close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

bd000101700

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
ЕГОРМИН
Петр Ацдре^нч
В Л И Я Н И Е АНТИДИАБЕТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ НА
ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ Ж И З Н И И РАЗВИТИЕ НОВООБРАЗОВАНИЙ
У МЫШЕЙ
14.00.53 - геронтология и гериатрия
14.00.14 - онкология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Санкт-Петербург — 2005
Работа выполнена в лаборатории канцерогенеза и спфения
и в лаборатории онкоэндокринологии Г У Н Н И И онкологии
им. проф. Н.Н.Петрова Федерального агентства по здравоохранению
и социальному развитию Российской Федерации,
в лаборатории онкогеронгологии Санкт-Петербургского института
биорегуляции и геронтологии Северо-Западного отделения Р А М Н
Н а у ч н ы е руководители:
доктор медицинских наук,
профессор Анисимов Владимир Николаевич
доктор медицинских наук,
профессор Берштейн Лев Михайлович
Официальные оппонентыс
доктор медицинских наук Рыжак Галина Анатольевна
доктор медицинских наук Бланк Михаил Аркадьевич
Ведущее научное учреждение:
Г О У ДПО «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного
образования» Минздравсоцразвития России
Запдата диссертации состоится «
^»
^2005 г. в «
^» часов на заседании
диссертационного совета Д 601.001.01 при Санкт-Петербургском инстатуте
биоре1уляции и геронтологии СЗО РАМН по адресу: 197110, Санкт-Петербург,
пр. Динамо, д. 3.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санм^Петсрбургского института
биорегулядии и геронтологии СЗО РАМН (197110, Санкт-Петербург,
пр. Динамо, я 3)
Автореферат разослан «
^»
Ученый секретарь
диссертационного Совета,
кандидат биологических наук, доцент
^2005 г.
CL^ ff^^KUA Козина Л.С.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
В связи с глобальным постарением населения и связанным с ним
увеличением заболеваемости злокачественными новообразованиями [Parkin
D.M. et al., 2002; Напалков Н.П., 2004; Анисимов В.Н. и соавт., 2004]
существенное
значение
имеет
поиск
средств
предупреждения
преждевременного старения и развития ассоциированной с возрастом
патологии. Известно, что наиболее эффективным методом увеличения
продолжительности жизни у лабораторных животных является ограничение
калорийноств питания [Masoro E.J., 2000; Mattison J . et al., 2003]. Е^и такой
диете наблюдается стойкое снижение уровня глюкозы и инсулина в плазме
крови, а также влногих других гормонов, что позволило назвать этот метод
«псевдогипофизэктомией» из-за схожести вьпываемых эффектов [Everitt
A.V. et al., 1980]. Гипофиз животных на калорийно ограниченной диете
продуцирует меньше гормона роста, а в крови снижена концентрация
инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1) и гормона роста [Sonntag W . E . et
al., 1999], что, как полагают авторы, является ведущим фактором
З^еличивающего продолжительность жизни действия ограниченной по
калориям диеты. Данные о существенном увеличении продолжительности
жизни у карликовых мьппей Эймса и мышей с нокаутированным геном
рецептора IGF-1 [Bartke А. et al., 2001] соответствуют этому предположению.
Использование миметиков калорийно ограниченной диеты, повьппающих
чувствительность к инсулину и снижающих уровень глюкозы в организме,
рассматривается
как
перспективное
направление
в
современной
геронтологии [Mattson М.Р. et al., 2001].
Нарушение толерантности к углеводам, представляющее собой фактор
риска развития значительного числа основных неинфекционных заболеваний
человека, в индивидуальном плане может проявляться большей или меньшей
степенью выраженности эндокринного или генотоксического эффекта
глюкозы на особенности патогенеза и клинического течения самих этих
патологических процессов [Берштейн Л.М., 2005]. В целом ряде работ
резистентность к инсулину и гиперинсулинемия рассматриваются как
важные факторы в развитии рака, причем указьшается, что разработка
лекарственных средств, восстанавливающих чувствительность к инсулину и,
соответственно, снижающих уровень инсулина, может стать наиболее
приоритетным направлением в профилактике рака [Дильман В.М. и др., 1974,
Colangelo L.A. et al., 2002;,Gupta К. et al., 2002].
Еще в 70-80-е годы прошлого века с помощью некоторых
фармакологических средств, в частпюсти, антидиабетических бигуанидов
(фенформин, буформин), которые повьппают чувствительность тканей к
инсулину, улучшают толерантность к углеводам, снижают уровень липидов
и устраняют явления метаболической иммунодепрессии, также удалось
увеличить продолжительность жизни мышей и крыс и снизить у них частоту
М С «АЩЮПАДЬН!
ВИБЛИОТПМ
С1
О*' ^ ^ ^
развития спонтанных и индуцированных химическими канцерогенами или
ионизирующей радиацией новообразований [Дильман В . М . и др., 1974;
Oilman V.M., Anisimov V.N., 1980; Anisimov V.N., 2000].
Применение буформина и, особенно, фенформина ньше ограничено
или не практикуется, что обусловлено высоким риском побочных эффектов,
в частности, лакгатного ацидоза. Используемый в настоящее время
антидиабетический бигуанид метформин вызывает меньше осложнений, чем
эти препараты, однако его влияние на продолжительность жизни и развитие
опухолей в эксперименте, по существу, не было изучено. Перспективным
представляется новый отечественный препарат диабенол, который повышает
чувствительность тканей к инсулину и обладает антиокислительной
активностью [Спасов А.А. и др., 1997; Межерицкий В.В. и др., 1998;
Анисимова В.А. и др., 2002]. Данные о его влиянии на развитие
новообразований и продолжительность жизни в литературе отсутствуют.
Перспективной моделью для изучения механизмов старения и рака
являются трансгешп.1е мыши с высокой частотой развития рака молочной
железы. У трансгенных мьппей HER-2/neu отмечено раннее возникновение
рака молочной железы, причем развиваготциеся опухоли дают метастазы в
легкие [Guy С Т . et al., 1992]. В исследованиях, выполненных в лаборатории
канцерогенеза и старения Н И И онкологии им. проф. Н.Н. Петрова, показано,
что у этих мьппей наблюдаются также признаки ускоренного старения
[Алимова И.Н., 2002].
Комплексное исследование показателей старения и канцерогенеза у
животных при воздействии диабенола и метформина у аутбредных и
трансгенных мьппей позволит углубить представления о механизмах
старения и канцерогенеза, а также оценить механизмы возможного
антрпсанцерогенного и геропротекторного действия этих средств.
Цель исследования.
Изучение влияния антидиабетических препаратов диабенола и
метформина
на
динамику
показателей
биологического
возраста,
продолжительность жизни и развитие спонтанных опухолей у мышей, в том
числе, у носителей гена HER-2/neu (егЬВ2).
Задачи исследования.
1. Изучить влияние препарата диабенол на показатели биологического
возраста и продолжительность жизни у мьппей низкораковой линии
N M R I и трансгенных мышей HER-2/neu.
2. Изучить влияние диабенола на развитие спонтшгаых опзосолей у
мьппей N M R I и HER-2/neu.
3. Оценить влияние антидиабетического бигуанида метформина на
старение и продолжительность жизни мышей HER-2/neu.
4. Изучить влияние метформина на канцерогенез молочной железы у
мышей IffiR-2/neu.
5. Провести
анализ
эффективности
и
механизмов
действрм
использованных в исследовании препаратов и оценить перспективы их
f
^^
lij-i'.-
-'■
«•(«♦-'I ■
дальнейшего изучения в качестве средств профилактики рака и
предупреждения преждевременного старения у человека.
Н а у ч н а я новизна исследования.
1. Впервые выявлен геропротекторный и антиканцерогенный эффект
отечественного антидиабетического препарата диабенол у аутбредньгх
Ашппей N M R I и трансгенных мьппей с инкорпорированным геном рака
молочной железы HER-2/neu.
2. Впервые
установлена
способность
метформина
увеличивать
продолжительность жизни и тормозить развитие аденокарцином
молочной железы у фансгенных HER-2/neu мьппей, что может быть
связано с нормализуюпщм влиянием этого препарата на состояние
жиро-углеводного обмена
Научно-практическое значение.
Выявление геропротекторных и антиканцерогенных свойств у
метформина и диабенола свидетельствует о перспективности дальнейшего
изучения этих антидиабетических препаратов в качестве
средств
профилактики рака и преждевременного старения.
Основные положения, выносимые па защиту.
1. Препараты метформин и диабенол, на изученных экспериментальных
моделях, обладают антиканцерогенными и геропротекторными
свойствами.
2 Действие исследованных препаратов на проявления старения
(динамику веса тела, поведенческие реакции, эстральную функцию,
частоту хромосомных аберраций), а также канцерогенез может быть
обусловлено
их
системным
эффектом
и
антиоксидантными
свойствами.
Апробация диссертации.
Основные результаты работы были представлены на отечественных и
международных научных форумах: 4* Geneva Aging Workshop «Ageing and
Cancer the Crossroads» (Geneva - Switzerland, 2004); Всероссийской
конференции «Пожилой больной. Качество жизни» (Москва, 2004);
«Геронтология: от кардиологии к социально-экономическим аспектам»
(Сыктьшкар, 2005); Всероссийской конференции
молодых
ученых
«Физиология и медицина» (Санкт-Петербург, 2005); Х П Международной
научной конференции студентов, аспирантов и молодых
ученых
«Ломоносов» (Москва,2005), конференции по фундаментальной онкологии
(Санкт-Петербург, 2005). Все основные результаты и положения
диссертационного исследования полностью отражены в публикациях. Из них
в периодических изданиях, выпускаемых в Р Ф , в которых В А К
Минобразования
России рекомендует
публикацию результатов по
диссертации на соискание ученой степени кандидата наук, опубликовано 4
статьи.
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 10 научных работ.
Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания
материалов и методов исследования, собственных результатов, обсуждения,
заключения и выводов. Объем работы составляет 137 страниц. Список
литературы содержит 125 отечественных и 107 зарубежных источника.
Диссертация иллюстрирована 19 таблицами и 13 рисунками.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования.
Животные. В
опытах было использовано 143 гомозиготных
трансгенных мьппи-самки линии FVB/N, несущих гея HER-2/neu, и 100
мышей-самок линии N M R I . Онкологическая характеристика мьппей HER2/neu, свидетельствующая о высокой предрасположенности к развитию рака
молочных желез, была изучена в серии хронических опытов [Анисимов В.Н.,
Агамова И.Н., 2001]. Мьппи этой линии первоначально были получены из
Итальянского Национального исследовательского центра старения (г.
Анкона) и поддерживаются в виде разводки в Отделе канцерогенеза и
онкогеронтологии Н И И онкологии им. проф. Н.Н. Петрова.
Аутбредные мыши N M R I были впервые получены в С Ш А , и их
онкологическая характеристика в значительной степени изучена ранее
[Bomhard Е., Mohr U., 1989]. Эта линия мьппей поддерживается в виде
разводки в Н И И онкологии им. проф. Н.КПетрова и относится к группе
типичных низкораковых линий.
Животные содержались по 10 особей в полипропиленовых клетках
размером 350x225x100 мм при стандартном режиме освещения (12 часов свет, 12 часов - темнота) и температуре 22 ± 2°С. Они получали стандартный
гранулированный корм для животных, а также водопроводную воду без
ограничений.
Части
животных
вводили с
питьевой
водой диабекол (9диэтиламиноэтил-2,3-дигидроимидазо-[1,2-а] бензилгадазол дигидрохлорид),
полученный из Волгоградской медицинской академии, и метформин (N,N диметилимиддикарбоимиддиамид; Сиофор, Berlin-Chemie, Menarini Group;
Германия/Италия). Растворы препаратов готовили через день.
В экспериментах с диабенолом как мьппя N M R I , так и мьппи HER2/neu в возрасте 2 мес. бьши рандомизированы по массе тела и подразделены
на две сходные по этому параметру группы:
1. Контрольные мыши (50 самок N M R I и 29 самок HER-2/neu),
получавшие водопроводную воду и не подвергавшиеся никаким
дополнительньпл воздействиям на протяжении всей жизни.
2. Подопытные животные (50 самок N M R I и 28 самок HER-2/neu)
получавшие диабенол с питьевой водой 5 раз в неделю в концентрации
0,1 мг/мл, что соответствовало терапевтической дозе 10 мг/кг массы
тела.
в опыте с метформином трансгенные мьшш аналогичным образом
были разделены на следующие гругаш:
1. Контрольные интактные животные (44 мыши).
2. Подопытные животные, получавшие метформин с питьевой водой 5
раз в неделю в конпентрации 1200 мг/л, что соответствует суточной
дозе 100 мг/кг веса тела (42 мыши).
У животных оценивали показатели гомеостаза и старения, а также
динамику выживаемости и канцерогенеза.
Всех мышей ежемесячно взвешивали на электронных весах. В каждой
группе находили среднее значение массы животных и ошибки среднего.
Один раз в месяц, одновременно с взвешиванием мышей, производили
определение суточного количества потребляемого корма из расчета массы
съеденного корма в граммах на одну мышь. Также изучали количество
вьшитой воды из расчета объема выпитой жидкости в миллилитрах на одну
мьппь в сутки.
Один раз в три месяца у животных, начиная с возраста 2-3 месяцев, в
течение 2 недель ежедневно цитологически исследовали содержимое
влагалищных мазков. Мазки готовились по общепринятой методике [Кабак
Я.М., 1968] из влагалищного содержимого, полученного всегда утром в одно
и то же время посредством введения во влагалище мьппей ватного
тампончика. Свежеприготовленные мазки без фиксации и окраски
микроскопировали при увеличении в 70 раз (об. 10, ок. 7) и с опущенным
конденсором микроскопа. Определение фазы эстрального цикла проводили в
соответствии с общепринятыми критериями. Результаты исследования
вагинального содержимого фиксировали в журнале, регистрируя Дату взятия
чазка.
Оценивались
следующие
параметры
эстральноЙ
функции:
длительность эстрального цикла (ЭЦ), соотношение фаз эстрального цикла,
рассчитывалось относительное число коротких (менее 5 дней) и длинных
(более 7 дней) эстральных циклов, а также относительное число животных с
регулярными циклами, персистирующим эструсом и анэструсом.
Измерение температуры тела производили с помощью медицинского
электротермометра ( Ш Э М - ! ) , вводимого в прямую кишку мышей.
Регистрация температуры проводилась 1 раз в 3 месяца. Поскольку
температура тела может зависеть от фазы эстрального цикла, параллельно
производилась оценка эстрального цикла с помощью влагалищных мазков.
В рамках опыта с метформином проведено исследование экспрессии
матричной Р Н К (мРНК) цитолитических ;тмфоцит-ассоциироваВных белков
перфорина и гранзима В. Оценка вьшолнена методом ОТ-ПЦР с препаратами
тотальной Р Н К , выделенными из опухолей молочной железы мьппей,
получавших и не получавших метформин. Исследовались опухоли молочной
железы трансгенных мышей HER-2/neu в возрасте 9 мес. После
гомогенизации образца ткани, выделяли Р Н К с использованием TRIR E A G E N T ™ в соответствии с инструкциями производителя (Sigma Chemical
Co., U S A ) . После обработки ДНК-зой (InvitroGen) определяли концентратдию
Р Н К по поглощению при волне 260 нм, используя спектрофотометр. Для
синтеза кДЦЖ использовали 1 мкг тРНК. При ПЦР
инкубация
осуществлялась в течение 35 циклов в режиме 1 мин 94°С (отжиг), 1 мин
60°С (денатурация), 1 мин 72°С (синтез). Оценка интенсивности и
специфичности ОТ-ПЦР проводилась при использовании в качестве
стандарта Р-актина.
Частоту хромосомных аберраций ( Х А ) в клетках костного мозга
изучали в возрасте 6 мес. у трансгенпъгх мьппей, получавших метформин, и у
интактных
животных.
Фиксацию
и
обработку
материала
для
цитогенетического анализа проводили по модифицированной методике
Форда [Ford С.Е., Hamerton I.D., 1956].
У получавших и не получавших метформин трансгеншлх мьппей HER2/neu в возрасте 5 и 9 мес. изучали уровень в крови инсулина и показателей
жиро-углеводного обмена; содержание тироксина и трийодтиронина
исследовали в возрасте 9 мес. Животных выводили из опыта путем
декапитации, кровь собирали и после центрифугирования сыворотку хранили
при -20°С.
В собранной сыворотке крови определяли:
- уровень инсулина - иммуноферментным методом ( E L I S A ) с
помощью наборов фирмы Diagnostic Systems Lab. Inc., С Ш А ; результаты
выражали в мкЕд/мл;
- уровни тироксина (Т4) и трийодтиронина (ТЗ) — иммуноферментным
методом с помощью наборов фирмы ХЕМА-Медика, Россия; результаты
выражали в нг/мл;
- уровень холестерина - энзимоколориметрическим методом с
помощью наборов фирмы «Ольвекс», Санкт-Петербург; результаты
выражали в мМ/л;
- уровень триглицеридов - энзимоколориметрическим методом с
помощью наборов фирмы «Ольвекс», Санкт-Петербург; результаты
выражали в мМ/л;
- уровень Р-липопротеидов и суммарных липопротеидов (сумма бета- и
пребета- липопротеидов) - турбидиметрическим методом [Ледвина М.,
1960], результаты выражали в единицах экстинкции;
- уровень гзпокозы - энзимоколориметрическим (глюкозоксидазным)
методом с помощью наборов фирмы «Ольвекс», Санкт-Петербург;
результаты выражали в мМ/л.
За животными вели постоянное наблюдение на протяжении всей
жизни. Появление ох^холей молочных желез и других видимых
новообразований у мьппей, а также прочих патологических изменений
регистрировали (отмечали срок обнаружения в сутках). Обнаруженную при
помощи пальпации опухоль измеряли раз в неделю.
При оценке динамики выживаемости рассчитывали среднюю
продолжительность жизни ( С П Ж ) всех животных, а также С П Ж 10%
максимально
проживших
мьппей,
медиану
и
максимальную
продолжительность жизни.
У f^ >
При расчете кинетических параметров популзщионного
использовали модель Гомперца для функции выживания:
старения
Six) = expj- ^[ехрСож) -1]|,
где параметры а и р связаны с популяционной скоростью старения и
начальной силой смергаоста, соответственно. Параметр
а
часто
характеризуется также величиной времени удвоения силы смертности
(mortality rate doublmg time, M R D T ) , рассчитываемой как ta (2)/a. Для
анализа выживаемости использовали метод Кокса [CoxD.R., Oakes D., 1996].
Всех павших или забитых в состоянии крайней слабости мышей
вскрывали. На аутопсии осматривали кожу, молочные железы и все
внутренние органы. Выявленные новообразования классифицировали
согласно рекомендациям Международного агентства по изучению рака
( М А И Р ) как "фатальные" (то есть, послужившие непосредственной причиной
гибели животных) или как «случайные» (в случаях, когда животное погибло
от других причин) [Gart J . J . , et al., 1986].
Все опухоли у мышей, а также другие патологические изменения и
основные внутренние органы, подозрительные на наличие опухолевого
роста, вырезали и фиксировали в 10% нейтральном формалине. После
обычной гистологической обработки ткани заливали в парафин.
Гистологические срезы толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилинэозином и изучали микроскопически. Использовали
гастологическую
классификацию опухолей, предложенную М А И Р [Turusov V., Mohr U., 1990].
При статистической обработке результатов опытов применяли методы
вариационной статистики с использованием пакетов статистических
программ S T A T G R A P H , S T A T I S T I C A (5.5) и S T A D I A . Достоверность
различий оценивали по критериям t Стьюдента, x^ Вилкоксона-МаннаУитни и точному методу Фишера [Гублер Е.В., 1978], а также Р-value,
рекомендованному М А И Р [Gart J . J . , et a l , 1986]. Доверительные интервалы
для показателей скорости старения рассчитывали, используя log-подобные
функции [CoxD.R., Oakes D „ 1996].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Изучение влияния диабенола на показатели биологического возраста,
продолжительность жизни и спонтанвый канцерогенез у мышей линий
N M R I н HER-2/neu
При длительном введении с питьевой водой диабенол существенно не
влиял на возрастную динамику веса мьппей линии N M R I , а у трансгенных
мьппей, при этом, отмечалась тенденция к снижению веса тела.
Диабенол не оказывал влияния на потребление корма животными у
мьппей N M R I , тогда как у самок HER-2/neu наблюдалась тенденция к
уменьшению потребления корма.
у мьппей N M R I введение диабенола замедляло возрастЕ1ые нарушения
эстральной ф5Т1кции, что выражалось у 12-мес. мьппей в снижении (на 1,9
дня) длительности Э Ц и уменьшении (на 61%) относительного количества
животных с иррегулярными циклами по сравнению с контролем (табл. 1).
У самок трансгенных мьппей в 9-месячном возрасте диабенол вызывал
сокращение в 1,3 раза длительности Э Ц за счет 5'величения (на 23%)
относительного количества коротких и уменьшения (на 26%) частоты
длинных ЭЦ, а также снижение (на 19%) частоты иррегулярных циклов по
сравнению с контрольными животными. Таким образом, диабенол
препятствовал старению эстральной функции у мышей обеих линий.
Таблица 1.
Возрастная динам н к я показателей эстральной функция у мышей N M R I ,
получавших и не получавших диабенол
Продолжи­
Возраст,
тельность
мес.
эстрального
цикла, дни
Относительное
количество
эстральных циклов
(%)с
продолжительностью
>7
<5
5-7
дней
дней
дней
Контроль (1-я группа)
17,2
3
6,7±0,28
6
9
29,6
15,8
12,5
6
9
12
17,4
6,2±0,34
6,4±0,63
12
8,0±1,34
Диабенол (2-я группа)
19,4
6,4±0,26
3
5,8±0,38"
6,3+0,44
6,1±0,54**
15,8
17,6
44,8
44,4
57,9
50
38
26
26,3
37,5
Количество
мышей с
регулярным
циклом ( % )
(%)
93,5
6,5
90
79,2
42,1
10
20,8
6Д
14,8
51,6
29
93,9
65,2
57,9
64,8
17,4
85,2
86,4
26,3
17,6
Количество
мьппей с
иррегуляр­
ным циклом
77,3*
57,9
13,6
22,7*
Различие с соответствующим параметром у контрольных мышей того же
возраста достоверно: *р<0,05; **р<0,01;
"-р<0,05 -различие с животными 3 мес. возраста внутри группы
статистически достоверно
У
мьпдей N M R I
под воздействием диабенола наблюдалось
незначительное снижение температуры тела в 6 мес. по сравнению с
контролем, в остальные возрастные периоды существенных различий между
этими гр^тшами не отмечшюсь. У трансгенных мьппей длительное введение
диабенола также не оказывало влияния на возрастную динамику
температуры тела.
lot»
b««s
nrj^
1
' 1
'
1
Щ
-
80
Ч
во
V'
4a
20
VcЮ
150
200
250
300
350
400
450
503^'
Рис. 1. Кривые выживаемости мышей NMRI не получавших (1)
и получавших (2) диабенол. По оси ординат: количество
мышей %, по оси абсцисс возраст, сут
^0
Рис 2. Динамика развития ОМЖумышей NMRI, не получавших (1)
и получавших (2) диабенол. По оси ординат: количество
мышей с опухолями %, по оси абсцисс: возраст, сут
У
мышей N M R I
под воздействием диабенола
наблюдался
положительный сдвиг в динамике выживаемости (рис. 1), отмечалось
статистически достоверное з'величение С П Ж последних 10% животных, при
этом увеличивалось среднее время удвоения смертности, а скорость
популяционного старения - уменьшалась (табл. 2). У трансгенных мышей,
12
при введении диабенола не отмечено существенных изменений в динамике
выживаемости и показателях продолжительности жизни. При этом скорость
старения была несколько выше, а время удвоения смертности - меньше у
подопытных мьппей, чем у контрольных.
Таким
образом,
у
животных
NMRI
диабенол
проявлял
геропротекторные свойства, увеличивая продолжительность их жизни, тогда
как у мьппей HER-2/neu препарат подобного эффекта не оказывал.
Таблищ 2.
Влияние диабенола на показатели продолжнтельяости жнзви
у м ы ш е й 1ЧМЮ и ИЕК-2/пец
Количество мышей
СИЖ всех мышей, сут.
СПЖ последних 10%
мьппей, сзгг.
-1
а, сут.
MRDT
Линия мьппей
NMRI
HER-2/neu
Контроль
Диабенол
Контроль
Диабенол
50
50
29
28
346 ±11,9 369 ±12,9 321 ± 10,4 324 ± 10,3
480 ir 9,2 504 ± 6,4* 457±21,1 444 ± 42,0
0,0140
49,62
0,0136
51,09
Различие с контрольной группой статистически
(критерий Стъюдента)
0,0307
22,58
достоверно:
0,0374*
18,54*
* р<0,05
При морфологическом исследовании обнаружено, что у мышей N M R I
обеих групп, в основном, развивались злокачественные опухоли молочной
железы ( О М Ж ) и злокачественные лимфомы. Введение диабенола
существенно не влияло на развитие новообразований, однако, наблюдалась
1ендешщя к снижению суммарной частоты развития опухолей в подопытной
группе (34%) по сравнению с контрольной (50%) и некоторое снижение
частоты злокачественных лимфом в группе мьппей, получавших диабенол
(табл. 3). У животных, получавших диабенол, О М Ж обнаруживали позже,
чем в контроле (рис. 2), отмечалось статистически достоверное увеличение
среднего латентного периода развития О М Ж с 259 до 328 дней (табл. 3). У
подопытных мышей метастазов О М Ж в легких не обнаружено, тогда как в
контроле их частота составила 10%.
Таблица 3.
Влияние диабенола на развитие спонтанных опухолей у мышей N M R I
Показатель
Количество мьппсй
Количество мьппей с О М Ж
Время обнаружения 1-й опухоли, сут.
Средний латентный период развития
ОМЖ, сут
Общее количество О М Ж
Среднее количество опухолей на 1 мышь
в группе
Максимальный диаметр О М Ж , мм
Количество мьппей с метастазами О М Ж в
легкие
Количество мьппей со злокачвственньп>(и
лимфомамв
С П Ж животных со злокачественными
лимфомами, сут.
Контроль
50
21 (42%)
176
259 ±13,8
Диабенол
50
16 (32%)
273
328 ± 12,4**
26
21
1,24 ±0,1
1,31 ±0,12
25,1 ±2,1
5(10%)
25 ± 2,5
0*
4 (8%)
1 (2%)
349,3±38,3
357
ОМЖ - опухоль молочной железы.
Различие с контрольной группой статистически
**р<0,01.
достоверно. * р < 0,05;
У трансгенных мышей диабенол не оказал вьфаженного влияния на
спонтанный канцерогенез. Была отмечена тенденция к снижению частоты
метастазов О М Ж в легкие в подопытной группе (36%) по сравнению с
контрольной группой (48%), а также некоторое уменьшение размеров
метастазов (с 0,52±0,11 до 0,46±0,08 см).
Таким образом, длительное введение диабенола тормозило развитие
спонтанных опухолей ( О М Ж и злокачественных лимфом) у мышей N M R I и
не оказывало существенного угнетающего эффекта на канцерогенез у
трансгенных мьппей HER-2/neu.
При сравнении результатов проведенных экспериментов можно
выделить общие черты, характерные для биологического эффекта диабенола.
В о всех опытах длительное введение препарата не приводило к
токсическому эффекту и диабенол не обладал канцерогенными свойствами,
что позволяет сделать вывод о безопасности диабенола и рекомендовать его
для дальнейшего изучения в целях клинического применения.
Наши исследования показали, что диабенол обладает благоприятньш
воздействием на организм, что в первую очередь связано с его способностью
тормозить возрастные нарушения репродуктивной системы у мышей.
отражающиеся на таких характерных показателях эстрального цикла, как его
продолжительность и частота иррегулярных циклов у мышей N M R I .
Замедление старения у животных, получавших диабенол, проявляется в
увеличении продолжительности жизни, отмеченном в опытах на мьппах
N M R I . У самок мышей HER-2/neu геропротекторный эффект диабенола
выявить не удалось, что, возможно, обусловлено равней гибелью животных
от опухолей молочных желез.
У мьппей N M R I , получавших диабенол, отмечено замедление развития
опухолей молочной железы (что приводило к увеличению их среднего
латентного периода), а также снижение частоты метастазов этих
новообразований и уменьшение количества злокачественных лимфом. У
мьппей HER-2/neu значительного антиканцерогенного эффекта диабенола не
отмечено, хотя выявлена тенденция к снижению метастатического
потенциала опухолей молочных желез и размеров метастазов.
В целом, результаты изучения потенциальных антиканцерогенных
свойств исследуемого соединения показали, что диабенол обладает довольно
широким спектром антиканцерогенной активности, что, возможно,
обусловлено системньпй действием препарата, как это отмечено при
действии других антидиабетических средств [Dilman V . M . et al., 1978;
Анисимов В.Н., и др., 1980, 1982; Dilman V . M . , Anisimov V . N . , 1980;
Anisimov V.N., 1987, 2003], и, предположительно, его антиоксидантными
свойствами.
Изучение влияния метформина на показатели биологического возраста,
продолжительность жизни и саоитанный канцерогенез у мышей с
инкорпорированным геном HER-2/neu.
Введение метформина несколько снижало потребление мьппамн корма,
но не воды, и не оказывало влияния на динамику веса тела. При введении
метформина трансгенным мышам отмечено небольшое увеличение
продолжительности ЭЦ, при этом частота иррегулярных циклов по
сравнению с контролем практически не менялась.
При изучении возрастного изменения температуры тела мышей
контрольной группы оказалось, что у 7 мес. животных этот показатель был
снижен по сравнению с 2 мес. самками (табл. 4). У мышей, получавших
метформин, значительных различий по сравнению с контролем выявить не
удалось.
Таким образом, хроническое введение метформина сзтцественно не
влияло на возрастные изменения эстральной функции и температуры тела
трансгенных мьппей.
В
опухолях контрольных и получавших метформин мьппей
исследовали экспрессшо мРНК, кодирующей лимфоцит-ассоциированные
белки гранзим В я перфорин. Экспрессия мРНК этих цитолитических
молекул не была обнаружена в контроле, но была существенно увеличена у 4
из 5 мьппей, получавших метформин. При сравнении денситометрическим
методом экспрессии гена перфорина или гранзима В в материале из опухолей
молочной железы у мышей, получавпгах
метформин, исследуемые
показатели составили 0,2 ± 0,1 и 0,4 ± 0,3 усл. ед. соответственно.
Цитогенетический анализ показал, что по ряду параметров
(«единичные мосты» и «множествен1п>1е мосты») не имеется больших
различий в частоте хромосомных аберраций у подопытных и контрольных
мьппей. В то же время, частота аномальных анафаз в клетках костного мозга
у животных, получавших метформин, возрастала по сравнению с контролем
(табл.5).
Таблица 4.
Возрастная динамика темпера1уры тела у мышей HER-2/neu,
получавших и не получавших метформин
Средняя температура ( f C ) в возрасте:
Показатели
5 мес.
7 мес.
2lrfec.
Контроль
38,04 ±0,17
37,68 + 0,22
37,28 ± 0,33
(1-я группа)
Мегформин
(2-я группа)
38,30 + 0,20
37,55 + 0,19
Различие внутри группы с 2 мес. животными статистически
*р < 0.01.
37,84 + 0,14»
достоверно:
Таблица 5.
Частота хромосомных аберраций ( % ) в клетках костного мозга у мышей
HER-2/neu, получавших и не получавших метформин
Одиночные Множественные Частота аномальных анафаз
Показатели
мосты
мосты
6 мес.
9 мес.
Контроль
(1-я группа)
4,3 ±0,10
2,15 ±0,09
6,45 + 0,09
7,7010,17
Метформин
(2-я группа)
5,03 ±0,15
2,27 ± 0,20
7,40 ±0,19*
9,92 ±0,27*
Различие с контрольной группой статистически
Каждая группа состоит из 4 животных.
достоверно- *р < 0,05.
Введение метформина сопровождалось замедлением возрастного
увеличения уровня глюкозы в крови. У 9-месячных подопытных мьппей
содержание глюкозы в крови было меньшим, чем в контроле (р > 0,05). Под
влиянием препарата отмечено также некоторое уменьшение уровня
триглицеридов у животных в возрасте 5 и 9 мес. У 5-мес. мьппей,
полз^авших метформин, снижалось и содержание суммарных лрнпопротеидов
по сравнению с контролем (табл. 6).
16
Табпгща 6.
Показатели жиро-углеводного обмена у трансгеяных мышей-самок
H£R-2/neu различного возраста, пол}гчавших
н не получавших метформвв
Суммарные
Общий
Возраст, Глюкоза,м
Триглицери- липопротеиды,
холесте­
Группа*
мес.
ды, мМ/л
единицы
М/л
рин, мМ/л
экстинкции
Контроль
3,56+0,29
220,8±45,38
5
4,98±0,29 3,66±0,28
(1-я группа)
3,32±0,37
9
1,9810,25"
132.8+31.15
iceti.ss"
Метформин
5
6,6±0,67" 3,64±0,21
2,70±0.29
122.6±29,81
(2-я группа)
9
1,58±0,37'
116,8+28,08
8,28±1,0б'' 3,36±0,35
* Каждая группа состоит из 5 животных
Различия параметров с животными
5 мес. возраста,
статистически
'-р<0,001.
внутри группы,
достоверны (критерий Стъюдента t): °-р<0,05, - р<0,01,
При исследовании уровня гормонов выявлено, что у получающих
метформин 9-мес. мьппей содержание инсулина в крови демонстрировало
тенденцию к снижению по сравнению с контролем, в то время как различий в
концентрации тиреоидных гормонов в крови животных не отмечалось
(табл. 7).
Таблица 7.
Уровень гормонов в сыворотке крови у трансгевных мышей-самок
H£R-2/neu различного возраста, получавших
и не получавших метформин
Трийодтиронин
Возраст,
Тироксин (Т4),
Инсулин,
Группа*
мес.
нг/мл
(ТЗ), нг/мл
мМ/мл
Контроль
5
3,8 ± 1,8
(1-я группа)
59,4 ± 7,7
2,48 ± 0,03
9
13,5 ±11,9
Метформин
3,9 ±1,8
5
(2-я группа)
2,58 + 0,10
59,9 ± 7,8
9
9,3 ± 5,6
Каждая группа состоит из 5 животных
Под влиянием антидиабетического бигуанида метформина у животных
отмечен сдвиг вправо кривой выживаемости
(рис. 3), средняя
продолжительность жизни ( С П Ж ) возросла на 8 % (р < 0,05), С П Ж 10%
долгоживущих животных увеличилась на 13,1 % (р < 0,05), а максимальная
П Ж - на 1 мее. по сравнению с контролем (табл. 8). Расчеты показали, что
скорость популяцногаюго старения мышей (константа а в уравнении
Гомперца) под влиянием метформина снизилась в 2,26 раза (р < 0,05).
17
Влияние метформина на продолжительность жизни
адепокарцином молочной железы
у самок траисгенных мышей HER-2/neu
Показатели
Контроль
34
Количество мышей
Продолжительность жизни, сут.:
средняя 264 ± 3,5
максимальная 311
Средняя продолжительность жизни 10%
297 ± 7,3
долгоживуших мышей, сут.
а (сут.'')*
0.0762
Количество мышей с опухолями молочных
34(100%)
желез
Время обнаружения 1-й опухоли, сут.
135
174 ± 2,4
Средний латентный период развития опухолей,
сут.
Общее количество опухолей
Среднее количество оп}осолей на 1 мышь в
rpjTine
Таблица 8.
и развитие
Метформин
32
285 ± 5,2*
340
336 ±2,7*
0,0337*
32 (100%)
128
187 ±3,5*
290
263
8,5 ± 0,25
8,2 ± 0,23
Средний диаметр опухолей, мм
17,9 ±0,55 15,9 ± 0,56*
Количество мьппей с метастазами опухолей в
24 (71%)
23 (72%)
легкое
Различие с показателем в контроле статистически достоверно. *-р < 0,05
" - Константа а в уравнении Гомперца R = Ro (ехр) at, где RQ = смертность
во время t = О
Динамика выявления опухолей молочной железы в контрольной и
подопытной группах не различалась до 5-го месяца жизни мьппей, тогда как
после этого было отмечено отчетливое замедление нарастания частоты
возникновения опухолей у животных, получавших метформин (рис. 4).
Средний латентный период развития О М Ж у подопытных мышей был
статистически достоверно >'величен по сравнению с контролем (табл. 8).
Частота развития аденокарцином молочной железы у мышей, несущих
ген HER-2/neu, составила 100% в обеих группах. Не различались
существенно
между
группами
количество
и
мпожественность
новообразований, а также частота метастазирования опухолей молочной
железы в легкие. Число мьппей, у которых развилось от 4 до 6 опухолей
молочной железы, в группе, получавшей метформин, не отличалось от
контроля (8,9% и 9,3%, соответственно), тогда как доля мышей, имевших 9
или 10 опухолей, под влиянием метформина снижалась в 2 раза по
сравнению с контролем (с 46,9% до 23,5%, р < 0,05). Размеры аденокарцином
молочной железы при введении препарата бьши также достоверно меньшими
(р<0,05).
It
"
^ -ta- ^ ^
-«•• 2.
^ ^ " ^ . r *
80
&?
^л>*
-
\%
Vv
iz ^ -
\
CO
S чо
X
-
\l^v
\♦л
01
-
\
\
♦
-
Ч
\
♦
20
250
Возраст, сут.
300
Рис. 3. Кривые выживаемости трансгенных мышей HER/2-neu,
не получавших (1) и получавших (2) метформин.
ICO
^
90
•
i
50
§
70
-
0
60
>v
и
;a»tt-
■
.
7
■
' £ 50
J—
30
V
¥ 20
эс
"120
р
f1
■
-*'
■
.
■
/ ^"^
1 f
1 *
■
1 40
S
J
/
-
e
^o
*
"
jT in'
._/-«'
»-о-^
140
160
180
В о з р а с т , сут.
200
,feiJ
£20
2*0
Рис, 4. Динамика развития ОМЖу трансгенных мышей HER/2-neu,
не получавших (1) и получавших (2) метформин.
Полученные данные свидетельствуют о замедлении под влиянием
метформина старения и развития опухолей молочных желез у трансгенных
мышей HER-2/neu. Как отмечалось выше, в опытах на крысах и мышах
долгоживущих яизкораковых и высокораковых линий показано, что другие
бигуаниды,
в
частности,
фенформин
и
буформин
обладают
геропротекторньпл и антиканцерогенным эффектами [Dilman V . M . et al.,
1978; Dilman V . M . , Anisimov V.N., 1980; Аннсимов B.H., 2003; Anisimov
V.N.,
2003].
Имеются
данные
об
антиокислительном
действии
антидиабетических бигуанидов, их прямом действии на митохондрии и
нейропротекторной активности, позволяющие рекомендовать бигуаниды для
профилактики нейродегенеративных заболеваний [Анисимов В.Н., 2003;
Берштейн Л.М., 2005]. Показано, что метформин оказывает влияние на
активность тех же генов, экспрессия которых изменяется при ограничении
калорийности питания [Spindler S.R. et al., 2003]. В совокупности,
имеющиеся
данные
позволяют
рассматривать
применение
антидиабетических средств, с учетом их химической природы и механизма
действия, в качестве перспективного направления в области профилактики
возраст-ассоциированной патологии.
20
ВЫВОДЫ
1. Введение антидиабетического препарата диабенол мышам-самкам
низкораковой линии N M R I и высокораковым трансгенпым мышам с
инкорпорированным
геном HER-2/neu
препятствует
возрастаьпй
нарушениям эстральной фз^кцин. При этом у мьппей N M R J отмечается
также сдвиг вправо кривой выживаемости и существенное увеличение
средней продолжительности жизни последних 10% животных.
2. В опытах на мьппах у диабенола выявлены антиканцерогенные свойства.
У мышей N M R I диабенол вьпвал статистически достоверное увеличение
среднего латентного периода развития опухолей молочных желез и
уменьшение частоты метастазирования их в легкие. У мьппей HER-2/neu,
получавших диабенол, отмечена тенденция к снижению частоты
метастазов опухолей молочной железы в легких и их размеров.
3. Антидиабетический бигуанид метформин тормозит возрастные изменения
гормонально-метаболических показателей у трансгенных мышей HER2/пеи, что выражается в тенденции к уменьшению уровня в крови
инсулина, глюкозы, триглщеридов и суммарных липопротеидов.
4. Метформин
статастически
достоверно
увеличивает
среднюю
продолжительность жизни всех мьппей HER-2/neu и 10% долгоживущих
животных этой линии.
5. Под влиянием метформина у трансгенных мышей bIER-2/neu существенно
возрастает латентный период развития новообразований молочрюй
железы, уменьшается их размер и снижается доля мьпней с
множественньпии опухолями.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
Проведенные экспериментальные исследования свидетельствуют о
геропротекторных н антиканцерогенных свойствах метформина и диабенола
и позволяют рекомендовать проведение дальнейших испытаний этих
антидиабетических
препаратов
с
целью
профилактики
рака
и
преждевременного старения.
21
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО Т Е М Е ДИССЕРТАЦИИ
1. Влияние антидиабетического препарата диабенол на показатели биологического
возраста, продолжительность жизни и развитие нтвообразований у мышей NMRI и
HER-2/neu / И.Г. Попович, М.А. Забежииский, П.А. Егормин, И.В. Аникин, М.Л
Тындык, А.В. Семенченко, А.А. Спасов, В.Н.Анисимов // Успехи геронтологии. 2004.-ВЫП. 15.-С.80-91.
2. Влияние антидиабетического препарата диабенол на продолжительность жизни
мышей NMRI и HER-2/neu / И.Г. Поиович, М.А. Забежииский, П.А. Егормин, И.В.
Аникин, М.Л. Тындык, А.В. Семенченко, А.А. Спасов, В.Н.Анисимов //
Клиническая геронтология. - 2004. - Т. 10, № 11. - С.81.
3. Влияние метформина на развитие аденокарцином молочной железы у
трансгенных мьппей HER-2/neu / П.А. Егормин, Т С. Пискунова, И.Г. Попович,
М.А. Забежииский, И.Г. Коваленко, Л.М. Берпггейн, В.Н Анисимов // Вопр. онкол.
-2005. - Т.50, № 1. Приложение - С.9.
4. Влияние метформина на старение, продолжительность жизни и канцерогенез
молочной железы у трансгенных мьппей HER-2/neu / П.А. Егормин // Тез. докл.
Всероссийской конференции молодых ученых «Физиология и медицина» - СанктПетербург. - 2005. - С.37.
5. Метформин замедляет старение и развитие опухолей молочной железы у
трансгенных мышей HER-2/neu / В.Н. Анисимов, П.А. Егормин, Л.М. Берштсйн,
М А. Забежииский, Т.е. Пискунова, И.Г. Попович, А.В. Семенченко // Бюл. эксп.
биол. и мед. 2005. Т. 139, Н«6. С. 691-694.
6. Особенности старения и канцерогенеза у трансгенньтх мьппей HER-2/neu при
введении метформина / П.А. Егормин // Тез. докл. X I I Межд>'народной Научной
конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». - Москва 2005.-С. 432-433.
7. Central and peripheral effects of insulin^GF-l signaling in aging and cancer:
antidiabetic drugs as geroprotectors and anticarcinogens / V.N. Anisimov, L.M.Berstein,
l.G. Popovich, M.A. Zabezhinski, P.A. Egormin, M.L. Tyndyk, I.V. Anikin, A.V.
Semenchenko // 4"* Stromboli Conference on Aging and Cancer, Siromboli Aeolian
Islands, Siyly, Italy - 2005. - P.8.
8. Effect of metformin on life span and on the development of spontaneous mammary
tumors in HER-2/neu transgenic mice / V.N. Anisimov, L.M Berstein, P.A. Egormin,
T.S. Piskunova, l.G. Popovich, M.A. Zabczinski, l.G. Kovalenko, Т.Е. Poroshina, A.V.
Semenchenko, M Provincial!, F Re, С Franceschi // Exp. Gerontol. -2005 Vol.40. P.685-693
9 Insulin in aging and cancer: antidiabetic drug diabenol as geroprotector and
anticarcmogen / V.N. Anisimov, l.G. Popovich, M.A. Zabezhinski, P.A. Egormin, M.L.
Tyndyk, I.V Anikin, A A. Spasov, A.V. Semenchenko, A.I. Yashin // 4* Geneva Aging
Woricshop «Aging and Cancer at the Crossroads». -Geneva - Switzerland. - 2004 - P 8.
10. Insulin in aging and cancer: antidiabetic drug diabenol as geroprotector and
anticarcinogen / l.G. Popovich, M.A. Zabezhinski, P.A. Egormin, M.L. Tyndyk, I.V
Anikin, A.A. Spasov, A.V. Semenchenko, A.I. Yashin, V N. Anisimov // Int. J . Biochem
Cell Biol. - 2005. - Vol.37. - P. 1117-1129.
22
Егормин П.А. Влияние антидиабетических средств на продолжительность жизни и развитие
новообразований у мышей//Автореф. дис канд мед наук 14.00.53 14 00 1 4 - С П б , 2005 -
21с
Формат 60xS4 1/8 Объем 1,0 усл. п.л.
Тираж 100 экз Заказ 03-08. Бесплатно
Подписано к печати 17.10 2005
Отпечатано с готового оригинал-макета
Издательство «Система»
Ш2^ 156
РНБ Русский фонд
2006-4
20889
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
965 Кб
Теги
bd000101700
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа