close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

bd000102449

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Гребенникова Татьяна Владимировна
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИИ
Ф УНКЦИОНАЛЬНО
МУТАЦИИ
ЗНА ЧИМЫЕ
АНАЛИЗ И
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ
ВИРУСА РЕПРОДУКТИВНОГО
РЕСПИРАТОРНОГО
СИНДРОМА
03.00.06-вирусология
Автореферат диссертации
на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Москва-2005
И
СВИНЕЙ
2^06-7
Т2МГ
На правах рукописи
Гребенникова Татьяна Владимировна
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ
Ф УНКЦИОНАЛЬНО
ЗНА ЧИМЫЕ
АНАЛИЗ И
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ
МУТАЦИИ ВИРУСА РЕПРОДУКТИВНОГО
РЕСПИРАТОРНОГО
СИНДРОМА
03.00.06-вирусология
Автореферат диссертации
на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Москва-2005
И
СВИНЕЙ
21171^J
Работа выполнена в Г У Н И И вирусологии им. Д.И.Ивановского Российской Академии
Медицинских Наук, в Научно-производственном объединении Н А Р В А К , г. Москва
Научный консультант:
Заслуженный ветеринарный врач
Российской Федерации
доктор биологических наук.
НЕПОКЛОНОВ Евгений Анатольевич
Официальные оппоненты:
Член-хорреспондент Р А М Н ,
доктор медицинских наук, профессор
У Р Ы В А Е В Леонид Викторович
Профессор
доктор биологических наук.
Г Р У З Д Е В Константин Николаевич
Профессор
В А Л И Х О В Алексей Федорович
доктор биологических наук.
Ведущее учреждение:
Г У Н И И эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф . Гамалеи Р А М Н
Защита диссертации состоится 21 ноября 2005 года в /«^•Часов на заседании
Диссертационного совета Д 001.20.01 при Г У Н И И вирусологии им. Д.И. Ивановского Р А М Н
по адресу: 123098 Москва, ул. Гамалеи, д. 16.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Г У Н И И вирусологии им. Д. И.
Ивановского Р А М Н .
Автореферат разослан
Л'
октября 2005 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета,
доктор медицинских наук
Н.П.Косякова
НОС. Н А Ц И О Н А Л Ь Н А Я ]
БИБЛИОТЕКА
1
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы
Работа посвяшена комплексному молекулярно-генетическому исследованию вируса,
вызывающего репрод)ктнвный и респираторный снн.Щ)ом свиней (РРСС).
РРСС - ннфекщгонное заболевание, которое обнаружено 1987 г. в Северной Каролине,
С Ш А (Keffabcr 1989) и Канаде (Dea S. et al. 1990) РРСС называли также загадочной
болезнью свиней (mystery swine disease) В настоящее время РРСС является эндемичным
заболеванием во многих, если не во всех странах с промышленным свиноводством (Goyal S. М.
1993) . Пракппсски все страны мира, вкшочая Россию, США и страны Западной Европы, несут
огромные экономические потери от этого респираторного и pcnpofljTcniBHoro синдрома свиней.
Заболевание выражается множеством клинических проявлений, но двумя наиболее
характерными являются патология органов дыхания и репродукции. Течение РРСС может
сильно отличаться по проявлению признаков: от полного отсутствия клинической картины до
выраженных признаков репродуктивных и респираторных
нарушений. Респираторные
расстройства, как правило, наиболее сильно выражены у поросят всех возрастов и
проявтяются в виде неспецифических лнмфомононуклеарных пневмоний (Hatbur Р. G. et al.
1996b и i p ) Нарушения репролуктивной функции наблюдаются, в основном, у ремонтных
свинок и свиноматок, инфицированных во время с)поросности (Christianson W . Т. et al. 1993;
Mengelmg W
L
et al. 1994). При этом наблюдаются аборты, рождение мертвых или
ослабленных поросят (Christianson W. Т. et al 1992; Terpstra С. et al. 1991), иногда гибель
свиноматок (Zimmerman J J . et al. 1997a). Считают, что в неблагополучных хозяйствах РРСС
способствует усилению других инфекционных заболеваний респираторного комплекса
(Galina L. et al 1994; CarvalhoL et al 1995;SoIanoG etal 1995; Van Alstine W G. et al. 1996).
Вирус РРСС относится к роду Arterh'irus, семейству Aiierividae, порядка Nidoviroles
(Cavanagh D. 1997).
Предполагается, что вирус распространился из Канады в С Ш А .
Происхождение вируса неизвестно. Различают два типа вируса РРСС: американский и
европейский. Предполагают, что европейский и американский типы вируса имеют различные
эволюционные истории, т.к. их геномы сильно различаются (Nelson Е. А, et al, 1993;
Wensvoort G. et al. 1992).
Вирус РРСС проникает в клетки иммунной системы, главным образом, в макрофаги
(\Vens\oort G. et al 1991; Voicu I L et al. 1994, ROSTOW K . D . et al. 1995; Rossow R. D. et al.
1996, Molitor T. \V. et al
1996) Быстрому распространению вируса способствует его
длительная персистенция в организме зараженных животных (Benfield D A
et al 1997), его
присузствие в сперме (Christopher-Hennings J . et al. 1995, Swenson S L et al 1994). высокая
контагиозность (Mengeling W L etal 1998).
Из-за сходства клинических признаков РРСС с признаками заболеваний, вызываемых
другими вирусными или бактериальными патогенами, для точной диагностики РРСС
требуются
специфические
иммуноферментпый
лабораторные
анализ,
реакцию
методы.
Серологические
нейтрализации
и
тесты
включают
непрям} ю
реакцию
иммунофлюоресценции (Yoon I J . et al. 1992, Dea S et al 2000, Witte S В et al 2000) Вир)с
выявляют с использованием иммуногистохимического анализа, окрашивания при поч101яи
флюоресцирующих антител, методом поличеразной цепной реакции и выдепенпя вируса в
культуре клеток (Paton D L et al. 1992, Suarcs Р ct al 1994, Christofer-Hennings J etal 1995,
Mengeling W. L et al 1995). Секвеиирование генома вируса РРСС позволяет, с определенной
степенью точности, определить родство между разными штаммами
Для установления в хозяйствах стабильной ситуации относительно репродуктивного и
респира горного синдрома свиней используют как частичную депопуляцию стада, так и его
полную замену (в странах Европы и Америки), а также вакцинацию Для специфической
профилактики Р Р С С используются, в основном, живые и инактивированные вакцины (Б. Г
Орлянкип и др 2000) В настоящее время разрабатываются субьединичные и ДНК-вакцины,
проводятся
активные
исследования
иммунною
ответа
животных.
Тем
не
менее,
эффективность применения вакцин на практике в условиях широкого распространения и
д11ггельной персистенции полевых штаммов вируса РРСС достоверно не подтверждена. В
настоящее время не существует вакцины, которая эффективно защищала бы животных от
заболевания. Более гого, использование живых вакцин часто приводит к заболеванию
животных из-за реверсии вакцинного штамма вируса к дикому типу fSmedegaar G. et al.
1997).
Таким образом, несмотря на значительный прогресс в изучении вируса, РРСС остается
загадочной болезнью и в настоящее время. Роль иммунного ответа в патогенезе Р Р С С
недостаточно изучена.
Известно, что при контакзе с вирусом у свиней вырабатываются
вирус-специфические антитела (Gorcyca D. Е. et al. 1995, Gorcyca D. E. et a! 1996; Hesse R. A.
et al. 1996, Mengeling et al. 1996). Предполагается также, что в определенных условиях
выработка антител может усиливать фагоцитоз (antibody dependent enhancement, A D E ) и
увеличивать репликацию вируса (Christianson W. Т et al. 1993; Yoon K.-J. et al. 1996) Эти
данные
косвенно
свидетельствуют
о
значительных
4
антигенных
вариациях
среди
циркулирующих вирусов РРСС Внрус-нейтрализуютиие антитела появляются поздно, через
3-4 не1ели после инфицирования (Yoon К-] et al. 1995, Loemba Н D. ct al 1996, Ostrowski M
et al 2002) Известно, что гуморальный иммунный ответ организма на присутствие вируса
РРСС не обеспечивает эффективной зашиты.
Очевидно, что для создания эффективных средств профилактики данного заболевания
необходимы
фундаментальные
мопекулярно-генстическое
исследования
исследование
В
этого
частности,
патогена,
необходимо
выявление
подробное
генетических
детерчинант вирулентности вируса РРСС. Для разработки стратегии профилактики РРСС
1реб)ется комплексное изучение инфекционного процесса, включая выяснение особенностей
патогенеза
и
также
подробное
молекулярное
исследование
вирусных
изолятов,
циркулирующих на терр1гторни России и пограничных с ней государств
Цель и задачи исследования
Работа посвящена комплексному молекулярно-генетическому анализу вируса РРСС, в
частности, выявлению функционально 3Ha4HMbtx генетических мутаций
Целью
работы было
репродуктивного
и
подробное молекулярно-генетическое
респираторного
синдрома
свиней
и
исследование
выявление
вируса
детерминант
вирулентности
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следую1цие задачи:
1.
Провести
исследование
распространения
вируса
репродуктивного
и
респираторного синдрома свиней на территории России и Белоруссии.
2. Разработать комплекс средств лабораторной диагностики РРСС, основанных на
выявлении вируса и антител к нему:
- Разработать тест-системы для выявления вируса РРСС с использованием ОТПЦР и ПЦР в реальном времени на основе отечественных реагентов;
- Разработать набор реагентов для опреде пения антител к вирусу РРСС на
основе непрямого И Ф А с использованием рекомбинантаых антигенов, полученных из
отечественных изолятов вируса РРСС.
3. Провести ш1фокие производственные испытания разработанных отечественных
тест-систем для выявления вируса Р Р С С и специфических антител.
4.
Провести
по;фобные
молекулярные
исследования
полевых
изолятов,
циркулирующих на территории России и Белоруссии, методом прямого секвенирования и
филогенетического анализа гена, кодирующего белок нуклеокапсида вируса РРСС.
5
5. Провести сравнение ш vivo свойств трех различных вариантов североамериканскою
штамма вируса РРСС NADC8: вирулентного штамма NADC8-2, апенуированного варианта,
полученного после 251 пассажа в культуре клеток - NADC8-251, а также промежуточного
варианта, выделенного от свиньи после частичной реверсии аттенуированного вируса NADCg-252P.
6. Определить полную первичную структуру геномов у трех штаммов вируса РРСС:
вирулентного штамма NADC8-2, его аттенуированного М)танта, пол) ценного пассированием
в культуре клеток (NADC8-251), а также частично ревертировавшето вируса (NADC8-252P)
7.
Провести
сравнительный
анализ
нуклеотидных
и
аминокислотных
последовательностей вирулентного штамма NADC8-2, аттенуированного штамма NADC825)
и частично ревертировавшсго NADC8-252P
и на основе 11роведен1юго анализа
определить функционатьно значимые участки генома, потеиинапьно ответственные за
аттенуацию вируса, а также молекулярные детерминанты, связанные со свойствами
вирулентности
8. Разработать стратегию и осуществить конструирование системы обратной генетики
для внесения целенаправленных генетических изменений в РНК-геном вирусов РРСС,
основанной на библиотеке полноразмерных инфекционных копий ге!юма аттенуированного
штамма NADC8-251.
9.
Получить рекомбинантные вирусы путем трансфекции перевиваемой культуры
клеток ш vitro, охарактеризовать их В1фусологическими методами. Подтвердить генноинженерное происхождение вируса опредспением первичной стр\ктл'ры его генома
Научная новизна работы
До начала комплексных исследований (1997-1998 г г )
не было сведений о
распространении вируса РРСС на территории Российской Федерации и пограничных с ней
государств. В рамках данной работы бы по проведено обследование свиноводческих хозяйств
России и Белоруссии на наличие антигел против вируса РРСС. Впервые было установпено
широкое распространение вируса на территории этих государств
Проведен подробный
молекулярный анализ первичной структуры геномов полевых нзолятов вируса РРСС.
выделенных на территорий Российской Федерации и Белоруссии Это позволило нам оиентъ
степень вариабельности геномов вирусов, циркулирующих
на данной территории, и
разработать средства лабораторной диагностики РРСС. Были созданы и утверждены
отечественные тест-системы для проведения комплексной лабораторной диагностики РРСС.
6
основанные на выявтенми компонентов вируса и антител к мe^^\ Отечественных тест-систем
ло этого разработано не было.
Впервые быти
подробно исследованы молекулярные
основы вирулентности и
аттетацни вируса РРСС На основании исследования полной первичной С1рукт\'ры геномов
трех вариантов Bnpjca РРСС вируле1ГТН0Г0 штамма NADC8-2, аттенуированного варианта
NADC8-251 и его ревертанта, образовавшегося в результате одного пассажа в организме
свиньи
NADC8-252P,
обнаружены
участки
генома,
которые
могут
играть
роль
в
приобретении вирулентности вирусом РРСС Впервые найдены генетические детерминанты
вирулентности вируса РРСС.
Впервые создана библиотека полиоразмерных инфекционных копий генома вируса
РРСС, состояи1ая из 32 плазмид, для изучения фундаментальных генетических характеристик
представителей рода Artenvirus методами обратной генетики Полноразмерные копии генома
аттенуированного штамма NADC8-251 вируса РРСС собраны и клонированы в ЕсоИ. На
основе полученных генноинженерных конструкций синтезированы РНК-геномы и получены
рекомбннантные инфекционные вирусы с минимальными различиями в первичной структуре
генома по сравнению с родительским штаммом NADC8-25]. Создание библиотеки, а не
елиннчной инфекционной копии вируса РРСС, позволттло успешно преодотеть трудности,
связанные с нестабильностью генома вируса РРСС
Таким образом, создана система
обратной генетики, позволяющая проводить генетические манипуляции с вирусным РНКгеномом, что ранее было невозможно.
Впервые проведены исследования микроэлементного состава клеток MARC-145,
инфицированных и не инфицированных вирусом РРСС, для определения воздействия вируса
на биологическ^то
систему. Определены специфические изменения
микроэлсментиого
профиля биологической системы.
Практическая значимость
Итогом проведенных исследований была разработка полного комплекса методов
лабораторной диагностики РРСС на основе отечественных реагентов. Разработаны тестсистемы для определения Р Н К вируса РРСС методами ПЦР и ПЦР в реальном времени
Разработан также набор реагентов для определения антител к вирусу РРСС методом И Ф А .
Тест-системы успешно прошли лабораторные испытания Тест-система для определения Р Н К
вир\са РРСС методом ПЦР и набор реагентов для определения антител к вирусу РРСС
методом И Ф А
получили
все необходимые сертификационные
7
документы
и прошли
широкомасштабные
производственные
испытания
Результаты
истлтанчП
позволяют
рекомендовать разработанные тест-системы для использования в хозяйствах Российской
Федерации и пограничных с ней государств Тест-система для определения вируса РРСС
методом ПЦР в реальном времени в настоящее время проходит комиссионные испытания
Пол}'ченные результаты позволяют надеэться на то, что данная тест-система
будет
использоваться для широкого мониторинга хозяйств на наличие вируса РРСС.
Наличие инфекционных копий вируса РРСС, полученных на основе библиотеки
полиоразмерных геномов, позволит вносить генетические изменения в вирусный РНК-геном и
получать вирусы с новыми свойствами.
Основные положения, пыпоснмые на заипну
1 Подтверждение распространения вируса РРСС на территории России и Беторуссии,
определением а1ггител к вирусу па основе серологического анализа сывороток крови свиней
2 Создание и характеристика комп.лекса новых средств лабораторной диагностики
РРСС на основе отечественных реагентов' тест-систем для выявления вируса РРСС с
использованием ОТ-ПЦР и ПЦР в реальном времени и набора реагентов для определения
антител к вирусу РРСС на основе непрямого И Ф А с использованием рекомбинантных
антигенов.
3 Доказательство эффек1Ивности разработанных тест-систем для выявления вируса
РРСС и антител к нему, полученных на основе отечественных реагентов в ходе масштабных
производственных испытаний.
4 Оценка генетического разнообразия и генотипирование полевых изолятов вируса,
циркулирующих на территории России и Белоруссии, и их филогенетический анализ
5. Экспериментальное подтверждение степени вирулентности или аттенуации трех
вариа1ггов полевого изолята NADC8' высоковирулентпого NADC8-2, атгенуированного
вируса NADC8-251, а также вируса-ревертанта -NADC8-252P.
6. Сравнительный анализ трех по1Норазмерных геномов, включающий анализ генов
вирусных белков и регуляторных последовательностей вирусов NADC8-2, NADC8-251 и
NADC8-252P.
Выявление потенциальных молекулярных
детерминант, связанных со
свойствами вирулентности вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней.
7
Создание
атгенуирова1»10го
библиотеки
штамма
полноразмерных
NADC8-251
для
вирусного генома методами обратной генетики
8
инфекционных
исследования
копий
функииональных
генома
участков
8 Характеристика бнб1нотски инфекционных копий генома вируса РРСС и отбор
рекомбинантного вируса РРСС со свойствами, приближенными к родительскому штамму
NADC8-251
Апробация результатов исследования: Материалы исследования доложены на заседаниях
Ученого Совета Г У Н И И вирусологии им Д. И Ивановского, Научно-технического совета
НПО Н А Р В А К , на Международной научно-практической конференвди Р У Д Н , Москва, 2004
г, на 7-м международном симпозиуме по исследованию положительно-цепочечных РНКсодержащих вирусов, Сан-Франциско, США, 2004 г., на Всероссийском совещании-семинаре
директоров ветеринарных лабораторий субъектов РФ, Брянск, 2004, на 82-й и 84-й
конференциях по болезням животных (CRWAD), Сент-Луис и Чикаго, С Ш А , 2001 г. и 2003
г , на конференции В Н И И Ж З , Владимир, 2003 г, на Международной научно-практической
конференции по болезням животных, Покров, 2003 г., на 17-м международном конгрессе
ветеринарных
вирусологов,
Эймс,
Айова,
Американского общества вирусологии,
США,
2002 г,
на
20-й
Мэдисон, Висконсин, С Ш А ,
конференции
2001 г., на X V I
Менделеевском съезде по обшей и прикладной химии в Москве, 1998 г , на Симпозиуме М Э Б
(OIE), Бирмингем, Великобритания, 1998 г, на международной конференции АТВ'92,
Милан, Италия, 1992 г.
П5бликацин по диссертационной работе. По теме диссертации опубликовано 26 работ
в периодических изданиях, материалах научных конференций, приняты к печати 4 работы.
Объем и структура работы. Материалы диссертации изложены на уОЗ> страницах
машинописного текста и состоят из следующих разделов' обзор литературы, материалы и
методы, результаты
практические
собственных
предложения,
исследований,
приложения
и
обсуждение
список
результатов,
литературы,
выводы
и
содержащий " ^ _ ^ _
источников. Диссертация иплюстрировэна 24 таблицами и 39 рисунками
Автор приносит глубокую благодарность научному консультанту Заслуженному вет.
врачу РФ. дб.н Е. А. Непоклонову, д.б.н. Т. И. Алиперу, д.б.н. А
профессору Б. Г
Д. Забережному,
Орлянкнну, Заслуженному деятелю науки Р С Ф С Р , профессору В. А
Сергееву, д б н А В. Сыроешкину, профессору В
Менгелингу и д-ру К. Лагеру (NADC,
Ames, М%К) за разностороннюю научно-методическую помощь в работе.
Автор приносит глубокою благодарность кб.н М. И. Мусиенко, к.б.н В. В Цибезову, В. С.
Богдановой, В В Грабовецкому, О. В Елисеевой, Н И Потаповой, А В. Байбак, к б н А. И
Власовой и к.б.н. К. П. Алексееву, совместно с которыми были выполнены отдельные
фрагменты представленной работы.
2. С О Б С Т В Е Н Н Ы Е И С С Л Е Д О В А Н И Я
2.1. Материалы и методы исследования
Клеточные пинии. Клеточные линии MARC-145 (субклон клеточной линии МА-104)
и ВНК-21 были любезно предоставлены Ur. W. L
Mengeling (Национальный институт
болезней животных (NADC), С Ш А ) . Рекомбинантные штаммы бакуловирусов выращивали в
клетках насекомых Spodopterafrugipedra (клеточные линии Sf-9, Sf-21). Клетки выращивали с
использованием ростовой среды ТС-100 ("Life Technology", США), содержащей 10%
сыворотки эмбрионов коровы (СЭК) и гейтам ицин в концентрации 50 ед/мл при 2 7 V . В
качестве
поддерживающей
использовали среду ТС-100, содержащую
5%
СЭК.
Для
препаративного получения рекомбинантных антигенов использовали суспензионную или
монослоиную культуру клеток Sf-21, а также культуру клеток High-Five, адаптированную к
росту в бессывороточной среде SF-900 ("Life Technology", С Ш А ) .
Полевые изоляты
вируса РРСС. Двенадцать полевых изолятов вируса РРСС были
получены из различных регионов центральной России и Белоруссии в период 1992-2000 г. г.
(таблица 1).
Таблицд 1. Полевые изоляты вируса РРСС, полученные из различных
областей России
и Белоруссии,
используемые
для
секвенирования
и
филогенетического анализа.
Наименование изолята
201Rus,92
202RUS.01
203Rus,01
204Rus,01
205 Rus, 01
206 Rus, 01
207 Bel, 01
208 Bel, 01
209 Rus, 86
210 Bel, 01
211 Rus, 01
212 Bel, 01
Место отбора образца
Центральная Россия, 1992
Центральная Россия, 2001
Центральная Россия, 2001
Сибирь, Россия, 2001
Сибирь, Россия, 2001
Алтайский край, 2001
Толочинский район, Беларусь, 2001
Дубровецкий район, Беларусь, 2001
Приморский край, Россия, 1986
Оршанский район, Беларусь, 2001
Центральная Россия, 2001
Лепельский район, Беларусь, 2001
10
Из01яты были
иссчедованы
на аш-игенную специфичность, с
испопьзоваиием
моноклональньтх антител W B E 6 (специфичные к европейскому генотипу вируса
РРСС) и
SD0\V17 (j ннверсальнт.ге, специфичные для дв^тс генотипов вируса РРСС) Проверку на
присутствие других вирусов осуществляли методом ГТЦР В качестве референтного штамма
европейского типа вируса Р Р С С был использован референтный штамм ie/v'orf(предоставил
Dr. Т Drew. Центральная ветеринарная лаборатория ( C V L ) , г Всйбридж, Великобритания) В
качестве полоЖ1ггельного контротя американского гипа вируса РРСС был использован
штамм NADC8 (предоставил Dr. W
L. Mengeling, Национальный институт болезней
животных, (NADC), С Ш А ) .
Штаммы
вируса РРСС и условия их культивирования. Штамм NADC8 вируса РРСС
быт выдепен из сыворотки крови поросенка недельного возраста (К. Lager 1997). Вирус
клонировали
медодом
предельных
разведений
серологическими и молекулярными методами
и
исследовали
вирусологическими,
Вирус адаптировали к размножению в
перевиваемой к)'льтуре клеток метолом серийного пассирования Вирусный материал после
выделения в культуре клеток MARC-145 и однократного пассирования (пассаж 2) был
использован в
настоящей работе под названием NADC8-2. При экспериметггальном
заражении свиней была установлена высокая вирулентность NADC8-2 (W. Mengeling и др
1996, К
Lager и др. 1997, К. Lager и лр.1999). После дополнителыплх 249 пассажей был
по'тучен высоко аттенуированный вирусный штамм NADC8-251 (пассаж 251), который при
экспериментальном заражении свиней не вызывал клинических признаков болезни (W.
Mengeling, 2003). "Пассаж 252Р" был получен через 28 дней после заражения свиньи
штаммом NADC8-251 путем выделения вируса из крови и однократного пассирования в
К)льт}ре клеток. Персистенция вируса в организме свиньи в течение 28 дней соответствует
84 циклам его репликации. Изолят NADC8-252P также является аттенуированным (в меньшей
степени,
чем
NADC8-251),
однако
он
полностью
утерял
высокую
эффективность
репродукции в культуре клеток, сравнявшись по этому показателю со штаммом NADC8-2.
Эксперименты
с ясивотными.
Из 4-недельных поросят (гибрид Yorkshire х Chester
White), выращенных в обычных условиях, сформировали 4 группы по 16 животных и
помести.ш их в разные изоляторы в Национальном центре болезней животных (Эймс, С Ш А )
Поросятам вводили интраназально вирус РРСС в дозе 2 х 10* ТЦИД50: штамм NADC8-2
(группа 4), NADC8-252P (группа 3); NADC8-251 (фуппа 2) и контрольный безвирусный
материал (группа 1) По 4 животных из каждой группы были убиты методом внутривенного
введения пентобарбнтала на 3, 10, 17 и 35-й дни после заражения
Вирулентность
испо1ЬЗОванных для заражения изолятов вируса РРСС оценивали, учитывая следующие
параметры
проявление
клинических признаков РРСС, уровень
и
прололжительность
вирусной репродукции, наличие вируса в сыворотке крови, сероконверсия животных, титры
антител к вирусу РРСС в И Ф А .
Выделение РНК
из клеточных культур, зарамсенных вирусом РРСС. Суммарн>то
Р Н К выделяли из моиослоя зараженных вирусом клеток с использованием тризола (Trizol,
"Life Technology", С Ш А ) no методике производителя.
Выдечение РНК для ОТ-ПЦР проводили с использованием разработанного нами набора
для выделения Р Н К с использованием неорганического носителя (Т В Гребенникова 1999)
Источники
генов белка нуклеокапсида (N). В качестве источника гена белка N
европенского варианта РРСС использовали РНК полевого изоляга "201 Rus 92" , выделенною
из сыворотки крови свиньи, полученной в Воронежской области. Изолят вируса РРСС "201
Rus 92" был выделен в 1992 г. проф Б Г. Орлянкиным, генотипирован и адаптирован к
перевиваемой
клеточной
линии
MARC-145.
В
качестве
источника
гена
белка
N
американского варианта вируса РРСС использовали Р Н К штамма NADC8-2.
Синтез рекомбинантного белка нуклеокапсида (rN) в экспрессионной системе рЕТ.
Для пол)'чения рекомбинантной экспрессионной плазмиды использовали вектор рЕТ23Ь*
(Novagen, С Ш А ) . Ген N-белка (ORF7) получали методом ОТ-ПЦР Очищенный продукт ОТПЦР после расп;епления эпдонуклеазами В а т H I и HindlH встраивали в векторную плазмнду
под контроль промотора фага Т7 таким образом, что нуклеотидная послеловатетьность,
кодирующая
шесть
аминокислотных
остатков
гистилина.
принадлежащая
векторной
плазмиде, оказалась на З'-конце гена белка N в одной рамке считывания Получающийся в
результате экспрессии рекомбинантный белок содержал на С-конпе шесть аминокислотных
осгатков гистидина, что дает возможность очищать продукт метолом металло-аффинной
хроматографии.
Для синтеза белка
нуклеокапсида
вируса РРСС
использовали
штамм Е
соИ
BL2I(DE3)pLy5S (Novagen, С Ш А ) В хромосому этих бактерий включена копия гена РНКполимеразы фага Т7 под контролем промотора lacUVS Ген белка нуклеокапсида находится в
экспрессионной плазмиде под контролем промотора фага Т7
Индукция экспрессии гена
происходит при добавлении в ростовую среду IPTG, блокирующего репрессию гена Т7 РИКполимеразы Трансформацию штамма Е coli BL2I(DE3)pLysS рекомбинантной плазмидой
pET23b*-ORF7 с послел5'гощей индукцией проводили с использованием методики фирмыпроизвод1ггепя (Novagen, Мэдисон, Висконсин, С Ш А ) .
12
Синтез рекомбинантного
белка нукпеокапсида (rN) в бакуловирусной
системе
экспрессии "Bac-to-Bac" Для получения рекомбинантной донорной плазмиды использовали
вектор pFastBacHTa ("Life Technology", С Ш А ) . Ген белка N CORF7) амплифицировали
методом ОТ-ПЦР. По сайтам рестрикции В а т П ! и Hindlll продукт ОТ-ПЦР встраивали в
плазмиду
pFaslBacHTa.
Перед полилинкером
плазмида содержит
последовательность,
кодпр)тош>то 6 гистидинов, что позволяет очищать полученный после экспрессии продукт
методом
металю-аффинной
бакуловирусной ДНК
хроматографии
использовали штамм ЕсоН
Для
получения
рекомбинантной
DHlOBac ("Life Technology", С Ш А ) ,
HecjfflHe геном бакулов1фуса в составе внехромосомного репликона (бакмияы) В
этих
бактериях содержится также плазмида-помошник с геном транспозазы Бакмила содержит
короткую последовательность, гомологичную бактериальному траиспозону Тп7 (mini-attTn7).
Плазчнда
pFastBacHTa
содержит
экспрессионнзто
кассету,
фланкированную
последовательностями Тп7. Рекомбинация между участками Тп7 и вставка 0RF7 в геном
бакуловируса происходит в клетках штамма Е
coli DHlOBac
после трансформации
рскомбннантными донорными плазмндами pFastBacHTa/0RF7.
На основании цветного теста отбирали рекомбинантные клоны. Наличие вставки ORF7
в рекомбинантной бакмиде проверяли методом ПЦР. Выделение ДНК из рекомбинантных
бакхтид
осуществляли
по
методике
фирмы-изготовителя
("Life
Technology",
США).
Очищенные рекомбинантные бакмиды использовали для трансфекиии культуры клеток.
Трансфекциго проводили с использованием липофекгина ("Life technology", С Ш А ) по
методике изготовителя Рекомбинантный вирус хранили при +4°С в среде, содержащей 2 %
СЭК.
Очистка рекомбинантного белка иуклеокапсида вируса РРСС.
Очистка
в денатурирующих условиях Клеточная или бактериальная масса была
собрана ннзкоскоростныч центрифугированием и промыты фосфатно-солевым буфером (рН
7,4). Затем собранные клетки лизировали при интенсивном перемешивании в буфере (8 М
мочевина, 0,1М NaHzPO,, 0,01 М Трис, рН 8,0). Полученный раствор центрифугировали при
13 000 g в течение 15 мин при +4°С, надосадок смешивали с 2 мл уравновешенной
лизирутошим б)фером носителя фирмы «TALON» («TALON Metal Affinity Resin», С Ш А ) и
инкубнровали в течение 20 мин при комнатной температуре. Для промывки носителя
использовали буфер (8 М мочевина, 0,1М NaH:P04, 0,01М трис) рН 8,0 и рН 7,0. Элюцию
проводили при разной кислотности раствора (рН от 6,3 до 4,5).
препаратах определяли спектрофотометрически
13
Концентрацию белка в
Очистка
в неденатурирующих условиях Клеточную
или бактериальную
массу
лизировали в буфере, содержащем 20 мМ Трис-НС1, 300 мМ NaCI. 10 мМ имилазола, 1 мМ
PMSF,
1 % тритона Х-100 рН 8,0. Полученный лизат разруи|али с
использованием
ультразвукового дезинтегратора 3 раза по 30 сек и центрифугировали при 10 000 g в течение I
ч. Супернатант отбирали и смешивали с Ni-NTA агарозой из расчета 1 г бакмассы на 1,5 мл
Ni-NTA агарозы. Затем инкубировали во льду в течение 2 ч при перемешивании и 16-18 ч
при +4 С
Агарозу промывали буферами, содержащими повышающиеся концентрации
имидазола (10, 20, 50 мМ соответственно). Элюцию проводили буфером, содержащим 250
мМ имидазола. Концентрацию белка в препаратах определяли спектрофотометрически
Оценка
антигенной
активности
рекомбинантного
белка
иуклеокапсида.
проводилась методом непрямого И Ф А с использованием моноклональннх антител W B E e
или SD0W17 и референтных сывороток.
Сыворотки. Использовали ранее проверенные на наличие специфических антитет к
вирусу РРСС с использованием набора «HerdChek enzyme-linked immunosorbent assa>»
фирмы ГОЕХХ, ( С Ш А ) . Использовали сыворотки крови от свиней, полученные из ЗАО
«Омский Бекон», а также референтные отрицательные сыворотки, полученные от Dr S.
Belak (Национальный институт ветеринарии, Швеция).
Антитела
к
рекомбинантному
определяли методом непрямого И Ф А . В
белку иуклеокапсида
в сыворотках
свиней
качестве антигена яля сорбции на планшет
применяли очищенный рекомбинантный белок rN
Результаты И Ф А
выражали в виде
величины К:
К = (Ас-А„,р )/ (А„„, - А„^)х 100,
где:
Ас - поглощение при Х= 450 п т в лунке с исследуемой сывороткой,
Aoip - поглощение при Х= 450 пга в лунке с отрицательной сывороткой
Апол - поглощение при h= 450 nm в лупке с положительной сывороткой
Амплификация
генома
вируса РРСС
методом
обратной
траискрипциии и
амплификации (ОТ-ПЦР). Реакцию ОТ-ПЦР проводили в одной пробирке (Sellner L N et al.
1994) Реакционная смесь, конечным объемом 100 ц1, содержала 1 \ig Р Н К , 100 pmol каждого
праймера, 2 5 ед полимеразы TaqI (Life Technology, Grend Island, С Ш А ) , по 250 цМ каждого
dNTP, 2,5 ед. обратной транскриптазы M M L V (Life Technology, Grend Island, США), 10 мМ
Tris-HCI, (рН 9 0 при 25°С), 50 мМ KCI, 0 . 1 % Triton Х-100, 1 5 мМ MgCb Использовали
след)ющне параметры ОТ-ПЦР: 50''С- 1 час - I цикл ОТ, 94°С - 30 с. - 50-54''С - 30 с, 72°С 60-90 с (для последнего цикла - 7 минут) - 25 циклов ПЦР.
14
ПЦР хтя диагностических исспедований проводили в объеме 25 |il Реакционная смесь
солсржата 5 ц) РНК, выделенной на неорганическом носителе, 10 pinol каждого праймера, по
250 ( J M каждого dNTP, 0.63 ед полимеразы TaqI, 0,063 ед. обратной траискриптазы M M L V
(IJfe Technology, Grend Island, США), 10 мМ Tris-IICl, (рН 9 0 при 25''С), 50 мМ КС1, О 1 %
Triton Х-100. 1.5 мМ MgCb Использовали следующие параметры ОТ-ПЦР: 50"С- 1 ч - 1 цикл
ОТ, 94°С - 30 с, 54°С - 30 с, И^С - 30 с (для последнего цикла - 7 минут) - 25 циклов ПЦР
Дзя проведения "гнезцовон ПЦР" в > ачествс матрицы использовали 5 ц1 реакционной смеси
посте прорезсния ОТ-ПЦР Соотнои "ние циклов амплифнклции и реамплификацин било 1 1
Ираймсры для определения РНК вируса РРСС и филогенетических исследований
разрабатывапи на основании сравнс! ня первичной структуры геномов референтных и1таммов
вир\са РРСС Lelyslad (европейский тип вируса РРСС) и VR2332 (американский тин вируса
РРСС) с использованием компьютерных программ AssemblyLign (Oxford Molecular Group
PLC, США), Oligo
версия 4.0, Amplify
версия
1.0. Праймеры для диагностических
исследований методами ПЦР и ПЦР в реальном времени были разработаны на участки гена,
кодирующего нуклеокапсидный белок вируса РРСС (0RF7)
Амплификация
генома вируса РРСС
методом
ПЦР
в реальном времени. Для
конструнроватшя тест-системы ПЦР в реальном времеш! иснопьзовалн данные о первичной
структ5'ре геномов референтных штаммов Lelyslad
и VR2332. Для ПЦР использовали
универсальные праймеры. специфические к американскому и европейскому генотипам вируса
РРСС. После проведения ПЦР в реальном времени попучапи фрагменты 105 п н (для
европейского штамма вируса РРСС) н 96 п н (для американского штамма вируса РРСС)
Дифференциацию проводили с пгчощыо молекулярных олигонуклеотидных зондов, с
различными фтуоресцентными красителями на 5' концах
Реакционная смесь конечным
объемом 25)il, содержала 2-5ц1 РНК, выделенной на неорганическом носителе, по 300 цМ
каждого dNTP, 400 пМ каждого пра'.Ыера, 100 пМ каждого зонда, 0,63 ед. ггалимеразы TaqI
(Life Technology, Grend Island, С Ш А ) , 0,125 ед обратной траискриптазы AMV-RT (Life
Technology, Grend Island. С Ш А ) , 10 ед рекомбинантного RNAsin, 10 мМ Tris-HCI, (рН 9 О при
25°С), 50 мМ КС1. О 1 % Triton Х-100, 1.5 мМ MgCb и 60 пМ R O X . Использовали следующие
параметры ОТ-ПЦР 48°С- 30 мин, &5"С - 10 мин, - ОТ и 40 циклов ПЦР (95°С -15 с, бО'С - 1
мин (для поспеднего цикла - 7 мин). Реакцию ОТ-ПЦР проводили в 0Д1юй пробирке Для
опредепения ч> вствительности ис юльзовали
1000, 100, 10, 1 ТЦДЬо/мл
результат регистрировали на экране монитора ( А В ! prism, С Ш А ) .
15
Полученный
Определение иукпеотидиой последовательности продуктоп амплификации генома
вируса ГРСС.
Геномы вирусов были амплифнинровачы в виде 14 перекрывающихся
фрагментов для каждого вируса. Продукты ПЦР быги очищены в агарозном геле, с
использованием набора для очистки продуктов ПЦР (Gcncclean. С Ш А ) и секпенировапы Дзя
получения усредненной (consensus) последовательности каждый нуклеотил был подтвержден
как минимум в результате анализа 2-х независимых продуктов ПЦР на дв^тс цепях ДПК.
Праймсры для получения продуктов амплификации и се' веннрования были разработаны на
оснопании анализа первичной структ>'ры геномов двух референтных штаммов вируса РРСС'
16344В и VR2332. Они располагались на расстоянии примерно 200 нуклеотидов по каждой
цепи ДИК, так что расстояние между соседними праймерами на соседних цепях было
примерно 100 нуклеотидов. Определение первичной стру1.туры проводили на автоматическом
ссквсиаторе ДНК ( A B I 377, CIIJA) и анализировали с использованием компьютерных
iipoi рамм MacVcclor/AssemblyLign (Oxford Molecular Group P L C . С Ш А )
Определение первичной
иипаммов вируса РРСС.
структуры
концевых фрагментов
генома
рапичных
Продукты амплификации концевых участков трёх вирусных
геномов штамма NADCS были получены на матрице вирусной Р Н К с использованием
наборов 3' R A C E н 5'RACE (Life Technologies, С Ш А ) по методике производ1ггеля Вирусную
Р Н К выделяли из монослоя зараженных вирусом клето-. с использованием тризола (Trizol,
"Life Tcclinologies,", С Ш А ) Продукты ПЦР были клонированы в Е coU по стандартной
методике. Отбирали по 15 независимых клонов для каждого продукта ПЦР
Каждый
отобран1н.н1 клон секвенировалн для определения точной последовательности 5' н 3'-кон1гов
генома вируса. Определение первичной структуры провопили на автоматическом секвенаторе
ДПК (ЛВ1 377, С Ш А ) и анализировали с использованием компьютерных программ.
Компьютерный
исрвичной
структуры
анализ
последовательностей
геиомои
проводили
с
генома
|ю-'1пи.ю
вируса
РРСС.
компьютсрт.тх
Анализ
программ
MacVcctor/AssemliljI ign (Oxfoid Molecular Group PLC, ( И1Л) версия 6 0 Фило1емстимсское
родство определяли с помощью пакета компьютерных лрограмч P H Y I IP версия 3 '^с Дзя
фплтспсгичсского аначиза на основе генетических ди^ганций применяли так называемый
cneiglibor-joninR» метод (I elsenstcin 1989) Посфоснис фгзогенетнческих деревьев проводнпн
с мспользоппнисм npoipaMM D R A W I R L E
и D N A G I ' A M M . а также пакета программ
DNASTAR
Сборка полнора1мгриой котт
вирусного гено^'а Для сборки 1снома использовати
векгор pACYC177 (New England Riolab<;, С Ш А ) Вектор молнфинировали. уладив фрагмент,
16
ограниченный сайтами ресгрикции Aval, Xhol
Были синтезнрованы комплементарные
олнгон\клео1нды. образовавшие после отжига полилинкер, содержащий следующие сайты
Aval-BamHI-Xbal-Xmal-Spel-XhoI. Фрагме1гг встроили в плазмиду pACYC177 и получили
вектор pACYC177(MCS+), содержащий менее 2 тыс нуклеотидных пар, пригодный для
сборю! вир}сного генома. Сборка вирусного генома осуществлялась последовательным
переклоннрованиеч 3-х фрагментов вирусного генома и прямым клонированием продукта
ПЦР (4-го фра| мента)
Синтез
паноразмерной
геномной
РНК
вируса
РРСС.
Плазмиднуго
ДНК
переводили в линейною форму с использованием рестрикциониой эндокуклсазы Spel (Life
Technology, С Ш А ) . Лннейнух) Д Н К обрабатывали протеиназой К для удаления РНКаз и
других ингибиторов транскрипции. Реакция транскрипции проводилась с помощью набора Megascript'" High Yield Transcription Kit (Ambion, С Ш А ) в соответствии с HHcrpjTcuHefl
производителя. Реакция транскрипции останавливалась добавлением 8М раствора LiCl до
концентрации З М
После перемешивания и инкубации при -lO'C в течение 1 часа
центрифугировали при -^4''C, при 13-14000 g в течение 15 минут. Осадок промывали 70%
этанолом и растворяли в воде, свободной от нуклеаз (15-20 ц1). Концентрацию Р Н К
определяли спектрофотометрически.
Трансфекция клеток MARC-14S и ВНК-21 геномной РНК вируса РРСС. Реакцию
проводили в соответствии с методикой производителя по следующей схеме: 2 ng
очпшенной Р Н К смешивали со 100 р1 D M E M ; в отдельной пробирке смешивали 7-12 р1
CellFECTTN* Reagent (Life Technologies, С Ш А ) с 100 ц1 D M E M . Оба раствора смешивали
между собой и инкубировали при комнатной температуре в течение 30-45 минут. Клетки
промывали
бессывороточной
средой
DMEM.
К
смеси,
содержащей
комплекс
CellFECTrN*Reagent-PHK, добавляли 1.8 ml бессьгаороточной среды D M E M и наслаивали
на промытый буфером P B S клеточный монослой. Клетки инкубировали в COj-инкубаторе
при 37°С 10-24 ч Затем меняли РНК-содержащ)'Ю среду на 4-5 ml ростовой средн. Ростовая
среда содержала глутамин (0.3 mg/ml), антибиотики (пенициллин и стрептомицин в
стандартных концентрациях) и 5-7% F B S (Life Technologies, С Ш А ) .
Э1ектропорация
клеток
MARC-145 и ВНК-21 геномной РНК
«ируса РРСС.
Однодневный клеточный монослой, полученный с одного культурального матраса (75 см >,
отбирали с использованием трипсина (4.5 ml), трипсин нейтрализовали D M E M (9 ml).
Клетки осаждали центрифугированием при 1500-2000 g, 15 минут при -^4 С и дважды
промывали I x P B S Клеточный осадок ресуспенлировали в 1.5 ml однократного P B S (или
17
Hypoosmolar Electroporation buffer, Eppendorf, Германия) Помешатп 400-450 (il клеточной
суспензии в кювету для элекгропорации эукариот (расстояние между электродами 2-4 мч) и
добавляли 13-15 ц1 очищенной РНК. Кювету помещали в электоропоратор (Eppendorf.
Германия) и пропускали импульсный разряд со слел)'юшимн параметрами электропоращпг
напряжение - 500V, время - 22рцз, число импульсов - I.
После твлечения кюветы из
электропоратора добавляли в кювету 0.5-1 ml D^'ГEM. В культуральный матрас (25 cv")
добавляли 5 ml D M E M и смесь из кюветы Инкубировали в течение 12 ч при 37 С в СОгинкубаторе.
Выявление вируса РРСС в клеточных культурах. Определение Р Н К вир\са РРСС
[фоводнли с исгюльзованием ПЦР. Иммунофлуорссцентный анализ был использован дчя
обнаружения
вирусных
белков
и
динамики
накопления
вируса
при
пассировании.
Зараженные культуры клеток (2-й и 3-й пассаж) либо замораживали-оттаивали, либо снимали
монослой трипсином. Капля суспензии клеток в ростовой среде помещалась на предметное
стекло. Для адсорбции клеток на поверхности стекла проводилась инкубация при ЗТ'С, в
течение 2 часов в СОг-инкубаторе После адсорбции промывали клетки P B S и фиксировали в
ацетоне (5 минуз при -20 С), просушивали, добавляли 25 ц1
специфичной
к
американскому
типу
вируса
РРСС
сыворотки крови свиньи,
(разведение
1:10
в PBS)
или
моноклональные антитела SD0W17. Инкубировали 30 мин при 37'С в С02-инк\баторе.
Промывали два раза P B S
и высушивапи в термостате при 37''С
Добавляли 25 ц1
иммунофлуоресцентного конъюгата (anti swine IgG FITC-labeled, разведение MOO) ("KPL"',
С Ш А ) и инкубировали в течение 30 мин при 37°С в СОг-инкубаторе Результаты учитывали в
иммунофлуоресцент)гом микроскопе под водной или PBS-глицерпновой иммерсией.
Проведение микроэлементного анализа инфицированных и неинфицированных
клеточных культур. По 1 ml культуральной среды и суспензии клеток с от^)К1того монослоя
(1,5 10* клеток/ml) растворяли в равном объеме царской водки (смесь НС1 и HNOs в
соотношении 3 1) и инкубировали в течение 1 CJTOK В полипропиленовых пробирках при
комнатной температ>'ре
Далее минерализацию образцов проводили под дав1ением в
микроволновой печи MDS2000 в тефлоновых бомбах при следующем режиме' 2 мин 20 с при 80% мощности, 5 чин - при 100% мощности
Во всех опытах вели обработку и
последующий анализ независимых экспериментов Параллельно микроэлементный анализ
проводили в неинфицированных клетках и образцах свежей ростовой среды дня учета
содержащихся в ней микроэлементов
18
Содерзкание металлов в минерализованных образцах определяли с помощью атомноабсорбционного
спектрометра
«SpectrAA-800»
эффектом Зеемана по протокол)
с
электротермической
атомизацией
и
фирмы "Varian" с модификациями по результатам
международной интеркалибрации о лабораторией M E L М А Г А Т Э (Монако). Источником
излучения служили одноэлементные лампы с полым катодом SpectrAA фирмы "Varian". Ток
ламп для элементов Ni, Си - 4,0 шА для А1 - 10mA; Мп, Zn - 5,0 mA; для Сг - 7,0 т А . Ширина
щели монохроматора составляла при измерении А1, N i , Си, Zn - 0,5 nm, а при измерении Сг,
Fe, Мп - 0,2 nm. Осуществляли релим коррекции базовой линии и горячий впрыск - 80 °С.
Использовали следующие длины волн (резонансные линии) и модификаторы: А1 - Я.=39б,2
nm, Mg(N03)2; Ni - Я.=232,0 nm, Mg(N03)2; Сг - X=357,9 nm, Mg(N03)2; Mn - Я=279,5 nm,
Mg(N03)2; Fe - >^248,3 nm, Mg(NOЛг; Cu - X.=327,4 nm, Pd(N03)2; Zn - X=307,6 nm, Mg(N03)2.
Относительное стандартное отклонение при определении с доверительной вероятностью 0,95
не превышало 20%, Средние относительные ошибки результатов трех-пяти повторных
измерений указаны на рисунке 11.
2. 2. Результаты исследований
Разработка методов диагностики Р Р С С
В качестве первого шага, направленного на разработку средств диагностики РРСС,
было проведено изучение распространения вируса РРСС на территории России и Белоруссии
Были проанализированы 342 сыворотоки крови свиней, полученные из 46 хозяйств России и
Белоруссии в 1993-2001 г.г. Были проанализированы 29 районов из 23-х областей России и 16
районов из 6-и областей Белорусси i. Для обнаружения специфических антител против вируса
РРСС на начальном этапе испо шзовали коммерческий набор «HerdChek enzyme-linked
immunosorbent assay» фирмы Ю Е Х Х
(США). Результаты анализа показали широкое
распространение вируса РРСС в xoiЯЙcтвax России (79%) и Белоруссии (81%) (таблица 2)
Таблица 2. Результаты проведенного мониторинга хозяйств России и Белоруссии на
наличие антител к вирусу РРСС.
Страна
Россия
Белоруссия
Определение антител к вирусу РРСС с использованием набора
«HerdChek enzyme-linked immunosorbent assay»
Положительных
Отрицательных
Общее к-во проб
94
224
111
118
73
45
19
Необходимо отметить, что антитела к данному вгрусу встречались практически во
всех возрастных группах животных, включая 2-3-дневных поросят, поросят-отьемышей и
супоросных свиноматок.
После проведения данного мониторинга было сде/ано заключение о необходимости
разработки отечественных средств выявления вируса РРСС и антител к нему.
При разработке средств определения вируса мы учгтывали, что вирус РРСС отличает
высокая вариабельность. У двух типов вируса (американского и европейского) наблюдается
вариабельность первичной структуры генома до 60%. Обширные территории Российской
Федерации позволяли предполагать наличие обоих
генотипов вируса. Поэтому для
конструирования универсальной тест-системы для опргделения Р Н К вируса РРСС мы
выбрали модификацию ОТ-ПЦР, называемую "множественной" Такая модификация ПЦР
позволяет определять два различных генотипа вируса в одной реакции. Известно, что РРСС
является генерализованной инфекцией. Для выявления Р Н К вируса используют такие пробы,
как кровь, сперма, органы и ткани организма. Содержанг^ вируса в данных образцах может
быть очень низким, следовательно, необходимо было разработать высокочувствительную
методику определения. Использовали «гнездовую ПЦР» которая в несколько раз повышает
чувствительность
реакции
в
сравнении
с
одностадийной
ОТ-ПЦР.
Аналитическая
чувствительность тест-системы позволяла выявлять 10 копий Р Н К в пробе. Диагностическая
чувствительность тест-системы ПЦР составляла примерно 1-10 ТЦДзо/мл. Разработанную
тест-систему сравнивали с тест-системой Центральной Европейской референтной лаборатории
(Вейбридж, Великобритания) с использованием более 300 образцов. Получили
100%
совпадение положительных и отрицательных проб.
Были проведены широкие производственные испытания отечественной тест-системы
для обнаружения вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (РРСС)
методом ПЦР и утвержден комплект документации (наставление по применению от 07. 10. 02
№
13-5-02/599 и Т У № 9388-002-42418073-02) для использования разработанной тест-
системы в диагностических лабораториях.
В
ходе широкого производственного испытания в течение 2002-2004 гг были
исследованы образцы крови, спермы и органов свиней различных возрастов из 41 района
России и 19 районов Белоруссии. В 49% хозяйств Российской Федерации обнаружили вирус
РРСС, в Белоруссии мы зарегистрировали наличие вируст в 53% хозяйствах (рисунок 1). При
подсчете положительных и отрицательных результатов, мы получили 16% положительных
проб в России, и 30% - в Белоруссии (таблица 3). Исследование поросят разных возрастов
20
показало, чго среди niix был о6к..,))жс11 вчрус в 26% стучаеп в России и в 3 5 % ci.jMaen к
Белоруссии (табч.'иа 3). По данньм исслсловатслей и* Kopeii, у поросят с респнр, юрными
заболеваниями wiiap)живали вир)с РРСС в 12 - 42% случаев (Hariiis ct al. 2001, Choi et al
2002, Kim el ai 2003) Как в России, так и в Белоруссии больший процент выявляе IOCTH
вируса РРСС пр; \одится на порос IT, ПО сравнению с выявляемое гью у взрослых животных.
Россия
49%
Белоруссия
51%
41 хозяйство
53%
47%
Ш
Выявлен вирус ЯРСС
□
Не вияЕлеи вирус РРСС
19хпяйств
Рисунок 1 Р е з у л ь т а т ! выявления вируса Р Р С С в хозяйстт.ах России и Белоруссии.
Таблица 3. Реззльтагы определения вируса Р Р С С [исюлом 1ТЦР в сыворотках
Kpoun и органа", животных я хс ,яйггоах России и Белоруссин
Взрослые животные
Россия
Белоруссия
Порося га
Россия
Бморуссия
Опре,' апетк вируса РРСС мei•oдoм ПЦР
] Отрииатсльных
ОбШ( к-ЕО проб
1 Положительных
К-во
1 К-во
Г "А
'" %
2024
300
1
1
324
90
1
1
16
30
1700"~
210
,
84
70
1020
350
1
1
265
173
1
26
iS
2?7
74
65
Исследования показали, 4i0 чувствитгльность и слеиифичносгь разработаниг'й тестсистемы позволяют с успехом опредрлять Р Н К .зир\са РРСС в сперме животных, что
явтяеття суш,ественнь1М иреимуи 'стпом метода ППр.
В ходе исс;;едован11я бы а также разработана тест-система для определения РНК
вируса РРСС методом ПЦР в per 1Ьном времени (Real time PCR) Назнааис офяжает обший
смыст новой модификации Рез льтат ПЦР в реальном врсмснч можно регис(рмровать в
процессе реакции, в калдый мо'.ент времени. Кроме двух пряймеров, тест-система ПЦР в
21
реальном времени содержит дополнительный зонд, комплементарный внутреннему 5'частку
фрагмента. К зонду ковалентно пришиты два химических соединения- флуоресцентная метка
(«reporten>) и гаситель флуоресценции («quencher»). В ходе синтеза Д Н К зонд подвергается
гидролизу за счет 3'-5' экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы Taql. что приводит к
количественному увеличению флуоресцентного сигнала. Регистрируя прирост интенсивности
свечения, исследователь может узнать о ходе реакции без дополнитетьной стадии электрофореза Тест-система на основе ПЦР в реальном времени, представленная в данном
исследовании,
состоит
из
пары
универсальных
праймеров
европейского и американского генотипов и двух зондов
для
опредепения
РНК
Один зонд комтементарен
(гомологичен) фрагме1гту генома американского генотипа вируса и содержит F A M в качестве
флуоресцентною красителя Другой зонд комплемен гарей фра1мемту генома европейского
генотипа вируса и содержит другой флуоресцентный краситель - V1C. Данная тест-система
на основе ПЦР в реальном времени является универсальной, в ходе одной реакции можно
определить Р Н К двух генотипов вируса РРСС. Аналитическая чувствительность ПЦР в
реальном времени для разработанной тест-системы составляет 10 копий РНК в пробе
Диагностическая чувствительность ПЦР в реальном времени не ниже, чем чувствительность
«гнездовой ПЦР»,
разработаннзто
и составляет
I
ТЦДзо'мл. Это
методику для проведения массовых
дает возможность
диагносп»ческих
рекомендовать
исследований в
хозяйствах.
Было показано, что с использованием ПЦР в реальном времени можно проводить
количественное определение вируса РРСС. Для сравнительной калибровки использовали
ппазмиду, содержащую полноразмерный геном вируса РРСС. На магрицс плазмиды был
проведен
синтез
полноразмерной
РНК
вируса
РРСС.
Количество
РНК
измеряли
спеетрофотометрически, затем раститровывали (в десятикратных разведениях). Проводили
ПЦР в реальном времени на матрице Р Н К в различных разведениях
Для построения калибровочного графика использовали величину С^, так называемого
порогового цикла (номер первого цикла, в котором происходит увеличение флуоресцентного
сигнала репортерной группы по сравнению с уровнем фонового сигнала (рисунок 2 а). После
построения калибровочной зависимости величины С, от исходного количества копий
стандартов (LogN) для каждого из стандартов, можно вычиспшь неизвестное исходное
количество копий в анализируемых образцах с помощью интерполяции (рисунок 2 б)
22
Ill
|i]|i|jj]j|j|||m]j[|ia
1pll
1
1Ш1Я
MiMiJ'WIiKln if
10* копий
10'копий
10* копий
10* копий
10'колий
\
:ч
Ю' копий
liwiHiRiwl lilil
iii iiiiiiiiii
10^ копий
\
•\
а
б
PHCJHOK 2 Результаты ГОДР в реальном времени на матрице референтной полноразмерной
Р Н К вируса РРСС в 10-кратных разведениях (от Ю' до 10^ копий плазмнды) (а).
Калибровочный график, построенный на основании диаграммы «а»,
позвопяющий определять количество вируса в пробе (б).
На следующем этапе исследовали молекулярные характеристики вирусных изолятов,
выделенных из хозяйств России и Белоруссии и проводили сравнительный анализ первичной
структуры их геномов Из 12 хозяйств России и Белоруссии были выделены вирусные
изоляты (табпица I) в к)'льтуре клеток альвеолярных макрофагов
Для филогенетического анализа мы использова.чи ген н>тслеокапсидного белка (ORF7),
который отличается бопьшей консервативностью первичной структуры, нежели остальной
lenOM. С лр\гой стороны, в области гена 0RF7, наряду с консервативными областями,
с)шес1и\-ют вариабельные области, сравнение которых позволяет проводить филогенетические
исспедования вирлсных изолятов
Как видно из pncj нка 3, все изоляты вируса РРСС можно подразделить на две большие
гр5ппьг американский генотип и европейский генотип. Филогенетические исследования
показали, что все выделенные нами вирусные изоляты на территории России и Белоруссии,
относятся к европейскому генотипу вируса. Даже поверхностный анализ указывает, что
выдс1енные нами изоляты близки к вирусам, циркулирующим в Испании Не было выделено
ни одного изолята американского генотипа вируса РРСС
К сожалсншо, в настояшее время не разработано единой международной системы для
из5'чения филогенетических отаошений между штаммами вируса РРСС. Попробуем оцентъ
пол^-ченные
результаты
Если
из)'чить
филогенетическую
дендрограмму
(рисунок
подробнее, то все европейские штаммы вируса РРСС делятся на две большие подгруппы
23
3)
France II V I , IX
UK N01
Franct 225
NL Boxler 10
Рисунок 3 Филогенетические отношения штаммов
вируса
РРСС,
выделенных
на
территории России и Белоруссии и
штаммов, выделенных в Европе и
Америке (полевые изоляты из России
и Белоруссии обведены рамкой)
UKNY4
UK HAI
LELYSTAD VIRL
Polmd 24 07.3 07
Depmari: 1H92
UKBEl
UK LEI
France
Spam VACCINF
Franct 151.296
Poland 11 07
Poland 4 07
UK N Y )
UKU
UKH3
France 292
Spain5710CI.
Spam 2!344.222t
Spam 4606
Spam РОЗ 5,5999
Spam 3211
Spain 2156
Spam AV30,92VO<8
Spam 705
Spam NL3-1
Spam 8d <a
<;pamffa
203 Rin.OI
209 RiM 86
206 Rus, 01
202Kus,OI
212 Bel.OI
207 Bel, 01
201 Kus,92
211Rir>.01
20! Bel.OI
204 Rm.OI
210 Bel.01
305 Rus.Ol
USILI
US1A6
China la
l>S3927.ISlil
US K Y I
US MOl
US SOI
USIAI
Canada 807/94. QuS
Canada lAF E.\P
Chma MDOI
LSMNl
TTiaTljnd Fl I
USU79
US KSl
USISU53 ISUl
US 1S94, ISU2
DK 516/1
N,\DC8
Denmark 350
DK 516.2
US ISU22
Chma SI
USNebl
Canada PAS
USNFl
US VR23J2
24
в одну подгр5Ш1у входят штаммы вируса РРСС, выделенные в Германии, Франции,
Встмкобр1гтанни. Голландии и Польше В эту же подгруппу входит испанский вакцинный
штамм
Друпто подгруппу составляют полевые нзоляты вируса РРСС, выделенные в
Испании, России и Белоруссии.
Итак, первичная структура гена, кодируюгцего белок нуклеокапсида большинства
российских н белорусских полевых изолятов, ближе всего к первичной структуре испанских
изолятов вируса РРСС. Подгруппа, включающая российские, белорусские и испанские
полевые изоляты также показывает некоторую неоднородность. В ней можно различить две
более мелкие с)бгр)'ппь]. В
одну входят испанские изоляты, 4 российских
изолята
(выдепенных из центральной России, Алтайского края, и Приморского края) Во вторую
су6гр\ппу входят тотько бспорусские и российские изоляты Полученные данные совпадают
с рез>льтатами исследования, проведенного во Всероссийском институте защиты животных
( Ф Г У ВНИИЗЖ, Владимир). Так, выделенные в институте российские пггаммы вируса РРСС,
также принадлежали к европейскому генотипу (Andreev V. G. et з1. 1997).
Более подробные филогенетические исследования были проведены с использованием
данных о первичной структуре геномов некоторых европейских генотипов вируса (рисунок 4)
с пспотьзованисм данных Центральной Европейской референтной лаборатории (Вейбридж,
Великобритания).
Прежде
всего,
необходимо
отеппъ,
что
мы
наблюдали
довольно
высокую
консервативность гена 0RF7 у изолятов европейского генотипа, выделен1п>1Х на территории
России и Белоруссии. Вирусы, изолированные на территории России и Белоруссии, можно
раздел1пъ на три отдельные подгруппы В первую cy6rpjTmy входят изоляты, циркулир5'1С(щне на
Teppirropnn центральной России, на террт^ории
Алтайского края и
вирус, полученный из
Приморья, из образцов 1986 года Все они оказались близки к европейскому штамму Lelystad,
который в настоящее время считается референтным цггаммом, и также к другим испанским
штаммам вирзса РРСС Они близки и к штаммам U K NY4 и U K L2, изолированным в
Великобр1ттании. Следовательно, в 90-х годах на территории Приморья циркулировал иггамм,
родственный штамму Lelystad. выделенному в 1991 году в Нидерландах. Ко второй субфуппе
можно отнести штамм, циркулирующий в Сибири Он также близок к испанским и английским
изолятач! В третью с)-бфуппу входят изоляты, шфк}'лирутошие на территории центральной
России, а также все белорусские изоляты Они имеют блткие филогенетические отношения с
испансктти вирусными изотятами, а также в этой субгруппе есть один родственный изолят UK
R A 1 , вылетениый на территории Великобритании.
25
£
SpRin 5а
SpamM
SpamNLl I
Spatn6i
Рисунок
4
Филогенетические
отношения
штаммов
вируса
РРСС,
выделенных на территории России
и
Белоруссии
(выделены)
и
штаммов, вылелснных в Европе
(данные о первичной структуре
генов
европейских
изолятов
предоставлены Dr Т. Drew н Dr. Т.
Stadejek).
20)Ri»,0I
211 Rui.Ol
fd
rtf
<—
-
UKHAI
208 Bel, 01
204Rui,0I
f
20SRi»,01
Spun AV30
S|Mm92V05l
41!!
f-l
rC
201 Rui.W
107 Btl.l)l
210 Bel, 01
212 Bel. m
Spein 705
1Жи
LEIYSTAD
202 Rus. 01
206Rlls,0.
209 Rui. Ы
25DIC
Spam 214
ruI
-Q
Spam 2228
Spam 4606
CZT
SpimVACCIVE
Pcland ) 07
Spain 21344
SpiunS7IOCL
Spam S999
Spam TO35
Poland 24 07
Spam 3211
Poland 4 07
76
Интересно, что на территории центральной России в 1992 и в 2001 г.г. циркул1фовалн
близкородственные вирусы, вхоляшие в третью подгруппу Вирусы, изолированные в Польше,
26
11х)еют 6oiee отдаленные филогенетические отношения ко всем российским и бепорусским
штаммам, представленным в данном исследовании.
С нашей точки зрения, нельзя с уверенностью утверждать, что на территории России и
Белоруссии циркулирует только европейский тип вируса РРСС Возможно, в дальнейшем мы
сможем выдел1пъ изоляты американского типа вируса РРСС. Применение живых вакцин на
ос1юве американского штамма вируса РРСС в Дании привело к его распространению на
севере Европы (Bother А. et al. 1997, Madsen К. G. et al. 1998).
В настоящее время, в Европе циркулируют как европейские, так и американские
штаммы вируса (Bother А et al. 1997, Madsen К G. et al 1998) С другой стороны, в Америке
были обнар>жены европейские штаммы вируса РРСС (Bautista Е. М. et.al. 1993; Dewey С
et al. 2000) Было сообщение о выделении североамериканского изолята в России (Андреев В.
Г и др 1999), однако данное сообщение, представленное в тезисах конференции, не получило
развитие в дальнейших публикациях.
Для проведения мониторинга хозяйств на территории России и Белоруссии.была
разработана универсальная тест-система для определения антител к вирусу РРСС. Для этого
были получены рекомбинантные белки нуклеохапсида
(N) вируса РРСС американского и
европейского типов в двух системах экспрессии - эукариотической (бакуловирусной) и
прокариотической (Е СоИ) (рисунок 5) Высокие титры антител к белку N обнаруживают у
всех больных животных (Plana-Duran et al 1997; Wootton et a l , 1998; Dea et al 2000; Witte et
al. 2000), поэтому данный белок использовали для диагностики. Рекомбинантные белки были
очищены
с
использованием
аффинной
хроматографии,
идентифицированы
в
HMMj-HOXHMHHecKHX реакциях с рефериггными моноклональными антителами и проверены в
иммунофермеетном анализе. В качестве компонента тест-системы для диагностики антител к
вирусу
РРСС
был использован рекомбинантный белок н5тслеокапсила вируса
РРСС
европейского типа, синтезированный в системе экспрессии Е coU
В результате был разработан универсальный набор реагентов для определения антител
к вирусу РРСС в сыворотках больных и переболевших животных методом И Ф А «РРСССЕРОТЕСТ». Были проведены широкие производственные испытания тест-системы и
лтвержден комплект док)'ментации (наставление по применению от 12.18 05 № 1-1.5/01446 и
ТУ
№
9388-012-42418073-04)
для
использования
диагностических лабораториях.
27
разработвнной
тест-системы
в
0RF7 Американский генотип
0RF7 Европейский генотип
система
экспрессии
Бакуловирусная
Клонирование
система экспрессии
ЕсоИ (рЕТ)
Ml-jiiiiiiMiL
Трансформация
штамм £ со//BL21(DE3)pLysS
клетки Е coli DHlOBac,
несущие геном бакуловируса
Трансфекция клеток насекомых
1
Рекомбинантный белок
Рекомбипантный белок
Очистка рекомбинантных
белков методом металлоаффинной хроматографии
Рисунок 5 Получение рекомбинантных белков нуклеокапсида в прокяриотическон и
бакуловирусной системах экспрессии (схема)
Сравнительный анализ результатов определения антител к вирусу РРСС набором
фирмы I D E X X
(США)
корреляции между ними
и
«РРСС-СЕРОТЕСТ»
(Россия)
свидетельствует
о
хорошей
значения чувствительности и специфичности набора «РРСС-
СЕРОТЕСТ» составляют, соответственно, 94,8% и 95,3%
28
Однако, набор фирмы 1DEXX
(CIJIA) разработан с использованием цепьного вирусного антигена. Применение в наборе
«РРСС-СЕРОТЕСТ»
рскомбинантного
антигена
позволяет
избавт'ься
от
ложнопопож1ггельных реакций, а, следовательно, повысить качество набора. Разработанный
набор реагентов прошел широкие проюводственные испытания, зарегистрирован для
нспопьзовання в России, )твержлена постоянная документация. «РРСС-СЕРОТЕСТ» с
успехом нспольз\ется как в Инстит>тс вирусологии им. Д
И. Ивановского, так и в
региональных ветеринарных лабораториях России и Белоруссии и в отделе иммунологии
НПО Н А Р В А К .
Выяв.тенпе и анализ геномных детерминант вирулентности вируса Р Р С С
До настоящего времени не существовало данных о том, какие именно участки генома
вируса РРСС отвечают за лтрату или возникновение вируле1ггности вируса РРСС. Отсутствие
таких
знаний
конструирования
не
дает
возможности
эффективной
вирусной
разработать
вакцины
стратегию
Нам
целенаправленного
представлялось
возможным
определить такие )"часткн путем сравнения первичной структуры геномов вирулентного
NADC8-2, аттенуированного NADC8-251 и промеж)точного по вирулентности NADC8-252P
вирусов, производных от одного родительского штамма вируса РРСС NADC8 (см. материалы
и методы).
Перед началом экспериментов необходимо было исследовать in vivo свойства трех
нсслея>еуььх вариантов иггамма NADC8 вируса РРСС (таблица 4) Кажд)то группу из 16
животных заражали вирусами NADC8-251, NADC8-252P и NADC8-2, в дозе 2x10* ТЦИД».
Контропьной ф)ппе интраназально вводти безвирусный материал
каждой группы были убиты на 3, 10, 17, и 35
По 4 животных из
день, отобраны сыворотки крови и
проанализированы на наличие вируса РРСС (Таблица 4А) и на наличие антител Против
вир}са РРСС (Табпица 4В) Перед заражением (день 0) специфических антител в сыворотках
животных обнар)'жено не было
Животные практически не имели клинических признаков после интраназального
заражения вир\сом NADC8-251 в дозе 2 х 10* ТЦИДи- Схожие данные были описаны в
предыл)щих исследованиях (Mengeling В
et al 2003) Для изучения аттенупрованных
вариантов вируса РРСС важна доза и способ введения вируса, так при введении вируса
вн>тримышечно в лозе 2 x 1 0 * ТЦИД» развивается вирусная инфекция (Lager К. et а! 2002,
Mengeling В el al 2003).
29
Таблица 4 Сравнение in vivo свойств трех различных пассажей штамма NADC8 вируса
РРСС-пассажи 2,251. 252Р.
Таблица 4А: Эффективность выделения вируса от зараженных животных Указано
количество положительных животных / количество протестированных животных (в скобках
указан усредненный титр вируса, -IORIQ)
День после заражения
Материал для
10
17
3
35
заражения
Безвирусный
0/4 (0 0)
0М(0 0)
0/4 (0 0)
0/4 (0 0)
материал
251
0/4 (0.0)
0/4 (0 0)
0/4 (0.0)
0/4 (0.0)
252Р
1/4 (0.4)
1/4(0.2)
2/4 (0.9)
0/4 (0.0)
2
3/4 (2.8)
4/4 (3.6)
3/4 (3.0)
0/4 (0.0)
Таблица 4В: Эффективность обнаружения антител к вирусу РРСС у зараженных
животных.
Количество
сероположитвльных
животных
/количество
животных,
протестированных на антитела к вирусу РРСС Положительной считается сыворотка с
величиной оптической плотности в И Ф А по отношению к положительному контролю S/P >
О 4, (в скобках указаны средние значения S/P).
День после заражения
Материал для
3
10
17
35
заражения
Безвирусный
0/4 (0 000)
0/4 (0.000)
0/4 (0 000)
0/4 (0 000)
материал
251
0/4 (0.000)
0/4 (0 000)
0/4 (0 000)
0/4 (0.000)
252Р
0/4 (0 000)
0/4 (0 000)
1/4(0.317)
3/4 (0 850)
3/4 (0 904)
4/4(1.280)
2
0/4 (0.000)
4/4 (0.766)
Итак, после исследования вирусных штаммов на стандартной модели животных
обнаружили, что они располагаются по степени вирулентности в следуюп1ем порядке (по
убыванию)
NADC8-2, NADC8-252P, NADC8-251
М ы предположили, что различия в
характере протекания вирусной инфекции в группах животных, зараженных разными
вирусами, связаны с генетическими изменениями, накопленными в ходе пассирования
штамма NADC8 вируса РРСС. Для проверки этой гипотезы была определена попная
первичная структура геномов всех трех вариантов штамма NADC8 (рисунок 6).
Геномы трех вариантов штамма NADC8 полностью соответствовали описанной
модели генома артеривирусов (Allendc. R и др 1999, Nelsen. С J и др 1999, Snijder, E J ,
Meulenberg, J . J М 1998) Они содержа1и две больших открытых рамки считывания O R F l a и
ORFlb, расположенных сразу после 5'-концевой нстранслируемой области (5' N C R )
На
стыке ORFla и O R F l b присутствовал семичленный участок ("slippery") сдвига рамки 5'-
30
UUU-^A^C-j'. распопоженный между нуклеотидачш 7677 и 7683, на 4 нуклеотнда выше
стоп-колона U A G в рамке ORFla.
Геном вируса РРСС
15453 нуклеотида
■
N
Т-
I
I
Г-
I
I
■
Прямое секвенирование 14 фрагментов ПЦР
ж:
1—г
I
Полная первичная структура генома
Рисунок 6 Схема определения полной первичной структуры генома вируса РРСС
Оста:1ьные открытые рамки считывания {ORF 2 - 7 ) расположены после ORFlb, а за
ними
находится
З'-концевая
нетранслируемая
область
(3'
NCR)
и
участок
полиаленнлированпя В j^iacTKax 5' NCR и 3' NCR различий между геномами 3 вариантов
штамма NADC8 не обнаружено (рисунок 7, таблица 6 ).
<-•■■ -■
5' N C R
Рис)110к 7
\а-
-
^
lb '
"slippery"
тпп_ т
7
3'NCR
Схематичное изображение генома вируса РРСС. Участки 5' NCR, У
NCR и "slippery" являются консервативными для трех вариантов
вируса NADC8.
При сравнении геномов NADC8-2 и NADC-8-251 обнаружено 50 нуклеотидных
различий и 3-нуклеотидная делеция. Из них 22 мутации были "молчащими", т е
не
прнволитн к аминокислотным заменам, остальные 28 вызвали замены аминокислот Не
найдено разпичий в последовательности Nsp6 (часть ORFla)
Nsp8 и
Молчащие мутации найдены в
N s p l l , они не приводят к изменению аминокислот вируса РРСС. Изменения
31
аминокислот найдены в Nspl, Nsp2, Nsp3, Nsp5 и Nsp7. Трехнуклеотидная делеция в O R F l a
(нуклеотиды 3763-3765) приводит к потере лейцина в Nsp2. Нуклеотидйые замены в O R F l b
привели к аминокислотным заменам в Nsp9, NsplO, и Nspl 2. Анализ мутаций в структурных
генах (ORF 2-7) показал, что только в ORF3 все мутации были молчащие. Другие мутации
вызывали по одной или более аминокислотных замен в структурных белках gp2, gp4, gp5, М ,
и N (таблица 5). В третьем столбце таблицы показаны только нуклеотиды и аминокислоты,
которые отличаются у штаммов NADC8-251 H N A D C 8 - 2 5 2 P .
Таблица 5. Нуклеотидйые и аминокислотные замены штамма NADC8 вируса РРСС на разных
пассажах (2, 251, и252р). Н = Нуклеотид. А К . = Аминокислота. Серым отмечены
молчащие мутации.
Пассажи шгамма NADC-8 вируса РРСС
ORFla
Белок
Nspl
Nsp2
251
Позиция
нуклеотида
Н
837
840
1628
1877
'■<ip§Jg7,jg
^;5ЁлА»А#«1
2504
2607
Nsp3
Н.
':;д-^ -г
ТТЛ
Делеция
F
I'.'^bii "
SC/t
» т
Nsp7
Nsp8
Nsp9
'i22lf,M|gfgf
L^gagMSi ШШ^
6357
^a»^''^s&%i'i,
8946
»
•
»
шжт
i/t'^r:
Ы: 'm:>:^At
5021
Nsp5
шшшш
^?,f?f^j■;'^
S^^^S
^^£0 ^ШмМ
ш-'¥^ш,1 Ж Р Ж
".bg-ISlMp Ш^
.'^^'^ЩШМ i " i
Л':ШШш
5825
35]
ЩI/^,f^^ П{4>РЩм'^'мШ
Am
Nsp4
АК
Шт. feiisga ^MMiti шапвж
Ут^ШЖ
Sr:usct»g
^ШМШй
3245
3763-3765
3767
252Р
•"■■«-■
КЦ€<а'У>
Делеция
й^ ш
Т
ШЕЖ? Г З ^
Ж^йд р ^ У 1 М Ш Ш ' Ш^ш
32
-?-'-•'.
'■«:>.
Делеция
у^^^^ ^swm^'^w.
Г.г?, f^-Cr^'p,
м" ч дал?,
- ,1У£ ь а '
'чШ^&Ш af'fgAJM?.- •Ж€Ж1Е
""9363
Делеция
'-i'?VVt*."<
R
lliitijf'.
:ЖкЖ,
W>tgt
D(C/A)
gifK^g^i
P/Q
Ш11Ш%Р
°^д^^у^ЙЙ<
(ШШМ
шшшя
0RF6
^Ш1^^8ШШ11^ШШВ|^^1Ш^НШ^^НШ^^^
ORF 7
Й^^Шв^ШШй^^^^вЙЁШ^^^Ш^Я^Ш
14467
15225
15227
15227
Количество и разнообразие нуклеотидных замен, обнаруженных в геномах вирусов
NADC8-2
и
NADC8-251,
вполне
согласуются
с
литературными
данными
других
исследователей, которые сравнивали аттенуированный вирус РРСС с родительским вирусом
дикого типа (Allende R. et al. 2000, Yuan S. et al. 2001) (таблица 6). Так при сравнении
родительского вируса и аттенуированного после 70 пассажей in vitro было найдено 44
нуклеотидные замены (Yuan S. et al. 2001). После подробного анализа локализации мутаций
не было обнаружено определенных участков генома, ответственных за аттенуацию вируса.
Первичные струшуры геномов NADC8 пассажей 251 и 252Р отличались лишь в 8
позициях (Таблицы 5 и 7). Две из этих мутаций в позициях 9061 (ORFla) и 12333 (0RF2)
были молчащими. Три нукяеотидных отличия в позициях 6357 (ORFla), 9735 (ORFIb) и
14440 (0RF6) приводили к изменениям аминокислотной последовательности белков Nsp5,
NsplO, и М соответственно. Эти мутации были прямыми реверсиями к генотипу NADC8-2.
Три остальные мутации в позициях 837, 840 и 5825 (все в ORF 1а) привели к появлению
новьк аминокислот в белках Nspl и Nsp4.
/ ^ОС. н д ц | . ^
33
ВИБЛИОУЕМ"'
^Ч'^г^г
i
Таблица 6 Количество и локализация мутаций, накопленных штаммами РРСС NADC8 и VR2332 (Yuan, et al., 2001) после аттенуации методом пассирования в культуре клеток.
Участок
Количество нуклеотидных
Процент гомологии между
генома
отличий
родительским и атгенуированным
вирусами
NADC8
VR-2332
NADC8
VR-2332
5'-UTR
0
2
100
99.5
ORFla
22
15
99.7
99.8
ORFlb
11
13
99.7
99.7
0RF2
1
4
99.9
99.5
0RF3
2
4
99.7
99.1
0RF4
3
2
99.7
99.6
0RF5
6
2
99.0
99.7
0RF6
2
3
99.6
99.4
0RF7
3
0
99.2
100
З'-UTR
0
0
100
100
Таблица 7. Нуклеотидные и аминокислотные отличия, обнаруженные между вариакгами
штамма NADC8 (пассажи 251 и 252Р). Для сравнения приведены данные по
штамму NADC8 2 Серым отмечены молчащие мутации.
NADC8-252P
NADC8 -2
NADC8-251
Пуклеотид белок ПуклеоГен
Амино­
Нуклео- Амино­ НуклеоАмино­
ная позиция
кислота
кислота
тид
кислота
тид
тид
генома
РРСС
Glutamic
Glycine
ORFla
Glutamic Acid
837
Nspl
Acid
Glycine
Valine
ORFla
840
Nspl
Glycine
ORFla
5825
Nsp4
Arginine D(C/A) Proline/Gluta
Arginine
mine
Phenylalanine
ORFla
Alanine
Threonine
Мутации в нуклеотидных позициях 837 и 840 приводят к замене аминокислот в
домене Nspip, содержащем подобную папаину цистеиновую протеазу. Мутация в позиции
5825 вызывает изменения на участке между сайтами расщепления химотрипсин-подобных
сериновых протеаз в белке Nsp4. Мутация в позиции 6357 локализована недалеко от сайта
расщепления химотрипсин-подобной протеазы в белке Nsp5. Мутация в нуклеотидной
34
П01ИШ111 9735, локатнзованная в ORFlb, приводит к замене aviHHOKHcnoTH в белке NsplO,
солсржашем иинк-связывагощий и хеликазный ломеи Последняя мутация в позиции 14440
0RF6 приводит к изменению аминокислоты в связантюм с мембраной районе (аминокислоты
18-34) белка М
Существует ряд на5'чных публикаций с анализом полной или частичной первичной
структуры генома вир} caPPCC(SuaresP etal 1996, Shen S. et al 2000, Stadejek T. et al 2002)
Однако
тишь
в
единичных
публикациях
анализируются
геномные
изменения,
ассоциированные с аттенуацией вируса РРСС или с приобретением аттенуироваииым
вирусом виру пеитных свойств Мутации в O R r i у вируса РРСС, связанные с реверсией к
вирулентному фенотипу, были описаны ранее (Nielsen Н S et al. 2001) Были пайленн две
реверсии к родительскому
генотипу
одна была локализована
в подобной папаину
Ш1стенновой протеазе Nspl р домена, др5тая - в хеликазном домене белка NsplO Найденную
в настоящей работе реверсию в 0RF6 описывали также другие исследователи и ука.зывали на
связь данной мутации с реверсией к вирулентности (Madsen К G 1998). По нашим данным, а
также исследованиям, проведенным ранее, можно предположить, что мутации в белках Nsp I,
NsplO, and М могут быть связаны реверсией аттенуированного штамма и приобретением им
вирулентных свойств.
Таким образом, удалось найти, как минимум, 6 позиций, которые ответственны за
приобретение свойств вирулентности вируса РРСС Для прямой экспериме1ггальной проверки
роли этих мутаций необходимо было создать полиоразмерную инфекционную копию генома,
дтя того, чтобы вести исследования вируса с использованием обратной генетики.
Создание библиотеки полноразмерных инфекционных копий генома
аттенл'ированного штамма вируса Р Р С С
Нашей задачей было получениерекомбинантного аттенуированного штамма NADC8251
вируса
РРСС,
который
можно
использовать
в
дальнейших
исследованиях молекулярных механизмов аттенуаШ1И вируса РРСС
фундаментальных
Ранее было описано
конструирование единичных полноразмерных копий геномов вирулентного европейского
штамма Lehstad (Meulenberg J J М ef al 1998) и североамериканского штамма VR-2332
(Nielsen Н S ei al 2003) Однако полученные конструкции не использутотся широко для
фунламентатьных исследований Вероятно, в первичной структутзе геномов рекомбинантных
вирусов имелись существенные различия в сравнении с родительскими штаммами В ряде
табораторнй сконструировали единственную копию вирусного генома в бактериальной
35
плазмиде Hj-3a необыкновенно высокой генетической изменчивости вируса РРСС, такая
инфекционная копня содержала несовмеспшые с вирусной репродукцией дефекты Чтобы
избежать подобной ситуации, в нашей работе испочьзована стратегия создания библиотеки
полноразмерных вир5'сных геномов и отбор самых биологически активных из них дзя
дальнейших исследований.
Плазмидный вектор pACYC!77 (New England Biolabs, С Ш А ) был изменен таким
образом, чтобы в нем содержались сайты уникальных рсстрикциопных
эидоиуклеаз,
необходимые для сборки полноразмерного вирусного генома Дтя получения потноразмерной
копии вирусного генома использовали стратегию, представлснич ю на рисунке 8
5' Xmal
4502
BamHI
1151
Xmal
2209
Ssp I-TT BamHI
1258 b.p.
BamHI
Xmal
У(АЬ,
14822
/
Xbal
10917
Xbal
5425 b.p.
Xmal -
Xbal
10745 b.p..
XmalfAlaSoel
MCS+v
Sspl A a t l l , BmiHI, X b * I , U i a t , S p a l , Xhol
pACYC177(MCS+) с геномом вируса РРСС
Рисунок 8. Схема получения полиоразмерной копии генома вируса
Р Р С С в плазмидном векторе pACYC177(MCS+)
Вирусный геном был предварительно ееквенирован и определена его рестрикционная
карта. На основании данных рестрикционного анализа полноразмерный вирус (15330
нуклеотидов) был получен в виде 4 фрагментов ПЦР
Три фрагмента (5'-кониевой, 3"-
концевой и Xbal-Xmal) были предварительно клонированы в векторе pCR4-Topo (Promega,
США)
и секвенированы для того, чтобы убедиться в гом. что первичная структура
36
полученных фрагментов соответствует родительскому штамму NADC8-251. Как и ожидалось,
пришлось секвенировать более 10 копий каждого фрагмента, чтобы отобрать те, которые не
содержали мутаций. В отобранных фрагментах, встроенных в вектор, содержались две
замены, которые
впоследствии были использованы
как молекулярные
маркеры для
тестирования рекомбинантного вируса и отличия его от родительского штамма.
Фрагменты были переклонированы в векгоре pACYC177(MCS+). После этого был
получен фрагмент BamHl-Xbal (10700 пар оснований) методом «bong-PCR» (Gluchov А. I.
1991). Данный
ПЦР-фрагмент
был
предварительного секвенирования. В
клонирован
в
векторе pACYC177(MCS+)
без
результате была получена библиотека плазмид,
содержащих полноразмерную копию вирусного генома. Данные плазмиды отличались по
первичной структуре клонированного фрагмента BamHl-Xbal.
Для того чтобы исключить наличие существенных изменений в первичной структуре
полноразмерных геномов вируса РРСС, плазмиды были проверены с
использованием
рестрикционных эндонуклеаз Aatll, В а т Ш , Xbal, Xmal, Spel, Xhol, EcoRI, Hindlll, Kpnl, a
также методом ПЦР. Из 450-ти клонов только 32 содержали все предполагаемые сайты
рестрикции, а следовательно, имели первичную структуру, подобную родительскому
штамму. Эти плазмиды использовали в дальнейшем.
Плазмиды были использованы для транскрипции Р Н К in vitro и трансфекции
клеточных линий ВНК-21 и MARC-145. На рисунке 9 представлены результаты выявления
белков рекомбинантного вируса РРСС (1-й пассаж) методом иммунофлуоресцентного
окрашивания. Как
видно из представленного рисунка, вирусные частицы начинают
формироваться, начиная с первого пассажа после трансфекции.
Рисунок 9. Результаты иммунофлуоресцентного окрашивания клеток MARC-145
(а) и клеток, зараженных рекомбинантным вирусом, полученным на
основе полноразмерной ДНК-копии вируса Р Р С С (б).
37
Двадцать плазмид были использованы для транскрипции РНК in vitro. После проверки
20 плазмид было обнаружено 9 различных плазмид, с которых после трансфекции Р Н К
образовывались
полноценные
вирусные частицы, начиная с
первого пассажа
после
трансфекции (или электропорации) (рисунок 10).
Пассаж 1
Рисунок 10
Пассаж 2
Пассаж 3
Пассаж 4
Пассаж 5
Накопление вирусных частиц рекомбинантного вируса РРСС, полученного на
матрице
плазмиды №257, начиная с
I
пассажа.
Результаты
иммунофлуоресцентного окрашивания клеток MARC-145.
Следует заметить, что из 450 копий геномов только 9 оказались способными к
репликации Это значит, что вероятность получить вирус, способный к репродукции, при
работе с одной единственной конструкцией составляет 2 %
Таким образом, стратегия
создания библиотеки геномов вируса РРСС оправдала себя. Проведено секвенирование
четырех из девяти полноразмерных инфекционных копий генома вируса РРСС. Подробный
анализ геномов, показал, что
первичная структура Д Н К
плазмиды №257
наиболее
приближена к таковой у родительского штамма вируса РРСС. Изучение штаммов с
различными ростовыми характеристиками и известными изменениями в первичной структуре
генома позволит дополнительно выявить набор функционально значимых мутаций в
вирусном геноме. Таким образом, создана конструкция кДНК, позволяющая вносить
генетические изменения в вирус РРСС.
Для дальнейшей характеристики in vitro рекомбинантных штаммов вируса РРСС были
использованы биохимические подходы.
Проведение микроэлементного анализа клеточной культуры MARC-145 до и
после инфицирования штаммами вируса Р Р С С различной вирулентности
Изучение микроэлементного статуса, как маркера заболевания, широко используется в
современной медицинской микроэлемеитологии (Bargellini A.et al, 2003, Kalkan A et al 2002,
Adachi S Et al. 1991, Andrasi E 1993, Скальный A. B, 2004). Восприимчивость к вирусным
38
инфекциям связывают обычно с условиями питания, в том числе, и минерального, что
увеличивает защитные свойства иммунной системы (Basset ct al 1999, Domingo 1997, Beck
1998) Ослаблением/усилением иммунитета объясняют и комбинированное действие вир) сов
и ряда rf-элементов (ПЬаск, Lindh et al 1995, Chou et al 1999). Поэтому мы попытались
провести оценку действия вирусов РРСС различной вирулентности на биологическую
систечу (к-)льтлру клеток)
Такой подход, безусловно, не позволяет изучить механизм
действия вир5са, но помогает выявить феноменологические проявления инфекционного
процесса.
Определяли содержание семи микроэлементов (А1, Сг, Мп, N i , Fc, Си, Zn) в клетках и
в ростовой среде. Зараженные кпетки культивировали в течение 3-х суток, по достижении
эффективного заражения монослоя. Наличие вируса в инфицированных клетках было
подтверждено в ПЦР и ПЦР в реальном времени В исследуемой культуре через 3 дня после
инфицирования концентрация вируса составляла не менее Ю' ТЦЦзо/мл. На рисунке 11
показаны диаграммы содержания каждого микроэлемента в незараженных клетках (1
колонка), в клетках, зараженных аттенуированным штаммом вируса РРСС NADC8-251 (2
колонка), а также в клетках, зараженных вирулентными штаммами NADC8-252P и Lelystad (3
и 4 колонка, соответственно). Из представленных данных видно, что при инфицировании
клеток, вирулентные штаммы вируса РРСС вызывают увеличение на порядок содержания
таких этементов, как хром, марганец, никель, железо и снижение содержания алюминия в 2-3
раза. Инфицирование аттенуированным штаммом приводит или к обратной реакции снижению на порядок содержания Мп и N i , или праю-цчески не влияет на концентрацию А1,
Сг, Fe Инфицирование штаммами NADC8-25I и NADC8-252P вируса РРСС практически не
В1няет на концентрацию Си в клетках, при инфицировании штаммом Lelystad концентрация
меди незначительно
уменьшается. Концентрация
цинка
при инфицировании
любым
штамхюм РРСС незначительно увеличивается в (1,5-2 раза).
Действия инфекционного агента или иного фактора на метаболизм микроэлементов
необходимо оценивать не только по величинам их стационарной концентрации в биомассе,
но и по интенсивности метаболических потоков "клетка (организм, популяция) - внешняя
среда" Такие потоки удобно характеризовать по коэффициенту накопления микроэлемента,
который рассчитывается
как соотношение концентрации
микроэлемента
в клетке к
концентрации элемента во внешней среде (ростовой среде). Коэффициенты соединяют
почаной кривой и называют ее микроэлементным профилем
Вид микроэпементных
профитей Д1Я биотогической системы является специфичным и постоянным для каждого
39
вида (Матвеева И С. и др 2003), мы предположили, что можно зафиксировать изменение
данного профиля после заражения вирусом РРСС
т ГмЛ
И
кпшрвяь 1S1
lilp
■•трель I S I
Myntt
ISlp
«o-Tpint, 151
ISlf
ItlyMtd
ItlTitX
puk ISI
...fi. о,
»>тр»->ъ 1«1
mp
I*Jp
klfltld
CD'
Vbitid
lil
151
ISlp
I51y
Ul,«t*«
l<l„t«ri
Рисунок 11. Содержание микроэлементов в клетках перевиваемой клеточной линии
M A R C - I 4 5 , контрольной культуры (на рисунке - «контроль») и
культуры, зараженной вирусом Р Р С С
- штаммом NADC8-251 (на
рисунке - «251») NADC-252P (на рисунке - «252р»), Lelystad.
На рисунке 12 представлены микроэлементиые профили культуры клеток почек
обезьяны
MARC-145
до
и
после
инфицирования
европейским
(Lelystad)
и
американским штаммами вируса Р Р С С (NADC8-252P), а также arrcHj-HpoBaHHbiM
штаммом вируса Р Р С С (NADC8-251).
Если сравнить первичную струюуру белков пгтаммов NADC8-251 и N A D C 8 252Р, можно найти только шесть аминою1Слотных различий (таблица 7) Эти отличия
приводят к изменению вирулентности вируса и одновременно связаны с изменением
микроэлементного
профиля
клеточной
линии
показательно
никеля,
железа
марганца:
для
и
после
заражения.
наблюдается
Особенно
уменьшение
это
их
концентраций при заражении аттещ'ированным штаммом и наоборот, ^-величение их
концентраций при инфицировании вирулентными штаммами Lelystad либо NADC8252Р(рис)-нки11, 12).
Увеличение концентрации rf-элементов можно объяснить возможной индукцией
при вирусной инфекции синтеза четаллотионеинов
40
(Ilback, Glynn et al, 2004),
связывающих ионы металтов с высокой аффинностью Гнпераккумуляция никеля, как
способ зашиты от впр)сной тгафекцни, была описана для растений (Davis et al, 2001).
10000 -= -
1000
-5
Рисунок
8.
10
Си
Zn
Коэффиш1ент когщентрирования микроэлементов в клетках (по
отношению к концентрации микроэлемента в ростовой среде)
контрольной культуры MARC-145 (на рисунке - « К » ) и культуры,
зараженной вирусом Р Р С С - штaм^^aми NADC8-251 («251»), NADC-252P
(«252р»), Lelystad («lei»).
По1\-'1енные
результаты
можно
использовать,
прежде
всего,
для
первичной
характеристики in vitro рекомбинантных штаммов вируса РРСС Эффект специфического
изменения
микроэлементных
профилей
клеточной
культуры
MARC-145
после
инфицирования штаммами вируса РРСС, предполагает также возможность дополнительной
стратегпн коррекции микроэлементного статуса, а именно' использование антагонизма в
действии вирулентных или аттенуирсванных штаммов или дополнительной регуляцией
промоторов генов металлотионеинов.
С\ммир)я результаты исследования, необходимо отметить, что поставленные задачи
были выполнены. Результатом исследования было комплексное изучение генома вируса
РРСС Проведено филогенетическое исследование пзолятов, циркулирующих на территории
России и Бепор>ссии На основании по.л)-ченных данных бып разработан комплекс средств
41
лиагносгики РРСС тест-системы для определения вируса и антитеп к нему Секвенированне
полноразмерных геномов и сравнение их структурно-функцнона1ьных j-MacTKOB позволито
определить потенциальные детерминанты внруленгности генома РРСС
Разработана
стратегия и сконструирована система обратной генетики для дальнейшего И35чен11я генома
артеривнрусов
статьи,
в
Полученные результаты отражены в публикациях В список также включены
которых
огшсана
оптимизация
условнП
и
эксперимента зьные
подходы,
примене1Н1ые в представленном исследовании
3. В Ы В О Д Ы
1.
Установлено широкое распространение вируса Р Р С С на территории России п
Белоруссии. В 41 хозяйстве Российской Федерации антитела к вирусу Р Р С С были
обнаружены в 79%. В
19 хозяйствах Белоруссии антитела к вирусу Р Р С С
были
найдены в 8 1 % .
2.
Разработана
н
внедрена
тест-система
для
обнаружения
вируса
РРСС
американского и европейскою icHonmoB методом полимеразной цепной реакции
( П Ц Р ) Диагностическая чувствительность тест-системы составляла I-IO ТЦДзо/ мл.
3.
Подтверждена постоянная циркуляция вируса Р Р С С на территории России и
Белоруссии
в рамках
широких
производственных
испьианий тест-системы
яля
определения Р Н К вируса Р Р С С методом П Ц Р в 2002-2004 г.г. В России из 41
исследованною района в 16-ти был обнаружен вирус Р Р С С у свиней различных
возрастных групп. В Белоруссии в 10 из 19 районов был обнар}'жсн вирус Р Р С С
4.
для
Разработана тест-система иа основе 11ЦР в реальном времени ('Real-time P C R " )
определения
РНК
вируса
РРСС.
Показана
количественного определения вируса Р Р С С
больных животных.
Диагностическая
принципиальная
возможность
в культурах клеток и материале от
ч}'вствительность
тест-системы
составляла
1 ГЦДзо/ мл.
5.
Вирусные изоляты, выделенные на территории России и Белоруссии, относятся
к европейскому генотипу вируса и близки к вирусам, цирку тирующим в Испании,
согласно
филогенетическим
исследованиям
нуклеокапсида вируса Р Р С С .
42
с
использованием
гена
белка
6.
Показано,
европейского
что
рекомбинантные
TimoB,
полученные
белки
в
нуклеокапсида
эукариотичсской
американского
(бакуловирусной)
и
и
прокариотической (£ coli) системах экспрессии могут быть использованы в качестве
специфических компонентов диагностической тест-системы.
7.
Разработан и внедрен набор реагентов для определения антител к вирусу РРСС
на основе непрямого И Ф А с использованием рекомбинантного белка нуклеокапсида,
полученного в системе экспрессии Е. coli.
8.
Исследова1ше in vivo свойств полевого изолята вируса РРСС NADC8-2,
аттенуированного вируса, полученного после 251 пассажа в культуре клеток - NADC8251, а также промежуточного варианта, выделенного от свиньи после частичной
реверсии аттенуированного вируса - NADC8-252P, на стандартной модели животных,
показало, что
три
исследованных
варианта
штамма
NADC8
вируса
РРСС
располагаются по степени вирулентности в следующем порядке (по убыванию):
NADC8-2, NADC8-252p, NADC8-251.
9.
Для выявления функционально значимьк участков генома проведено сравнение
первичной структуры геномов трех вариантов штамма вируса РРСС NADCg размером
15453 нуклеотида. При сравнении геномов NADC8-2 и NADC8-251 обнаружено 50
н^тслеотидных различий, 22 из когорых не приводили к замене аминокислоты, и 3н>'клеотидная делеция. Геномы штаммов NADC8-251 и NADC8-252P отличались лишь
в 8 позициях, при этом две из замен были молчащими. Выявлено 6 потенциальньпс
генетических детерминант вирулентности вируса РРСС
10.
Создана
и
функционально
охарактеризована
значимых
сконструирована
библиотека
участков
из
эксперимента.чьная
РНК-генома
32 клонов
модель
для изуче1гая
артеривирусов.
полиоразмерных
Для
копий
этого
геномов
аттенуированного штамма NADC8-251 вируса РРСС под контролем промотора Т7 в
плaз^шднoм векторе Ecoli па основе плазмиды pACYC177 с уникальным сайтом
множественного клонирования. На основе полученных плазмид синтезированы
инфекционные
РНК-геномы
инфекционные вирусы
иггамма NADC8-251 вируса
РРСС
и получены
Генно-инженерное происхождение вирусов подтверждено
секвенированием.
43
4. П Р А К Т И Ч Е С К И Е П Р Е Д Л О Ж Е Н И Я
На
основании
проведенных
исследований
разработаны
и
предложены
для
практического использования:
1 Тест-система для обнаружения вируса репрод>'ктивного н респираторно! о
синдрома свиней (РРСС) методом полимеразной цепной реак1ши (ПЦР)
Техгшческие условия 1У № 9388-002-42418073-02
2. Наставление
по
репродуктивного
применению
и
тест-системы
респираторного
синдрома
для
обнаружения
свиней
(РРСС)
вируса
методом
полимеразной цепной реакции (ИЦР). Утверждено Департаментом Ветеринарии
м е х Р Ф 07. 10. 02, № 13-5-02/599
3. Набор реагентов для выявления антител к вирусу
репрод>ктивного и
респираторного синдрома свиней (РРСС) имм>'ноферментны\| методом «РРСССЕРОТЕСТ». Технические условия ТУ № 9388-012-42418073-04
4. Наставление по применению набора реагентов для выявле1гия антител к вирусу
репродуктивного
иммуноферментным
и
респираторного
методом
синдрома
свиней
«РРСС-СЕРОТЕСТ».
(РРСС)
Утверждено
Россельхозпадзором 12. 18. 05 № 1-1.5/01446.
5. Тест-система для количественного обнаруже1П1Я вируса репрод>т(тивного и
респираторного синдрома свиней (РРСС) методом ПЦР в реальном времени
ИД утверждена директором НПО НАРВАК и находится на межведомственных
комиссионных испы1аниях.
44
5. С П И С О К О С Н О В Н Ы Х РАБОТ ПО Т Е М Е ДИССЕРТАЦИИ
1
Гребенникова Т. В., Забережный А. Д , Верховскнй О
А , Орлянкин Б. Г.,
Атипер Т Н , Непоклонов Е. А . - Создание средств лабораторной днапюстики
репрод>-ктнвного
и
респираторного
синдрома
свиней
(РРСС)
// 2005.
-
Ветерпнарня. -10
2
Гребенникова Т. В Метол полимеразной цепной реакции ( П Ц Р ) в дчагностике
и мониторпрованин лечеття инфекционных заболеваний. //- М . - Изд-во Р У Д Н .
- 2 0 0 5 . - с . 1-39.
3
Гребенникова
Т.
В,
Матвеева
И С,
Мусиенко
М.И.,
Забережный А Д.,
С ы р о е ш ю т А В. Изменение содержания микроэлементов в клетках MARC-145
при их заражении штаммами вируса Р Р С С различной вирулептности // 2005. Молек)лярная генетика микробиология и вирусология. - принята к публикации
4
О.
В,
Гребенникова Т. В., Верховский О. А., Забережный А . Д , Алипер Т
Богданова
В.
С,
Цибезов
В
В.,
Грабовецкий
В.
В.,
Елисеева
И.
Применение иммунофермеитного анализа для выявления антител к вирусу
репродуктивного и респираторного синдрома свиней в сыворотках крови
животных // 2005. - Вопросы вирусологии. - принята к пу бликацин.
5
Богданова В. С , Грабовецкий В. В , Костина Л . В. Гребенникова Т В. Синтез
растворимой
формы
рекомбннантного
белка
нуклеокапснда
вируса
репродуктивного и респираторного синдрома свиней ( Р Р С С ) и применение его
для выявления специфических антител к вирусу // 2005 - Международный
конгресс «Современные проблемы генетики». -Брянск
6
Гребенникова Т . В. Метод полимеразной цепной реакции ( П Ц Р ) в диагностике
инфекшюшгых заболеваний // глава в югиге «Микробиология» под ред. А
Лабпнской и В. Г. Ж^тговицкого - М . - 2005,
С
в печати.
7. Grebenniko\ а, Т. V , Clouser, D.F., Vorwald, А.С , Musienko, M.I.,
Mengeling,
W L., Lager, K. M . Wesley, R. D , Biketov, S.F., Zaberezhny, A.D., Aliper. T . I . ,
NepokIono\', E.A. -Genomic Characterization of Virulent, Attenuated and Revertant
45
Passages of a North American Porcine Reproductive and Respirator)- S>ndrome Virus
Strain//2004.-Virology.-V. 321 ~ N 2 . - P . 383-390.
8. Гребенникова Т. В., Забережный Л . Д , Мусиенко М . И , Mengeling W L , I.ager.
K M . , Алипер Т. И. , Пепоклонов Е
Л
-
Анализ геномных детерминант
вирулентности и создание библиотеки полноразмерных инфекционных копий
генома
аттенуированного
штамма
вируса
репродуктивно-респираторного
синдрома // 2004 - Вопросы вирусологии. - 3 - стр. 56-63.
9. Гребенникова Т. В., Алексеев К. П., Гибадулин Р. А ,
Богданова В
Мусиенко М .
И.,
С , Забережный А. Д., Алипер Т. И., Непоклонов Е. А.- Синтез и
антигенные свойства рекомбинантных белков американского и европейского
типов вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней ( Р Р С С ) в
бакуловируспой системе.// 2004. - Вопросы вирусологии. - 2. - стр. 37-42.
10. Гребенникова Т. В , Забережный А Д , Власова А. Н., Мусиенко М . И., Соколов
М
А., Грабовецкий В
Алипер
Т.И,
В., Цибезов В. В., Богданова В. С , Орлянкин Б. Г.,
Непоклонов
F. А -
Генетическая
вариабельность
белка
нуклеокапсида вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней
(РРСС)// 2004. - Молекулярная генетика, микробиолотя н вирусология -2 ~
стр. 37-40
11 Orebennikova, T.V., Zaberezhny, A . D , Musienko, M.I., , Mengeling W . L . , Lager,
K M . , Alipcr, T.I. , Nepoklonov, E.A. Library of Infection c D N A Genome of the
Attenuated strain of North amerycan porcine reproducti\ e and respiratory syndrome
virus // 2004. - Symposium on Positive Strand R N A viruses. - M a y 27 - June 1. San Francisco, California, U S A . - P.95.
12.Балышев Л . В . , Плетенсва T.B., Гребенникова T.B., Сыроешкпн А . В . Влияние
исследуемой фармацевтической композиции на основе Zn ' с глицином на
выработку естественных киллеров// Здоровье и образование в X X I
веке.
Материалы V Международной научно-практической конференции . - М : Издв о Р У Д Н 2004.-С. 36
46
13. Орляныш Б
Г,
Гребенникова Т. В.,
Алипер
1. И., Непоклонов Е.
А-
Специфическая профилактика репродуктивного и респираторного синдрома
свиней // 2004. - Ветеринария. - 11. - стр. 3-5.
14 Забережный А . Д., Гребенникова Т. В. - Применение молекулярных методов в
диагностике
и
профилактике
В1фусных
болечней
-
2004. -
Материалы
Всероссийского совещания-семинара директоров ветеринарных лабораторий
субьектов Российской Федеращш - Брянск. - 1 -4 ноября 2004 г. - стр. 83-94
15.Балышев
А.В,
Гребенникова
противот> беркулезного
(мпкроэлементные
Т.В.,
действия
профили,
Сыроешкин
нового
клеточный
А.В.
Обоснование
Zn^^-содержащего
иммутггет,
препарата
неспецпфическая
резистентность)// 2004 - Микроэлемегпы в медицине Т 5 - В ы п 4. - С. 6-8.
16 Алексеев К.
П,
Грабовецкий В.
В,
Гибалулип Р
А,
Мусиенко М
И.,
Гребенникова Т. В , Алипер Т. И., Непоклонов Е. А., Забережный А . Д. Получение
рекомбинантных
вирусных
белков
в
бакуловирусной
системе
экспрессии для их дальнейшего использования в качестве специфических
компонентов диагностических тест-систем на основе И Ф А
// «Актуальные
проблема.! инфекционной патологии животных» - Владимир. - 30-31 октября
2003.-Р. 180-185.
П.Гребенникова
Т. В., Мусиенко М . И., Алипер Т
Забережньн"! А. Д
И., Непоклонов Е.
А,
- Создание полноразмерной инфектшонной копии генома
аттенуированного иггамма вируса репродуктивного и респираторного синдрома
св1гней ( Р Р С С ) американского типа// «Актуальные проблемы инфекционной
патологии животных».- Владимир, октябрь 2003 - Р. 164-169.
18 Grebenniko\ а, T.V., Musienko, M . I ,
A D , Aliper, T I
Mengcling, W L , Lager, K. M
Zaberezhny,
, Nepoklonov, E A. -An Infectious Oenomic c D N A Clone of the
Attenuated P R R S V Strain of North American Porcine Reproductive and Respiratory
Syndrome Virus.// 84"''Annual Meeting, Conference of Research Workers in Animal
Disease, ( C R W A D ) - 2003. - Chicago, U S A , Novembcrl 1-13.
19 Власова
A.
H.
Гребенникова
Т.
В.,
Алипер
Т. И ,
Непоклонов
Е
А.,
Забережный Л . Д. - Разработка и применение тест-системы на основе П Ц Р для
47
детекции н дифференциации Европейского и Американского типов вируса
репродуктивного и респираторного синдрома свиней.// Труды "Между народной
научно-практической конференции по болезням животных. Ветеринарные и
медицинские аспекты зооантропонозов". - 2003. - Покров - С. 405-410.
20.Vlasova А. N., Risatti G., Grebennikova, Т. V., Zaberezhny, А . D , Aliper, Т. I,,
Nepoklonov, Е. А .
Infectious genomic copy of the Russian vaccine strain of
Classical Swine Fever (Hog Cholera) virus // 2002. 17* Congress of the International
Pig Veterinary Society, Iowa, Ames, U S A , June 2-5, P. 324.
2/.Tsybezov, V V . , Vlasova A. N., Grebennikova, T. V., Drew, T.W., Zaberezhny, A .
D , Aliper, T. I., Nepoklonov, E. A. Indirect E L I S A test for detection of antibodies
again.st Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus based on recombinant
nucleoprotein from European type of the virus // 2001. C R W A D
82"" Annual
Meeting, St. Louis, Missouri, U S A , Novemberl M 3 , P. 179
22.Grebennikova, T. V., Clouscr, D. F , Vonvald, A C , Zaberezhny, A. D . Biketov, S.
P., Aliper, T. I., Nepoklonov, E. A., Mengeling, W . L. Entire genomic sequencing of
the Porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain NADC-8 from 3
different passages.// 2001. 20* Annual Meeting A S V , Madison, Wisconsin. July 2125, P. 194.
23. Grebennikova, T. V., Zaberezhny, A. D., Paton D. J . , Aliper, T. I., Nepoklonov, E.
A.Complete Nucleotide Sequence of the Vaccine Strain «Cs» of Classical Swine
Fever Virus. // Сборник научных работ специалистов Н П О Н А Р В А К . - Москва,
2001.-С. 261-278.
24. Гребенникова Т. В., Забережный А. Д., Сергеев В.А., Бикетов С.Ф., Алипер Т.
И , Непоклонов Е. А. Генетическая характеристика вакцинного штамма К С
вируса
классической
последовательности
чумы
генов
свиней:
Сравнительный
поверхностных
анализ
гликопротеинов
Е™,
первичной
Е 1 , Е2.//
Молекулярная генетика, микробиолопгя и вирусология, №2 1999. - С. 34-40.
25.Сыроешкин А В., Гребенникова Т.В
Реализация принципа Кюри в локально
анизотропных средах: особенное™ ферментативного кататиза с участием Н ' -
48
АТТаз и Д11К-полнмераз// X V I Менделеевский съе!л по общей и прикладной
xjivnii Х и м и я живого. - Москва, 1998. - С 153-154
26. Grebenniko\ а, Т. V , Zaberezhny, А. D., Palon D J , McGoldrick, А , Aliper. Т. 1 ,
Nepoklonov, Е
А Sequencing analysis of the Classical Swine Fe\cr Virus// 1998.
Oie symposium on Classical Swine Fever (Hog Cholera) Birmingham (United
Kindom), 9-10JuIy,p. 53.
27 Grebennikova, T. V , Glukhov, A 1., Chist\'akova, L G., Kiselev, V. I , Severin, E.
S Detection of Interleukin-2a and Determination of MDR-1 Gene Expression by
Combined Re\erse transcription and Amplification Using
Tliermus TItermophilus
D N A Polymerase//1995 Molecular Biology. V 29, N. 4, part 2. p 542-547
28 Glukhov, A T , Grebennikova, T V , Kiselev. V 1 , Se\erin, E. S Detection of CD-4
Receptor m R N A by Combined Reverse transcription and Amplification Using
Tliermus Tliermophilus D N A Polymerase// 1995 Molecular Biology, V
29, N
4,
part 2, p 942-949.
29. Glukhov, A I., Grebennikova, T. V., Kiselev, V
Pol>'merase in R N A
I Use of thermostable Tet-z D N A
detection by coupled RT/PCR reaction. // 1992. ATB"92
Conference, Milan, 24-27 November
30. Glukhov, A . I., Trofimova, M . E., Gordeev, S. A., Grebennikova, T. V., Vinogradov,
S. V , Kiselev, V. I., Kramarov, V. M . P C R amplification of phage lambda D N A
sequences using thermostable D N A Polymerase.// 1991. Molecular Biology, V. 25,
p 1602-1610.
49
Поди, в печ. 12.10.05r.
Объем Усл. Печ. л. 2.S
Формат издания 60x88/16
Тираж 10О эк1.
Отпечатано в Ф Г Т П «ЭКСПЛОР»
Москва, 107139, Орликов пер., я.З, тел. 207-80-52
Б ) м . Тип.
Заказ 290
л. •
120443
РНБ Русский фонд
2006-4
22422
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
2 070 Кб
Теги
bd000102449
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа