close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

bd000101653

код для вставкиСкачать
КАРИЦЕСАЯ
Инна Аватольюня
К
РЕГУЛЯЦИЯ NA*,K*-ATOA3M ПРИ АКТИВАЦИИ
ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА
03.00.25
Гистология, цитология, клеточная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Санкт-11егер<^г
2005
Работа выполнена в Инсппуге цитологии РАН,
Санкт-Петербург
Научный руководитель:
доктор биологических наук
Марахова Ирина Ильинична
Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор
Маслова Марина Николаевна
Институт эволюционной физиологии и биохимии имени
И.М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург
доктор биологических наук
Негуляев Юрий Алексеевич
Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург
Ведущая организация:
Биолого-почвенный факультет
Санкт-Петербургского Государственного Университета
Защита, состоится «25» ноября 2005 года в «14» часов на заседании диссертационного
совета Д.002 230 01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург,
Тихорецкий пр., д. 4
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН
Автореферат разослан «25» октября 2005
Ученый секретарь
диссертационного совета
кандидат биологических наук
«^
т/^'
Ё.В. Каминская
iif
. ^^з^^у
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность
проблемы.
Действие ростовых факторов и запуск клеточной пролиферации сопровождается
активацией ион-транспортирующих
внутриклеточной
систем плазматической мембраны, а изменения
концентрации ионов
кальция, натрия и
рН цитозоля являются
компонентами раннего ответа клеток на мнтогенный сигнал (Kaplan, Owens, 1978; Moolenaai
et al., 1981; Rozengurt, 1981; Веренинов, Марахова, 1986; Grinstein, Dixon, 1989). Известно,
что выключение отдельных систем ионного транспорта специфическими ингибиторами
обратимо останавливает запуск пролиферативного ответа в клетках разного типа (Rosoff,
Cantley, 1985; Domand et al., 1986; S2amel, Resch, 1981; Orlov et al., 2001). Ha основе
большого экспериментального материала сложилось предположение, что изменение ионного
состава внутриклеточной среды играет существенную роль в регуляции размножения клеток.
Однако, как механизмы регуляции, так и конкретная роль связанных с пролиферацией и
трансформацией клеток изменений в работе ионных транспортеров остаются мало
изученными.
Среди ионных транспортеров плазматической мембраны первостепенная роль в
поддержании внутриклеточного ионного гомеостаза и осмотического баланса клеток
животных отводится натриевому насосу. Ма*,К*-АТФаза, составляющая основу натриевого
насоса, является встроенным в цитоплазматическую мембрану ферментом, который
осуществляет гидролиз АТФ и сопряженный с ним перенос ионов натрия и калия через
мембрану против электрохимического градиента. Структурно Ка*,К*-АТФаза представляет
собой гетеродимер, состоящий из двух полипептидных цепей: а-субъединицы массой около
100 кДа, выполняющей каталитическую функцию и несущей места связывания катионов,
АТФ и гликозидов, и р-субъединицы - гликопротеина массой 40-60 кДа, не участвующего в
катализе (Glynn, Karlish , 1975; Beguin et al., 1998; ЗсЫепег-ВоЫз, 2002; Jorgensen et al., 2003).
В
последнее десятилетие основное внимание сосредоточено не на структурных и
кинетических параметрах Ка^К^-АТФазы, а на ее роли в ответе клетки на различные
физиологические стимулы и ростовые факторы. Ма*,К*-АТФазу рассматривают не только
как
основной
компонент
натриевого
насоса,
регулирующего
внутриклеточную
концентрацию н'т>ия и калия, но и как сигнальную молекулу, или рецептор эндогенны?
уабаин-подоС
х гликозидов и внеклеточного калия (Xie, Askaii, 2002).
Являясь 1.
понентом системы жизнеобеспечения клетки, натриевый насос находится
под контролем регуляторных механизмов разного типа, которые обеспечивают как быстрое,
так и долговременное изменение интенсивности ионных потоков через плазматическую
•м
мембрану (Clausen, 1996; Clausen, 1998; Therien, B l|5«арг1«9И1вЙНА^!КйШ 2001; Лопина
БИБЛИОТЕКА
I
Cderepi
ОЭ V»J шм
2001). Можно считать установленным, что индуцированное активацией рецепторов ростовых
факторов и гормонов, быстрое изменение функциональной активности натриевого насоса,
связано
с
мембране
изменением
кинетических
транспортных
единиц,
а
параметров
также
с
присутствующих
рекрутированием
в
в
плазматической
мембрану
новых
транспортных комплексов из неактивного внутриклеточного пула (Clausen, 1998; Therien,
Blostein, 2000) В последнее время внимание исследователей привлекают более поздние,
длящиеся во времени изменения в работе ионных транспортеров и ионных каналов,
непосредственно связанные с клеточным циклом Сравнительно недавно на Т-лимфоцитах
было обнаружено зависимое от пролиферации возрастание численности CRAC-каналов и
кальций-зависимых калиевых каналов (Chanshani, 2000, Fomina, 2000). Отмечается, что
повышенная
функциональная
экспрессия
этих
каналов
важна
для
подцержания
пролиферативного статуса лимфоцитов. Именно лимфоциты периферической крови человека
благодаря своей способности под действием митогенов выходить из состояния покоя Go, и
начинать клеточный цикл являются удобным объектом для проведения исследований,
посвященных событиям, сопровождающим прогрессию клетки в цикле. Ключевую роль в
пролиферативном
ответе
лимфоцитов
играет
синтез Т-клеточного
ростового
фактора
интерлейкина-2 (ИЛ-2), сборка на мембране высокоаффинного рецептора ИЛ-2 и активация
ассоциированных с ним сигнальных молекул, в том числе, нерецепторной тирозинкиназы
J A K 3 и адапторного белка ras/MAP-киназного пути She (Berridge, 1997, Lin, Leonard, 1997;
Wang et al., 1999; Lin, Leonard, 2000). Именно на лимфоцитах человека получены данные о
динамике уабаин-чувствительных потоков во время прогрессии GQ—>Gi—>S и установлена
связь между повышением активности натриевого насоса, бласттрансформацией и синтезом
Д Н К (Веренинов и др., 1991; Marakhova et al, 1998).
Природа
связанных
с
клеточным
циклом изменений
транспортной
активности
натриевого насоса не изучена Усиление входных потоков калия в переходный период из
состояния покоя к пролиферации возможно за счет увеличения числа работающих ионных
помп в поверхностной мембране активированной клетки. Не известно, может ли нарастание
численности
мембранных
ион-транспортирующих
комплексов
быть
следствием
рекрутарования готовых Ка*,К*-АТФазных комплексов в мембрану из внутриклеточных
компартментов, или это нарастание контролируется на уровне транскрипции и синтеза
белковых субъединиц, входящих в состав натриевого насоса. Для понимания роли ионных
изменений,
обусловленных
работой
натриевого
насоса
по
ходу
клеточного
цикла,
представляется важным выяснить природу механизмов, которые контролируют уровень
потоков через плазматическую мембрану, и исследовать возможность участия сигнальных
путей, инициируемых при активации рецепторов ростовых факторов и цитокинов
Цели
и задачи
исследования.
механизмов,
обеспечивающих
натриевого
насоса
при
Цель данной работы - изучение природы
долговременное
развертывании
изменение
транспортной
пролиферативного
ответа
активности
лимфоцитов
периферической крови человека. Были поставлены следующие задачи:
Изучить динамику ионных потоков, контролируемых натриевым насосом, при
переходе лимфоцитов из состояния покоя к пролиферации.
Исследовать экспрессию каталитической а 1-субъединицы Na*,K*-АТФазы по ходу
запуска пролиферативного ответа нормальных лимфоцитов человека.
Выяснить, связана ли бласттрансформация нормальных лимфоцитов с синтезом новых
транспортных единиц натриевого насоса.
Установить возможную взаимосвязь экспрессии Ка*Д'^-АТФазы с ИЛ-2-зависимой
стадией пролиферации нормальных лимфоцитов человека.
Выявить сигнальные пути, контролирующие экспрессию Na*,K*-ATФaзы при запуске
клеточной
пролиферации,
для
чего
исследовать
статус
фосфорилирования
транскрипционных факторов STAT3 и STAT5 и протеинкиназы ERK1/2 в активированных
лимфоцитах человека.
Основные
положения,
выносимые
на
защиту.
Позднее длительное
возрастание активности натриевого насоса на пререпликативной стадии (переход Gi->S)
пролиферативного ответа Т-лимфоцитов человека, индуцированного митогенами разной
природы, происходит за счет механизмов долговременной регуляции, связанных с
экспрессией новых субъединиц Ыа^К^-АТФазы.
В активированных лимфоцитах человека как функциональная активность, так и
экспрессия На*,К'^-АТФазы
подавляются иммунодепрессантом
циклоспорином А
и
сопряжены с ИЛ-2-зависимой стадией пролиферативного ответа.
JAK/STAT и МАР-киназные пути передачи сигнала с рецептора ИЛ-2 участвуют в
регуляции функциональной активности и экспрессии Ка'^,К*-АТФазы в Т-лимфоцитах
периферической крови человека.
Научная
чувствительного
новизна. Впервые экспериментально показано, что возрастание уабаиивхода
калия,
сопровождающее
переход
нормальных
лимфоцитов
периферической крови человека из состояния покоя к пролиферации, обеспечивается
механизмами долговременной регуляции, которые обусловлены экспрессией новых
каталитических субъединиц натриевого насоса.
Впервые показано, что торможение пролиферативного ответа иммуносупрессантом
циклоспорином А сопровождается снижением уровня экспрессии Ка'^,К'''-АТФазы в
лимфоцитах, стимулированных Ф Г А или смесью форболового эфира и иономицина.
Впервые
экспериментально
установлено,
что
в
компетентных
лимфоцитах,
предактивированяых Ф Г А в субмитогенной концентрации, экспрессия Ма'^,К*-АТФазы
контролируется Т-клеточным ростовым фактором ИЛ-2.
Впервые показано, что уровень экспрессии а 1-субъединицы На*,К*-АТФазы (также
как интенсивность потоков калия, связанных с работой натриевого насоса) коррелируют с
динамикой пролиферативного ответа Т-лимфоцитов периферической крови человека.
Впервые выявлено участие JAK/STAT и МАР-киназного путей в регуляции
функциональной активности и экспрессии Ка*,К*-АТФазы в Т-лимфоцитах человека.
Теоретическое
и практическое
значение работы.
Проблема регуляции
активности Ка*,К*-АТФазы на протяжении многоступенчатого процесса пролиферативного
ответа важна для понимания условий, которые обеспечивают нормальную прогрессию
лимфоцитов в клеточном цикле и запуск иммунного ответа. До настоящего времени этот
вопрос сводился к изучению изменения активности натриевого насоса на начальном этапе
стимуляции лимфоцитов. Данные, полученные в ходе настоящего исследования, позволяют
расширить представления о механизмах долговременной регуляции натриевого насоса в
процессе развертывания пролиферативного ответа Т-клеток. Интригующим является факт
изменения механизмов регуляции натриевого насоса на разных этапах активации
лимфоцитов Появление в мембране новых функционально активных помп на критическом
для пролиферативного ответа ИЛ-2 зависимом этапе можно объяснить как необходимостью
в новых ионных насосах, регулирующих ионный гомеостаз при увеличении объема клеток,
так и возможным вовлечением Na*^C'^-ATФaзы в процесс проведения пролиферативного
сигнала. Данная работа открывает широкие перспективы для дальнейщих исследований в
области регуляции и роли натриевого насоса в пpoJшфepaции. Сведения о различной
динамике пролиферативного ответа нормальных лимфоцитов могут быть полезными для
оценки иммунного статуса практически здоровых доноров.
Апробация работы.
По теме диссертации опубликованы 15 печатных работ (из
них 5 статей). Материалы диссертации были представлены на XIV Всероссийском
симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, 2002), 13-ой
Европейской студенческой конференции (Берлин, 2002), 42-ой ежегодной конференции
Американского
общества
клеточной
биологии
(Сан-Франциско,
США,
2002),
Меткдународной конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003),
I Всероссийском съезде Общества Клеточной Биологии (Санкт-Петербург, 2003), X I X
Всероссийском съезде Физиологического Общества имени Павлова (Екатеринбург, 2004), I
съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005) и на научных семинарах Лаборатории физиологии
клеточного цикла Института Цитологии РАН.
Объем и структура
диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора
литературы, материала и методов исследования, результатов, обсуждения и списка
цитируемой литературы. Работа изложена на
иллюстрирована
страницах машинописного текста и
рисунками.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Выделение
человека.
и культивирование
лимфоцитов
периферической
крови
Лимфоциты выделяли по общепринятой схеме (Воуию, 1968) из свежей
донорской крови. Лейкоцитарную фракцию отбирали после осаждения эритроцитов,
добавляя в кровь 6 % раствор декстрана (Т500). Суспензию лейкоцитов (пробы по 8 мл)
наслаивали на 3 мл гистопака и центрифугировали в течение 30 мин при 600 g. После
центрифугирования интерфазу переносили в пробирки объемом сначала 50 мл, затем 10 мл и
3-4 раза промьгеали фосфатно-солевым буфером (PBS) следующего состава (в мМ): NaCl 137, Na2HP04 - 8, KCl - 2.7, КН2РО4 - 15. Для удаления макрофагов клеточную суспензию
после отмывки разбавляли средой RPMI-1640 без антибиотиков и помещали в пластиковые
матрацы, предварительно обработанные 10 % сывороткой человека группы крови О (1), и
оставляли на 40 мин при 37 "С в атмосфере 5 % СОг. Далее полученную суспензию
лимфоцитов разливали во флаконы по 40-50 мл с концентрацией клеток 2 млн/мл, а на
следующие сутки суспензию переносили в пенициллиновые флаконы по 1.5 мл (для
последующего измерения ионных потоков) и во флаконы по 10-15 мл с концентрацией 1.5-2
млн/мл.
Схемы
активации
лимфоцитов.
Использовали
три
схемы
запуска
прояиферативного ответа лимфоцитов человека. 1) Покоящиеся лимфоциты (находящихся в
фазе Go клеточного
цикла)
активировали
добавлением
митогенного
лектина
-
фитогемагглютинином (ФГА, 10 мкг/мл), который взаимодействует с комплексом Тклеточного рецептора и инициирует выход покоящихся клеток из фазы Go и их вступление в
клеточный цикл 2) Т-лимфоциты стимулировали активатором протеинкнназы С форбол12,13-дибутириловым эфиром (ФДБ, 10"* М) в сочетании с кальциевым ионофором
иономицином (ИМ, 5x10"' М) 3) Лимфоциты активировали экзогенным цитокином ИЛ-2.
Цитокин (100 ед/мл) добавляли к суспензии Т-клеток, предварительно обработанных в
течение 24 ч ФГА в субмитогенной концентрации (0.8-1 мкг/мл). Такая предактивация дает
возможность лолучшъ «ко&шстентные» клетки, которые способны в ответ на действие ИЛ-2
начать клеточный цикл.
Обработка
клеток
ингибиторами.
Иммуносупрессор циклоспорин А (ЦА)
добавляли в культуральную среду в концентрации 2 мкг/мл одновременно с добавлением
митогенов. Ингибитор киназы JAK3 тирфостин В42 (50 мкМ) и ингибитор киназ ERK1/2
PD98059 (20 мкМ) добавляли в культуральную среду после суточного культивирования с
ФГА в субмитогенной концентрации, за 1 ч до внесения экзогенного ИЛ-2.
Культивирование
клеток
постоянных
клеточных
линий. Клетки линии
К-562 (эритроидной лейкемии человека) и Т-клеточной линии Jurkat культивировали в среде
RPMI-1640 с глутамином («Биолот», Санкт-Петербург), без антибиотиков, содержащей 10 %
эмбриональной сыворотки («Биолот», Санкт-Петербург).
Получение
тотальных
клеточных
лизатов
и мембранных
фракций.
Общие клеточные лизаты получали из свежевыделенных, покоящихся лимфоцитов и
лимфоцитов, активированных соответствующими мигогенами. Лимфоциты осаждали
центрифугированием при 600 g в течение 10 мин, осадки промывали 3 раза холодным PBS и
лизировапи на льду 20 мин в лизирующем буфере (рН 7.4), содержащим 50 мМ Tris-HCl, рН
7.4, 1 % тритона Х-100, 0.5 % нонидега Р-40 (NP-40), 0,5 % дезоксихолата, 150 мМ NaCi, по
1мМ EDTA, EGTA и PMSF, по 1 мкг/мл лейпептина, апротинина и пепстатина, по 1 мМ
ЫазУ04 и NaF. Полученную смесь центрифугировали при 10000 g в течение 15 мин при 4 "С.
Супернатант отбирали, 2 мкл брали для определения концентрации белка К остальному
супернатанту добавляли буфер Лэммли для электрофоретических проб (40 мМ Tris-HCl рН
6.8, 20 % SDS, 20 % р-меркаптоэтанола и 40 % глицерина) из расчета 1 часть буфера на 4
части лизата.
Мембранные фракции клеточных лизатов получали путем мягкой гомогенизации
клеток (после их осаждения и трехкратной отмывки холодным PBS) в буфере TES, рН 7.4 (10
мМ триэтаноламина, 0.25 М сахарозы, по 1 мМ EDTA, PMSF, Na3V04 и NaF, по 1 мкг/мл
лейпептина,
апротинина
(десятиминугным
и
пепстатина),
центрифугированием
осаждения
при
1500
ядер
g,
4
и
неразбитых
"С)
и
клеток
последующего
ультрацентрифугирования в течение часа при 200000 g, 4 "С. Полученный осадок растворяли
в буфере TBS, рН 7.4 (20 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl), добавляли тритон Х-100 до конечной
концентрации 1 %, оставляли на 1 ч во льду и центрифугировали 15 мин при 10000 g К
супернатанту добавляли буфер Лэммли (предварительно отобрав 10 мкл на определение
концентрации белка) и инкубировали в течение 5 мин при 100 " С
Количество общего белка в пробе оценивали по методу Бредфорд (Bradford, 1976). В
качестве стандарта для калибровочной кривой использовали овальбумин
Антитела.
моноклональные
Цщ
антитела
специфического
абР
против
выявления
Ка'^.К'^-АТФазы
использовали
а 1-субъединицы Na■^,K■^-ATФaзы, любезно
предоставленные д-ром Д. Фамброх (Балтимор, США). Антитела разводили (из расчета
1:300) 5 % раствором обезжиренного молока в 0.05 % TTBS.
В качестве вторичных
использовали конъюгированные с пероксидазой хрена козьи антитела, полученные против
иммуноглобулинов мыши - GAM-HRP (Sigma, США), также приготовленные на 5 % молоке
в разведении 1 ;20000.
Поликлональные антитела против STAT3, фосфорилированного по тирозину 705 и
STAT5 (STATSa), фосфорилированного по тирозину 694 (Cell Signalling Technology, США)
разводили (МООО) 5 % раствором бычьего сывороточного альбумина (BSA) в 0.1 % TTBS.
Поликлональные кроличьи антитела, опознающие нефосфорилированные формы ERK1/2
(Santa Cruz, США) в разведении 1:2000 готовили на 1 % BSA. В качестве вторичных
использовали конъюгированные с пероксидазой хрена козьи антитела, полученные против
иммуноглобулинов кролика - GAR-HRP (Cell Signalling, США) приготовленные на 5 %
обезжиренном
молоке
в
разведении
1:6000. Моноклональные
антитела
против
фосфорилированных форм ERK1/2 (ТЬг202/Туг204) (Cell Signalling Technology, США)
разводили
1%
BSA
из
расчета
1:1000.
Моноклональные
антитела
против
нефосфорилированного STAT3 (Transduction Laboratories, США) и вторичные антитела
GAM-HRP готовили на обезжиренном 5 % молоке в разведении 1:1000 и 1:20000,
соответственно.
Электрофорез
и иммуноблотинг.
Электрофоретическое разделение белков
проводили методом диск-электрофореза в 7.5 % полиакриламидном геле в присутствии SDS
с последующим полусухим электропереносом (0.8 мА/см^, 1 ч 15 мин) на нитроцеллюлозную
мембрану (Hybond-C Extra, Amersham Pharmacia Biotech, Швеция). Визуализацию блотов
проводили путем усиленной хемилюминесценции (ECL, Western blotting protocol, Amershaffi,
США). Хемилюминесцентное свечение регистрировали при экспонировании мембраны на
пленку для рентгеновских снимков Fujifilm Super RX. Пленку сканировали с помощью
сканера ARCUS 11 (AGFA) для оценки относительных изменений плотности проявленных
полос. Для оценки равномерности нанесения тотальных лизатов после окраски антителами
против фосфорилированных форм белков STAT мембрану инкубировали в специальном
буфере для
удаления
антител (62.5 мМ Tris-HCl рН 6.8, 2 % SDS, 100 мМ
Э-
меркаптоэтанола) в течение 40 мин при температуре +50 "С и подвергали повторной окраске
с антителами против нефосфорилированного STAT3.
Измерение
входных
потоков
рубидия.
Для
оценки
функциональной
активности Ка'^,К'^-АТФазы измеряли однонаправленные ионные потоки с помощью метола
пламенно-эму хионной фотометрии. Входной поток калия оценивали по накоплению
лимфоцитами его физиологического аналога рубидия, добавляя RbCl на 30 мин в конечной
концентрации 2.5 мМ (Веренинов и др., 1982). Поток рубидия, чувствительный к уабаину,
.четектировали по разности между общим накоплением рубидия и его входом в клетку в
присутствие 0.05 мМ уабаина в течение 30 мин. После инкубации с RbCl и уабаином, клетки
8
осаждали центрифугированием в течение 3-5 мин. при 600 g. Осадок пятикратно промывали
охлажденным раствором M g C l j (85 мМ), не ресуспендируя, и заливали
I
мл 5
%
трихлоруксусной кислотой. Содержание катионов в надосадочной жидкости определяли на
атомно-абсорбционном фотометре Perkin-Elmer АА-306. Далее осадок растворяли в 1 мл
0.1 N N a O H для последующего определения содержания общего белка по методу Лоури.
Концентрацию катионов выражали в мкмолях на мг общего белка.
Оценка
пролифератиеного
ответа
лимфоцитов.
Для оценки уровня
пролиферации в культуре активированных лимфоцитов использовали метод проточной ДНКцитометрии. Перед измерением клетки инкубировали 30 мин в PBS, содержащем 0,02%
сапонина, и после отмывания клеток от сапонина окращивали в течение 30-40 мин при
температуре 37''С в PBS, содержащем 50 мкг/мл иодида пропидия и 250 мкг/мл
рибонуклеазы. Анализ распределения клеток по фазам клеточного цикла проводили на
двухлазерном проточном цитометре-сортировщике АТС 3000 („Brucker", Германия) при
скорости anairasa 1000 клеток в 1 с. Численную обработку гистограмм и определение долей
клеток, соответствующих по количеству ДНК фазам цикла (Go+Gi, S и Gj+M), проводили
согласно модели Дина.
Р Е З У Л Ь Т А Т Ы И ОБСУЖДЕНИЕ.
Изменение
лимфоцитов
митогенами,
входных
потоков
периферической
из состояния
рубидия
крови
при
переходе
человека,
нормальных
стимулированных
покоя к пролиферации. На нормальных лимфоцитах
человека,
активированных
митогенами,
показано,
ионных
потоков
на
разными
что
возрастание
ранней
стадии
активации (до 5 часов) сменяется стойким
долговременным
повышением
транспортной активности натриевого насоса
на поздних стадиях перехода Go—»Gi—»S (16
- 48 ч) (Веренинов и др., 1991; Marakhova et
al., 1998). В наших опытах м ы проводили
параллельно
уабаином
экспрессии
вреия 1
Рис.1. Изменение входных потоков рубидия при
стимуляции нормальных лимфоцитов периферической
крови человека ФГА или ФДБ и ИМ
оценку
входных
ингибируемых
потоков
каталитической
рубидия
и
субъединицы
Ка*,К*-АТФазы и подтвердили полученные
ранее данные
о двухфазном
изменении
активности натриевого насоса при активации лимфоцитов человека фитогемагглютинином
Ф Г А или форболовым эфиром ( Ф Д Б ) в сочетании с иономицином ( И М ) (рис. 1). Характерно,
что уабаин-резистентный поток рубидия не меняется с течением времени. Быстрые
изменения ионных потоков в ответ на митогенную стимуляцию Т-клеток хорошо изучены
(Kaplan, Owens, 1978; Sege! et al., 1979; Averdunk, Gimther, 1980; Prasad et a i , 1987; Severini et
a l , 1987; Orinstein, Dixon, 1989), в то время как механизмы, отвечающие за нарастание
активности
Ка^,К^-АТФазы
в
течение
длительного
периода
развертывания
пролиферативного ответа нормальных лимфоцитов не исследованы.
Внутриклеточное
рубидия
содержание
в активированных
натрия
лимфоцитах.
и уровень
входных
потоков
Известно, что зависимость величины
входных потоков калия (рубидия) от внутриклеточной концентрации натрия является одной
из важных кинетических характеристик натриевого насоса (Glynn, 2002). В нормальных,
физиологических условиях именно изменение концентрации натрия в клетке контролирует
скорость работы (число каталитических циклов в единицу времени) натриевого насоса и
определяет величину направленного в клетку потока калия.
Стимуляция
Na,,
Поток рубидия,
мкмоль на 1 г белка
мкмоль на 1 г за 30 мин
Контроль
121+4
14.8±1
ФГА, 5ч
197+11
27.4+3
М + ФГА, 5 ч
534+4 (2.7)
78.0+2 (2.9)
ФГА, 24 ч
187+5
47.7±4.5
М + ФГА, 24 ч
561+23 (3.0)
108.6±2.5 (2.3)
ФГА, 48 ч
173±12
59.7±5
М +ФГА, 48 ч
491+24 (2.9)
122.8+4.5 (2.1)
Таблица 1 Влияние моненсина (М) на внутриклеточное содержание натрия (Na,) и уабаинчувствительный входной поток рубидия в лимфоцитах человека, стимулированных ФГА. В скобках указано во
сколько раз концентрация ионов после обработки клеток моненсином превышает контрольный поток в
лимфоцитах, стимулированных ФГА в течение того же периода времени без моненсина.
Общепризнанно, что быстрое возрастание входа калия в ответ на Ф Г А обусловлено
усилеш!ем
транспортной
активности
На*,К'^-АТФазы
в
результате
увеличения
внутриклеточной концентрации натрия (Kaplan, 1978). К а к было показано ранее и как видно
из табл. 1, через 5 ч и в течение следующих двух суток после активации лимфоцитов Ф Г А
10
внутриклеточное
содержание
натрия практически
не изменяется, поэтому,
высокую
транспортную активность натриевого насоса во время пререпликативной стадии нельзя
связать с повышенной концентрацией натрия в лимфоцитах (Marakhova et al., 1998). Этот
вывод подтверждают данные экспериментов, в которых оценивали изменение потоков
рубидия при дополнительном повышении содержания натрия в лимфоцитах с помощью
Na*/H* ионофора - моненсина. Моненсин (20 мкМ) вносили в культуру лимфоцитов на
разных сроках активации на 30 мин и нашли, что на поздних сроках активации моненсин
повышает внутриклеточное содержание натрия в 2.9-3.0 раза н увеличивает
также
ингибируемый уабаином вход рубидия в 2 1-2.3 раза (табл. 1). Таким образом, в бластах
натриевый насос не работает в режиме максимального переноса ионов через мембрану, он
сохраняет способность увеличивать транспортную активность в ответ на повышение
внутриклеточной концентрации натрия. Нарастание входных потоков рубидия, которое
сопутствует прогрессии Go-^Gi->S, нельзя объяснить повышенной скоростью работы
присутствующих в мембране Ка*,К"^-АТФазных транспортных единиц.
Динамика
экспрессии
пролиферативного
а-субъединицы
ответа
Na*,K*-AT0a3bi
ФГА-стимулированных
по
лимфоцитов.
ходу
В
функционально-активном комплексе натриевого насоса а- и р-субъединицы находятся в
соотношении
1:1, при
этом
каталитическую
функцию
выполняет
а-субъединица.
установлено, что у человека a l р 1 изоформа Na*,K*-ATФaзы встречается почти во всех типах
клеток (Crambert et al., 2000). Показано также, что в активированных лимфоцитах человека в
течение 2 суток происходит постепенное увеличение количества al мРНК (Vereninov et al.,
1993), в то время как сведения о динамике экспрессии pi мРНК противоречивы (Masat et al.,
1996,
[^^
117кДа
"-«i
,
''^-
. ™>^1?'"* ,
Тотал. Мембр. i Тотал, Мембр. [ Тогал Мембр.
™'"'' фракция! лизэт
И
фравщ1| яш«т
,
фракюи
,
LMW
дТкДа
Веренинов
и
др., 2001).
Исходя их этих данных, изменение
СОДержаНИЯ аКТИВНЫХ
натриевых
насосов
КОМПЛеКСОВ
при запуске
пролиферативного
'***
Рис 2. Идентификация а1ч;убьединииы в лизатах клеток
эритроияной лейкемии К-562, Т-клеточной линии lurkat и
лимфоцитов человека (HBL), стимулированных ФГА (10 мкг/мл)
в течение 24 ч Здесь и далее нанесены маркеры молекулярного
веса HMW (high molecular weight) и LMW (low molecular weight)
лимфоцитов
изменению
ответа
оценивали
по
Содержания
al-
субъединицы.
Ha нммуноблотах тотальных
лизатов свежевыделенных покоящихся лимфоцитов полоса, соответствующая молекулярной
массе а 1-субъединицы (около 100 кДа), практически не выявляется (рис. 2). В общих лизатах
активно пролиферирующих клеток эритроидной лейкемии К562 и Т-клеточной линии Jurkat,
11
а также лимфоцитов, стимулированных ФГА в течение суток, эта полоса имеет слабую
интенсивность, в то время как в мембранных фракциях этих же клеток она отчетливо
идентифицируется. Из литературы известно, что по сравнению с другими тканями, в
эритроцитах и лимфоцитах содержание Na*,K*-ATOa3bi самое низкое и составляет в
среднем соответственно 0,071 и 3,5 пмоль связанного ['Н] уабаина в расчете на 1 мл клеток
(Clausen, 1998)
Для сравнения, в миоцитах скелетных мышц и кардиомиоцитах
концентрация натриевых насосов в мембране составляет от 300 до 760 пмоль/г клеток, а в
клетках коры головного мозга - около 11400 пмоль/г клеток (Clausen, 1998). Опираясь на
данные, представленные на рис 2. уровень экспрессии а 1-субъединицы мы определяли в
мембранных фракциях лизатов лимфоцитов.
Ц
А
ФГА
-
-
а
-
+
.
.
б
.
+
.
в
.
+
-
i'
I 1
S
I
1
о
Рис 3 Динамика экспрессии al-субьединицы Ка*,К*-АТФазы по ходу пролиферативного ответа лимфоцитов,
стимулированных Ф Г А по данным трех (а, б в) независимых экспериментов г, д ,е - изменения относительной
оптической плотности полос, соответствующих белку а! За единицу принята интенсивность полос,
соответствующих содержанию at-субъединицы в покоящихся лимфоцитах
Оценка изменений содержания а 1-субъединицы по ходу стимуляции лимфоцитов
ФГА показала, что на ранних этапах пролиферативного ответа (до 5 ч) количество белка al
не изменяется, а после суточной инкубации с ФГА увеличивается примерно в 2,5 раза (2,7 ±
0,5, п = 5) по сравнению с контрольными покоящимися клетками (рис. 3, а). Следует
заметить, что динамика и уровень пролиферативного ответа зависят не только от способа
активации и концентрации митогена, но и от индивидуальных особенностей донора
(вероятно, от его иммунологического
статуса). При этом максимальный уровень
пролиферации, оцениваемый по проценту клеток в S-фазе, может быть достигнут как после
48 ч, так и через 72 ч после добавления митогена к суспензии лимфоцитов. Кроме того, к
концу первых суток стимуляции лимфоциты вступают в стадию роста, объем клеток и масса
12
тотального белка возрастают в 1,5-1,8 раз. В связи с чем становится затруднительно
количественно оценивать прирост содержания индивидуального белка al. Этим объясняются
различия в уровне экспрессии белка в отдельных независимых экспериментах. По нашим
данным, на вторые сутки после активации количество белка al увеличивается в диапазоне от
4,5 (рис. 3, б) до 11 раз (рис.3, в) по сравнению с покоящимися клетками.
Таким образом, мы обнаружили, что при стимуляции лимфоцитов с начальной стадии
(активации Т-клеточного рецептора), накопление каталитической субъединицы
Na*,K*-
АТФазы в мембранных фракциях наблюдается через 24 ч после добавления ФГА, что
согласуется по времени с началом второго пика увеличения уабаин-чувствительного
входного потока рубидия (рис.1).
Динамика
экспрессии
пролиферативного
ответа
эфиром и иономицином.
а-субъединицы
лимфоцитов,
Ма*,К*-АТФазы
стимулированных
по
ходу
форболовым
Известно, что активаторы протеинкиназы С и кальциевые
ионофоры способны вызывать пролиферацию Т-клеток, минуя стадию активации Тклеточного рецептора (Berridge, 1997; Kumagai et al, 1998a). Согласно литературным данным,
при одновременной обработке клеток ФДБ и ИМ, максимум экспрессии мРНК ИЛ-2 (через 3
ч) достигается в 4 раза быстрее, чем при стимуляции одним ФГА (через 12 ч). Однако
динамика
<т,1м
ЦА
| 9 mm»
мРНК
рецептора ИЛ-2 (необходимого для
им. 24*
ткКааж
экспрессии
_ „
imkit
инициации
второй
пролиферативного
ступени
ответа)
при
активации ФДБ совместно с ИМ не
отличается
инкубации
от
клеток
максимальный
наблюдается
таковой
с
ФГА,
при
а
уровень
между 12 и 48 ч
после стимуляциии (Kumagai et.al,
1998b; McCrady et al., 1988).
Как показано на рис. 4,
Рис 4 Экспрессия al -субъединицы Na+,K+-ATOa3H в
лимфошгтах, стимулированных ФДБ и ИМ. Денситограмма
показывает изменения относительной оптической плотности
полос, соответствующих белку al ЦА - циооспорин А.
после инкубации лимфоцитов в
течение 24 ч в присутствии ФДБ и
ИМ наблюдается более высокий
уровень экспрессии а 1-субъединицы Na*,K*-АТФазы, в среднем в 9 раз превышающий
контрольный и сопоставимый с таковым в трансформированной Т-клеточной линии Jurkat и
клетках миелоидной лейкемии К-562.
13
Нарастание
уабаин-чувств'ительного
входного
потока
рубидия
в
лимфоцитах,
активированных Ф Д Б и И М , коррелирует по времени с увеличением экспрессии a l субъединицы субъединицы Ыа*Д*-АТФазы. Следует отметить, что вход рубидия в клетку
после 48 ч стимуляции Ф Д Б и И М выше, при их стимуляции Ф Г А (рис. 1).
Влияние
ингибиторов
Na*,К*-АТФазы.
В
транскрипции
и трансляции
на экспрессию
литературе и м е ю т с я н е м н о г о ч и с л е н н ы е сведения о т о м , ч т о рост-
с т и м у л и р у ю щ и е ф а к т о р ы п о в ы ш а ю т уровень э к с п р е с с и и м Р И К а- и р- субъединиц Na*,K*А Т Ф а з ы (Martinez M a s et a l . , 1995; Nemoto et al., 1997; В е р е н и и о в и др., 2001). Следовательно,
связанное
с
запуском
пролиферации
увеличение
общего
пула
Na*,K*-ATФaзныx
транспортных единиц м о ж е т контролироваться н а транскрипционном уровне. В
работах,
п о с в я щ е н н ы х а к т и в а ц и и N a * , K ' ^ - A T Ф a з ы в митоген-стимулированных лимфоцитах, показано,
что к а к добавление ингибитора транскрипции а к т и н о м и ц и н а D ( А к т D , 0.004 мкг/мл), т а к и
ингибитора трансляции циклогексимида ( Ц Т , 5 мкг/мл) на п е р в о й с т у п е н и пролиферативного
ответа
не
влияет
на
функциональную
пререпликативной с т а д и и (через
На
поздней
16-24 часа после с т и м у л я ц и и ) А к т D и Ц Т
активность
натриевого
насоса.
снижают
интенсивность уабаин-чувствительного ионного транспорта в 2 и 2-3,5 раза соответственно
( M a r a k h o v a et a l . , 1998; M a r a k h o v a et a l . , 2000).
В н а ш е й работе м ы о б н а р у ж и л и , ч т о к о л и ч е с т в о а 1-субъединицы N a * , K * - А Т Ф а з ы в
мембранных фракциях л и м ф о ц и т о в после п я т и ч а с о в о й и н к у б а ц и и с Ф Г А в п р и с у т с т в и и и в
о т с у т с т в и и Ц Т одинаково (рис. 5, а). В т о ж е в р е м я , добавление Ц Т после 18 ч с т и м у л я ц и и
отменяет Ф Г А - о п о с р е д о в а н н о е усиление экспрессии этого б е л к а (рис. 5, б ) .
HMW
117 K S > '
ФГА. 5 ч.
W
ФГА. 24 ч.
I
ISSTf.
^Я^Р"^
цг
LMW
?7цД»
М1№
76iM(*
Рис. 5
Влияние циклогексимида (ЦГ) на
содержание
a l субъединицы
в
мембранных
фраюшях лимфоцитов, стимулированных Ф Г А .
Рис 6 Влияние актиномицина D (Акт Д) и
циклогексимида (ЦГ) на экпрессию a l -субьеднницы
На+,К+-АТФазы в лимфоцитах, стимулированных
совместным действием ФДБ и И М
14
В мембранных фракциях лимфоцитов, стимулированных ФДБ и ИМ, актиномицин D
и циклогексимид на поздних сроках запуска пролиферативного ответа также снижают
содержание белка al (рис. 6).
Суммируя вышеизложенные данные, можно заключить, что запуск пролиферации в
нормальных лимфоцитах человека на первом этапе активации сопровождается повышением
интенсивности уабаин-чувствительных
ионных
потоков
за
счет
усиления работы
присутствующих в мембране натриевых помп, в то время как вторая длительная стадия
нарастания ионных потоков обусловлена экспрессией новых субъедшшц Na*,K*-ATOa3H.
Экспрессия
al-субъединицы
лимфоцитах является
Ма*,К*-АТФазы
в
активированных
циклоспорин Л - зависимым процессом. На следующем
этапе работы мы попытались выяснить, связана ли экспрессия Ыа*,К'^-АТФазы с ИЛ-2зависимой стадией пролиферации нормальных лимфоцитов человека. Частичное подавление
пролиферации лимфоцитов достигается добавлением иммуносупрессора циклоспорина А
(ЦА) (Shaw et al., 1995). ЦА ингибирует Са^*/кальмодулин-зависимую серин/треониновую
фосфатазу - кальцинейрин, которая индуцирует транслокацию в ядро цитоплазматического
компонента NFAT-содержащего комплекса - транскрипционного фактора, отвечающего за
синтез ИЛ-2 (Liu et al., 1992; Shaw et al., 1995). При инкубации лимфоцитов с ФГА в
присутствии ЦА в антипролиферативной концентрации (1-2 мкг/мл) уровень экспрессии
белка о1 через 48 ч снижается в среднем в 2 раза по сравнению с клетками,
активированными без ЦА (рис. 3, б; рис. 3, в). После инкубации в течение суток эффект ЦА
выражен не столь отчетливо (рис. 3, а). Степень ингибирования экспрессии белка о1 ЦА в
лимфоцитах, стимулированных ФДБ и ИМ (рис. 4), более выражена, чем при действии ФГА.
Эта данные коррелируют со сведениями об угнетении
функциональной активности
натриевого насоса под действием ЦА (Marakhova et al., 1999). Как правило, в мембранных
фракциях лимфоцитов, активированных ФГА в присутствии ЦА в течение 48 ч, содержание
белка al все-таки выше, чем в покоящихся клетках (рис. 3). Неполное подавление
экспрессии белка a l под действием ЦА отражает тот факт, что данный иммуносупрессор
тормозит пролиферативный ответ Т-лимфоцитов частично, поскольку существует ЦАнезависимый путь активации NFAT (Ghosh et al, 1996). Таким образом, полученные
результаты дают основание предполагать, что сигнал для синтеза новых субъединиц
натриевого насоса и их сборки в функционально активный комплекс топологически
привязан к ИЛ-2 зависимому этапу пролиферации.
Экспрессия
стимуляции
al-субъединицы
экзогенным
ИЛ-2.
Nа*,К*'-ATФазы
лимфоцитов
Для проверки предположения
при
о связи между
экспрессией Ка'^,К*-АТФазы и ИЛ-2-регулируемой стадией пролиферативного ответа
15
лимфоцитов исследовали изменения содержания белка a l при стимуляции компетентных
лимфоцитов экзогенным ИЛ-2. Субмитогенная концентрация Ф Г А (0.8-1 мкг/мл) приводит
покояпщеся лимфоциты в «компетентное» состояние: добавление экзогенного ИЛ-2 (100
ед/мл) к таким предактивнрованным Т-клеткам вызывает бластгрансформацию и запуск
пролиферации (Kumagai et al., 1998а). На рис. 11, а видно, что содержание а 1-субъединицы
Ка*,К*-АТФазы в компетентных лимфоцитах
«ГА.
не отличается от содержания в покоящихся
Blti
ч»
клетках. После инкубации с экзогенным ИЛ-2
fw ■ t ' t « | ^ К J S
(100 ед/мл) в течение 24 или 48 ч содержание
--в1?1Й»
белка о1 увеличивается в среднем в 4,5 и 8,5
раз соответственно (рис. 11, рис. 7).
Исследование входных потоков рубидия
в параллельных пробах лимфоцитов тех же
доноров
показало,
компетентных
что
лимфоцитов
стимуляция
человека
ИЛ-2
вызывает длительное усиление транспортной
JLl
ill
активности натриевого насоса, коррелирующее
с уровнем экспрессии а 1-субъединицы Na*,K*А Т Ф а з ы (рис, 7) Следовательно, возрастание
уровня экспрессии белка a l и сборка новых
активных
Рис 7 Корреляция экспрессии al-субъединйць,
«а*,К*-АТФазы с функциональной активностью
натриевого насоса ЦА - циклоспорин А.
Na*,K*-ATФaзы
происходят
на
ИЛ-2-зависимой
пролиферации лимфоцитов человека,
Как
чувствительный входной поток Rb*
комхиексов
ВИДНО
на
рис.
7,
стадии
уабаин-
возрастает в 3-5 раз, а уровень экспрессии a l -
субъединицы в 7-12 раз. Известно, что один ион калия переносится через плазматическую
мембрану за один каталитический цикл Ка*,К*-АТФазы (Jorgensen et al., 2003). При условии,
что скорость каталитического цикла или число рабочих циклов насоса в единицу времени
существенно не изменяется, возрастание входных потоков рубидия должно быть согласовано
с увеличением числа работающих ионных насосов в мембране. В наших эксперимен1ах
относительнмй прирост количества белка a l в мембранных фракциях клеточных лизаюв
больше, чем относительное возрастание трансмембранных ионных потоков. Этот феномен
можно объяснить тем, что увеличение количества белка a l в мембранных фраыщях бластов
отражает изменение общего пула вновь синтезированного белка в клетке, и лишь часть этого
16
пула используется для сборки димерного
комплекса
оР, являющегося
основной
составляющей функционально активного натриевого насоса плазматической мембраны.
В
долговременной
активности
регуляции
Na*,K*-AT0a3bi участвуют
экспрессии
JAK/STAT
и
функциональной
и МАР-киназные
пути.
В
свете вышеизложенного представлялось важным выяснить, какие сигнальные пути,
инициируемые ИЛ-2 в компетентных Т-лимфоцитах, участвуют в регуляции экспрессии
Ка*,К*-АТФазы. Рецептор ИЛ-2 состоит из трех субъединиц: IL-2Ra (а-цепь рецептора ИЛ2), IL-2RP и субъедияица ус (общая у-цепь цитокиновых рецепторов). Только в
активированных лимфоцитах обнаруживаются высокоаффинные рецепторы, содержащие все
3 цепи, необходимые для запуска максимального пролиферативного сигнала (Lin, Leonard,
1997; Lin, Leonard, 2000). Появление в среде ИЛ-2 (в результате предшествующих этапов
активации лимфоцитов) ведет к гетеродимеризации цитоплазматических доменов IL-2RP и Ус
и сборке на мембране рецепторного комплекса со средней аффинностью. Гетеродимеризация
рецептора индуцирует быструю активацию ассоциированных с ним сигнальных молекул,
таких как нерецепторные тирозинкиназы семейства J A K (JAK1 и JAK3), семейство Srcкиназ (Lck, Lyn и Fyn), семейство Syk-киназ (Syk, Zap-70), Рук-2, адапторный белок She
(Berridge, 1997; Lin, Leonard, 1997; Wang et al., 1999; Lin, Leonard, 2000). Активированные
JAKl и JAK3 фосфорилируют друг друга, рецептор ИЛ-2 и запускают JAK/STAT и
Shc/MAP-киназный сигнальные пути (Lin, Leonard, 1997; Wang et al., 1999). Промотор гена
IL-2Ra является мишенью для димеров белков семейства STAT5 (Lin, Leonard, 2000;
Buitenhuis et al., 2004). В результате запускается транскришдая и синтезируются молекулы
lL-2Ra, необходимые для сборки высокоаффиного рецептора ИЛ-2. Таким образом, в
запуске пролиферативного ответа Т-лимфонитов одну из ключевых ролей играют
близкородственные транскрипционные факторы STATSa и STAT5P (Moriggl et al., 1999; Lin,
Leonard, 2000; Buitenhuis et al., 2004). Мы проследили динамику активации белков STAT5 и
STAT3 при стимуляции нормальных лимфоцитов человека митогенами различной природы.
О степени активации STAT-белков судили по уровню фосфорилирования по тирозину.
Как показано на рис. 8, увеличение более чем в 15 раз количества фосфорилированвых
форм STAT5 наблюдается уже в первые 10 мин стимуляции предактивированных
лимфоцитов ИЛ-2 (рис. 8, д и б). На протяжении последующих 24 ч уровень
фосфорилирования STAT5 постепенно снижается. В отличие от STAT5, фосфорилированные
формы STAT3 присутствуют в покоящихся и в компетентных Т-клетках, на этом фоне
динамика фосфорилирования STAT3 вьп-лядит «сглаженной», и ИЛ-2 через 10 мин
увеличивает степень фосфорилирования STAT3 не более чем в 2-2,5 раза (рис. 8, а и в).
17
Далее, в течение суток в присутствии ИЛ-2 степень фосфорилирования STAT3 сохраняется
примерно на одном и том же уровне
»
I
ФГА.10]дт^
{-
1
1
Ют
2
2
1ч 9ч 3*ч\ I
3
3
4
4
S
5
1
ИЛ-а, 100«Як«
Юям ЗОЯМ 1ч
6
7
6
7
« • щв 'mm» ф^
8
Эвч]
9
8
10
9
i 19
pSTATS
1
10
Ш^<ш1>'^
2
3
4
5
*
7
8
9
10
3
pSTATJ
i
1
2
4
S
«
7
8
9
10
3
i
STAT3
J
2-
illill
Рис 8 Изменения уровня фосфорилирования STAT5 (pSTATS) и STAT3 (pSTAT3) по ходу пролиферативного
ответа лимфоцитов, стимулированных ФГА и компетентных лимфоцитов, стимулированных ИЛ-2 а иммуноблот тотальных лизатов лимфоцитов человека; б, в - изменения оптической плотности полос,
соответствующих фосфорилированным формам STAT5 и STAT3. За единицу принята интенсивность полос,
соответствугоших степени фосфорилирования STAT5 и STAT3 в покоящихся лимфоцитах
Из всей совокупности данных, полученных нами при анализе динамики активации
белков семейства S T A T после стимуляции нормальных лимфоцитов человека разными
митогенами, резкое (в 10 раз и более) увеличение степени фосфорилирования STATS может
служить
своеобразным
маркером
вхождения
Т-клеток
в
ИЛ-2-зависимую
стадию
пролиферативного ответа.
Как отмечено выше, помимо активации STAT белков, димеризованный рецептор ИЛ-2
запускает Shc/ras/ERK/MAP-киназный сигнальный путь (Benidge, 1997; Wang et al., 1999)
И)9«059
ИЛ>2
ФГА,в,81аг/мя,24ч
■ + *
vno» 10иш + + +
+
- +
24ч ЧМ
+
+
■ш 45 1Щ& sSlWete *.
1.
■■
Тм^^т.
.
.
.
.
- 10юп Зч
24ч
+ И) 98059
ФГА,10ш!Г/Ш1,24ч
24ч
li
iiiiMii
»...
^>^*
рЕЮСШ
ERK1/2
Рис. 9 Фосфорилирования ERK1/2 при активации лимфоцитов экзогенным ИЛ-2 и ФГА
18
Активацию
ERK1/2,
финальной
киназы
этого
каскада,
оценивали
по
наличию
ее
фосфорилированных по треонину и тирозину форм (Тпг202/Туг204) (рис.9)
Как и в случае ИЛ-2-зависимой активации S T A T 5 , фосфорилированные формы
ERK1/2 появлялись через 10 мин после добавления экзогенного ИЛ-2 к компетентным
лимфоцитам, а спустя 24 ч уровень фосфорилирования ERK1/2 значительно увеличивался.
Предварительная обработка лимфоцитов ингибитором MEK1/ERK1/2 PD98059 приводила к
отмене фосфорилирования ERK1/2 в первые минуты после стимуляции ИЛ-2, причем этот
эффект сохранялся длительное время при последующем культивировании в присутствии ИЛ2 и ингибитора (рис. 9). При стимуляции лимфоцитов Ф Г А в митогенной концентрации,
заметное нарастание степени фосфорилирования ERK1/2 так же, как и его снижение под
действием PD98059, наблюдалось после 24 ч инкубации с Ф Г А (рис. 9).
Для выявления возможного участия JAK/STAT и МАР-киназного пути в регуляции в
а
ФГА ,24 ч,
ИЛ-2,24ч
В-42
ФГА ,
48 ч
ФГА ,
24 ч
ИЛ-2-зависимой
6
ФГА ,24 ч,
ИЛ-2, 48 ч
В-42
активности
и
экспрессии Na"'',K*-ATOa3bi, лимфоциты
обрабатывали
Рис. 10. Содержание о1-субъединицы в мембранных
фракциях лимфоцитов, активированных экзогенным ИЛ-2
в присутствии ингибитора тирозинкиназы JAK3
тирфостина В42 по данным двух (а и б) независимых
экспериментов.
специфическими
ингибиторами тирозинкиназы J A K 3
тирфостином
В42
(50
мкМ)
и
ингибитором MEK1/ERK1/2 — PD98059
(20 мкМ). В наших экспериментах
обработка «компетентных» лимфоцитов
тирфостином В42 снижала уровень экспрессии о 1-субъединицы Ыа*,К'''-АТФазы в среднем в
2-2,5 раза как после 24 ч, так и
после 48 ч инкубации с ИЛ-2
(рис. 10).
на
каталитической
влияния
6
ИЛ-2.24 ч
117 >ДВ a i 4>1
ФГА,0^ккгА|л,24ч
Анализ
98059
а
РП9Ш5
<-
PD-
содержание
субъединицы
Na\K*-ATФaзы в мембранных
фракциях
лимфоцитов,
активированных ИЛ-2, показал,
что
в
конце
инкубации
присутствии
с
первых
суток
цитокином
ингибитора
в
в
двух из четырех независимых
UL
Рис. и Влияние ингибитора MEK1/ERK1/2 - PD-98059 на уровень
экспрессии о1-субъединицы Ка*,К*-АТФазы в лимфоцитах,
активированных экзогенным ИЛ-2. по данным двух (а, 6) независимых
экспериментов в, г - изменения относительной оптической плотности
полос, соответствующих белку аХ.
экспериментов количество белка a l в мембранных фракциях почти не изменялось (рис 11,6),
19
а в двух других случаях резко снижалось (рис. 11, а) по сравнению с лимфоцитами, которые
активировали ИЛ-2 без предварительной обработки ингибитором. Инкубация Т-клеток в
течение 48 ч с ИЛ-2 в присутствии PD98059 во всех экспериментах приводила к снижению
содержания белка a l
до контрольного уровня в мембранных фракциях компетентных
лимфоцитов (рис. 11,6).
Полученные
нами данные о подавлении экспрессии белка a l
в присутствии
ингибиторов J A K / S T A T и МАР-киназных сигнальных путей согласуются с изменением
уабаин-чувствительных потоков рубидия (рис.12).
900 -i
800
•*- ИЛ.2
С З ИЛ-2 + В42
п а ИЛ-2 + РО980$9
[К1
-*• ИД.2
■ ■ ИЛ-2 + В42
«33 l № 2 + PD9«B9
[Nal
С=Э ИЯ-2
ШВ WI-2H-B42
900
860
g 700
700 •
600
(00
24
36
BpfflM, Ч
12
24
К
60
Время, ч
Рис 12 Влияние тирфостина В42 и PD98059 на внутриклеточное содержание калия и натрия (а) и на уабаинчувствительные входные потоки рубидия (в) в «компетентных» лимфоцитах, стимулированных ИЛ-2
Ионные потоки и
содержание белка a l
измеряли в параллельных
пробах
в
лимфоцитах, полученных от одного донора. Важно отметить, что длительная инкубация (до
48
ч)
лимфоцитов,
активированных
ИЛ-2
в
присутствии
В42
или
PD98059,
не
сопровождалась такими изменениями внутриклеточного содержания катионов, которые
могли бы свидетельствовать о токсическом действии ингибиторов на клетки (рис. 12, а). Как
следует из данных, показанных на рис. 12, б, как В42, так и PD98059 снимают то нарастание
уабаин-чувствительного
входа
рубидия,
стимулированных ИЛ-2 течение 48 ч
которое
наблюдается
в
лимфоцитах,
Таким образом, наблюдается корреляция между
подавлением транспортной активности натриевого насоса и снижением уровня экспрессии
а 1-субъединицы Ка*,К*-АТФазы при выключении JAK/STAT- и М А Р К - путей сигнализации
с рецептора ИЛ-2.
Подводя итог, можно отметить, что в ходе проведенного нами исследования впервые
было обнаружено, что при переходе активированных лимфоцитов из состояния покоя к
20
пролиферации, происходит связанное с клеточным циклом изменение уровня экспрессии
каталитической al-субъединшщ Ка*Д*-АТФазы. Сравнение динамики ионных потоков,
сопряженных с работой насоса плазматической мембраны, и экспрессии каталитической alсубъединицы Ка*,К*-АТФазы
у
лимфоцитов
человека,
стимулированных
разными
митогенными агентами, показало, что усиление ингибируемых уабаином входных потоков
рубидия (физиологического аналога калия) во время прогрессии Go-^G|-^S сопряжено с
возрастанием количества белка al в мембранных фракциях и, вероятно, обеспечивается за
счет синтеза новых функционально активных Ка*,К*-АТФазных транспортных комплексов.
Весьма интригующим представляется установленный факт связи механизмов, регулирующих
экспрессию и функциональную активность Ка*Д*-АТФазы с ИЛ-2-зависимой стадией
пролиферативного ответа, являющейся ключевой для процесса активации лимфоцитов
Совокупность имеющихся в литературе данных дает основание предполагать, что
возрастание числа функционирующих натриевых помп, так же как и других ионных
транспортеров и каналов, является одним из элементов общей программы клеточного цикла,
а уровень
экспрессии
ион-транспортирующих
белков
контролируется
в
связи
с
необходимостью регулирования ионного гомеостаза в условиях интенсивного роста клеток
по ходу пререшшкативной стадии и подготовки к репликации ДНК и делению.
вьгаоды
1. Долговременное нарастание входных потоков калия во время пререпликативной
стадии пролиферативного ответа нормальных лимфоцитах человека, стимулированньк
митогенами, сопряжено с экспрессией белка a l , являющегося каталитической субъединицей
Ма*,К*-АТФазы.
2. В активированных лимфоцитах человека экспрессия а 1-субъединицы Na*,K*АТФазы является циклоспорин А-чувствительным процессом и соотносится с ИЛ-2зависимой стадией прогрессии Go->Gi->S. ИЛ-2 контролирует транспортную активность
натриевого насоса и уровень экспрессии На^,К*-АТФазы.
3. На ИЛ-2-зависимой стадии пролиферативного ответа активация протеинкиназ
ERK1/2 (МАРК путь) и JAK3 (JAK/STAT путь) является необходимой для регуляции
экспрессии
Ма'^.К'^-АТФазы
при
переходе
нормальных
лимфоцитов
человека
к
бласттрансформации и про.пвферации.
4. Фосфорилирование по тирозину транскрипционного фактора STAT5, независимо от
способа активации Т-клеток, может служить маркером вхождения лимфоцитов в ИЛ-2зависимую стадию пролиферации.
21
ПУБЛИКАЦИИ ПО Т Е М Е ДИССЕРТАЦИИ
1 Марахова И.И, Аксенов Н.Д., Виноградова Т.А., Карицкая И.А., Торопова Ф.В.
2003(a). Изменение транспортной активности Ка*,К*-насоса и связывания меченого ['Н]
уабаина на разных стадиях активации лимфоцитов человека. Биол. мембраны. 20 (6) : 486496.
2. Марахова И.И, Карицкая И.А., Виноградова Т.А., Аксенов Н.Д., Мошков А.В.,
Хайдукова А.Л. 2003 (б). Изменение транспортной активации натриевого насоса и уровня
экспрессии Ка+,К+-АТФазы при активации лимфоцитов человека. Цитология. 45 (11) : 11491159.
3. Марахова И.И., Виноградова Т.А., Карицкая И.А., Епифанцева И.В., Аксенов Н.Д.,
Зенин В В 2004. Регулируемая экспрессия Na*,K*-Hacoca при активации лимфоцитов
человека. Биол. мембраны. 21 (6): 473-482.
4. Карицкая И.А., Аксенов Н.Д., Виноградова Т.А., Марахова И.И.
2005.
Регулируемая интерлейкином-2 экспрессия Na*,K*-ATФaзы в активированных лимфоцитах
человека. Цитология. 47 (1): 28-37.
5. Marakhova I.I, Karitskaya I.A., Aksenov N.D., Zenin V.V., Vinogradova T.A. 2005.
biterleukin-2-dependent regulation of Na/K pump in human lymphocytes. FEES Letters. 579 :
2773-2780.
6 Марахова И И , Виноградова Т.А., Карицкая И.А., Торопова Ф В. 2001. Механизмы
регуляции ионных транспортеров в активированных лимфоцитах человека. Тезисы докладов
и сообщений, представленных на XVIII всероссийском съезде Физиологического общества
им. И.П. Павлова) С 383.
7. Марахова И.И., Виноградова Т.А., Карицкая И.А., Торопова Ф.В. 2001.
Функциональная экспрессия Na+,K+-Hacoca при активации лимфоцитов человека. Цитология
(Тезисы докладов и сообщений, представленных на международный симпозиум «Биология
клетки в культуре»). 43 (9): 876.
8 Марахова И.И., Карицкая И.А., Виноградова Т.А., Торопова Ф.В. 2002. Механизмы
регуляции натриевого насоса при активации лимфоцитов человека. Материалы III
всероссийского съезда Биохимического общества. С. 92.
9. Карицкая И.А., Виноградова Т.А., Торопова Ф.В., Марахова И.И. 2002. Механизмы
регуляции натриевого насоса на разных стадиях активации лимфоцитов человека. Цитология
(Тезисы докладов и сообщений, представленных на XIV всероссийский симпозиум
«Структура и функции клеточного ядра»). 44 (9): 880.
10. Karitskaia I.A., Marakhova I.I. 2002. Regulated expression of Na/K pump during Human
lymphocyte proliferation. Abstract book of 13th European Students' Conference for promising
biomedical scientists and future doctors. P: 126.
11. Karitskaya I.A., Vinogradova T.A., Marakhova I.I. 2002. Regulated expression of Na/K
pump during human lymphocyte activation. Supplement to Mol. Biol, of the Cell (Abstracts of the
42°^ American Society for Cell Biology Annual Meeting). 18 : 400a.
12. Карицкая И.А., Аксенов Н.Д., Виноградова T.A., Зенин В.В., Хайдукова А.Л,
М^ахова И.И. 2003. Транскрипционные факторы STAT3 и STAT5 в активации Тлимфоцитов периферической крови человека. Материалы международной конференции
«Рецепция и внутриклеточная сигнализация». С. 69-70.
13. Карицкая И.А., Аксенов Н.Д., Виноградова Т.А., Зенин В.В., Хайдукова А Л ,
Марахова И.И. 2003. Динамика активации STAT3 и STAT5 в Т-лимфоцитах периферической
крови человека Цитология (Тезисы докладов и сообщений, представленных на 1-й
всероссийский съезд Общества клеточной биологии). 45 (9) ; 884.
14. Хайдукова А.Л., Карицкая И.А., Аксенов Н.Д., Зенин В.В., Марахова И.И. 2004.
Транскрипционные факторы STAT в активации Т-лимфоцитов человека. Росс, физиол. жури.
22
им. И.М. Сеченова (Тезисы докладов и сообщений, представленных на X I X всероссийском
съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова). 90 (8): 117.
IS. Марахова И.И., Карицкая И.А., Аксенов Н.Д., Виноградова Т.А., Хайдукова А.Л.
2005.Механизмы регуляции Na/K насоса в активированных Т лимфоцитах человека.
Научные труды I съезда физиологов СНГ. С. 105-106.
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
• Веренинов А.А., Виноградова Т.А., Ивахнюк И.О., Марахова И.И., Торопова Ф.В.
1982. Применение пламенно-эмиссионного анализа для измерения потоков щелочных
катионов через клеточную мембрану. //Цитология. 43 (6) : 98-103.
• Веренинов А.А., Марахова И.И. Транспорт ионов у клеток в культуре. - Л.: Наука,
1986.-292 с.
• Веренинов А.А., Гусев Е.В., Казакова С М . , Клименко Е.М., Марахова И.И., Осипов
В.В. 1991. Транспорт и распределение моновалентных катионов при бласттрансформации
лимфоцитов периферической крови человека, активированных фитогемагглютинином.
Цитология. 33 (11): 78-93.
• Веренинов А.А., Васильева И.О., Юринская В.Е., Матвеев В.В., Глушанкова Л.Н.
2001. Исследование «групповой» экспрессии мРНК ионных транспортеров А Т Р Ш 1 , NHE1 и
NKCC1, Р-актина, глицерофосфатидгидрогеназы, белков-регуляторов пролиферации и
апоптоза h53, Вс1-2, IL-2 b и киназы hSGK на пререпликатнвной стадии активации
лимфоцитов человека. Цитология. 43 (6): 602-612.
• Лопина О.Д. 2001. Взаимодействие каталитической субъединицы Ка'^,К*-АТРазы с
клеточными белками и другими эндогенными регуляторами. // Биохимия. 66 (10) : 1389-1400.
• Averdunk R., Guenther Т. 1980. Effect of Concanvalin A on intracellular K* and Na*
concentration and K.+ transport of Ьишап lymphocytes. // Immunobiol. 157 : 132-144.
• Beguin P., Hasler U., Beggah A., Horisberger J-D., Geering K. 1998. Membrane
integration of Na+/K+-ATPase a-subunits and P-subunit assembly. J . Biol. Chem. 273 : 2492124931.
• Berridge M.J. 1997 Lymphocyte activation in health and disease. // Critical reviews in
Immunology. 17:155-178.
• Воушп A. 1968. Separation of leiwocytes from blood and bone marrow. J . Clin. Lab.
Invest. 21 :9-29.
• Buitenhuis M., Coffer P.J., Koenderman L. 2004. Signal transducer and activator of
transcription 5 (STATS). Int. J . Biochem. Cell Biol. 36 (11): 2120-2124.
• Chanshani S., Wulff H., Miller M.J,, Rohm H., Neben A., Gutman G.A., Cahalan M.D.,
Chandy K.G. 2000. Up-regulation of the IKCal potassium channel during T-cell activation.
Molecular mechanism and functional consequences. J . Biol. Chem. 275 ; 37137-37149.
• Clausen T, 1998. Clinical and therapeutic significance of the Na*, K*-pump. // Clinical
Science. 95:3-17.
• Clausen T. 1996. Long- and short-term regulation of Na*, K*-pump in skeletal muscle. //
News Physiol. Science. 11:24-30.
• Crambert G., Hasler U., Beggah A.T., Yu C , Modyanov N.N., Horisberger J.D., Lelievre
L. 2000. Transport and pharmacological properties of nine different human Na, K-ATPase
isozymes. // J . Biol. Chem. 275 :1976-1986.
• Demand J . , Favero J . , Bonnafous J . C , Mani J.C. 1986. Mechanism whereby ouabain
inhibits human T lymphocyte activation: effect on the interleukin 2 pathway. // Immtmobiol. 171 (45): 436-450.
• Dimbar L.A., Caplan M.J. 2001. Ion pumps in polarized cells: sorting and regulation ofthe
Na+, K+- and Na+/K+-ATPases. // The Journal of Biological Chemistry. 276 (32): 29617-29620.
23
• Fomina A.F., Fanger С М . , Kozak J.A., Cahalan M.D. 2000. Single channel properties and
regulated expression of Ca released-activated Ca^* ( C R A C ) channel in human T cells. J . C E L L
Biol. 150:1435-1444.
• Ghosh A., Sica A., Cipetelli M., Subleski J . , Lahesmaa R., Young H.A., Rice N.R. 1996.
Activation of nuclear factor of activated T cells in a Cyclosporine A-resistant pathway. // J . Biol
Chem. 271 (13): 7700-7704.
• Glynn I M , Karlish S J . 1975. The sodium pump. Annual Rev. Physiol. 37. P.: 13-55.
• Glynn I.M. 2002. A hundred years of sodium pumping. Armu. Rev. Physiol. 64 :1-18.
• Grinstein S., Dixon S.J. 1989. Ion transport, membrane potential and cytoplasmic pH:
changes during activation. Physiol. Rev. 69 : 417-481.
• Jorgensen P.L., Hakansson K.O., Karlish S.J. 2003. Structure and mechanism of Na+,K+ATPase; functional sites and their Interactions. // Annu. Rev. Physiol. 65 : 817-849.
• Kaplan J . G . , Owens. 1978. Membrane cation transport and the control of proHferation of
mammalian cells. Aimu. Rev. Physiol. 40 ■ 19-41.
• Kumagai N., Benedict S.N., Mills G.B., Gelfand E.W. 1988 (a). Induction of competence
and progression signals in human T lymphocytes by phorbol esters and calcium ionophores. // J .
Cell. Physiol. 137 : 329-336.
• Kumagai N., Benedict S.N., Mills G.B., Gelfand E.W. 1988 (b). Comparison of phorbol
ester/calcium ionophore and phytohemagglutinin-induced signalling in human T lymphocytes. //
The Journal of Immunology. 140 ( 1 ) : 37-43.
• Lin J - X , Leonard W . J . 1997. Signalling from the IL-2 receptor to the nucleus. // Cytokine
and Growth Factor Reviews. 8 ( 4 ) : 313-332.
• Lin J - X , Leonard W . J . 2000. The role of StatSa and StatSb in Signalling by IL-2 family
cytokines. // Oncogene. 19 : 2566-2576.
• Liu J . , Fanner J . D . , Lane W . S . , Friedman J . , Weissman I., Schreiber S.L. 1991.
Calcineurin is a common target of cyclophilin-cyclosporin A and FKBP-FK506 complex. // Cell.
66 :807-815.
• Marakhova I.I., Vereninov A.A., Toropova F.V., Vinogradova T.A. 1998. Na+/K+ATPase pump in activated human lymphocytes: on the mechanisms of rapid and long-term increase
in К influxes during the initiation of phytohemagglutinin-induced proliferation // Biochem.
Biophys. Acta. 1368 : 61-72.
• Marakhova 11., Ivanova A.E., Toropova F.V., Vereninov A.A., Vinogradova T.A., 1999.
Functional expression of the Na+/K+-pump is controlled via a cyclosporin A-sensitive signalling
pathway in activated human lymphocytes. F E B S Letters. 456 : 285-289.
• Marakhova 1.1., Vinogradova T.A., Toropova F.V. 2000. Na+/K+-pump and cell response
to mitogenic signal- Regulatory mechanisms and relation to the blast transformation of the human
blood lymphocytes. Membr. Cell. Biol. 14 (2) : 231-239.
• Martinez Mas J . V . , Peinado Onsurbe J . , Ruiz Montasell В., Felipe A., Casado F.J., Pastor
Anglada M 1995 Na+/K+-ATPase expression during the early phase of liver growth after partial
hepactomy. F E B S Lett. 362 : 85-88.
• Masat L., Cascalho M., Wabl M . 1996. Loss of the b l subunit of the sodium pump during
lymphocyte differentiation. //Eur. J . Immunol. 26 : 2731-2735.
• McCrady C.W., Ely С М . , Westin E., Carchman R.A. 1988. Coordination and reversibility
of signals for proliferative activation and interleukin-2mRNA production ia resting human T
lymphocyte? by phorbol ester and calcium ionophore. J . Biol. Chem. 263 . 18537-18544.
• Moolenaar W . H . , Mummetry C.L., van der Saag P.T., de Laat S.W. 1981. Rapid ionic
events and the initiation of growth in serum-stimulated neuroblastoma cells. Cell. 23 : 789-798.
• Moriggl R., Topham D.J., Teglund S., Sexl V., McKay C , Wang D., Hoftoeyer A., van
Deursen J . , Sangster M.Y., Bunting K.D., Grosveld G.C., Ihle J . N . 1999. StatS Activation Is
Uniquely Associated with Cytokine Signalling in Peripheral T Cells. Immunity. 11 : 225-230.
24
• Nemoto J . , Muto S., Ohtaka K., Asano Y. 1997. Serum transcriptionally regulates
Na+/K+-ATPase gene expression in vascular smooth muscle cells. Am. J . Pbysiol. 273 :1088-1099.
• Orlov S.N., Taurin S., Tremblay J . , Hamet P. 2001. Inhibition of Na+/K+-pump affects
nucleic acid synthesis and smooth muscle cell proliferation via elevation of the [Na+]I /[K+]I ratio:
possible implication in vascular remodelling. J . Hypertens. 19:1559-1565.
• Prasad K.V. S., Severini A., Kaplan J . G . 1987. Sodium ion influx in proliferating
lymphocytes; an early component of the mitogenic signal. // Archives of Biochemistry and
Biophysics. 252 (2) : 515-525.
• Rosoff P.M., Cantley L.C. 1985. Ion fluxes and differentiation in transformed cell lines. //
Soc. Gen. Physiol. Ser. 39 ; 193-204.
• Rozengurt E. 1981. Stimulation of Na influx, Na-K ршпр activity and DNA synthesis in
quiescent cultured cells. Adv. Enzyme Regul. 19 :61-85.
• Schiener-Bobis G. 2002. The sodium pump. Its molecular properties and mechanics of ion
transport. Eur. J . Biochem. 269:2424-2433.
• Segel G.B., Simon W., Lichtman M.A. 1979. Regulation of sodium and potassium
transport in phytohemagglutinin-stimulated human blood lymphocytes. // J . Clin. IvesL 64 : 834841.
• Severini A., Prasad K.V.S., Almeida A.F., Kaplan J.D. 1978. Regulation of the number of
Na+/K+-pump sites after mitogenic activation of lymphocytes. // Biochem. Cell. Biol. 65 : 95-104.
• Shaw К.Т.У., Ho A.M., Raghavan A., Kim J . , Jain J.N., Park J . C , Sharma S., Rao A.,
Hogan P.O. 1995. Immunosuppressive drugs prevent a rapid dephosphorylation factor NFATl in
stimulated immune cells. // Proc, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 : 11205-11208.
• Szamel M., Resch K. 1981. Inhibition of lymphocyte activation by ouabain. Interference
with the early activation of membrane phospholipids metabolism. // BBA. 647 (2): 297-301.
• Therien A.G., Blostein R. 2000. Mechanisms of sodium pump regulation. // Am. J .
Physiol. - Cell Physiology. 279 (3): 541-566.
• Vereninov A.A., Marakhova I.I., Osipov V., Toropova F.V. 1993. Expression of mKNAs
encoding the al and bl subunits of Na+/K+-ATPase in human lymphocytes activated with
phytohemagglutinin. //FEBS. 316 (1): 37-40.
• Wang L.H., Kiiken R.A., Erwin R.A., Yu C-R., Farrar W.L. 1999. JAK3, STAT, and
МАРК signalling pathways as novel molecular targets for the t5TT)hostin AG-490 regulation of IL2-mediated T cell response. // The Journal of Immunology. 162 : 3897-3904.
• Xie Z., Askari A. 2002. Na+/K+-ATPase as a signal transducer. // Eur. J . Biochem. 269 :
2434-2439.
Подписано в печать 19.11.2005. Формат 60x84/16
Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ЗАО «КопиСервис»
Печать ризографическая. Заказ № 2/1911.
П. л. 1.5. Уч.-иэи. л. 1.5. Ткраж 100 экз.
ЗАО «КопиСервис»
Адрес юр.: 194017, Сайкт-Петербург, Скобелевский пр., д. 16.
Адрес факт.: 197376, Санкг-Петербур!; ул. Проф. Попова, д. 5.
тел.: (812) 327 5098
на 19 6 7 8
Р Н Б Русский фонд
2006-4
20835
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
1 324 Кб
Теги
bd000101653
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа