция
рассчитанной зависимости скорости сворачивания kiN(M) из промежуточного в нативное
состояние от концентрации мочевины.
Мутантные
белки
с
заменами
а/к
остатков
в
консеувативных
нефункциональных положениях. Из рис. 10 (А, G и Н спирали) видно, что,
несмотря на то, что процесс разворачивания данных мутантных белков сильно
ускоряется по сравнению с W T при одних и тех же концентрациях денатуранта,
17
процесс сворачивания во всех случаях меняется не так существенно. Для
мутантного белка с заменой Тгр 14, из-за его сильной дестабилизации, вообще
не удалось получить ветвь сворачивания, а ветвь разворачивания изменила
наклон по сравнению с белком WT. Это может свидетельствовать о возможном
изменении пути сворачивания данного белка.
Мутантные
белки с
заменами
а/к
остатков
в положениях,
предсказанных с помощью «ландшафтного» подхода. Из рис. 10 (В, С, D, и Е
спирали) видно, что замены в данных положениях ускоряют разворачивание, то
есть приводят к дестабилизации нативной структуры белка. Однако если
посмотреть на ветвь сворачивания, можно видеть, что эти замены по-разному
влияют на скорость сворачивания белка. Так, для белков с заменами 11е28 (Вспираль) и Leu76 (Е-спираль) скорость сворачивания замедляется на столько
же, на сколько ускоряется процесс разворачивания белка. Замены Met55 (Dспираль) и Leu61 (Е-спираль) замедляют сворачивание белка, однако скорость
разворачивания меняется более существенно. Замены F33 (В-спираль) и L40 (Сспираль) влияют на скорость разворачивания белка, тогда как скорость
сворачивания не изменяется.
Для расчета скоростей сворачивания H 3 I B N H H 3 U B N (рис. 10) ко всем
белкам был применен подход, разработанный для белка WT. Зная зависимость
1пкш(М) и lnk>4i(M) для мутантных белков и белка WT, можно применить Фанализ Фершта для оценки вклада замененных а/к остатков в структуру
переходного состояния на барьере, разделяющем I и N состояния. Параметр Ф,
отражающий вовлеченность остатка в ядро сворачивания, был рассчитан по
формуле [Fersht 2000]:
, Aln[kn,]
'"--Alnlk./kJ-
(»^>
Если параметр Ф близок к 1, то остаток входит в ядро сворачивания, если к О не входит.
В таблице приведены значения параметра Ф, рассчитанные для всех мутантных
белков:
18
Замены в положениях,
Замены в консервативных
нефункциональных положениях
параметр
wr V10A W14A
Середина
перехода
ич-1
2.2
±0.2
Середина
перехода
l4-»N
4.2
±0.2
-
Ф
предсказанных при помощи
«ландшафтного» подхода
Н П А И 1 5 А М131А L135A П8А F33A L40A М55А L61A L76A
2.2
2.1
2.0
2,0
2.3
2.3
2.1
2.1
2.0
2.0
2.2
2.0
2.8
?
2.3
1.0
0.4
1.0
2.8
0.9
2.2
0.9
0.6
0.4
?
0.3
0.2
0.3
0.2
0.6
0.2
0.0
0.4
0.4
0.7
0.3
±0.1
Из таблицы видно, что для всех мутантных белков с заменами
консервативных а/к остатков параметр Ф имеет значение порядка 0.2 - 0.3, что
свидетельствует о том, что в переходном состоянии для N*->I перехода данные
остатки завязывают порядка 20% - 30% контактов от возможных в нативном
состоянии.
Для белков с заменами в В, С, D и Е спиралях Ф варьирует от 0.0 до 0.7.
Для 11е28 (В-спираль) и Leu76 (Е-спираль) параметр Ф имеет высокое значение
(0.6 и 0.7, соответственно), что указывает на то, что данные остатки входят в
ядро сворачивания апомиоглобина на стадии перехода из промежуточного в
нативное состояние, а РЬеЗЗ, Leu40, Met55 и Leu61 ведут себя сходно с
консервативными нефункциональными остатками, т.е. они слабо вовлечены в
ядро сворачивания в переходе, лимитирующем скорость сворачивания.
В таблице также представлены концентрации мочевины, при которых
населенности ( U и I) и (I и N) состояний равны. По сравнению с диким типом
нативное состояние всех мутантных белков сильно дестабилизировано
относительно
развернутого
и
промежуточного
состояний,
тогда
как
стабильность промежуточного состояния относительно развернутого меняется
незначительно.
19
выводы
1. Разработан
метод определения кинетических
и
термодинамических
параметров переходов между нативным, промежуточным и развернутым
состояниями
для белков, сворачивание
и разворачивание
которых
проходит по двухстадийному механизму.
2. Показано,
что
мутации
в
гидрофобном
ядре
белка
сильно
дестабилизируют нативное состояние, но практически не сказываются на
стабильности промежуточного состояния.
3. Показано, что консервативные нефункциональные а/к остатки образуют
.
мало контактов в переходном состоянии на барьере, разделяющем
нативное и промежуточное состояние, и, по-видимому, не входят в ядро
сворачивания апомиоглобина на этой стадии, в то время как некоторые
неконсервативные а/к остатки (11е28 и Leu76), образуя более 50%
нативных контактов в переходном состоянии, участвуют в формировании
ядра сворачивания апомиоглобина при переходе из промежуточного
состояния в нативное.
Основные результаты диссертации опубликованы в работах:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Е.Н. Барышникова, Б.С. Мельник, Г.В. Семисотнов, В.Е Бычкова Изучение
кинетики сворачивания/разворачивания апомиоглобина. Молекулярная биология
39(6), 2005, in press
E.N. Baryshnikova, B.S. Melnik, A.V. Finkelstein, G.V. Semisotnov, and V.E.
Bychkova. Three-state protein folding: experimental determination offree-energyprofile.
Protein Sci., 14, 2005, p. 2658-2667.
E.H. Барышникова, М.Г. Шарапов, И.А. Кашпаров, Н Б. Ильина, В.Е. Бычкова
Изучение стабильности апомиоглобина в зависимости от мочевины и температуры
при двух значениях рН. Молекулярная биология 39(2), 2005, стр. 292-297.
E.N. Baryshnikova, B.S. Melnik, А V. Finkelstein, G.V Semisotnov and V.E Bychkova.
Effects of substitutions of conserved nonftinctional residues by Ala on the folding of
apomyoglobin. The FEBS Journal, 272, 2005, p. 363.
E.N. Baryshnikova, B.S. Mebik, A.V. Finkelstein, G.V. Semisotnov and V.E. Bychkova.
Equilibrium and kinetic study of three-state apomyoglobin with substitutions of conserved
nonfunctional residues. 6* European Symposium of the Protein Society, Barcelona, Spain;
Final program and abstracts, 2005, p. 125
B.S. Melnik, E.N. Baryshnikova, A.V. Finkelstein, G.V. Semisotnov and V.E. Bychkova.
Analysis of a chevron plot for three-state unfolding/refolding reactions of apomyoglobin. 6
European Symposium of the Protein Society, Barcelona, Spain; Final program and
abstracts, 2005, p. 125
E.N. Baryshnikova, B.S. Melnik, A.V Finkelstein, G.V Semisotnov and V.E. Bychkova
Three-state protein folding: Analysis of a chevron for three-state unfolding/refolding
20
reactions of aponiNoglobm 49"' Лплиа! Meeting of B'oplnsical Societ> Long Beach С Л .
Abstidct Issue. 2005. !87-Pos
8. M 1 Шарапов Е.Н. Барышникова. И Л Кашпаров, И Б Ильина, В Ь Бычкова
Исследование стабильносли м\тантных
форм апомиоглобина с
именами
консервативных нефункциональных аминокислотных остатков
17-ая зимняя
молодежная начиная школа «Перспективные направ.ления физико-химической
биологии и биотечно.югии)/. Москва. Россия Гезисы докладов и стендовых
сообщений. 2005. стр 52
9.
В А Балобанов, Е.Н. Барышникова. И А Кашпаров. Н Б Ильина. В Е Бычкова
Исследование стабильности мчтантных форм апомиог.юбина с точечными заменами
аминокислотных остатков в С и Е спиралях на аланин, 17-ая зимняя молодежная
научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и
биотехнологии». Москва. Россия, Тезисы .докладов и стендовых сообщений. 2005.
стр. 33
10. Е.Н. Барышникова, Б С Мельник А В Финке.льштейн. Г В Семисотнов. В Е
Бычкова
Изучение кинетики сворачивания и разворачивания апомиоглобина. III
Съезд Биофизиков России. Воронеж Гезисы докладов. 2004. Т I. стр 7-8
11. E.N. Baryshnikova. В S Melnik. W
Finkelstem. G V Semisotno\' V E Bvchkova
Three-state protein folding investigation of aponnoglobin unfolding refolding kinetics bj
tryptophan fluorescence International Summer School on "Understanding Protein
Stability", Huddinge, Sweden. Book of abstracts. 2004 p 44
12. E.N. Baryshnikova (F N Trofimova). D A Dolgikh. A E D\u>sekina, E 1 Tiktopulo,
N В Ilvina, V E Bychkova. Сравнительное изучение апомиоглобина дикого типа и его
мутантов, замена консервативного Vail О на гидрофобные остатки
III Съезд
Биохимического общества. Санкт-Петербург Россия. Тезисы научных докладов.
2002.стр 525-526
13. Е Н Трофимова ( Е . Н . Барышникова). Д А Дол1 их. А Е Дюйсекина. Е И
Тиктопуло. Н Б Ильина. В Е Бычкова. О Б Птицын Значение триптофана 14 для
сворачивания миог.лобина Открытый семинар кафедры Молек\лярной биофизики
физического факультета СПбГУ. С.Петербург. Россия. Сборник тезисов. 2001. 52
14. .Л Е Dyuysekina. D А Dolgikh. Е N Trofimova (E.N. Baryshnikova). N В Ilyina, Е I
Tiktopulo. V Е Bychkova. Р Е Wright Conserved residues m apomvoglobin influence of
Trpl4 substitution b\ Phe and Ala on protein folding International Conference on "Protein
Synthesis". Pushchmo, Russia. Programme and abstracts 2001 p 59
15. Трофимова E H (Барышникова E.H.). Долгих Д А . Дюйсекина А Е . Тиктопу.ло
Е И , Ильина Н.Б. Бычкова В Е . Птицын О Б. Сравнение равновесных и
кинетических свойств апомиоглобина дикого типа и его мутантов с заменой
консервативного триптофана 5-ая Пчшинская конференция молодых \ченых
«Биология - наука 21 го века». Пушино. Россия. Сборник тезисов. 2001. стр 60
16. Е И Трофи.мова ( Е . Н . Барышникова). Д Л Долгих, А Е
Дюйсекина. Е Й
Тиктопуло. И Б Ильина. В Е. Бычкова. О Б Птицын Сравнительное изучение
апомиоглобина дикого типа и его м\тантов замена консервативного триптофана на
алифатические остатки
Школа-конференция «Горизонты
физико-химической
биологии», Пущино, Россия, Тезисы стендовых сообщений. 2000, стр 61
21
ll^18 7 9 l
РНБ Русский фонд
2006-4
19992
Принято к исполнению 14/10/2005
Исполнено 14/10/2005
Заказ № 1125
Тираж: 100 экз.
0 0 0 «11-й Ф О Р М А Т » И Н Н 7726330900
Москва, Варшавское ш., 36
(095) 975-78-56
(095) 747-64-70
www.autorefei:at.ru.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
1 027 Кб
Теги
bd000101055
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа