close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

bd000102527

код для вставкиСкачать
Российская Академия Паук
Институт Эволюционной Физиологии и Биохимии имени И.М. Сеченова
На правах рукописи
Голобокова Елена Юрьевна
ФОТОЛИЗ З Р И Т Е Л Ь Н О Г О П И Г М Е Н Т А И Т Е М П О В А Я АДАПТАЦИЯ
ФОТОРЕЦЕПТОРОВ
03.00.04 - биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург
2005
Работа выполнена в лаборатории эволюции органов чувств (заведующий доктор
биологических
наук
В.И.
Говардовский)
Института
эволюционной
физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН.
Научный руководитель:
доктор биологических наук
Говардовосий Виктор Исаевич
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор
Розенгарт Евгений Викторович
кандидат биологических наук
Фельдман Татьяна Борисовна
Ведущее учреждение:
Институт физиологии
им. И.П. Павлова РАН
Защита состоится 22 ноября 2005 года в И часов на заседании диссертационного
совета Д 002.127.01 при Институте эволюционной физиологии и биохимии им.
И.М. Сеченова РАН по адресу:
194223 Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, д. 44, конференц-зал.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института эволюционной
физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН.
Автореферат разослан 20 октября 2005 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор биологических наук
С
. ^С / V ^ ^
^У'^
М.Н. Маслова
M&J:^
1111779
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы
Зрительная система человека и животных способна функционировать в
чрезвычайно широком диапазоне интенсивностей света и обеспечивать восприятие
объектов в разное время суток. Одним из проявлений этой способности является
феномен темновой адаптации - восстановление чувствительности зрительной
системы к слабому свету после пребывания под действием высоких освещенностей.
Темновая адаптация происходит как на уровне фоторецепторов и нейронных сетей
сетчатки, так и на уровне центральных структур нервной системы. Однако именно
изменения свойств фоторецепторов определяют поведение последующих звеньев
обработки сигнала, и, следовательно, адаптация на уровне фоторецепторных клеток
(палочек и колбочек) является ключевым моментом для всего процесса.
Возбуждение фоторецепторов начинается с поглощения квантов света
молекулами зрительного пигмента, которые находятся в наружных сегментах этих
клеток. Зрительные пигменты принадлежат
к классу
семиспиральных
трансмембранных рецепторных белков, передающих сигнал через ГТФсвязывающие белки (G-белки) Поглощение кванта вызывает переход хромофорной
группы пигмента (в качестве которой служит ретиналь или 3,4-дегидроретиналь) из
11-г/мс-формы в т/7анс-форму, что инициирует серию конформационных изменений,
приводящих к появлению активной конформации - метапигмента I I , который
связывается с G-белком. Последующие превращения приводят к фотолизу
зрительного пигмента - отделению транс-хромофора от апобелка опсина. При этом
хромофорное место на опсине делается доступным для связывания новой молекулы
11 -г/ис-ретиналя, что обеспечивает восстановление исходной (темновой) структуры
зрительного пигмента [обзоры: DeGrip & RothscHld, 2000; Hofinann, 2000].
Фотолиз зрительного пигмента палочек - фоторецепторов сумеречного зрения
- изучался как в детергентных экстрактах, так и в интактных фоторецепторах
Процессы фотолиза зрительных пигментов колбочек - фоторецепторов дневного
зрения - исследованы значительно меньше, поскольку экспериментальные
возможности ограничены трудностью получения достаточного количества
колбочковых пигментов для исследований in vitro. При этом данных о фотолизе
колбочковых пигментов в интактных фоторецепторах (ш situ) почти нет, а
имеющиеся в этом отношении немногочисленные работы выполнены с
использованием методик, которые не позволяют надежно идентифицировать все
продукты фотолиза в колбочках.
В
настоящее время предполагается. что в палочках процесс темновой
юс. НАЦИОНАЛЬНАЯ '
БИБЛИОТЕКА
.
СПетер*г{>гО(У^'
ОЭ ?ва7«й^7|Ь'
адаптации определяется течением медленных реакций, связанных с распадом
долгоживущих продуктов фотолиза и регенерацией темнового зрительного
пигмента. Из психофизических экспериментов известно, что в колбочках темновая
адаптация происходит как минимум на порядок быстрее, чем в палочках. Возможно,
что такое различие в скоростях адаптации связано с разными скоростями
фотопревращений палочкового и колбочкового пигментов, но прямое
подтверждение этого при анализе in vivo пока отсутствует. Это делает актуальным
сравнительное исследование процессов фотолиза зрительного пигмента в интактных
палочках и колбочках сетчатки.
Цель работы
Исследование процессов фотолиза зрительных пигментов палочек и колбочек
т
VIVO и выяснение роли продуктов фотолиза в темповой адаптации
фоторецепторов.
Задачи работы
1.
Исследовать
последовательность
и
кинетику
взаимопревращений
долгоживущих продуктов фотолиза в интактньк палочках и колбочках сетчатки.
2. Исследовать ход процесса темповой адатггации палочек и колбочек после
контролируемого обесцвечивания зрительного пигмента.
3. Сопоставить отличия процессов фотолиза палочковых и колбочковых
зрительных пигментов с особенностями временного хода темповой адаптации
палочек и колбочек.
4. На основе проведенного анализа установить роль медленных стадий
фотолиза в процессе темновой адаптации для разных типов фоторецепторов.
Научная новизна результатов исследования
Применение скоростной поляризационной микроспектрофотометрии впервые
позволило
надежно
идентифицировать
долгоживущие
хфодукты
фотолиза
колбочковых зрительных пигментов ш vivo и представить кинетическую схему
взаимопревращений между ними.
Исследование кинетики фотопревращений зрительного пигмента позволило
установить, что в палочках генерация конечного продукта фотолиза (ретинола)
лимитируется образованием ретиналя в результате распада метапродуктов, а в
колбочках - реакцией восстановления ретиналя в ретинол, катализируемой
ферментом ретинолдегидрогеназой.
Проведено
сопоставление
временного
хода
выключения
каскада
фототрансдукщш в палочках и колбочках с кинетикой распада долгоживущих
продуктов фотолиза в этих фоторецепторах. При этом впервые показано, что распад
метапродуктов является основным фактором, контролирующим процесс темновой
адаптации как в палочках, так и в колбочках, а его более быстрое течение в
колбочках
обеспечивает
высокую
скорость
темновой адаптации этих
фоторецепторов.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Схема медленных стадий фотолиза, установленная ранее для родопсина
быка и лягушки, не является универсальной, поскольку образуюпщеся продукты
фотолиза зависят как от вида зрительного пигмента, так и от вида животного.
2. Скорость распада колбочкового зрительного пигмента в процессе фотолиза
на один-два порядка выше по сравнению с палочковыми пигментами.
3. Лимитирующей стадией в генерации одного из ключевьпс продуктов
зрительного цикла - транс-рептоля - в палочках является образование ретиналя в
результате распада метапродуктов, а в колбочках - ретинолдегидрогеназная
реакция.
4. Выход фоторецепторов из насыщения после действия ярких стимулов,
контролирующий временной ход темновой адаптации, определяется кинетикой
распада фотопродукгов.
5. Быстрый распад колбочковых зрительных пигментов по сравнению с
палочковыми является одним из основных факторов, лежащих в основе быстрой
темновой адаптации колбочек.
Теоретическая и практическая значимость работы
Выполненное в данной работе исследование фотолиза зрительных пигментов
и процессов темновой адаптации разных типов фоторецепторов из сетчаток рыб и
амфибий позволило прояснить молекулярные механизмы, лежащие в основе
темновой адаптации зрения. Кроме того, оно дало возможность объяснить различия
в скорости восстановления чувствительности палочек и колбочек после воздействия
света высокой интенсивности и, следовательно, различия скоростей адаптации
дневного и ночного зрения.
Весьма вероятно, ^гго полученные выводы также справедливы и для
фоторецепторов млекопитаюпщх, включая человека, поскольку принципиальное
отличие между палочками и колбочками, заключающееся в более высокой скорости
фотолиза зрительного пигмента и темновой адаптации последних, согласуется с
физиологическим отличием дневного зрения от ночного как у холоднокровных, так
и у теплокровных позвоночных. Эти результаты могут оказаться полезными и при
изучении других клеточных систем передачи сигнала через G-белки, о которых
известно значительно меньше, чем о передаче сигнала в каскаде фототрансдукции
Связь, установленная между определенными стадиями фотолиза и этапами
темновой адаптации, позволила определить те критические стадии фотолиза,
которые могут быть мишенью при различных заболеваниях сетчатки, связанных с
нарушениями темновой адаптащга.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены и обсуждены на ХП Международном
совещании и V школе по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2001); V
Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей
(Санкт-Петербург, 2002); V I Пущинской конференции молодых ученых (Пущино,
2002); v n Пущинской конференции молодых ученых (Пущино, 2003); П
Международном симпозиуме «Visionarium» (Твярминне, Финляндия, 2003); VII
Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей
(Санкт-Петербург, 2004); Ш Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004); Ш
Международном симпозиуме «Visionarium» (Твярминне, Финляндия, 2004);
Международном симпозиуме по физиологии клетки (Санкт-Петербург, 2004);
X X V I I I Европейской конференции по зрительному восприятию (Ла Корунья,
Испания, 2005); IV Международном симпозиуме «Visionariшn» (Твярминне,
Финляндия, 2005).
По материалам диссертации опубликованы 4 научные статьи в рецензируемых
журналах и 11 тезисов докладов на российских и международных конференциях.
Личный вклад автора
Все результаты, включенные в диссертацию, получены лично автором или при
его непосредственном участии.
Структура диссертации
Диссертация изложена на 168 страницах, состоит из введения, четырех глав
(обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты, обсуждение
результатов), выводов и списка литературы, включающего 210 источников.
Диссертация иллюстрирована 45 рисунками и 3 таблицами.
Материалы и методы
Измерения выполнялись на разных типах фоторецепторов из сетчаток
травяных лягушек Rana temporaria, озерных лягушек Rana ridibunda, обыкновенных
жаб Bufo bufo и серебряных карасей Carassius auratus auratus. Перед экспериментом
животные адаптировались к темноте в течение 12 часов Декапитация животного
проводилась в полной темноте, чтобы избежать обесцвечивания зрительного
пигмента. С той же целью все последующие операции по извлечению сетчатки и
приготовлению препарата проводились при помощи инфракрасной телевизионной
системы или, при работе с палочками амфибий, при слабом красном свете (А, > 650
нм).
МикроспектроФотометрия.
Для
исследования
продуктов
фоголиза
зрительного пигмента в интакгных фоторецепторах (палочках и колбочках)
использовался скоростной микроспектрофотометр [Говардовский и Зуева, 2000;
Govardovskii et al., 2000]. Существующая в настоящее время модификация прибора
позволяет регистрировать спектры поглощения одиночных фоторецепторов при
двух направлениях поляризации света: в плоскости мембран фоторецепторных
дисков (далее обозначается Т) и перпендикулярно ей (L). Скорость сканирования
составляет до 1200 нм/с.
При измерениях фоторецепторы находились в физиологическом солевом
растворе, содержащем ПО мМ NaCl, 2.5 мМ КС1, 1 мМ СаСЦ, 1 мМ MgS04, 5 мМ
МаНСОз, 10 мМ глюкозы, 50 мкМ ЭДТА. рН раствора поддерживался посредством
10 мМ Na-HEPES (рН 7.5, в большинстве случаев), 10 мМ Na-фосфатного буфера
(рН < 6.5) или 10 мМ Tris-HCl (рН > 8.0).
Для исследования процессов фотолиза зрительный пигмент обесцвечивался
светодиодом высокой интенсивности (Marl International Ltd., Великобритания). В
зависимости от максимума поглощения зрительного пигмента использовался один
из следующих диодов: излучающий свет в синей (465 нм), зеленой (525 нм) или
оранжевой (615 нм) области спектра. Нужный светодиод вводился в световой путь,
подавалась короткая обесцвечивающая вспышка, и записывалась серия спектров:
первый - непосредственно после вспышки, остальные - через заранее заданные
интервалы времени. При этом первая запись после обесцвечивания (в дальнейшем
будет обозначаться О с) начиналась через 0.02 с после окончания засветки.
хода
Для вычисления концентраций продуктов фотолиза и построения временного
концентраций
использовались
математические
составленные нами на основе кинетических схем.
модели,
специально
Электрофизиологические исследования. Для исследования восстановления
чувствительности палочек и колбочек в темноте после действия яркого света
использовался метод всасывающей микропипетки [Baylor et al., 1979; Baylor et al.,
1980], позволяющий регистрировать внеклеточный ток фоторецепторов. Клетки
помещались в физиологический солевой раствор, содержащий 90 мМ NaCl (в случае
работы с палочками амфибий) или ПО мМ NaCl (при работе с фоторецепторами
карасей), 2 5 мМ КС1, 1 мМ СаСЬ, 1 мМ MgS04, 5 мМ NaHCOs, Ю мМ глюкозу, 50
мкМ ЭДТА, бычий сывороточный альбумин в количестве 100 мг/л; рН раствора
поддерживался == 7.5 с помощью 10 MMNa-HEPES.
Отведения выполнялись от одиночных свободно плавающих палочек и
колбочек, при этом внутри пипетки находился наружный сегмент фоторецептора.
Для световой стимуляции фоторецепторной клетки использовалась лампа-вспышка
и/или один из светодиодов: излучающий свет в оранжевой (615 нм) или в зеленой
(525 нм) области спектра. Для решения систем уравнений при математическом
моделировании сигнальной активности каскада фототрансдукции использовалась
программа MathCad 2001/ Professional (США).
Результаты и обсухздение
Методический подход, предназначенный для исследования тфоцессов
фотолиза зрительных пигментов, был предварительно отработан на красных
(родопсиновых) палочках из сетчатки амфибий, по которым в экспериментах in vitro
и in VIVO накоплен значительный объем литературных данных. Затем этот метод
анализа in vivo был применен для исследования процессов фотолиза палочковых и
колбочковых зррггельных пигментов у других животных.
Фотолиз порфиропсина палочек. На рис. 1 показана серия спектров
поглощения изолированных наружных сегментов палочек серебряного карася
Carassius auratus auratus, записанных
при Т- и
L-поляризации
в
темноадаптированном состоянии и через разное время после обесцвечивающей
вспышки (525 нм, 1 с) при рН 7.5. Спектр поглощения порфиропсина имеет
максимум при 517 нм (см. кривые «темнота» на рис. 1), а дипольный момент
хромофорной группы - 3,4-дегидроретиналя (далее - ретиналь) - ориентирован
преимущественно в плоскости дисков, как и у родопсина. Сразу после
обесцвечивания порфиропсина образуется равновесная смесь метапорфиропсина I,
максимально поглощающего около 500 нм, с метапорфиропсином П, поглощающим
около 400 нм (кривая О с на рис. 1 Т). Дальнейшее уменьшение Т-поглощения
вблизи 400 нм свидетельствует о распаде метапорфиропсина П. При изменении Тспектров в ходе фотолиза порфиропсина не наблюдается постепенного увеличения
поглощения в области 460-520 нм, характерного для фотолиза родопсина, т.е. распад
метапорфиропсина
II,
по-видимому,
не
сопрювоящается
появлением
метапорфиропсина Ш.
Т
/ос1
0 03
Темнота
3
Гц/зООсЛ
I
002 -,
С
ТЩ
1800 с ^ \ л
350
400
450
=B0«At**i4*»ite(
500
550
Длина волны, нм
600
кым
650
002
Темнота
0 01
350
400
450
500
550
600
650
700
Длина волны, нм
Рис. 1. Спектр поглощения порфиропсина (обозначен «темнота») и серия спектров в
разные моменты времени после обесцвечивающей вспьппки при двух направлениях
поляризации (Т, L ) для изолированньпс наружных сегментов палочек Carassius
auratus auratus. Каждый спектр - среднее из записей от 19 клеток
На L-спектрах видно образование /иранс-ретиналя при 400 нм и
одновременное образование продукта с максимумом поглощения в области 450-500
нм, названного нами Р-480 (рис, 1 L). Р-480 представляет собой транс-реггиаяль,
образовавший неспецифические шиффовы основания с различными аминогруппами
опсина и фосфатидилэтаноламинов липидного бислоя фоторецепторной мембраны.
В зависимости от природы нового места связывания и рН могут образовываться
продукты с различными спектрами поглощения, протонированные формы которых
и представляет собой Р-480. Поскольку изолированные наружные сегменты палочек
метаболически неактивны, то образования 3,4-дегидроретинола (далее в тексте ретинол) не происходит, а накапливаются ретиналь и Р-480.
10
Зная временной ход изменения поглощения при двух направлениях
поляризации, можно составить систему уравнений и определить временной ход
концентрации каждого из продукгов фотолиза.
Рассчитанные кривые временного хода концентраций продукгов фотолиза
порфиропсина показаны на рис. 2 А. Видно, что уменьшение концентрации
метапорфиропсинов I
и П в ходе фотолиза хорошо соответствует
одноэкспоненциальной кинетике (гладкая кривая). Ретиналь и его неспецифические
шиффовы основания (Р-480) достигают максимума к 900 с, после чего их
концентрации остаются постоянными. Расчет не показал достоверного образования
метапорфиропсина III: значения его концентрации варьируют вблизи нуля,
оставаясь в пределах экспериментальной ошибки.
Установленная схема медленных стадий фотолиза порфиропсина (рис. 2 Б)
отличается от схемы фотолиза родопсина отсутствием стадии образования мета Ш.
Экспериментально наблюдаемое отсутствие этого продукга подгверяадается
одноэкспоненциальной кинетикой распада метапорфиропсина П, которая при 20 °С
характеризуется константой скорости к = 2.110'^ с''. Следовательно,
альтернативный путь фотолиза через стадию метапигмента III, присутствующий у
амфибий, не обязателен для распада зрительного пигмента до свободного ретиналя
и опсина. Таким образом, схема фотолиза родопсина амфибий не универсальна и не
распространяется на все зрительные пигменты.
I
концентрация
В-0
\
1°
1о
I
Ml ♦ МП
.
.
Ретиналь + опсин <
Р-4в0
/\...^'-^.
1
^ МетаП
Реганаль
/^
!
^лстро«
Мета! <
рслшмесие
\
1 к
А
1
вОО
Mill
.
.
1
BQO
.
.
1200
-" Р-480
1S00
Время после вспышки, с
Рис. 2. Временной ход изменения относительных концентраций долгоживущих
продукгов фотолиза порфиропсина палочек Carassius auratus auratus (А) и схема
взаимопревращений долгоживущих продуктов фотолиза порфиропсина карася (Б)
Фотолиз
зрительного
пигмента
зеленых
палочек.
Так
называемые
«зеленые» палочки, встречающиеся в сетчатках некоторых видов амфибий.
11
содержат колбочковый опсин [Ма et al., 2001] Благодаря относительно большим
размерам наружных сегментов, зеленые палочки являются хорошим объектом для
изучения процессов фотолиза их колбочкоподобного зрительного пигмента.
Рассчитанный по спектрам поглощения временной ход изменения
концентраций продуктов фотолиза в изолированных наружных сегментах зеленых
палочек показан на рис. 3 (А, Б) заполненными символами. Видно, что
концентрация метапигментов I и I I непрерывно уменьшается (см. рис. 3 А).
Продукт, предположительно названный нами метапигментом Ш, достигает
максимума примерно к 30 с и затем распадается (концентрация метапигмента Ш
показана на рис. 3 А в увеличенном масштабе и должна соотноситься с правой осью
ординат). Ретиналь и его неспецифические шиффовы основания с опсином
(имеющие в данном случае максимум поглощения около 440 нм и названные нами
Р-440) накапливаются в течение 5 минут, а затем медленно уходят из наружного
сегмента, что видно по незначительному уменьшению их концентраций (рис. 3 Б).
i
10
а
5
08
Ф
-106
S
1
S
CD
О
^
Щ
О
^
0"
02
00^
02
А
■
Д м + м«
i
?
■
а.
Ё
з!
S2.
о:
i
Т
»
100
Mill
т
200
В р е м я после в с п ы и к и , с
~ .
10
08
06 .^^^\^ ^ " Р е т и н о л
04
S
iО 02,
00
300
Б
Ретиналь
а.
о
^ 00'
Цц^
р-440
1
300
600
900
В р е м я после вспышки, с
Рис. 3. Временной ход изменения концентраций долгоживущих продуктов фотолиза
зрительного тгагмента зеленых палочек Rana temporaria. Заполненные символы
относятся к изолированным наружным сегментам, незаполненные - к интактным
клеткам; данные для метапигмента Ш на А должны соотноситься с правой шкалой
ординат. Все значения концентраций - среднее от 8 клеток. Гладкие кривые аппроксимация средних значений по всем клеткам двумя экспонентами; для
изолированных наружных сегментов приведены средние значения ± ошибка
среднего
В
метаболически активных интактных зеленьге палочках кинетика
образования и распада метапигментов I, I I и Ш (незаполненные символы на рис. 3
А) совпадает с данными для изолированных наружных сегментов. Ретиналь и Р-440
12
накапливаются только до 100 с, а затем их концентрации уменьшаются, поскольку
они превращаются в ретинол (незаполненные символы на рис. 3 Б). Однако полного
превращения ретиналя и Р-440 в ретинол не происходит, вероятно, из-за
ограниченности метаболических ресурсов изолированных палочек.
Схема медленных стадий фотолиза зрительного пигмента зеленых палочек
показана на рис. 4. Обратимость перехода метапигмент I - метапигмент I I следует из
обратимой рН-зависимости относительного количества этих продуктов. Обратные
реакции из ретиналя и Р-440 маловероятны, что следует из независимости кинетики
распада метапродуктов от того, происходит ли превращение ретиналя в ретинол или
нет (см. рис. 3 А). Следует заметить, что небольшое количество короткоживущего
продукта, который условно назван метапигментом Ш, не позволяет сделать
надежные выводы относительно его свойств. Константы скорости реакций (^i)
можно найти, приближая экспериментальные данные (рис. 3 А) двумя
экспонентами. Значения ki и кг определяются достаточно надежно: к\ = 3.110'' с'';
кг = 4.510"^ с''. Значения k.i и к^, характеризующие минорный компонент
(метапигмент Ш), очень чувствительны к погрешностям экспериментальных
данных, и анализ дает для кз отрицательное значение, что, очевидно, не имеет
смысла.
1с
быстрое
'*' I
Meral равновесие
^ = ± МетаП <—»
МетаШ
К
Ретиналь + опсин <
> Р-440
Рис. 4. Схема переходов между долгоживущими продуктами фотолиза зрительного
пигмента зеленых палочек амфибий
Таким образом, схема медленных стадий фотолиза зрительного пигмента
зеленых палочек амфибий совпадает со схемой фотолиза родопсина, но распад их
пигмента происходит на порядок быстрее, чем в случае родопсина и порфиропсина.
Тем не менее, пигмент зеленых палочек является достаточно специфическим
примером колбочкового пигмента, и неясно, насколько его свойства характеризуют
свойства «настоящих» колбочек. Для выяснения этого вопроса были исследованы
зрительные пигменты красночувствительных колбочек, которые, вместе с
зеленочувствительными
колбочками,
составляют
основной
процент
цветоразличающих фоторецепторов и определяют свойства дневного зрения.
Фотолиз зрительного пигмента колбочек Спектр поглощения темнового
зрительного пигмента красночувствительных колбочек карася, хромофором
которого является 3,4-дегидроретиналь, характеризуется о-полосой с максимумом
около 620 нм и р-полосой около 420 нм (кривые «темнота» на рис. 5). Дихроичное
отношение в максимуме поглощения темноадаптнрованного пигмента ~ 2,
следовательно, дипольный момент его хромофора преимущественно ориентирован в
плоскости мембран, как и у зрительных пигментов палочек. Спектр поглощения
темнового зрительного пигмента хорошо описывается стандартной кривой для
пигментов на основе витамина Аг с максимумом при 617 нм [Govardovskii et al.,
2000].
ф
I
ф
004
=г
о
а
002
ООП
Твмюта
/оЛ
Т
JtriocM
2ooSvJN^
350 400 450 500 550 600 650 700 750 800
Длине волны, нл
;
004
!
0 02
000
350 400 450 500 550 600 650 700 750 800
Длина волны, нм
Рис. 5. Спектры поглощения темноадаптированного наружного сегмента и серия
спектров в разные моменты времени после обесцвечивающей вспышки, при двух
направлениях поляризации (Т, L) для красных колбочек серебряного карася
Carassius auratus auratus; каж}цш спектр - среднее из записей от 13 клеток
Сразу после обесцвечивания зрительный пигмент исчезает, и появляется
высокий пик на 400 нм, соответствующий метапигменту П (кривая О с на рис. 5 Т).
Небольшой пик около 525 нм соответствует метапигменту I, находящемуся в
равновесии с метапигментом П. Дальнейшие изменения Т-спекгров демонстрируют
быстрый распад метапигментов I и II и появление небольшого коротковолнового
пика, соответствующего ретинолу (3,4-дегидроретинолу, кривая 200 с на рис. 5 Т). В
процессе распада метапигмента П не возникает даже небольшого количества
метапигмента III, формирование которого должно было бы проявляться как
постепенное увеличение Т-поглощения в области 460-550 нм. Поведение L-спектров
значительно отличается от поведения Т-спектров. Низкий начальный пик на 400 нм
в ходе фотолиза быстро возрастает, демонстрируя накопление ретиналя.
14
освобождающегося из метапигмента П и ориентированного преимущественно
перпендикулярно мембране (кривая 10 с на рис. 5 L). В дальнейшем ретиналь
быстро превращается в ретинол с максимумом поглощения около 350 им, также
ориентированный преимущественно перпендикулярно мембране (кривая 200 с на
рис. 5 L). Анализ спектров также показал образование короткоживущего продукта с
максимумом поглощения при 450-490 нм, по-видимому, аналогичного Р-480
палочек.
Рассчитанные изменения концентраций продзтсгов фотолиза колбочкового
зрительного пигмента показаны на рис. 6 А. Распад равновесной смеси
метапигментов 1/П происходит по двухэкспоненциальной кинетике с периодом
полураспада около 5 с. Концентрация ретиналя возрастает примерно до 10 с, а затем
уменьшается в результате его восстановления в ретинол Образование ретинола
сопровождается постепенным его уходом из наружного сегмента, поэтому кривая
концентрации ретинола на конечном этапе хфактически горизонтальна. Временной
ход концентрации метапигментов 1/П хорошо приближается суммой двух экспонент
с постоянными времени TI = 5 с и гг = 73 с и относительными амплитудами 0.79 и
0.21, соответственно. Временной ход концентрации ретиналя - разностью двух
экспонент с одинаковой амплитудой и постоянными времени TI = 142 с и гг = 5 с.
канцвтрация
быстрое
Мета! <-
-^ МетаП
Ретиналь + опсин «=_
Р-480
Время после вспышки, с
Рис. 6. Временной ход концентраций долгоживущих продуктов фотолиза (А) и
схема переходов между долгоживущими продуктами фотолиза (Б) для зрительного
пигмента красных колбочек серебряного карася Carassius auratus auratus;
образование небольшого количества короткоживущего продукта Р-480 на А не
показано
Предлагаемая схема медленных стадий фотолиза зрительного пигмента
красночувствительных колбочек (см. рис. 6 Б) отличается от схемы фотолиза
пигментов палочек амфибий. Заложенный в данную схему прямой распад
15
равновесной смеси метапигментов I и П на свободный траис-регтналь и опсин не
подтвержцается двухэкспоненциальной кинетикой распада метапигментов, но и не
противоречит ей. Распад метапигменгов I/II по кинетике не первого порядка может
происходить без формирования дополнительного продукта, хотя не исключено, что
такой продукт все же существует, но необнаружим при микроспектрофотометрических измерениях.
Сравнение процессов фотолиза исследованных зрительных пигментов.
Таким образом, в ходе фотолиза палочковых родопсина и порфиропсина,
колбочкоподобного пигмента зеленых палочек и пигмента красночувствительных
колбочек образуются следующие промежуточные состояния: мета I, мета I I , трансретиналь и его неспецифические шиффовы основания, а также транс-ретинол.
Продукт, соответствующий состоянию мета Ш, образуется в больших количествах
только при фотолизе родопсина палочек, и в незначительных количествах - в
зеленых палочках. В палочках и колбочках Carassius auratus auratus аналог мета Ш
не обнаруживается, что подтверждает ранее предполагавшееся отсутствие этого
альтернативного пути фотолиза в сетчатке карася [Reuter, 1973; Donner et al., 1974].
Следовательно, метапигмент III не обязателен для распада зрительного пигмента на
свободный ретиналь и опсин. Следует отметить, что отличие между схемами
распада основанных на витамине Ai (ретиналь) пигментами амфибий и
Время, с
Рис. 7. Сравнение кинетики распада метапродуктов в разных типах фоторецепторов
1 - порфиропсиновые палочки Carassius auratus auratus, 2 - родопсиновые палочки
Bufo bufo, 3 - зеленые палочки Rana temporaria, 4 - красночувствительные колбочки
Carassius auratus auratus; по оси ординат - суммарная концентращм всех
метапродуктов
НУ гтл immm
16
содержащими витамин Аг (3,4-дегидроретиналь) пигментами карася не связано
непосредственно с природой хромофора Ранее было показано, что метапигмент Ш у
лягушки-быка (Rana catesbeiand) образуется как в палочках центральной части
сетчатки, содержащих ретиналь, так и в палочках дорзальной ее части, содержащих
3,4-дегидроретиналь, при этом все палочки используют одинаковые опсины
[Gyllenberg et al., 1974].
Качественно похожий ход процессов фотолиза во всех исследованных
фоторецепторах сопровождается важным количественным отличием - существенно
более высокой скоростью распада колбочковых зрительных пигментов на трансретиналь и опсин по сравнению с пигментами палочек. Для сравнения кинетики
фотолиза на рис. 7 приведены кривые, отображающие временной ход изменения
суммарной концентрации метапродукгов I, П и Ш в разных типах фоторецепторов.
Высокую скорость распада зрительного пигмента колбочек (кривая 4) нельзя
связывать с отсутствием метапигмента III, поскольку мета Ш отсутствует,
например, и в палочках карася, порфиропсин которых показывает самую низкую
скорость фотолиза (кривая 1).
Результаты нашего исследования показывают, что гидролиз связи хромофора
с опсином у колбочкоподобного пигмента зеленых палочек происходит почта на
порядок быстрее, чем у родопсина красньпс палочек той же сетчатки (ср. кривые 2 и
3 на рис. 7). Константа скорости распада суммы метапигментов I и П в зеленых
палочках при 20 "С и рН 7.5 равна 4.510'^ с ' , в то время как у родопсиновых
палочек она составляет 5.310'' с"'. Кроме того, в красных палочках образуется
большое количество относительно долгоживущего метародопсина Ш, в котором
нативное хромофорное место на опсине по-прежнему занято ретиналем и
недосту1шо для регенерации [Kolesnikov et al., 2003]. В зеленых палочках продукт,
называемый нами метапигментом Ш, является минорным короткоживущим
компонентом и не должен ограничивать скорость регенерации.
В «настоящих» колбочках гидролиз связи транс-ретиналя с опсином
происходит почти в 70 раз быстрее, чем в палочках той же сетчатки (ср. кривые 1 и
4 на рис. 7). Первый протекает по двухэкспоненциальной кинетике и
характеризуется периодом полураспада 5 с, а второй - по одноэкспоненциальной
кинетике с периодом полураспада 338 с.
Таким образом, характерной отличительной особенностью фотолиза
колбочковых зрительных пигментов является быстрый гидролиз связи трансретиналя с опсином. Это делает хромофорный центр на опсине доступньпл для
рекомбинации с П-^ис-ретиналем и дает субстрат (свободныйотранс-ретиналь)для
17
регенерации 11-1/мс-хромофора, тем самым обеспечивая быстрое восстановление
темнового зрительного пигмента.
Фотолиз и темповая адаптация. Для сопоставления данных о скорости
распада зрительных пигментов со скоростью темновой адаптации фоторецепторов
было проведено исследование восстановления чувствительности палочек и колбочек
в темноте после действия света высокой интенсивности.
Серия ответов изолированной красной палочки из сетчатки Rcma ridibunda на
вспышки увеличивающейся интенсивности показана на рис. 8 А. Величина
темнового тока принимается за нулевой уровень, а фотоответы изображаются в виде
положительных отклонений от него. До определенной интенсивности стимула
амплитуда фотоответа градуально возрастает, пока не происходит насыщение
Уровень насыщения фотоответа соответствует полному закрытию катионных
каналов плазматической мембраны фоторецептора. Дальнейшее увеличение силы
стимула приводит к тому, что ответ находится в насыщении все большее время (см.
рис 8 А). Выход фотоответа из фазы насыщения отражает восстановление
способности фоторецептора реагировать на свет, т.е. течение процесса темновой
адаптации.
100
200
Время после вслышш, с
10^
10'
10-"
Относительное обесцвечивание
Рис. 8. Серия ответов на короткие насыщающие вспышки увеличивающейся
интенсивности в состоянии темновой адаптации (А) и зависимость времени
пребывания фотоответа в насыщении от относительного обесцвечивания родопсина
(Б) для изолированной красной палочки Rana ridibunda. Штриховая линия на А
показывает уровень восстановления темнового тока, принятый в качестве критерия
выхода из насыщения
18
График зависимости времени пребывания фотоответа в насьпцении от
относительного обесцвечивания родопсина (рис 8 Б) имеет две характерные фазы.
Линейный участок зависимости при достижении некоторого критического уровня
яркости вспышки делает крутой изгиб, после чего восстановление темпового тока
резко замедляется. Выход фотоответа из фазы насыщения происходит в тот момент,
когда свегоиндущфованная активность эффекторного фермента каскада
фототрансдукции - фосфодиэстеразы цГМФ - падает до определенного
критического уровня. Поэтому из графика зависимости времени в насыщении от
относительного обесцвечивания зрительного пигмента (рис. 8 Б) можно определить
временной ход выключения светоиндуцированной активности фосфодиэстеразы
(см. различные символы на рис. 9 Б).
С другой стороны, временной ход выключения активности фосфодиэстеразы
можно предсказать на основе построенной нами математической модели, которая
описывает выключение активности каскада фототрансдукции с учетом кинетики
распада продуктов фотолиза и их способностей возбуждать каскад (см. рис. 9 А).
М1Г * „
Рис. 9. Схема выключения активности каскада фототрансдукции, направленной на
гидролиз цГМФ (А) и временной ход выключения светоиндуцированной активности
фосфодиэстеразы в красных палочках Rana ridibunda (Б); разные символы на Б
соответствуют
разным
клеткам. МП*
- метародопсин П, MII-P
фосфорилированный метародопсин П, М-Р-Агг - фосфорилированные и связанные с
аррестином метародопсины. Ops - опсин, Rh - родопсин, Т* - трансдуцин, PDE* и
PDE - соответственно, активная и неактивная формы фосфодиэстеразы цГМФ; куц,
кмп р, f^MA, kops, kpDE - константы скорости первого порядка для соответствующих
реакций; Омп, амп Р, <^МА, ^Ор^ - каталитические активности соответствующих
продуктов фотолиза (относительно Mil)
19
Подбирая параметры модели, можно хорошо воспроизвести экспериментальные
данные (сплошная линия на рис. 9 Б - модельная кривая, параметры подгонки см. в
табл. 1).
Снижение светоиндуцированной активности фосфодиэстеразы следует
двухфазной кинетике, причем первая быстрая фаза примерно через 30 с сменяется
второй более медленной фазой, продолжительность которой в палочках лягушки
составляет более часа. Пунктирные и штриховые линии на рис. 9 Б отображают
вклад в общую активность фосфодиэстеразы ее долевых активностей, вызванных
отдельными промежуточными продуктами фотолиза. Видно, что значительный
вклад в медленную фазу между 30 с и 5 мин после вспышки вносят распадающиеся
метародопсины I, П и Ш. Остальная часть медленной фазы (после 5-й минуты)
контролируется образованием свободного опсина из метародопсинов и его
исчезновением в результате регенеращш родопсина.
Аналогичный методический подход был применен к колбочкам. Они отвечают
на вспышки света подобно палочкам (см. рис. 10 А), но фотоответы колбочек на
порядок быстрее, а чувствительность этих фоторецепторов на два порядка ниже по
сравнению с палочками. Результаты проведенного для колбочек математического
моделирования показаны на рис. 10 Б и в табл. 1. Двухфазная кинетика снижения
светоиндущ1рованной активности колбочковой фосфодиэстеразы выражена менее
ярко, чем в палочках. Смена фаз происходит уже на 2-3 секунде после
3
Ч^^
«•rV
Ш-Р
Б
о
ia2
4V *
^^
i(H '
л» •
\\ у\ *••
\ \ 0
\
10* .
10» 5
и
15
Время после вслышш, с
10»
№'
10» I
♦ О ^
\
\
S
ia-|
I
10-' к
«
+ \
\
Время, с
10'
О
10* I
10« I
Рис. 10. Серия ответов изолированной красночувствительной колбочки Carassius
auratus auratus на короткие насыщающие вспышки увеличивающейся
интенсивности в состоянии темповой адаптации (А) и временной ход выключения
светоиндуцированной активности фосфодиэстеразы в красночувствительных
колбочках (Б)
20
обесцвечивания зрительного пигмента, а к 20 с происходит п р а к т и ч е с к и полное
выключение
активности.
фосфодиэстеразы
Видно,
контролируется
что
первая
фаза
инактивацией
затухания
метапигмента
активности
П , а вторая
-
распадом метапигментов I и I I н а ретиналь н опсин. Т а к и м о б р а з о м , в ы к л ю ч е н и е
активности каскада фототрансдукции в колбочках происходит п о т о й ж е схеме, ч т о
и в палочках.
И з соответствующих математических моделей б ы л и определены к о н с т а н т ы
скорости реакций и относительные каталитические а к т и в н о с т и продуктов фотолиза
( с м табл. 1). В е л и ч и н ы отностггельных каталитических а к т и в н о с т е й продуктов д л я
палочек и к о л б о ч е к близки. Зато распад продуктов фотолиза и соответствующее
в ы к л ю ч е н и е активности каскада фототрансдукции происходагг в к о л б о ч к а х намного
быстрее. Э т о и я в л я е т с я одним и з факторов, о б е с п е ч и в а ю щ и х более
высокую
скорость темповой адаптации к о л б о ч е к п о сравнению с п а л о ч к а м и .
Таблица 1
Константы скорости первого порядка (к, с"') и относительные каталитические
активности (а) для продуктов фотолиза родопсина палочек лягушки и зрительного
пигмента колбочек карася (также см. рис. 9 А )
кми
кш1Р
кмл
kops
kpDE
омп
OMIIP
ОМА
OOps
Палочки
1.0
0.28
1.210-^
8-10-^
0.33
1
0.012
9-10-*
2.110-*
Колбочки
11
4
0.2
0.01
10
1
0.025
410'
2.510-*
Выводы
1.
При
помощи
скоростного
дихроичного
микроспектрофотометра
исследованы медленные реакции фотолиза зрительного пигмента в
палочках
и колбочках
амфибий
и р ы б , и установлены
интактных
кинетические
схемы
взаимопревращений метапигмепггов I , П , Ш , ретиналя и ретинола.
2. С х е м а медленных стадий фотолиза, установленная ранее д л я родопсинов
б ы к а и л я г у ш к и , н е я в л я е т с я универсальной, поскольку о б р а з у ю щ и е с я продукты
фотолиза зависят к а к от вида зрительного пигмента, т а к и о т вида животного.
3
В
зависимости
метапигментов
в
10 -
метапорфиропсинов.
о т вида
животного,
70 раз в ы ш е ,
скорость
чем у
распада
палочковых
колбочковых
метародопсинов/
21
4. Лимитирующей стадией в генерации одного из ключевых продуктов
зрительного цикла -отранс-ретинола- в палочках является образование ретиналя в
результате распада метародопсинов, а в колбочках - превращение ретиналя в
ретинол, катализируемое ферментом ретинолдегидрогеназой
5. При электрофизиологическом исследовании одиночных палочек и колбочек
показано, что выход фоторецепторов из насыщения после действия ярких стимулов
происходит в две временные фазы. Первая фаза определяется быстрой инактивацией
метапигмента П, а вторая - медленным распадом метапигментов на опсин и
ретиналь и последующей регенерацией темнового пигмента.
6. Каталитические активности различных промежуточных продуктов распада
зрительного пигмента по отношению к полностью активному метапигмету П у
палочек и колбочек близки и составляют для фосфорилированного мета П ~ 10'^,
фосфорилированных и связанных с аррестином метапродукгов ~ 10'', свободного
опсина -10"*.
7. Быстрый распад колбочковых зрительных пигментов по сравнению с
палочковыми является одним из основных факторов, лежащих в основе более
быстрой темновой адаптации колбочек.
Список работ, опубликованных по материалам диссертации
1. Голобокова Е.Ю. Кинетика медленных стадий фотолиза зрительного
пигмента "зеленых" палочек лягуппси // Тез. докл. Х П Международного совещания и
V школы по эволюционной физиологии. - Санкт-Петербург. - 2001. - С. 32.
2. Голобокова Е.Ю., Колесников А.В. Фотолиз зрительных пигментов
"красных" и "зеленых" палочек амфибий in situ II Тез. докл. 5-й Всероссийской
медико-биологической конференции молодых исследователей "Человек и его
здоровье". - Санкт-Петербург. - 2002. - С. 55-56.
3. Голобокова
Е.Ю.,
Колесников
А.В.
Медленные стадии фотолиза
зрительного пигмента "зеленых" палочек лягушки in situ II Тез. докл. 6-й
Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука X X I века". Пущино. - 2002. - С. 15-16.
4. Голобокова Е.Ю. Медленные стадии фотолиза зрительного пигмента
колбочек // Тез. докл. 7-й Пущинской школы-конференции молодых ученых
"Биология - наука X X I века". - Пущино. - 2003. - С. 57-58.
5. Голобокова Е.Ю., Колесников А.В., Говардовский В.И. Медленные стадии
22
фотолиза зрительного пигмента зеленых палочек лягушки Rana temporaria II
Сенсорные системы. - 2003. - Т. 17. - С. 134-143.
6. Kolesnikov A.V., Golobokova E.Y., Govardovskii V.I. The identity of
metarhodopsin Ш // Visual Neuroscience. - 2003. - V. 20. - P. 249-265.
7.
Golobokova E.Y., Kolesnikov A.V., Govardovskii V.I. Photolysis of cone
visual pigments in situ II Abstracts of the "Visionarium П". - TvSnniime (Finland). 2003.-P. 6-7.
8. Говардовский В.И., Шуколюков C.A., Колесников A.B., Голобокова Е.Ю.
Цикл зрительного пигмента и темповая адаптация: новые подходы к исследованию
// Российский физиологический журнал. - 2004. - Т. 90. - С. 1015-1025.
9. Голобокова Е.Ю. Сравнение процессов фотолиза зрительных пигментов
палочек и колбочек // Тез. докл. 7-й Всероссийской медико-биологической
конференции молодых исследователей "Человек и его здоровье". - СанктПетербург. - 2004. - С. 61-62.
10. Голобокова Е.Ю. Особенности медленных стадий фотолиза зрительного
пигмента колбочек // Тез. докл. Ш Съезда биофизиков России - Воронеж. - 2004. С. 407-408.
11. Golobokova E.Y., Govardovskii V.I. Slow stages of the visual pigment
photolysis: rods vs. cones // Abstracts of the "Visionarium Ш". - Tvarminne (Finland). 2004. - P. 7.
12. Golobokova E.Y. Signaling states of a G-protein coupled receptor: rod and
cone visual pigments // Abstracts of the international workshop in cell physiology. - St.
Petersburg (Russia). - 2004. - P. 33.
13. Firsov M.L., Kolesnikov A V., Golobokova E.Y., Govardovskii V.I. Two
reahns of dailc adaptation // Vision Research. - 2004. - V. 45. - P. 147-151.
14. Golobokova E.Y., Govardovskii V.I. Late stages of photolysis: cone vs rod
visual pigments // Perception. - 2005. - V. 34 (Supplement: Abstracts of the X X V I I I
European conference on visual perception). - P. 195-196.
15. Golobokova E.Y. Visual pigment photolysis and cone daric adaptation //
Abstracts of the "Visionarium IV". - Tvarminne (Finland). - 2005. - P. 8.
Лицензия Л Р №020593 от 07.08.97
Подписано в печать 19.10.2005. Формат 60x84/16. Печать цифровая.
Усл. печ. л. 1,25. Тираж 70. Заказ 119Ь.
Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором,
I Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета.
195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29.
Тел.: 550-40-14
Тел./факс: 247-57-76
•"21137
РНБ Русский фонд
2006-4
22584
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
994 Кб
Теги
bd000102527
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа