close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

bd000101606

код для вставкиСкачать
На правах рушшиси
-^^-^
ГУБ^^Ц^УЛДИН И Р Е К И Л Ь Я С О В И Ч
Гибридные лектияы с изменеЙпЫМи углёводсвязывающими
свойствами и их влияние на бобово-ризобиальный симбиоз
03.00.03 - молекулярная биология
Автореферат диссертации
на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Уфа - 2005
Работа
выполнена
в
Институте
биохимии
и
генетики
У ф и м с к о г о н а у ч н о г о центра Р о с с и й с к о й А к а д е м и и наук.
Научный руководитель
Кандидат биологических наук,
А.Х. Баймиев
Научный консультант
Доктор биологических наук,
профессор А . В . Чемерис
Официальные оппоненты
Доктор биологических наук,
профессор Ф . М . Шакирова
Кандидат биологических наук,
В.И. Сафронова
Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха Р А Н
Защита диссертации состоится
Регионального
диссертационного
«Ju^.Cf
совета
Y3A 002.133.01
» на заседании
при Институте
биохимии и генетики Уфимского научного центра Р А Н по адресу: 450054, Уфа,
проспект Октября, 71.
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского
научного центра Р А Н .
Автореферат разослан « ^ » октября 2005 г.
Ученый секрет^ь
Регионального диссертационного совета
—.
у^^^
^
' Z - ^ Бикбулатова С М .
1
Ш
Ides'
^^^^^^
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность
проблемы. Усвоение
молекулярного
азота
воздуха
(азотфиксация) является одним из важнейших биологических процессов, от
которого во многом зависит жизнь на нашей планете. Химические азотные
удобрения, применяемые обычно в качестве источника азота в сельском
хозяйстве, могут быть вредны с точки зрения экологии, и, кроме того, их
производство
требует
азотфиксаторы
значительных
усваивают
затрат
свободный
азот
энергоресурсов.
воздуха
в
Организмы-
процессе
своей
жизнедеятельности, используя, в том числе, энергию солнца. Особый интерес
представляет фиксация атмосферного азота бобовыми растениями в симбиозе с
клубеньковыми
привлекает
бактериями.
внимание
Проблема
ученых
всего
симбиотической
мира
в
связи
с
азотфиксации
возможностью
практического применения результатов таких исследований (Спайнк и др.,
2002). Одним из критических моментов становления бобово-ризобиального
симбиоза является стадия взаимного "узнавания" микроорганизма и растенияхозяина. Этот процесс характеризуется сложным обменом сигналами между
макро- и микросимбионтом в ризосфере растения-хозяина еще до инвазии
клубеньковых бактерий. Показано, что специфичность образования бобоворизобиального симбиоза определяется, в первую очередь, растением-хозяином,
диктующим способ формирования, характеристику структуры и развития
азотфиксирующего клубенька (Broughton et al., 2000; Gualtieri et al., 2000).
Однако
в
отличие
от
ризобиальных
факторов
клубенькообразования,
растительные компоненты, участвующие в инициации симбиоза, изучены не
так хорошо. Несомненно, что в данный процесс вовлечены лектины бобовых,
которые, как показано, могут обеспечивать избирательные взаимодействия
растений с ризобиями благодаря своим углеводсвязывающим свойствам (Brill
et al., 2004). Можно предполагать, что интродукция чужеродных бобовых
лектинов в другие бобовые растения будет способствовать расширению группы
клубеньковых бактерий, из которьк макросимбионт в данных почвенноклиматических условиях сможет выбрать наилучшего партнера для симбиоза.
Это,
в
конечном
азотфиксации,
а,
счете, должно
стало
быть,
привести к
и
3
к
более
высокому
увеличению
уровню
урожайности
РОС НАЦИОНАЛЫ!/.
БИБЛИОТЕКА
•
^^'"T^Ml
сельскохозяйственных культур. Эксперименты с трансгенными растениями,
несущими различные гены лектинов, позволяют оценивать роль этих белков,
однако такого рода исследования довольно сложны. При этом в настоящее
время сведения о полноразмерных генах бобовых лектинов весьма ограничены
и, кроме того, процедура трансформации бобовых растений представляет собой
достаточно трудоемкий процесс. Один из вариантов решения данной проблемы
заключается в изучении симбиотической роли лектинов при экзогенной
обработке ими растений и микроорганизмов. Так, удобным инструментом для
подобных
исследований
являются
применением
прокариотических
возможности
использования
бобовые
лектины,
экспрессионных
этих
систем
полученные
систем. При
таковы,
что
они
с
том, что
позволяют
нарабатывать сконструированные гибридные лектины с заданными свойствами
для исследования функционально значимых углеводсвязывающих областей,
определяющих возможность формирования бобово-ризобиальных отношений.
Дели и задачи исследования. Целями данной работы являлось изучение
структурных особенностей углеводсвязывающих участков лектинов бобовых
растений,
создание
гибридных
лектинов
и
исследование
их
углеводсвязывающих свойств, а также изучение влияния таких лектинов на
становление симбиоза между бобовым растением и ризобиями.
Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:
1. Клонировать и секвенировать углеводсвязывающие области генов
лектинов бобовых растений;
2. Провести сравнительный анализ как секвенированных нами, так и
имеющихся в Международном банке данных нуклеотидных и аминокислотных
последовательностей углеводсвязывающих областей бобовых лектинов;
3.
Исследовать
значение
лектина
в
существовании
двух
групп
инокуляции Galega officinalis - Rhizobium galegae bv. officinalis и Galega
orientalis - Rizobium galegae bv. orientalis;
4. Сконструировать гибридные лектаны на основе полноразмерного гена
лектина гороха с измененной специфичностью к углеводам путем замещения
углеводсвязывающего участка этого белка гомологичными участками генов
лектинов других бобовых растений;
4
5. Подобрать условия экспрессии гибридных генов лектинов в клетках
Е.соИ и полз^ения фзт1кционально активных белков;
6. Исследовать углеводсвязывающие свойства гибридных лектинов;
7. Оценить влияние природных и гибридных лектинов на становление
симбиоза бобовых растений с различными ризобиями.
Научная новизна. Обнаружено, что лектины бобовых растений одной
группы
перекрестной
инокуляции
имеют
формируемую
их
углеводсвязываюпцши последовательностями (УСП) сходную специфичность
к
простым
сахаридам. Показано,
что
в
УСП
лектинов
присутствуют
консервативные аминокислоты, определяющие специфичность
лектина
с
ризобиальными
рецепторами,
что
указывает
связывания
на
участие
углеводсвязывающего участка лектина и в формировании специфичности к
сложным сахаридам. Из этого следует, что специфичность к моносахаридам
является
необходимым, но
не достаточным
условием, чтобы
лектины
специфично связывались с поверхностными полисахаридами ризобий.
Впервые показано, что лектин является одним из критических факторов,
обусловливающих существование двух групп инокуляции G. officinalis R. galegae bv. officinalis и G. orientalis - R. galegae bv. orientalis. Сходство в
строении Nod-факторов биоваров R. galegae и различия в строении лектинов
козлятника восточного и козлятника лекарственного можно рассматривать как
свидетельство
в
пользу
независимого
влияния
этих
двух
факторов
специфичности на формирование бобово-ризобиального симбиоза.
Впервые секвенированы фрагменты генов лектина Trifolium repens,
Т. pretense и Т. trichocephalum. Обнаружено, что эти растения из одной группы
перекрестной
инокуляции
имеют,
тем
не
менее,
совершенно
разные
углеводсвязывающие последовательности лектинов.
Впервые созданы уникальные гибридные конструкции, представляющие
собой
полноразмерный
ген
лектина
гороха
с
замещенными
углеводсвязывающими участками из генов Т. pratense, Onobrychis arenaria,
Melilotus albus (psl/таГ) и Astragalus glycyphyllos (psl/agl). Синтезируемые в
клетках E.coli гибридные лектины PSL/AGL и PSL/MAL связывали сахариды и
вызывали агглютинацию эритроцитов, что указывает на корректность их
5
пространственной укладки и ассоциации субъединиц. Замещение У С П лектина
гороха на У С П пектинов М
albns и А. glycyphyllos привело к изменению
специфичности к моно- и дисахаридам, что свидетельствует о формировании
углеводсвязывающим пептидом пектинов аффинности к простым сахаридам.
Впервые показано, что пектины бобовых растений, синтезированные в
бактериях,
сохраняют
свойства,
вызывающие
специфические
реакции
симбиоза.
При обработке гибридным лектином PSL/AGL бактерий из клубеньков
Astragalus
cicer
(идентифицированных
нами
по
генам
16S
рРНК
как
микроорганизмы, близкие к Agrobacterium tumefaciens) в ризосфере люцерны
впервые наблюдали нетрптичные симбиотические отношения с образованием
инфицированных клубеньков. Это свидетельствует о том, что лектин является
одним из критических факторов в данной симбиотической системе.
Практическая значимость. Знания о закономерностях формирования
углеводной
специфичности
пектинов,
обусловленной
их
структурными
особенностями, могут быть использованы в моделировании белков с новыми и
заданными углеводсвязывающими свойствами. Разработанная нами стратегия
изменения углевосвязывающих свойств пектинов позволяет моделировать
пектины с разнообразной специфичностью, что может найти применение в
биотехнологии и фармакологии
Гибридные
пектины
можно
использовать
для
исследований
физиологических свойств этого белка в бобово-ризобиальных взаимодействиях;
более того, они способны расширять специфичность растений к ризобиям, то
есть увеличивать круг микросимбионтов, из которых растения могут выбрать
наилучшего
партнера для азотфиксации, что
может
привести к
росту
урожайности сельскохозяйственных культур.
Апробация
работы.
Материалы
диссертации
были
доложены
на
конференции молодых ученьпс «Молодые ученые Волго-Уральского региона на
рубеже веков» (Уфа, 2001 г.); на 6-ой конференции молодых ученых «Биология
- наука 21-го века» (Пущино, 2002 г.); на Ш съезде Биохимического общества
(Санкт-Петербург, 2002 г.); на X V I зимней молодежной научной цжоле
«Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии»
6
(Москва, 2004 г.); на международной конференции «Наука и бизнес: Поиск и
использование
новых
биомолекул: биоразнообразие, окружающая
среда,
биомедицина». Пущино, 2004.
Конкурсная
поддержка
работы. Исследования
были
поддержаны
грантами Р Ф Ф И ( № 04-04-48884), РФФИ-Агадель (№ 02-04-97903), грантом
Программы поддержки ведущих научных школ Р Ф (НШ-2217.2003.4).
Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 7 печатных
работах, а также депонированы в международных банках данных E M B L ,
GenBank и D D B J .
Объем
и структура
диссертации. Диссертация изложена на 148
страницах, содержит 3 таблицы и 19 рисунков. Она состоит из введения, обзора
литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2),
результатов исследования и их обсуждения (глава 3), заключения, выводов и
списка литературы, включающего
249 источника (15 отечественных и 234
зарубежных).
О Б Ъ Е К Т Ы И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Для
исследования
структурных
особенностей
углеводсвязывающих
участков лектинов бобовых, конструирования гибридных лектинов, а также
изучения их влияния на становление бобово-ризобиального симбиоза были
взяты следующие растения: козлятник восточный (Galega orientalis), козлятник
лекарственный {Galega officinalis), клевер белый (Trifolium repens), клевер
луговой
{Trifolium
pratense),
клевер
волосистоголовый
{Trifolium
trichocephalum), горох посевной {Pisum sativum), донник белый {Melilotus albus),
эспарцет песчаный {Onobrychis arenaria), астрагал солодколистный {Astragalus
glycyphyllos), люцерна посевная {Medicago sativa), а также ризобии Rhizobium
galega bv. orientalis 0702, Sinorhizobium meliloti и Rhizobium leguminosarum bv.
viciae и бактерии из клубеньков Astragalus cicer, идентифицированные нами по
генам 16S рРНК как микроорганизмы, &луакяе к Agrobacterium tumefaciens.
В
работе использованы следующие методы. ДНК из 2-х суточных
проростков
выделяли
фенольно-детергентным
методом
(Graham,
1978).
Плазмидную ДНК вьщеляли методом мягкого лизиса (Clewel, Helinski, 1969) с
некоторыми
модификациями. При
анализе рекомбинантных
7
клонов для
определения размера вставки применяли быстрый метод щелочного лизиса
бактериальных
колоний
(Bimboim,
Одноцепочечную фагмидную Д Н К
Doly,
1979;
Kondo
et
al.,
1991).
получали, используя хелперные фаги
М13К07 или R408. Качество и количество выделенных преп^атов определяли
аналитическим электрофорезом в 1%-ном агарозном геле. Расщепление ДНК
проводили в буферах, рекомендованных фирмами-поставщиками. Агарозный
гель-электрофорез
проводили
в
приборах
подводного
типа
GNA-200
(Pharmacia, Швеция) или аналогичных. ПЦР проводили в амплификаторе
производства компании "ДНК-технология" с использованием ДНК-полимеразы
Thermus aquaticus (McPherson et al., 1995). Элюцию фрагментов Д Н К из
агарозного геля проводили с помощью легкоплавкой агарозы (Wieslander,
1979). Секвенирование проводили, на автоматическом секвенаторе
«ABI
P R I S M 310 Genetic Analyzer» (Applied Biosystems, Inc., С Ш А ) , a также в
неавтоматическом режиме в приборе вертикального типа Макрофор (Pharmacia
- L K B , Швеция). Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей
проводили с помощью пакета компьютерных программ D N A S I S
(Hitachi
Software Engineering Со, Япония) и Lasergene фирмы "DNASTAR, Inc." ( С Ш А ) .
Для синтеза белка питательную среду «Terrific broth» засевали ночной
культурой Е.соН, наращивали при 37°С до ODMO = 0.6, экспрессию гена лектина
индуцировали добавлением I P T G до 0.7 мМ, инкубировали в течении 4 ч при
30°С. Клетки лизировали замораживанием, белковую фракцию фильтровали
через мембранные фильтры « S Y N P O R » с размером пор 40 мкм. Элюировали
белок на никелевых колонках «HisTrap» по протоколу фирмы Amersham. Тесты
агглютинации лектином были выполнены с 25 мкл 2%-ного раствора
эритроцитов
на
планшетах
в
фосфатном
буфере.
Планшеты
были
инкубированы при комнатной температуре в течение 1 ч. Результаты реакции
определялись
визуально. Реакция
разведением соответствующего
ингибирования выполнялась
серийным
сахарида при найденном титре лектина.
Обработку ризобий лектинами в ризосфере проростков бобовых растений
проводили в стерильных условиях в пробирках типа эппендорф в течении 15 ч
при 28°С. После инкубации проростки с инокулятом пересаживались в
стаканчики со стерилизованным вермикулитом.
8
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
1. Углеводсвязывающие участки лектинов козлятников восточного и
лекарственного. Симбиоз Galega sp. - R. galegae строго специфичен, ни
макросимбионт не инокулируется другими ризобиями, ни его микросимбионт
не способен нодулировать другие бобовые. Более того, штаммы R. galegae bv.
officinalis (инфицирующий козлятник лекарственный) и R. galegae bv. orientalis
(инфицирующий
перекрестной
козлятник
инокуляции.
восточный)
Проведенные
не
составляют
ранее
одну
исследования
группу
геномного
полиморфизма различных штаммов R. galegae с помощью методов случайного
праймирования ( R A P D )
и концевого мечения рестриктазных фрагментов
( К М Р Ф ) показали отчетливо выраженную генетическую разнородность между
биоварами (Баймиев и др., 1996). Однако штаммы R. galegae, принадлежащие
двум биоварам, продуцируют почти идентичные Nod-факторы, являющиеся
детерминантами специфичности (Yang et al., 1999). То есть, Nod-факторы
служат барьером при становлении симбиоза Galega sp. с гетерологичными
ризобиями, но не являются таковым на пути формирования симбиотических
отношений между G. orientalis и R. galegae bv. officinalis или G. officinalis и
R. galegae
bv.
orientalis.
Поэтому
природа
фактора,
ограничивающего
перекрестную инокуляцию ризобиями морфологически близких растений
G. orientalis и G. officinalis, оставалась до конца неясной.
Принимая во внимание гипотезу о лектине как критическом факторе
специфичности со стороны растения-хозяина (Diaz et al., 1989; Kijne et al., 1997;
Hirsch, 1999), нами были секвенированы фрагменты генов лектинов длиной ~
360 п.н. у растений G. orientalis и G. officinalis разного географического
происхождения.
Эти
фрагменты
включают
в
себя
последовательности,
кодирующие углеводсвязывающий домен данных белков. В
нуклеотидной
последовательности фрагмента гена лектина козлятника восточного обнаружена
открытая рамка считывания, не нарушающаяся по всей длине клонированного
фрагмента. Однако при анализе последовательностей гена лектина козлятника
лекарственного обнаружены мутантные кодоны и кодоны терминации сразу
после
области,
кодирующей
углеводсвязывающий
пептид.
При
этом
локализация и число мутаций в генах лектина растений из разных мест
обитания различаются между собой (рис. 1).
Судя по тому, что кодоны терминации и множественные мутации
локализованы именно после функционально значимых областей, идентичных
среди
лектинов
козлятника
лекарственного,
можно
предположить, что
третичная структура функциональной части такого «укороченного» лектина все
же не сильно нарушена, и что он способен правильно сворачиваться в
пространстве
с
сохранением
своих
функций.
Хотя
нельзя
исключать
вероятность сушествования у этого вида и других лектинов - изолектинов.
Функционально значимые области козлятника лекарственного обнаружили
гомологию с той же областью гена лектина козлятника восточного, уровень
которой, однако, оказался меньше, чем можно было ожидать для этих очень
близких морфологически и филогенетически видов растений.
Gorieniaiis
с officimlis А
ярьаьу-э-и
тУАУ-гот—и—№
я;:опго»-1";
10
30
10
40
50
япльпсвтуаютотухуктпсяилпииж- - - к а ш у я ы х в т
ЯРЬД.ГОВаМЯК'Гвк'ГУЛУКИХгаТЯЕИЯДУМЖШЦаГМУМаПГОУ
с officinalis 68 аядьгаасруясгдкгтаустпгруиаивьттгриагопгояаигоу
G officinalis 7}
G officinalis 85
а)
8ИЖ.И1Ы(Д1У*К'Г1НТ1АУКЯ1ТРЯВИ1ПЬУ1К111ШП01ЯУИ81ИУу
КИД.ИГОиИУУХЧШЫ'УАУКРРГУЯПШЯйУтаШЮОДУИВЯУУ
>Gorlenlalis
CofflcinalisA
G offlcinalis 68
GofficinalisJS
GofficlnallsSS
«о
—x-чшnL-n-тв,^x--■L—■a-■ч-lf
70
во
——*^--T—il>—-—..—..-——....——.—.■.-.
б)
90
100
ITl[gWBFIjMaKBWVMIKPIWVraVbSVTL-laB- -1ДГ1ИЪВ- - Р У У Д .
NeWtVQCni
XDVLeWIXnHrtlXDDWIIflVIBIVPL
gCDKVQCmXDVbSVTbTyPWBDVIVILTVTDlVPL
ЯЩКУЦСЯ
XDVLSVTbTYlimeVWII/rVTDIVPL
ЖЗМСУОСГН
XPVbBVTiyf«mHJDV«yiLlVTDIVPL
»-ми1и11М1Ш1Ш.11Т-
170
Uo
ito
]i«
alt
lie
>1«
lit
111ШМ111111 iiHiimimiiHiw.ianiiiiiuiHiHHiii i immiiiuji, H I I H I J I H J I U I M I H I I i n
молюшдствне-
Рис. 1. Аминокислотная (a) и нуклеотидная (б, показан участок с терминирующими
триплетами) последовательности фрагментов генов лектинов козлятников восточного и
лекарственного. Терминирующие кодоны и аминокислоты, участвующие в связывании
ионов металлов, выделены жирным шрифтом Последовательность углеводсвязывающего
пептида подчеркнута.
Кроме того, у лектина козлятника лекарственного обнаружена в той же области
делеция
в
41 п.н. Области
углеводсвязывающих
пептидов
лектинов
TYCNPGWDPRDR - у G. orientalis и TFYNEEWDLVIKDEH - у G. officinalis сильно
10
отличаются.
Принимая
во
внимание
важность
этого
участка
белка
в
формировании его углеводсвязывающей способности, можно думать, что
имеются
принципиальные
различия
в
специфичности
лектинов
данных
растений. При этом, как было показано ранее, У С П лектинов бобовых растений
одной группы инокуляции, характеризуются высокой схожестью (Баймиев и
др., 2001). Из чего также можно сделать вывод, что лектин является одним из
критических
факторов,
обусловливающих
невозможность
перекрестной
инокуляции G. officinalis ризобиями R. galegae bv. orientalis или G. orientalis R galegae bv. officinalis. Кроме того, сходство в строении Nod-факторов
биоваров R. galegae и различия в строении лектинов козлятника восточного и
козлятника лекарственного можно рассматривать как свидетельство в пользу
независимого влияния этих двух факторов специфичности на формирование
бобово-ризобиального симбиоза.
2. Сравнительный анализ углеводсвязывающих
аминокислотных
последовательностей лектинов бобовых растений. Сопоставляя данные по
лектинам некоторых растений взятые, в том числе, из Международного банка
нуклеотидных
и
аминокислотных
последовательностей,
с
известной
специфичностью к моносахаридам, с данными по видовому составу ризобий,
инфицирующих одинаковые виды растений, обнаружили, что растения с очень
схожими зтлеводсвязывающими участками лектинов инокулируются одними и
теми же ризобиями (Баймиев и др., 2001). Чтобы проследить их взаимосвязь,
был
проанализирован
аминокислотный
состав
УСП
этих
лектинов.
В
первичной структуре лектинов бобовых, входящих в одну группу инокуляции,
наличествуют
консервативные,
характерные
только
для
этой
группы
растительных лектинов, аминокислоты. У представителей как одной, так и, как
правило, разных гр5тш их положение совпадает (рис. 2). Эти консервативные
аминокислоты, часть из которых вовлечены в формирование специфичности к
моносахаридам, видимо, и определяют специфичность связывания лектина с
ризобиальными
рецепторами.
Таким
образом,
наличие
консервативных
аминокислот в У С П указьшает на то, что этот участок, а также прилежащие
аминокислотные остатки на поверхности лектина принимают участие и во
взаимодействии с олигосахаридами.
11
Rhlzoblum
G. officinalis
G. officinalis
G.
G.
G.
VaVKFDTfMlgeWDLVIKDBHHIGIN
VaVKFDTfHneEWDLVIKDBHHIGIN
12
Rhizobium
vicia
cracca
V i C i a faba
Pisum sativum
Lathyrus
ocbrus
Lathyrus
Lens
VAVKFDTtTMeEWDLVIKDBHHIGIW
galegae
bv.
oxlentalis
VGVBFPNYVME-WDP—KH-PHIGID
VAVBFPTVCMPGWDP
RDRHIGIN
legimlnosarum
bv.
viciae
Man/Glo
УДУ1ГРТГМЦДЯРРЯ-РКДШ1С1Р
VAVEFDTFMMAHDPS-MGIJRHIGIG
VAVBFDTfTiWAAWDPS-WRJRHIGID
VAVEFPTrMtrAWDPa-WGDRHIGID
sativum
VAVllFDTri№UWDPg-»GPRHIGID
culinaris
VAVEFDTFHlAAWDPS-WKeRHIGID
laoiottei
VAVEFPTFtHmWDPS-MKERHIGID
Lena
ervoides
Lens
Lens
nigricans
odemensis
Rhizobium
iens
officinalis
3
4
Rhizobium
11
orientalis
bv.
lAVKFDTraMaWDLVIKDIMHIGIN
2
Officinalis
officinalis
G. orlentalis
galegae
1
VAV«n>TJI№UWDPS-MKCRHIGID
VAVBFDTlTMAAWDPS-WKIlEailGID
VAVBfPTgMlAAWDPS-tnagRHIGID
leguminosarum
bv.
trifolii
Trifolium
pratense
Trifolium
lepens
VAVEFDTtflMA-WDP—KJGRHIGID
Melllotus
Melilotus
albus
officinalis
VAVEFDTITnitA-WDP—KbGRHIGID
УАУЕГОТтаНА-ТОР—KIDRHIGID
Trlfolium
VAVEFDTrWVDWD-r-MRroHIGID
trichocephalum
VAVEFDTrru-QWDPG—FQHI6ID
Sinorhizobium
meliloti
Мгш/eic
sativa
VAVBIDTrHWIT-WDP—fCJNRHIGIN
truncatula
VAVEIDTFHWr-vmP—KrNRHIGIN
Phyllobacterium
trifolii
Mim/Glc
Onobryahis
viciifolla
VAVBFDTFSHR-Vmpa
NSHIGIN
Rhizobium
sp.22Al
Man/Glo
Canavalia
enslformis
VAVELDTYPNTDIGDP—SYPHIGID
Bradyrhizobium
japonicum
Gal
Arachls
hypogaea 4
VGVBFl5TySMgEYNDPP—TDHVGID
Arachis
hypogaea 5
VGVEFDiraiaEYNDPP—THHVGID
Arachis
hypogaea 6
VGVaFDsySHSlBFKDPP—YQHVGID
GalNAc
Medicago
Medicago
Cytisus
scoparius
Vigna linearis
11
Phaseolus lunatus
Glycine
Phaseolus
max
Rhizobium
VAVEFDTlTIMfiaWDPQT—NPHIGID
leguminosarum
phaseoli
Gal
vulgaris
УАУЕГРТДЗМУИНРРКР
Mezorhizobium
loti
Astragalus
falcatus
Astragalus
glycyphyllos
Oaytropis pilosa
Robinla
VAVEFDT£ajHHWDPET—G-HIGIN
VAVBFDTCIMtnWDPK
GSHIGID
GalNAo/Gal
VAVBFDTgBNg-WDPP
MPHIGIN
RHIGID
VAVKFDTXXMgeWD-T-g-VPHIGID
VAVEFDTUKBEWD-T-ff-VPHIGID
VAVBFDTXmEEWD-T-g-VPHIGID
pseudoacacia
VAVSFDTrPMVAWDPN-S-I-HMGID
Mezorhizobium
amorphae
Amorpha fruticosa
VAVBET)TFP-DAWDPQ-G-R-HIGID
Рис. 2. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей У С П лектинов
бобовых растений, инокулирующихся соответствующими штаммами ризобий. Курсивом
выделены аминокислоты, определяющие специфичность связывания углеводов лектинами,
обычным полужирным шрифтом - в связывании ионов металлов.
12
в
лектинах растений, вступающих в симбиоз с одними и теми же
штаммами
ризобий,
имеются
редкие
замены
по
консервативным
аминокислотам, которые, как правило, почти всегда представляют собой
замены на подобные аминокислоты. Например, Leu <-> Не «^ Val - неполярные
(гидрофобные) аминокислоты; Lys <-> Arg *^ ffis - положительно заряженные
аминокислоты; Asp <-> Glu - отрицательно заряженные аминокислоты.
Из рис. 2 видно, что сахароспецифичность лектинов выходит за пределы
группы растений одной инокуляции. Так, специфичность связывания лектинов
с
ризобиями
очевидно
формируется
не
только
их
аффинностью
к
моносахаридам, но и аффинностью к сложным углеводам. Если корреляции
между группой У С П Man/Glc-специфичных лектинов растений и их группой
инокулируемости ризобиями почти не наблюдается, то по консервативным
аминокислотам в этих участках она легко прослеживается. Напротив, растения
с
Gal/GalNAc-специфичными
лектинами преимущественно
инфицируются
одними и теми же ризобиями В. japonicum. Поскольку лектины растений одной
группы инокуляции имеют сходную специфичность к простым сахаридам, то
можно сделать вывод, что это необходимое, но недостаточное условие, чтобы
лектины специфично связывались с поверхностными полисащэидами ризобий.
3. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей
секвенированных фрагментов генов лектина Trifolium rqtens, Trifolium
pratense и Trifolium tnchocephalum. В экспериментах по исследованию роли
лектина
при
становлении
бобово-ризобиального
симбиоза
некоторые
представители Trifolium sp. являются по существу модельными растениями.
Тем не менее, последовательности их лектинов до сих пор не были определены.
Нами были секвенированы фрагменты генов лектинов длиной ~ 360 п.н.
Т. герет,
Т. pratense
и
Т.
trichocephalum,
включающие
в
себя
последовательности, кодирующие углеводсвязывающий домен данных белков.
В нуклеотидных последовательностях этих фрагментов обнаружена открытая
рамка считывания, не нарзтпающаяся по всей длине клонированного фрагмента
и не содержащая нитронов. При анализе нуклеотидного и аминокислотного
состава углеводсвязывающего участка лектинов разных видов клеверов мы
обнаружили крайнюю их гетерогенность между собой, выходящую за пределы
13
их группы 1шокуляции. На филогенетическом древе углеводсвязывающих
доменов лектинов, клевер белый образует компактный кластер с донниками
белым я лекарственным, клевер же луговой далеко отстоит от представителей
Trifoleae, тогда как сравнительный анализ У С П на нуклеотидном уровне и
древо, основанное на последовательностях внутренних транскрибируемых
спейсеров генов рРНК, свидетельствуют о том, что луговой клевер входит в
группу Trifolium sp. Аналогичная ситуация наблюдалась и в фуппе Galegae у
лектинов
козлятников
восточного
и
лекарственного.
Нуклеотидные
последовательности У С П их схожи, но аминокислотные сильно различаются.
Клевер волосистоголовый по углеводсвязывающему участку на нуклеотидном
и на аминокислотном уровне не входит в группу представителей Trifoleae.
Подобная картина наблюдается и с лектинами М sativa и М truncatula. Все три
изолектина последнего вида входят в совершенно разные группы.
По всей видимости, перед нами разные аллели генов лектина Trifolium sp.
-
изолектины.
У
рассматриваемой
делетирован Pro 130, являюпщйся
формы
лектина
инвариантной
клевера
аминокислотой
красного
лектина
бобовых, связьгеающий ионы металлов и стабилизирующий пространственную
структуру
белка. Это
функциональную
может
оказывать
активность.
существенное
Возможно,
у
влияние
клеверов
на его
красного
и
волосистоголового, в отличии от клевера белого, имеется не один лектин, а
несколько, как это обнаружено у некоторых представителей рода чечевицы,
например.
4.
Создание
гибридных
конструкций
гена
лектина.
Заменяя
функционально значимые аминокислоты или области углеводсвязываюпщх
участков, можно создавать лектины с заданной специфичностью к сахаридам. В
связи
с
этим
нами
бьши
созданы
гибридные
лектины
на
основе
полноразмерного гена лектина гороха {Pimm sativum) с углеводсвязывающими
участками следующих растений: Trifolium pratense, Melilotus albus, Onobrychis
arenaria, Astragalus glycyphyllos. Ha рис. 3 показана схема создания гибридных
конструкций гена лекиша. Вектор pIC-!9h с полноразмерным геном лектина
гороха амплифицировали праймерами, направленными друг от друга, их 5'концы приходились
точно встык
с углеводсвязывающим
14
участком, во
избежание нарушения как рамки считывания в целом, так и кодонов значимых
аминокислот. Таким образом, создавался ампликон-вектор pIC-19hPSL"c геном
лектина гороха без У С П , в котором затем клонировали У С П других растений,
полученные
амплификацией
Pfii
полимеразой
с
фосфорилированными
праймерами.
/
^
,'
pIC-19h
SamHI
"
амплифвкация I
plC-19hPSL
Рис. 3. Схема создания гибридных конструкций гена лектина путем замещения УСП
лектина гороха на УСП лектинов других бобовых растений.
Сконструированные таким способом гибриды амплифицировали праймерами с
сайтом рестрикции Bgl I I , один из которых приходился на A T G кодон гена
гороха, а другой отжигался чуть ниже кодона терминации. Ампликоны
рестрицировали
по
Bgl
II
сайту
и
клонировали
по
Ват
HI
сайту
экспрессионного вектора рЕТ-15Ь, предварительно обработав его липкие концы
щелочной фосфатазой.
5. Синтез лектинов в клетках Е.соП и их выделение. Поиск наиболее
оптимального уровня синтеза лектина был проведен среди штаммов клеток
КсоИ:
BL21(DE3)pLysS,
BL21trxB(DE3)pLysS
и
OrigamiB(DE3)LysS,
удовлетворительная наработка белка найдена у последних двух. Экспрессию
генов лектина индуцировали изопропил-|3-тиогалактопиранозидом (ИПТГ).
Методом электрофоретического фракционирования в геле с SDS, в белковом
15
лизате клеток OrigamiB(DE3)LysS с геном лектина, обнаружен целевой белок,
отсутствующий в контрольных образцах (рис. 4).
28 Ша
1 2 3 4 5 6 7 8 9
10
Рис. 4. Электрофореграмма препаратов тотального белка (ТБ) клеток Е соН:
1 - ТБ клеток с геном лектина Р. sativum в 7 М гуанидин гидрохлориде; 2 - ТБ клеток с
геном лектина Р sativum; 3 - ТБ с гибридным геном лектина О arenaria; 4 - ТБ с гибридным
геном лектина А glycyphyllos; 5 - ТБ с гибридным геном лектина М. albus; 6 - ТБ с геном
лектина G orientalis; 7 - ТБ с гибридным геном лектина Т pratense; 8 - ТБ клеток с вектором
рЕТ-15Ь без гена лектина; 9 - ТБ клеток ЕсоИ; 10 - лектин Р sativum Стрелкой показан
лекгин.
Вектор рЕТ-15Ь имеет шесть повторов гистидинового кодона CAT,
локализованных
синтезируемый
между
белок
его Т7
является
промотором и
«fusion»
белком
полилинкером.
с
шестью
Поэтому
остатками
аминокислоты гистидина. Это позволяет с помощью никелевых колонок
элюировать «меченый» таким образом белок и детектировать его как целевой в
процессе выделения.
Хотя наиболее высокий уровень экспрессии гена лектина обнаружен в
штамме OrigamiB(DE3)LysS
в котором образуется наименьшее количество
нерастворимых
агрегатов,
белковых
BL2 ltrxB(DE3)pLysS,
наработку
белка
проводили
в
поскольку именно с использованием этого штамма
удалось добиться наилучшей элюции аффинной хроматофафией на колонках
«HisTrap» фирмы Amersham. Как видно на рис. 5а, белка массой в 28 Ш а нет в
тотальной белковой фракции штамма клеток BL21trxB(DE3)pLysS
без гена
лектина (дорожка 1) и в элюатах белка из этих клеток (дорожки 3 и 4).
Напротив, в рекомбинантных клетках с геном лектина можно видеть целевой
белок (дорожка 2) и в его элюате из этих клеток (дорожки 5 и 6).
16
Таким
образом,
наглядно
показано,
что
элюируемый
белок
не
принадлежит клеткам Е.соИ, а является целевьпй белком, лектином.
На рис. 56 показаны результаты аффинной хроматофафии природных и
гибридных лектинов, синтезированных в клетках BL21trxB(DE3)pLysS.
97,4 kDa
67kDa
28 Ю а
45 kDa
29 kDa
6)
a1
1 2
1
3
4
5
Рис. 5. a) Электрофореграмма препаратов белка клеток E.coli:
1 - тотальный белок (ТБ) клеток без гена лектина,- 2 - ТБ клеток с гибридным геном лектина
А glycyphyllos: 3 и 4 - 1 и II фракшя элюции белка из клеток без гена лектина; 5 и 6 - 1 и II
фракция элюции белка из клеток с геном лектина А. glycyphyllos, 7 - маркер молекулярного
веса. Стрелкой показан лектин.
б) Электрофореграмма лектина, вьцеленного аффинной хроматографией из рекомбинантных
клеток E.coli: 1 - лектин Р sativum (PSL); 2 - лектин G orientalis (GOL), 3 - гибридный
лектин А. glycyphyllos (PSL/AGL),- 4 - гибридный лектин М. albus (PSL/MAL); 5 - гибридный
лектин О arenaria (PSL/OAL).
6. Анализ специфичности лектинов. Анализ гибридных лектинов на
специфичность
гемагглютинацией
взаимодействия
эритроцитов.
их
с
моносахаридами
Минимальная
концентрация
проводился
белка, при
которюй еще наблюдалась агглютинация, составила приблизительно 40 мкг/мл.
Ингибирование реакции агглютинации сахаридами проводили в пределах от 10
до 100 м М с двукратным разведением.
Как видно из таблицы 1, при относительно отличающейся первичной
структуре У С П лектинов астрагала, гороха и донника, они показывают
некоторое сходство по специфичности к сахаридам, но по силе аффинности к
ним заметно различаются. Замещение углеводсвязывающего участка лектина
Р. sativum участком лектина А. glycyphyllos привело к значительному (почти на
порядок) ослаблению аффинности к Man и приобретению свойства связываться
17
с Gal. Таким образом, можно предположить, что У С П лектина А. glycyphyllos
принимает
участие
соответствующему
в
формировании
участку
лектина
специфичности
Bauhinia
purpurea
к
Gal,
подобно
или Р
sativum,
октапептид которого проявляет специфичность к Man (Yamamoto et al., 1992).
Таблица 1
Специфичность гибридных лектинов PSL/MAL и PSL/AGL к моно- и дисахаридам
Сахарнд
Концентрация сахарида ( м М )
ингибирования реакции агглютинации
гибридный лектин
PSL/MAL
гибридный лекгин
PSUAGL
Glc
25
25
Man
10
>100
Gal
>100
25
>100
-
GalNAc
Fru
25
Lac
25
25
Mai
-
>50
Cel
10
>50
>50
Напротив, при замещении углеводсвязывающего участка лектина Р. sativum
участком лектина М. albus, белок сохранил специфичность к Man и Glc и
приобрел слабую аффинность к Gal и GalNAc. В-обоих случаях, при изменении
У С П лектина P S L на таковой донника и астрагала не происходило изменения
его сродства к Glc из чего мы сделали вывод, что данная специфичность
лектина, видимо, формируется преимущественно другими его областями.
Таким
образом,
эти
гибридные
лектины
проявили
совмещенную
специфичность к Gal и Man/Glc, что не характерно для бобовых лектинов.
Гибридные лектины экспрессировались в Е. соИ в функциональной форме и
представляли собой мультивалентные белки, подобно природному лектину Р.
sativum.
Поскольку У С П формирует не только специфичность лектина к простым
сахаридам, но и, как было показано нами выше, к сложным, очевидно, что
замещение У С П гороха соответствующими участками лектинов донника и
астрагала привело и к изменению специфичности белка к сложным сахаридам.
18
7.
Анализ
влияния
природных
и
гибридных
лектинов
на
взаимодействие бобовых растений с ризобиями. Для оценки влияния лектина
на развитие бобово-ризобиального симбиоза были поставлены различные
варианты опытов с инокуляцией растений астрагала путового, козлятника
восточного и люцерны посевной ризобиями люцерны, гороха, козлятника
восточного и астрагала при обработке их природными PSL, G O L и гибридными
пектинами
PSL/MAL,
PSL/AGL.
Наиболее
заметные
фенотипические
проявления были обнаружены в следующих вариантах.
При обработке ризобий R. leguminosarum bv. viciae лектином гороха P S L
в
ризосфере
люцерны
были обнаружены
неинфицированные
клубеньки
необычайно больших размеров, имевшие особенную гроздеподобную форму,
не наблюдавшиеся в других вариантах (рис. ба).
Рис. 6. Клубеньки, сформировавшиеся на корнях люцерны при инокуляции ее:
а) неспецифическими R leguminosarum bv. viciae, обработанными лектином PSL;
б) бактериями из Astragalus cicer и при обработке гибридным лектином PSL/AGL;
в) ризобиями люцерны - контрольный вариант.
Хотя экзогенный
характер действия лектина ограничивает
область
исследования его влияния на бобово-ризобиальные взаимодействия, можно,
тем не менее, сказать, что в данном опыте лектин был необходим для
клубенькообразования. Таким образом, лектин, синтезированный в клетках
Е.соИ, способен, подобно природному, вызывать специфические реакции
симбионтов.
19
в результате инокуляции люцерны неспецифичными для нее бактериями
из клубеньков А. cicer и обработки лектином PSL/AGL мы обнаружили
несколько серых клубеньков (рис. 66). Методом R A P D
была показана
идентичность геномов ризобий из данных клубеньков и исходного инокулята.
Таким образом, мы наблюдали совершенно нетипичные отношения
между люцерной и бактериями астрагала, упоминаний о которых в литературе
пока нет. Как было показано в предыдущей главе, замена У С П лектрша
Р. sativum участком лектииа из А. glycyphyllos привела к изменению его
специфичности к моносахаридам. На системе же М sativa - клубеньковые
бактерии А. cicer исследованы физиологические свойства этого белка. Так,
лектин необходим для формирования инфекционных нитей, образования
клубеньков, инфицированных ризобиями и, по видимому, участвует в адгезии
бактерий
к
корневым
волоскам. Это
согласуется
и
в
очередной раз
подтверждает наблюдения, что растения одной группы инокуляции имеют
очень сходные углеводсвязывающие участки лектинов (Баймиев и др., 2001).
При инокуляции G. orientalis разнообразными неспецифичными для него
штаммами
с
обработкой
их
лектинами
не
обнаружено
заметных
фенотипических проявлений, что доказывает строго специфичный симбиоз
G. orientalis - R. galegae bv. orientalis, определяемый многими критическими
факторами.
На основании результатов данных исследований углеводсвязывающих
свойств гибридных лектинов и их влияния на симбиоз можно сказать
следующее. При экзогенной обработке ризобий такими лектинами в ризосфере
растений, такие фенотипические проявления симбионтов, как адгезия бактерий
к поверхности корней, образование инфекционных нитей и формирование
клубеньков
вызываются, по всей видимости, секретируемым лектином.
Исследования физиологических
свойств лектина
в
бобово-ризобиальных
взаимодействиях можно проводить гибридньпли лектинами, полученньп^и
путем изменения их углеводсвязывающих участков. При этом, как показывают
эксперименты над люцерной, астрагалом и горохом, принадлежащим разным
трибам, гибридные лектины, тем не менее, вызывали у них симбиотические
реакции, более того, они расширяли специфичность растений к ризобиям. Это
20
значительно упрощает исследования роли лектинов в бобово-ризобиальном
симбиозе,
связанные
с
нехваткой
данных
по
полноразмерным
последовательностям их генов, а также с проблемами их выделения. Кроме
того, гены таких гибридных лектинов можно интродуцировать в бобовые
растения с целью значительно увеличить группу клубеньковых бактерий, из
которых растения в данных почвенно-климатических условиях могут выбрать
наилучшего партнера для симбиоза, что, в конечном счете, может привести к
более высокому уровню азотфиксации, а, стало быть и к росту урожайности
сельскохозяйственных культур.
ВЫВОДЫ
1. в углеводсвязывающей области лектинов бобовых растений одной
группы перекрестной инокуляции выявлены консервативные аминокислоты,
ответственные как за формирование специфичности лектинов к простым
сахаридам так и за специфрпшое взаимодействие лектинов с ризобиями.
2.
Обнаруженные
З^частков
генов
различия
лектина
последовательности,
G.
так
секвенированных
officinalis и
и
по
G.
последовательностей
orientalis, как
консервативным
по общей
аминокислотам,
свидетельствуют в пользу гипотезы, что лектин является одним из критических
факторов,
обуславливающих
существование
двух
фупп
инокуляции
G. officinalis • R. galegae bv. officinalis и G. orientalis - R. galegae bv. orientalis.
3. Показано, что растения Trifolium repens, Т. pratense и Т. trichocephalum,
из одной группы перекрестной инокуляции, имеют лектины с совершенно
различными У С П .
4. На основе гена psl лектина Pisum sativum сконструированы гибридные
гены лектинов с У С П лектинов Onobrychis arenaria, Т. pratense, Astragalus
glycyphyllos ipsl/agl), Melilotus albus (psl/mal).
5. Синтезируемые в клетках E.coli гибридные лектршы PSL/AGL и
PSL/MAL
способны
связывать
сахариды
и
вызывать
агглютинацию
эритроцитов, что указывает на их корректную пространственную укладку и
ассоциацию субъединиц. Замещение У С П лектина Р. sativum на У С П лектинов
М. albus и А. glycyphyllos привело к изменению специфичности к моно- и
дисахаридам.
21
6. Обработка
находящихся в ризосфере Medicago
sativa
ризобий
R. leguminosarum bv. viclae синтезированным в E.coli лектином P S L , привела к
образованию
неинфицированных
клубеньков,
что
свидетельствует
о
сохранении у бобовых лектинов бактериального происхождения функций,
способствугопщх становлению симбиоза.
7. При обработке гибридным лектином PSL/AGL бактерий Astragalus
cicer
в
ризосфере
отношения
с
М.
sativa
образованием
обнарз^ены
нетипичные
инфицированньк
симбиотические
клубеньков,
что
является
доказательством критичности влияния лектина на данный симбиоз. Гибридный
лектин
сохраняет
свои
функции, вызывающие
специфические
реакции
симбиоза.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1.
Губайдуллин
углеводсвязывающих
И.И.,
пептидов
Баймиев
лектина
А.Х.
у
Различия
козлятников
в
строении
восточного
и
лекарственного определяют разницу выбора ими партнера при бобоворизобиальном симбиозе. // Материалы юбилейной научной конференции
молодых ученых «Молодые ученые Волго-Уральского региона на рубеже
веков». Уфа, 2001. - С. 16-17.
2. Губайдуллин И.И., Баймиев А.Х. Специфичность симбиоза козлятников
восточного и лекарственного со штаммами Rfiizobium galegae определяется
различиями в строении углеводсвязывающих пептидов их лектинов // 6-я
Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука 21-го
века». 2002. - Том 1, - С. 237.
3. Губайдуллин И.И., Баймиев А.Х. Химерные гены лектинов бобовых с
измененной специфичностью к углеводам // Ш
Съезд
Биохимического
общества. Санкт-Петербург, 2002. - С. 285.
4. Чемерис А.В., Усанов Н.Г., Баймиев Ал.Х., Губайдуллин И.И., Корпела
Т., Вахитов В.А.
Генетическое штрих-кодирование микроорганизмов как
способ изучения их биоразнообразия. // Тезисы докладов международной
конференции «Наука и бизнес: Поиск и использование новых биомолекул:
биоразнообразие, окружающая среда, биомедицина». Пущино, 2004. - С. 46-48.
22
5. Губайдуллин И.И., Баймиев А.Х. Клонирование генов лектина Galega
orientalis и Pisum sativum в бинарном векторе для трансформации растений
pGreen 0229 (35S). // X V I зимняя молодежная научная школа «Перспективные
направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва, 2004. С. 47.
6. Губайдуллин И.И., Баймиев А.Х., Муниров Х . С , Чемерис А.В. Влияние
загрязнения
субстрата
кадмием
на
симбиоз
козлятника
восточного
с
бактериями Rizobium galegae II Агрохимия. 2005. - №12. - С. 1-5.
7. Баймиев А.Х., Губайдуллин И.И., Чемерис А.В., Вахитов В.А. Вклад
структуры
углевод-связывающих
пептидов
лектина
в
определении
специфичности бобово-ризобиального симбиоза у козлятника восточного и
лекарственного. // Молекулярная биология. 2005. - Том 39, № 1 . - С. 103-111.
23
120 0 78
. -» X
■■-'"-
*\
6. * v - ' ^ ' ■*
Р Н Б Русский фонд
"
'-^ '
' :^
2006-4
20765
Губайдуллин Ирек Ильясович
Гибридные лектины с измененными углеводсвязывающими свойствами
и их влияние на бобово-рюобиальный симбиоз
03.00.03 -молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
каидидата биологических наук
Лицензия № 0177 от 10.06.96 г.
Подписано в печать
2005 г.
Отпечатано на ризографе.
Формат 60x84 Vi6. Усл.-печ. л 1,5 Уч.-изд. л. 1,7
Тираж 100 экз. Заказ № 317.
450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3,
ГОУ ВПО «Башюсмедуниверстет РОСЗДРАВА»
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
1 034 Кб
Теги
bd000101606
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа