close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

bd000101632

код для вставкиСкачать
на гравах рукописи
КУИШИР
Екатерина Ллсксавдровва
О ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ИММУНОМОДУЛЯТОРОВ
д л я КОРРЕШЩИ АЛКОГОЛЬНОЙ МОТИВАЦИИ
03.00.13 - физиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва-2005
Работа вьшолнена на кафедре физиологии человека н животных
Биолопгческого факультета МГУ им М.В. Ломоносова
(зав. кафедрой - академик РАМН И.П. Ашмарин).
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор Р.Л. Данилова
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор О.А. Гомазков
доктор медицинских наук, профессор Р.У. Островская
Ведущая организация:
Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН
Запогга состоится 13 декабря 2005 года в 15 час. 30 мин. на заседании
Диссертационного Ученого CoBeira Д 501.001.93
Биологического Факультета МГУ им. М.В. Ломоносова по а;фесу:
119992, Москва, Ленинские Горы, Биологический факультет МГУ
им. М.В. Ломоносова, ауд. М-1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке
Биологического фа1д'льтета МГУ.
Автореферат разослан 12 ноября 2005 года.
Ученый секрепфь
диссертационного совета,
доктор биологических наук
г
.
i
j I tjO/ v
Б.А. Умарова
■зЖИ
Ms/f^
I1Ы99
S
О Б Щ А Я ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Существующие на сегодняшний день методы
лекарственной терапии алкогольной зависимости отличаются недостаточной
длительностью воздействия, требуют многократного введения препаратов и
зачастую
вызывают
инверсной
тяжелые
иммунорегулящш
побочные
- активной
эффекты. Применение
иммунизации
к
метода
эндогенным
регуляторам, - при небольшом числе воздействий приводит к долговременным и
специфичным изменениям физиологического статуса организма (Ашмарин,
1989, 1994). В экспериментах на крысах показано, что активная иммунизация к
одному из основных ферментов метаболизма этанола, алкогольдегидрогеназе
(АДГ),
-
вызывает
длительное
подавление
процесса
формирования
экспериментального алкоголизма у крыс (Ashmarin et al. 1992, 2000; Ашмарин и
др. 1997, 2003). Подобная иммунизация не оказывает негативного влияния на
физиологические фунюдии экспериментальных животных и сопровождается
образованием
аутоантител
к
АДГ.
В
связи
с
этим
использование
иммунологического подхода при разработке средств длительной коррекции
алкогольной мотивации представляется наиболее перспективным.
Известно, что хроническая алкогольная интоксикация сопровождается
развитием комплекса компенсаторных процессов, в частности, усиленной
продукцией аутоантител к антигенамголовногомозга, печени, сердца и других
органов (Крыжановский и др. 1986; Эдмондс и др. 1985). Причиной
приобретения иммуногенных свойств собственньвга белками организма может
быть их модификация ацетальдегидом, образующимся в ходе метаболизма
этанола, с образованием так называемых ацетальдегидных аддуктов (Lin et al.
1985; Worall et al. 1986). Наиболее уязвимой мишенью такого связывания может
быть сама АДГ,
в
непосредственной близости от которой находится
образующийся ацетальдегид; модифицированная АДГ могла бы индуцировать
синтез аутоантител к самой себе.
С
д>угой
стороны,
иммунореактивность
пациентов,
страдающих
хроническим алкоголизмом, снижена (Эдмондс и др. 1985). Возможно,
повышение
иммунного
статуса
этих
юМвнщх ц. МШИМ^Ш*^
I
БИБЛИОТЕКА
! о^'Ж.Мз.
введения
иммуномодулирующих
препаратов
на стадии хронической
алкогольной
интоксикации, когда можно ожидать появления иммуномодифицированной
АДГ, стимулировало бы образование антител к данному ферменту и привело бы
к подавлению влечения к алкоголю.
К
настоящему
иммуномодулирующих
зависимости.
моменту
показана
препаратов
Введение
этих
в
эффективность
клинике
веществ,
в
терапии
наряду
с
некоторьк
алкогольной
повышением
иммунореактивности больных алкоголизмом, приводило к нормализации
высших психических функций, а также, в некоторых случаях, к снижению у
пациентов влечения к алкоголю в ранней постинтоксикационной фазе (Земсков
и др., 1983; Гамалея и др., 2000). При этом изучение возможности длительного
подавления влечения к алкоголю (на протяжении многих недель после
иммуномодуляции), ни у животных, ни в клинике у людей, ранее не
проводилось.
Наши исследования, основанные на идее, развиваемой И.П.Ашмариным,
направлены на разработку принципиально нового подхода к длительному
снижению алкогольной мотивации путем иммунокоррекции - повьппения
иммунного статуса организма экспериментальных животных различными
иммуномодуляторами.
Мишенями
(полиоксидоний,
применявшихся
в
альфа-интерферон
нашей
и
работе
арбидол)
иммуномодуляторов
являлись
различные
компоненты иммунной системы (Hadden et al. 1993; Хаитов и др. 2000). Кроме
того, мы использовали преп^ат, принадлежащий к группе адаптогенов, комплекс полиненасьпценных жирных кислот семейства омега-З эйконол, также характеризующийся иммуномодулирующими свойствами. Каждое из
перечисленных
особенности
их
веществ
способно
стимулировать
нейроиммунологического
антителогенез,
воздействия
различны.
но
Все
выбранные нами препараты допущены к применению в клинике, что при
положительных эффектах на животных может позволить без предварительной
проверки на безвредность перейти к испытаниям описанного подхода к
снижению влечения к алкоголю на людях.
Наряду с оценкой влияния иммуномодуляторов на алкогольную мотивацию
нам было интересно изучить их эффекты на психоэмоциональный статус крыс
(в том числе и в период депривации от этанола), что могло бы выявить
возможность снижения негативной симптоматики и, таким образом, облегчения
протекания абстинентного
синдрома после курсового
введения данных
препаратов. При этом мы учитьгеали, что характер изменений, наблюдающихся
в поведении длительно алкоголизированных крыс, может быть различньпа и
зависеть от типа исходной алкогольной мотивации животных (Салимов, 1998;
Cloninger, 1987).
В работе также оценивалось влияние введения иммуномодуляторов на
такие показатели, как титр антител к АДГ, активность данного фермента и
активность системы биогенных аминов. Выбор последнего показателя связан с
тем, что участию АДГ в метаболизме биогенных аминов в процессе регуляции
алкогольной мотивации в настоящее время придают не меньшее значение, чем
ее влиянию на метаболизм этанола (Ашмарин, 2003).
Кроме того, мы оценивали эффективность полиоксидония в качестве
адъюванта при активной иммунизации гетерологичной АДГ, выделенной из
печени
лошади,
с
целью
подавления
влечения
к
алкоголю
вместо
использовавшегося ранее полного адъюванта Фрейнда (ПАФ), не разрешенного
Минздравом Р Ф
для
применения
на
людях.
Позитивные
результаты,
полученные в экспериментах по иммунизации к АДГ с полиоксидонием, могли
бы служить основанием для использования такого подхода в клинике на
поздних стадиях данного заболевания, неизлечимых с помощью существующих
методов.
Пели и задачи исследования.
1. Оценка
титров
аутоантител
к
АДГ
в
плазме
крови
длительно
алкоголизированных крыс.
2. Исследование влияния препаратов, обладающих иммуномодулирующим
действием (эйконола, арбидола, а-интерферона и полиоксидония) на уровень
потребления 15% этанола, а также на изменения в поведении, вызванные
алкогольной депривацией.
3. Исследование влияния иммуномодуляторов на титр антител к АДГ,
активность АДГ в печени и надпочечниках, а также активность системы
биогенных аминов.
4. Исследование эффективности полиоксидония в качестве адъюванта при
иммунизации АДГ и влияния подобной иммунизации на влечение к алкоголю.
Научная новизна и практическая значимость. В
работе впервые
продемонстрировано появление аутоантител к АДГ в плазме крови длительно
алкоголгоированных крыс. Выявление аутоантител к АДГ при злоупотреблении
алкоголем может стать основой нового метода в комплексной диагностике
хронической
алкогольной
интоксикации.
Помимо
этого,
формирование
аутоантител к АДГ обосновывает возможность использования препаратов,
повышаюпщх иммунный статус организма, с целью усиления собственного
образования антител к АДГ и снижения алкогольной мотивации.
Выявлен режим, при котором курсовое введение иммуномодулирующих
препаратов
(эйконола,
арбидола,
альфа-интерферона
и
полиоксидония)
алкоголизированным 1фысам приводит к длительному снижению потребления
ими 15% этанола. Показано, что введение эйконола и полиоксидония
нивелирует изменения в поведении крыс, вызванные алкогольной депривацией.
Продемонстрировано усиление собственного формирования антител к АДГ у
алкоголизированных крыс после введения иммуномодуляторов. Выявлено
влияние иммуномодуляторов на активность АДГ в надпочечниках и печени, а
также активность МАО в печени, содержание биогенных аминов и их
метаболитов в стрнатуме и надпочечниках алкоголизированных крыс.
Показана эффективность полиоксидония в качестве адъюванта при
иммунизации гетерологичной АДГ, выделенной из печени лошади. Подобная
иммунизация приводила к длительному подавлению процесса формирования
экспериментального алкоголизма у крыс, не влияя на поведение опьтных
животных, и сопровождалась синтезом антител к АДГ, изменением активности
данного фермента в печени и надпочечниках, а также снижением уровней
дофамина, серотонина и их основных метаболитов в стриатуме крыс.
Показано сходство направленности иммунологических и биохимических
изменений, сопровождающих
курсовое
введение
иммуномодуляторов
и
активную иммунизацию гетерологичной АДГ с полиоксидонием.
Позитивные
результаты,
полученные
после
курсового
введения
иммуномодулирующих препаратов длительно алкоголизированным крысам
указывают на целесообразность включения этих веществ в комплексную
терапию алкогольной зависимости в клинике для снижения алкогольной
мотивации и негативной симптоматики абстинентного синдрома у людей.
Показанный
в
экспериментах
на
крысах
антиалкогольный
эффект
иммунизации к АДГ с полиоксидонием открывает перспективу создания
преп^ата длительного действия (при конъюгации АДГ с полиоксидонием) для
коррекции
влечения
к
алкоголю
у
людей, страдающих
хроническим
алкоголизмом в случаях, неизлечимых с помощью существующих методов.
Положения, выносимые на защиту.
1.
Длительная алкоголизация белых крыс приводит к появлению в плазме
крови аутоантител к АДГ.
2.
Курсовое
действием
введение
(эйконола,
препаратов,
арбидола,
обладающих
иммуномодулирующим
альфа-интерферона
и
полиоксидония)
приводит к длительному снижению уровня потребления 15% этанола у
предварительно алкоголизированных крыс и оказывает позитивное влияние на
поведение этих животных во время алкогольной депривации.
3.
Курсовое введение иммуномодуляторов приводит к увеличению титров
антител к АДГ в плазме крови, изменению активности АДГ в органах, а также
модуляции
активности
системы
биогенных
аминов
у
длительно
алкоголизированных крыс.
4.
Активная иммунизация крыс гетерологичной АДГ с полиоксидонием в
качестве адъюванта приводит к формированию антител к АДГ и длительному
подавлению алкогольной мотивации у нативных крыс.
Апробация работы. Диссертация апробирована на заседании кафедры
физиологии человека и животных биологического факультета М Г У (31 октября
2005 г.)- Материалы диссертации доложены на 13-й европейской студенческой
конференции (Берлин, ноябрь 2002г.); семинаре "Новые Технологии в
Медицине и Экологии - Интегративная Медицина" (Словакия, январь 2003 г.).
Тезисы по результатам исследования были представлены на 18-м съезде
физиологов России (Казань, сентябрь 2001г.); 11-м российском национальном
конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, апрель, 2004г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ в научных
журналах, сборниках, материалах конференций. Работа поддержана грантом
РГНФ№02-06-00029а.
CrpYicrvpa и объем диссертации. Диссертация состоит из введения,
обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения
результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой
литературы. Список литературы включает 287 работ, из них 151 зарубежных
авторов.
Работа
изложена
на
170
страницах
машинописного
текста,
иллюстрирована 35 рисунками.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Экспериментальные животные
и общий план исследования. Работа
выполнена на самцах белых беспородных крыс весом 150-500 гравлм, общим
количеством около 450 животных. В ходе исследования использовали как
нативных, так и предварительно алкоголизированных в течение 4-6ти месяцев
животных.
Введение
препаратов
осуществляли
на
фоне
алкогольной
депривации (в некоторых случаях алкогольная дехфивация начиналась за 10
дней до начала введения); курс состоял из десяти введений. Тестирование
поведения осуществляли до и после иммуномодуляции. После введения
препарата и проведения поведенческих исследований оценивали алкогольную
мотивацию крыс в течение 7-10 недель. При этом у нативных крыс исследовали
влияние иммуномодуляторов на формирование алкогольной мотивации; у
предв^ительно алкоголизированных крыс - изменение уровня алкогольной
мотиващш
после
депривации
и
введения
препарата.
По
окончании
алкоголизации крыс декапитировали, забирали кровь на оценку титров антител
к
АДГ; мозг, печень и надпочечники замораживали для дальнейших
биохимических исследований.
Алкоголизацию проводили по методу свободного выбора между 15%
этанолом и водой (Буров, Ведерникова, 1985). Для этого животных помещали в
индивидуальные камеры размером 25x20x20 см с двумя стеклянными поилками,
содержащими, соответственно, воду и 15% раствор этанола. В дальнейшем
оценивали среднесуточный индивидуальный уровень потребления алкоголя и
воды.
Схема введения препаратов, В ходе расчета доз препаратов за исходную
величину брали среднюю терапевтическую дозу вещества для человека и
учитывали более высокую скорость метаболизма у крыс. Было проведено 14
экспериментальных серий с целью подбора доз и режимов введения препаратов
для выявления выраженного антиалкогольного эффекта. Наиболее эффективные
дозы и режимы представлены в настоящем разделе.
Эйконол вводили животным в виде пищевой добавки ежедневно в течение
10 дней в дозе 0,45 г. Контрольные животные в аналогичном режиме получали
подсолнечное масло. Арбидол разводили 10% раствором крахмала; полученный
раствор вводили крысам внутрижелудочно (при помощи зонда) в дозе 3 мг
ежедневно в течение 10 дней. Контрольным крысам вводили 0,5 мл 10%
раствора
крахмала.
Альфа-интерферон
(а-ИФН)
инъецировали
внутрибрюшинно в дозе 300 миллионов единиц (ME) ежедневно в течение 10
дней. Полиоксидоний (ПО) вводили внутримышечно в дозе 150 мкг 10 раз с
интервалом 1 сутки; за десять дней до введения крысы были подвергнуты
алкогольной депривации
(общая
длительность
алкогольной
депривации
составила 30 дней). В сериях с а-ИФН и ПО контрольным животным вводили
ОД мл физиологического раствора в соответствующем режиме. В ходе
иммунизации АДГ с ПО смесь белка с адъювантом вводили подкожно в 4 точки
спины троекратно с интервалом в 7 дней. Доза АДГ (по белку) составила 150
8
мкг/крысу; доза ПО - 200 мкг/крысу. Контрольным группам животных также
троекратно
вводили, соответственно, ПО
(200
мкг/крысу)
или только
физиологический раствор (объем - 0,2 мл).
Исследование поведения. Для оценки двигательной и ориентировочноисследовательской активности использовали прибор «РОДЭО», позволяюшрнй
раздельно
фиксировать
горизонтальные
и
вертикальные
компоненты
двигательной и ориентировочно-исследовательской активности. Для выявления
компонентов тревожности и страха в поведении животных использовали
крестообразный приподнятый лабиринт (Pellow et al., 1986). Общее время
тестирования в данных тестах составляло 5 мин. Склонность крыс к развитию
депрессивноподобного состояния оценивали в тесте неизбегаемого плавания по
методике Порсольта
(Porsolt,
1978). С
использованием
компьютерной
программы в течение 10 минут регистрировали суммарную продолжительность
активного
плавания
(энергичные
гребки всеми
лапами),
длительность
пассивного плавания (слабые гребки одной или двумя лапами, необходимые для
поддержания
головы
над
водой)
и
время
иммобилизации
(полная
неподвижность). Для более объективной оценки состояния крыс (Щетинин,
1989) вычисляли ритмологический индекс депрессивности (ИД) как отношение
числа коротких (до 6 сек.) циклов иммобилизации к общему количеству
периодов активного плавания.
Иммунологический анализ. Для оценки титров антител к АДГ пробы
крови
выдерживали
2
часа
при
комнатной
температуре,
затем
центрифугировали 30 мин. со скоростью 3000 об/мин. Титры антител
определяла Обухова М.Ф.
(институт Нормальной физиологии) методом
твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя фосфатный
посадочный буфер рН 7,5.
Биохимические исследования.
Оценку активности АДГ проводила Шмальгаузен Е.В. (НИИ Ф Х Б им.
Белозерского биологического факультета МГУ). Экстракция ферментов из
тканей печени и надпочечников проводилась буфером, содержащим 0,01 М
ТРИС, 0,5 мМ дититотреитол, рН 8,5 (4 мл буфера на 1 г ткани). Активность
АДГ определяли спектрофотометрически по нарастанию оптической плотности
при 340 нм в 1-см кювете при 25оС. Среда для определения активности
содержала 100 м М глицин (рН 9,0), 1 м М НАД, 0,1 м М этанол и 50 мкл
экстракта. Белок определялся по методу Брэдфорд.
Определение активности эндогенных изоферментов МАО в печени крыс
осуществлялось Москвитиной Т.А. (институт биомедицинской химии РАМН).
Выделение
митохондриальной
фракции
проводилось
по общепринятой
методике дифференциального центрифугирования из 10% гомогената. Осадок
после центрифугирования при 12000 g несколько раз промывали 0,05 М K-Na
фосфатным буфером, рН 7,4. Белок определяли по методу Лоури, активность
МАО
по модифицированному
радиометрическому
методу
определения
активности аминооксидаз, используя в качестве субстратов для МАО А и М А О
В, соответственно, серотонин (100 иМ, С14, 4 Кю/моль) и фенилэтиламин (50
иМ, С14,5 Кю/моль).
Исследование содержания биогенных аминов проводилось в стриатуме и
надпочечниках
крыс
Попковой
Е.В.
(институт
Патофизиологии РАН).
Определение содержания биогенных аминов и их метаболитов (дофамина (ДА),
диоксифенилуксусной кислоты (ДОФУК), 3,4 - гомованилиновой кислоты
(ГВК), серотонина (5-ОТ) и 5-оксииндолуксусной кислоты (5-ОИУК)) в органах
крыс проводилось методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с
электрохимической детекцией (Грехова с соавт., 1995).
Для статистической
критерии
обработки данных применяли непараметрические
Вилкоксона-Манна-Уитни
и
Фишера,
а
также
использовали
стандартный пакет статистических программ Microsoft Excel 2000 и Statistica 6.0.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И И Х ОБСУЖДЕНИЕ
1.
Выявление аутоантител к АДГ в плазме крови длительно
алкоголизированяыж К Р Ы С
Исследования по выявлению аутоантител к АДГ в плазме крови крыс
проводились на животных, в течение 5-6 месяцев употреблявших алкоголь в
10
условиях свободного выбора между водой и 1 5 % этанолом; контролем служили
неалкоголизированные (нативные) крысы.
Иммунологический анализ свидетельствовал о статистически значимом (по
критерию Вилкоксона - Манна - Уитни) увеличении (в 2-8 раз) титра антител к
А Д Г в плазме крови длительно алкоголизированных крыс при различной
длительности алкоголизации (Табл. 1).
Таблица 1.
В л и я н и е длительной алкоголизации на титр антител к А Д Г .
Титр антител к А Д Г
№
Длительность
серии
алкоголизации
Нативные
(недели)
крысы
1/640
1
(п=17)
19
1/40
20
1/640
22
рованные
по отношению к
крысы
иативным крысам
1/1280
1/320
25
2
1/320
8
1/2560
р<0,005
4
(п=8)
увеличения титра
р<0,001
3
(п=19)
Алкоголизи-
р<0,01
2
(п=12)
Кратность
4
1/640
р<0,01
2
Оценка всей совокупности данных выявила достоверное влияние фактора
"алкоголизация" (наличие контакта с алкоголем) на прирост титра антител к
А Д Г ( F ( 1 , 33) = 9,5632, р<0,005 по Kruskal-Wallis A N O V A ) . При этом анализ
изменения титров антител к А Д Г при увеличении длительности алкоголизации с
20™ до 25™ недель свидетельствовал об уменьшении их прироста (кратность
увеличения
титров
снижалась
с
8 до
2, соответственно).
Применение
корреляционного анализа вьгавило наличие отрицательной корреляции между
длительностью алкоголизации и величиной титра антител к А Д Г (г=-0,529,
р=0,001 по Spearman). Уменьшение прироста титра антител на поздних сроках
алкоголизации может свидетельствовать о некотором спаде иммунного ответа,
что согласуется с данными литературы. Так, известно, что концентрация
и
антител к
альбумин-АцАА
в
сыворотках крови больных хроническим
алкоголизмом находится в обратной зависимости от сроков алкоголизации
(Шимановская, 2000).
Факт индукции аутоантител к АДГ является подтверждением возможности
модификации данного фермента обмена этанола у крыс, подвергшихся
длительной алкоголизации. Выявление аутоантител к АДГ могло бы служить
дополнительным инструментом в комплексной доклинической диагностике
хронической
алкогольной
интоксикации.
Кроме
того,
формирование
аутоантител к АДГ может служить точкой приложения для коррекции
алкогольной мотивации посредством применения в определенный период
болезни иммуномодуляторов, повышающих иммунный статус организма.
2. Исследование влияния препаратов, обладающих иммуномодулируюшим
действием, на уровень потребления 1 5 % этанола, а также на изменения в
поведении, вызванные алкогольной деприваиией
2,1, Комплекс ПНЖК т-З эйконол.
Исследование
влияния
эйконола
на
алкогольную мотивацию
предварительно алкоголизированных крыс показало, что препарат оказывает
подавляющее влияние на потребление алкоголя, но степень подавления зависит
от
исходного
уровня
алкогольной
мотивации
животных.
Так,
при
использовании крыс с исходным уровнем потребления алкоголя 4-7 мл 15%ного этанола в сутки эйконол вызьгоал снижение потребления алкоголя в
среднем на 40% от контрольного уровня, антиалкогольный эффект наблюдался
в течение, по крайней мере, 5 недель (рис. 1). В
то же время, при введении
эйконола в выбранной дозе крысам с более высоким исходным уровнем
потребления 15% этанола (9-11 мл в сутки) влияния эйконола на уровень
потребления алкоголя выявлено не было. Возможно, следствием высокой
алкогольной мотивации у крыс из данной экспериментальной серии явились
значительные биохимические изменения в организме, коррекция которых,
необходимая для подавпшия влечюшя к алкоголю, требуег более сильного воздействия
(^«запЕвия
дозы
и^ли
более
пращжжвсеанют
введения
12
•Алкоголи$ированныв+эОтнол:
обилвв число животных, п'^го
120
100 1'
80
» г 60
40
20
сутки алкоголизации после введения эйконола
10
15
25
20
35
30
40
Рис. 1. Потребление 1 5 % этанола предварительно алкоголизированными фысами (в % к
алкоголизированному контролю) после курсового введения эйконола. Различия мез*зду
контролем и опьп-ом достоверны за весь период наблюдения - р<0,005.
Возможно также, что отсутствие влияния эйконола на потребление алкоголя
данными крысами связано с типом их алкогольной мотивации. Поведенческие
исследования позволили предположить развитие алкогольной мотивации у этих
животных по второму типу по Cloninger (1987). В то же время оценка поведения
крыс, на которых эйконол оказывал антиалкогольное действие, указывала на
наличие компонентов первого типа влечения к алкоголю.
Оценка тюведения алкоголизированных крыс свидетельствовала о действии
эйконола, противоположном влиянию алкогольной депривации. Так, на
контрольных алкоголизированных животных, у которых во время депривации
наблюдались изменения анксиогенного характера (статистически значимое
снижение числа стоек и поведения риска в крестообразном лабиринте при
достоверном увеличении времени замирания, р<0,05), введение эйкоиола
оказывало анксиолитическое действие, приближая данные показатели к уровню
нативных животных (достоверно по числу стоек и времени замирания, р<0,05)
(Рис.2). Напротив, в поведении контрольных алкоголизированных крыс из
другой
экспериментальной
наблюдались
изменения
серии
во
время
анксиолитического
алкогольной
характера.
При
депривации
повторном
тестировании в крестообразном лабиринте у них было выявлено достоверное
увеличение времени, проведенного на открытых лучах лабиринта, числа заходов
13
в закрытые лучи, общего количества переходов, поведения риска, числа стоек, а
также снижение времени замирания (р<0,05) (Рис. 3).
□ " • " н а / п и в н ы е крысы, п=10
^^f*~ алкоголизированные крысы, п=10
'алкогопизированныв ■> эОконоп, п=10
Дельта(повторное
тестироаание- первое
твстрование)
# ^ £-^Jt
80-
—ш
60
ПоввД' риска
Открытые лучи
40-
^'
го-|
^В
1
0
* '
•20
Переходы
Выглядывания
•40
Время замирания, дельта
Р и с . 2. Влияние эйконола на поведение алкоголизированных крыс во время алкогольной
депривации в крестообразном лабиринте. Серия 1 Различия между нативными и
алкоголизированными крысами: # - р<0,05; межпу алкоголизированным контролем и
алкоголизированными-ьэйконол: * - р<0,05
С=3"
^ 3 ■
Дельта
(разноси»
между вторым и
первым
тестированием)
СгаЙЕи
-нативныв крысы, п=10
•апкоаопизироваиные крысы, п=10
-атогопизированиыв+эОконоп, п=10
Время на открытых лучах
Закрытые лучи
40
30
20
10
О
Поведение риска
А Ч >1
во
во
Переходы
—
' ' '____^^^_
-10
-20
время замирания, дельта
Рис.3. Влияние эйконола на поведение алкоголизированных крыс во время аткогольной
депривации в крестообразном лг^иринте. Серия 2.
Р а з л и ч и я уещу нативными и алкогализированными крысами- # - р<0,05; различия межчу
алкоголизированными крысами и алкоголизированные + эйконол- * - р<0,05; ** - р<0,01.
14
Введение эйконола оказывало на этих животных некоторое седативное
действие, нивелируя описанные изменения (статистически значимо по времени
на открытых лучах, поведению риска, числу стоек, времени замирания (р<0,05)
и общему количеству переходов (р<0,01)).
Илшунологический анализ свидетелыугвовал об усилении собственного
образования антител к АДГ у алкоголизированных крыс после введения
эйконола (титры антител составили: 1/3200 против 1/640 у контрольных
алкоголизированных крыс (р<0,001) и 1/160 у нативных крыс (р<0,001)).
Биохимический анализ
выявил
статистически
значимое
снижение
активности АДГ в печени крыс, которым вводили эйконол (до 87% от уровня
контрольных алкоголизированных крыс, р<0,005).
Опенка активности МАО в печени крыс свидетельствовала о снижении
активности цитозольных МАО А и МАО В (49%, р<0,005 и 52%, р<0,005 от
уровня контрольных алкоголизированных крыс, соответственно). Учитывая, что
у доштельно алкоголизированных
животных
происходит
значительное
увеличение содержания цитозольных форм МАО (Medvedev et al., 1995;
Породенко и др., 1999), введение эйконола могло нивелировать данные
изменения. Кроме того, было показано снижение активности митохондриальной
формы МАО А (59%, р<0,005), что могло служить частью механизма
антиалкогольного эффекта данного препарата. Так, в литературе описана
возможность снижения алкогольной мотивации при подавлении активности
МАО А (Mega et al., 2002). Наконец, у опытных крыс было обнаружено
увеличение активности митохондриальной МАО В (127%, р<0,01). Поскольку у
цитозольной МАО В сродство к субстрату 2-фенилэтиламину значительно
выше, чем у митохондриальной формы этого фермента (Москвитина, 2000),
данные изменения (при снижении активности цитозольной формы) могли
свидетельствовать о снижении скорости деградации биогенных аминов и
являться отражением нормализующего действия эйконола на активность
системы биогенных аминов у длительно алкоголизированных крыс.
15
2.2. Арбидол.
Введение арбидола оказывало антиалкогольное действие как на крыс с
исходным уровнем потребления 15% этанола 2,5-4 мл/сут., так и с более
высокой алкогольной мотивацией (8-14 мл/сут.). Снижение потребления 15%
этанола происходило на третьи сутки оценки потребления алкоголя после
некоторого статистически незначимого его увеличения и длилось до 5 недель
(Рис. 4).
Оценка поведения негативных побочных эффектов арбидола не выявила.
Иммунологический анализ свидетельствовал об усилении антителогенеза у
крыс, которым вводили арбидол (титр антител к АДГ у опытных крыс составил
1/1280 против 1/320 в группе контрольных алкоголизированных крыс (р<0,005)
и 1/40 в группе нативных животных (р<0,001)).
Алкоголизированнью+арбидол;
общее количество животных п-20
сутки от начала алкоголизации после введения арбидола
О
5
10
15
20
26
30
36
40
Рис. 4. Потребление 15% этанола предварительно алкоголиэированными крысами (в % к
контролю] после курсового введения арбидола. Различия мвжр,у контролем и опытом
достоверны за период 3-36 сутки алкоголизации - р<0,05.
Оценка активности АДГ выявила достоверное снижение активности
данного фермента в печени опытных животных (до 69% от контрольного
уровня, р<0,05) и статистически незначимое подавление активности АДГ в
надпочечниках (до 73%).
16
2.3. Альфа-интерферон (а-ИФН).
В ходе оценки влияния а-ИФН на алкогольную мотивацию было показано,
что данный иммуномодулятор подавляет влечение к алкоголю у крыс,
характеризовавпшхся относительно высоким уровнем исходной алкогольной
мотивации (7-13 мл 15% этанола в сутки), а также наличием положительного
алкоголь-депривационного эффекта (рис. 5). Вместе с тем у животных с более
низким исходным уровнем алкогольной мотивации (менее 7 мл/сут.), не
демонстрировавших алкоголь-депривационного эффекта, а-ИФН, напротив,
статистически
значимо
увеличивал
алкогольную
мотивацию
(р<0,005).
Возможно, а-ИФН оказывает антиалкогольный эффект только на крыс со
вторым типом алкогольной мотивации, для которых характерны достаточно
высокий уровень потребления алкоголя, а также наличие положительного
алкоголь
-
депривационного
эффекта.
Последнее
предположение
подтверждается данными литературы (Салимов, 1998).
14
-Апкоголизированныв крысы, п=5
'Алкоголизированныв+а-ИФН, п=5
-24
-21 -19
-17
-14
11
14
1в
18
21
23
25
28
30
Рис. 5. Потребление 1 5 % этанола крысами (с исходным уровнем алкогольной мотивации более
7 мл/сут.) после курсового введения о-ИФН. Различия мелоду уровнем потребления в
контрольной и опытной группах: р<0,05; в опытной группе мезкду потреблением до и после
введения а- ИФН: р<0,05. Положительный алкоголь-депривационный эффект (достоверное
увеличение потребления алкоголя в первые сутки после окончания алкогольной депривации):
*-р<0,05
Негативного
влияния
на
поведение алкоголизированных
находящихся в состоянии алкогольной депривации, а-ИФН не оказывал.
крыс,
17
Иммунологический анализ выявил увеличение титров антител к АДГ у
опытных крыс, снизивших после введения а-ИФН уровень алкогольной
мотивации (1/640 против 1/1280).
Таким образом, у крыс с определенным паттерном поведения а-ИФН
подавлял влечение к алкоголю. Возможно, поиск иных доз, режима введения
препарата с учетом особенностей алкогольной мотивации животньпс привел бы
к выявлению более выраженного антиалкогольного эффекта препарата.
2,4. Полиоксидоний (ПО).
Применение высокоэффективного иммуномодулятора нового поколения
полиоксидония (ПО)
приводило к длительному
мотивации предварительно
алкоголизированных
снижению алкогольной
крыс.
Антиалкогольный
эффект данного препарата выявлялся в первые же сутки оценки алкогольной
мотивации и длился до 7 недель; уровень алкогольной мотивации в опыте ни
разу не превышал своей исходной величины (рис.6).
7-
а АпкоаотзированиыО контроль, п=10
—
ДО
делривации
1
-т Алкогопизироеанныв*ПО, п=10
2
3
4
5
недели после окончания введения препарата
6
Рис. 6. Потребление 1 5 % этанола длительно алкоголизированными крысами после
введения ПО. Различия ме)еду контрольной и опьлной фуппами: * - р<0,05; ** р<0,01 различия иеткр!/ показаниями в опытной группе до и после введения ПО: # - р<0,05;
«#-р<0,005; *«#-р<0,001.
При этом ПО оказывал антиалкогольное действие как на крыс, в поведении
которых имелись черты первого типа влечения к алкоголю (повьш1енная
тревожность), так и на тех, формирование алкогольной мотивации которых
18
могло идти по второму типу (низкий уровень тревожности и меньшая
выраженность депрессивноподобных компонентов в поведении).
Оценка поведения длительно алкоголизированных крыс свидетельствовала
об анксиолитическом и антидепрессивном действии ПО. Так, в крестообразном
лабиринте у опытных крыс наблюдалось достоверное увеличение числа заходов
в закрытые лучи и общего числа переходов (р<0,05), а в тесте Порсольта статистически значимое снижение индекса депрессивности (р<0,05). Влияние
ПО на поведение крыс в крестообразном лабиринте имело направленность,
противоположную
действию
алкогольной
депривации,
поскольку
у
контрольных алкоголизированньпс крыс наблюдалось снижение активности в
данном тесте. При этом на алкоголизированньпс крыс, активность которых в
крестообразном лабиринте во время депривации возрастала, ПО оказывал,
напротив, транквилизирующее действие, приближая их показатели к уровню
нативных крыс. Таким образом, данный иммуномодулятор нивелировал
изменения в поведении животных, вызванные алкогольной депривацией, вне
зависимости от их исходной направленности.
Иммунологический анализ выявил увеличение титра антител к АДГ после
введения ПО нативным крысам и периода алкоголизащ!и (1/640 против 1/320,
р<0,05).
Оценка активности АДГ в органах, проведенная спустя 3,5 недели после
начала введения ПО нативным крысам, выявила достоверное снижение
активности данного фермента в надпочечниках крыс (62% от уровня нативных
крыс, р<0,05) при статистически значимом увеличении активности АДГ в
печени (138%, р<0,05). Снижение активности АДГ в надпочечниках после
иммуномодуляции может указьгоать на связь механизма антиалкогольного
эффекта ПО с изменением уровней катехоламинов в данных органах.
Оценка уровня биогенных аминов и их метаболитов
в
стриатуме
контрольных алкоголизированных крыс выявила достоверное снижение уровня
одного из метаболитов ДА - Г В К (р<0,05), снижение отношения уровня
ДОФУК к ДА (р<0,05) и отношения уровня Г В К к ДА, отражающего скорость
общего обмена ДА (р<0,05). Кроме того, статистически значимо снижалось
19
содержание основного метаболита 5-ОТ - 5-ГИУК (р<0,05) и статистически
незначимо уменьшалось отношение 5-ГИУК к 5-ОТ, отражающее величину
оборота 5-ОТ (рис. 7, светлые столбики).
ЩЁ
5
Рис. 7. Изменение уровней биогенных аминов и их метаболитов (в % к нативным крысам)
в стриатуме алкоголизированных крыс после введения ПО
А. Обмен дофамина. Б.Обмен серотонина. Различия достоверны
между нативными и алхоголизированными крысами: # - р<0,05; ## -р<0,005;
мезкяу контрольными и опытными алкоголизированными крысами- * - р<0,05;** -рО,01
Данные результаты могут указывать на изменение активностей ферментов,
участвующих
в
соответствующих превращениях, вызванное длительным
контактом с алкоголем. Подобные факты описаны и в литературе: в частности,
результатом алкоголизации при некоторых условиях является уменьшение
активности ацетальдегиддегидрогеназы (Кершенгольц и др., 1985) и катехол-ометилтрансферазы (Tiihonen et al., 1999) при увеличении активности АДГ
(Haseba et al., 2003) и МАО (Породенко, 1999). Снижение общего обмена
дофамина и серотонина может являться компенсаторной реакцией организма на
длительное
употребление
алкоголя,
сопровождающееся
прогрессивным
уменьшением содержания данных моноаминов в мозге (Анохина, 2002; Буров и
др., 1985).
Введение ПО
длительно алкоголизированным животным, напротив,
приводило к некоторому увеличению отношения Г В К к ДА, отношения Г В К к
ДОФУК, а также статистически значимое увеличение отношения 5-ГИУК к 5ОТ, являющегося показателем оборота серотонина (р<0,05) (рис. 7, темные
20
столбики). Описанные результаты могут свидетельствовать о восстановлении
активностей соответствующих ферментов, в том числе снижении активности
АДГ у опытных крыс. Последнее предположение подтверждается данными
литературы, согласно которьас подавление активностей АДГ и АцДГ при
введении препарата дайдзеин грызунам сопровождается накоплением 5-ГИУК и
3,4-ДОФАЛ (соответственно, падением уровня ДОФУК) в мозге и снижением
влечения к алкоголю у этих животных (Keimg et al., 1998).
В
надпочечниках
опытных
крыс
было
выявлено
небольшое, но
статистически значимое снижение содержания ДА (до 80% от уровня
контрольных алкоголизированных крыс, р<0,05).
Таким образом, оценка содержания биогенных аминов в мозге и
надпочечниках крыс позволяет говорить о возможном влиянии ПО на
алкогольную
мотивацию
крыс
посредством
изменения
активности
катехоламиновой и серотониновой систем, расположенных как центрально, так
и на периферии. Полученные в ходе биохимических исследований данные
могут служить подтверждением участия АДГ в регуляции влечения к алкоголю
через модуляцию активности системы биогенных аминов.
2. Исследование эффективности П О в качестве адъюваита ири
иммунизации К Р Ы С гетерологичиой ЛЛГ
Иммунизация нативных крыс АДГ с ПО сопровождалась длительным (до 8
недель) подавлением формирования алкогольной мотивации (рис. 8). При этом
введение ПО без АДГ само по себе вызывало снижение алкогольной мотивации,
но выраженное в меньшей степени.
Иммунологический анализ свидетельствовал о формировании аутоантител к
АДГ у крыс, иммунизированных АДГ с ПО, уже спустя 3 недели после начала
иммунизации (титр антител в опыте составил 1/6400 против 1/160 у
контрольных нативных крыс, р<0,001). Столь же высокий титр антител к АДГ
выявлялся и спустя 3 месяца после начала иммунизации по окончании
алкоголизащш (1/6400 против 1/640, р<0,001).
Влияния иммунизации АДГ с ПО на поведение крыс выявлено не было.
21
б 1
Б.
(КО.Об
1
4
■--
3
2
■
—
1
,
ал
■^Й
ipg ^ н
п
о
Контроль ПО Иммуиимция
АДГ'НЮ
Рис. 8. Потребление 15% этанола крысами после введения ПО и иммунизации АДГ с ПО.
А. Динамика потребления алкоголя. Б. Среднесуточное потребление алкоголя за 10-56
сутки алкоголизации Различия статистически значимы- р<0,005 между группами контроль
и иммунизация АДГ с ПО за 10-56 сутки; р<0,05 - ме)еду фуппами ПО и иммунизация АДГ с
ПО за 12-56 сутки; р<0,05 - меящу фуппами контроль и ПО за 19-50 сутки алкоголизации.
Биохимический анализ свидетельствовал о статистически незначимом
снижении активности АДГ в надпочечниках на ранних сроках до алкоголизации
(до 62% от уровня у нативных крыс) и статистически значимом уменьшении
активности АДГ
в
печени на более поздних сроках после периода
алкоголизации (78%, р<0,01).
Оценка уровней биогенных аминов выявила у опытных крыс снижение ДА,
5-ОТ и их метаболитов в стриатуме. Описанные изменения были аналогичны
наблюдавшимся ранее после иммунизации АДГ с ПАФ.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, нами было впервые продемонстрировано появление
аутоантител к АДГ в плазме крови крыс при длительном употреблении
алкоголя. Данный факт может стать основой нового метода в комплексной
диагностике
хронической
обосновьтает
перспективу
использовании
в
алкогольной
интоксикации.
снижения
алкогольной
определенный
период
болезни
Кроме
того, он
мотивации
при
иммуномодуляторов.
22
повышающих иммунный статус организма, с целью усиления собственного
образования
антител
к
АДГ.
Эффективность
данного
подхода
была
продемонстрирована нами в исследованиях на крысах.
Результаты экспериментов свидетельствовали о том, что курсовое введение
иммуномодуляторов при определенных условиях может подавлять влечение к
алкоголю у крыс, а также компенсировать изменения, вызванные в их
поведении алкогольной депривацией. Один из механизмов антиалкогольного
эффекта исследованных веществ может бьггь связан с усилением собственного
синтеза аутоантител к АДГ у длительно алкоголизированных крыс, изменением
активности данного фермента в печени и надпочечниках животньпс, а также с
модуляцией активности системы биогенных аминов как на периферии (в печени
и надпочечниках), так и в мозге, в стриатуме. Полученные результаты
указывают на сходство механизмов подавления влечения к алкоголю при
курсовом введении иммуномодуляторов и активной иммунизации АДГ.
Особенности эффектов различных иммуномодуляторов могут бьггь связаны с
различиями в их нейроиммунологическом действии и, кроме того, с
различными типами алкогольной мотивации у экспериментальных животных.
Анализ полученных результатов
позволяет
предположить, что эйконол
оказывает антиалкогольное действие на крыс с первым типом алкогольной
мотивации, а-ИФН - со вторым, ПО - как на животных с чертами первого, так и
второго типа влечения к алкоголю; однако данное предположение требует
дальнейшей экспериментальной проверки. Поскольку все выбранные нами
вещества допущены к применению на людях, то полученные результаты
позволяют говорить о целесообразности включения данных веществ (с учетом
их индивидуальных особенностей) в комплексную терахгаю алкоголизма в
клинике для снижения алкогольной мотивации и негативной симптоматики
абстинентного синдрома.
Позитивные результаты, полученные в экспериментах по иммунизации к
АДГ с полиоксидонием, также могут служить основанием для использования
данного подхода в клинике у людей, страдающих хроническим алкоголизмом,
на
поздних
стадиях
существующих методов.
данного
заболевания,
неизлечимых
с
помощью
23
ВЫВОДЫ
1. Длительная алкоголизация белых крыс приводит к появлению в плазме
крови
аутоантител
к
алкогольдегидрогеназе
(АДГ)
(титры
антител
составляют 1/320-1/2560 против 1/40-1/640 в контроле).
2. Курсовое введение иммуномодулирующих препаратов - эйконола, арбидола,
альфа-интерферона и полиоксидония при определенных режимах вызывает
длительное (до 7 недель) снижение уровня потребления 15% этанола у
предварительно алкоголизированных крыс, а также нивелирует изменения в
поведении, вызванные алкогольной депривацией.
3. Курсовое введение иммуномодулирующих препаратов приводит к усилению
собственного образования антител к АДГ в плазме крови, снижению
активности АДГ в печени и надпочечниках и модуляции активности МАО в
печени и содержания биогенных аминов и их метаболитов в стриатуме и
надпочечниках опытных животных.
4. Иммунизация крыс гетерологичной АДГ с использованием полиоксидония в
качестве адъюванта оказывает подавляющее действие на формирование
алкогольной мотивации в течение длительного периода времени (до 8
недель) и сопровождается увеличением титра антител к АДГ, подавлением
активности этого фермента в надпочечниках, а также снижением уровней
биогенных аминов и их метаболитов в стриатуме.
5. Сходная направленность иммунологических и биохимических сдвигов при
активной иммунизации к АДГ и курсовом введении иммуномодуляторов
предполагает
наличие
общих механизмов развития антиалкогольного
эффекта при данных подходах к иммунологической коррекции алкогольной
мотивации.
6. Полученные
результаты
являются
основанием
для
соответствующих
исследований в клинических условиях (при комплексной диагностике
хронической алкогольной интоксикации, а также в качестве дополнительного
средства подавления влечения к алкоголю).
24
СПИСОК РАБОТ, О П У Б Л И К О В А Н Н Ы Х П О Т Е М Е Д И С С Е Р Т А Ц И И
1. Исаев В.А., Данилова Р.А., Кушнир Е.А., Ловать М.Л., Ашмарин И.П..
Влияние эйконола, - препарата, обогащенного комплексом омега-3
полиненасыщенных жирных кислот, - на поведение и алкогольную
мотиващ1ю крыс // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.
2001.Т. 131.№5.-С.543-547.
2. Ловать М.Л., Куишир Е.А., Исаев В.А., Данилова Р.А. Алкогольная
мотивация и поведение белых крыс после введения эйконола - комплекса
полиненасыщенных жирных кислот: Тез. докл. 18-й съезд физиологов
России - Казань; М.; ГЭОТАР-МЕД, 2001. - С.140.
3. Kushnir Е.А., Lovat' M.L., Korotkova Т.М., Danilova R.A., Ashmarin LP. Course
administration of the immunomodulator arbidol decreases the alcohol motivation
in previously alcoholised albino rats: Abstract book. 13th European Students
Conference at the Charite Berlin - Berlin, 2002. - P. 220.
4. B.A Исаев, P.A. Данилова, М.Л. Ловать, E.A. Кушнир, Москвитина Т.А.,
Обухова М.Ф., Шмальгаузен Е.В., Ашмарин И.11.. Введение препарата омега3 полиненасыщенных жирных кислот (эйферола) снижает алкогольную
мотивацию у белых крыс, повышая уровень антител к алкогольдегидрогеназе
// Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2003. №1. С.21-23.
5. Кушнир Е.А., Ловать М.Л., Данилова Р.А., Исаев В А . , Ашмарин И.П.
Влияние эйферола, пищевой добавки, обогащенной Омега-3 ПНЖК, на
поведение и алкогольную мотивацию крыс: Тез. докл. Международный
Семинар "Новые Технологии в Медицине и Экологии - Интегративная
Медицина" - Высокие Татры, Словакия, 2003. - С. 65-67.
6. Кушнир Е.А., Ловать М.Л., Обухова М.Ф., Шмальгаузен Е.В., Данилова Р.А.,
Ашмарин И.П.. Использование полиоксидония для иммунологической
коррекции алкогольной мотивации // РТммунология. - 2004. >Г9 2. - С. 87-90.
7. Кушнир Е.А., Данилова Р.А., Обухова М.Ф., Ловать М.Л., Ашмарин И.П..
Образование аутоантител к алкогольдегидрогеназе при длительной
алкоголизации // Шшунология. - 2004, №4. - С. 216-218.
8. Кушнир Е.А., Рудько О.И., Ловать М.Л., Обухова М.Ф, Данилова Р.А.,
Ашмарин И.П. Полиоксидоний как адьювант при активной иммунизации к
алкогольдегидрогеназе и холецистокинину-4 с целью коррекции патологии
поведения: Тез. докл. X I российский национальный конгресс «Человек и
лекарство» - Москва, 2004.- С. 218.
9. Ловать М Л . , Ключникова М.А., Кушнир Е.А., Ашмарин И.П. Влияние
комплексного введения 4-метилпиразола, флуоксетина и тетурама на
потребление этанола белыми крысами // Вопросы наркологии. - 2005. № 3. С.21-27.
ч
Настоящая работа выполнялась при постоянном участии акад. РАМН,
проф. И.П. Ашмарина, оказывавшего консультативную и организационную
помощь в наших исследованиях.
.М(ШЩ^
/
РНБ Русский фонд
2006-4
20799
Заказ Xt638. Объем 1 п л . Тираж 100 экз.
Отпечатано в ООО «Петроруш».
г. Москва, ул. Палвха-2а, тел. 250-92-06
www.postator.ra
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
1 137 Кб
Теги
bd000101632
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа