close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

bd000101305

код для вставкиСкачать
iia iipaiiax рукописи
УДК 533.9
ВЕРЕЩАГА ЯНА АЛЕКСАНДРОВНА
Взаимодействие а-спиральиых пептидов в биомембранах:
моделирование методом Монте-Карло.
03.00.02. - биофизика
автореферат диссертации на соискание ученой степени
кандидата физико-математических наук
Москва 2005
Работа
выполнена
в
Лаборатории
структурной
биологии
Института
биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Р А Н и на
кафедре физико-химической биологии и биотехнологии Факультета молекулярной и
биологической физики Московского Физико-Технического Института.
Научный руководитель:
Доктор физико-математических наук
Ефремов Роман Гербертович
Официальные оппоненты:
Доктор биологических наук, профессор
Коротков Евгений Вадимович
Доктор физико-математических наук, профессор
Шайтан Константин Вольдемарович
Ведущая организация:
М И Ф И , Факультет экспериментальной и теоретической физики.
Кафедра прикладной математики.
Заишта состоится 15 декабря 2005 г. в
час.
мин на заседании диссертационного
совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте (141700, Московская
обл., г. Долгопрудный, Институтский пер. 9, М Ф Т И ) .
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке М Ф Т И .
Автореферат разослан «
»_
2005 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
кандидат физико-математических наук
В.Е. Брагин
ш^
Шт-\^
^^'^WirfyWjibiiocTi. проблемы.
Исключительно важная роль мембранных белков (МЬ) в клетке обусловлена их
способностью детектировать и передавать ситалы через ли1П1дный бислой, осуществлять
транспорт ионов и различных BCUICCTB, участвовать в слиянии мембран и т.п. Понимание
связи между структурой МБ и их функцией представляет собой одну из актуальных и
интереснейших задач структурной биологии. Решение указанной проблемы имеет и
большой практический интерес. В частности, МБ являются привлекательными объектами
для создания новых лекарственных препаратов. Многие такие белки содержат в своих
мембранных доменах несколько участков полипептидной цепи и/или функционируют в
олигомерных состояниях - в виде димеров, тримеров и т.д. Механизмы ассоциации и
межбелкового узнавания, играющие важную роль в ряде клеточных процессов [1-2],
являются ключом для понимания функционирования белковых комплексов. В связи с
этим, большой интерес представляют задачи по изучению детальных молекулярных
механизмов межбелковых взаимодействий в такой гетерогенной среде, какой является
липидный бислой. Получение структурной информации о процессах олигомеризации
белков в мембранах с помощью современных экспериментальных методов крайне
затруднено из-за больших сложностей с выделением, очисткой, приготовлением образцов
[3]. Многообещающей альтернативой в решении данной проблемы является применение
методов компьютерного моделирования.
Наиболее подходящими объектами для разработки и тестирования таких методов
являются а-спиральные комплексы в мембранах. Эти системы достаточно стабильны и
состоят из гидрофобных и/или амфифильных а-спиралей. Появление единственной на
сегодняшний
день
пространственной
модели
трансмембранного
(ТМ)
димера
гликофорина А человека (GpA) [4] стимулировало разработку теоретических методов
исследования взаимодействия а-спиралей в мембранных доменах белков. В настоящее
время предпринимаются
лишь
первые
попытки
создания
указанных подходов.
Предлагаемые методики характеризуются целым рядом ограничений, возникающих
вследствие сложности корректного представления влияния мембранного окружения [5-7].
Цели настоящей работы:
- разработка теоретического метода предсказания пространственной структуры
а-спиральных димерных комплексов в мембранном окружении;
- применение разработанного подхода для моделирования димерных комплексов
с неизвестной пространственной структурой.
РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ
БИБЛИОТЕКА
ib^:B3b*
■ ■■■»
т
Иа защиту выносятси следующие основные положения и результаты:
1. Разработана
методика
моделирования а-спиральпых
димериых
комплексов
методом Монте-Карло (МК) с использованием модели неявно заданной мембраны
(на примере димера GpA).
2. Моделирование без учета мембранного окружения не позволяет корректно описать
поведение ТМ а-спиралей GpA.
3. Прешюженная методика адекватно описывает следующие аспекты поведения аспиралей GpA в бислое: а) Пептиды, сохраняя а-спиральную конформацию,
встраиваются в мембрану в ТМ положении и образуют димеры в ориентации
«голова к голове»; б) Конформации низкоэнергетических состояний хорошо
согласуются с данными мутагенеза; в) Найдена группа димерных состояний,
структура которых близка к установленной экспериментально с помощью
спектроскопии ЯМР.
4. Предложена альтернативная модель димера, также хорошо согласующаяся с
данными мутагенеза и удовлетворяющая ограничениям на расстояния, полученным
методом спектроскопии ЯМР.
5. Впервые проведено моделирование пространственной структуры димера ТМ
сегмента белка BNIP3 с помощью предложенного подхода. Полученные модели
хорошо согласуются с данными мутагенеза.
6. На основании анализа гидрофобных/гидрофильных характеристик ТМ сегментов
GpA/BNIP3 и расчетов МК предложены мутантные формы ТМ пептида BNIP3,
потенциально обладающие улучшенной димеризационной способностью.
Научное значение и новизна работы.
Разработана
пространственную
новая
теоретическая
структуру
методика,
позволяющая
предсказывать
а-спиральных димерных комплексов в мембранном
окружении. Подход не подразумевает использования априорной информации ни о
расположении субъединиц в комплексе, ни об их ориентации относительно мембраны.
Метол
дает
возможность
охарактеризовать
особенности
спираль-спирального
взаимодействия в мембранном окружении, а также идентифицировать а.к. остатки,
важные для димеризации.
Практическое значение работы.
Применение разработанного подхода открывает перспективы конструирования
пептидов с заданными
свойствами, например, с
измененной димеризационной
способностью. Полученные результаты помогут создавать de novo пептиды, обладающие
(или, наоборот, не обладающие) высокой аффинностью друг к другу, либо к заданным
пептидам-мишеням, что имеет большое значение для разработки новых лекарственных
препаратов, вакцин и т.д. В частности, данная методика может оказать существенную
помощь в проектировании пеггтидов-ингибиторов для разнообра)н1>1Х ТМ рецепторов,
пептидов с канал-образующей активностью и т.д.
Таким образом, создан подход для дальнейшего изучения лимеризации белков с
неизвестной пространственной Сфуктурой. Высказанш.ге в работе гипотезы и созданные
модели дают возможность их проверки в эксперименте, что будет стимулировать
дальнейший прогресс в понимании физико-химических закономерностей, определяющих
механизм олигомеризации пептидов и белков в липидных бислоях, и позволит
усовершенствовать существующие алгоритмы моделирования этих сложных систем.
Публикации и апробация.
Основные результаты работы изложены в статье, опубликованной в Journal of
Chemical Theory and Computation, и в двух статьях, направленных в печать. Материалы
диссертации
докладывались
международном
симпозиуме
«Пептид-мембранные
взаимодействия» (Намюр, Бельгия, 2004), на 4-ой международной конференции по
биоинформатике (Новосибирск, 2004), международной конференции по вычислительной
молекулярной биологии (Москва, 2003), на 10-ом германо-российском пептидном
симпозиуме (Тюрингия, 2003), на Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов
(Москва, 2003), на 15-ой и 14-ой зимних международных молодежных научных школах
«Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва,
2003/2002).
Структура и объем диссертации.
Диссертационная работа имеет следующую структуру: Во Введении (Глава I)
сформулированы основные цели и задачи, их взаимосвязь с общими тенденциями
развития моделирования олигомерных взаимодействий в а-спиральных комплексах.
Глава I I представляет собой обзор литературы, посвященный известным теоретическим
моделям упаковки спиралей. Рассматриваются наиболее изученные экспериментально
димерные комплексы, представляющие интерес для биомедицинских применений.
Полученные результаты и их обсуждение представлены в Главе П1, состоящей из 2-х
разделов. В разделе Ш.1 на примере димера GpA показана поэтапная разработка методики
моделирования димерных комплексов в гетерогенном мембранном окружении. В разделе
П1.2 предложенный подход использован для исследования возможных механизмов
димеризации ТМ сегмента белка BNIP3, пространственная структура которого еще не
установлена. Глава IV (Заключение) содержит перечень основных результатов работы,
обсуждение их научно-практического значения, а также дальнейшие перспективы
исследований
литературы.
в
данной
области.
Завершает
диссертационную
работу
Список
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
I. ВВЕДЕНИ1В
первой
главе
обосновывается
псобходимость
применения
методов
молекулярного моделирования для исследования ассоциации а-спиральпых пептидов в
мембранном окружении, сформулированы направления и цели исследования.
II. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ.
В датюй главе рассматриваются основные принципы образования а-спиральньк
комплексов
в
мембранном
окружении.
Проведен
обзор
нескольких
белков,
функционирующих в димерном состоянии и активно изучаемых в настоящий момент в
мире. Рассматриваются существующие на сегодняшний день подходы в молекулярном
моделировании ассоциации ТМ а-спиралей.
III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
1П.1. Разработка методики моделирования пространственной структуры аспиральных димеров в мембранном окрузкении на примере димера гликоЛорина А
(GDA).
В
данной главе описана
поэтапная
разработка
пространственной структуры димерных а-спиральных
окружении
на
примере
ТМ
сегмента
методики
моделирования
комплексов в мембранном
(S69EPEITLnFGVMAGVIGTILLISYGIRR97)
гликофорина А человека.
///.7.7. Моделирование мономера GpA в «вакууме».
Расчет мономера GpA в «вакууме» приводит к нарушению а-спиральной
структуры в области, наиболее подверженной конформационным перестройкам: 01у79Glygi (PHC.IA-B) (структуры такого вида в дальнейшем будут называться «шпильками»).
Существенное влияние иа формирование подобных
состояний оказывают
пары
заряженных аминокислотных остатков на концах - Gluyoji и Arg96,97- Противоположно
заряженные группы атомов формируют выгодные электростатические контакты. Ранее [89] поведение мономера было изучено с применением модели неявно заданной мембраны.
В этом случае наиболее энергетически выгодным состоянием является ТМ а-спираль
(Рис.]Д). Таким образом, наличие сольватационного терма, имитирующего гетерогенное
мембранное окружение, препятствует образованию нековалентных взаимодействий между
удаленными по последовательности остатками. Структура пептида определяется балансом
следующих
фупп
энергетических
вкладов:
водородных
связей - с одной стороны, и
сольватационного
терма
ван-дер-ваальсовых
и
энергии
и кулоновских
взаимодействий - с другой. Пренебрежение эффектами среды приводит к преобладанию
взаимодействий второй фуппы и, следовательно, к дестабилизации вытянутой аспиральной коиформации и образованию «шпильки».
Ai
"•i'jr^iJ
\) »i
,y.^f«7
0
"'С'^
-11^, у
"''/"
'
^V"
f
^
1
ч
Рисунок I. MK расчет и-спнрильных мономеров GpA в
«вакууме» (А-В) н в мембране с ТМ потенциалом (Г-Д).
А ) Стартовая структура а-спирального мономера ОрА в
«вакууме»; Б-В) Низкоэнсргстичсскис конформации типа
«шпилька». Г) Стартовая конформация «развернутой»
полипептидной цепочки GpA. Д) Низкоэнсргетическос
состояние в мембране - а-спирапь. Ленточной
диаграммой
обозначена
а-спиральная
структура
мономера. " N " и " С " - N и С - концы, соответственно.
Значками «+» и «■» указаны заряженные остатки Argie-i?,
Glu7i),72. соответственно. Выделены боковые цепи этих
остатков и тяжелые атомы их полнпептидной цепи.
Границы а-спнральных сегментов обозначены числами,
соответствующими номерам а.к. остатков.
Ш.1.2. Моделирование двух а-спирапьиых сегментов в «вакууме».
Среди низкоэнергетических состояний наблюдали два вида топологий: «спиральшпилька» и димерные состояния в ориентации «голова к хвосту» (антипараллельный
димер,
ti)'
Между
мономерами
возникает
образование
ряда
вьт)дных
ван-дер-
ваальсовых и электростатических контактов, что, по-видимому, приводит к стабилизации
а-спиральной
конформации
(Рис.
2).
Образуется
большое
число
выгодных
электростатических контактов на концах мономеров (Рис. 2). В центральной части димера
плотной упаковки между а-спиралями не наблюдается, что хорошо видно из Рис.2Б-В,
поэтому взаимодействуют мономеры преимущественно за счет остатков с длинными
боковыми цепями.
Таким
образом,
межмономерные
контакты
для
структур,
рассчитанных
в
«вакууме», сильно отличаются от «мотива димеризации» LIxxGVxxGVxxT (где х - любой
остаток), установленного для GpA экспериментально. По-видимому, мембранная среда
оказывает существенное влияние как на взаимную ориентацию мономеров (в структуре,
полученной методом спектроскопии Я М Р (в дальнейшем - модель СрАямр), мономеры
расположены «голова к голове»), так и на плотность их упаковки. Следовательно,
необходимо
рассмотреть
гетерогенного
полученные
окружения
с
механизм
межмолекулярного
«вода-мембрана-вода».
использованием
подобной
модели,
Ниже
в
взаимодействия
приводятся
которой
обе
с
учетом
результаты,
поверхности
эквивалентны с точки зрения их математического описания. В этом приближении модель
представляет собой мембрану без приложенного Т М электростатического потенциала.
в
чЛ*-^^^
Рисунок 2. Моделирование двух а-спиральньпс мономеров GpA в «вакууме». А) Исходное
расположение мономеров относительно друг друга: показан мономер 1 и различные положения
мономера 2 (2, 2', 2"); Б-В) Ниэкоэнергетические димерные конформации. Буквенными
обозначениями показаны остатки, образующие мсжмономерные контакты, серым цветом
выделены а.к. остатки, совпадающие с данными мутагенеза [10]. Остальные детали - как в
подписи к Рис. I.
1П.1.3. Взаимодействие
приложенного
ТМ
а-спиральных сегментов в мембранах разной толщины
без
потенциала.
Рисунок 3. Расположение мономеров в стартовых
состояниях при расчете методом М К (А-В). Г)
Стартовая структура димера СрАямг. «1» и «2» мономеры I и 2, соответственно. Серым цветом
обозначена гидрофобная область мембраны.
МК-поиск
низкознергетических
состояний с произвольно заданных стартовых
^w*
'
положений ач:пиральных мономеров (Рис. 3)
показал,
что
обеим
субъединицам
энергетически выгодно принять Т М ориентацию - при этом практически все гидрофобные
остатки располагаются в неполярной области (|z| < D, где D - толщина мембраны, z координата
Z
атомов
остатков,
ось
Z
перпендикулярна
плоскости
мембраны),
имитирующей липидный бислой, а полярные и заряженные остатки экспонированы в
водную фазу.
Из Рис. 4 видно, что мономеры взаимодействуют друг с другом, образуя комплексы
с различной структурой Среди низкоэнергетических состояний обнаружены следующие
виды топологий - антипараллельный ТМ-димер ( Т М ц , Рис. 4:А1-2, БЗ, В1), параллельный
ТМ-димер ( Т М ц Рис 4:Б4), «спираль-шпилька» (Рис. Ш.4:В5), «шпилька-шпилька» (Рис.
4:Вб), нетрансмембрамные димеры. Заметим, что «шпильки» образовывались только при
D = 36 А (Рис 4В) и 40 А, а нетрансмембранные димеры - при D = 40 А (не показаны).
Анализ отдельных энергетических термов полученных комплексов свидетельствует
о том, что оба типа состояний, Т М ц
и Т М ц , характеризуются
8
низкой энергией
взаимоленствия со средой Симметричная модель мембраны не создает выделенного
направления для лнгюльных моментов а-с1Н1ралсй. но1Тому оба THita димеров (ТМц м
T M j t ) являются энергетически выгодными состояниями. Очевидно, тго структуры Т М ц
гораздо более стабильны в мембране без Т М потенциала - учитывая значительную
величину дипольного момента а-спирали GpA (-90-100 Дебай), можно ожидать, что
наличие Т М электростатического потенциала ( А у Ф 0) будет приводить к значительному
повышению энергии таких конформаций.
Рисунок 4. Низкоэнергетические конформаций димеров GpA,
полученные методом М К в симметричной мембране разной
толщины (D=24A; ЗОА; ЗбА). Цифрами обозначены группы
выделенных состояний.
Многие
Б
наблюдаются
Исключение
обнаруженные
лишь
при
составляет
группы
одном
состояний
из
значений
D.
1
состояний
с
фуппа
параметрами: d ~ 9.5 ± 0.5 А и |0| = 160" ± 10* (здесь d и
0 - расстояние и угол между осями а-спиралей) (Рис.
4:А1,В1), которая присутствует при всех значениях D. В
этом
наборе
формируется
структур
посредством
LIxxGVxxGxxxTxxLI,
данными
мутагенеза
даже при
интерфейс
димеризаиии
аминокислотных
что
хорошо
(LIxxGVxxGVxxT).
антипараллельной
ориентации
образуются схожие контакты, обеспечиваемые специфической
остатков
согласуется
Видно,
с
что
мономеров
последовательностью
пептида. Замечено, что плотные контакты между а-спиралями позволяют мономерам
синхронно «подстраиваться» под толщину мембраны (Рис. 4А1,В1), т.е. угол наклона осей
спиралей по отношению к плоскости мембраны (ср) меняется одновременно на одну и ту
же величину при увеличении толщины мембраны от 24 до 36 А. Так, при D=24 А угол
наклона каждого из мономеров составлял (pi = «рг = 45'( Рис. 4 A I ) , при D=30 А - <pi = ф2 =
60', а при D =36 А ф! ~ (р2 ~ 75* ( Рис. 4В1) (ф1 и ф: - углы наклона мономеров 1 и 2,
соответственно). При такой «подстройке» гидрофобный участок каждого из мономеров
GpA наилучшим образом контактирует с гидрофобной областью мембраны, что хорошо
согласуется
с
известным
эффектом
«гидрофобного/гидрофильного
соответсгвия»,
наблюдаемого экспериментально [ И ] . Таким образом, мы полагаем, что в дополнение к
описанным выше факторам, важным для стабилизации Т М а-спиральных олигомеров, на
формирование структуры также оказывают существенное воздействие электростатические
взаимодействия и эффект «гидрофобного/гидрофильного соответствия».
111.1.4. Моделирование с электростатическим
потенциалом
на мелгбрине.
Присутствие разности потснцмшюв на мембране имеет большое значение д;1Я
многих процессов в
клетке, например, для
явлений, связанных
с запасанием
и
преобразованием энергии, для управления транспортом ионов и молекул через мембрану,
для встраивания белков в липидный бислой, и т.д. [12]. Т М потенциал может играть
существенную роль во взаимодействии белков с мембраной и в процессах сборки
мсмбраносвязанных белковых фрагментов. Следует ожидать, что при этом влияние Лц/
будет особенно значительным для а-спиральных
пептидов, обладающих
большим
значением дипольного момента. Учет изменения потенциала вдоль нормали к плоскости
мембраны (координата z, Л ^ = 300 м В ) описывали энергетическим термом ( последний
добавляли
в
выражение для
полной
энергии системы)
следующего
вида:
м
E^^'=(FAi///D)^ qiz, , где qi к z, - парциальный заряд и координата Z атома i, F м
константа Фарадея. В случае U, |>z„,
МК
поиск с трех
относительно
друга
и
Е^^ = О [9].
независимых
относительно
стартовых
мембраны
положений спиралей G p A
показал, что
друг
низкоэнергетические
состояния (с энергией в диапазоне [Ешн, Еынн + А Е ] , где Ещи - минимальная энергия, ЛБ
= 15 ккал/моль), характеризуются следующим образом. Как и в случае симметричной (Ду
= 0) мембраны, мономеры хорошо сохраняют ач:пиральную конформахшю (Рис. S). При
этом камсдая из а-спиралей принимает Т М ориентацию, мономеры образуют плотно
упакованные комплексы в мембране в ориентации «голова-к-голове».
1
'(врАш)
»
»
(
OftitMumi
Рисунок 5. Низкоэнергетические состояния, рассчитанные методом М К в неявно заданной
мембране с приложенным Т М потенциалом (1-6). Номера групп соответствуют номерам групп в
Табл. 1. СрАямг-ао - низкоэнергетаческос состояние, полученное в результате моделирования
методом М К в мембране при старте с экспериментально установленной структуры (Рис.ЗГ) [4].
Остальные детали см, в подписи к Рис. I
Приложенный потенциал существенно влияет на геометрию упаковки Т М аспиралей GpA в димере при Л\)^ * 0. Среди иизкоэнергетических структур наблюдаются
разнообразные типы упаковки спиралей (Рис. S), отличающиеся значениями параметров d
и 0 (Табл. 1). Тем не менее, во всех этих структурах в спираль-спиральных контактах
участвуют остатки, важная роль которых в процессе димеризации G p A была установлена
экспериментально [4].
10
Таблица I. (1аримстрьг групп мизкозпсргстнчсских состояний, рассчитанных в исснммсфимпоП
(Ау ^ 0) мембране.
E
y
Группа'
E
'
Интерфейс димеризации''
£^
rf^
в'
''ХЯГКЯ.
SEPEITUlF№nullVl(eiI'LISyGIKR
1 (TMtt)
10.1
(0.1)
-50 1
(0.5)
llOfA»)'
9.1
(0.41
-25.9
( 1 4)
3(TMt1)
9.2
(0.1)
22.1
(1.1)
4 (TMtt)
6.9
(0.1)
42.6
(0.8)
SCTMn)
5.5
(0.2)
60.2
(2.0)
9.0
5.9
(0.2)
ГГМн)
«(TMtt)
(0.1)
ОрАямг<|П1*
fTMtt)
'
'
'
'
7.1
(0.1)
-39.8
(0 3)
II
Itl
VM
V«
у
1J
I
I
I
-'-^-Hf-Hi-°-
=ii3JBtozli=!t±
1...Я
I
T J «
<-'■''
Л| . 0
LL
f
T
I
I _
—E Д и a ct—ь—0—
я ■ ■ II 1
"F
1 ■
И
t
18.2
(0.2)
-370.4
(0.3)
191.8
(0.4)
628.4
(4 4)
17.4
(0 4)
-372.7
(2 5)
-192.0
(3 71
-632.4
(1.7)
18.9
(0.2)
-382.3
(1.5)
-185.9
(0.6)
-629.3
(1.6)
21.6
(0.4)
-392.3
(1.4)
-174.8
(0.7)
-626.5
(2.9)
19,3
(1.3)
'-378.6
(3.0)
(1.2)
-626.9
(2.7)
IS.8
(0.3)
-379.3
(1.9)
-188.0
(1.3)
-622.3
11.0)
20.6
(0.2)
-382.5
(3.7)
(0 5)
E_t08/_J&_J
1 R *l °
629 8
I
I
Номера групп соответствуют номерам групп на Рис 5 TMft - днмеры в параллел|1Ной ориентации,
соответственно.
d и в - средние значения расстояния (в А ) и угла (в град.) между осями ач;пиралей. В скобках приведены
значения стандартных опиюненнй.
Остатки, найденные на иктерфейсе димеризации, обозначены буквой. Серым цветом окрашены а.к остатки
на интерфейсе димеризации, совпадающие с данными мутагенеза [10].
£«а> • "
> E.i„ £а>м - полная эиерпи, энергия электростатических и ван-дер-ваалыэтвых взаимодействий,
энергия сольватации (ккал/моль), соответственно. В скобках приведено стандартное отклонение.
ОрАик - группа расчетных конформеров, наиболее близкая к структуре димера (СрАямг). устаноалениой
экспериментально [4].
С!рАямг.««« - низкоэнергетические состояния, полученные при моделировании методом М К при старте с
экспериментально установленной модели СрАямг структуры (Рнс.ЗГ) [4],
Интересно
также,
что
возможны
варианты
укладки
спиралей
как
с
положительными (кластеры 3-6, Табл. 1), так и с отрицательными (кластеры 1-2, Рис. 5,
Табл. 1) значениями угла 0. Первые из них отвечают двойной суперспирали с левой
закруткой, а вторые - с правой. Среди состояний с 0 < О наилучшее совпадение с
экспериментально установленной структурой СрАямр (d * 7 А, 0 и -40°) наблюдается у
состояний из кластера-2: d » 8.3 А, 0 » -27' (Табл. 1, Рис. 5), хотя расстояние между
мономерами в них несколько превышает наблюдаемое в ЯМР-моделях. (В дальнейшем эта
структура обозначается символом GpAjiiK-) Именно для подобных состояний интерфейс
димеризации полиостью симметричен и практически не отличается от обнаруженного по
данным мутагенеза и ЯМР.
И
III.1.5. Сравнительный анализ моделей димера, полученных с помощью
спектроскопии ЯМР и рассчитанных методом Монте-Карло.
Особый интерес представляет набор рассчитанных состояний, обладающих
плотной упаковкой спиралей и левой закруткой друг относительно друга (0 > 0). К ним
относятся состояния из кластеров 4 и
5 с параметрами (d ~ 7.0 А; 0 = 40*) и (d = 6.0 А;
0 = 55*), соответственно (Табл. 1). Мономеры в указанных кластерах образуют выгодные
ваи-дер-ваальсовы контакты, обладают энергетически выгодной симметричной и плотной
упаковкой а-спиралей за счет контактов в их центральной части - посредством мотива
GVxAGxxG. На наш взгляд, наличие структур такого типа поднимает вопрос о возможном
существовании моделей димера GpA, альтернативных полученным по данным ЯМРспектроскопии. Заметим, что основанием для построения моделей GpA Энгельманом и др.
являлись
данные мутагенеза, позволившие
определить остатки, участвующие
в
димеризации [10], а также набор из пяти пар ограничений на расстояния между
мономерами, полученный из анализа сигналов ядерного эффекта Оверхаузера (ЯЭО) в
спектрах ЯМР [4]. Возможно ли существование гипотетическойструктурыдимера с 0>
0°, удовлетворяющей данным мутагенеза [10] и ЯМР [4] ?
Для ответа на этот вопрос был проведен следующий вычислительный эксперимент.
Полученная методом МК конформация димера с параметрами d =: 6.0 А; 0 ~ 55* была
выбрана в качестве структурного шаблона для построения искомой модели. На ее основе
сконструирована
конформация
димера,
состоящего
из
идеальных
а-спиралей,
ориентированных друг относительно друга как в исходной МК-модели ( в дальнейшем эта
структура обозначается символом GpAt). Анализ экспериментальных данных по
ограничениям на межмономерные расстояния [4] для моделей СрАям?. GpAt и GPAMK
показывает, что суммарные значения нарушений достаточно близки. ( Для 19 моделей
димера GpA рассчитанных на основе ограничений ЯМР, среднее отклонение от
ограничений составило 0.74 ± 0.07 А, для моделей GpAt и ОрАмк суммарное значение
нарушений -1.10Аи2.17А, соответственно.) Следовательно, пространственная структура
гипотетической модели GpAt в целом не противоречит имеющимся данным ЯМРспектроскопии. Анализ упаковки мономеров в модели GpA[. показывает, что интерфейс
димеризации в ней сформирован остатками l76XxG79V8oxA«2G83XxG86XxL89b>o (Табл. 1).
Заметим, что ряд остатков, важная роль которых в димеризации была установлена с
помощью мутагенеза, формируют интерфейс спиральч:пираль в модели с 0 > 0°. Это Leu75, Пе7б, Gly79. Valjo, 01у»з, ТЬг87. Кроме них, в межспиральном взаимодействии
участвуют Glyi6, Leut9, Leu«o. Согласно данным мутагенеза, замена каждого из указанных
остатков может существенно влиять на процесс димеризации, хотя в итоговой модели
Энгельмана они не лежат на межмономерном интерфейсе.
12
и 1.1.6. Гидрофобная оргаптиция
а-спирильиых димерпых комплексов СрА.
О д н и м из к р и т е р и е в к а ч е с т в а нространс1ве1Н1ЫХ моделей димера м о ж е т с л у ж и т i.
характер распределения их гидрофобных/гидрофильных с в о й с т в на п о в е р х н о с т и к а ж д о ю
из
мономеров.
В
частности, комплементарность
таких
свойств
в
областях
контакта
спираль-спираль и спираль-мембрана характерна для Т М с е г м е н т о в б е л к о в . Д л я оценки
т д р о ф о б н ы х с в о й с т в а-спиралей G p A использовали метод м о л е к у л я р н о г о г и д р о ф о б н о ш
потенциала
(МГП),
который
ранее
успешно
применялся
для
изучения
мембрапо-
с в я з а н н ы х а-спиралей [ 1 3 ] . Н а Р и с . 6 представлены д в у м е р н ы е к а р т ы гидрофобности,
р а с с ч и т а н н ы е д л я одной из о-спиралей (69-97) в моделях С р А я м р . G p A u и О р А м к -
т
'^Т'Ш
A
g
o
Рисунок
6.
Распределение
гидрофобных
/
гидрофильных
свойств и димсрная упакоька
Biitpxv:
Июнотенциальные
tt^^^
J
ЭВкЩпчк
двумерные карты молскулярно! и
гидрофобного потенциала ( М Г П ) пл
iiOBq)XHOCTH
а-с11иральных
мономеров в димерных комплексах.
Серым цветом окрашена область
межмономерных
коитаюин
в
димерных структурах: А ) GpAjMi'.
Б) СрАмк! В ) GpAt. Переменная пи
оси
X
угол
вращения
относительно
оси
спирали
Переменная по оси Y- смешение
вдоль оси спирали. Показаны
только области с М Г П > 0 09.
контурные линии посфоены с
интервалом
0.01S
Позиции
|^жта^
щ
^^г
\т
1,"«
^-\!F
"~щг)
остатков
показаны
буквенными
обозначениями. Карты рассчитаны,
как описано в [13]. Внизу Модели
соответствующих
димеров
Пептиды изображены с помощью
ленточных диаграмм, в области
димерного интерфейса показаны
атомы структуры
Остатки 01>
окрашены в черный цвет, Val - н
серый, Пстб н ThfiT- в теино^ерый. Неполярная область мембраны окрашена в светло-серый цвет
Контурными
изолиниями
поверхности,
обладающие
поверхности
о-спирали
показаны
высокими
является
ее
только
значениями
высокая
наиболее
МГП.
степень
гидрофобные
Характерной
области
особенностью
гидрофобности
и
наличие
о т н о с и т е л ь н о более п о л я р н о г о «Л-образного» паттерна, формируемого о с т а т к а м и Serg),
ТЬг87, G l y m ,
С1у79, С1унб и
взаимодействовать
протяженную
01у94. М о ж н о
посредством
область полярности
предположить, ч т о
контактов
между
а-спирали
остатками,
на их поверхности. В
которые
чтом случае
GpA
могут
образуют
обеспечивается
в ы с о к а я с т е п е н ь к о м п л е м е н т а р н о с т и м е ж д у их п о л я р н ы м и у ч а с т к а м и , а б о л ь ш а я часть
гидрофобной п о в е р х н о с т и э к с п о н и р о в а н а в неполярное липнднос о к р у ж е н и е . В npiniUHiic.
с о г л а с н о п р е д л о ж е н н ы м к р и т е р и я м , д л я а-спиралей G p A в о з м о ж н ы два варианта yk.ia.iKii
13
- с участием остатков, формирующих левый (Зсгчг, Thru?, Glysj, 0\ут,) и правый (01уч4,
Olyw,, С1у7ч) «рукава» «Л-образного» паггерна. Интересно, что именно эти два варианта и
рси;тзуются как в реальном, так и в в[.1числитсльном экспериментах. 13 частности, в
моделях с правой закруткой a-cimpancH (СрАямр и СрАмк) интерфейс димеризации
совпадает с первой из полярных областей (Рис. 6А,Б), а в модели с левой закруткой
( G p A i ) - со второй (Рис. 6В). Как видно иэ^ Рис. 6А,Б, в структуре ОрАмк область
межспирального
контакта
хорошо согласуется с наблюдаемой
в
СрАямр, хотя в
теоретической модели паттерн интерфейса на поверхности характеризуется меньшим
углом наклона к оси спирали и, следовательно, меньшей степенью суперспирализации
димера. Кроме того, в обеих моделях зона контакта включает как гидрофильный, так и
параллельный ему гидрофобный паттерн. Последний образован остатками Пстб, Valgo,
ValM, Ilc9i.
///. 1.7. Влияние степени гидрофобности мембраны на результаты
моделирования.
Чтобы оценить, насколько результаты моделирования димера G p A чувствительны
к изменению параметров липидного бислоя, расчеты, аналогичные описанным выше,
были проведены с использованием как «менее», так и «более гидрофобной мембраны». ( В
дальнейшем термины «менее гидрофобная мембрана» и «более гидрофобная мембрана»
обозначают модели неявно заданной среды, описываемые
атомными
параметрами
сольватации «вода-октанол-вода» и «вода-циклогексан'-вода» (см, ниже)).
В первом случае «менее гидрофобное» мембранное окружение моделировали с
помощью аппроксимации неполярной части октанолом, обладающего более полярными
свойствами
по сравнению с циклогексаном. Полученные в результате МК-поиска
низкоэнергетические
состояния
представляют
собой
ТМ
а-спиральные
димеры.
большинство из которых обладают параметрами d = 10 А , |0| < 10' (Рис.7: А Г ) , а менее
представленная группа состояний - параметрами d = 9 А , |0| = 50* (Рис,7:АЗ'). Также
присутствовали шпилькообразные димеры, где «излом» а-спирали наблюдался на участке
GxxxG (Рис.7:А2'). а-Спирали
взаимодействуют
в
основном
за
счет
остатков
с
протяженными гидрофобными боковыми цепями, и интерфейс димеризации сильно
отличается от экспериментально установленного (данные не приведены). Таким образом,
более полярное окружение способствует
образованию
контактов
между
наиболее
гидрофобными остатками. При этом не найдено групп состояний, близких по структуре к
описанным
выше
(полученным
экспериментально,
либо
рассчитанных
в
немодифицированной мембране).
Модель «более гидрофобной мембраны» основана на искусственном увеличении
(на 40%) степени гидрофобности центрального слоя мембраны путем изменения значений
АПС
в
модели
неявно
заданного
растворителя
14
[8].
(Циклогексан'
им1ггируется
модифицированными
AIIC
«водяной
низкоэнер! стичсскнх конформсрок (~10
конформации
воспроизводились
в
пар
-
пикло1сксин»).
Среди
набора
структур) наиболее спснмфичмой упаковкой (
независимых
расчетах
с
различных
стартовых
состояний ) обладала группа I (~150 структур) - эти состояния представляли собой
лсвозакрученные, плотно упакованные димеры с параметрами d= 6.5 ±0.3 А, 0= 65.2 ±4.2°
и
интерфейсом
представителей
димеризации
дагпюго
IxxGVxAGxGxxLLxxY
класса
практически
(Рис.
7:Б1").
совпадают
с
Конформации
моделями
GpAi,
наблюдавшимися в немодифицированной мембране («вода-циклогексан-вода», см. выше)
Конформеры, соответствующие остальным расчетным состояниям, обладают сильной
А
гетерогенностью (Рис. 7:Б2"-6"), и для них
представляется
затруднительным
специфичность
в
выявить
образовании
межспиральных контактов.
Рисунок 7. Низкоэнсргстическис димсрныс
состояния, полученные методом МК в неявно
заданных мембранах с разной степенью
гидрофобности А) в «менее гидрофобной
мембране»; Б) в «более гидрофобной мембране»
М ы полагаем, что на стадии сборки
димерного комплекса в мембране важную
роль
играют
необходима
|к
эффекты
аккуратная
сольватации,
и
параметризация
используемого силового поля. Нарушение
баланса
Есоли.
между
и
Еш,
энергетическими
Ездоа
термами
и т.д. приводит
к
нарушению сборки димерных комплексов. В
значении А П С заложена
энтропии,
связанное
дальнодействуюшая
в неявном виде информация о многих факторах - понижение
с
упорядочением
растворителя
у
гюверхности
белка,
электростатическая компонента свободной энергии сольватации
белка, конфигурационная энтропия боковых цепей и т.д. Данный численный эксперимент
демонстрирует также, что разные по свойствам модельные искусственные мембраны
могут влиять на способность к димеризации.
Таким образом, ah initio предсказание структуры димера возможно лишь при
условии корректного описания мембранного окружения - например, с помощью модели
сольватации, основанной на А П С «водяной пар - вода» и «водяной пар - циклогексан».
15
III.2. Изучение димепиюнии ТМ сегмента баша BNIP3 методом Монте-Карло
неивно заданной мембране.
1/1.2.1. Характер взаимодействия мономера BNIP3
остатков на концах.
в
с мембраной: роль зарнзкенных
Белок B N I P 3 (Вс1-2/19-кОа, домен 3) является представителем семейства BCL-2,
отнстствснного за реализацию активной формы гибели клетки - апоптоза. Установлено,
что этот белок образует гомодимеры в мембранах и в мицеллах детергентов [14-15]. В
отсутствие С
- концевого Т М
домена он не способен
образовывать
димеры
и
локализоваться на внешней митохондриальной мембране, вследствие чего теряется его
проапоптотическая активность.
С - концевой участок BNIP3 включает в себя ярко выраженный гидрофобный
сегмент Vali63-01yiM> на N-конце которого содержится ряд заряженных (Argue, Lysisa,
Lysi53, GluiM, Lysi63) и ароматических ( Pheise, Phei6o, Phei64) остатков, a на С-конце
расположены положительно заряженные остатки - Argi85-i86 (Рис. 8Б). Исследование
возможных мод связывания пептидов с мембраной проводили с мономерами разной
длины (варианты 1-6) (Рис. 8): «длинными» ( 1 , 2 ) «средними» ( 3, 4), «короткими» ( 5, 6).
^i6^ \ \^
4а
Б
Ти1ш мономеров
«М'/инные»
«Средние»
1
R,^NTSVMKKG,j^GIF|j,SAEF,^,LK,^jV^^F,^,LPSLLLSHLLAIGLGIYlGRR_^
г
0
3(BNIPJ,uO
GIF „SAEF,,,LK,„V,^F,„LPSLLLSHLLAIGLGIYIGRR,^
54
K|^jV|^F,^,LPSLLLSHLLAIGLGIYIGRR,„
4 (BNIP30
«Короткие»
46
K,^,V,^F,„LPSLLLSHLLAIGLGiyiGR,„
103
5
6
IM
\ьъ
V,^F,„LPSLLLSHLLAIGLG1YIGRR,„
V|^F,^jLPSLLLSHLLAIGLGIYlG
Рисунок 8. A) Низкоэнергетические состояния ТМ сегментов пептида BNIP3 разной длины (см. п.
Б), полученные методом М К в неявно заданной мембране; Б) А.к. последовательности
моделируемых пептидов. Другие детали см. в подписи к Рис.1.
Уже па первых шагах конформационного поиска метолом М К энергия мономеров
значительно уменьшилась за счет перехода субъединиц из водного окружения в мембрану
(Рис
8А), и, независимо от длины а к. последовательности, наиболее гидрофобный
участок
Vali67-Glyi84
мономеров
находился
16
преимущественно
в
а-спиральной
конформации в бислос. Между тем, также црнсугствовали и состояния с изломим аспирали для пептидов группы 4 (Рис
8А, 4з). Оказалось, что на характеристики
связывания мономеров разной длины с мембраной влияет присутствие заряженных
остатков на концах пептидов. Так, а-спирали в «средних» и <<длинных» мономерах
располагались под углом 75-80* к плоскости мембраны (Рис. 8), в то время как угол
наклона оси спирали «коротких» пептидов составил = 45*. Таким образом, ориентация Т М
сегмента BNIP3 в мембране определяется как длиной гидрофобного участка (происходит
«подстройка» пептида под толщину гидрофобной области мембраны за счет изменения
угла наклона оси спирали), так и за счет взаимодействия заряженных остатков Lysitj,
Argiti, окаймляющих гидрофобный участок, с водным окружением. Заряженные остатки
Argi44,
Lysij2-i53. GluiM
в
примембранном
а-спиральном
участке
не
влияют
на
характеристики связывания Т М сегмента с мембраной. В дальнейшем, для упрощения
задачи
конформационного
поиска
и
более
эффективного
исследования
спираль-
спиральных контактов, при моделировании димера была выбрана группа 4 «средних»
пептидов ( B N I P B R ) .
III.2.2. Гидрофобные/гидрофильные свойства ТМ сегмента
BNIP3.
Рисунок
9. Распределение гидрофобных/гидрофильных
свойств на поверхности Т М сегмента белка BNIP3. Другие
детали см. в подписи к Рис.6.
Гидрофильный паттерн на поверхности а-спирали
BNIP3
(
гидрофильный
относительно
сильно
гидрофобных остатков этих пептидов Leu, Val, Phe и т.д.)
имеет вид : Si6«xxxSi72Hi73XxAi76XxxGi8oxxxGi84 (Рис. 9).
Он содержит все три остатка (Hisi76, Alanj, Giso). влияние
которых на димеризацию было выявлено с помощью
экспериментов по направленному мутагенезу [14]. Как
Угол ■ращения, град.
отмечают
авторы
димеризацию
не
[14],
влияние
всегда
остатка
очевидно.
Hispj
Известно,
на
что
ионизация боковой цепи остатка His в сильной степени зависит от окружения (рКа боковой
цепи = 6.3). Экспериментально зафиксирована активация белка BNIP3 только при низких
значениях рН [16]. Возможно, что протонирование остатка Hisnj имеет функциональное
значение. В настоящий момент механизм действия BNIP3 на молекулярном уровне далек от
понимания, поэтому влияние зарядового состояния остатка Hisns на димеризацию требует
дополнительного изучения.
1Ц.2.3. Расчет димерных состояний
ТМ сегментов
ВШРЗ.
Проведен аЬ initio конформационный поиск (в данном контексте термин иЬ miiio
означает, что при моделировании не использовали каких-либо офаничений на структуру)
низкоэнергетических состояний системы, состоящей из двух субъединиц B N I P 3 R
17
в
мсмбраммом окружении. BJtияllиc последнего аппроксимируется с 1гомо1цью модели
нсянно заданного растворителя [8]. Выявлены группы параллельных лимерных упаковок.
как с правой, так и с левой закруткой. Наиболее специфичными межспиральными
взаимодействиями обладала фуипа правозакручениых димеров (Табл. 2) с параметрами
d = 5 7 А, 0 = -19.8" и симметричным интерфейсом димеризации FxxLxxxHxxAxxLGxxIG
( М а Ы 1R) Интересно, что могут реализовываться и другие состояния, для которых также
характерны контакты вдоль гидрофильного паттерна ( 0 = -20.5°, МаЫ2к) (Рис. 9).
Однако, ввиду того, что мономеры в комплексе расположены несимметричным образом,
не достигается плотной упаковки между мономерами (6.2 + 10.0 А, Табл. 2), и теряется
тонкая специфическая межспиральная подстройка. Таким образом, высокая степень
комплементарности обеспечивает плотную межмономерную упаковку, что, по-видимому,
является приоритетным при олигомеризации, также как и в процессах межбелкового
узнавания.
Роль ионизаиии боковой иепи остатка
His и].
Моделирование проводили с учетом двух
боковой
цепи
Hisi73-
Класс
правозакручениых
возможных
димерных
зарядовых
состояний
упаковок
(МаЬПк)
воспроизводился как в случае протонированного, так и в случае непротонированного
остатка Hisi73 (Табл. 2). Интересным фактом является образование левозакрученных
димерных структур с плотной упаковкой на С - конце. И»ггерфейс димеризации также
совпадает с данными мутагенеза - межспиральиые контакты образованы за счет остатков
Hi73XxAi7exxxGno. В данном случае упаковка левозарученных димеров зависела от
зарядового
состояния
Hisi73.
формировались структуры св~
Так,
в
вычислительном
эксперименте
с
His+i73
20° ( М а Ь 2 и ) , а в случае с незаряженным остатком Hisnj
угол 0 составил = 60° (МаЬ22к). Сравнение ориентации OCTtmcoB His друг относительно
друга в разных укладках показало (Рис. 10), что боковые группы HiS|73 имеют тенденцию
образовывать невалентиые «стэкинп> взаимодействия. В зависимости от типа укладки,
ароматические
кольца
находятся
на
разных
расстояниях
(h).
Так,
наибольшая
сближенность между плоскостями ароматических
колец His (h) наблюдается у состояний с © = 60°:
h = 4.0 А. В конформациях с 0 = 20°: h=: 7.0 А, а в
моделях с 0= - 20°: h= 8.5 А.
Рисунок 10. Нижний РЯД: расположение расчетных
структур в «мембране» с параметрами:
А)
МаЫ lR(His.His+) d а 6А, 0 = -20°; Б) Mab2lR (His+) d
= 9А, 0 = 20°; В) Mab22|,(His) d = 8 А, 0 = 60° (см
Табл. 2). Верхний ряд: вид сверху этих структур. С
полновтомном виде представлены остатки HiS|7], а
также заряженные остатки на концах (Lysi»j, Argus).
Остальные детали см. в подписи к Рис.5.
18
Таблица 2. HHUKOSHCPI-CTHHCCKHC днмсрныс состояния, рассчитанные методом М К в неявно
заданной мембране. В скобках показано, была ли эта группа лолу<1ена с заряженным остатком
HiS|7) (II1S-1-), незаряженным (Mis) или в обоих случаях (llis-f. His).
0^
Л.'
F
Послс/юватслыюсть'*
*
Емкт.
Ь*СОЛ№».
Е^ма
■^ноли.
Ab initio расчет
ИаЬИ.
IHis.Hi
KVFLPSLLLSHLLAlGLGiylGR
5.7»0 0
-19.810.1
—P_b_S»
r
s«l
L
4
g
Ш_1С
|t
t
-441.210.6
2 3 . 0 1 0 . 1 -314.310 5
111.410.4
0
IUbl2.
(Hli.Hi
8.010.8
-20.511.5
s<l
_V
8.710.4
19.910.5
НаЬ22,
8.310.0
62.513.4
В |I
6^ ° "
-444.612.6
22.710.4
-310.912.3
-114.211.0
L
В A
1 IG
-441.911.4
2 2 . 6 1 0 . 1 -305.411.5
-113.710.3
-443.610.8
2 0 . 8 1 0 . 1 -299.511.2
S L _ S _ l l _ g t _ I _
1<лЬ21.
(Hl»*t
L
1 |I ■
(Hi»
lie
710.5
I
s 1 ir-a_x_
' Обозначения групп низкоэиергетических состояний, полученных при расчете методом МК.
'due- средние значения расстояния (в А ) и угла (в град.) между осями а-спиралей.
' Остатки, найденные на интерфейсе димеризации, обозначены буквой Серый цветом окрашены а.к осптки
на интерфейсе димеризации, совпадающие с данными мутагенеза [14].
* Етш., Еи,щщ, £ata ^еа»>« ~ полная энергия, энсргия электростатических и ван-дер-ваал1>совых взаимодействий,
энергия сольватации (исал/моль), соответственно.
Ш.2.4. Мутагенез in silica: поиск гомологов ТМ пептида BNIP3, способных к
эффективной димеризации.
Пептиды с потенииально улучшенной димерюаиионной способностью.
Как упоминалось ранее, мотив GxxxG (х - любые остатки последовательности) в
последовательностях различных белков способствует образованию плотных димерных
упаковок [17]. Методом мутагенеза установлено, что в ТМ сегменте белка BNIP3 важным
для димеризации, является
мотив, образованный
остатками АхххО
[14]. Мы
предположили, что замена Alai76 на остаток Gly (также производили замену Hisi73—'Leu
для исключения влияния остатка Hisi73 ) будет способствовать образованию более
плотных контактов между а-спиралями, и, возможно, повышенной способностью к
димеризации.
МК расчет в неявно заданном мембранном окружении показал, что наиболее
энергетически выгодный и заселенный класс состояний образуют димерные конформаиии
с правой закруткой (параметры d == б.б А, 0 а
-35.4°) и интерфейсом димеризации
VFxxSLxSLi73XxGi76btLGijoXxIG. Заметим, что на интерфейсе, присутствуют все три
остатка Gly, и угол между осями а-спиралей несколько увеличился по сравнению с
правозакрученной моделью димера для ТМ сегмента белка BN1P3 дикого типа. Мы
предполагаем, что такая мутантная форма гомодимера должна обладать более плотной
19
пан-дср-ваальсовоП
«подстройкой»
за
счет
остатков
Gly
м
более
высоко!!
лимсрнзациошюп способностью по сравнению с Т М сегментом белка BNIP3 дикого типа
Моде трование ассоииашт ТМ сегмента BN/PS с мутантом
BNIP3^; цд в неявно
заданном мембранном окружении.
Целью данного этапа работы являлось создание in silico пептида, способного
конкурировать
за
димеризацию
с
ТМ
сегментом
белка
BNIP3
дикого
типа
Предполагается, что мутантная форма пептида с заменой остатка Alai76—»Gly будет
способна образовывать гетеродимеры с Т М пептидом BN1P3 дикого типа.
Вычислительный эксперимент показал возможность образования гетеродимсрных
моделей с протяженным интерфейсом димеризации, где образование плотной упаковки
происходит как за счет мугируемого остатка Glyne мономера А, так и остатка А1апб
мономера Б дикого типа (серым закрашены остатки, важные для димеризации [14], и
мутируемый остаток Glym)'Мономер А :
F
L
^
Мономер Б :
VF
SL
S
В'""^
rjjnc
В^—^G—
Д
IG
Модель гетеродимера обладает более плотной «подстройкой» боковых цепей остатков
А1апб, Glyuo, Glyi84 одного мономера и остатков Glyne, Glyno, GlyiM другого за счет
гидрофильных «лошин», образуемых остатками Gly (Рис. 11). Заметим, что более тонкая
«подстройка» межатомных контактов может быть осуществлена путем расчетов М Д
димеров в явно заданных гидратированных липидных бислоях. Расчет свободной энергии
ассоциации мономеров мог бы помочь в оценке стабильности межмономерных
взаимодействий в различных комплексах. Данная задача носит нетривиальный характер, в
настоящее время, она решается в Лаборатории структурной биологии И Б Х Р А Н . Резюме.
Таким образом, с помощью моделирования in silico показано, что мутантные
формы пептида
Alane—'Gly,
Hisi73-*Leu образуют
плотно
упакованные
димерные
структуры с правой закруткой. М ы полагаем, что димеризационная способность этих
мутантных пептидов может быть выше, чем в белке дикого типа, за счет более плотных
контактов между остатками GiyeXxxGijoxxxGiMРисунок П . Упаковка а-спиралей на С - концевом
участке Т М сегмента белка BNIP3 дикого типа (А,
модель МаЬПк) и гетеродимера (Б). Показаны
атомы,
образующие
наиболее
плотные
межспиральные контакты. Светло-серым показаны
остатки Gly, темно-серым - остатки Ala. Другие
детали см. в подписи к Рис.6.
Моделирование показало возможность
образования
сегментами
20
гетеродимеров
мутанта
между
Alane—'Gly
и
ТМ
белка
BNIP3
дикого
типа.
Отмстим,
что
в
образовании
1С1еролимсра
участвует
как
Gi7(.xxxGiKoxxxGiiM. так и АпбХххСшоХХхОци мотив. М ы полагаем, что данный мутантный
пептид сможет конкурировать за образование димсрных состояний с Т М пептидом белка
BN1P3 дикого типа.
Безусловно,
данные
предположения
должны
пройти
экспериментальную
апробацию. В Лаборатории структурной биологии И Б Х Р А Н уже ведутся работы по
изучению
возможности
создания de novo пептидов, способных
ингибировать или
усиливать ассоциацию природных Т М пептидов. Механизм олигомеризации далек от
понимания и в настоящее время лишь начинается создание таких искусственных систем.
В
решении
этой
сложной
задачи
существенную
помощь
могут
оказать
методы
молекулярного компьютерного моделирования.
ГУ. З А К Л Ю Ч Е Н И Е .
В этой главе проведен обзор выполненных исследований и полученных результатов
Основные
1.
результаты.
Исследована роль гетерогенной, полярно-неполярной, среды при моделировании
белок-белковых
взаимодействий в мембране. Вывод: а) Моделирование без учета
эффектов среды не позволяет корректно описать поведение как одного, так и двух Т М аспиралей GpA. Расчет методом М К двух мономеров GpA в «вакууме» показывает, что
полученные
установленных
конформации
в
димерных
экспериментах.
состояний
значительно
Кроме того, не
наблюдается
отличаются
специфичности
от
в
образовании межспиральных контактов.
2.
Изучены механизмы ассоциации пептидов в гетерогенном мембранном окружении.
Выводы: а) Моделирование пептидов GpA в мембране без приложенного Т М потенциала
показало, что
пептиды, сохраняя
а-спиральную
структуру,
располагаются
в
ТМ
положении, образуя димеры как в ориентации «голова к хвосту», так и в ориентации
«голова к голове». Найдена только одна группа структур с антипараллельной ориентацией
пептидов, хорошо коррелирующая с данными мутагенеза (СрАмкп); б) При расчете с
мембранами разной толщины наблюдается эффект «подстройки» димера G P A M K H под
толщину гидрофобного слоя без нарушения межспиральных контактов; в) Субъединицы в
комплексах обладают о-спиральной структурой при толщине мембраны D < 36 А, при
дальнейшем увеличении толщины мембраны наблюдаются нарушения а-спирзльной
конформации.
3.
ТМ
Проведены исследования формирования димеров GpA в мембране с приложенным
потенциалом.
Выводы:
а)
Пептиды,
сохраняя
а-спиральную
конформацию,
встраиваются в мембрану в Т М положении и образукгг димеры в ориентации «голова к
голове»; б) Конформации низкоэнергетических состояний хорошо согласуются с данными
мутагенеза; в) Найдена группа состояний с правой закруткой, по параметрам упаковки
21
близкая к -жснериментально установленной димерной структуре; г) Наблюдается группа
плотно упакованных димерных структур с левой закруткой, также хороню согласующихся
с данными мутагенеза и удовлетворяющих ограничениям на расстояния, полученным
методом спектроскопии Я М Р ; д) Проведен анализ особенностей образования лево- и
правозакручснных димерных упаковок, рассмотрено влияние мутаций на упаковку димера
и
т.д. Таким
образом, впервые
предложена
методика
моделирования
димерных
комплексов в мембранном окружении.
4
Разработанный вычислительный подход применен для моделирования димера с
неизвестной пространственной структурой - Т М сегментов белка B N I P 3 . Выводы: а) АЬ
initio
поиск
низкоэнергетических
состояний
выявил
несколько
возможных
групп
димерных состояний как с правой, так и с левой закруткой. Наблюдается высокая
корреляция полученных конформеров с данными мутагенеза; б) Сделан вывод о роли
состояния ионизации остатка Hisi73 в ассоциации а-спиралей; в) Предложены мутантные
формы BNIP3 с потенциально более высокой, чем в белке дикого типа, димеризационной
способностью.
V. вьгеоды.
1. Разработана
методика
моделирования
а-спиральных
димерных
комплексов
методом Монте-Карло с использованием иеявно-заданной модели мембраны. В
подходе
не
используются
оп^аничения
иа
пространственную
структуру
исследуемых объектов.
2. Установлено, что моделирование без учета эффектов среды не позволяет корректно
описать поведение двух Т М о-спиралей GpA. Полученные конформации димерных
состояний значительно отличаются от установленных в экспериментах.
3. Образование
димерных
комплексов,
хорошо
согласующихся
с
экспериментальными данными, возможно при следующих условиях: а) Толщина
гидрофобной
части
мембраны
должна
примерно
соответствовать
длине
гидрофобного участка мономера GpA ( « 32 А ) ; 6) Необходим учет Т М потенциала
мембраны; в) Свойства липидного бислоя наилучшим образом аппроксимируются
моделью среды «вода-циклогексан-вода».
4. Разработанная методика применена для моделирования димера Т М сегмента белка
BNIP3 с неизвестной пространственной структурой. Полученные модели хорошо
согласуются с данными мутагенеза. Показано, что степень ионизации остатка Hisns
влияет на характер ассоциации а-спиралей.
5. На основании анализа гидрофобных/гидрофильных характеристик Т М сегментов
GpA/BNIP3 и расчетов методом Монте-Карло предложены мутантные формы Т М
пептида
BNIP3,
потенциально
обладающие
способностью.
22
улучшенной
димеризационной
с п и с о к ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.
1. Y.A. Vcreshaga, Р.Е. Volynsky, D.E. Nolde, A.S. Arscnicv, R.G. Efremov. Helix
interactions in membranes : lessons from unrestrained Monte Carlo simulations. Journal
of Chemical Theory and Compulation, 2005, v . l , № 6, DOI: 10.1021/ct0501250.
2. R.G. Efremov, D.E. Nolde, P.E Volynsky, Y . A Vcreshaga, N.A, Simakov, A A
Polyansky. Molecular modeling of membrane peptides and proteins Fundamental and
Clinical Pharmacology, 2004, v. 18, p. 594.
3. R.G. Efremov, P.E. Volynsky, D.E. Nolde, Y.A. Vcreshaga, A.G. Konshina, N.A.
Simakov, A.S Arseniev. Membrane proteins: the new insights via computational
experiments. Computational structural and functional proteomics Proceedings of the
Fourth International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure
( B G R S ) , Novosibirsk, 2004, p. 255-257,
4. R.G. Efremov, D.E. Nolde, P.E. Volynsky, Y.A. Vereshaga, N.A. Simakov, A.S.
Areeniev. In silico Modeling of Peptides and Proteins in Membranes; Structural,
Dynamical, and Functional Aspects. Proceedings of the International Simposium
"Peptide-Membrane Interactions", Namur, Belgium, 2004, p. OL-2.
5. Y.A. Vcreshaga, P.E. Volinskii, D.E. Nolde, R.G. Efremov. Helix-helix association in
membrane: Monte Carlo simulations of glycophorin A. Proceedings of the international
Moscow conference on computational molecular biology, Moscow, 2003, Add. 1-2.
6. Р.Г. Ефремов, Д.Е Нольде., П.Е. Волынский, Н.П. Сырцев, Я.А. Верещага, А.Г.
Коншина, Н.А. Симаков, А.С Арсеньев. Белки в мембранах: результаты и уроки
вычислительных экспериментов. //Российский симпозиум по химии и биологин
пептидов, Москва, 2003 г., тезисы докладов, с. 24.
7. R.G.Efremov, D.E.Nolde, Р.Е.Volynsky, A.G.Konshina, N.P.Syrtcev, Ya.A.Vereshaga,
A.S.Arseniev. Peptides in Membrane-Mimic Media: Molecular Modeling Studies.
Proceedings of the Tenth German-Russian Peptide Symposium, Friedrichroda/Thuringia,
Germany, 2003, p. 2.10-5.10.
8. R.G.Efremov, D.E.Nolde, P.E.Volynsky, A.G.Konshina, N.P.Syrtcev, Ya.A.Vereshaga,
A.S.Arseniev. Peptides and proteins in membranes: what can we leant via computer
simulations? Proceedings of the International Moscow Conference on Computational
Molecular Biology, Moscow, 2003, p. 62-63.
9. Я.А. Верещага, П.Е. Волынский, Р.Г. Ефремов. Структурные и энергетические
аспекты димеризации гликофорина А в мембранном окружении //XV Зимняя
международная молодежная научная школа «Перспективные направления физикохимической биологии и биотехнологии», Москва, 2003, тезисы докладов, с. 5.
10. Я.А. Верещага, П.Е. Волынский, Д. Е. Нольде, Р.Г Ефремов. Новый метод
молекулярного моделирования олигомеризации белков в мембране. //Первая
национальная конференция: «Информационно-вычислительные технологии в
решении фундаментальных научных проблем и прикладных задач химии,
биологии, фармацевтики, медицины», Москва, 2002, сборник тезисов и докладов, с
20-21.
П . Я . А . Верещага, П.Е. Волынский, Р.Г. Ефремов. Молекулярное моделирование
структуры гидрофобного участка гомодимера гликофорина А в мембране. //XIV
Зимняя международная молодежная научная школа «Перспективы и направления
физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 2002, тезисы докладов и
стендовых сообщений, с. 72.
12. Я.А. Верещага, П.Е. Волынский, Р.Г. Ефремов. Моделирование пептид-пептидного
взаимодействия в мембране методом Монте-Карло. //Научная сессия М И Ф И .
Москва, 2002, сборник научных трудов т. 5, с. 35-36.
23
с п и с о к ЛИТЕРАТУРЫ:
1
2
3
4
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
Harder, Т , Philos. Trans R. Soc Lond В Biol. S c i , (2003), 358: 863
Ubarretxena-Belandia, I. and Engelman, D.M., Curr. Opin. Struct. Biol.. (2001), 11: 370.
Liang, J . . Curr. Opin, Chcm. Biol., (2002), 6: 878.
MacKenzie, K.R., Prcsii.y,inl, J H and Engelman, D.M., Science, (1997), 276: 131.
Adams, P.D., Engelman, D.M. and Brllnger, A.T., Proteins, (1996), 26: 257.
Ducarme, P., Thomas, A. and Brasscur, R., Biochim. Biophys. Acta., (2000), 1509: 148.
Im, W., Feig, M. and Brooks 111, C.L., Biophys. J . , (2003), 85: 2900.
Efremov, R.G., Volynsky, P.E., Nolde, D.E. and Arseniev, A.S., Theor. Chem. A c e ,
(2001), 106:48.
Efremov, R.G., Volynsky, P.E., Nolde, D.E., van Dalen, A., de KruijlT, B. and Arseniev,
A.S., F E B S Lett., (2002), 526: 97.
Lemmon, M.A., Flangan, J . M . , Treutlein, H.R., Zhang, J . and Engelman, D.M.,
Biochemistry, (1992), 31: 12719.
Bechinger, В., Mol. Membr. Biol., (2000), 17: 135.
Gennis, R.B. Biomembranes. Molecular Structure and Function. Springer-Verlag. New
York, Berlin, Heidelberg, Tokyo, (1989).
Efremov, R.G., Nolde, D.E., Vergoten, G. and Arseniev, A.S., Biophys. J . , (1999), 76:
2448.
SuHstijo, E.S., Jaszewski, T . M . and MacKenzie, K.R., J. Biol. Chem., (2003), 278:
51950.
Chen, G., Ray, R., Dubik, D., Shi, L , Cizeau, J . , Bleackley, R. C , Saxena, S., Gietz, R.
D., Greenberg, A. H., J . Exp. Med., (1997), 186:1975.
Kubasiak, L.A, Hernandez, O.M., Bishopric, N.H. and Webster, K.A., Proc. Natl. Acad.
Sci. и S A., (2002), 99: 12825.
Senes, A., Engel, D.E. and DeGrado, W.F., Curr. Opin. Struct. Biol., (2004), 14: 465.
24
Верещага Яна Александровна
Взаимодействие а-спиральных пептидов в биомембранах:
моделирование методом Монте-Карло
Подписано в печать 02.11.2005. Формат 60*84/16. Печать офсетная.
Ус/1 печ л
1,0 Уч-нзд л
1,0. Тираж 70 э ю
3aKaj №ф-519
Государственное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
Московский физико-технический институт
(государственный университет)
Отдел автоматизированных издательских систем
«ФИЗТЕХ-ПОЛИГРАФ»
141700, Московская обл., г.Долгопрудный, Институтский пер., 9
«22 314
РНБ Русский фонд
2006-4
20290
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
1 091 Кб
Теги
bd000101305
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа