close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

bd000101497

код для вставкиСкачать
МОСКОВСдаШ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
им. М.В. Ломоносова
..:л
Биологический факультет
На правах рукописи
К О Ц Ю Р Б Е Н К О Олег Ролландович
М Е Т А Н О Г Е Н Н Ы Е М И К Р О Б Н Ы Е С О О Б Щ Е С Т В А ИЗ Х О Л О Д Н Ы Х
НАЗЕМНЫХ ЭКОСИСТЕМ
Специальность 03.00.07 - микробиология
Диссертация
на соискание ученой степени
доктора биологических наук
в форме научного доклада
0Б9{'^
БЕС1и>Ли-:',А А
ЭКЗЕМПЛЯР
МОСКВА-2005
Работа выполнена в Институте микробиолонш им. С.Н. Виноградского РАН.
Научные консультанты:
Академик РАН, профессор
Г.А. Заварзин (микробиология)
Доктор биологических наук
А.Н. Ножевникова (биотехнология)
Официальные опноненты:
Доктор химических наук, профессор
С.Д. Варфоломеев
Доктор биологических наук, профессор
Н.Б. Градова
Доктор биологических наук
П.А. Кожевня
Ведзтяя организация - Р1нститут биохимиии и физиологии микроорганизмов им.
Г.К. Скрябина Р А Н
Защита состоится «
совета Д
»
ноября
2005 г. в 15 ч. на заседании диссертационного
501.001.21 при Московском
государственном )тшверситете
им.
М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Россия, Москва, Ленинские горы, дом 1, кор.12,
биологический факультет, аудитория 557.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского госуд^зственного
университега им. М.В.Ломоносова
Автореферат разослан
октября 2005
Ученый секретфь диссертационного совета,
кандидат биологических наук
-ЛС^^^УО
Н.Ф.Пискункова
Актуальность проблемы
Необходимость изучения механизмов биогенного образования метана
обусловлена его ролью как парникового газа, ежегодный прирост содержания
которого в атмосфере составляет 1 % (Intergovernmental Panel on Climate Change,
1990, 2001). Рамочная
ратифицированная
конвенция ООН
Россией,
обязывает
об
изменении
каждую
страну
климата (1992),
создать
баланс
источников и стоков парниковых газов. Такая задача была поставлена в начале
1990-х годов (Круговорот углерода на территории России, 1999) в Госпрограмме
Р Ф под руководством акад. Н.П.Лаверова, в рамках которой была начата
настоящая
работа.
Северные
увлажненные
наземные
экосистемы,
представленные болотами и заболоченными почвами тундры и бореальной зоны
являются одними из основных природных источников метана. Особая роль
таких экосистем в отношении цикла метана была указана для России, на
территории
которой
климатические
находятся
условия
наиболее
обширные
характеризуются
массивы
низкими
болот,
а
среднегодовыми
температурами (Круговорот углерода на территории России, 1999; Парниковые
газы и современный климат Земли, 2004). Основными источниками метана
антропогенного происхождения считаются рисовники и жвачные животные.
Если биогеохимические оценки глобальных потоков C R , можно полагать
установившимися, то механизмы биогенного цикла метана для холодного
влажного климата в противоположность мезофильным процессам оставались
неизвестными. Между тем, управление процессом предполагает знание его
механизма,
в
данном
случае
микробиологии
метаногенеза,
почти
неисследованной к началу работы для микробных сообществ, развивающихся
при низкой температуре.
Повышенный
метаногенного
значимостью
интерес
мшфобного
анаэробных
к
изучению
сообщества
биологических
деятельности
обьясняется
способов
психроактивного
также
очистки
большой
различных
органических отходов, связанных с агропромышленной деятельностью человека
и отрицательно влияющих на экологическую обстановку в природе. Их
эффективная обработка является одной из важнейших проблем современной
цивилизации. В настоящее время перспективные биогехнологические методы
анаэробной переработки антропогенных отходов направлены не только на
,
1 РОС. П'.ЦИОНАЛЬНАЯ 1
БИБЛИОТЕКА
!
• ^J^^IL
решение проблемы сохранения экологического равновесия, но также на
снижение
энергетических
затрат
на
подогрев
биогазовых
установок,
рассчитываемых обычно на условия умеренных и высоких температур, от 20° до
55°С. Для стран с умеренным климатом, к числу которых относнгся Россия,
решение вышеупомянутых задач связано с проведением процесса метанового
сбраживания органических отходов при температуре окружающей среды в
условиях жизнедеятельности психроактивных микроорганизмов.
Метаногенез
представляет
собой
многоступенчатый
процесс,
осуществляемый кооперативным микробным сообществом с определенной
трофической структурой (Заварзин, 1986). При сбалансированной работе всех
его звеньев метан является конечным продуктом. Однако, при различной
реакции функциональных микробных групп на изменения во внешних условиях
(температура, рН и т.д.) возможны изменения в трофической структуре
сообщества, а следовательно в направлении его работы. Поэтому знание
физиологии чистых культур микроорганизмов, входящих в состав сообщества,
оказывается
необходимым,
но
недостаточным
условием
для
понимания
процесса. При прогнозировании поведения низкотемпературного метаногенного
сообщества необходимо понять особенности его регуляции как биологической
системы. Системное изучение микробных сообществ началось только недавно
(Заварзин, 2004), и следовательно результаты настоящей работы имеют как
практическое,
так
очевидное
фундаментальное
значение.
Основной
особенностью низкотемпературных процессов является их малая скорость,
требующая очень длительного времени экспериментов, что препятствует их
повторению и увеличивает ценность полученных результатов.
Состояние вопроса
Существует
достаточно
много
да1шых
по
микробиологическому
образованию метана при низкой температуре. Метаногенез происходит как в
различных холодных природных экосистемах (Aselmann and Crutzen, 1989;
Panikov, 1999; Whalen and КееЬш-§11, 2000), так и в искусственно созданных
резервуарах
-
биореакторах,
при
обработке
промышленных
и
сельскохозяйственных отходов в анаэробных условиях (Ножевникова и др.,
1986, 1988; Zeeman et al., 1988; Lettinga et al., 2001). Образование метана
зафиксировано также в мерзлотных почвах при отрицательных температурах
(Ривкина и др., 1992; 1998). В го же время имеющиеся данные являются
результатом, главным образом, биогеохимических исследований скоростей
метаногенеза и влияния различных факторов на эмиссию СН4 в различных
экосистемах.
Решение
проблемы
биологического
образования
метана
в
низко хемпературных экосистемах включает в себя изучение микробного состава
низкотемпературного метаногенного сообщества, его ключевых микробных
групп, а также исследование их взаимодействия на уровне сообщества как
биологической системы. Последнее утверждение обусловлено наличием тесных
трофических взаимодействий в анаэробном сообществе, вне которого отдельные
микроорганизмы не могут существовать (Заварзин, 1986).
Работа сообщества метанокисляющих бактерий и других микроорганизмов,
перехватывающих С Щ и ряд других соединений, поступающих из анаэробной
зоны была хорошо изучена за последнее десятилетие (Омельченко и др., 1992;
Dedysh et al., 1998а). Психрофильные метанотрофные бактерии из почвы тундры
(Omelchenko et al., 1993) и кислых таежных болот (Dedysh et al., 1998b; Dedysh et
al., 2002) были выделены и описашл как представители новых родов или видов.
До
последнего
времени
мало
данных
существовало
об
анаэробных
микроорганизмах и, в частности, о метанобразующих археях, способньгх расти
при низкой температуре.
В
настоящее время известно большое количество психрофильных
и
психроактивных микроорганизмов, но лишь небольшая часть из выделенных
культур представлена облигатными анаэробами (Goimot, 1999 The Prokaryotes,
3rd Ed., Electronic, 1999-2005). Анаэробные организмы в связи с трудностью
работы с ними до недавнего времени были исследованы недостаточно.
Сообщения
о
выделении психроактивных
гомоацетатной
бактерии рода
Acetobacterium (Бак, 1988) и метаносарцины (Жилина и Заварзин, 1991) были
единственной информацией о терминальных микроорганизмах анаэробного
сообщества холодных наземных экосистем до начала настоящего исследования.
Накопление знаний о физиологических свойствах отдельных организмов,
входящих в трофическую структуру анаэробного психроактивного микробного
сообщества
необходимо
для
низкотемпературных условиях.
понимания
их
функциональной
роли
в
Сравнительно
недавно
низкотемпературного
обратили
внимание
метаногенного
сельскохозяйственных
и
животноводческих
на
изучение
процесса
сбраживания
различных
отходов, как
альтернативной
энергосберегающей технологии, (Wellinger and Kaufmann, 1982; Zeeman et.al.,
1988; Паршина и др., 1993). Подавляющее большинство биотехнологических
исследований проводилось с мезофильными и термофильными мстаногенными
ассоциациями, способными к быстрому сбраживанию субстрата. Основной
особенностью низкотемпературного метаногенного сбраживания является очень
долгий период адаптации, в течение которого устанавливается необходимый
баланс между микроорганизмами (Zeeman et.al, 1988; Ilaande! and Lettinga,
1994). Активные исследования в этом направлении проводились в нескольких
европейсюгх лабораториях и, в первую очередь, в Голландии (Леттинга) и
Финляндии
(Ринтала)
с
акцентом
на биотехнологические
параметры
и
показатели эффективности процесса (Lettinga et.al., 1999; Kaparaju and Rintala,
2003).
Трофическая
структура
сообщества,
деградирующего
сложные
органические соединения, изучалась поверхностно.
Таким
образом,
анализ
литературы
показывает,
что
изучения
метаногенного сообщества с применением вышеописанного системного подхода
к
началу
настоящей
низкотемпературном
работы
не
метаногенезе
проводилось.
содержали
Имевшиеся
скудную
данные
информацию
о
об
основных микробных агентах, осуществляющих деградашпо органического
вещества в холодных наземных экосистемах с образованием СН4. Однако,
параллельно с настоящим исследованием в Институте Макса Планка (Германия,
Марбург) (МПИ) также началось юучение трофических взаимодействий в
психроактивном метаногенном сообществе. В дальнейшем эта работа проходила
в тесном сотрудничестве Института Микробиологии (ИНМИ) и М П И .
Цели и задачи исследования.
Целью
настоящего
исследования
было
изучение
метаногенного
микробного сообщества из холодных наземных экосистем как биологической
системы, выявление и изучение основных регулирующих взаимодействий,
идентификация ключевых микроорганизмов.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1.
Провести
сравнительное
функционирования
метаногенных
изучение
и
микробных
выявить
сообществ
особенности
из
различных
наземных мест обитшшя при низкой температуре и оценить их потенциал к
образованию метана при разложении различных органических соединений.
2. Изучить особенности трофической структуры и выявить основные
микробные группы, определяющие результат работы сообщества.
3. Выявить основные регулирующие взаимодействия в метаногенном
ммфобном сообществе и определить основные закономерности, характерные
для сообществ, развивающихся при низкой температуре в различных наземных
экосистемах.
4.
Выделить
психроактивного
чистые
культуры
ключевых
микроорганизмов
метаногенного сообщества. Исследовать особенности их
биологии и установить их филогенетическое положение и таксономический
статус.
5. Определить состав, числешюсть и соотношение популяций архей и
эубактерий, населяющих анаэробную зону кислых сфагновых болот.
Научная новизна и значимость работы.
Исследован
развивающегося
нетрофических
сообществе.
новый
при
объект:
низкой
физических
Выявлены
метаногенное
температуре.
факторов
основные
микробное
Впервые
сообщество,
изучено
влияние
на трофические
взаимодействия
закономерности
функционирования
в
сообщества и основные регулирующие юаимодействия, влияющие на результат
работы сообщества. Обнаружено, что изменения в трофической структуре
анаэробного
микробного
сообщества,
развивающегося
при
пониженной
температуре приводят к перераспределению в потоках вещества.
Показана
исключительно
конкурентоспособность
органического
по
вещества
важная
отношению
к
роль
ацетогенеза
метаногенезу
низкотемпературным
при
микробным
и
его
разложении
сообществом.
Впервые установлено, что в условиях развивающегося сообщества при низкой
температуре
гомоацетогены
выигрывают
конкуренцию
у
мстаногенов за
основные субстраты, в частности водород и диоксид углерода, вследствие более
высокой
скорости
роста.
В
сбалансированном
сообществе
между
вышеупомянутыми микробными группами результат конкуренции зависит
также
от
сродства
к
субстрату
и
адаптации
микроорганизмов
к
низкотемпературным условиям.
Показано, что низкотемпературный метаногенез происходит с приемлемой
скоростью лишь при накоплении достаточной численности метанобразующих
архей. В исследованных нами экосистемах, где концентрация сульфатов не
превьппала 300 мг/л, именно метаногены способны поддерживать низкий
уровень Нг, необходимый для работы синтрофной микрофлоры и обеспечивать
сбалансированную работу сообщества. Низкая активность метаногенов приводит
к подавлению синтрофных реакций и накошюнию в системе различных
органических кислот.
Идентифицированы
ключевые
микроорганизмы
психроактивного
метаногенного сообщества, выделено и охарактеризовано
12 анаэробных
микроорганизмов, растущих при низкой температуре. Шесть из них были
описаны как новые виды родов: Clostridium, Trichococcus и Acetobacterium.
Впервые
создана
коллекция психроакгивных
гомоацетатных
бактерий и
метаногенных архей - ключевых ми1фобных групп метаногенного сообщества.
Благодаря выделению чистых культур впервые измерены кинетические (к„,
Упих)
и
термодинамические
(пороги
потребления)
характеристики
Нг-
метаболизма у гомоацетатных и метаногенных микроорганизмов при низкой
температуре.
Полученные
результаты
существенно
расширяют
знания
о
жизнедеятельности микробных сообществ и о разнообразии микробного мира.
Практическая ценность.
Найдены новые подходы к исследованию жизнедеятельности микробных
сообществ. На основе изученных закономерностей их функционирования
разработаны принтщпы использования анаэробных сообществ для очистки
различных промышленных и сельскохозяйственных отходов при пониженной
температуре.
Получен опыт и разработаны приемы выделения и культивирования
психроактивных
анаэробов. Создана коллекцрм метаногенных
микробных
сообществ и отдельных микроорганизмов, способных к деградации различных
8
органических соединений при шпкой температуре и имеющих хороший
потенциал для применения в биотехнологии очистки сточных вод. Получена
аклимированная микробная ассоциация, способная сбраживать навоз крупного
рогатого скота при (>°С с образованием метана. Показано, что основным
препятствием для проведения процесса при низких температурах является
длительный период адаптации микробного сообщества, который устраняется
добавлением психроактивной закваски. На основе имеющихся результатов даны
рекомендации по получению психроактивных метаногенных ассоциаций и их
адаптации к различным условиям среды.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены и обсуждены на следующих
международных и российских конференциях и симпозиумах:
1. 6-th International Symposium on Cl-Compounds, Gottingen, F.R.G, 1989.
2. 6-th International Symposium on Anaerobic Digestion, Sao-Paolo, Brazil, 1991.
3. Всесоюзный симпозиум "Микробиология охраны биосферы в регионах Урала
и Северного Прикаспия. Оренбург, 1991
4. 7-th International Symposium on Microbial Growth on C I Compounds, Warwick,
U.K., 1992.
5. International Conference on Global Change and Arctic Terrestrial Ecosystems,
Oppdal, Norway, 1993.
6. International Symposium on Anaerobic Digestion 94, Cape Town, South Africa,
1994.
7. Международное
рабочее
совещшше
EERO
"Метаногенез
в
охране
окружающей среды", Санкт-Петербург, 1996.
8. 8-th International Conference on Anaerobic Digestion, Sendai, Japan, 1997.
9. International Meeting "Bioavailability of organic xenobiotics in the environment",
Jesenik, Czech Republic, 1997.
10.1-й Российский Симпозиум SETAC "Risk assessment for Environmental
Contamination", Санкт-Петербург, 1998.
11.2-nd International J A W Q Symposium on Sludge treatment, Athens, Greece, 1999.
12. Международная конференция "Biocatalysis-2000", Москва, Россия, 2000.
13.1-st l A W Congress, Paris, France, 2000.
14. International Conference "Wetlands - 2000", Quebec, Canada, 2000.
15.3-rd International Congress on Extremophiles, Hamburg, Germany, 2000.
16. Международная научная конференция "Автотрофные микроорганизмы": К
75-летию со дня рождения академика Р А Н Е.Н. Кондратьевой. Москва, М Г У им.
М.В. Ломоносова, 2000.
17. Всероссийская конференция "Сельскохозяйственная микробиология в X I X X X I веках", Санкт-Петербург, 2001.
18.9-th International
Symposium
on
Microbial
Ecology,
Amsterdam,
The
Netherlands, 2001.
19.4-th International Congress: Extremophiles 2002, Naples, Italy, 2002.
20. International Conference on Arctic Microbiology, Rovaniemi, Finland, 2004.
Публикации
Материалы диссертации содержатся в 65 печатных работах, в том числе в
21 экспериментальной статье и 3 обзорах. Основные результаты работы
обобщены в следующих публикациях: Acetogenesis at low temperature (6),
Метаногенное микробное сообщество наземных холодных экосистем (22),
Trophic interactions in the methanogenic microbial community of low-temperature
terrestrial ecosystems (23).
Место проведения работы
Основная часть работы проводилась в Институте микробиологии им. С.Н.
Виноградского Р А Н : с 1988 по 1995 г. в лаборатории микробных сообществ, под
руководством академика Р А Н профессора Г.А. Заварзина, а с 1996 года в
лаборатории
ми1фобных
сообществ
антропогенных
местообитаний
под
руководством доктора биологических наук А.Н.Ножевниковой. Основная часть
молекулярно-биологических и ряд биогеохимических исследований торфяных
образцов западно-сибирского болота были выполнены в Макс-ТТланк-Институте
Микробиологии Суши (Марбург, Германия), в лаборатории проф. Р.Конрада.
Образцы тундровой почвы были отобраны во время научной экспедиции в
приполярный Урал. Иловые осадки сильно эвтрофицированного загрязненного
пруда-отстойника
были
получены
от
работников
сыктывкарского
Лесо­
промышленного Комплекса (ЛПК). Образцы торфа болота Западной Сибири,
10
использованные в работе, были любезно предоставлены проф. Н.С.Паниковым и
М.В .Глаголевым
(ИНМИ
РАН).
Навоз
экспериментов по низкотемпературному
крупного
рогатого
скота
для
метаногенному сбраживанию был
доставлен с животноводческого комплекса г.Истра (Московская область).
Основные исследования по метаногенезу в нативных образцах, изучению
различных факторов, влияющих на скорость метаногенеза, а также выделение и
описание
анаэробных
MrnqpoopramoMOB
выполнялись
в
Институте
Микробиологии Р А Н под руководством академика Г.А.Заварзина и д.б.н.
А.Н.Ножевниковой
Н.П.Бородулиной
при
и
д.б.н.
сотрудничестве
Т.Н.Жилиной
с
к.б.н.
(ИНМИ
М.В.Симаньковой,
РАН).
Исследования
ультратонкого строения клеток выделенных микроорганизмов были проведены
совместно с Н.А.Кострикиной и Л.Л.Митюшиной (ИНМИ РАН). Молекулярнобиологический анализ выделенных микроорганизмов и образцов торфа был
проведен совместно с к.б.н. А.М.Лысенко ( И Н М И РАН), а также сотрудниками
Института Макса Планка (Марбург, Германия) K.-J.Chin, M.Friedrich и S.Stubner.
Определение жирнокислотного состава липидного комплекса чистых культур
микроорганизмов и анализ ароматических соединений в торфяных образцах из
кислого
болота
были
выполнены
д.х.н. Г.А.Осиповым.
Математическая
обработка данных проводилась при тесном сотрудничестве с чл.корр. Р А Е Н
В.А.Вавилиным ( И В П РАН), д.х.н. С.В.Калюжным ( М Г У ) и М.В.Глаголевым
(МГУ).
Автор выражает глубокую признательность академику Р А Н профессору
Г.А.Заварзину и доктору биологических наук А.Н.Ножевниковой за постоянное
внимание
к данному
исследованию
и ценные советы
при .обсуждении
полученных результатов, профессору Р.Конраду за проявленный интерес к
работе
и
критические
замечания,
кандидату
биологических
наук
М.В.Симаньковой за непосредственное участие и помощь в работе на всех ее
этапах, а также всем вышеупомянутым коллегам за неоценимую помощь в
настоящем исследовании.
И
Основные защищаемые положения диссертации.
1.
Формирующееся
понижение
метаногенное
температуры
микробное
сообщество
изменением
реагирует
трофической
на
структуры
метаболических потоков и основных регулирующих взаимодействий.
2.
Ключевую роль при развитии психроактивного метаногенного сообщества
играют
конкурентные
взаимоотношения
между
метанообразующими
археями и гомоацетатными бактериями.
3.
Роль гомоацетатных бактерий существенно повышается при низкой
температуре. Имея относительно высокую скорость роста и используя
широкий набор субстратов, гомоацетогены являются одной из наиболее
значимых микробных групп в психроакгивном анаэробном сообществе.
4.
Накопление активной биомассы метаногенных архей служит необходимым
условием
сбалансированности
работы
анаэробного
микробного
сообщества, генерирующего метан при низкой температуре.
5.
С понижением рН водородный метаногенез становится преобладающим
терминальным
процессом
при
работе
метаногенного
сообщества.
Доминирующими метаногенными семействами кислых болот Западной
Сибири являются Methanomicrobiaceae, Methanosarcina, Methanobacterium,
а также RC-II группа метаногенов.
6.
Ключевые микроорганизмы психроактивного метаногенного сообщества
имеют широкие температурные шггервалы роста. Их способность к росту
при низкой температуре обусловлена
фенотипической
адаптацией к
холодным условиям среды обргтания.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Методы исследования
Эксперименты по исследованию кинетики образования метана из нативных
образцов, а также
при деградации различных
органических
субстратов
анаэробным микробным сообществом проводили с использованием анаэробной
техники (Hmigate, 1969), в атмосфере N2 и СОг или Щ и СОг, если последняя
смесь использовалась в качестве субстрата. Культивирование
микробных
культур или сообщества ми1фоорганизмов проводили на бикарбонатной среде
Пфеннига (Pfennig, 1965). Выделение чистых культур осуществляли методом
12
предельных разведений с последующим высевом на агаризоватгаую среду во
вращающиеся пробирки Хангейта с целью получения отдельных колоний. В
среду также добавляли раствор микроэлементов (Pfennig and Lippert, 1966), 0,5
г/л Na2Sx9H20 для создания восстановленных условий, 0,002% резазурина для
контроля окислительно-восстановительного потенциала. В качестве факторов
роста вносили дрожжевой экстракт и раствор витаминов (Wolin et al., 1963).
Использование того или иного источника углерода и энергии зависело от
конкретных задач исследования. При количественном определении двуокиси
углерода и в опытах по исследованию влияния рН на рост культур вместо
бикарбоната натрия, была использована 3-(Ы-морфолино)-пропансульфокислота
(МОПС) в концентрации 40 м М в качестве буфера. Для определения оптимума
рН метаногенных сообществ кислых болот варьирование кислотности среды
осуществляли путем добавления 1М растворов NaOH и НС1. При полученрш
монокультуры умеренно ацидофильного метаногена использовались среда
Пфеннига. ра,збавленная в 20 раз с МОПС в качестве буфера и цитратом титана в
качестве
восстановителя,
а
также
вышеуказанный
набор
витаминов
и
микроэлементов.
Морфологию клеток изучали в световом микроскопе МБИ-3 с фазовоконтрастным устройством, в световом аноптральном микроскопе " Z E T O P A N "
Reichert (Австрия), а также в электронном микроскопе JEM-100. Ультратонкую
структуру клеток исследовали па срезах, изготовленных по методу РитерКеленбергер (Ryter and Kelenberger, 1958). Оптическую плотность клеточных
суспензий определяли на спектрофотометре "Spekol-ll" (Карл Цейс ЙЕНА,
Германия) при 600 нм.
Для определения соотношения между ацетокластическим и водородзависимым
метаногенезом
(бромэтансульфонат,
метаногенеза
ЮтМ)
проводили
с
эксперименты
и
с
ингибиторами
ацетокластического
кислыми
торфяными
(фторацетат,
образцами,
общего
0,5%)
которые
инкубировали при разных температурах. Концентрация накопившихся
в
результате ингибирования метаболических продуктов измерялась в конце
эксперимента,
после
чего
по
ним
проводился
расчет
потенциального
образования метана в сравнении с неингибированным контролем.
13
в
качестве радиоактивно меченных субстратов использовались Na-[2-
'*С]ацетат и НаН'*СОз. После их добавления флаконы инкубировали с
периодическим анализом общей концентрации метана и СОг в газовой фазе, а
также их радиоактивной составляющей. Используя полученные данные, далее
рассчитывали скорость конверсии ацетата, скорость общего метаногенеза и
соотношение фракций метана из ацетата и СОг.
Газы,
летучие
жирные
кислоты
(ЛЖК)
и
спирты
определяли на
газожидкостном хроматографе "Chrom-5" (Прага, Чехия). Расход газа-носителя
(аргон) составлял 40 мл/мин. Для анализа газов использовали детектор по
теплопроводности. Сорбентом служил активированный уголь марки АГ-3. Л Ж К
и спирты определяли с пламенно-ионизационным детектором. В
качестве
сорбента использовали хромосорб-101. Газообразные соединения анализировали
также на хроматографе с пламенно-ионизационным детектором (Carlo Erba,
Милан, Италия) и дополнительным блоком с никелевым катализатором,
восстанавливающим СОг и СО до СН4 (Chromopak, Миддельбург, Голландия).
Низкие
концентрации
водорода
определяли
на
анализаторе
с HgO-Hg-
катализирующем блоком. Радиоактивные газы измеряли на газожидкостном
хроматофафе, оснащенном пламенно-ионизационным детектором, блоком с
никелевым катализатором и пропорциональным счетчиком R A G A (Raytest,
Штраубенхарт, Германия). Л Ж К и другие растворенные соединения определяли
также методом высокоэффешивной жидкостной хроматографии (HPLC)
-
(Sykam, Гаутинг, Германия) с UV- и RI-детекторами. Ароматические соединения
анализировали с применением газовой хроматографии и масс-спектрометрии
(GC-MS system, QP-2000, Shimadzu, Япония). Неорганические ионы определяли
методом
ионной
хроматографии
с
использованием
детектора
по
теплопроводности.
Содержание стабильного изотопа '^С анализировали на масс-спектрометре
Micromass-602D'. Метан окислялся до СОг и НгО с СиО-катализатором. После
этого все компоненты разделяли криогенно и далее анализировали.
При описании чистых бактериальных культур определение глюкозы
проводили энзиматически с глюкозооксидазой и пероксидазой (Щербухин и др.,
1970). Формиат определяли колориметрически (Lang and Lang, 1972). Лактат
определяли энзиматически с лакгатдегидрогеназой (Gutman and Wahlefeld, 1974),
14
используя стандартный набор реактивов фирмы Boehringer, а также методом
дериватизации с йодной кислотой в качестве окислителя (Teimissen et al., 1989).
Выделение и очистку ДНК проводили по методике Мармура (Marmur, 1961).
Содержание ГЦ в ДНК определяли по температуре плавления (Marmur and Doty,
1962). Гибридизацию ДНК проводили методом оптической реассоциации по Де
Лею (De Ley etal., 1970).
Клеточные липиды экстрагировали гексаном из высушенной при бСС в
токе гелия, а затем вакуумированной микробной биомассы клеток. Экстракт
высушивали и силилировали в
К,0-,бис(триметилсилил)-трифларацетамида
(БСТФЛ). Реакционную смесь анализировали на хромато-масс-спектрометре
НР-5985В
(Hewlett-Packard)
с
использованием
капиллярной
колонки
из
плавленного кварца НР-101.
При работе с культурами метаногенов, а также с образцами торфа для
экстракции ДНК использовали модификацию стандартного метода, основанного
на применении додецил сульфата натрия в качестве лизирующею агента, с
дополнительным этапом разрушения агрегатов клеток путем растирания со
стерильными стеклянными бусинками. В ходе работы производили ПЦРамплификацию фрагментов микробного гена, кодирующего
16S рРНК
и
функционального гена метаногенных архей, кодирующего метил-коэнзим М
редукгазу (MCR-гена). ПЦР реакции проводили на термоциклере Р Е GeneAmp
PCR System 9700 (Perkin-Elmer Applied Biosystems). Для клонирования ПЦРамплифицированных
клонирования
ТА
фрагментов
(Invitrogen).
использовали
набор
Филогенетический
реактивов
анализ
для
полученных
нуклеотидных последовательностей, а также построение филогенетических
дендрограмм был выполнен с помощью программного пакета A R B (Stnmk and
Ludwig,
2000;
репрезентативных
Chin
et
клонов
al.,
или
1999).
Нуклеотидные
амшгафицированных
последовательности
фрагментов
ДНК
определяли на секвенаторах A B I 373А и A B I 377А (Perkin-Elmer Applied
Biosystems).
При
использовании
метода T-RFLP
реверс-праймер
был
мечен 5-
карбоксифлуоресцином ( Ф А М ) по 5"-концу. Аликвотные количества ампликона
рР1Ж гена были обработаны Taql-полимеразой (Promega, Mannheim, Германия).
Каждая реакция была проведена с 8 мкл S S U рДНК ампликона, 1 мкл
15
соответствующего буфера для инкубации (Promega) и 1 мкл рестрикционного
фермента (10 U). Инкубацию проводили в течение 3 часов при б З Т .
Полученную массу рДНК смешивали с формамидом и со стандартными
фрагментами меченных флюоресцентным красителем нуклеотидов, длинной от
29 до 928 пар. Образцы далее денатурировали при 94°С в течение 2 мин. и
помещали в полиакриламидный гель для проведения элеюгрофореза. Фрагменты
рДНК разделяли по их размеру и детектировали лазерным сканером по
интенсивности флюоресценции меченных по 5'-концам фрагментов.
При
использовании
специфичными
метода
in
situ-гибридизации
флуоресцентно-меченными
с
16S
олигонуклеотидными
рРНКзондами
образцы торфа или чистые культуры микроорганизмов фиксировали в 4%-ном
растворе формальдегида. Перед фиксатщей образцов торфа была проведена
процедура последовательной экстракции из них клеток микроорганизмов.
Гибридизацию препаратов фиксированных клеток или торфяных экстрактов с
флуоресцентно-мечеными
олигонуклеотидными
зондами
проводили
в
соответствии с методикой Dedysh et al. (2001) с последующей окраской
препаратов универсальным
красителем ДНК
-
DAPI
При
определении
микробного состава торфяных образцов использовали группо-специфичные
зонды для детекции эубакгерий (ЕиЬ338), архей (Агс344 и Атс915) и нескольких
метаногенных групп: семейства Methanomicrobiaceae и родов Methanosarcina и
Methanobacterium (Amann et al., 1990; Raskin et al., 1994). В качестве позитивного
контроля для каждого исследуемого образца использовали коллекционные
культуры: Methanosarcina barken ( D S M 800), Methanoculleus thermophibus (DSM
2373), a также метаногенный штамм M B , выделенный в ходе работы. Синтез
олигонуклеотидных зондов, меченых флуоресцентными красителями СуЗ, Су5 и
FLUOS, осуществлялся фирмой M V G Biotech (Эбсрсберг, Германия). Препараты
анализировали с использованием конфокального лазерного
сканирующего
ми1фоскопа Leica TCS-NT (Leica, Гейдельберг, Германия). Общую численность
микроорганизмов в образцах определяли путем подсчета клеток, окрашенных
DAPI.
16
РЕЗУЛЬТАТЫ
1.
Трофическая
структура
метавогенного
микробного
сообщества,
развивающегося при низкой температуре.
Основные
закономерности
метаногенного
сообщества
метаногенной
ассоциации,
функционирования
были выявлены
психрофильного
при сравнительном
формирующейся
при
изучении
низкотемпературном
сбраживании навоза, а также микробных сообществ из прудовых осадков
загрязненного таежного водоема, почвы тундры и кислого сфагнового болота
как биологических систем, существенно различных по своему происхождению и
экологическим
условиям, однако, объединенных
общей способностью
к
жизнедеятельности в холодных условиях (табл. 1).
Таблица.
1. Краткая
характеристика
низкотемпературных
биоснстем -
источников изученных метаногенных микробных сообшеств.
Биосистема
Температура, "С
рН
Тип системы
Навоз КРС
6 - 40
7,0
антропогенная
4 - 25
6,8
полу-антропогенная
6 (макс.)
6,1
природная
15 (макс.)
3,8-5,5
природная
Загрязненный водоем
средней тайги
Почва тундры
Сфагновое болото Западной
Сибири
Навозохранилище
крупного
рогатого
скота
является
примером
антропогенной системы, богатой органическим веществом и содержащей
мезофильную
метаногенную
популяцию,
способную
адаптироваться
к
низкотемпературным условиям. Пруд системы доочистки сыктывкарского Л П К
представляет собой модель природного таежного водоема, испытывающего
антропогенное воздействие в условиях сезонных температурных изменений, что
способствует развитию психротолерантного микробного сообщества. Почва
тундры представляет собой постоянно холодную природную
Особенностью экосистемы кислого сфагнового болота
экосистему.
Западной Сибири,
находящегося в сходных с таежным прудом температурных условиях, является
17
очень низкая минерализация и пониженный рН, что предполагает наличие
умеренно-ацидофильных анаэробных микроорганизмов.
Очередность
представления материала
в автореферате выдержана
в
соответствии с таблицей 1, что дает возможность последовательно сравнивать
метаногенные микробные сообщества из вышеперечисленных экосистем.
1.1. Метаногеняое микробное сообщество, сбраживаюшее навоз крупного
рогатого скота при низкой температуре.
Метаногснное сообщество, формирующееся при сбраживании навоза,
существенным образом отличается от сообщества рубца жвачных. Анаэробное
разложение органики в рубце заканчивается на стадии образования жирных
кислот,
тогда
как
при
сбраживании
навоза
развивается
полноценное
метаногениое сообщество с высоким содержанием синтрофной микрофлоры,
использующей жирные кислоты, а также ацетокластических и водородных
метаногенных архей. Основными препятствиями для широкого использования
низкотемпературного метаногенеза в биотехнологических целях являются его
низкая скорость при пониженных температурах и длительный период адаптации
микробного сообщества (Wellinger and Kauflnann, 1982; Zeeman et al., 1988).
Нами было установлено, что добавление психроактивной метаногенной
ассоциации (закваски) к свежему (не сброженному) навозу
способствует
осуществлению процесса низкотемпературного метаногенного сбраживания [4].
Такая закваска представляет собой метаногениое микробное сообщество,
которое было
получено
методом автоселекции в течение
1,5 лет при
сбраживании навоза К Р С и акклимировании к 6 - 8''С. Психроактивную закваску
добавляли к сбраживаемой навозной массе в 25%-ном соотношении, и далее
контролировали динамику образования продуктов при низкотемпературном
(б'С) сбраживании навоза как формирующейся (навоз без инокулята), так и
аккпимированной
ассоциациями.
Было
показано,
что
при
добавлении
акклимированной ассоциации образование метана начинается без лаг-периода
(Рис. 1); за 140 дней концентрация метана достигла 47 ммоль/л. В течение этого
же времени в опыте без добавления микробной закваски образовалось лишь 3
ммоль/л СН4 (Рис. 2). Общим для двух систем являлась активная работа
бродильной
микрофлоры, приводящая к
18
накоплению больших количеств
30
60
90
120
150
Дни
Рис. 1. Образование продуктов при сбраживании навоза К Р С при 6°С с
использованием психрофильной ассоциации. 1 - ацетат; 2 - пропионат; 3 бутират; 4 - метан.
Рис. 2. Образование продуктов при сбраживании навоза К Р С без психрофильной
закваски при 6°С. 1 - ацетат; 2 - пропионат; 3 - бутират; 4 - метай; 5 - водород.
19
жирных кислот, в особенности ацетата, сопровождавшаяся некоторым падением
рН от 7.0, в начале эксперимента, до 6.5. В контрольной системе концетрация
субстрага была в
1,5 раза выше, и на протяжении почти
100 суток
поддерживался определенный пороговый уровень водорода, не детектируемый в
системе с закваской.
Кинетический анализ кривых образования метана в экспериментах по
сбраживанию навоза в различных температурных условиях показал, что
численность активных метаногенов в опыте с закваской почти на три порядка
выше, а их удельная скорость роста при 6°С в 2,2 раза выше, чем в опыте без её
добавления
[4].
Полученные
результаты
свидетельствуют
о
том,
что
акклимированная к низкой температуре микробная ассоциация представляет
собой сбалансированное
микробное сообщество,
которое характеризуется
высоким содержанием метаногенных архей, способных к использованию как
водорода, так и ацетата. Было установлено, однако, что такая метаногенная
ассоциация теряет свои преимущества при проведении процесса сбраживания
при более высокой температуре. При температурах
15 -
35°С, после
определенного лаг-периода, развивалось полноценное микробное сообщество,
генерирующее метан, причем удельная скорость роста метаногенов теперь бьша
выше в опытах без добавления психроактивной ассоциации. Предварительное
выдерживание психрофильной ассоциации при 55°С приводило к потере ее
значения как стимулирующей добавки при низкотемпературом сбраживании.
Скорость метаногенеза в этом случае в контроле и в системе с закваской
практически
не
отличались.
По
экспериментальным
данным
процесса
ферментации навоза КРС была построена модель, в которой использовалось
классическое уравнение Моно при описании субстратного лимитирования в
системе
[12]. Мрдель
показала,
что
только
участие
гомоацетогенов
в
потреблении водорода и СОг дает возможность адекват1ю описать реальный
процесс. Было также установлено, что микроорганиЗлМы, которые входят в состав
акклимированной ассоциации, имеют широкие интервалы роста от 1° до 30-35°С
и принадлежат к психротолерантным микроорганизмам (Раздел 3),
Таким образом, критическим фактором при формировании метаногенного
сообщества в процессе низкотемпературного разложения навоза КРС оказалось
накопление собственно метаногенов, которые необходимы для установления
20
баланса в трофических взаимодействиях анаэробного сообщества. Основным
результатом
применения
количества
психроактивных
Адаптированные
к
закваски
низким
является
метаногенов
температурам
увеличение
в
первоначального
сбраживаемой
микроорганизмы
массе.
способствуют
увеличению скоростей анаэробного сбраживания с образованием СН4.
1.2. Метаногенное микробное сообщество сильно загрязненного водоема
средней тайги.
Примером метаногенного анаэробного сообщества, находящегося под
сильным антропогенным воздействием, является экосистема, представленная
иловыми осадками таежного пруда-отстойника Лесопромышленного Комплекса
(ЛПК) (г. Сыктывкар, Республика Коми, 62 с. ш., 51 в. д.) [2,5]. Пруд в течение
долгого времени был выключен из системы очистных сооружений предприятия
и представлял собой модель сильно загрязненного водоема бореальной зоны.
Накопление в нем больших количеств органических отходов, поступавших из
аэротенков, способствовало развитию
активного
анаэробного
сообщества,
осуществляющего процессы деградации при низкой температуре. Большую
часть года температура пруда составляла 4-6°С, однако в летний период пруд
мог прогреваться до 15°С. Значение рН было близким к нейтральному и
составляло 6.8.
При
инкубировании
образцов
иловых
осадков
пруда-отстойника
в
интервале температур 6-28''С было установлено, что скорость метаногенеза
существенно
снижалась
при
понижении
температуры.
К
90-м
суткам
концентрация СН4 составляла 9 мМ в опыте при 28''С, 4 мМ - при 15''С и 0,4 при б'С.
Образование метана не было зарегистрировано при повышении
температуры до 40''С, что указывает на отсутствие в данной экосистеме
термофильного метаногенного сообщества и на преимущественное развитие
психротолерантных микроорганизмов, растущих как при умеренных, так и при
пониженных температурах.
Принцип изучения трофической структуры метаногенного сообщества
состоял в создании условий, благоприятных для развития ключевых микробных
групп сообщества. Для этого в нативные образцы, генерирующие метан в
качестве
конечного
продукта (сбалансированное
21
микробное
сообщество).
разбавленные минеральной средой, вносились различные элективные субстраты.
Разбавление образцов (в 10 раз) проводилось с целью изучения воздействия
температуры как основного фактора на рост ми1фоорганизмов, входящих в
состав сообщества, а также чтобы уменьшить влияние иных факторов на
ростовые
характеристики.
характеризовался
Специфический
динамикой
разложении вносимых
микробных
субстратов
ответ
процессов,
микробных
групп
происходящих
в различньгс температурных
при
условиях
(развивающееся микробное сообщество).
Проследить
последовательную
работу
всей
трофической
цепи
метаногенного сообщества возможно на примере разложения целлюлозы основного компонента растительного опада. В экспериментах с этим субстратом
было
показано
существование
трех
основных
стадий:
кислотогенной,
сингрофной и метаногенной (Рис. 3). Ацетат, пропионат и ряд других жирных
кислот, а также водород образовывались
на первой стадии микробной
деградации целлюлозы. Было установлено, что синтрофное разложение жирных
кислот зависело от уровня водорода (см. Раздел 2.1), а пропионата - также и ог
уровня ацетата. Ацетат потреблялся с одновременным образованием метана.
10
350
--300
I
50
100
150
Дни
Рис. 3. Продукты деградации целлюлозы микробным сообществом прудовых
осадков при 15°С. 1 - ацетат; 2 - пропионат; 3 - бутират; 4 - изо-бутират; 5 - изовалерат; б - водород; 7 - метан.
22
при понижении температуры скорость деградации существенно снижалась. Для
перехода из кислотогенной в синтрофную стадию сообществу требовалось 60, 90
и 360 суток при 28°, 15° и 6°С соответственно. Обнаружено, что при низкой
температуре
активное
участие
в
использовании
водорода
принимают
гомоацетатные бактерии, быстро снижая его концентрацию до определенного
порогового уровня. Заключительной стадией разложения целлюлозы при всех
температурах инкубирования был ацетокластический метаногенез.
При
формировании
анаэробного
сообщества
иловых
осадков
сыктывкарского пруда-отстойника важную роль играл протеолитический путь
деградации
органического
вещества.
Причиной
являлись
периодически
поступавшие в пруд стоки из аэротенка, содержащие большое количество
бактериальной биомассы. При разложении пептона и казеина как примера
полимерных соединений белковой природы наблюдалось образование большого
количества Л Ж К (Сг-С^) и их изоформ на стадии ацидогенеза с их последующим
потреблением синтрофными бактериями. Было установлено, что при понижении
температуры
соотношение
образующихся
жирных
кислот
существенно
сдвигалось в пользу ацетата, пропионата и бутирата. Высвобождение в среду
ионов аммония в течение кислотогенной фазы способствовало поддержанию
нейтрального значения рН, благоприятного для протекания метаногенеза.
Однако было показано, что скорость образования СН4 сильно замедляется при
понижении температуры. Метан образовывался по ацетокластическому пути.
Водород потреблялся с образованием ацетата, который далее служил субстратом
для метаногенов.
Основными
мономерами, высвобождающимися
на
стадии
гидролиза
являются различные сахара, и в первую очередь глюкоза, а на стадии протеолиза
- аминокислоты. Эти соединения легко дехрадируются, и при их избытке
создаются
условия
для
быстрого
роста
соответствующей
бродильной
микрофлоры. Результатом является продукция большого количества различных
Л Ж К , и снижение рН среды, препятствующее метаногенезу. В экспериментах с
прудовыми осадками было показано, что глюкоза и ряд других Сахаров
разлагались с образованием ацетата, пропионата, бутирата, а также этанола,
лакгата и водорода в качестве основных продуктов при 28°С. Ацетат, этанол и
лакгат далее участвовали в микробных процессах синтеза с накоплением
23
бутирата. При понижении температуры до 15°С основные продукты разложения
глюкозы оставались прежними, однако последующих реакций синтеза не
происходило. При 6°С главными продуктами брожения становились ацетат и
бутират, что указывает на снижение числа оаювных биохимических путей
деградации различных соединений при понижении температуры. Водород
потреблялся с образованием ацетата, как при умеренных, так и при пониженных
температурах.
Характерной
особенностью
кислотогенной
стадии
при
сбраживании Сахаров и аминокислот, а также ряда полимеров, является
увеличение при понижении температуры доли бутирата, как менее окисленного
соедршения, по отношению к ацетату. Так при разложении пептона и глюкозы
соотношение ацетат/бутират сдвигалось при понижении температуры с 10 (при
28°С) до 3,3 (при 6°С) и с 1 (при гЯ'С) до 0,3 (при 6''С) для вышеназванных
субстратов, соответственно, что указывает на синтез, развивающимся при
пониженной температуре, сообществом менее окисленных соединений при
недостатке акцеш-оров электронов.
Одним из
ключевых
этапов
деградащш
органического
вещества
в
анаэробных условиях является синтрофная стадия, на которой происходит
разложение жирных кислот как основных продуктов гидролитических и
бродильных микроорганизмов, а также ряда ароматических соединений и
спиртов (Staras, 1994; Schink, 1997). Синтрофные взаимодействия обусловлены
межвидовым переносом Нг диффузионным путем из микроокружения водородгенерирующего к водород-потребляющему партнеру. Нами было установлено,
что
температурные
условия
оказывали
определяющее
воздействие
на
протекание таких реакций. Наиболее характерные жирные кислоты, пропионат и
бутират, разлагались анаэробным сообществом прудовых осадков лишь при
28°С после некоторой лаг-фазы, необходимой для накопления соответствующей
синтрофной микрофлоры. Для инициации микробного разложения пропионата
требовалось накопление также ацетокластических метапогенов, поэтому начало
этого процесса затягавалось - лаг-фаза длилась в два раза дольше, чем при
разложении бутирата, и в качестве конечного продукта накапливался только
метан. При понижении температуры до 15°С выпгеупомянутые синтрофные
реакции не происходили в течение 6 месяцев, а при 6°С жирные кислоты не
разлагались в течение года.
24
Важнейшую роль в работе психроактивного анаэробного сообщества
играют
конкурентные
микробные
взаимоотношения
при
использовании
водорода - основного промежуточного продукта, влияющего на протекание
различных микробных реакций (Кожевникова и Боднар, 1989). Обычно, при
умеренных и повышенных температурах в пресноводных экосистемах в
отсутствии сульфатов водород используется, главным образом, метаногенами.
Нами было установлено, что в эвтрофных условиях таежного пруда-отстойника
ацетогенез из водорода и COj в развивающемся сообществе преобладал как при
умеренных, так и при низких температурах с очень низким коэффициентом Qio,
равным 1,9 в интервале от 6 до 28°С (Рис.4). Это указывает на активность и
хорошую адаптащпо присутствуюпщх в сообществе гомоацетогенов к низким
температурам, а также на возможность их участия в перераспределении потоков
органического вещества. В такой системе ацетат был одним из основных
микробных
продуктов
при
развитии
метаногенного
психроактивного
сообщества. При отсутствии в системе, помимо бикарбоната, иных доноров
электронов ацетат может разлагатся либо метаногенами (ацетокластический
путь), либо в результате синтрофных реакций с очень низкой скоростью (Zinder
and Koch, 1984; Nuesslein et al., 2001). В исследуемой системе наличие
ацегокластического
подтверждено
метаногенеза
стехиометрией
в
качестве
ацетат/метан,
основного
которая
в
процесса
было
соответствии
с
биохимической ацетокластической реакцией была близка к единице при всех
температурах.
накопление
При
этом
активной
главным
биомассы
лимитирующим
медленно
фактором
растущих
являлось
ацетокластических
метаногснов. При низкой температуре (б'С) необходимый лаг-период для
сообщества
прудовых
экспериментальным
осадков
данным
составлял
модель,
150
суток.
описывающая
Построенная
кинетику
по
микробных
процессов показала, что в условиях избытка субстрата (Нг и СОг) основной
мшфобной группой, потребляющей водород, являются гомоацетогены
и
основным субстратом для метанобразующих архей служит ацетат [11].
Нами
было
также
установлено,
что
наиболее
предпочтительными
субстратами для развития метаногенов при низких температурах являются
различные Сi-соединения. При использовании метанола метан оставался
преобладающим конечным продуктом как при умеренных (ZS^C), так и при
25
низких температурах
(6-15°С). Гомоацетатные
бактерии
были
способны
конкурировать с метанобразующими археями за метанол только при б'С с
образованием ацетата из метанола в количестве в 2,5 раза меньшим, чем СН4.
Таким образом, понижение температуры не является критическим фактором для
развития метилотрофных метаногенов. Однако, в пресноводных экосистемах
уровень
доступных
С i-соединений
незначительный,
и
метилотрофные
метаногены могут присутствовать в минорных количествах.
I
Рис. 4. Продукты потребления Н: и СОг микробным сообщес1вом прудовых
осадков при 6°С. 1 - водород; 2 - ацетат; 3 - метан.
Таким образом, метаногенное микробное сообщество
таежного
пруда
представляет
собой
активную
из эвтрофною
биологическую
систему,
включающую все ключевые микробные группы анаэробной трофической це1ш,
способные
к
функционированию
при
пониженной
температуре
и
адаптированные к повышенному содержанию органического вещества. Такое
микробное сообщество не развивается при 40°С и выше, что указывает на
функционирование в изучаемой системе психротолершггаых микроорганизмов.
Влияние
низких температур
существенному
замедлению
на развивающееся
микробных
сообщество
процессов.
приводит
Установлено,
к
что
критическим для сбалансированной работы сообщества при пониженных
26
те.мпературах является формирование необходимых синтрофных микробных
взаимодействий и накопление биомассы активных метанобразующих архей.
1.3. Метаногенное сообщество почвы тундры.
Характерной особенностью почв тундры является низкая концентрация
минеральных
компонентов
при
избытке
органического
углерода,
что
обусловлено низкой скоростью деструкции в условиях холодного климата. Тем
не менее, именно экосистемы тундры рассматриваются в качестве важных
источников
эмиссии
метана.
Образование
СН4
в
почве
тундры
было
зарегистрировано в ряде исследований (Whalen and Reeburgh, 1988; Слободкин и
др., 1992). В качестве модели при изучении жизнедеятельности анаэробного
микробного сообщества тундры нами были исследованы образцы болотистой
почвы кустарничковой (ерниковой) тундры из мочажины у пос. Хальмер-Ю (68
с. ш. 65 в. д.), в 100 км севернее г. Воркута. Температура почвы летом на глубине
отбора образцов (30-40 см) была 5-6°С и рН - 6,1. Для данных образцов была
исследована динамика метана и установлена величина его эмиссии - 7,85 мг
СН4/м^час в месте отбора проб (Слободкин и др., 1992). В процессе анаэробного
инкубирования образцов тундровой почвы при различных температурах (6-28''С)
было зарегистрировано образование метана с максимальными скоростями в
диапазоне 15° - 28''С, что свидетельствует о функционировании психроактивного
метаногенного сообщества в почве тундры.
1.3.1. Основные микробные группы в развивающемся сообществе почвы
тундры.
Трофическая структура развивающегося метаногенного сообщества тундры
изучалась в экспериментах с потреблением характерных субстратов ключевых
ми1фобных групп [10]. Также как и в опыте с осадками пруда-остойника, нами
установлено наличие трех основных стадий разложения целлюлозы, которые
бьига существенно растянуты во времени и не имели четких переходов при
низких температурах. Основными продуктами кислотогенной стадии деградации
целлюлозы являлись ацетат и пропионат (Рис. 5), однако, дальнейшее их
потребление было затруднено. При 28"С метаногенез протекал с невысокой
скоростью, и сильно замедлялся с понижением температуры. При всех
27
температурных
режимах
наблюдался
длительный
лаг-период,
особенно
продолжительный при б'С (150 суток). Полученные данные свидетельствуют о
невысокой начальной численности активной микрофлоры в образцах почвы
тундры в сравнении с прудовыми осадками с той же степенью разбавления.
Вышеописанные закономерности были подгверждены при разложении
пептона. Основным продуктом его деградации при низких температурах был
ацетат. Также в небольших количествах накапливались и другие Л Ж К (С2-С4), в
том числе и их изо-формы. Разложение кислот при 15°С было затруднено, а при
6°С не происходило в течение почти 300 суток. Нейтральный рН среды
способствовал прохождению метаногенеза, но скорость его была очень низкой и
не превышала 0,003 мМ/сутки.
Рис. 5. Продукты деградации целлюлозы микробным сообществом почвы тундры
пря 1S°C. 1 - ацетат; 2 - пропионат; 3 - бутират; 4 - метан.
Ми1фобное сообщество из почвы тундры достаточно быстро, как при
умеренных, так и при низких температурах, разлагало сахара, в качестве
примера которых были выбраны глюкоза и ксилоза. На стадии кислотогенсза
основными продуктами были ацетат, пропионат и бутират. Дополнительный
ацетогенез и синтез бутирата далее были зарегистрированы при использовании
водорода и этанола, накопившихся ранее на кислотогенной стадии. Общей
тенденцией, ранее отмеченной и для микробного сообщества иловых осадков
28
пруда, оказалось повышение доли бутирата среди образующихся жирных кислот
при понижении температуры. Так при 15°С соотношение ацетат/бутират
составляло 2,0 и 4,9 при разложении глюкозы и ксилозы, а при 6°С - 0,5 и 1,2,
соответственно. Ещё сильнее менялось
конверсии
этанола:
от
4,5
(15''С)
вышеназванное соотношение при
до 0,3
(6''С). Быстро
протекающая
кислотогенная стадия, приводила к понижению рН, препятствуя процессу
метаногенеза.
Выводы
о чрезвычайно низкой скорости синтрофной стадии были
подтверждены в экспериментах с Л Ж К в качестве субстратов. При температуре
15°С и ниже микробное сообщество почвы тундры не разлагало пропионат,
Бутират потреблялся при 15''С только после продолжительной лаг-фазы (150
суток), причем начало его разложения совпадало с началом образования метана
(Рис. 6). При более низкой температуре бутират не разлагался в течение года.
Метан образовывался лишь в следовых количествах. Полученные результаты
50
100
150
200
250
300
Дни
Рис. 6. Разложение бутирата микробным сообществом почвы тундры при 15*С. 1 ацетат; 2 - бутират; 3 - водород; 4 - метая.
свидетельствуют о том, что низкая численность активных микроорганизмов,
участвующих в синтрофных взаимоотношениях, и их медленное развитие при
низкой температуре препятствуют разложению
29
жирных кислот.
Важным
условием для синтрофных взаимодействий является формирование физически
оформленных
сообществ с минимальными диффузионными
расстояниями
между партнерами (<10 мкм). Значение этого фактора возрастает с понижением
темепературы,
когда
диффузия
замедляется.
Низкие
скорости
роста
микроорганизмов дополнительно затрудняют образование таких сообществ.
Низкая скорость образования метана была также продемонстрирована в
экспериментах с использованием характерных для метаногенов Сг (ацетат) и Ci
(метанол)
субстратов,
свидетельствующие
метанообразующих
где
о
были
зафиксированы
необходимости
архей.
Для
накопления
начала
длительные
лаг-фазы,
активной
биомассы
ацетокластического
метаногенеза
потребовался лаг-период длительностью 100 суток при 15°С и более 160 суток
при И'С.
При понижении температуры до 6°С
длительность
лаг-фазы
превышала время эксперимента. Использование метанола в сообществе почвы
тундры при 28°С происходило после длительной лаг-фазы (около 100 суток) с
образованием
метана и
ацетата в
понижении температуры до
ацетогенез.
В
отличие
15°С
от
сравнимых
и
количествах, однако при
ниже доминировал
метаногенов
таежного
метилотрофный
пруда-отстойника
метанобразующие археи почвы тундры не потребляли триметиламин, по
крайней мере в течение 300 суток.
Таким образом, при формировании метаногенного сообщества почвы
тундры наблюдались сходные с вышеописанной микробной системой таежного
пруда
закономерности:
быстрое
развитие
кислотогенной
микрофлоры,
медленное формирование синтрофных взаимодействий и низкая скорость
накопление активной биомассы метаногенов. Установлено, что роль ацетогенеза
при низких температурах существенно возрастает. Главным образом это связано
с активностью гомоацетатных бактерий, конкурентоспособность которых в
отношении других бактерий и метаногенных архей за общие субстраты
существенно повышается при понижении температуры.
1.3.2. Конкуренция за водород в метаногенном сообществе почвы тундры
при различных температурах.
Водород
регулирующим
является
важнейшим
микробные
трофические
30
промежуточным
взаимоотношения
метаболитом,
в
анаэробном
сообществе. Возрастание роли гидрогснотрофных гомоацетатных бактерий в
развивающемся при низкой температуре сообществе предполагает их участие в
потреблении Нг. В отличие от микробной системы прудовых осадков, где
гомоацетогены
являлись
основными
водород-потребляющими
микроорганизмами, анаэробное сообщество почвы тундры потребляло водород в
условиях
конкуренции
[3,10]. Было обнаружено, что в
зависимости от
температурных условий использование Н2 и СОг, проходившее с практически
одинаковыми скоростями при 28° и 15°С, приводило к существенно разным
результатам- преобладанию либо метаногепеза (при 28°С), либо ацетогенеза (при
15°С и ниже) (Рис. 7). При 28*0 потребление вышеупомянутых газообразных
субстратов приводило к накоплению 31 мМ метана и только 6 м М ацетата.
Обратная картина наблюдалась при ]5°С: образование 31 м М ацетата к 50-м
суткам и очень слабый метаногенез. Аналогичная тенденция сохранялась при
дальнейшем понижении температуры до б^С при более низких скоростях
процессов. Образование ацетата доминировало также при низкотемпературном
использовании формиата и СО.
50
100
150
200
250
300
Дни
Рис. 7. Потребление Нг и СОг развивающимся микробным сообществом почвы
тундры при 28° (черные символы) и 15°С (светлые символы). 1 - водород (28°С); 2 водород (15°Q; 3 - метан (28°С); 4 - метан (15°С); 5 - ацетат (28°С); 6 - ацетат (15°С).
31
Для
того,
чтобы
определить
являются
ли
принципиально
тгыми
конкурентные отношения за водород в нативном микробном сообществе с
установившимся количественным соотношением микроорганизмов водородноуглекислотная газовая смесь была добавлена к почвенным образцам, не
разбавленным минеральной средой. Откликом сообщества на избыток субстрата
(Нг и СОг) явилось образование метана и ацетата при всех температурах
инкубации. Однако если при 28°С метаногенез явно доминировал, то при
температуре 15°С роль ацетогенеза значительно повышалась. Метан и ацетат
образовывались в сравнимых количествах. Вторая фаза - ацетокластический
метаногенез начинался после непродолжительного лаг-периода, и в конечном
итоге через 90 суток метан оставался единственным продуктом. При 6°С
конкуренция метаногенов и гомоацетатных бакгерий привела к образованию на
50-е сутки роста И м М ацетата и 9 мМ метана (Рис.8). Однако для начала
ацетокластического метаногенеза потребовался довольно продолжительный лагпериод, примерно 90 суток, и далее лишь к 180-м суткам
50
100
150
200
Дни
Рис. 8. Образование метана и ацетата из Н : и СО^ в нативных образцах почвы
тундры при 6°С. 1 - водород; 2 - метан; 3 - ацетат.
метан оказался единственным конечным продуктом. По данным эксперимента
была построена модель, описывающая двухфазность процесса потребления
32
водорода и СОг микробным сообществом п о ч в ы тундры [15]. Б ы л о показано, что
предполагаемое участие гомоацетогенов или гидрогенотрофных метаногенов на
первом этапе одинаково хорошо оъясняет эксперименталыгые данные. Модель
также
показала
высокую
чувствительность
исследуемой
биосистемы
к
начальной численности метаногенов, особешю при низких температурах.
Таким
образом
формирующееся
показано,
метаногенное
что
воздействие
сообщество
низких
приводит
к
температур
изменениям
на
в
его
трофической структуре и перераспределению потоков органического вещества в
микробной системе. Основньпии особенностями метаногенного сообщества из
почвы
тундры
были
микроорганизмов,
соотношение
приводило
по
сравнению
ключевых
развивающегося
к
конкуренции
существенно
с
при
продолжительным
археями,
лаг-периодам
инкубирования.
Микробное
групп.
различных
и
в
В
нативных
иное
условиях
возникновению
зависел
и
субстратов
гомоацетогенными
которой
сообщество
численность
пруда-отстойника,
деградащш
результат
начальная
микробтих
гидрогенотрофными
метаногенными
низкая
системой
терминальных
сообщества
между
более
это
активной
бактериями
от
и
температуры
образцах
реагировало
сходным образом, однако, переключение процесса метаногенеза на ацетогенез
сдвигалась в сторону
низких температур, что
начальной численностью
меньп1ую зависимость
микроорганизмов.
метаногенов
результата
Несмотря
на
и, в
более
высокой
следствие этого, указывает
конкурешщи
ряд
объясняется
различий
от ростовых
в
на
характеристик
процессах
деградации
органического вещества в рассмотренных в ы ш е экосистемах была выявлена
общая
схема
функционирования
анаэробного
сообщества
при
низкой
температуре. Установлено, что двумя основными особенностями трофической
цепи при формировании психроактивного метаногенного сообщества я в л я ю т с я :
в значительной степени подавленное синтрофное разложение Л Ж К и высокая
конкурентоспособность гомоацетатных бактерий при использовании водорода.
1.4. Метаногенное микробное сообщество кислого сфагнового болота.
К и с л ы е болота ( р Н 3.0-5.5) представляют наиболее экстенсивный
северных увлажненных
земель
Евразии
и
Северной Америки
и
тип
1"
являются
мощным источником атмосферного метана ( M a p ^ ^ s ^ ^ ^ J m ^ 7 T 5 8 7 r ^ s p l m a n n ,
33
Ч
ВИБЛИОТЕКА
СПетербург
0 9 100 «кг
Crutzen, 1989). Кроме низкого рН такие экосистемы характеризуется крайне
невысокой
концентрацией минеральных солей. Из-за отсутствия контакта с
грунтовыми водами содержание солей в верховых болотах не превышает 50 мг/л
торфяной влаги, обуславливая резвычайно низкую буферную способность воды
и роль твердого буфера на поверхности сфагнов. Болотные экосистемы
характеризуются также преобладанием пониженных температур. Источником
торфяных образцов было Западно-сибирское болото Бакчарское (Зб'З! с.ш,
82°51 в.д), расположенное в 150 км от г. Томск. Оно принадлежит к поясу
сфагновых омбротрофных болот Западно-сибирской низменности (Инишева и
др., 2001). Даже в летние месяцы температура на глубине 50 см (анаэробная
зона)
не превышала
12°С. Инкубационные
эксперименты
с
торфяными
образцами проводились при варьировании значений температуры и рН среды,
что позволило изз^чить одновременное влияние двух нетрофических факторов на
трофические микробные взаимодействия в метаногенном сообществе кислого
болота. Исследования образования метана в нативных торфяных образцах
показало, что наивысшая скорость меганогенеза наблюдалась при рН 5.0 - 5.5,
что
указывало
на
прнсзтствие
в
исследуемой
экосистеме
умеренно
ацидофильного метаногенного сообщества. Однако, инкубирование тех же
образцов с более высоким рН в течение длительного времени способствовало
развитию нейтрофильных метаногенов, очевидно, находившихся в минорном
количестве. Температурный оптимум для функционирования сообщества был
установлен при 20 - 2 5 ^ . При температуре 35°С и выше метаногенез не
происходил.
1.4.1.
Основные
микробные
группы
ацидофильного
метаногенного
сообщества.
Для проведения экспериментов по динамики потребления различных
субстратов были использованы образцы торфа из кислого болота с рН 4.8, к
которым в соотношении 1:10 добавлялась разведенная в 100 раз среда Пфеннига.
Образцы инкубировались в диапазоне температур от Г до 30°С. Контролем
служили разбавленные образцы без субстрата.
Было установлено, что использование целлюлозы в качестве субстрата
лишь незначительно увеличивает количество промежуточных продуктов по
34
сравнению с контрольным экспериментом и лишь при умеренных температурах
(20°С и выше). Основными соединениями, накопившимися в системе при 30°С,
были, главным образом, ацетат, а также пропионат и бутират в соотношении
22:3:1. При понижении температуры инкубации доля ацетата среди других Л Ж К
заметно уменьшалась, и при 10°С вьппеу помянутое соотношение Л Ж К было
11:2,3:1. При температуре ниже 10°С заметной деградации целлюлозы не
наблюдалось по крайней мере в течение года. Образование метана происходило
во
всем
температурном
диапазоне,
сильно
замедляясь
при
понижении
температуры.
Резкое повышение микробной активности наблюдалось при использовании
глюкозы. В процессе потребления этого субстрата ацетат, бутират, пропионат, а
при 30°С и этанол, детектировались в качестве основных, накопившихся в
системе продуктов. Необходимо отметить, что именно при ЗСС количество и
концентрация метаболитов в инкубируемых образцах были самыми высокими,
что свидетельствует о дисбалансе в ми1фобном сообществе, развивающемся при
не оптимальной температуре. Накопившиеся на стадии ацидогенеза Л Ж К не
потреблялись
в системе в течение нескольких месяцев при умеренных
температурах и по крайней мере в течение года при 10°С и ниже. Таким образом,
было установлено, что найденные закономерности развития
анаэробного
сообщества кислого болота, такие как медленный гидролиз органического
вещества,
быстрый
ацидогенез
и
в
значительной
степени
подавленное
синтрофное разложение Л Ж К оказались сходны с основными особенностями
развития сообществ из других выше рассмотренных холодных экосистем и с их
откликом на понижение температуры. Аналогично анаэробному сообществу
почвы тундры микробное сообщество кислого болота характеризуется низкой
начальной численностью микроорганизмов и их медленным ростом, что
приводит
к
длительным
лаг-периодам
при
деградации
субстратов
в
разбавленных образцах.
Было
показано,
ацидофильного
что
основная
ми1фобного
специфика
сообщества
в
регуляции
проявляется
в
умеренно-
трофических
взаимоотношениях микробных групп, участвующих в метаболизме водорода.
Источником
водорода
были
микробные
процессы
на
гидролитической,
сахаролитической и синтрофной стадиях. Добавление формиата к болотным
35
образцам приводило к его быстрому разложению на эквимолярные количества
Нг и СОз как при умеренных, так и при пониженных температурах, что не
наблюдалось при развитии анаэробного сообщества из нейтральных экосистем.
Главным
отличием
пониженного
рН
при развитии метаногенного
явилось
резкое
сообщеста
снижение
в
условиях
конкурентоспособности
гидрогенотрофных гомоацетогснов, и повышение роли гидрогенотрофных
метаногенов
в
качестве
терминальной
микробной
группы
сообщества.
Использование газовой смеси Н2+СО2 при температуре 20°С и рН 6,2
происходило в течение 10 суток в процессе гомоацетогенеза (Рис. 9). Второй
фазой был медленный ацетокластический метаногенез. Такая двухфазность
микробных процессов при разложении субстратов - источников водорода была
характерна
для
всех
описанных
выше
низкотемпературных
экосистем.
Принципиальная разница наблюдалась в способности микробного сообщества
сфагнового болота к метаногенезу при рН ниже 5,0, в то время как это значение
рН было нижним пределом для образования CHi в изученных нейтральных
экосистемах. При рН 4,5 потребление H j и СОг ацидофршьным сообществом
протекало почти в течение 3 месяцев с преимущественным образованием метана
(Рис. 10).
При добавлении метанола в качестве субстрата к разбавленным образцам
метаногенез начинался после длительной лаг-фазы (6 месяцев при 10°С), что
свидетельствовало о низкой численности Срметаногенов и указывало на их
подчиненную роль в сообществе. При добавлении тримстиламина метаногенез
не происходил.
Таким образом, было показано, что основной особенностью трофической
цепи формирующегося метаногенного сообщества из Западно-Сибирского
кииюго болота является снижение конкурентоспособности
гомоацетатных
бактерий при пониженных рН, гидрогенотрофные метаногены становятся
наиболее
важной
терминальной
группой
в
ацидофильном
анаэробном
сообществе. В целом, необходимо отметить, что метаногенные сообщества из
различных низкотемпературных экосистем имеют одни и те же основные
особенности функционирования и сходный отклик на температурные изменеття.
Снижение
рН
приводит
прежде
всего
к
изменениям
в
трофических
взаимоотношениях терминальных микробных групп. В то же время в реальных
36
Рис. 9. Потребление водорода и COj микробным сообществом кислого болота при
температуре 20°С с преимущественным образованием ацетата при рН 6Д. 1 - СОг;
2 - Hj; 3 - ацетат; 4 - метан.
*
^
8
Рис. 10. Потребление водорода и СОг микробным сообшеством кислого болота при
температуре 20'*С с преимущественным образованием метана при рН 4,5.1 - COi;
2 - Иг; 3 - ацетат; 4 - метан.
37
условиях
метаногениое
сообщество
может
также
находится
под
дополнительным влиянием иных факторов различной природы, которые могут
усиливать или нивелировать специфические отклики сообщества, описанные
выше.
Цикл СН4 в холодных и кислых условиях, включающий метаногенов и
метанотрофов,
может
оказаться
рассогласованным.
Работа
анаэробного
сообщества может останавливаться на стадии продукции Нг и Л Ж К
с
замыканием цикла психрофильными и ацидофильными органотрофами и Нг используюищми
аэробами.
При
медленной
продукции
CUt
активность
метанокисляющего фильтра (Омельченко и др., 1992; Dedysh et al., 1998) может
оказаться достаточной для предотвращения эмиссии в атмосферу.
1.4.2. Пути метаногенеза в образцах кислого болота и его зависимость от рН
и температуры.
Эксперименты
с
нативными
образцами
кислого
торфяного
болота
проводились с целью изучения основных биохимических путей образования
метана и определения степени их зависимости от рН и температуры. Предстояло
также выяснить существуют ли пршпдапиальные отличия в функционировании
сбалансированного
метаногещюго
сообщества
в
природных
образцах
и
развивающегося сообщества, сильно разбавленного минеральной средой при
избытке субстрата. В исследовании были применены три независимых метода:
введение в систему ингибиторов метаногенеза, использование радиоактивно
меченных субстратов метаногенов и измерение соотнощения
стабильных
изотопов в молекуле метана, образующегося в исследуемой системе (Comad and
Юозе, 2000; Fey and Conrad, 2000; Glissman et al., 2004). Принцип первого метода
состоял в намеренном блокировании микробного образования метана для
изучения состава выделяющихся в среду метаболитов и последующего расчета
углеродного баланса. Второй метод заключался во введении в систему следовых
концентраций изучаемых метаногенных субстратов (ацетата и СОг) с целью
изучения их потребления по измерению радиоактивности. Теоретическая основа
третьего метода - изменение в фракционировании стабильных изотопов метана
при разных биохимических путях его образования.
38
Добавление 2-бромэтансульфоната и фторацетата как ингибиторов общего
и ацетокластического метаногенеза к нативным образцам, имеющим рН 4,8,
привело к накоплению в конце инкубирования различных продуктов, главным из
которых являлись Л Ж К
и ряд ароматических соединишй
(фенилацетат,
фенилпропионат, м-ОН-фенилацетат, 4-ОН-фенилэтанол). В то же время в
контрольной системе без ингибиторов наблюдалось образование метана и СОг
как
единственных
конечных
продуктов
работы
сообщества.
Отсутствие
промежуточных метаболитов свидетельствует о сбалансированности нативного
метаногенного сообщества. При расчете количеств метана, образовавшегося по
ацетокластическому или водород-зависимому пути, исходили из предположения,
что все промежуточные соединения, накопившиеся в системе в результате
добавления
ингибиторов,
деградировались
в
процессе
метаногенеза
в
контрольной системе по соответствующим биохимическим реакциям до ацетата,
водорода и СОг. Расчеты эквивалентных количеств метана, которые могли
образоваться из вышеназванных субстратов, показали, что образование СН4 из
ацетата составляло 62 - 72% от общего метаногенеза и не зависело от
температуры.
Рис. и . Доля метана (f(H2))i образованного из Hj/COj в образцах сфагнового
болота при 15°С и различных рН. (1 - рН 3,8; 2 - рН 4,8; 3 - рН 6,0).
39
Преобладание ацетокластического метаногенеза в нативных образцах торфяного
болота было также показано в экспериментах с добавлением в систему
радиоактивно
меченных
субстратов;
Na-P-'^CJaqeraTa
и
NaH'^COs.
Инкубирование проводили в интервале температур 4 - 25''С, и во всех
экспериментах был обнаружен радиоактивный метан. Скорости потребления
ацетата, которые расчитывались по скорости накопления радиоактивного СИ»,
снижались примерно в 1,5 и 9 раз при понижении температуры с 25° до 15°С и
4''С
соответственно.
водородному
Однако,
соотношение
и ацетокластическому
СН4,
образовавшегося
по
путям, не зависело от температуры.
Коэффициент fm, показываюпщй долю метана, образовавшегося из Нг и СОг,
был определен в экспериментах с радиоактивно-меченным бикарбонатом и
составлял 0,35 - 0,43 (Рис. И ) . Сходные с вышеописанными закономерности в
образовании метана в болотных образцах обнаруживались при повышении рН до
6,0. Было установлено, что кардинальные изменения в путях метаногенеза
происходили при понижении рН до 3,8 (Рис. 11). В этом случае коэффициент fm
составлял 0,95, что означало доминирование водород-зависимого метаногенеза в
системе. Однако, его скорость была примерно на порядок ниже, чем в образцах с
более высокими рН (4,8 и 6,0).
Выводы о преобладании Нг-метаногенеза при понижении рН
были
подтверждены в экспериментах со стабильными изотопами углерода. Бьшо
показано, что величина рН оказывала сильное влияние па фракционирование " С
при
образовании
метана
в
болотных
образцах
Как
в
лабораторных
экспериментах, так и по данным полевых измерений обнаруживается очевидная
тенденция к увеличению фракционирования изотопов углерода в молекуле
метана при понижении рН с 6,0 до 3,8 (Рис. 12) и, следовательно, к
преобладанию водородного метаногенеза. При самых низких значениях рН доля
СН4, образовавшегося по Нг-зависимому пути, резко возрастала.
Таким образом, эксперименты с нативными образцами кислого болота
подтвердили
основные
закономерности,
выявленные
нами
ранее
при
исследовании развивающегося метаногенного сообщества. Главный вывод,
полученный при исследовании сообщества сфагнового болота - увеличение роли
водород-зависимого метаногенеза при понижении рН. Было показано, что если
40
-50,00
-55,00
г
li
ю
рН
;|
т
3,5
-60,00
5
4.5_
4
-65,00
4"
-70,00
•
•
--♦-—•"б"
•
0
-75,00
-80,00
-85,00
•
-90,00
• Лабораторные измерения
Рис. 12. Значения S
образцами сфагнового
в
Л-
6
-■г
—
-
•
-95,00
_5^5
О измерения in situ
С-СН4, полученные в лабораторных экспериментах с
болота, имеющими различный рН, и в
полевых
нзмерениах.
при рН 4,8 и 6,0 в болотных образцах метан образуется через ацетат и Н2+СО2 в
примерном процентном соотношении 60:40, то при понижении рН до 3.8 доля
метана из Нг и СОг возрастает до 95%. В то же время сбалансированное
сообщество, в отличие от развивающегося, демонстрирует пониженную реакцию
на изменения исследованных внешних факторов (температуры и рН) благодаря
установившимся
трофическим
микробным
взаимодействиям,
играющим
компенсаторную роль. Так температурная зависимость образования метана из
ацетата или Н2+СО2 отсутствовала при исследовании нативных образцов, но
четко обнаруживалась в экспериментах с разбавленными болотными пробами.
1.4.3. Состав групп архей в анаэробном сообществе кислого болота.
Филогенетическое исследование биоразнообразия архей в микробном
сообществе кислого болота проводили с целью определения влияние рН и
температуры на состав групп микробного сообщества, ответственных за
41
образование метана. Дтя этого бьиа выделена ДНК из образцов, отобранных из
четырех различных мест, характеризующихся преобладанием различных типов
растительных
сообществ.
Проба
1
бьша
отобрана
под
растительным
сообществом с преобладанием Equisetum (рН 4,8), проба 2 - под сообществом с
преобладанием Сагех (рН 4,2), проба 3 - под сообществом с преобладанием
Menyantes (рН 4,45), проба 4 - под смешанным растительным сообществом (рН
4,45) Архейные гены, кодирующие фрагменты малой субъединицы р-РНК
анализировались методом T-RFLP. Терминальные фрагменты, полученные после
специфической рестршщии ДНК определенной длины в 83, 91,120, 160,185, 392
и более 700 пар нуклеотидов были обнаружены во всех образцах. Для того,
чтобы
определить
каким
археиным
группам
COOTBCTCTBJTOT
полученные
фрагменты была создана библиотека клонов для пробы №4, отличавшейся
наибольшим разнообразием полученных T-RF фрагме1ггов. Установлено, что
основными архейными группами, присутствующими во всех четырех образцах
были: Methanomicrobiaceae, Methanosarcinaceae, Methanobacteriaceae, а также
RC-n,rV,V,VI группы, обнаруженные ранее при исследовании рисовников в
работах Р.Конрада с соавтороами.
Отклик архейного сообщества на изменение рН был изучен в образцах с
Equisetum, в качестве доминирующего компонента растительного сообщества,
где были зарегистрированы наивысшие скорости метаногенеза. Основным
различием в составе архей, присутствующих в исследуемых образцах, являлось
появление на T-RFLP хроматограмме образца с рН 3,8, инкубированного при
15°С,
четкого
пика,
соответствующего
Methanobacteriaceae, что
является
гидрогенотрофному
микробиологическим
семейству
цод1верждением
повышения роли водород-зависимого метаногенеза при понижении рН (Рис. 13).
Количественное
соотношение
двух
других
доминантных
метаногенных
семейств: Methanomicrobiaceae и Methanosarcianceae не зависело от рН. Состав
архейного сообщества в образцах, инкубированных при разных температурах
(4°, 15" и 25°С), также не обнаруживал существенного различия. Метаногены
рода Methanosaeta не бьши обнаружены в исследуемых образцах кислого болота,
что
свидетельствовало
о
вовлечении
только
ацетокластический метаногенез в данной экосистеме.
42
рода
Methanosarcina
в
Таким образом, анализ архейного компонента сообщества кислых болот
подтверждает
обнаруженную
в
кинетических
и
биогеохимических
исследованиях тенденцию к увеличению роли Нг-зависимого метаногенеза
15°С,рНб.О
4000.
. Methanomicrobiaceae
Methanospirillum
Methanosarcinaceae
эоео.
RCIV
eowj
/
/
10CW.
fl,.
Crenarchaeota
У
/ \
-.^Sm^-f^-*-.
50
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 600 650
15°C,pH4.8
50
100 150 200 250 300 350 400 460 500 550 600 650 700 750 800 850
I
1
■
15»C,pH3.8
60
100 ISO год 250 300 350 400 460 SQO 860 600 650 70U 750 8Й0 850
toooj
Methanobacteriaceae
^^
iBoo;
180U.
see'
40o;
L
. л .1
0
50
■
Рис.
j
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 660 700 760 800 850
■
■
■
13. T-RFLP
■
■
■
■
■
'
■
■
■
■
■
I
хроматограмма фрагментов архейного SSU рРНК
I
— .
гена,
амплифицированных из ДНК, полученной из болотных образцов с разным рН и
инкубированных при 15°С.
при понижении рН. Установлено, что гидрогенотрофные
метаногены в
изученном кислом болоте представлены, главным образом, семействами
43
Methanomicrobiaceae и Methanobacteriacea. Ацетокластический метаногенез
осуществляет род Methanosarcina.
1.4.4.
Количественный
анализ
микробного
сообщества
популяций
эубактерий и архей и их распределение по профилю болота.
Для проведения количественной оценки микробных популяций применялся
метод in situ-гибридизации (FISH). Метод основан на детекции определенных
групп
микроорганизмов
посредством
специфического
флуоресцентно-меченных олигонуклеотидных зондов с
связывания
168-субъединицами
рибосомальной РНК. Задачей исследования являлось определение соотношения
эубактерий и архей в торфяных образцах кислого болота, отобранных на
различной глубине, а также идентификация на уровне семейства метаногенов,
обнаруженных ранее T-RFLP методом. In situ-гибридизация бьиа проведена с
экстрагированными из торфяных образцов микробными клетками. Экстракция
клеток из торфяных образцов осуществлялась последовательно дважды с
использованием бумажного фильтра (Dedysh et al., 2001). Полученные фракции
смешивали и использовали для дальнейшего анализа. Контрольная оценка
эффективности экстракции с помощью подсчета клеток, окрашенных ДАЛИ
показала, что происходило извлечение 85 - 90% от общего количества клеток.
Далее к экстрагированному клеточному материалу добавлялись различные
специфические олигонуклеотидные зонды: ЕиЬ338 (бактерии), Агс344 + Агс915
(архей), MS821 (род Methanosarcina), М В З Ю (род Methanobacterium), MG1200
(семейство
Methanomicrobiaceae).
FISH-анализ
показал
существенное
уменьшение числа эубактериальных клеток в образцах торфа с увеличением
глубины
их
отбора
и,
соответственно,
с
уменьшением
окислительно-
восстановительного потенциала (Рис. 14). На глубине 50 см количество клеток
эубактерий снижалось почти в 5 раз по сравнению с верхним аэробным слоем. В
то же время, число клеток архей практически не изменялось на разных глубинах.
Количество
клеток
составляло 40-50 %
рода
Methanosarcina,
определенных
FISH-методом
от численности всех архей. Микроорганизмы рода
Methanobacterium также обнаруживались в образцах, но их количество не
превышало
5%
от
всех
архейных
44
клеток.
Представители
семейства
Methanomicrobiaceae не были обнаружены, несмотря на их наличие в микробном
сообществе, установленное другими молекулярно-биологическим методами.
Число клеток (х 10 )/г торфа
1
10
100
-О- Eubacteria ■ - Archaea - - Methanosarclna
Рис. 14. Вертикальный профиль количества клеток эубакгерий и архей,
детектированных методом F I S H в торфяных образцах. Зонды, использованные
для идентификации: Bacteria (ЕпЬЗЗв), Archaea (Arc344+At4^1S), Methanosarcina
sp. (MS821).
Таким образом, FISH-анализ показал, что численность эубакгерий в
торфяных образцах существенно снижается при переходе от аэробных к
анаэробным условиям, тогда как численность архей практически не меняется. В
анаэробном слое численность архей, основную долю которых составляют
метаногены, лишь в 3 раза ниже, чем эубакгерий. Это подтверждает ранее
сделанный вывод о накоплении активной биомассы метаногенов как о
необходимом этапе для установления баланса в трофических микробных
взаимодействиях в анаэробном сообществе. Получено прямое микроскопическое
подтверждение высокой доли микроорганизмов рода Methanosarcina среди
других архей, что указывает на активное участие метаносарцин в образовании
метана в кислых болотах. Важной особенностью метаносарцин является их
трофический универсализм: в отличие от других метаногенов они способны к
адаигации к Нг, Сг и Cj субстратам.
45
2. Ключевые микробные взаимодействия в психроактивном метаиогенном
сообществе.
В
рассмотренных
примерах метаногенных
сообществ
из различных
экосистем было показано, что измене1П1Я температуры (также как и рН)
приводят
к
перестройке трофических
взаимодействий
микробных
групп
метаногенного сообщества. Наиболее важными микробными взаимодействиями,
определяющими результат работы психроакгивного
синтофные
взаимоотношения
и
конкуренция
сообщества, являются
между
гомоацстатными
бактериями и метаногенными археями.
2.1.
Термодинамический
анализ
сивтрофвыг
взаимодействий
в
метаиогенном сообществе при низкой температуре.
Нами бьшо установлено, что осуществление синтрофных реакций является
одним из узких мест в работе анаэробного сообщества, развивающегося при
пониженной температуре. Известно, что термодинамически благоприятные
условия
для
прохождения
реакции
разложения
жирных
кислот
могут
достигаться при значительном снижении концентрации продуктов, и главным
образом водорода (Stams, 1994; Schink, 1997). Эксперименты с развивающимися
микробными сообществами показали, что психроактивные
гомоацетогены
активно потребляют Нг при его избытке в системе. Тем не менее, прохождение
синтрофных реакций потребления жирных кислот при пониженной температуре
всегда сопровождалось метаногенезом.
При разложении целлюлозы мшфофлорой прудовых осадков следовые
концентрации водорода были обнаружены на 10-е и 65-е сутки процесса (Рис. 3),
соответствуя в первом случае гидролитической
стадии, протекающей с
накоплением в системе различных Л Ж К , а во втором - началу стадии их
синтрофного разложения. В течение синтрофной стадии было зафиксировано
увеличение скорости метаногенеза и падение уровня Нг ниже 10 р.р.т. (1 Ра).
Значительно более высокие пороговые концентрации водорода (50-100 р.р.т.)
обнаруживались при разложении крахмала и моносахаридов в температурном
интервале 6-15°С, когда понижение рН до 4,0-4,5 в результате накопления
различных кислых продуктов препятствовало прохождению метаногенеза, и
разложения жирных кислот не происходило.
46
Аналогичные закономерности наблюдались при исследовании сбраживания
навоза К Р С . Бутират,
закваской,
образовавшийся
потреблялся
при
в системе с
концентрации
низкотемпературной
водорода
ниже
10
р.р.т.
одновременно с интенсивным образованием метана. В системе без закваски, в
отсутствии метаногенеза бутират не потреблялся, а концентрация водорода
долгое время находилась на уровне 100-140 р.р.т. (10-14 Ра), характерном для
гомоацетатных бактерий (Рис. 2) (Conrad and Wetter, 1994).
Разложение бутирата микрофлорой почвы тундры при 15° С начиналось
только через 150 суток, когда концентрация водорода в системе снизилась с 90100 р.р.т. до уровня ниже 10 р.р.т. (Рис. 6). Заметное повышение скорости
образования СН4 в этом случае также указывало на определяющую роль
метаногенов в инициации данной синтрофной реакции.
Термодинамический анализ условий прохождения синтрофной стадии
разложения Л Ж К был проведен для трех вышеописанных нейтральных систем.
Предстояло
оценить
возможность
участия
гомоацетатных
бактерий
и
метаногенных архей в сишрофных реакциях при низкой температуре. Значения
энергии Гиббса (ДО) для реакций образования метана и ацетата из Нг и COi
были вычислены по уравнениям 1 и 2, учитывающим зависимость ДО и Д0°
(стандартная энергия Гиббса) от температуры. В расчетах использовались
необходимые термодинамические константы вышеназванных биохимических
реакций (Табл. 2), а также данные по реальным условиям в исследуемых
системах и концентрагщям метаболитов в нативных образцах (Табл. 3).
Д0 = Д0'' + КТ1пд
(1)
Д0'' = ДН°-ТД8°
(2),
где Q - константа равновесия между реагентами и продуктами реаккции (Conrad
and Wetter, 1994).
Результаты вычислений показали, что понижение температуры оказывает
положительное
влияние
на
термодинамику
как
метаногенеза,
так
и
гомоацетогенеза. Однако, в сочетании с синтрофными реакциями разложения
ЛЖК,
отрицательные
значения
ДО,
достаточные
для
осуществления
межвидового переноса водорода (Schink, 1997), способны поддерживать только
47
гидрогенотрофтпле метаногены (Табл. 4) иловых осадков пруда-отстойника и
тундровой
почвы.
отсутствие
накопления
нативными
образцами
метаногенеза.
При
Это
подтверждается
пропионата
из
и
экспериментально
бутирата
вьппеназванных
сбраживании
навоза
в
объясняет
контрольных
экосистем
КРС,
и
при
системы
опытах
с
прохождении
перегруженной
Таблица 2. Значения энтальпий, энтропии и свободных энергий Гиббса для
различных Нг-метаболнческих реакций в стандартных условиях (1 М ; 1 bar). A G " '
= A G " + mRTlii[10''] с продукцией m l T .
ДН"
AS"
(кДж/моль)
(Дж/моль°С)
-253,0
-410Д
-130,7
-130,7
-270,7
-723,2
-55.0
-95,0
СНзСНгСОО' + гНгО = CHjCOO" + СО2 + ЗН2
205,1
447,0
71,7
71,7
СНзСНгСНгСОО' + гНгО = 2СНзСОО" + Г Г + гНг
135 6
159,0
88,2
48,3
Реакция
Ш'
Ш"
(кДж/моль) (кДж/моль)
Метаногенез:
4Hj + C02 = CH4 + 2H20
Ацетогенез:
4Н2 + 2С02 - CHjCOO" + Н* + гНгО
Разложение Л Ж К .
Таблица 3. Условия и концентрации различных метаболитов в образцах из
различных экосистем.
Навоз КРС
Условия и метаболиты
(акклимированная
закваска, 35 сут)
Ацетат (мМ)
Иловые осадки прудаотстойника
Тундровая почва
22,0
0,113
0,100
Протаюнат (мМ)
7,3
7Л X 10"^
8,4X Ю '
Бутират (мМ)
2,6
5,0 X 10-'
3,6 X 10"'
СОгСРа)
2,19x10*
3,3 X 10'
5,0 X lO'
СН4(Ра)
2,70 X Ю*
120
158
6
б
6
6,5
6,8
6,1
Температура (°С)
рН
48
Т а б л и ц а 4. Э н е р г е т и ч е с к и й в ы х о д с и н т р о ф н ы х р е а к ц и й р а з л о ж е н и я пропионата и
б у т и р а т а п р и у ч а с т и и водород-использующих ацетогенов ( Д С ( А ) ) и метаногенов
( A G ( M ) ) и к о н ц е н т р а ц и я х метаболитов in situ.
Навоз К Р С
Реакция
Разложение
дц^д^
(кДж/моль Нг)
пропионата
Разложение
бутирата
И л пруда-отстойника
Тушфовая почва
дц^^
дд^д^
дд^1^
дд^д^
др^^
(кДж/моль Hi) (кДж/моль Нг) ДАюль Н г) (кДж/моль Н ; (кДж/моль Нг)
15,8
-2,5
11,9
-8,8
13,1
-9,0
10,3
-2,0
-3,8
-17,6
1,0
-13,8
о р г а н и ч е с к и м в е щ е с т в о м , значение д о с т у п н о й э н е р г и и д л я с и н т р о ф н ы х реакций
п р и метаногенезе оказалось
близким к п у л ю , и разложение
пропионата
и
бутирата было затруднено (Рис. 1).
Таким образом, низкая концентрация Нг в системе - главное условие
сбалансированной работы психрофильного метаногенного сообщества. Низкая
скорость
ги.1фолиза
первичного
органического
вещества
способствует
накоплению метаногенов, которые снижают парциальное давление водорода до
недоступного
для
гомоацетогенов
уровня и
обеспечивают
условия для
прохождения синтрофных реакций. Поступление в анаэробную систему избытка
легкодеградируемых органических соединений способствует развитию быстро
растущих водород-потребляющих
гомоацетатных бактерий и накоплению
различных жирных кислот.
2.2. Конкуренция за водород между психроактявнымн гомоацетатными
бактериями и метаногеннымн археями.
Выводы, изложенные выше, получили дополнительное подтверждение при
исследовании
конкуренции
между
гомоацетатными
бактериями
и
метанобразующими археями на уровне чистых культур [19]. Была изучена
динамика потребления низких концентраций водорода (1,5%) в отсутствие роста
психроактивным гомоацетогеном Acetobacterhan bakii и метаногенами родов
Methanobacterium (штамм
MSB)
и
Methanocorpusculum (штамм
MSP),
выделенными из одной и той же экосистемы - иловых осадков таежного пруда
(см. Раздел 3). Было обнаружено, что все микроорганизмы потребляли водород
49
до определенных пороговых значений, Гфичем метаногены, имеющие более
высокое сродство к водороду, до уровня в 100 раз более 1Шзкого, чем
гомоацетогены.
Пороговые
концентрации
снижались
при
понижении
температуры как для гомоацетатных бактерий, так и для метаногенных архей
(Рис.
15), что
полностью
соответствовало
термодинамике
протекающих
биохимических реакций (Табл. 2). Однако, такая ситуация наблюдалась в
интервале температур 15° - ЗО'С. При дальнейшем понижении температуры
пороги потребления водорода для двух исследовашплх метаногенов оказались
существенно различными. Для щтамма MSP пороговое парциальное давление H j
резко повышалось и при 10°С оказалось сравнимо с величиной, характерной для
психроакхивных гомоацетогенов, а при 4°С намного превысило эту величину
(Рис. 15, кривая 2).
Такое резкое повышение пороговых концентраций водорода коррелировало
с нижним температурным пределом роста (4"С) для штамма MSP, и очевидно
1000
0,1
-1
1
р
1
1
г
5
10
15
20
25
30
35
Температура, °С
Рис. 15. Пороговые парциальные давления водорода для культур психроактивных
микроор! анизмов. 1 - Acetobacterium bakii; 1 - Methanocorpusculum штамм MSP; 3 Melhanobacterium штамм MSB.
являлось следствием неблагоприятных для него условий развития. Пороговые
парциальные давления водорода для штамма M S B , имеющего более низкий
температурный предел роста ( Г С ) , находились на постоянно низком уровне во
всем интервале температур от 4° до 30°С.
50
Таблица 5. Значения Vm„ и Кш, полученные при потреблении H i гомоацетогеном
А. bakii и метаногенными штаммами MSB в MSP при разных температурах.
Methanobacterium Methanocorpusculum
Acetobacterium bakii
Температура
Кщ
(нмоль h'') (Pa)
(нмоль h'')
(Pa)
(нмольЬ'') (Pa)
4
270±30
190±30
110±10
50±10
80±35
10
440±50
180110
320±10
70±5
180 + 50
15
590±50
300±40
470±70
110±20
240±40
20
740 ±100
400 ±40
540 ±90
130 ±30
320 ±30
170 ±20
25
790 ±90
480180
590150
140 ±20
320 ±20
190 ±20
30
760 ±60
520IJO
560160
]60120
360140
При
Kfli
Штамм MSP
Vmax
fC)
Vmax
Штамм MSB
исследовании
метаногенами
и
кинетики
гомоацетатной
'inax
потребления
бактерией
Hi
были
лщ
640±180
300±70
160 + 30
190130
психроакгивными
также
определены
максимальные скорости этого процесса (V„ax) и константы Михаэлиса (К„)
(Табл. 5). Было показано, что оба параметра зависят от температуры и имеют
более высокие значения для гомоацетогена. На
основании полученных
кинетических параметров (Vnax, Km, Рцг порог.) и использовании уравнения
Михаэлиса-Ментен
была
создана
модель,
которая
описывает
результат
конкуренции за водород между указанными выше микроорганизмами. Для
оценки
конкурентоспособности
изученных
мюфоорганизмов
был
введен
1фитерий Ксотр, который и был рассчитан на единицу биомассы согласно
скоростям потребления Нг по формуле :
Kcomp = (Vl-V2)/(Vi+V2),
где V] и V2 - скорости потребления Нг конкурирующими ми1фоорганизмами.
Построенная модель предсказывает два основных сценария микробнь^х
взаимодействий. В случае наличия в сообществе хорошо адаптированных к
низким температурам метаногенов, они будут основными Нг-использующими
микроорганизмами при накоплении достаточной биомассы и отсутствия в
системе мощного источника водорода. При его наличии гомоацетогены
51
выигрывают конкуренцию за водород за счёт более высокой скорости роста (или
скорости использования Нг,
на основании которой
30
создавалась модель).
iglHJ.Pa
.1
Рис. 16. Преимущественное образование ацетата при конкуренции за водород
между гомоацетогеном A.bakii и метаногеном Methanobacterium штамм M S B в
зависимости от температуры и парциального давления Hj. Зона I
- нет
потребления H j ; Зона I I - Неконкурентное потребление Hi штаммом M S B ; Зона Ш
Пренмушествеиное
протребление
Нг
штаммом
MSB;
Зона
IV
Преимущественное потребление W.2 A.bakii.
Примером такого сценария являются конкурентные отношения между A.bakii и
метаногенного штамма M S B (Рис. 16). Метаногены способны неконкурентно
потреблять водород при его концентрации 1-10 Ра (Рис.
Конкурентные
отношения за Н^ между
16, зона П).
метанобразующими
археями
и
гомоацетатными бактериями при низкой температуре возникают в диапазоне
концентраций 100-1000 Ра (зона Ш), выше которой гомоацетогены становятся
основными водород-использующими микроорганизмами (Рис. 16, зона ГУ).
Второй сценарий микробных взаимодействий рассматривает вариант наличия
плохо адаптированных к низким температурам метаногенов (конкуренция между
A.bakii и MSP штаммом) (Рис.17). В этом случае вышеописанная ситуация
реализуегся только при умеренных температурах (выше 15''С). При температуре
ниже 15°С гомоацетатные бактерии выплывают конкуренцию за водород у
метаногенов при любых доступных обеим микробным группам концентрациях
52
Нг (Рис.17, зона I V и V ) . Такие сценарии, в зависимости от конкретных условий
в системе могут являться основными или реализовываться временно.
10
Temperature,
IfltHJ.Pa
Рис. 17. Преимущественное образование ацетата при конкуренции за водород
между гомоацетогеном A.bakii и метаногеиом Methanocorpusculum штамм MSP
взависимости от температуры и парциального давления Hj. Зона I - нет
потребления Нг; Зона П - Неконкуреитиое потребление Hj штаммом MSP; Зона I I I
- Преимушественное протребление Нг штаммом MSP; Зона IV- Преимущественное
потребление Нг A.bakii; Зона V - Неконкурентное потребление Н} A.bakii.
Таким
температуре
образом,
зависит
сбалансированная
от
накопления
работа
в
сообщества
системе
при
низкой
психроактнвных
гидрогенотрофных метаногенов. Кинетический и термодинамический анализ
микробных взаимодействий показал, что результат конкуренции за Н2 между
метаногенами и гомоацетогенами определяется скоростью роста и сродством к
субстрату.
3.
Психоактивные
анаэробные
микроорганизмы
из
различных
низкой
температуре,
низкотемпературных экосистем.
Анаэробные
микроорганизмы,
растущие
при
представляют собой технически трудную для работы микробную группу
вследствие низкой скорости их роста и высокой чувствительности даже к
53
следовым концентрациям кислорода. К настоящему времени их количество
среди
известных
микроорганизмов
очень
незначительно,
несмотря
на
исключительно важную экологическую роль психроактивных анаэробов в
процессах деградации органического вещества в различных
экосистемах
(Gounot, 1999).
Из холодных мест обитания, в том числе рассмотренных в предыдущих
разделах,
нами
были
выделены
12
анаэробных
микроорганизмов,
принадлежащих к различным трофическим группам и способных к росту при
низких температурах (Табл. 6). Ниже представлена их краткая характеристика.
3.1. Сахаролитические бактерии.
Два
сахаролитических
микроорганизма,
принадлежа1цие
к
родам
Clostridium и Ruminococcus, были выделены из сброженного при низкой
температуре навоза КРС и низового подмосковного болота Абрамцево, и далее
были описаны как новые виды вышеназванных родов: C.fimetarium [9] и
Rpalustris [8] (Табл. 6). Последний, на основании анализа последовательноеги
16S-pPHK гена был позднее отнесен к роду Trichococcus с тем же видовым
названием (Liu et al., 2002).
Clostridium flmetarium sp.nov.
(Коцюрбенко
и
др.,
1995).
Клетки
представляют собой прямые или слегка изогнутые тонкие палочки размером 0,5
- 0,6 X 2,1 - 5,0 мкм, одиночные или собранные в цепочки до 10 клеток. Организм
обладает подвижностью благодаря перетрихиально расположенным жгутикам.
Олигоспоровый, Психроактивный микроорганизм и нейтрофил, растущий в
щироком температурном диапазоне, от Г С до ЗО'С с оптимумом при 20-25° и в
интервале рН 5,5 - 8,3 (оптимум 6,8). Строгий анаэроб. Потребляет ряд
моносахаров, а также целлобиозу и пектин. Сбраживает глюкозу с образованием
ацетата, этанола, лактата, формита, Нг и СОг Содержание Г+Ц оснований
геномной ДНК - 35,6 мол.%. Основной компонент липидного состава клеточной
стенки - насыщенная жирная кислота С ^ о- Организм отличается от других видов
рода
по
совокупности
физиологических,
морфологических
и
геномных
характеристик. Типовой штамм - Z-2189 ( D S M 9179).
Trichococcus palustris
sp.nov.
(Жилина
и
др.,
1995).
Представлен
кокковидными или слегко овальными клетками с приостренными концами,
54
размером 0,75-1,3 х 0,7-1 мкм. Клетки одшючные, в парах, иногда в коротких
цепочках. Сгрогий анаэроб и нейтрофил, растущий диапазоне рН 6,2 - 8,4
(оптимум 7,5). Психроактивный микроорганизм. Растет в температурном
интервале от 1°С до 33°С с оптимумом при 30°. Потребляет различные сахара и
ряд других соединений. Сбраживает глюкозу с образованием лактата, ацетата,
этанола, формиата и изо-бутирата. Содержание Г+Ц оснований геномной ДНК
составляет 47,5 мол.%. Основными компонентами липидного состава клеточной
стенки являются мононенасыщенные жирные кислоты Ci^ 1д9 и Cig 1д9, а также
насыщенная жирная кислота Ci4 о- Типовой штамм - Z-7189 (DSM 9172).
Потребляемые вышеописанными сахаролитическими микроорганизмами
соединения в анаэробном сообщестае являются характерными субстратами для
последующих микробных групп трофической цепи и могут разлагаться либо в
сигггрофных реакциях, либо использоваться гомоацетатными бактериями или
метаиобразующими
археями.
Оба
сахаролитических
микроорганизма
демонстрировали высокую скорость роста при низкой температуре, что
указывает
на их
принадлежность
к зимогенной микрофлоре в составе
психроактивного анаэробного сообщества.
3.2. Гомоацетатные бактерии.
Гомоацетатные
бактерии
являются
одними
из
наиболее
типичных
микроорганизмов в составе анаэробного сообщества, развивающегося при
низкой температуре. В результате проведенных нами исследований различных
низкотемпературных экосистем были выделены и описаны четыре новых вида
гомоацетатных
микроорганизмов,
растущих
при
низкой
температуре
и
принадлежащих к роду Acetobacterium (Табл. 6), имеющем в своем составе также
несколько мезофильных видов.
Acetobacterium bakii (Kotsyurbenko et al., 1995). Клетки представлены
толстыми короткими палочками (0,9-1,5x1,5-2,7 мкм) (Рис. 18), не образующими
спор. Подвижный, имеет
одтгополярно расположеш1ые
жгутики. Грамм-
положительная клеточная стенка. Психроактивный организм Нейтрофил. Растет
в щироком интервале температур от 1°С до ЗО'С при оптимуме 20* (Рис. 19) и в
55
Таблица
6. Психроактивные
анаэробные
микроорганизмы,
выделенные
из
различных холодных мест обитания.
Организм
Температурные
интервалы роста
(Оптимум)
Субстраты
(Продукты)
1-30°С
(20-25°С)
Глюкоза, фруктоза, мальтоза, арабииоза,
ксилоза, целлобиоза, галактоза, манноза,
пектин.
(Ацетат, этанол, лактат, формнат, Нг,
СОг).
Глюкоза, сахароза, фруктоза, манноза,
мальтоза, рафиноза, лактоза, целлобиоза,
маннит, сорбит, пируват, М,Ы-ацетил-0глюкозамин.
(Лактат, ацетат, этанол, формиат, изобутират)
Навоз
КРС,
сброженный при
низкой
температуре
Фруктоза,
лактат,
малат,
2метоксиэтанол,
2,3-бутандиол,
метильные
группы
бетаина
и
ароматических
соединений,
нуСОг,
формиат, С О .
(Ацетат)
Фруктоза, глюкоза, ксилоза, мальтоза,
целлобиоза,
лактат,
малат,
2метоксиэтшюл, метанол и метильные
группы бетаина, Нз/СОг, формиат, СО.
(Ацетат).
Фруктоза, глюкоза, ксилоза, мальтоза,
лактат, манноза, пируват, метанол и
метильные группы бетаина, Н^/СОг,
формиат, СО.
(Ацетат)
Фруктоза,
лактат,
малат,
2метоксиэтанол,
2,3-бутандиол,
метильные
группы
бетаина
и
ароматических
соединений,
Н2/СО2,
формиат, СО.
(Ацетат)
Иловые осадки
таежного прудаотстойника
Местообитание
Сахаропшники
Clostridium
fimetanum
Trichococcus
palustns
1-33°С
(ЗО-С)
Низовое
подмосковное
болото
Гомоацетогены
Acetobacienum bahi
1-30°С
(20°С)
Acetobacterium
paludosum
1-30°C
(20°C)
Acetobacterium
tundrae
ЬЗО'С
(20°C)
Acetobacterium
1-35°C
(30°C)
fimetarium
Низовое
подмосковное
болото
Почва тундры
Навоз
КРС,
сброженный при
низкой
температуре
Метаногены
Methanosarcina
Штамм MS
Methanosarcina
1-32''С
. (25°С)
Метиламины, метанол,, ацетат, Н2/СО2.
(СН4)
Штамм MM
(25°С)
изг-с
Метиламины, метанол, Н2/СО2.
(СН4)
Methanosarcina
5-40°С
(35°С)
1-32°С
(25°С)
Метиламины, метанол. ацетат, Н2/СО2.
(СН4)
Формиат, Н2/СО2.
(СН4)
Штамм МТ
Melhanobactenum
Штамм MSB
Methanocorpusculum
Штамм M S P
4-35°С
(25-30°С)
Формиат, Н2/СО2
(СНд)
56
Иловые осадки
таежного прудаотстойника
Навоз
КРС,
сброженный при
низкой
температуре
Почва тундры
Иловые осадки
таежного прудаотстойника
Иловые осадки
таежного прудаотстойника
диапазоне рН 5.5 - 8 5 с оптимумом при 6,5. Хемоорганотроф и автотроф.
Потребляет ряд Сахаров, гидроксикислот и метильные группы некоторых
соединений, а также Н2+СО2, формиат и СО. Образует ацетат в качестве
единственного продукта. Строгий анаэроб. Основным компонентом липидного
состава клеточной стенки является насыщетшый альдегид Ci6o. Содержание Г+Ц
оснований геномной ДНК составляет 42,1 мол.%. Типовой штамм - Z-4391 (DSM
8239, АТСС 51794).
Acetohacterium paludosum (Kotsyurbenko et al., 1995). Клетки представлены
толстыми короткими палочками (0,8-1,1x1,3-2,9 мкм) (Рис. 18), не образующими
спор. Подвижный, имеет перитрихально расположенные жгутики. Граммположительная клеточная стенка. Психроактивный организм. Нейтрофил. Растет
в широком интервале температур от 1°С до 30°С 1фи оптимуме 20° (Рис. 19) и в
диапазоне рН 5.0 - 8.0 с оптимумом при 7.0. Хемоорганотроф и автотроф.
Потребляет ряд Сахаров, гидроксикислот и метальные группы некоторых
соединений, а также Н2+СО2, формиат и СО. Образует ацетат в качестве
единственного продукта. Строгий анаэроб. Основным компонентом липидного
состава
клеточной
стенки
является
насыщенная
жирная
кислота Ci6o-
Содержание Г-(-Ц оснований геномной ДНК составляет 41,7 мол.%. Типовой
штамм - Z-4092 ( D S M 8237, АТСС 51793)
Acetobacterium flmetarium (Kotsyurbenko et al., 1995). Клетки представлены
короткими, не образующими спор палочками (0,8-1,1x1,5-2,6 мкм) (Рис. 18).
Подвижный,
имеет
перитрихально
расположенные
жгутики.
Грамм-
положительная клеточная стенка. Психроактивный организм. Нейтрофил. Растет
в широком интервале температур от 1 "С до 35''С при оптимуме 30° (Рис. 19) и в
диапазоне рН 6.0 - 8.5 с оптимумом при 7.5. Хемоорганотроф и автотроф.
Потребляет ряд Сахаров, гидроксикислот и метильные группы некоторых
соединений, а также Н2+СО2, формиат и СО. Образует ацетат в качестве
единственного
продукта.
Строгай
анаэроб.
Основными
компонентами
липидного состава клеточной стенки являются мононенасыщенные жирные
кислоты С|41Д9 и С|61Д11, а также насыщенный альдегид Cieo^ Содержание Г+Ц
оснований геномной ДНК составляет 45,8 мол.%. Типовой штамм - Z-4290 (DSM
8238, АТСС 51795).
57
t tm
Рис.
18.
Морфология
в
ультратонкяя
структура
новых
писхроактивных гомоацетогенов. 1
Acetobacterium bakii; 2 A.paludosum; 3 - Afimetarium. я Фазово-контрастная микроскопия;
b - электронная микроскопия; с ультратовкне клеточные срезы.
Acetobacterium tundrae (Kotsyurbenko et al., 1995). Клетки представлены
короткими, не образующими спор палочками (0,7-1,1x1,1-4,0 мкм) (Рис. 21).
Подвижный, имеет перитрихально расположенные жгутики. Грамм-положительная
клеточная стенка. Психроакгивный организм. Нейтрофил. Растет в широком
интервале температур от Г С до ЗО'С при оптимуме 20° и в диапазоне рН 6.0 - 8.0 с
оптимумом при 7.0. Хемоорганотроф и автотроф. Потребляет ряд Сахаров,
гидроксикислот и метильные группы некоторых соединений, а также Н2+СО2,
формиат и СО. Образует ацетат в качестве единственного продукта. Строгий
анаэроб. Основными компонентами липидного состава клеточной стенки являются
насыщенный
альдегид
Cieo
и
мононенасыщенная
жирная
кислота
CI6IA9-
Содержание Г+Ц оснований геномной ДНК составляет 39,2 мол.%. Типовой штамм
-Z-4493(DSM9173).
58
на ■
Apaludosum
<ц ■
//^\
0,15 '
е
л.
A-bakii
\
AJimetarium
wY
Jl
ад ■
ода ■
0-
1
1
1 ——
1
IS
20
—
1
2S
—
•
—
1
—
30
TeMoepaiypa, °C
Рис. 19. Скоростн роста психроактивных гомоацетогенов Acetobacterium bakii,
A.paludosum nAJimetarium в зависимости от температуры.
Принадлежность выделенных микроорганизмов к новым видам была
доказана на основании сравнения морфологических и метаболических свойств,
нуклеотидных последовательностей генов 16S-pPHK, результатов ДНК-ДНК
гибридизации с ранее описанными бактериями данного рода (не более 38%
гомологии), а также при сравнении состава липидного комплекса новых
бактерий между собой. Ранее только один психроактивный гомоацетоген
Acetobacterium штамм НР4 был выделен в чистую культуру (Вак, 1988; Conrad et
al., 1989) и был классифицирован как Acetobacterium carbinolicum, хотя он
значительно отличался от типового штамма по температурному интервалу роста
(Eichler and Schink, 1984). Краткое описание штамма НР4 не позволяет провести
его сравнение с вышеописанными организмами. Однако, его клетки не обладали
подвижностью, в противоположность всем выделенным нами бактериям.
Высокое
содержание
альдегидов,
в
частности,
альдегида
Ci^o.
указывающих на присутствие плазмологенов и наличие двух, а у штамма А.
tundrae даже трех изомеров ненасыщенных соединений являются характерными
59
4а#*
■«ч
■/ Г * ^ ^
Рис. 20. Морфология и ультратонкая струтура Acetobacterium tundrae. Световая
микроскопия клеток, выращенных при 20" (а), 25° (Ь) и 30°С (с). Электронная
микроскопия
клетки
обычной
морфологии
(d),
раздутой
клетки
(е,<),
ультратонких срезов деляшихся клеток (g) и раздувшихся неподелнвшихся клеток
(h).
особенностями липидного комплекса всех выделенных штаммов и, возможно,
рода Acetobacterium. Однако, данные по составу липидного комплекса других
видов этого рода отсутствуют в литературе-Было обнаружено, что морфология
клеток гомоацетогенов варьировала в зависимости от возраста культуры, состава
среды и температуры культивирования. Особенно сильное влияние температуры
на форму и размеры клеток было установлено для А tundrae. Характерная,
описанная выше морфология клеток наблюдалась в диапазоне температур 120°С При 25°С вследствие нарушения процесса деления появлялись крупные
60
раздутые клетки, достигавгаие размеров 0-1,1 х 1,1-4,0 мкм. При температуре
30°С численность таких клеток достигала 95 % от общего числа клеток (Рис. 20).
Несмотря на то, что все гомоацстогены были способны к росту при
температурах близких к нулю, скорость их роста менялась различным образом
при
понижении
температуры.
В
кинетических
экспериментах
с
тремя
гомоацетогенами было показано, что наименьшее значение Qio (величины,
характеризующей степень увеличения скорости реакции или скорости роста
микроорганизмов при повышении температуры на 10 градусов) в диапазоне от 5"
до Ю'С наблюдалось для A.bakii (1,5), что указывает на его хорошую адапташпо
к низкой температуре, рю для Apaludosum составляла - 1,9. Наибольшее
значение величшш рю установлено для A.fimetarium (2,2), имеющего так же
более высокие оптимум и верхний температурный предел роста, что повидимому, связано с температурными условиями его первоначальной среды
обитания.
Приспособление
вышеописанных
сахаролитических
и
гомоацетатных
бактерий к низким температурам отмечалось по изменению жирнокислотного
состава. На понижение температуры культивирования с 25°С до б'С оба
сахаролитических микроорганизма отвечали повышением доли ненасыщенных
жирных кислот в составе липидного комплекса клеточной стенки. В сумме их
процентное содержание возрастало с 48,6 до 55,1 и с 54,7 до 64, соответственно
для Cfimetarium и T.palustris. При понижении температуры с 25° до 6''С доля
ненасьпценных жирных кислот и альдегидов увеличивалась для А bakii,
Apaludosum и A.fimetarium на 21,8; 16,0 и 6,8% соответственно. Заметное
увеличение синтеза ненасыщенных соединений в числе прочих компонентов
липидного комплекса при снижении температуры культивирования указывает на
важную роль данного биохимического механизма в
низкотемпературной
адаптации гомоацетогенов. Дополнительным свидетельством в пользу этого
предположения является четкая обратная корреляция величины таких изменений
в компонентах липидов и значений рю в ряду A.bakii - A.paludosum Aflmetarium.
Проведенное
сравнительное
исследование
нуклеотидных
последовательностей ДНК, кодирующих 16S рРНК гены не обнаружило
принципиальных
филогенетических
различий между
мезофильными представителями гомоацетогенов (Рис. 21).
61
психроактивными
и
r,DSM«237T(3069S8)
lOPJ
Lm
79
ММИ73Т
DSM8239''(»e95e)
Dat»238T(X96958)
AcebAaeterium maticum С Ш 4132'^ (X96$sg)
100
— Aeet^facieriumcarbinoliaimDSMZSisToiS&st)
— AcetokK;t0iitmwia7ngaeT>SIAmf(X969Si)
Рис. 21. Фило1'енетическое
родство психроактивньпс
и
мезофильных
гомоацетогенов рода Acetobacterium на основании 16S рДНК нуклеотидной
последовательности.
Таким
образом,
адаптация
к
низкотемпературным
условиям
у
рассматриваемых видов не связана с качественными изменениями в геноме и
является в значительной степени фенотипической.
3.3. Метаногенные архев.
Психроактивные метаногены являются терминальной микробной группой
трофической цепи анаэробного сообщества и представляют собой наиболее
сложную микробную группу для культивирования. Они используют простые,
достаточно бедные энергетически соединения, очень чувствительны к кислороду
и характеризуются медленным ростом при пониженных температурах. Кроме
того, многие виды растут только в жидких средах и могут быть выделены
исключительно методом предельных разведений. К
настоящему
времени
узаконено только шесть видов архей, растущих при низких температурах, и все
они принадлежат к группе метаногенов. Четыре из них были выделены из
морских осадков и являются умеренными галофилами (Franzmann et al., 1992;
62
1997; Chong et al., 2002; Von Klein et a l , 2002). Первый пресноводный метаноген,
принадлежащий к роду Methanosarcina был выделен (однако, не узаконен в
качестве вида) из подмосковного болота Абрамцево (Жилина и Заварзин, 1992).
Первый и единственный узаконенный вид пресноводного метаногена, также из
рода Methanosarcina, был выделен из озерных осадков (Simankova et. al., 2003). В
результате длительных работ по получению активных накопительных, а затем и
чистых культур метапогенов из различных низкотемпературных экосистем, нами
было выделено восемь штаммов метаногенных архей [18,20]. Новые выделенные
штаммы метапогенов были распределены на три группы согласно особенностям
своей морфологии, физиологии и субстратной специфичности и данным
филогенетического анализа 16S - рРНК гена (Рис. 22, 23, 24).
Первая группа включает три штамма (МТ, M S и М М ) (Рис. 22 а,Ь,с),
принадлежащих к роду Methanosarcina и использующих субстраты, типичные
для представителей этого рода. Филогенетический анализ последовательности
168-рДНК гена у новых штаммов метаногенов показал высокое родство штамма
МТ к Methanosarcina mazei, а штаммов М М и M S к Methanosarcina lacustris (Рис.
23).
Вторая группа, включающая штаммы M S B
и MSP
(Рис. 22 d,e),
представлена использующими только формиат и Н2+СО2 нейгрофильными
организмами. Клетки штамма M S B имеют спиралевидную форму. Штамм MSP
представлен мелкими кокками На основании анализа последовательности 16SрРНК гена штаммы M S B и MSP были отнесены к родам Methanospirillum и
Methanocorpusculum, соответственно.
Несмотря на близкое родство с мезофильными видами (0,1 - 0,3% различия
в нуклеотидной последовательности 168-рДНК) вьщеленные психроактивные
метаногены имеют оптимумы и температурные пределы роста на 10-15°С ниже,
что позволяет им развиваться в холодных условиях в местах их обитания. Ни
один из новых метаногенов не является представителем нового рода, что
указывает на определяющую, для этих организмов, роль адаптационных
фенотипических изменений к пониженным температурам.
63
l*.iiZ^;S>l%v*'-
Рис. 22. IIcmpoairniBHbie метаногенные ярхеи. Фязово-коятрастная микроскопия,
а - штамм MS; b - штамм М М ; с - штамм МТ; d - штамм MSB; е - штамм MSP; f штамм MB.
Третья группа включает три штамма МВ2, М В З , МВ4, которые позднее
были отнесены к одному и тому же организму M B , уникальность которого
состоит в способности к росту при пониженных рН (Рис. 22 f). Организм был
выделен из образцов кислого сфагнового болота с использованием разбавленной
в 100 раз среды Пфеннига и Н2+СО2 в качестве субстрата при рН 4,5.
64
I Umanosafclm татЫ, AF028691
* Mamanosankia тагШ, Х№в74
i
jn_m
J "
Uethanosardna berkori, AJ012094
[ L f MS, MM
y
I ^■~~'MelftanosaransteeusWs, AF432127
^ " ~ ~ " MeffanosaflSfriaseroes^ae, AJ012742
Uettianomeyiyksvorans holtandtca. АР1201вЗ
ZB
~ MGthammethylovorana vldoriae. AJ27e437
Methanotobus bombayensis, 1120148
Ateffianosaete солс»^ Xil6932
u&hanoooipuscutum ШЬюатип
MeOmnocorpusculum pannm
f
MSP
Г " ~ M^tanospirUum hungatet, МбОввО
'
MSB
Methanotherrnobadm thermoautotmphlcus, 237155
Uettiaiv3fhBrmus terMi«, U32222
—"———
Uethampynis kantHeri, U59932
010
Рис. 23. Филогенетическое положение психроактивньпЕ метаногенных штаммов
согласно 168-рДНК нуклеотидной последовательности.
Мшфоорганизм образует метан в интервале р Н 3,5 - 7,0 и температурном
интервале 1 - 35''С с оптимумами при р Н 5,0 - 5,5 и 25° - ЗО'С. Это первый
метаноген, способный образовывать СНЦ при таком низком р Н . Н и один из ранее
выделенных метаногенов не обладает способностью к росту при значениях р Н
ниже 4,5.
Согласно филогенетическому анализу последовательности гена 16S-pPHK
организм принадлежит к роду Methanobacterium
в качестве нового вида (Рис.
24). Данный род включает в себя гидрогенотрофных метаногенов и, с учетом
выделенного ацидофильного штамма M B (валидирование в стадии подготовки),
характеризуется самым широким, по сравнению с другими родами метаногенов,
диапазоном роста, входящих в него видов микроорганизмов от р Н 3,5 до 9,9.
Т а к и м образом, в результате длигельных работ по нюкотемпературному
инкубированию
анаэробных
микроорганизмов
были
охарактеризованы представители ключевых мгофобных групп
65
выделены
и
метаногенного
г
AFU924S,M^iaiubacterimmfaniddeam,AF16n4S
' MbmFdrTnl,liMhanatacMiiffltonnldciini,M3e60e,147e
'
—
MbmSpBcg. MaBunotaetarium «pi. 3tt9137.965
MfamSpecS, MrtimobaclwliHi щ . 3a8138JMP
MbmFonna. Mslhanobectwium ГоплЫсит. 229438 229538,917
Mattwioewi tp.. xsaiMs, i43o
r—I MtnSpeca,
"
MtnSpeci, IMhonogm цх, X99044,1436
МЬшПмтБ, MrtMnobactorium fbmiiciajm, ARKMSB, 1476
М Ь п А у ^ Methanobactarium ЬгуапМ, U63419, S68
МЬ|лвгуш1, DMhanotadwIum bf^nO, N59184,1443
MbmBiveS, МавплоНаоМшл biyanlSi, ARieeeee, 1478
MbmSpocS, Methanobaeterium q>. DSM11108, АГОгбббО, 144S
S-14,815-14, АЯВ_А1«9в8В, 734
-t:
J — AP276958,MeauuuAa4:taiumeurmm,AP276958
'— AF2335St,Meaanobaetenumcomgiaeate,AP2335K
End(X4, «ndiMynibiont of MMopui palaatormit, N86386,415
МНАЯВ_С53617РР
MB2,ARB_7FAS2&C6
MB3,ARBJ134AM0
mo
Рис. 24. Филогенетическое положение трех штаммов ацидофильного метаиогена,
выделенных из кислого болота.
сообщества. Было установлено, что все они являются психротолерантными
(психроактивными) микроорганизмами, имеющими тирокий температурный
интервал для роста, температурные оптимумы 20°-30°С, однако способными к
росту при температурах ниже 15°С, наиболее характерныхдаших мест обитания.
Заключение
Исследование жизнедеятельности метаногенных микробных сообществ из
различных наземных холодных мест обитания, где единственным акцептором
электроном является СОг, привело к установленшо ряда принципиальных
особенностей
трофических
взаимодействий,
определяющих
регуляцию
метаногенеза при низкой температуре. Показано, что основную роль в регуляции
метаногенеза на уровне сообщества играет конкуренция между гомоацетатными
бактериями
и
метапобразующими
археями.
В
анаэробном
сообществе,
развивающемся при низкой температуре, в нейтральных и слабо кислых
условиях (рН 5-7) высокая активность гомоацетатных бактерий, потребляющих
как водород, так и широкий набор органических субстратов, приводит к
66
перераспределению
потоков
органического
вещества
(Рис.
25).
Ацетат
становится основным субстратом для метаногенных архей. Различные Ср
соединения,
наиболее
предпочтительные
для
метаногенов
при
низкой
температуре, доступны лишь в небольших количествах и вносят незначительный
вклад в общий метаногенез.
Определены основные кинетические константы (Утах> Кщ, H i порог.) Нгметаболизма гомоацетатных бактерий и метаногенных архей, на основании
которых была создана модель, предсказывающая результат
конкуренции
вышеупомянутых микробных групп за водород и развитие ацетогенного или
метаногенного микробного сообщества в зависимости от условий в системе.
ЕЬ - Метано гены
"4^ моакстогены
Органическое
ЛЖК
тестер —ЦГидролитит)
Мономеры
*|Сиятрофы
\Ацетат
>
С2 - Метано гены
.СНл
-»|Са1аролитнки-[
Метанол,
Рис. 25. Схема трофических
сообществе, развивающемся
метиламины
• Ci-Метавогены
взаимодействий в метаногенном микробном
при низкой температзфе
и
рН
близком
к
нейтральному. Сплошные линии соответствуют основным потокам вещества,
пунктирные - второстепенным.
Установлено, что из-за медленного роста формирование необходимого
баланса в трофических взаимоотношениях в метаногенном сообществе при
низкой температуре происходит в течение долгого времени. Наиболее важным
фактором является накопление акгавной биомассы ключевых микроорганизмов,
и главным образом, ацетокластических и гидрогенотрофных метаногенов.
67
которые обеспечивают прохождение сшггрофных реакций. Поступление в
систему легко-деградируемых соединений, разбавление, изменения температуры
и рН могут ускорить или замедлить рост различных микроорганизмов, нарушая
при этом согласованное функционирование микробных групп в сообществе.
Сравнительный анализ жизнедеятельности метаногенных сообществ из
различных холодных мест обитания показал зависящее от рН изменение в
основных путях образования метана (Рис. 26). При нейтральном рН преобладает
ацетокластический метаногенез вследствие активного участия гомоацетатных
бакгерий в деградации органического вещества и потреблении Нг. В умереннокислых условиях (рН 4,5 - 6,0) в качестве терминальных микробных групп
-I
С
г-*;
H^l^CO^
I
^ Г "tttaaiafstBaaaaL^y-
рН
7
А^гяшт
CH^J^
I
►
>\ %^ШаШЯ1<юал
L^^^^^J
^---^-СШштШ^-
Ацгтат
V ,
-'— ^'■'^'-—i
си,,
5-
^
Ацаяат
б
H,(+COJ
^ ^^^>.]^^^ЯУ*^^л
Ацетат
3
3-*
Рис. 26. Схема трофических взаимодействий терминальных микробных групп
психроактивного метаногенного сообщества при различных рН.
68
функционируют как ацетокластические, так и гидрогенотрофные метаногены,
тогда как при рН ниже 4,5 водород-зависимый метаногенез становится
доминирующим.
Биогеохимические
и
молекулярно-экологические
исследования
анаэробного сообщества кислого западно-сибирского болота показали, что
вышеназванные
закономерности,
установленные
в
экспериментах
с
развивающимся сообществом согласуются с данными, полученными при работе
с
природными
образцами. Применение
методов F I S H
и
T-RFLP
дало
возможность изучить состав и численность микробного сообщества кислых
болот
и
определить
доминирующие
семейства
метаногенов:
Methanomicrobiaceae, Methanosarcinaceae, Methanobacteriaceae и RC-II группа
метаногенов.
Таким образом, данные настоящего исследования могут также быть
использованы для прогноза поведения сообщества в реальных условиях. Такой
прогноз
особенно
ценен при проведении биотехнологических
процессов
анаэробной деградации различных промыышенных и сельскохозяйственных
отходов. Необходимые рекомендации для осуществления такого процесса при
низких температурах могут быть даны на основе результатов, полученных в
настоящей работе.
При исследовании микробного состава в образцах из различных природных
экосистем и антропогенных мест обитания были получены
психроактивных
анаэробных
микроорганизмов,
12 культур
принадлежащих
к
трем
функционально-значимым микробным группам: сахаролигикам, гомоацетогенам
и
метаногенам.
Шесть
анаэробных
бактерий,
и
в
том
числе,
два
сахаролитических организма и четыре гомоацетогена, описаны в качестве новых
видов с присвоением следующих названий: Clostridiumfimetarium,Trichococcus
palustris, Acetobacterium bakii, A.paludosum, A.fimetarium, A.tundrae. Выделенные
метаногенные археи филогенетически относятся к родам Metharwsarcirm,
Methanocorpusculum, Methanospirillum и
Methanobacterium. Показано,
что
микроорганизмы низкотемпературного метаногенного сообщества из наземных
экосистем способны развиваться в пшроком диапазоне температур. Они имеют
оптимумы (20 - 30°С), намного превышающие максимальные температуры,
69
харакгерные для их мест обитания, однако хорошо адаптированы к росту при
пониженных температурах.
Исследования метаногенных микробных сообществ, развивающихся при
низких температурах, позволили значительно расширить знания о принципах
функционирования биологических систем и их отклике на изменение внепших
условий, о регуляции биологических процессов и основных
микробных
взаимодействиях на уровне сообщества, а также о биологии и экологии
ключевых
микроорганизмов
в
составе
психроактивного
метаногенного
сообщества.
ВЫВОДЫ
1.
Исследовано влияние нетрофяческих факторов (температуры и рН)
на метаногенное микробное сообщество. Показано, что на понижение
температуры и рН сообщество реагирует изменением трофической
структуры, что приводит к перераспределению потоков вещества.
2.
В
развивающемся
анаэробном
сообществе
при
пониженной
температуре водород-зависимый ацетогенез предшествует метяногенезу.
3.
При низких температурах гомоацетатные бактерии характеризуются
повышенной
конкурентоспособностью
по
отношению
к
других
микроорганизмам за общие субстраты.
4.
С понижением рН среды основным изменением в
структуре анаэробного сообщества является
трофической
повышение
роли Иг-
использующих метаногенов как терминальной микробной
сообщества.
Метаногенез
становится
преимущественно
группы
водород-
завнсимым.
5.
Благодаря
выделению
чистых
культур
психроактивных
гомоацетатных бактерий и метаногенных архей впервые измерены
кинетические характеристики ( K „ , Ущ») и пороги потребления водорода
как величины, определяющие результат конкуренции за водород при
низкой температуре для вышеназванных микроорганизмов.
70
Впервые
бактерий
создана
и
коллекция
метаногенных
архей
психроактивных
- ключевых
гомоацетатных
микробных
анаэробного сообщества. Все выделенные гомоацетатные
являются
новыми
видами и принадлежат
к
групп
бактерии
роду Acetobacterium.
Метаиогенные археи, выделенные из различных холодных экосистем,
принадлежат
к
родам
Methanosarcina,
MethanospiriUum
и
Methanocorpusculum. Впервые выделен умеренно ацидофильный Нгиспользующий метаноген, отнесенный к роду Methanobacterium.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
Экспериментальные
статьи
1. Александров Г.А., Коцюрбенко О.Р., Соколов М.А., Степанов А.Л. О
возможных артефактах в экспериментальных исследованиях поглощения и
выделения метана микробным сообществом почв. Журн общ. биологии,
1991,т.52,Хо6,с.916-921.
2. Коцюрбенко О.Р., Ножевникова А.Н., Заварзин Г.А. Анаэробное
разложение органического вещества психрофильными микроорганизмами.
Журн. общ. биологии, 1992, т.53, №2, с.159-175.
3. Заварзин Г.А., Коцюрбенко О.Р., Соловьева Т.Н., Ножевникова А.Н.
Температурный порог при развитиии метаногенного или ацетогенного
микробного сообщества из почв туаары. ДАН, 1993, т.329, №6, с.792-794.
4. Коцюрбенко О.Р., Ножевникова А.Н., Калюжный С В . , Заварзин Г.А.
Метановое сбраживание навоза крупного рогатого скота в психрофильных
условиях. Микробиология, 1993, т.б2, вып.4, стр.761-771.
5. Kotsyurbenko O.R., Nozhevnikova A.N., Zavarzin G.A. Methanogenic
degradation of organic matter by anaerobic bacteria at low temperature.
Chemosphere, 1993, v.27, n.9, pp. 1745-1761.
6. Nozhevnikova A.N., Kotsyurbenko O . R , Simankova M.V. Acetogenesis at low
temperature. In: Acetogenesis, Ed.: H.L.Drake, Chapman & Hall, 1994, pp.416431.
7. Kotsyurbenko O.R., Simankova M.V., Nozhevnikova A.N., Zhilina T.N.,
Bolotina N.P., Lysenko A.M., Osipov G.A. New species of psychrophilic
acetogens: Acetobacterium bakii sp. nov., A paludosum sp.nov., Aflmetarium sp.
nov. Arch. Microbiol, 1995, v.l63, p. 29-34.
8. Жилина Т.Н., Коцюрбенко O.P., Осипов Г.А., Кострикина Н.А., Заварзин
Г.А. Ruminococcus palustris nov.sp. - психроактивный анаэробный организм
из болота. Микробиология, 1995, т.64, № 5, с.674-680.
9. Коцюрбенко О.Р., Ножевникова А.Н., Осипов Г.А., Кострикина Н.А.,
Лысенко А . М . Новая психроактивная бактерия Clostridium fmetarium,
выделенная из навоза крупного рогатого скота, сброженного при низкой
температуре. Микробиология, 1995, т.64, № 6, с.804-810.
71
10. Kotsyurbenko O.R., Nozhevnikova A.N., Soloviova T.I., Zavarzin G.A.
Methanogenesis at low temperatures by microflora of tundra wetland soil. Antonie
van Leeuwenhoek, 1996, v.69, № 1, p.75-86.
11. Vavilin V.A., Lokshina L.Ya., Rytov S.V., Kotsyurbenko O.R., Nozhevnikova
A.N., Parshina S.N. Modelling methanogenesis during anaerobic conversion of
complex organic matter at low temperatures. Wat.Sci.Technol, 1997, v.36, N.6-7,
p.531-538.
12. Vavilin V.A., Lokshina L.Ya., Rytov S.V., Kotsyurbenko O.R., Nozhevnikova
A.N. Modelling low-temperature metiiane production from cattle manure by an
acclimatied microbial community. Bioresource Technology, 1998, v.63, p.l59171.
13. Nozhevnikova A.N., Kotsyurbenko O.R., Parshina S.N. Anaerobic manure
treatment under extreme temperature conditions. Wat. Sci. Technol, 1999, v.40, N
1, p.207-214.
14. Nozhevnikova A.N., Rebak S., Kotsyurbenko O.R., Parshina S.N., Holliger
C , Lettinga G. Anaerobic production and degradation of volatile fatty acids in
low temperature environments. Wat. Sci. Technol., 2000, v.41(12), p.39-46
15. Vavilin V.A., Lokshina L.Y., Rytov S.V., Kotsyurbenko O.R., Nozhevnikova
A.N. Description of two-step kinetics in methane formation during psychrophilic
H2/CO2 and mesophilic glucose conversions. Bioresource Technology, 2000,
v.71(3),p.l95.209.
16. Simankova M.V., Kotsyurbenko O.R. Stackebrandt E., Kostrikina N.A.,
Lysenko A.N., Osipov G.A., Nozhevnikova A.N. Acetobacterium tundrae
sp.nov., a new psychrophilic acetogenic bacterium from tundra soil. Arch.
Microbiol. 2000, v.l74, p. 440-447.
17. Nozhevnikova A.N., Nekrasova V.K., Kevbrina M.V., Kotsyurbenko O.R.
Production and oxidation of methane at low temperature by the microbial
population of municipal sludge checks situated in north-east Europe. Wat. Sci.
Technol, 2001, v.44(4), p.89-95.
18. Nozhevnikova A.N., Simankova M.V., Parshina S.N., Kotsyurbenko O.R.
Temperature characteristics of methanogenic archae and acetogenic bacteria
isolated from cold environments. Wat Sci. Technol. 2001, v. 44(8), p. 41-48.
19. Kotsyurbenko O.R., Glagolev M.V., Nozhevnikova A.N., Conrad R.
Competition between homoacetogenic bacteria and methanogenic archea for
hydrogen at low temperature. FEMS Microbiol.Ecol. ,2001, v. 38, p.153-159.
20. Simankova M.V., Kotsyurbenko O . R , Lueders Т., Nozhevnikova A.N.,
Wagner В., Conrad R., Friedrich M.W. Isolation and description of the new
strains of methahogens from different cold habitats. System Appl.Microbiol., 2003,
v.26(2),p.312-318.
21. Kotsyurbenko O.R., Chin K-J., Glagolev M.V., Stubner S., Simankova M.V.,
Nozhevnikova A.N,, Conrad R. Acetoclastic and hydrogenotrophic methane
production and methanogenic populations in an acidic West-Siberian peat bog.
Environmental Microbiology, 2004, v.6(l 1), p. 1159-1173.
Обзоры
22. Коцюрбенко О.Р. Метаногенное микробное сообщество наземных
холодных экосистем. Труды Института микробиологии РАН Т. 12. Москва,
Изд-во «Наука». 2004, с.213-235.
72
23. Kotsyurbenko O.R. Trophic interactions in the methanogenic microbial
community of low-temperature terrestrial ecosystems. FEMS Microbial Ecology
2005,v.53,p.3-13.
24. Simankova M.V., Kotsyurbenko O.R. Genus Acetobacterium. Bergey's Manual
of Systematic Bacteriology Third Edition. 2005. v.3, (In press).
Нерецензируемые статьи, принятые на междунеродных конференциях
25. Nozhevnikova A.N., Kotsyurbenko O.R., Zavarzin G.A. Methanogenesis from
organic matter at low temperature. Int. Course on Anaerobic Waste Water
Treatment, Case Studies, IHE Delft, Agricaltural University Wageningen,
Netherlands, 1992,pp.72-962.
26. Nozhevnikova A.N., Kotsyurbenko O.R. Microbiological fiindamentals of
methanogenesis in a wide range of temperatures (5''-75 °C). In: Biogas technology
as an environmental solution to pollution. Eds: Marhaim U. & Ney G., Rome,
1994. Proceedings ofpapers contributed to the 4th FAO/SREN Workshop, Migal,
Israel 13-16 June 1994,p.l2-15.
27. Nozhevnikova A.N., Kotsyurbenko O . R , Nekrasova V.K. Methane formation
and oxidation at low temperature by microflora of a polluted small northen lake
(Ezhva, Russia). Abstr. book of Int Workshop on Aquatic Microbial Ecology,
April 1995, Konstanz, Germany, p 27-29.
28 Kotsyurbenko O.R., Soloviova T.I., Nozhevnikova A.N., Zavarzin G.A.
Anaerobic degradation of organic matter by psychrophilic microorganisms from
tundra soil. In: Global change and arctic terrestrial ecosystems, Luxembourg,
1995. Proceedings of papers contributed to the International Conference, 21-26
August 1993, Oppdal, Norway, p.273-278.
29. Nozhevnikova A.N., Kotsyurbenko O.R., Zavarzin G.A. Microbial
methanogenesis at low temperature. Proceedings of papers contributed to the
International Meeting on Anaerobic processes for Bioenergy and Environment,
January 1995, Copenhagen, Denmark, part 1, p.1-10.
30. Vavilln V.A., Lokshina L.Ya., Rytov S.V., Kotsyurbenko O.R., Nozhevnikova
A.N., Parshina S.N. Modelling methanogenesis during anaerobic conversion of
complex organic matter at low temperatures. Proc. 5'* International Conf. On
Anaerobic Digestion. May, 1997, Sendai, J ^ a n , Vol.2, pp.601-608.
31. Nozhevnikova A.N., Parshina S.N., Rebac S., Kotsyurbenko O.R., Holliger C ,
Lettinga G. Anaerobic degradation of volatile fatty acids at low temperatures.
Proceedings oflnt.Symp. «Energy and Agriculture towards the Third Millenium»
FAO/SREN Workshop, Athens, Greece, June 1999, p.325-332.
32. Nozhevnikova A.N., Nekrasova V.K., Kevbrina M.V., Kotsuyrbenko O.R.
Production and oxidation of methane at ambient temperatures by the microbial
population of municipal sludge checks. Proceedeings of VI Oficina e Seminano
Latino-Americano de Digestao Anaerobia. Recife 2000 , Brasil, November 2000,
p.150-154.
33. Nozhevnikova A.N., Parshina S.N., Kotsyurbenko O.R., Holliger C , Lettinga
G. Production and degradation of volatile fatty acids in low temperature
environments. Proceedings of VIISEB, Nordwjekoud, The Netherlands, 2000, p.
34-36.
73
34. Nozhevnikova A.N., Simankova M.V., Parshina S.N., Kotsyurbenko O.R.
New anaerobic bacteria and archaea isolated from cold environments. Proc.of
farewell seminar ofprof. Dr. Ir. Gatze Lettinga "Anaerobic digestion for suitable
development", March 2001, Wageningen, The Netherlands, E P and PS (J.V.Lier,
M.I,exmod, eds), p.42-50.
35. Nozhevnikova A.N., Nekrasova V.K., Parshina S.N., Shatilova K.A.,
Simankova M.V., Kotsyurbenko O.R. Anaerobic microorganisms and
communities in low temperature waste treatment. 7-th FAO/Sren Workshop
"Anaerobic digestion for sustainability in waste (water) treatment and re-use", 1922 May 2002, Moscow, Russia, Proceed. Book, v.2, p.394-402.
Тезисы конференций
36. Nozhevnikova A.N., Simankova M.V., Kotsynrbenko O.R. Simultaneous
utilization of glucose and hydrogen by Clostridium thermoautotrophicum. Abstr
of the 6-th Int. Symposium on Cl-Compounds, August 1989, Gottingen, F.R.G.,
p.435.
37. Kotsynrbenko O.R., Nozhevnikova A.N. Methanogenesis from organic
compounds at low temperature. Poster-Abstr. of the 6-th Int Symposium on
Anaerobic Digestion. May 1991, Sao-Paolo. Brazil, P.96.
38. Nozhevnikova A.N., Parshina S.N., Nekrasova V.K., Kotsynrbenko O.R.
Acidogenic fermentation of animal-breeding wastes under extremely thermophilic
conditions. Poster-Abstr. of the 6-th Int. Symosium on Anaerobic Digestion. May
1991, Sao-Paolo. Brazil, p. 137.
39. Parshina S.N., Kotsyurbenko O.R., Nozhevnikova A,N. Methanogenic
fermentation of organic substrates of manure at low temperatures. Poster-Abstr. of
the 6-th Int. Symposium on Anaerobic Digestion. May 1991, Sao-Paolo. Brazil,
p.138.
40. Коцюрбевко O.P., Ножевникова A.H. Анаэробное разложение различных
органических веществ при низких температурах микрофлорой загрязненного
водоема Среднего Приуралья (Коми АССР). Тезисы докладов Всесоюзного
симпозиума "Микробиология охраны бгюсферы в регионах Урала и Северного
Прикаспия. Оренбург, 1991, стр.60-61.
41. Kotsyurbenko O.R., Nozhevnikova A.N., Zavarzin G.A. Anaerobic microbial
degradation of pollutants at low temperature. Abstr. of Meeting "Bioavailability of
organic xenobiotics in the environment". August 1997, Jesenik, Czech Republic,
p.88.
42. Nozhevnikova A.N., Kotsyurbenko O.R., Nel<rasova V.K., Kevbrina M.V.
Anaerobic degradation of organic pollutants in sludge lagoons. Abstr. of the 1-st
Russian SETAC Symposium on Risk assessment for Environmental Contamination.
St-Petersburg, 14-17 June 1998, p.35.
43. Паршина C.H., Коцюрбевко O.P., Некрасова B.K., Ножевникова А.Н.
Анаэробная обработка отходов животноводства в экспериментальных
условиях. Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума "Микробгюлогия охраны
биосферы в регионах Урала и Северного Прикаспия". Оренбург, 1991, стр.9798.
44. Nozhevnikova A.N., Kotsyurbenko O.R., Soloviova T.I., Zavarzin G.A.
Methanogenesis from Cl-compounds and acetate at low temperature. Abstr. of7lA
Int. Symposium on Microbial Growth on CI Compounds, August 1992, Warwick,
U.K., A 52.
45. Kotsyurbenko O.R., Nozhevnikova A.N., Zavarzin G.A. Methanogenic
degradation of organic matter by anaerobic bacteria at low temperature. Abstr of
7-th Int. Symposium on Microbial Growth on CI Compounds, August 1992,
Warwick, U.K., A 53.
46. Kotsyurbenko O.R., Simankova M.V., Bolotina N.P., Zhilina T.N.,
Nozhevnikova A.N. Psychrotrophic homoacetogenic bacterium from several
environments. Abstr. of 7-th Int. Symposium on Microbial Growth on CI
Compounds, August 1992, Warwick, U.K., С 136.
47. Kotsyurbenko O.R., Nozhevnikova A.N., Zavarzin G.A. The competition
between methanogenic and acetogenic bacteria from tundra soil for Ha and CO2 at
low temperature after longterm adaptation period. Abstr. of Int Conference on
Global Change and Arctic Terrestrial Ecosystems. August 1993, Oppdal, Norway,
p. 109.
48. Kotsyurbenko O.R., Soloviova T.I., Nozhevnikova A.N., Zavarzin G.A.
Anaerobic degradation of organic matter by pfsychrophilic microorganisms from
timdra soil. Abstr. of Int Conference on Global Change and Arctic Terrestrial
Ecosystems. August 1993, Oppdal, Norway, p.l 10.
49. Kotsyurbenko O . R , Soloviova T.I.,Nozhevnikova A.N., Zavarzin G.A. The
temperature threshold in the development of methanogenic versus acetogenic
community from the tundra soil. Abstr. of Int. Conference on Global Change and
Arctic Terrestrial Ecosystems. August 1993, Oppdal, Norway, p. 111.
50. Simankova M.V., Kotsyurbenko O.R., Bolotina N.P., Zhilina T.N.,
Nozhevnikova A.N. Psychrotrophic bacteria from several environments. Abstr. of
Int Symposium on Anaerobic Digestion 94, Cape Town, South Africa, 1994,
pp.27-30.
51. Kotsynrbenko O.R., Nozhevnikova A.N., Zavarzin G.A. Termodynamics of
methanogenic and homoacetogenic microbial processes at low temperature. Abstr.
of Int EERO Workshop, St.Petersburg, 1996, p.52.
52. Kotsyurbenko O.R., Kostrikina N.A., Nekrasova V.K., Nozhevnikova A.N.
Methane formation and oxidation at low temperature by microflora of polluted
small northern lake (pond). Abstr of Int EERO Workshop, St.Petersburg, 1996,
p.53.
53. Kotsynrbenko O.R., Simankova M.V., Nozhevnikova A.N., Zhilina T.N.,
Zavarzin G.A. New psychrophilic anaerobic bacteria. Abstr. of Int. EERO
Workshop, St.Petersburg, 1996, p.57.
54. Vavilin V.A., Lokshina S.V., Rytov O.R,, Kotsyurbenko O.R., Nozhevnikova
A.N., Parshina S.N. Modelling methanogenesis during anaerobic conversion of
complex organic matter at low temperatures. Abstr. of the 8-th Int Conference on
Anaerobic Digestion, Sendai, Japan, 1997, v.2, p.601-608.
55. Nozhevnikova A.N., Kotsyurbenko O.R., Nekrasova V.K,, Kevbrina M.V.
Anaerobic degradation of organic pollutants in sludge lagoons. Abstr. of the 2-nd
Int JAWQ Symposium on sludge treatment. Athens, Greece, October 1999.
56. Nozhevnikova A.N., Nekrasova V. K., Kevbrina M.V., Kotsuyrbenko O.R.
Production and oxidation of methane at ambient temperatures by the
microbialpopulation of municipal sludge checks. Abstr of Int Conference
Biocatalysis-2000, June 2000, Moscow, Russia, p. 104.
75
57. Nozhevnikova A.N., Nekrasova V. К., Kevbrina M.V., Kotsuyrbenko O.R.
Low temperature methane cycle in municipal sludge checks. Abstr. of the l-stlAW
Congress, Paris, July, 2000.
58. Nozhevnikova A.N., Kotsyurbenko O.R., Simankova M,V. Microbial
methanogenesis in Polar Ural Tundra wetlands. Abstr. of Int. Conf. "Wetlands 2000", Quebec, Canada, August 200, p. 235.
59. Kotsyurbenko O.R., Simankova M.V., Nekrasova V . K , Nozhevnikova A.N.,
Conrad R. Methanogenesis in samples from West-Siberian acidic wetland. Abstr.
of the 3-rd Int. Congress on extremophiles. September 3-7, 2000, Hamburg,
Germany, p.97.
60. Ножевникова A.H., Симанькова M.B., Коцюрбенко O.P. Новые
анаэрюбные автотрофные бактерии из холодных местообитаний. К 75-летию
со дня рождения академика РАН Е.Н.Кондратьевой: Междун.науч.конф.,
Москва, М Г У им.Ломоносова, биолог, факультет, 13-15 декабря 2000:
Материалы. - М А К С Пресс, 2000,стр.131.
61. Ножевникова А.Н., Симанькова М.В., Коцюрбенко О.Р., Паршива С И .
Микробные сообщества и новые анаэробные бактерии и археи из холодных
местообитаний.
Всероссийская
конференция: Сельскохозяйственная
микробиология вXIX-XXIвеках, Санкт-Петербург, 14-19 июня 2001, стр.33.
62. Ножевникова А.Н., Коцюрбенко О.Р., Паршина С.Н. Микробные
сообщества и микроорганизмы при анаэробной отработке отходов
животноводства в экстремальных температурных условиях. Всероссийская
конференция' Сельскохозяйственная микробиология в XIX - XXI веках,
Санкт-Петербург, 14-19 июня 2001, стр. 34.
63. Kotsyurbenko O.R., Simankova M.V., Nozhevnikova A.N., Friedrich М.,
Conrad R. Methanogenic microbial community from cold environments. Abstr of
the 9-th Int. Symposium on Microbial Ecology, 26-31 August, Amsterdam, The
Netherlands, 2001, p.331.
64. Kotsyurbenko O.R., Simankova M.V., Friedrich M., Lueders Т.,
Nozhevnikova A.N., Conrad R. Psychroactive methanogenic archaea from
different low temperature terrestrial environment. Abstr of the 4-th Int. Congress.
Extremophiles 2002, Naples, Sept 22-26, 2002, p. 156.
65. Kotsyurbenko O.R., Simankova M.V., Zhilina T.N., Friedrich M., Conrad R.,
Nozhevnikova A.N. Methanogenic microbial community in CH4 cycle at low
temperature and new psychroactive microorganisms isolated from different cold
environments. Abstr. of Int. Conference on Arctic Microbiology. Rovaniemi,
Finland, March, 22-25,2004, p.41.
^
-
-
^
76
Напечатано с готового оригинал-макета
Издательство ООО "МАКС Пресс"
Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г.
Шдписаио к печати 10.10.2005 г.
Формат 60x90 1/16. Уся.печ.л. 4,75. Тираж 120 экз. Заказ 621.
Тел. 939-3890. Тел /Факс 939-3891.
119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, М Г У им. М.В. Ломоносова,
2-й учебный корпус, 627 к.
№20526
РНБ Русский фонд
2006-4
20597
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
3 171 Кб
Теги
bd000101497
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа