close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

bd000102261

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
П Р О Х О Р О В А Марина Владимировна
АНАЛИЗ ИММУНОТРОПНОИ АКТИВНОСТИ
ПОЛИОКСИДОНИЯ И Б Е Л К О В Ы Х ПРЕПАРАТОВ КРОВИ
В СИСТЕМЕ IN VITRO
Специальность 03.00.13 - физиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Нижний Новгород - 2005
Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии и иммуно­
логии Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лоба­
чевского
Научный руководитель:
доктор медицинских наук,
профессор
Добротина Наталия Аркадьевна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук,
профессор
Анастасиев Валентин Васильевич
доктор медицинских наук,
профессор
Литовская Анна Владимировна
Ведущая
организация:
Нижегородская
государственная
медицинская академия
Заищта состоится « ^ yt^'^-^^y^-^'lWA г. в
часов
на заседании диссертационного совета Д 212.166.15
в Нижегородском государственном университете
им. Н.И. Лобачевского по адресу: 603950 г. Н. Новгород,
пр. Гагарина, 23 корп. 1, биологический факультет
e-mail: kmbcaibio.unn.ru
тел: (8312) 65-82-07
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке
Нижегородского государственного университета
им. Н.И. Лобачевского
Автореферат разослан « * ^ » _f2;^£^f^^;^fl05 i
Ученый секретарь
диссертационного совета,
кандидат биологических наук,
доцент
А.С. Корягин
1006 -f
ггоц
Список сокращений
А О А - антиоксидантная активность
Б А В - биологически активные вещества
Е-РОК - розеткообразующие клетки
И А Н - индекс активации нейтрофилов
И З Ф - индекс завершенности фагоцитоза
И К К - иммунокомпетентные клетки
н е т - нитросиний тетразолий
П О - полиоксидоний
П О Л - перекисное окисление липидов
РО - розеткообразование.
Ц И К - циркулирующие иммунные комплексы
Э Б - эритроциты барана
Alb - альбумин
IgG - гамма-глобулин
Ср - церулоплазмин
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. Обоснованием настоящего исследова­
ния является актуальность прюблем физиологической иммунологии,
адаптации, и, в связи с этим, широкий поиск и выяснение механизмов
действия различных иммуностимуляторов и иммуномодуляторов.
В настоящее время большое значение придается изучению про­
блем нарушения иммунной системы человека, вызванных действием
различных факторов (Хаитов P.M., с соавт., 2004; Ройт А., 1991). Среди
них следует выделить антропогенные и техногенные факторы, влияю­
щие на возникновение и формирование различных патологий человека,
прежде всего экозависимых заболеваний: комплексное влияние химиче­
ских, радиационных и других факторов, климатогеографические осо­
бенности региона и др. (Ярилин А.А. с соавт., 1997).
Злободневной проблемой являются также нарушения не только эк30-, но и эндоэкологии организма человека. Это обусловлено, прежде
всего, тем, что постоянно меняющаяся и ухудшающаяся экологическая
среда обитания, нарастание антигенного фуза и и^ушение регуляции
гомеостаза вносит разрушительный вклад йо внутреннее благополучие
организма. Необходимость приспособления к условиям жизни изменяют
показатели «нормы реакции», вынуждает пересматривать критерии
адаптации к патологическим воздействиям и учитывать влияние эколо­
гической составляющей в оценке этиопатогенеза заболеваний (Добротина Н.А., Копытова Т.В., 2004). Возможная эндоинтоксикация является
следствием нар)аиения протекания различных биохимических реакций
внутри организма, вызванного патологическими процессами. (Малахова
М.Я.,2000).
POCHAUHOHA^biU.
I _~3^,i
1
БИБЛИОТЕКА
Эта совокупность проблем приводит к необходимости поиска но­
вых иммуномодулирующих препаратов (Hadden J . W . , 1993; Werner G.H.,
1996). Основными научными направлениями ведущих клиник являются
изучение К внедрение в клиническую практику новых иммуномодуляторов, иммуностимуляторов и методов фармакотерапии иммунной недос­
таточности и аллергических заболеваний (Манько В. М., 2002). В меди­
цинской практике большое внимание уделяется новому химически син­
тезированному препарату - полиоксидонию (ПО), который обладает
иммуномодулирующим, детоксицирующим и другими эффектами (Пет­
ров Р.В., Кабанов В.А., 2002). В настоящее время действие ПО in vivo
является достаточно изученным, именно поэтому П О широко применя­
ется в клинической практике (Дьяконова В.А. с соавт, 2002; Дамбаева
С В . с соавт., 2000). Однако, неисследованным остается эффект взаимо­
действия ПО с другими препаратами, которые обладают специфической
и параспецифической физиологической активностью.
В связи с этим целью настоящей работы является изучение
физиологического эффекта совместного воздействия иммуномодуляторов различного происхождения (химически синтезированного ПО и
белковых препаратов) на клеточные реакции и факторы неспецифиче­
ской резистентности в условиях in vitro.
В соответствии с целью определены следующие задачи:
1.
Исследование действия синтетического иммуномодуля гора
полиоксидония на иммунологические рюакции и факторы неспецифиче­
ской резистентности организма человека in vitro, а также определение
фаниц физиологического и цитотоксического действия на выделенные
клетки.
2.
Изучение действия П О на иммунологические показатели
клеточных реакций и факторы неспецифической резистентности орга­
низма человека при ожоговой интоксикации.
3.
Выяснение эффектов воздействия церулоплазмина (Ср),
гамма-глобулина (IgG) и альбумина (Alb) на иммунологические реакции
и показатели неспецифической р)езистентности in vitro.
4.
Изучение совместного влияния препаратов различного про­
исхождения (ПО и Ср, ПО и IgG, П О и Alb) на функциональную актив­
ность лимфоцитов периферической крови человека и неспецифическую
резистентность in vitro.
Положения, выносимые на защиту.
1. На выделенной из крови человека популяции лимфоцитов в
экспериментах in vitro определены физиологически действующие, неповреждающие концентрации П О и доказана его иммуномодулирующая
активность.
2. Выявлено иммуностимулирующее влияние ПО на кооператив­
ное взаимодействие иммунокомпетентных клеток, обеспечивающее ре­
акции розеткообразования Т-лимфоцитов и адгезию мононуклеаров. Ус­
тановлено активирующее влияние ПО на систему комплемента и сниже­
ние уровня мелкодисперсных Ц И К под действием П О в условиях in v i ­
tro.
3. Установлено, что стимулирующее воздействие ПО на иммуно­
логические реакции и неспецифическую резистентность сохраняется при
использовании с нативными иммуномодуляторами (Ср, IgG, Alb).
4. В экспериментах in vitro доказана обоснованность применения
ПО при ожоговой интоксикации в ряде случаев.
Научная новизна.
•
Проведенные исследования позволили установить стимули­
рующее влияние ПО в системе in vitro на иммунокомпетентные клетки
( И К К ) , снижение уровня циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК),
причем мелкодисперсных (повреждающих); выявлена умеренная стиму­
ляция системы комплемента. Установлен дозозависимый антиоксидантный эффект ПО на процессы П О Л в сыворотке крови.
•
Установлено действие П О in vitro на иммунологические ре­
акции крови пациентов с термической травмой как модели воспалитель­
ной и интоксикационной патологии.
•
Впервые получены данные о комплексном влиянии препара­
тов различного прюисхождения (эндогенных и химически чистых) на
иммунологические реакции.
Практическая значимость выполненного исследования заключа­
ется в том, что получены дополнительные данные, обосновывающие
применение П О в качестве иммуномодулятора. Показана принципиаль­
ная возможность комплексного использования препаратов различного
происхождения с целью повышения эффективности этиотропной тера­
пии соответствующих заболеваний.
Апробация работы. Основные положения диссертации обсужде­
ны на 1П сессии молодежной школы-семинара «Экологическая и про­
мышленная безопасность» (Саров, 2003),8-й Международной П у т и н ­
ской конференции молодых ученых (Пущино, 2004), Международной
конференции молодых ученых «От фундаментальной науки - к новым
технологиям...» (Тверь, 2002.), I X нижегородской сессии молодых уче­
ных (Н. Новгорюд, 2004), X I I I международной конференции «Ферменты
микроорганизмов: структура, функции, применение» (Казань, 2005).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.
Благодарности. Автор вьфажает глубок)то признательность и
благодарность сотрудникам кафедры молекулярной биологии и имму­
нологии, в особенности к.б.н., доц. Ж.А. Казацкой, д.б.н., проф. В.В. Но­
викову за помощь при подготовке работы; д.б.н., проф., зав. каф. клини­
ческой лабораторной диагностики К.Н. Конторщиковой, к.м.н., зав. клинико-иммунологической лаборатории ННИИТО М.Ю. Лебедеву.
Структура и объем диссертации.
Материалы диссертации изложены на^°^страницах машинопис­
ного текста, иллюстрированы -^л таблицами и 2 2 рисунками. Работа со­
стоит из введения, обзора литературы, характеристики материалов и ме­
тодов исследования, обсуждения, заключения, выводов и списка литера­
туры, содержащего ^"^источника, из которых ^ ^ на иностранных язы­
ках.
М А Т Е Р И А Л Ы И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
В работе использованы следующие препараты: иммуномодулятор
ПО («Иммафарма», Москва), препараты крови - Alb, IgG (ННИИ'ЭМ),
Ср (ИмБио).
Объектом исследований служила донорская кровь и сыворотка,
полученная в Нижегородском областном центре крови; кровь больных,
предоставленная Нижегородским ожоговым центром. В качестве мо­
дельной системы в работе применен разработанный ранее на кафедре
молекулярной биологии и иммунологии (МБИ) комплекс лабораторных
методов (Добротина Н.А., Казацкая Ж.А., 1997).
С целью изучения влияния препаратов на розеткообразование (РО)
и адгезию популяцию лимфоцитов получали путем фракционирования
периферической крови человека в градиенте плотности фиколверографина (1,077) - 15 мин. 3000 об/мин. Выделенные клетки дважды
центрифугировали (10 мин. 1000 об/мин) с целью отмывания клеток от
градиента. Подсчет концентрации лимфоцитов в 1 мл проводили в каме­
ре Горяева. Полученную взвесь разводили раствором Хенкса до концен­
трации 2*10* кл/мл.
Жизнеспособность лимфоцитов оценивали в тесте с трипановым
синим, окрашивая мертвые клетки 0,5% раствором трипанового синего
(МеньшиковВ.В., 1987)
Розеткообразующую способность Т-лимфоцитов определяли ме­
тодом спонтанного розеткообразования (РО). Индикаторными частица­
ми служили эритроциты барана (ЭБ). Розеткообразующими счигали
лимфоциты, связавшие 3 и более Э Б . С целью изучения влияния различ­
ных препаратов на розеткообразующие свойства Т-лимфоцитов клеточ­
ную взвесь инкубировали с различными концентрациями препаратов в
течение 1 часа при 37°С (Ляпон А.О., 1980). Традиционно метод спон­
танного розеткообразования используется для определения количества
Т-лимфоцитов в крови. В нашей работе метод применен для изучения
тайного розеткообразования используется для определения количества
Т-лимфоцитов в крови. В нашей работе метод применен для изучения
влияния различных физиологически активных веществ на розеткообразующую активность Т-лимфоцитов.
Для изучения адгезивных свойств иммунокомпетентных клеток
полученную, по описанной выше методике, взвесь лимфоцитов, в объе­
ме 1 мл наносили на синтетический носитель (20 мг), помещенный в ту­
беркулиновый шприц (высота колонки 1см). Клетки предварительно об­
рабатывали различными концентрациями исследуемых препаратов.
Контролем служила взвесь необработанных клеток. В камере Горяева
производили подсчет клеток до и после пропускания через пористую во­
локнистую поверхность. Затем рассчитывали процент адгезированных
на синтетическом волокне клеток (Arnold L.,1974).
Активацию системы комплемента под действием препаратов оце­
нивали по гемолизу в геле агарозы (Мотавкина Н.С. с соавт., 1980). Учет
уровня активации комплемента в изучаемом субстрате проводили по
диаметру кольца лизиса сенсибилизированных Э Б (классический путь
активации), сопоставляя его с диаметром кольца лизиса контрольной
пробы, принимаемого за 100%.
Уровень циркулирующих иммунных комплексов ( Ц И К ) оценивали
методом Т.В. Копьгговой (1991), принцип которого заключается в осаж­
дении Ц И К полиэтиленгликолем.
Для определения антиоксидантной активности (влияние на про­
цесс ПОЛ) использовался метод измерения интенсивности свечения ин­
дуцированной хемилюминесценции (Конторщикова К.Н., 2000).
Для определения общей окислительно-восстановительной актив­
ности нейтрофилов использовался НСТ-тест, основанный на способно­
сти нейтрюфилов поглощать нитросиний тетразолий и восстанавливать
его в гранулы нерастворимого диформазана синего цвета. Восстановле­
ние н е т обеспечивается энергией и п|Х)дуктами окислительновосстановительных реакций «метаболического взрыва», сопровождаю­
щего процесс фагоцитоза, а также повышенного метаболизма активиро­
ванного нейтрофила.
Влияние ПО на бактерицидную активность нейтрофилов изучали
методом определения индекса завершенности фагоцитоза ( И З Ф ) клеток
периферической крови человека (Матусис З.Е., Пылаева С И . , 1972).
Принцип метода основан на способности фагоцитирующих клеток по­
глощать и переваривать живые микроорганизмы. Методика использова­
лась для определения фагоцитарной активности клеток крови в отноше­
нии золотистого стафилококка. И З Ф определялся по формуле: И З Ф =
исход/опыт.
Результаты исследований обрабатывались статистически с исполь­
зованием t - критерия Стьюдента при Р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Модулирующее действие П О иа иммунологические реакции и
неспецифическую резистентность
Принципиальное значение для дальнейшего исследования дейст­
вия препаратов на клеточные реакции имеет установление оптимальных
и пороговых цитотоксических концентраций.
В результате проведенных исследований по влиянию на жизнеспо­
собность лимфоцитов показано, что в концентрации 1000 мкг/мл и выше
ПО не проявляет цитотоксического эффекта. По данным исследований,
проведенных ранее на кафедре молекулярной биологии и иммунологии
установлено, что даже такие физиологические препараты, как Ср, IgG, в
определенных концентрациях обладают токсичностью или способству­
ют сдвигу иммунного гомеостаза. Нами показано, что Ср не вызывает
токсического эффекта в концентрации до 500 мкг/мл, IgG - до 25 мг/мл.
Таким образом, определение концентрации токсичности ПО на
клеточном уровне обосновывает исключительный факт - отсутствие вы­
раженной токсигенности химически синтезированного ПО даже в срав­
нении с аутогенными белковыми препаратами.
Комплексное исследование влияния ПО на реакции клеточного
иммунитета и неспецифической резистентности позволило выявить иммуномодулирующий эффект изучаемого препарата в условиях in vitro.
Используя тест спонтанного розеткообразования, мы провели ис­
следование влияния ПО на количественное содержание как «активных»,
так и «общих» Е-розеткообразующих лимфоцитов доноров в условиях in
vitro. Предполагается, что наиболее адгезивно активные Е-РОК опреде­
ляются после минимальной инкубации («активные» розетки), а менее
активные - при более длительном контакте эритроцитов с лимфоцитами
(«общие» розетки).
Нами установлено, что под воздействием ПО на выделенные лим­
фоциты происходит увеличение числа розеткообразующих клеток (ЕРОК). ПО в различных концентрациях оказывает стимулирующее дейст­
вие, как на "общие", так и на "активные" Е-РОК (табл. 1).
Максимальное достоверное увеличение (на 48,6%) количества "активных" Е-РОК наблюдается при использовании ПО в концентрации
30 мкг/мл (р<0,05); "общих" Е-РОК (на 60%) - в концентрации 60
мкг/мл (р<0,05).
С целью выяснения механизмов нарастания розеткообразующей
активности Т-лимфоцитов, были изучены адгезивные свойства иммунокомпетентных клеток. Адгезия - общебиологический физиологический
феномен, характерный для различных клеток, в том числе этот феномен
работает и в иммунной системе (Hynes L., Zhao J . , 2000). Основная
функция рецепторов адгезии состоит в поддержании межклеточных
взаимодействий и взаимодействий между клетками и экстраклеточным
матриксом (Wagner J . , Roth W., 2000).
Влияние полиоксндояия па иммунные реакции и
неспецифическую резистентность ( М ± ш, п = 10)
Препарат,
мкг/мл
к
ПО(ЗО)
ПО(60)
ПО(125)
Е-РОК, %
«активные»
«общие»
100
148,6±8,57*
126,7±9.5
143,8±13,6*
100
147Д±7^*
160,4±5,5*
157.4±8,1*
Количество
адгезированных
клеток, %
100
148,9±7,7*
149,8±5,5*
149,8±4,3*
Таблица I
Активность ком­
племента (диа­
метр кольца ге­
молиза, мм)
100
104±1,2*
110±0,6*
120±2,0*
♦ - достоверные отличия в сравнении с контролем (р < 0.05).
При сравнительном анализе изменения адгезии, как одного из по­
казателей рецепторной функции клеток крови, под действием исследо­
ванных Б Л В в большинстве случаев выявлен параллелизм между изме­
нением розеткообразующей и адгезивной активностью. Это, повидимому, связано с перестройкой рецепторного пейзажа лимфоцитов и
возможной активацией субпопуляции лимфоцитов, которые в неактив­
ном состоянии не обладают способностью связывать Э Б . Представлен­
ные в работе результаты свидетельствуют о том, что П О усиливает эф­
фект адгезии до 50% (р<0,05) во всех исследуемых концентрациях (табл.
1).
Согласно поставленным в работе задачам, было исследовано влия­
ние ПО на активность системы комплемента как один из важнейших
факторов неспецифической резистентности организма человека. В диа­
пазоне исследованных концент()аций препарата не обнаружено дозозависимого эффекта; активность системы комплемента повысилась иа 102 2 % (р<0,05) в сравнении с контролем (табл. 1).
Повышение активности системы комплемента, вероятно, может
быть взаимосвязано со способностью заряженных групп макромолекулы
ПО взаимодействовать с активным центром компонентов комплемента,
стимулируя, таким образом, протекание следующих протеолитических
процессов.
Исследовано влияние препарата на реакции образования циркули­
рующих иммунных комплексов (ЦИК). Образование Ц И К - это важ­
нейшая реакция иммзшпяого и патоиммунного процессов, взаимосвязан­
ная также с процессами детоксикации (Добротина Н.А., Копытова Т.Е.,
2004). В результате экспериментов нами выявлено стабильное снижение
уровня мелкодисперсных Ц И К под действием препарата во всех иссле-
дованных концентрациях. Максимальное снижение - со 100% до 2 3 %
(р<0,05) - наблюдалось в концентрации 80 мкг/мл. Уровень крупнодисперсных Ц И К снижается незначительно (на 5-16%) (рис. 2.).
Возможно, это взаимосвязано со способностью молекул ПО (в ча­
стности полярных групп) изменять комплексообразование ЦИК. Факти­
чески это коррелирует с детоксицирующим эффектом ПО. Мелкодис­
персные иммунные комплексы, возникающие в условиях неболыиого
избытка антигена, представляют наибольшую опасность ввиду длитель­
ности их циркуляции и высокой комплементактивирующеи способности
(Осипов С.Г., 1983), поэтому их снижение под влиянием ПО можно рас­
сматривать как положительный эффект.
Антиоксидантные свойства П О in vitro исследованы с помощью
метода оценки активности П О Л (измерение интенсивности свечения ин­
дуцированной хемилюминесценции).
|0.6
0,5
0,4
0,3
0,2
0.1
10
SO
100
250
500
П О , мкг/мл
Рис. 1 . Влияние полиоксидония на об1цум антноксидантную
активность
Статистически достоверное снижение S (показатель светосуммы
хемилюминесценции) в диапазоне концентраций 5O-S0O мкг/мл в срав­
нении с контролем свидетельствует о повышении общей антиоксидантной активности ( А О А ) ; в концентрациях 1-10 мкг/мл наблюдается тен­
денция к повышению S (рис.1), т.е. снижению АОА.
Потенциальная способность системы к П О Л оценивалась с помо­
щью Im»- Под действием П О в концентра1ЩИ 100-500 мкг/мл значение
1п«1ч снижено в сравнении с контролем, что говорит о снижении потенци­
альной способности системы к ПОЛ.
10
Влияние ПО на иммунологические показатели
пациентов с термической травмой
Терапия ожоговой болезни представляет большие трудности; в ча­
стности требуется исключительная индивидуализация коррекции гомеостаза. В настоящее время в патогенезе ожоговой болезни наряду с ток­
семией обязательным компонентом выделяется вторичный иммуноде­
фицит в сочетании с аутоиммунными процессами (Алексеев А А , Лав­
ров В.А., 1998). Принципиальным вопросом является необходимость
применения иммуностимуляторов, однако возможность использования
иммуномодуляторов с адаптационным и детоксицирующим эффектом
является обоснованной.
ТаС) ища -
Влияние полиоксидония на розеткообразование Т-лимфоцитов
ожоговых больных и доноров
ПО, мкг/мл
К
Доноры
Ожоговые больные
Е-РОК,%
"активные"
"общие"
Е-РОК,%
"активные"
"общие"
100
100
145,7±7,6*
120,4±16,9
117.4±9.8
150,8±9,1*
124,6±17,6
126,7*9.3*
100
100
ПО (5)
142,2±6,6*
ПО(10)
143,7±7,4*
■ р<0,05 по сравнению с контролем (без ПО)
В таблице 2 представлены данные, отражающие изменение числа
Е - Ю К под действием полиоксидония у пациентов с термической трав­
мой (средняя площадь ожога - 36% поверхности тела) и практически
здоровых доноров.
Полученные результаты свидетельствуют, что розеткообразуюшая
способность Т-лимфоцитов ожоговых больных была достоверно выше,
чем доноров. При этом используемые дозирювки препарата практически
не отличались по эффективности действия на данный показатель. Сти­
муляция розеткообразования отмечалась как для "активных", так и для
"общих" розеток (табл. 2).
При изучении действия ПО на уровень ЦИК в сыворотке ожого­
вых больных, учитывая различия пациентов в площади ожога, они были
разделены на две группы: 1-я группа - пациенты с ожогом от 10 до 30%
поверхности тела, 2-я фуппа - пациенты с ожогом от 30 до 60% поверх­
ности тела.
В сыворотке больных с ожогом менее 30% поверхности тела со­
держание мелкодисперсных иммунньп комплексов было достоверно
большим, чем в группе больных с ожогом, превышающим 30 % .
Под влиянием ПО наблюдалось снижение уровня мелкодисперс­
ных ЦИК у обеих групп пациентов, причем наибольший эффект отмечен
при использовании концентрации 10 мкг/мл (в первой qjynne больных на 22 % , во второй - на 37%). Применение ПО в концентрации 30
мкг/мл приводило к увеличению содержания мелкодисперсных Ц И К на
17% в сыворотке больных с площадью ожога более 30% поверхности
тела, то есть в данном случае наблюдался обратный (реципрюкный) эф­
фект препарата.
Таблица 3
Действие полиоксидония на уровень мелко- и крупнодисперсных
Ц И К в сыворотке пациентов с термической травмой
ПО,
мкг/мл
ЦИК, единицы оптической плотности
крупнодисперсные ЦИК
мелкодисперсные Ц И К
ожог 10-30% п.т. ожог 30-60% п.т. ожог 10-30% п.т. ожог 30-60% п.т.
0
0,410±0,015
0,150±0,007
0,055±0,001
0,040±0,001
3
0,365±0,016*
0,130±0,005*
0,047±0,002*
0,039±0,001
10
0,320±0,014*
0,095±0,004*
0,046±0,001*
0,039±0,002
30
0,390±0,016
0,175±0,010*
0,052±0,001
0,042±0,002
* - р<0,05 по сравнению с контролем (без ПО)
Пол влиянием полиоксидония в концентрации 3 и 10 мкг/мл сни­
жение содержания крупнодисперсных иммунных комплексов наблюда­
лось только в 1-ой группе пациентов (на 17 и 15% соответственно) и
тенденция к снижению в дозе препарата 30 мкг/мл (табл. 3).
Таким образом, в результате проведенного исследования показа­
но дозозависимое действие полиоксидония на уровень Ц И К в сыворотке
пациентов с термической травмой.
При изучении действия ПО на функциональную активность ней­
трофилов установлено, что в группе пациентов с ожогом менее 30% по­
верхности тела индекс активации нейтрофилов был близок к норме и
достоверно не отличался от показателя у доноров ( И А Н у практически
здоровых доноров составляет 15±1%) Во второй группе больных с ожо­
гом свыше 30 % поверхности тела индекс активации нейтрофилов на
момент исследования был выше нормальных значений.
При использовании ПО в концентрации 10 и 100 мкг/мл в группе
пациентов с ожогом менее 30% поверхности тела прослеживалось сни­
жение индекса активации нейтрофилов. При увеличении дозы полиок­
сидония до 500 мкг/мл наблюдалось повышение изучаемого показателя
в данной группе пациентов.
В группе пациентов с ожогом более 30% поверхности тела под
i:
действием ПО наблюдалось достоверное увеличение этого параметра по
отношению к контролю (наибольшая стимуляция отмечена при исполь­
зовании ПО в концентрации 100 мкг/мл (в 3,2 раза).
Полученные результаты свидетельствуют, что действие полиоксидония на функциональную активность нейтрофилов в НСТ-тесте от­
личалось в разных группах больных, то есть наблюдалась зависимость
между эффектом препарата и тяжестью состояния пациентов.
Для изучения действия ПО на поглотительную функцию нейтро­
филов определяли индекс завершенности фагоцитоза (ИЗФ) в отноше­
нии стафилококка (Staphylococcus aureus, штамм 600).
В группе пациентов с площадью ожога менее 30 % поверхности
тела исходные значения индекса завершенности фагоцитоза были досто­
верно снижены по сравнению с показателями у практически здоровых
■•доноров. Действие ПО проявлялось в этой фуппе пациентов повышени­
ем переваривающей способности нейтрофилов в отношении стафило­
кокка. У пациентов с ожогом более 30% поверхности тела индекс за­
вершенности фагоцитоза был в среднем повышен по отношению к нор­
ме. Влияние ПО на нейтрофилы пациентов этой группы также зависело
от дозы препарата.
Полученные данные показывают, что ПО оказывал стимулирую­
щее влияние на индекс завершенности фагоцитоза нейтрофилов в обеих
фуппах пациентов.
Совместное действие П О и белковых препаратов
Закономерно, что в современной доказательной биомелииине
обосновывается применение системной коррекции патологических со­
стояний вместо монотерапии.
Появляясь в крови, П О действует не изолированно, а во взаимо­
действии с белками крови, поэтому следующим этапом работы было ис­
следовано совместное влияние ПО с Ср, IgG и Alb на иммунологические
реакции.
В результате проведённых экспериментов был обнаружен более
выраженный эффект совместного действия препаратов ПО и Ср на кле­
точные реакции по сравнению с отдельно взятыми препаратами. Иссле­
дованы различные комбинации концентраций, но определенной зависи­
мости влияния доз препаратов на степень стимуляции иммунных реак­
ций не выявлено. Под действием ПО и Ср в концентрациях от 30 до 125
мкг/мл количество «активных» Е-РОК увеличилось на 64-88%, «общих»
- на 24-44%, адгезивная способность мононуклеаров увеличивается на
35 - 77% (р<0,05) (табл.4).
Таким образом установлен стимулирующий эффект ПО как от­
дельно взятого, так и с Ср на кооперативное взаимодействие IIMMN не­
компетентных клеток, причем совместное применение ПО и Ср характе­
ризовалось синергетическим эффектом.
14
Таблица 4
Влияние полиоксидоиия и церулоплазмина
на иммунные реакции ( М ± т , п = 10)
Препарат,
мкг/мл
Е-РОК,%
«активные»
Количество
«общие»
адгезиро-
ванных кле­
ток, %
Активность
комплемента
(диаметр кольца
гемолиза, м м )
К
100
100
100
100
ПО (125)
143,8±13,7»
159,5±8,18*
149,8±5,5*
120±2,0*
Ср(125)
109,5±10,9
133,6±9,9
130,2±4,9*
120±2,0*
Ср+ПО(125)
164,4±14,4*
144,4±6,0*
176,9±5,8*
118±0,4*
* - достоверные отличия в сравнении с контролем ( р < 0.05).
П р и исследовании действия препаратов П О и С р в модельной с и с ­
теме in vitro, в а ж н ы м аспектом, кроме собственно иммунологических
реакций, является изучение их влияния на такие показатели неспецифи­
ческой резистентности, как активацию системы комплемента.
В
результате проведенных экспериментов установлено, ч т о при
совместном действии П О и С р повышение комплементарной активности
составило 10-20% (р<0.05) (табл. 4), т. е. суммации стимулирующего
влияния препаратов не обнаружено.
120
100
S»
80
60
40
20
Ср+ПО(166)
Ср+ПО(80)
Q Мелкодисперсные ЦИК
С|Ч166)
I Крупнодисперсные ЦИК
Р и с . 2. В л и я н и е п р е п а р а т о в П О и С р на у р о в е н ь ц и р к у л и р у ю ­
щих и м м у н н ы х к о м п л е к с о в .
14
Одним из этапов исследования ПО и Ср на иммунологические ре­
акции было изучение их действия на мелкодисперсные и крупнодис­
персные иммунные комплексы (ИК). Установлено, что отдельно взятые
препараты ПО и Ср и при их совместном использовании однонаправленно влияют на уровень И К : значительно снижают содержание мелко­
дисперсных И К : со 100% до 2 3 % (р<0.01) в концентрации 80 мкг/мл,
уровень крупнодисперсных Ц И К снижается незначительно - на 5-16% под действием всех исследованных концентраций (р<0.01) (рис.2.). Это
еще раз подчеркивает значение адаптационного эффекта действия ис­
следованных препаратов, учитывая, что патофизиологическое влияние
мелко- и крупнодисперсных Ц И К различно.
В результате изучения совместного действия ПО и IgG на клеточ­
ные реакции был отмечен эффект суммации. Следует учесть, что IgG
сдерживает, регулирует развитие некоторых иммунологических реак­
ций; в частности, обнаружено, что IgG снижает количество «активных»
розеткообразующих клеток на 41,5%, «общих» - на 40,5% (р < О 05). что
имеет соответствующее физиологическое объяснение, как предупрежде­
ние гиперергических реакций. Однако совместное применение ПО и
IgG отменяет эффект действия IgG и активация розеткообразующих кле­
ток увеличивается на 15-17% (р>0,05) (табл. 5).
По нашим предположениям, молекула или агрегаты иммуноглобу лина взаимодействуют с лимфоцитом, за счет специфических рецепто­
ров (CD32, CD16) (Ярилин А.А., Добротина И.А., 1997) или неспецифи­
ческих взаимодействий, стерически закрывая рецепторы для клеток ми­
шеней, либо вызывает изменения мембраны лимфоцита, приводящие к
снижению функциональной способности CD2 антигена к взаимолсйствию с CD58 молекулой на поверхности эритроцита.
Таблица 5
Совместное влияние полиоксидония и иммноглобулина G
на иммунные реакции (M±in, в=10)
Препарат, мкг/мл
Е-РОК,%
«активные»
«общие»
Количество
1
клеток адгезии. % '
К
100
100
100
IgG (16000)
58,42±6,8*
59,5±4,5*
76,4±9,1
130,0110,52*
137,6±4,2*
140,2±9,1*
114,7±12,6
116,8±8,9
131,1±15,2*
ПО (10)
IgG(l600>i-nO(10)
1
♦ - достоверные отличия в сравнении с контролем (р < 0.05).
1.^
Подтверждением результатов, полученных нами при изучении
влияния IgG на розеткообразование, служат данные, свидетельствую­
щие о снижении способности мононуклеарных клеток крови к адгезии
на синтетическом носителе (на 23,6%). При совместном использовании
ПО с IgG активация лимфоцитов увеличивается в сравнении с контро­
лем (без препарата) на 3 1 % (р<0.05) (табл.5).
Одной из задач работы являлось изучение совместного влияния
препаратов ПО и Alb на иммунные реакции. В связи с этим мы провели
исследование воздействия различных концентраций коммерческого аль­
бумина, близких к физиологическим на функциональное состояние от­
дельных звеньев системы иммунитета в условиях in vitro.
В результате экспериментов показано, что альбумин снижает уро­
вень Е-РОК и адгезивные свойства мононуклеарных клеток крови. Под
действием альбумина обнаружена тенденция к снижению активности
системы комплемента, не установлено его влияния на уровень ЦИК.
Совместное действие полиоксидония и альбумина
на иммунные реакции ( М ± т , п=10)
Препарат, мкг/мл
Е-РОК,%
«активные»
«общие»
Таблица 6
Количество
клеток адгезии, %
К
ПО
Alb
138,7±8,3*
122.9±3,1*
93,5±6,2
86,8±7,9*
86,8±10,3
Aib+nO
118,4+11,9
102,5±8,2
119,7±10,3
100
100
100
135,8±14,8*
* - достоверные отличия в сравнении с контролем (р < 0.05).
Следует предположить, что снижение количества Р О К в присутст­
вии альбумина происходит, как и в случае с Ig, из-за экранирования
прикрепившимся альбумином рецепторов межклеточного взаимодейст­
вия Эти данные о влиянии альбумина на розеткообразование и адгезию
мононуклеаров наводят на предположение о сдерживаю1цем характере
действия альбумина на активацию иммунной системы и его ограничи­
вающей роли в условиях in vivo.
Как и в случае с другими нативными препаратами, при совмест­
ном использовании ПО и Alb наблюдается эффект суммации действия
препаратов, стимулирующее действие ПО и ингибирующее влияние
альбумина на иммунокомпетентные клетки в сумме вызывают тенден­
цию к повыщению количества розеткообразующих и адгезированных
клеток в реакциях РО и адгезии соответственно (табл. 6).
Обобщая результаты исследований, можно заключить, что в мо­
дельной системе in vitro получены новые данные по действию иммуномодулятора ПО на клетки иммунной системы и факторы неспецифнческой резистентности не только в норме, но и при патологии (ожотвая
травма).
Принципиальное значение имеет исследование действия ПО со­
вместно с нативными белковыми препаратами сыворотки крови. Поле­
ченные данные раскрывают новые механизмы действия препаратов pajличного происхождения и имеют научно-практическое значение
ВЫВОДЫ
1. в экспериментах in vitro на популяции лимфоцитов, выделенных и!
крови человека, установлено отсутствие повреждающего токсическо­
го эффекта ПО; доказана выраженная иммуномодулирующая актив­
ность ПО в изучаемой системе.
2. Выявлено стимулирующее влияние ПО на кооперативное взаимолействие иммунных
клеток (в реакциях розеткообразования 1лимфоцитов и адгезии мононуклеаров) и систему комплемента. Oiмечено снижение уровня мелкодисперсных ЦИК под действием ПО.
3. В модельной системе in vitro на клетках крови пациентов с термиче­
ской травмой показано стимулирующее действие ПО на клеточные
реакции и неспецифическую резистентность. Выявлено дозозависимое влияние П О на уровень циркулирующих иммунных комплексов в
сыворотке ожоговых больных.
4. Обнаружена зависимость влияния П О на функциональную актив­
ность нейтрофилов в ИСТ-тесте от используемой дозы препарата и
тяжести состояния ожоговых больных. Фагоцитарно-бактерицидная
способность нейтрофилов в отнощении микробных клеток увеличи­
вается независимо от используемой дозы ПО и площади ожога.
5. Установлено более эффективное совместное действие препаратов ПО
с церулоплазмином, гамма-глобулином и альбумином на кооператив­
ные свойства иммунокомпетентных клеток, чем действие отдельных
препаратов.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ
ДИССЕРТАЦИИ
1. Добротина, Н.А. Иммунитет и здоровье, современные аспекты '
Н.Л. Добротина, Ж . Л . Казацкая, А.А. Бабаев, М.В. Прохорова.
Е.А. Гостюжова // Экологическая и промыщленная безопасность ■
тез. докл. Ш сессии молодежной школы-семинара. - Саров, 2003. 17
с. 18-19.
2. Казацкая, Ж.А. Современные проблемы нормализации иммуните­
та, значение в терапии и профилактике / Ж.А. Казацкая, А.А. Баба­
ев, М.В. Прохорова, Е.А. Гостюжова, Н.А. Добротина // Вестник
ННГУ. Сер. Инновации в образовании. - 2003. - С. 258-261.
3. Кравченко, Г.А. Физиолого-иммунологическое обоснование при­
менения натуральных биологаческих активных добавок (фермент­
ных препаратов) / Г.А. Кравченко, М.В. Прохорова, Н.А. Добро­
тина // Сб. материалов межд. конф. молодых ученых «От фунда­
ментальной науки - к новым технологиям...». - Тверь, 2002. Вып. 2. - С.27-28.
4. Прохорова, М. В. Иммуномодулятор полиоксидоний и белки кро­
ви в системе иммунологических реакций in vitro / М . В. Прохорова,
Ж. А. Казацкая // Актуальные проблемы медицины и биологии. 2004. - Вып. 3. - С. 306.
5. Прохорова, М.В. Механизмы регуляторной активности некоторых
иммуномодуляторов в системе крови человека in vitro / М.В. Про­
хорова, Е.А. Гостюжова, Е.С. Васильева // Тез. докл. 8-й Междуна­
родной Пущинской школы-конференции молодых ученых. - Пущино. - 2004. - С. 126.
6. Прохорова, М.В. Механизмы активности некоторых современных
иммуномодуляторов / М.В. Прохорова, Е.А. Гостюжова // Тез.
докл. I X нижегородской сессии молодых ученых (Естественнона­
учные дисциплины). - Н. Новгород. - 2004. - С. 230 - 231.
7. Добротина, Н. А. Характеристика активности полиоксидония в
системе иммунологических реакций in vitro / Н. А. Добротина, М.
В. Прохорова, Ж . А. Казацкая // Иммунология. - 2005. - №.3. -С.
152-156.
IX
\
i.
Подписано в печать 19.10.2005. Формат 60x84 1/16.
Бумага офсетная. Печать офсетная.
Усл. печ. л. 1. Зак. 1396. Тир. 100.
Типография Нижегородского госуниверситета.
Лиц. ПД № 18-0099 от 04.05.2001.
603000, Н. Новгород, ул. Б. Покровская, 37.
№20570
РНБ Русский фонд
2006-4
22084
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
771 Кб
Теги
bd000102261
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа