close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

bd000101429

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
ИвЕнтьЕВ АЛЕКСАНДР НИКОЛАЕВИЧ
ФИЗИКО - Х И М И Ч Е С К И Е И Р Е Г У Л Я Т О Р Н Ы Е СВОЙСТВА ИЗОФОРМ
ГЛИКОЛАТОКСИДАЗЫ ИЗ С4-РАСТЕНИЙ
Специальность 03.00.12 - физиология и биохимия растений
Автореферат
диссертации на соискание учёной степени
кандидата биологических наук
Воронеж 2005
Работа выполнена в Воронежском государственном университете
Научный руководитель:
доктор биологических наук, доцент
Попов Василий Николаевич
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук,
профессор
Корнеева Ольга Сергеевна
кандидат биологических наук,
старший научный сотрудник
Егорова Елена Александровна
Ведущая организация: Институт фундаментальных проблем биологии,
Пущино
Защита состоится 11 ноября 2005 года в/^асов на заседании диссертационного
совета Д 212.038.02 при Воронежском государственном университете по
адресу; 394006, г. Воронеж, Университетская пл., 1, аудитория
С
диссертацией
можно
ознакомится
в
библиотеке
SP,
Воронежского
государственного университета.
Автореферат разослан « 10» октября 2005 года.
Ученый секретарь
Диссертационного совета
Л^
^ А г ^
Брехова Л.И.
204??
^^fff/Г
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. Исследование отдельных звеньев клеточного
метаболизма является одной из важнейших задач современной биологии. Оно
имеет как теоретическое, так и практическое
значение, поскольку позволяет
приблизиться к пониманию функционирования растительного организма, как
целостной системы и, благодаря этому, создает условия для решения проблем,
связанных с повышением продуктивности и урожайности. Растительная клетка
представляет собой совокупность взаимосвязанных органелл, вьшолняющих
разнообразные функции и тесно взаимодействующих между собой. Одним из
метаболических звеньев функционирования растительного 0ргщ1изма является
фотодыхание связывающее такие процессы как фотосинтез и дыхание.
процесс
имеет
важнейшее
значение
для
существования
Этот
растительного
организма и объединяет комплекс клеточных органелл таких как хлоропласты,
митохондрии,
стимулируемое
пероксисомы.
светом
Процесс
поглощение
фотодыхания
Ог
и
представляет
вызванное
этим
собой
окисление
промежуточных продуктов фотосинтеза с вьщелением СОг ( при этом не имеет
ничего общего с типичным митохондриальным дыханием в
понимании этого слова). В
привычном
процессе фотодыхания первичным продуктом
является гликолевая кислота, и его дальнейшая метаболизация связана с
гликолатным путем. У С4-растений для защиты от фотодыхательных потерь
существует функциональное разделение фотосинтетических процессов между
клетками обкладки и мезофилла. В клетках обкладки достигается уменьшение
содержания Ог, что приводит к снижению оксигеназной активности РУБФкарбоксилазы. Оксидаза L-2-гидроксикислот (гликолат: Ог-оксидоредуктаза,
К Ф 1.1.3.15) ( Г О ) распространена в ш iiiim \л\ WMIIII ф|I[гц'идтугнцрруиу тканей и
pnrti 11[ 1111ТПК фптпг:1ШТГТ1Г1Г(
rSii^j
' ^Ш
СПетер
О»
4
является ключевым ферментом фотодыхания. Она окисляет различные 2гидрокислоты, но более специфична к гликолату. В ГО-реакции электронный
перенос с гликолата связан с флавином ( F M N ) - акцептором, с которого
электроны далее переходят на Ог с образованием пероксида водорода, который
затем
разлагается
каталазой.
Помимо
флавиновой
ГО,
сообщалось
о
присутствии в этиолированных и зеленых листьях пшеницы альтернативной
формы Г О , акцептором электронов для которой служит ферредоксин. Она
локализована в цитозоле и является очень нестабильной. Фермент Г О бьш
выделен преимущественно из широкого ряда Сз-растений и некоторых С4растений. Представители С4- растений обладают высокой биологической
продуктивностью, так как в результате эволюционных адаптации хорошо
приспособлены к современной окружающей среде. Главной отличительной
особенностью
их является отсутствие
или очень
низкая
интенсивность
фотодыхательного метаболизма. Эти отличия у С4 - растений напрямую
связаны с наличием кранц-анатомии листа. Сравнение свойств Г О из растений
с различными типами фотосинтеза (Сз, Сз^, С4) показало, что различные виды
гликолатоксидазы из Сз и Сз^-промежуточных растений похожи, но очень
отличаются от Г О из С4-растений. Из литературных данных известно, что
ключевой фермент фотодыхания гликолатоксидаза у С4 -растений обнаружена
как в клетках обкладки, так и в мезофилле (Popov et al. 2003). В связи с этим
возникает вопрос о функциональной роли мезофильной Г О . В настоящее время
считается, что фотодыхательный метаболизм, локализованный в клетках
обкладки, обеспечивается Сг-кислотой (гликолатом), благодаря оксигеназной
реакции Р У Б И С К О , а гликолатный путь в мезофилле преимущественно
использует
гликолат,
кетокислот с перекисью.
источником
которого
является
взаимодействие
5
Цель и задачи исследований. Целью данной работы было исследование
каталитических
и
регуляторных
особенностей
изоформ
ГО
из
клеток
мезофилла и обкладки С4-растений.
В соответствии с целью, были поставлены следующие задачи:
1. Модернизировать методику разделения различных тканей листа
(паренхимной обкладки и мезофилла) различных видов С4 - растений и
исследовать распределение ключевого фермента гликолатного пути гликолатоксидазы
-
в
них.
Провести
анализ
закономерностей
распространенности гликолатоксидазы у растений с различным типом
метаболизма.
2. Осуществить разделение изоформ гликолатоксидазы с различной
тканевой специфичностью из листьев С4 - растений: кукурузы,
амаранта, сорго, табака.
3. Провести очистку изоформ гликолатоксидазы из различных тканей
листьев кукурузы, амаранта, сорго, табака и сравнить их физикохимические
и
каталитические
электрофоретические
исследования
свойства.
Провести
очищенных
препаратов
вьвделенных изоформ.
4. Исследовать механизмы регуляции различно локализованных форм
Г О из нескольких видов С4-растений.
5. Изучить возможное изменение активности гликолатоксидазы в
листьях
этиолированных
взаимосвязь
изменения
растений
активности
при
зеленении.
изоформ
ГО
Установить
с
динамикой
накопления хлорофилла у исследуемых растений.
Научная новизна работы.
Нами
модернизированы
методы
разделения
клеток
паренхимной
обкладки и мезофилла С4-растений, и разработана схема очистки Г О из
различных тканей Сз-, С4-растений, а также из растений с переходным типом
метаболизма
(С3-С4-ТИПОМ). Впервые
нами
были
ферментные препараты Г О из клеток мезофилла и
параллельно
очищены
клеток паренхимной
6
обкладки амаранта, кукурузы и сорго, а также изучены каталитические
свойства этих изоформ, в сравнении с Г О из клеток обкладки и мезофилла СзС4-типа растения - табака и листьев Сз - растения - пшеницы. Ферментный
препарат Г О из клеток обкладки и мезофилла С4-группы растений получен в
гомогенном состоянии, для этого фермента были определены показатели
молекулярной массы полученных изоформ, а также молекулярные массы и
количество
отдельных
субъединиц
фермента.
Проведена
работа
по
исследованию регуляции активности различных изоформ Г О из Сз, С3-С4, С4 растений:
пшеницы,
метаболитами
табака,
дыхания
и
амаранта,
гликолатного
сорго,
пути.
кукурузы
Выявлены
отдельными
показатели
температурного оптимума для данного фермента из вышеуказанных групп
растений. Определены константы активации для изоформ Г О при воздействии
некоторых метаболитов дыхания и гликолатного пути. Выявлена роль ионов
двухвалентных металлов в регуляции активности Г О из различных типов
клеток.
Практическая значимость исследования.
Научные положения диссертационной работы расширяют и углубляют
современные
представления о механизмах
катаболических
процессов
в
клетках
сопряжения
высших
анаболических
растений,
и
представляют
целостную картину для понимания процессов функционирования комплекса
органелл
клеток
(пероксисом,
митохондрий,
хлоропластов)
в
системе
биохимических механизмов фотосинтеза и фотодыхательного метаболизма.
Мнение о том, что фотодыхание снижает урожайность и продуктивность
сельскохозяйственных культур, наталкивается иа противоречие связанное с
фактом
нежизнеспособности
искусственно
полученных
мутантных
растительных форм дефицитных по ферментам фотодыхательного метаболизма
(Blackwell R. D., 1990; Leegoon R. С. [at al.],1995; Igamberdiev A. U., 2001). В
данной работе показана высокая активность Г О
- ключевого фермента
гликолатного пути — у С4-растений, что подтверждает важность этого процесса
у всех групп высших растений.
7
В результате исследований были получены
гомогенные препараты
изоформ Г О , что дает возможность для аналитического определения гликолата
посредством
применения
полученных
гомогенных
преп^атов
гликолатоксидазы. Гомогенные препараты изоформ Г О , полученные из ряда
растений, могут также найти применение в биохимических исследованиях.
Материалы по результатам работы используются в учебном процессе на биоло­
го-почвенном
факультете
Воронежского
госуниверситета.
Результаты
исследований вошли в курсы лекций по физиологии растений, биохимии,
спецкурсы «Фотосинтез» и «Дыхание растений», кроме того, они находят
применение
при
проведении
практикумов
и
выполнении
курсовых
и
дипломных работ.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены
на международных, всероссийских и региональных конференциях. Они были
представлены на 6^* ,7*^ и 9^* международных Пущинских конференциях
молодых учёных «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2002, 2003, 2005), Vом съезде общества физиологов растений России, международной конференции
«Физиологов растений - основа фитобиотехнологии» (Пенза 2003), годичном
собрании общества физиологов растений России и международной научной
конференции "Проблемы физиологии растений севера" (Петрозоводск 2004),
межрегиональной
конференции
«ИОНИТЫ-2004»
(Воронеж,
межрегиональных конференциях, посвященных памяти А.А.
2004),
Землянухина
«Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов» (Воронеж,
2001,
2002,
2003,
2004,
конференции преподавателей
2005),
ежегодной
научной
секции
отчетной
и сотрудников Воронежского госуниверситета
(2004,2005).
Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы
изложены в 15 публикациях- 10 статьях и 5 тезисах.
Объём и структура работы. Диссертация изложена на
машинописного
текста
и
состоит
из
введения,
обзора
161 странице
литературы,
экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов.
8
списка литературы (257 источников). Иллюстрационный материал включает
43 рисунка, 21 таблицу.
О Б Ъ Е К Т Ы И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В
качестве объекта исследования применяли зеленые листья
18-ти
дневных проростков С^, Сз-С4-растений: амаранта, кукурузы, сорго, табака
(Amarantus retroflecsus L., . Zea mays L., Sorghum sudanense (Piper) Stapf,
Nicotiana rustica. L ) , a также Сз-растения - пшеницы (Triticum vulgare L.).
Растения
выращивали
гидропонным
методом при температуре 20-22°С:
этиолированные - в темноте, зеленые - при 16-часовом освещении дневным
светом интенсивностью 400цмоль квант/м^с.
Разделение клеток обкладки и мезофилла у C j . С^-Сд-растений.
Растительный материал гомогенизировали в среде выделения с помощью
измельчителя тканей при температуре 4°С и центрифугировали при 300g, таким
образом,
получали
гомогенат
клеток
мезофилла.
Оставшийся
в
марле
растительный материал промывали буфером, затем растирали в фарфоровой
ступке с кварцевым песком при температуре 4°С. Жидкую фракцию отделяли,
фильтруя через несколько слоев марли, и центрифугировали при 5000g в
течение 10 мин., получая гомогенат клеток обкладки. О степени перекрестного
загрязнения между клетками мезофилла и паренхимньши клетками обкладки
судили по активности маркерных ферментов, которые локализованы в каком
либо из вышеуказанных типов клеток. В связи с тем, что ФЕП-карбоксилаза
локализована
исключительно
в
клетках
мезофилла,
данный
фермент
использовали для определения загрязнения клеток обкладки мезофиллом.
Маркерным
ферментом
клеток
глицеральдегидфосфатдегидрогеназа.
обкладки
В
связи
является
с
этим
НАДФ-зависимая
данный
фермент
использовали для определения загрязнения мезофилла клетками обкладки
(Kleczkowski L.A., 1989).
Определение ферментативной активности. Активность ферментных
препаратов
определяли
спектрофотометрически.
При
этом
реакцию,
катализируемую Г О инициировали внесением ферментного препарата. Об
активности фермента судили по увеличению поглощения при 324 нм, что
9
обусловливалось образованием комплекса глиоксилата с фенилгидразином.
Определение ферментативной активности ФЕП-карбоксилазы
производили
следующим образом: реакцию инициировали внесением Н А Д Н , об активности
судили по уменьшению оптической плотности при 340 нм, обусловленному
утилизацией
НАДН.
Об
активности
НАДФ-зависимой
глицеральдегидфосфатдегидрогеназы судили по увеличению поглощения при
340 нм, обусловленному образованием Н А Д Ф Н .
Очистка гликолатоксидазы. Г О очищали при 0-4° С в несколько этапов,
по следующей разработанной нами схеме: получение тканевого экстракта, гельфильтрация
через
использованием
сефадекс
G-25,
ДЭАЭ-фрактогеля
ионообменная
(элюировали
хроматофафия
фермент
с
линейным
градиентом K C I концентрацией от О до ЗООмМ), гель-хроматография на
сефадексеО- 150.
Изучение
кинетических
и
регуляторных
свойств
фермента.
Регуляторные и кинетические свойства ферментного препарата изучали на
гомогенных или высокоочищенных препаратах. Константы Михаэлиса-Ментен
определяли с использованием линейной аппроксимации по методу Хейнса в
координатах S/V от S.
Аналитический
проводили
по
электрофорез.
модифицированной
Электрофорез
методике
Девиса
нативного
(Davis,
фермента
1964). Для
специфического проявления гликолатоксидазы применяли модифицированный
реагент Шиффа (Reeves, 1972). Для
универсального окрашивания белков
использовали метод проявления нитратом серебра (Shevchenko et al., 1996).
Статистическая обработка данных. Опыты проводили в 5 - кратной
биологической повторности, аналитическое определение для каждой пробы - в
трех повторностях. Для определения достоверности результатов применяли
метод вариационной статистики. В таблицах и на рисунках приведены данные
типичных опытов, где каждое значение есть среднее арифметическое. Для
построения графиков применяли программы линейной и параболической
аппроксимации. При математической обработке использовали статистический
критерий Стьюдента (Лакин, 1990; Чернышов, 1998).
10
В Ы Д Е Л Е Н И Е И О Ч И С Т К А И З О Ф О Р М Г Л И К О Л А Т О К С И Д А З Ы ИЗ
К Л Е Т О К О Б К Л А Д К И И М Е З О Ф И Л Л А Л И С Т Ь Е В С4-РАСТЕНИЙ
В результате проведенных нами исследований установлено, что большая
часть активности Г О локализована в клетках обкладки (79 - 9 4 % в зависимости
от вида растений). Это обусловлено её физиолого-биохимической ролью в этих
тканях, а именно интенсивным фотодыханием в данном типе клеток.
Применение 5 - стадийной очистки, включающей получение гомогената,
фракционирование
сульфатом
аммония,
гель-фильтрацию
на
G-25,
ионообменную хроматографию на Д Э А Э фрактогеле, гель-фильтрацию на G150, позволило вьщелить и получить в высокоочищенном или гомогенном
состоянии
изоформы
ГО
из
различных
тканей
С4-растений.
Типичные
результаты очистки фермента из исследуемых растений приведены в таблице 1.
Таблица 1.
Результаты очистки фермента из исследуемых растений
Вид растения
Удельная
Выход, %
активность,
Степень
очистки
Е/мг.б.
Атагш1Ш8
клетки
1,33
6,30
49,25
retroflecsus L.
обкладки
мезофилл
0,55
9,20
100,00
клетки
7,60
2,20
86,35
мезофилл
0,73
7,30
130,40
Sorghum
клетки
2,06
3,60
40,39
sudanense (Piper)
обкладки
Stapf
мезофилл
0,84
6,00
48,00
Nicotiana rustica. L
клетки
1,76
6,87
40,11
0,44
11,25
47,31
Zea mays L.
обкладки
обкладки
мезофилл
n
Очистке изоформ Г О предшествовало разделение клеток мезофилла и
обкладки из Ct ~ растений, при этом перекрестное загрязнение тканей было
небольшим и колебалось в зависимости от вида растения от 11 до 16,4 %
(Таблица 2).
Таблица 2.
Распределение маркерных ферментов между клетками мезофилла и обкладки
С4-растений
Фракции
Мезофилл
амарант
Обкладка
ам^ант
Мезофилл
кукуруза
Обкладка
кукуруза
Мезофилл
сорго
Обкладка
сорго
Мезофилл
табак
Обкладка
табак
ФЕП-карбоксилаза
НАДФ-зав11симая
глицералу цегидфосфатдегид рогеназа
Активность,
%
Е/г.см.
Активность,
Е/г.с.м.
%
4,72±0,28
.83,9
0,017±0,006
11,97
0,91±0,06
16,1
0,125±0,005
88,03
4,77±0,28
85,0
0,02±0,007
11,77
0,84±0,06
15,0
0,15±0,007
88,23
5,01±0,31
89,0
0,014±0,005
10,90
0,62±0,05
11,0
0,115±0,006
89,10
4,85±0,22
83,6
0,022±0,007
12,03
0,95±0,07
16,4
0,161±0,007
87,97
Нами получены различно локализованные изоформы фермента. Первая
изоформа ( r O i ) локализована в клетках обкладки. Третья изоформа (ГОз) имела
исключительно мезофильную локализацию. Вторая же изоформа (ГОг) была
обнаружена в обеих тканях. Значения удельной активности очищенных
препаратов
изоформ
ГО
колебались
незначительно.
Величина
этой
характеристики для изоформы из обкладки составляла от 1,33 до 2,06
(исключение обнаружено для клеток обкладки кукурузы, в которых удельная
активность составляла 7,6 Е/мг.б.), Удельная активность для мезофильной Г О
12
(от 0,44 до 0,84 Е/мг.б.)- Выход очищенного фермента колебался от 2,2% до
1 1 % , в зависимости от вида и тканей организмов. Большинство полученных
препаратов Г О являлись электрофоретически гомогенными, за исключением
фермента из листьев Nicotiana rustica. L. Все исследуемые изоформы Г О имели
близкие значения относительной электрофоретической подвижности (Rf).
Результаты исследований молекулярной массы гель-хроматографией и
субъединичного
строения
с
помощью
электрофореза
в
присутствии
додецилсульфата натрия приведены в таблице 3.
Таблица 3.
Физико-химические и кинетические свойства гликолатоксидазы различных
растений
Вид растения
рН
Rf
Молекуля
Субъединичное
рная
строение
масса
количество
субъедин
фермента,
субъединиц
ицы,кД
кД
Amarantus
клетки
7,3
0,31
160
4 (тетрамер)
37 и 44
retroflecsus L.
обкладки
мезофилл
7,5
0,28
158
4 (тетрамер)
37 и 44
клетки
7,3
0,30
308
8 (октамер)
37 и 44
мезофилл
7,5
0,29
310
8 (октамер)
37 и 44
Sorghum
клетки
7,3
0,32
156
4 (тетрамер)
37 и 44
sudanense
обкладки
(Piper) Stapf
мезофилл
7,5
0,27
160
4 (тетрамер)
37 и 44
Nicotiana
клетки
7,3
0,31
170
4 (тетрамер)
37 и 44
rustica. L
обкладки
7,5
0,28
164
4 (тетрамер)
37 и 44
Zea mays L.
обкладки
мезофилл
13
Значения молекулярной массы нативной Г О колеблются в значительных
пределах в зависимости от исследуемого вида. Максимальная величина этой
характеристики получена для фермента из листьев кукурузы. Так молекулярная
масса Г О из клеток обкладки этого растения составляет 308 кДа, а из
мезофилла 310 кДа. Величина Mr Г О из других объектов была примерно в 2
раза меньше. Сравнительный анализ субъединичного строения исследуемого
фермента указывает на отличия в четвертичной структуре Г О , вьзделенной из
кукурузы. Г О из клеток обкладки и мезофилла листьев кукурузы представляет
собой октамер, состоящий из двух типов субъединиц, при этом изоформы Г О
из других исследуемых d
- растений, представляют собой тетрамеры,
состоящие также из малых и больших субъединиц. Общими для всех тканей и
видов растений являются значения Mr малой 37 кД и большой 44 кД
субъединицы
изучаемого
исследований
изучались
фермента.
как
С
помощью
гомогенность
электрофоретических
полученных
ферментных
препаратов, так и их субъединичное строение и специфическое проявление. В
результате электрофореза в 9 % П А А Г с помощью универсального красителя
AgNOj проявлялась одна белковая полоса, из чего следовало заключение о
гомогенности полученного ферментного препарата. По результатам Э Ф
исследований специфического окрашивания с помощью модифицированного
реагента Шиффа было установлено, что проявляется одна белковая полоса при
специальном окрашивании с предварительной инкубацией белка с субстратом
(гликолатом), причем локализацию полосы с максимальной активностью
совпадала с максимальной концентрацией белка. В результате доказывается
наличие именно Г О в гомогенном препарате белка из клеток обкладки и
мезофилла исследуемых С4-растений. На рисунке 1 и 2 в качестве примера
представлены электрофореграммы ГО, выделенной из клеток обкладки и
мезофилла листьев сорго.
М
О
М
I
О
II
Рис. 1 Электрофореграммы гликолатоксидазы, очищенной из клеток обкладки
и мезофилла листьев сорго:
I - окрашивание нитратом серебра; I I - специфическое проявление;
М - клетки мезофилла; О - клетки обкладки; Р - белковая полоса: F - фронт
красителя бромфенолового синего
»
2
■\
►■
*•
►
4
Рис. 2. Определение молекулярной массы субъединиц Г О методом Na-Ds
электрофореза из обкладки и мезофилла сорго
1 — целлюлаза (94,6 кДа);
2 - бычий сывороточный альбумин (66,2 кДа);
3 - яичный альбумин (45 кДа);
4 - кфбоангидфаза (31 кДа);
5 - ингибитор трипсина (21,5 кДа);
6 - лизоцим (14,4 кДа);
7 - большая субъединица Г О ;
8 - малая субъединица ГО.
Показано, что Г О из клеток обкладки проводящих пучков С4-растений
имеет более низкие значения рН оптимума (7,2 - 7,3) по сравнению с рН
оптимумом из мезофилла исследуемых С4-растений (7,5), Но вместе с тем,
значения рН оптимума С4-растений ниже в сравнении с таковыми показателями
для Г О из Сз-растений (7,8). Установлено также, что Г О из клеток мезофилла
исследованных Сд-растений имеет большее сродство к гликолату. Значение Km
для
ГО
из
клеток
мезофилла
амаранта,
сорго,
кукурузы
составило
соответственно 20 мкМ, 22мкМ, 23 MKJVI, а для Г О из паренхимной обкладки 58 мкМ, бЗмкМ, 65 мкМ. Для Сз-растений этот показатель обычно выше. Так
по нашим данным K m для Tritikum vulgare L., равно 210мкМ.
В
нашей работе также показано влияние метаболитов дыхания на
активность гликолагоксидазы из С^-растительных объектов.
Так, например,
малые
конкурентными
концентации
(до
1 мМ)
изоцитрата являются
активаторами гликолатоксидазы для С4-растений (Рис 3).
Е/мг 6.
Е/мг.б.,
1
1.5
[изоцитрат], мМ
1
15
[изоцупрат],мМ
Рис.3. (А) Влияние изоцитрата на активность Г О из клеток обкладки
амаранта, (Б) Влияние изоцитрата на активность Г О из мезофилла амаранта
16
Это может обеспечивать координацию фотодыхательного метаболизма с
процессами дыхания и биосинтетическими реакциями. В работах (Bergman А.,
1983), было показано, что глицин, образующийся в результате процессов
фотодыхания, может монополизировать работу электрон-транспортной цепи
митохондрий, а поэтому накапливающийся в этом процессе Сукцинат может
снижать интенсивность образования глиоксилата и, соответственно, глицина,
тем самым блокируя работу гликолатоксидазы. Известен также факт, что за
счет внеглиоксисомальной формы изоцитратлиазы в равновесном состоянии
поддерживаются количественные составляющие сукцината и
глиоксилата
(Игамбердиев А.У., 1990). Этот фермент трансформирует вышеуказанные
соединения в изоцитрат.
Было установлено активирующее влияние ионов двухвалентных металлов
на
различные
изоформы
гликолатоксидазы.
Са^*,
конкурентными активаторами для всех изоформ Г О
Мп^*
являются
исследованных С,-
растений. Константы активации составили значения от 2,44 мМ до 18,52 мМ.
Выявлено, что Mg^* является бесконкурентным активатором всех изоформ Г О
изучаемых С4-растений (Рис 4).
Таблица 4.
Константы активации Г О из обкладки и мезофилла при влиянии различных
ионов двухвалентных металлов.
Кд ГО/обкладки
К А ГО/мезофилла
Сорго /Са^*
6,90±0,16
18,52*0,11
Сорго /Мп"''"
5,00±О,08
2,44±0,06
Амарант /Са^*
3,3±0,06
5,7±0,11
Амарант /Мп^*
8,3±0,17
4,1±0,06
Кукуруза /Са^*
2,5±0,05
4,3±0,08
Кукуруза /Мп^"^
2,1±0,02
2,3±0,04
Объект /Ионы,
мМ
Установлены величины температурного оптимума для изоформ фермента
исследуемых видов С4-растений. Так для сорго и кукурузы эти показатели
17
равны 45 °С, для амаранта же эти значения несколько ниже и составляют
величину порядка 40°С.
Рис.4 Влияние ионов Mg^* на Г О из клеток обкладки (А), и из клеток
мезофилла (Б).
—♦—атвноаьГО
вкп обкладке
Е 0,016-1
0,014
H i 'аешвнооьГО
вка
мвэофкла
/
0,012
0,01
0,00в'
V-V-B—■
0,006
0,004
0,002
0-
5
6
7
10
12
супи
Рис. 5. Накопление хлорофилла в листьях в процессе зеленения
этиолированных проростков сорго (А), Изменение активности Г О в процессе
зеленения этиолированных проростков сорго (Б).
Определена
зависимость,
показывающая
увеличение
активности
различных изоформ гликолатокеидазы совместно с синтезом хлорофилла в
процессе зеленения С4-растений. Установлено, что на 6-7 сутки зеленения
проростков С4-растений практически замедляется рост активности Г О в клетках
18
мезофилла, но увеличивается активность в клетках обкладки в исследуемых
видах растений (Рис.5).
Это может быть связано с различной ролью изоформ ГО. В клетках
паренхимной
обкладки
этот
фермент
утилизирует
фотодыхатеяьный
гликолат и поэто(лу формирование фотосинтетического аппарата в этих
клетках требует увеличения активности Г О .
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Несмотря на универсальность фотосинтетических процессов для всех
растительных организмов, существует деление высших растений на qjynnbi,
исходя из типа их метаболизма (Сз, С4, С3-С4, С А М - метаболизм). Так для С4фотосинтеза, процесса присущего только растениям, в фотосинтезирующих
частях которых присутствуют клетки паренхимной обкладки проводящих
пучков и клетки мезофилла, первичным продуктом фотосинтеза является С4дикарбоновая кислота - оксалоацетат, трансформирующаяся затем в аспартат
или малат (процесс идет в клетках мезофилла). Посредством этих органических
кислот происходит транспорт углерода в клетки обкладки проводящих пучков,
где высвободившийся углерод вступает в цикл Кальвина. Для исследованных
представителей С4-группы растений отмечено, что в проростках этих объектов
отмечается Сз-тип фотосинтеза,
но на более поздних этапах
растение
приобретает ярко выраженную кранц-анатомию листа, и, как следствие,
переходит к С4-процессу фотосинтеза. Для растений же Сз-группы основным
источником
гликолата
является, так
называемая,
оксигеназная
реакция
рибулозобисфосфат карбоксилазы (Рубиско). В гликолатном пути происходит
трансформация
гликолата,
последовательно
идущих
протекающая
реакций
в
посредством
хлоропластах,
нескольких
митохондриях
и
пероксисомах; в результате чего происходит образование фосфоглицериновой
кислоты.
в проведенном исследовании нами обнаружено, что гликолатоксидаза,
являющаяся ключевым ферментом гликолатного пути, встречается как в
клетках обкладки проводящих пучков, так и в клетках мезофилла у всех
19
исследованных видов С4-растений. Полученные в гомогенном состоянии
препараты различно локализованных изоформ для всех трех исследованных
видов С4-растений, что позволило изучить свойства отдельных изоформ
гликолатоксидазы и выявить их отличительные особенности в кинетических,
физико-химических и регуляторных свойствах.
Показано, что Г О из клеток обкладки проводящих пучков С4-растений
имеет более низкие значения рН оптимума (7,2 - 7,3), по сравнению с рН
оптимумом из мезофилла исследуемых Сц-растений (7,5). Но вместе с тем,
значения
рН
оптимума
С4-растений
ниже,
в
сравнении
с
таковыми
показателями для Г О из Сз-растений (7,8).
В нашей работе выявлено влияние различных метаболитов на активность
гликолатоксидазы из С4-растительных объектов. Так малые концентации (до 1
мМ)
сукцината
и
изоцитрата
являются
конкурентными
активаторами
гликолатоксидазы для С4-растений. Это может быть связано с необходимостью
координации
фотодыхательного
биосинтетическими
реакциями.
метаболизма
Например
с
процессами дыхания
наличие
и
внеглиоксисомальной
формы изоцитратлиазы позволяет поддерживать в равновесном состоянии
определенное количество сукданата и глиоксилата в тканях (Игамбердиев А.У.,
1990). Этот фермент трансформирует вышеуказанные соединения в изоцитрат.
Показано активирующее влияние ионов двухвалентных металлов на
различные изоформы гликолатоксидазы. Са^*, Мп^* являются конкурентными
активаторами для всех изоформ Г О исследованных С4-растений. Константы
активации составили значения от 2,44 м М до 18,52 мМ. Выявлено, что Mg^*
является бесконкурентным активатором всех изоформ Г О изучаемых С4растений.
Нами были установлены величины температурного
оптимума для
изоформ фермента исследуемых видов С4-растений. Так для изоформ ГО,
выделенных из листьев сорго и кукурузы, эти показатели равны 45°С, для
изоформы Г О из амаранта эти значения несколько ниже и составляют величину
порядка 40°С.
20
Определена
зависимость,
показывающая
увеличение
активности
различных изоформ гликолатоксидазы, совместно с синтезом хлорофилла в
процессе зеленения С4-растений. Установлено, что на 6-7 сутки зеленения
проростков
С^-растений практически замедляется
рост
активности
всех
изоформ Г О в исследуемых видах растений.
Исходя из полученных данных, нами представлена возможная схема
регуляции активности Г О у С4-растений (Рис. 6).
переаминирование
фотодыхание
+ СВЕТ,
Ciurres хлорофилла
Mg^*,Mn^CaJl
гликолат
гликолатоксидаза
HjO
сукцинат
изоцитрат
глицин
Формиат + COj
Рис. 6, Схема регуляции активности Г О у С4-растений
_+
^ - усиление активности Г О
21
ВЫВОДЫ
1. Изучено распределение Г О между клетками мезофилла и пг^енхимой
обкладки в листьях сорго, амаранта, кукурузы. Показано, что большая часть
Г О локализована в клетках обкладки всех исследованных С4-растений (74,4
- 94 % от общей активности в зависимости от вида растения).
2. Получены гомогенные препараты Г О из клеток обкладки и мезофилла
листьев кукурузы, амаранта, сорго. Удельная активность дня фермента из
клеток
мезофила
электрофоретических
гомогенных
ниже
в
исследований
препаратов
специфическое
чем
клетках
свидетельствуют
исследуемого
проявление
обкладки.
фермента,
доказывает,
что
а
о
Результаты
получении
положительное
исследуемым
ферментом
является Г О .
3. Изучено влияние концентрации ионов водорода на активность ГО из клеток
мезофилла и обкладки различных С4-видов растений. Для Г О из клеток
обкладки из всех видов рН оптимум составил 7,3; для фермента из клеток мезофилла 7,5, что соответствует рН среды в клетках С4-растений in vivo.
4. Показано, что Г О из клеток мезофилла исследованных С4-растений имеет
большее сродство к гликолату. Значение K m для Г О из клеток мезофилла
амаранта, сорго, кукурузы составило соответственно 20 мкМ, 22мкМ, 23
мкМ, а для Г О из обкладки -58 мкМ, бЗмкМ, 65 мкМ.
5. Для трех
видов С4-растений определены субъединичное строение и
молекулярная масса фермента. В сорго и амаранте фермент находится в
тетрамерной форме. Изоформы Г О , полученные из кукурузы, являются
октомерами. Показано, что Г О из клеток мезофилла и обкладки листьев всех
исследованных
С4-растений
состоит
из
двух
типов
субьединиц
с
молекулярной массой 44 и 37 кДа.
6. Показана возможность участия метаболитов дыхания и гликолатного пути в
регуляции активности ГО. Изоцитрат активировал работу фермента по
конкурентному типу из клеток мезофилла и обкладки. Сукцинат и глицин
увеличивали активность ГО из клеток обкладки, также по конкурентному
22
типу, но оказывали
ингибирующее
влияние
на фермент
из
клеток
мезофилла.
7 Определены константы активации для некоторых метаболитов и ионов
двухвалентных
металлов
гликолатоксидазы
в
у
различно
С4-растениях,
локализованных
осуществляющих
изоформ
активацию
по
конкурентному типу (Са**, Мп^*). Показано, что ионы Mg^* осуществляют
активацию по бесконкурентному типу.
8. Увеличение активности изоформы гликолатоксидазы из клеток мезофилла
кореллирует с синтезом хлорофилла в процессе зеленения С4-растений, что
подтверждает
взаимосвязь
этого
изоферментов
с
фотодыхательным
метаболизмом.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАНЫХ РАБОТ
1.
Дмитриева Е.А.. Распределение активности гликолатоксидазы между
клетками обкладки и мезофилла в кукурузе / Е.А.Дмитриева,
А.Н.
Ивентьев // Биология наука X X I века : 6-я Пущинская школа-конференция
молодых ученых : сб. тез. - Тула, 2002. - Т. 3 - С. 201-202.
2.
Ивентьев А.Н. Выделение и характеристика гликолатоксидазы из клеток
обкладки и мезофилла листьев кукурузы / А.Н. Ивентьев, В.Н. Попов //
Организация
и
регуляция
физиолого-биохимических
процессов
межрегион, сб. науч. работ, посвященный памяти А.А. Землянухина. Воронеж, 2002. - Вып. 4. - С. 59-62.
3.
Ивентьев А.Н. Изучение распределения и свойств гликолатоксидазы в
клетках обкладки и мезофилла кукурузы / А.Н. Ивентьев, В.Н Попов //
Биология наука X X I века : 7-ая Пущинская школа-конференция молодых
ученых (Пущине, 14-18 апреля 2003г.): сб. тез. - Тула, 2003. - С. 334.
4.
Электрофоретические характеристики изоформ гликолатоксидазы из
разных тканей кукурузы / А.Н. Ивентьев [и др.] // Организация и регуляция
физиолого-биохимических процессов : межрегион, сб. науч. работ. Воронеж, 2003. - Вып. 5. - С. 69-73.
23
5
Епринцев А.Т. Обнаружение изоформ гликолатоксидазы в мезофилле и
обкладке листьев кукурузы Zea mays L. / А.Т. Епринцев, А.Н. Ивентьев,
В.Н. Попов // V съезд общества физиологов растений России, международ,
конф. «Физиологов растений - основа фитобиотехнологии», Пенза, 15-21
сент. 2003 г.: тез. докл.. - Пенза, 2003. - С. 42-43.
6.
Ионообменная
хроматография
как
важнейший
этап
очистки
гликолатоксидазы из кукурузы / А.Н. Ивентьев [и др.] // Сорбционные и
хроматографические процессы. - Воронеж, 2004. - Т.4, вып. 1. - С. 65 - 69.
7.
Физико-химические и регуляторные характеристики гликолатоксидазы из
обкладки и мезофилла амаранта (Araarantus retroflecsus L.). / А.Н. Ивентьев
[и др.] // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов :
межрегион, сб. науч. работ. - Воронеж, 2004. - Вып. 6. - С. 74-78.
8.
Особенности основных характеристик гликолатоксидазы из разных
тканей С4 - растений / А.Н. Ивентьев [и др.] // Годичное собрание
общества
физиологов
растений
России
и
Международная
научная
конференция "Проблемы физиологии растений севера", Петрозаводск, 15 18 июня 2004 г.: тез. докл. - Петрозаводск, 2004. - С. 74.
9.
Применение
ионообменной
хроматографии
для
очистки
гликолатоксидазы из листьев С4-растений. / А.Н. Ивентьев [и др.]
//
Сорбционные и хроматографические процессы : спец. вып. ИОНИТЫ2004. - Воронеж, 2004. - Т.4. - С. 284-287.
10.
Очистка и физико-химические свойства гликолатоксидазы из Sorghum
sudanense
(Piper.)./
А.Н.
Ивентьев
[и
др.]
//
Сорбционные
и
хроматографические процессы. - Воронеж, 2005. - Т.5, вып.2. - С. 242-247.
11.
Ивентьев А.Н. Ионообменная хроматография как основной этап в
процессе очистки гликолатоксидазы из листьев табака (Nicotiana rustica. L ) .
/
А.Н.
Ивентьев,
А.Т.
Епринцев, В.Н.
Попов
// Сорбционные
и
хроматографические процессы. - Воронеж, 2005. - Т.5, вып.З. - С. 361 363.
12.
Ивентьев А.Н. Роль изоформ гликолатоксидазы в различных тканях САрастений / А.Н. Ивентьев, А.Б. Пузырев, Е.В. Маслова // Биология наука
2006-4
US 1 8 9 8 ff 20475
24
X X I века : 9-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино,
18-22 апреля 2005г.): сб. тез. - Тула, 2005. - С. 78.
13.
Епринцев А.Т. Распределение и свойства изоформ гликолатоксидазы из
клеток обкладки и мезофилла листьев амаранта (Amarantus retroflecsus L.) /
А.Т. Епринцев, А.Н. Ивентьев, В.Н. Попов // Физиология растений. 2005. Т. 52, № 4. - С. 622-627.
14.
Физико-химические и регуляторные характеристики гликолатоксвдазы из
обкладки и мезофилла С4-растений / А.Н. Ивентьев [и др.] // Организация и
регуляция физиолого-биохимических процессов : межрегион, сб. науч.
работ. - Воронеж, 2005. - вьш. 7. - С. 84-89.
15.
Физико-химические
и свойства
изоформ
гликолатоксидазы
из СА-
растений / А.Н. Ивентьев [и др.] // Вестник В Г У . Серия : Химия. Биология.
Фармация. - Воронеж : В Г У , 2005. - № 1 . _ С. 113-115.
Заказ №744 от 6 10 2005г ТиражЮО экз Лаборатория оперативной полиграфии В Г У
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
846 Кб
Теги
bd000101429
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа