close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

bd000102834

код для вставкиСкачать
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
ИИ. MJB. ЛОМОНОСОВА
ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ
Ий щшвах/укоянсн
СУБАЧ ФЕДОР ВАСИЛЬЕВИЧ
ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ КОМПЛЕКСА ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ
EcoRII С ДНК С ПОМОЩЬЮ БИОХИМИЧЕСКИХ И СПЕКТРАЛЬНЫХ МЕТОДОВ
02.00.10 - биооргяннческяя хпияя
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата химических наук
^^^Лихги
Москва - 2005
Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета М Г У
им. М.В. Ломоносова
Научный руководитель:
доктор химических наук, профессор
Громова Елизавета Сергеевна
Официальные оппоненты:
доктор химических наук,
Демидкина Татьяна Викторовна
кандидат биологических наук,
Солонин Александр Сергеевич
Ведущая организация:
Институт биоорганической химии
им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Р А Н
Защита состоится 20 декабря 2005 года в 17 часов на заседании Диссертационного совета
Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском Государственном Университете
им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, М Г У , Институт физикохимической биологии им. А.Н. Белозерского, ^дитория 501.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета М Г У
им. М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан 18 ноября 2005 г.
Ученый секретарь диссертащюнного совета
кандидат химических наук
И.Г. Смирнова
1П1Ш
^MAzJf
^ЗП 9
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Аюуальность проблемы.
Эндонуклеазы рестрикции (ЭР), входящие в систему рестрикции-модификации в
прокариотах, защищают клепку от пронихновевня чужеродной Д Н К путЕм узнавания и
расщепления
коротких
нуклеотидных
последовательностей. Э Р
модельными системами для исследования молекулярных
основ
являются
удобными
сайт-специфического
взаимодействия белков с ДНК. Как показано в последнее время, среди большого
многообразия Э Р (более 3700) часть ферментов при расщеплении ДНК взаимодействует
одновременно с двумя участками ДНК. Изучение таких Э Р позволяет понять сложные
генетические процессы, в которых ферменты взаимодействуют с несколькими участками
ДНК. Эти Э Р интересны с точки зрения изучения эволюционных взаимосвязей между Э Р и
другими ферментами, обладающими яуклеазной активностью (рекомбиназы, резольвазы,
транспозазы, ишегразы, и тл.)- Открьпве Э Р , взаимодействующих с двумя участками
узнавания в Д Н К , в практическом применении позволяет разработку новых подходов в
генной инженерии.
Обьектом исследования данной работы является Э Р EcoRII (R.EcoRII), существующая
в растворе в виде гомодимера н относящаяся к подтипу НЕ ЭР, для функционирования
которых необходимо одновременное связывание двух копий участка узнавания, причбм одна
копия
участка
узнавания
(аллостерический
эффектор)
активирует
расщепление
фосфодвэфирных связей в другой копни участка узнавания (субстрате). R.EcoRII узнабт в
ДНК
пятвзвенную
вуклеотядную
последовательность
каталитический акт в присзпствии кофактора, ионов
( ^~ CCAGG )
3- GGTCC^
и
за
один
', расщепляет две фосфодиэфирные
связи в одном из двух участков узнавания в положениях, указанных стрелками. Как было
показано с помощью рентгеноструктурного анализа (РСА) фермента и биохимических
методов, каждая субьединица R.EcoRn состоит из двух доменов: N-концевого (эффекторсвязывающего) и С-концевого, содержащего каталитический центр (каталитического).
Показано, что два каталитических центра, уятгдыО из которых отвечает за расщепление
одной фосфодиэфирной связи, стерически блокированы эффекторными доменами. Сделано
предположение, что вначале зффекюрные домены R.EcoRII связывают один из двух
участков узнавания (эффекгорную ДНК), открывая доступ к каталитическим доменам. Затем
происходит связывание и расщепление другого участка узнавания (ДНК-субстрата) двумя
каталитическими доменами. В нашей лаборатории Бабкиной О.В. было показано, что
аминокислотные остатки (а.о.) из обеих субьединиц фермента формируют каждую из двух
ДНК-связывающих полостей R.EcoRII в комплексе R.EcoRII-ДНК.
РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ\
БИБЛИОТЕКА,
J
s^'iftM
Цель и задачи исследонания. Целью настоящей работы явилось изучение ДНКбелковых контактов и определение взаимного расположения двух участков узнавания EcoRII
в комплексе эндонуклеазы рестриюции EcoRII с ДНК.
В
работе решались следующие задачи. (1) Определение контактов R-EcoRU с
углеводофосфатным остовом и с группами атомов ДНК, расположенными в малой бороздке
двойной спирали, путем изучения субстратных свойств ДНК-дуплексов, содержащих в
участке узнавания EcoRII остатки 1-ф-0-2'-дезокси-трео-пентафуранозил)шпозина
или
1-(Р-0-2'-дезокси-трео-пентафуранознл)тимина
(dTi)
вместо
dC
или
(dC,)
dT,
межнуклеотидвую хиральную тиофосфатную группу, замещающую фосфатные группы, и
остатки (+)- или (-)-mpflHC-aHmu-6eH3o[fl]nHpeHa-N^-dG ((+)dG* или (-)dG*) вместо dG. (2)
Определение участка(ов)
в
R.EcoRII,
взаимодействуюшего(их)
с
А/Т-парой участка
узнавания EcoRII, методом фотоаффинной модификации R.EcoRII. (3) Анализ топографии
двух участков узнавания E c o R I I в комплексе R.EcoRII-ДНК с помощью изучения переноса
энергии возбужгкиия флуоресценщга между флуоресцентными метками, введенными в
молекулу ДНК, содержащую два участка узнавания EcoRII.
Т^аучиаа
новнзн»
н
практичесюм
денностъ
р«6<пы. Впервые
проведено
зондирование коитахтов R-EcoRII с отдельными фосфатными группами Д Н К с помощыо
изменения пространственного расположения этих групп. Установлен различный вклад
отдельных фосфатных групп во взаимодействие с эффекюрными и каталитическими
доменами R.EcoRII, что предполагает разные механизмы взаимодействия отдельных
доменов фермента с ДНК. Разработан подход для получения аналогов субстрата R.EcoRII, в
которых каждая межвукпеотвдная фосфатная группа участка узнавания замещалась на
хиральную тиофосфатную группу. С помощью этих аналогов субстрата показано, что не
только гетероциклические основания, как было установлено ранее, но и большая часть
фосфатных групп участка узнавания EcoRII играют важную роль во взаимодействии
R-EcoRII с ДНК. Впервые показано, что в процессе расщепления Д Н К R.EcoRII фосфатные
группы, расположенные с З'-конца от расщепляемых связей, принимают участие в
координации ионов Mg^'^, что подтверждает гипотезу об участии данных фосфатных групп в
расщеплении соседней связи Э Р (Pingoud et al, 2005). Впервые с помощью аналогов
субстрата, содержащих остатки (-)-)dG* или (-)dG* вместо остатков dO в участке узнавания
EcoRII, было установлено, что R.EcoRII образует контакты не только с группами атомов,
расположенными в большой бороздке ДНК, как было найдено ранее, но и в малой бороздке.
В каталитическом домене R.EcoRII, вне каталитического кора R.EcoRII, определена
область ^ ^ * V E Y D " ' , ответственная за взаимодействие R.EcoRII с центральной нуклеотвдной
парой участка узнавания.
Разработан подход для структурного анализа комплекса К.ЕсоКП-ДНК в растворе,
базирующийся на изучении переноса энергии возбуждения флуоресценции в комплексе
К.ЕсоК11-ДНК между флуоресцентными метками, присоединенными рядом с участками
узнавания EcoRII, находящимися
на разных
концах протяжённой молекулы
ДНК.
Предложена модель, описывающая взаимное расположение двух участков узнавания EcoRII
в комплексе R.EcoRII-AHK.
Разработанные в работе подходы могут бьпъ рекомендованы для изучения ДНКбелковых
контактов
и
структуры
ДНК-белковых
комплексов
для
ферментов,
взаимодействующих с двумя участками ДНК.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 3
статьи. Результаты работы были представлены на 8-ой Менделеевской конференции
студентов-химиков (Москва, Россия, 1997), международном симпозиуме стипендиатов
научного фонда Медицинского института Говарда Хьюза стран Балтии, Центральной
Европы и бывшего Советского Союза (Москва, Россия, 1999), на международной
конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-2000"
(Москва, 2000) и на международной конференции "Биокатализ-2000" (Москва, 2000)
CmvicTVpa н объем работы. Диссертационная работа изложена на 142 страницах
машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы,
обсуждение результатов, экспериментальная часть, выводы и список литературы
( 200 цитируемых работ). Материал иляюстрирован 38 рисунками и 20 таблицами.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Зондирование контактов эндонуклеязы Е с о К П с фосфатными группами Д Н К .
Высокая специфичность расщеплевия Д Н К Э Р обусловлена образованием контактов
Э Р с гетероциклическими основаниями ("прямое считывание") и межиуклеотидными
фосфатными группами Д Н К ("непрямое считывание") участка узнавания ЭР. Ранее были
исследованы контакты Э Р EcoRII с гетероциклическими основаниями ДНК, однако данные
относительно контактов R.EcoRH с фосфатными группами ДНК практически отсутствовали.
ДНК
дуппексы,
содерясащие модифицированные углеводные остатки.
Для
зондирования контактов R.EcoRII с межиуклеотидными фосфатными группами Д Н К в
участке узнавания EcoRII в пяти позициях 2-4, 8 и 9 изменялось пространственное
положение фосфатной группы с помощью замещения остатков dC или dT в участке
узнавания EcoRII на остатки 1-(р-0-2'-дезокси-шрео-пентафуранозил)цитозина (dC,) или 1-
(Р-0-2'-дезокси-трео-пентафуранозил)тнмина (dT,), соответственно, (схема 1 и табл. 1) и
исследовалось влияние этих модификаций на субстратные свойства ДНК-дуплексов II-VI.
1 2
3 4 5 6
5 ' - G C C A A * p C p C p T p G p G p СТСТ
З'-CGGTTpGpGpApCpCnG АСА
10 9 8
о—,
^
с
^
Выделены межнуклеотвдные фосфатные группы,
[1ростравственвое положение которых менялось;
места расщепления R.EcoRII указаны стрелками.
о—,
т
^
^
o-i^e
Ow*
dCx
Оллл
dTx
Схема 1
Табл. 1. ДНК-дуплексы, содержащие остатки dC, или dT, и их температуры плавления.
№
I
П
Ш
IV
V
VI
ДНК-дуолскс
5'-GCCAACCTGGCTCT
З'-CGGTTGGACCGAGA
T™*C
58
5'-GCCAAC.CTGGCTCr
З'-COGTTG G A C C G A G A
5 •-GCTAACC.TGGCTCT
З'-CGGTTGG A C C G A G A
5'-GCCAACCT,GGCTCT
3'-CGGTTGGA C C G A G A
5'-GCCAACCTGG CTCT
3'-C»GTTGGACC,GAGA
5'-GCCAACCTG GCTCT
3'-CGGTTGGAC,CGAGA
55
54
49
-
' - ощждеяены с точностью ± 0.51радуса; Сднк 2 мкМ, X 260 ны.
ДНК-дуплексы I I и I I I , содержащие остаток dCi, имели термическую стабильность на
3-4 градуса меньшую, чем ДНК-дуплекс I, тогда как температура плавления ДНК-дуплекса
I V , содержащего остаток dTi, была на 9 градусов ниже, чем у ДНК-дуплекса I (табл. 1). С
помощью КД-спектроскошш показано, что происходит локальное изменение структуры
ДНК, но В-форма ДНК-дуплексов сохраняется (данные не приведены).
В отсутствие ионов Mg^'^ R.EcoRII связывала ДНК-дуплексы Ш , I V и V I (рис. 1, дор.
4, 5 и 7) с той же эффективностью, что и немодифицированный субстрат I (рис. 1, дор. 2);
связывание Д1Ж-дуплекса П ухудшалось в 2.5 раза, а ДНК-дуплекс V вообще не связывался
R.EcoRn (рис. 1, дор. 3 и 6). Можно предположить, что в отсутствие ионов Mg^'^ R.EcoRII
образует
контакты с
фосфатными группами Д Н К
в
позициях 2 и 8 (схема
1),
расположенными с 3'-конца от расщепляемых связей, и не образует контактов с фосфатными
группами в позициях 3, 4 и 9. Возможно, зги контакты отвечают за взаимодействие
эффекторных доменов R.EcoRII с ДНК, так как в отсутствие ионов Mg^^ зффекторвые
домены, полученные путем удаления каталитических доменов из полноразмеряой R.EcoRII с
помощью молекулярного клонирования, прочно связывают субстрат, а кагалитаческие
домены, пол}^енные аналогичным способом, практически не связывают ДНК при
используемых вами концентрациях R.EcoRII и ДЬЖ-дуплексов (Tamulaitis, G., and Siksnys,
v., неопубл. данные).
ДНКдуплексы
Ш а§ 11
Os
R.EcoRn
Рнс. 1. Связывание '^Р-меченвых
немодифицированного
ДНКдуплекса I (дор. 1 и 2) в ДНКдуплекса V I I , не содержащего
участка узнавания EcoRII (S'-
TAGAGCCGGTTGGaS 'ATCTCGGCCAACCG) (дор. 8), И
ДНК-дуплексов
II-VI,
содержащих
в
указанных
позициях
участка
узнавания
EcoRII остатки dC, или dT, (дор.
3-7) (Сднк 0.35 мкМ), с R.EcoRH
(CRECDRD лмер 0.13 МкМ), 5°С, в
буфере А; 40 мМ Tris-HCl, рН 7.6,
50мМКаС1,7мМДТТ.
Расщепление R.EcoRII обеих цепей ДНК-дуплексов П, Ш , V в V I , содержащих
остатки dCi, было полностью блокировано (данные не првведены). ДНК-дуплекс I V ,
содержащий остаток d T „ обладал таквмв же субстратными свойствами (К^
3.4 мин'*), как и немодифицнрованный субстрат I (К^
4.6 мкМ, к..,
2.3 мкМ, кщ 3.0 мин''). Следует
отметить, что и эффекгорные, в каталитические домены R.EcoRII образуют ковтахты с ДНК,
поэтому нгфушение ДНК-белкового контакта хотя бы в одном из доменов может приводить к
нарушению
расщепления
ДНК
R.EcoRII.
На
основании
влияния
нарушения
пространственного расположения межнуклеотидной фосфатной группы на расщепление
ДНК R.EcoRII можно предположить, что эффекгорные и/или каталитические домены
R.EcoRII образуют контакты с фосфатными группами ДНК в позициях 2, 3, 8 и 9 в ве
образуют контактов с фосфатной группой в позиции 4. Однако по данным расщепления
R EcoRII даК-дуплексов, содержащих тиофосфатную группу (см. ниже), R.EcoRII образует
контакт с фосфатной группой в позиции 4, поэтому, мы полагаем, ч ю введение остатка dTi,
вызывающее наибольшую дестабилизацию ДНК, приводит к локальному изменению
конформацвв ДНК-дуплекса, благоприятствующему
дуплекса
в
переходном
фермент-субстратном
изменению ковформации ДНКкомплексе
и
компенсирующему
энергетические потери от н!Ц>ушеш1я ДНК-белкового контакта.
Для зондирования контактов между каталитическими доменами R.EcoRII и
фосфатными группами ДНК было проведено расщепление ДНК-дуплексов I I , Ш , V и V I в
присутствии
14-звенного
немодифицированного
ДНК-дуплекса
VIU
(5'-
ACCTACCTGGTGGT/3'-TGGATGGACCACCA),
выступающего
В
качестве
аллостерического
эффектора, когда сохраняются контакты между эффекторяьоми доменами R.EcoRII и ДНК, а
могут нарушаться контакты между каталитическими доменами R.EcoRII и ДШС. В этих
условиях ДНК-дуплексы I I , V и V I не расщеплялись R.EcoRII, но наблюдалась активация
расщепления обеих цепей ДНК-дуплекса Ш (данные не приведены). Можно предположить,
что каталитические домены R.EcoRII образуют контакты с фосфатными группами Д Н К в
позициях 2,8 и 9 и не образуют контактов с фосфатной группой в позиции 3.
ДНК-дуплексы, содержащие межиуклеотидиую хиральную тиофосфатную группу.
Jifisi систематического исследования взаимодействия R.EcoRII с каждой из фосфатных
групп участка узнавания EcoRII использовались ДНК-дуплексы, в которых одна из
межнуклеотидяых фосфатных групп замещалась на тиофосфатную (Ps-) группу. Данная
модификация вносит минимальные изменения в структуру ДНК. Ps-rpynna существует в
виде Rp- и 5р- днастереомеров (схема 2).
VbT '"Vb^
12 3 4 5 6
5'-CCAApCpCpTpGpGpCTC
З'-GGTTpGpGpApCpCpGAG
9»«
S-P
OP'
12 11 10 9 8 7
о
I
Пронумерованы иежнуклеотидные фосфатные группы.
соторые замещались на тнофосфвтную;
песта расщепленм R.EcoRII указаны стрелками
Яр-двастереомср
Sp-ятстереоиер
Схемя2
Межвуклеотидные
фосфатные
группы
ДНК
участвуют
в
образовании
как
электростатических, так и Н-связей с а.о. ферментов. В фосфатной группе отрицательный
заряд делокализован между двумя иемостиковыми агтомамв кислорода (ща-Rp и jspo-Sp
атомами кислорода), тогда как в Ps-rpynne он локализуется преимущественно на атоме серы;
связь P-S длиннее связи Р-О на 0.5Л и атом серы хуже образует Н-связь, чем атом кислорода.
Ввиду
этих
различий,
при
введении
Ps-группы
следует
ожидать
изменений
во
взаимодействии замещаемой фосфатной группы с а.о. фермента. Один контакт между
фосфатной
группой
ДНК
и
а.о.
ЭР
вносит
вклад
в
энергетику
ДНК-белкового
взаимодействия в среднем -1 - -2 ккал/моль или нарушение этого контакта должно приводить
к изменению кинетических констант в 4-30 раз (на основании изучения взаимодействия Э Р
EcoRI или EcoRV с ДНК). Поэтому мы приняли, что R.EcoRII образует контакт с фосфатной
группой ДНК, если ее замешевие на Ps-rpynny приводило к изменениям кинетических
констант в 4 или большее число раз.
Табл. 2. Кинетические п^аметры расшешхения R.EcoRII модифицированной цепи ДНКдуплексов, содержащих межнуклеотидную тиофосфатную группу Rp- или 5р-конфигурации.
ДВК-дуплекс"
Обюяачеине
5'-CCAACCTGGCTC
З'-GGTTGGACCGAG
...iCCTGG...
.. G G A C C . . .
...CiCTGG...
...G-GACC...
...ССЛСС...
...GG-ACC...
...CCT«GG...
...GGA-CC...
...CCTGJG...
...GGAC-C...
..CCTGGS...
...GGACC...
...CCTGG...
...GGACCs ..
...CCTG-G...
...GGACfC...
...CCT-GG...
...GGAiCC...
...CC-TGG...
...GGJACC...
...C-CTGG...
...GJGACC...
...CCTGG...
....GGACC,
*»..»"""
/:(f*IO,MicM*
Л/«зоиер I
S^-eaoHtp
Л^нзоиер
IX
14.6+0.9
11+2
x«.
-
XIIHAHXIS
ХПкШшПЬ
ХШкИлиХШ,
Х1У.илиХ1У,
ХУ.илиХУ»
1 5>-юоиср
22±2
14+2
4%'
20+4
10+5
24+3
3.5+0.9
5,1+0.9
10+2
13.0+0.9
21+2
12+2
1.5+0.4
12.7Ю.9
1.5+0.09
8+2
8+2
5.9±0.6
15+2
17+3
24+3
31+2
17+4
XVI„
4%"
XVIIiroraXVIIs
ХУШкНлиХУПи
ХКкшшХК,
ХХкилиХХ$
ХХ1кШшХХ1,
10+3
8+2
7.0+0.9
3.2+03
9+1
16+2
15.1+0.9
U.9+0.9
4.0+0.4
3.0+0.5
9.5+0.6
2.1+0.1
5.3+0.5
4.5+0.8
8.9±0.3
8.4+0.6
9+1
15+3
12.4±0.6
17+2
« и^п _ pg_rpyi0ia^ Верхняя и юокняя строга соответствуют параметрам расщсплетш верхней и нижней цепей ДНКлуплексов Значения К^
и к,,^ рассчитаны из концеиграциоиных зависимостей начальных скоростей
расщепления модифицированной цепи ДНК-дуплексов ItEcoRn с использованием уравнения МихаэлисаМентен Расщепление ДНК проводили 30 мин при 37''С, Сднк 350 нМ, CR.ECI>IUI диср 11 нМ, в буфере А,
содержащем 5 мМ MgCl^ ' Относительная степень расщепления ДНК-дуплексов Х и и X V I M , содержащих
рацемическую смесь R^ и 5р-диастереонеров Определена относительно степени расщепления ДНК-дуплекса
IX, принятой равной 100%
Использование стереоспецифических аналогов субстрата позволяет избежать усреднения
найденных эффектов по диастереомерам.
Были
получены
12-звеяные
ДНК-дуплексы, в
которых
хиральная
Ps-rpynna
последовательно замешает одну из фосфатных ipymi в участке узнавания EcoRII в позициях
2-6 и 8-12 (схема 2 и табл. 2), Индивидуальные диастсреомеры 12-звенных олигонуклеотидов
получали путем разделения рацемических смесей Rp- и 5р-диастереомеров с помощью метола
высокоэффективной жидкостной хроматографии ( В Э Ж Х ) , либо путбм ферментативного
лигирования предварительно разделенных с помощью В Э Ж Х Rp- и 5р-диастереомеров 5-7-
звенных
олигонуклеотидов
с
соответствующими
короткими
олигонуклеотидами
на
комплементарной ДНК-матрице.
Для ДНК-дуплексов X I R - X V s и X V I I R - X X I s с помощыо метода стационарной
кинетики определены значения эффективных констант Михаэлиса {KJ**)
и констант
скоростей расщепления ( к ^ ) (табл. 2).
Г»**
А ) * ^
I Х,-дпстереомеры {
1 2
3
4
5
6
...pC^ifiQ^jlGpq^...
••j^^fiQf^tiQ^p—
12
11 10 9
8
| ^'.-дшктермиеры |
1 Л,-днастереоисры |
ut 1
2
...рСр<;|»Тр44»:..
7
..jfCffGpP^pCp...
tr
t
3
4
12 11 10 9
5
^Л/
15,-днаетерсомеры |
1
6
2
3
4
5
6
...-Q»Q»TpGj»Gpf..
..^GpGpy^jrQC-...
8
12 11 10ж^мжмвдтф
9 8 7 /шмвдтф .
^гнемодыф 12
/ т/'Модиф
11 10 9 _^8 .
\ - дляна данной стрелки соответствует л^^^^
/ *мюи
~ ^ "лн ■'» j , ^
1 ^м
t~
♦!!
Рис. 2. Фосфатные группы Д Н К , необходимые для функционврования R.EcoRII. Определены
путбм анализа значений к^^ ( А ) и К"^
(Б), полученных прн изучении стадионной
кинетики расщепления R.EcoRII ДНК-дуплексов, содержащих Rp- или 5p-P8-rpynny.
фосфатные группы, при замещении которых на Rp- или 5p-Ps-rpynny Л ^ З * * A Z T * - ^ ''ли
^Г°**/^Г**
5 4 (размер стрелок пропорционален Л , ^ * * / * ^
или
KT^I^-T^)-
'
>^ - фосфатные группы, при замещении которьлх на нехиральную Ps-rpynny наблюдалось
сильное ингибирование расщепления ДНК. Зачёркнуты фосфатные группы, при замещении
которых на Я,- или 5p-Fs-rpynny ;t,^;;»**/fc^ = 0.7 - 2.1 или К'^"°^/к^
= 0.7 - 2.7.
В случае ДНК-дуплекса X I X R , содержащего Л,-Р8-группу в позиции 10, и ДНКдуплексов X I I I s и X I X s , содержащих S,-Ps-rpynny в позициях 4 и 10, соответственно,
значение К1}* уменьшалось по сравнению с ДНК-дуплексом I X в 4-9 раз (табл. 2). В случае
ДНК-дуплексов, содержащих Я^-Рв-группу или 5),-Ps-rpynny в других позициях, значения
Klf* изменялись слабо. Можно предполож1пъ, что R.EcoRII не образует контактов с
фосфатными группами в позициях 2, 3, 5, б, 8, 9,11 и 12 и образует в позициях 4 и 10 (рис.
2Б). Наблюдаемые уменьшения значений KJ^
наличием
отрицательного
заряда
на
для позиций 4 и 10, вероятно, связаны с
атоме
серы
Ps-групшл,
улучшающего
электростатические взаимодействия фосфатных групп со сближенными положительно
згфяжевными а.о. R.EcoRn.
В случае ДНК-дуплексов X R S И X V I R S , содержащих Л,Др-Р8-группу в позициях 1 и 7,
соответственно, наблюдалось наиболее сильное ингибирование расщепления R.EcoRII (табл.
2). В случае ДНК-дуплексов X I V R И X V I I R , содержащих Rp-Ps-трутшу в позициях 5 и 8,
соответственно, и ДНК-дуплексов X I s , X I I I s , X V I I s и X I X s , содержащих S^-Ps-rpynny в
10
позициях 2, 4,8 и 10, соответственно, наблюдалось уменьшение значений к^^ по сравнению
с
немодифицированным ДНК-дуплексом
IX
в 4-14 раз. В
случае ДНК-дуплексов,
содержащих /J,-Ps-rpynny или Sp-Ps-rpynny в других позициях, значения к,^ практически
ие изменялись. Таким образом, замещение семи фосфатных ipynn в позициях 1, 2,4,5,7, 8 и
10 на Ps-труппу оказывает влияние на каталитическую стадию ферментативной реакции,
которая включает расщепление фосфодиэфирных связей и диссоциацию продуктивного
комплекса. Если предположить, что химическая стадия является скорость лимитирующей во
всех случаях (это может быть справедливо в случае коротких ДНК-дуплексов), то
вемостиковые атомы кислорода фосфатных групп в зтих позициях (рис. 2А) образуют
контакты с R.EcoRII и вносят вклад в стабилизацию переходного состояния ферментативной
реакции. В целом, число фосфатных групп участка узнавания EcoRII, необходимых для
эффективного протекания катализа R.EcoRII (рис. 2А), больше числа фосфатных групп,
необходимых для связывания Д Н К ферментом (рис. 2Б). Можно предположить, что после
образования комплекса Я.ЕсоК11-ДНК происходит доузваванне ферментом субстрата.
Наблюдается тенденция к симметрии контактов, образуемых R.EcoRn с фосфатными
группами относительно оси второго порядка, проведенной через центр (A/T-nqiy) участка
узнавания (рис. 2). Это связано с тем, что две одинаковые субьеднннцы R-EcoRH
одинаковым образом взаимодействуют с участками угвввйвяя
EcoRII. В
большинстве
случаев замещение на атом серы в фосфатных группах npo-j'^.-HeMOCTHKOBoro атома
кислорода, расположенного ближе к малой бороздке ДНК, оказывает влияние на значения
кинетических констант, а замещение про-/?р-атома кислорода, нащ)авленного в большую
бороздку Д Н К , - нет. Можно предположить, что R.EcoRn образует контакты с фосфатными
группами преимущественно со стороны малой бороздки ДНК.
Следует отметить, что конценграционвые зависимости расщепления коротких 12звенных ДНК-дуплексов IX-XXIs R.EcoRII имеют несигмоидальный вид. Это связано с тем,
что в диапазоне концентраций ДНК-дуплексов IX-XXIs, используемых для определения
кинетических
констант,
эффекторные
домены R.EcoRn
васьт1ены
ашюстерическим
эффектором (аллостеричесхая активация уже прошла). Можно предположить, что изменения
кинетических констант, найденных на основании стацнонгфиой кинетики расщепления
R.EcoRn
Ps-содержащих
ДНК-дутшексов,
связаны с
нарушением контактов
между
каталитическими доменами R.EcoRII и фосфатными группами ДНК, а тсрушевяе контактов
с эффекгорными доменами не оказывает влияния на значения этих констант. Чтобы
подтвердить это, была изучена активация расщепления Д Н К фага Т7, которая устойчива к
расщеплению R.EcoRII, так как участки узнавания EcoRII в ней удалены друг от друга на
расстояние >1000 н.п. (рис. 3, дор. 1). Расщепление такой ДНК наблюдается в присутствии
11
коротких немодифицврованных ДНК-дуплексов, выступающих в роли эффектора (рис. 3,
дор. 2). Была изучена активация расщепления Д Н К фага Т7 в присутствии эффекторов, в
качестве которых выступали модифицированные ДНК-дуплексы X R S , X I S , X I I I S , Х Г У Ц ,
X V I R S , X V D S И X I X S , плохо расщепляемые R.EcoRII ( * ^ ° * * А ^ ^ 4). Расщепление
проводили в условиях насыщения R.EcoRII эффекторами, при концентрации эффекторов
значительно больше К^.
В этих условиях активация расщепления Д Н К фага Т7 в
присутствии Ps-содержащего ДНК-дуплекса должна бьпъ такой же, как и в случае
немодифицврованного ДНК-дуплекса К , если нгфушение контактов между эффекторвыми
доменами R.EcoRII и Ps-содержащим ДНК-дуплексом не будет приводить к н^)ушению
контактов между каталитическими доменами и Д Н К фага Т7.
ДНКяуппексы
Продукты f—
гидролиза ( ^
Г
|s
Рис. 3. Акгавация расщепления Д Н К фага Т7
эндонуклеазой EcoRII в присутствии ДНКдуплексов, содержащих тнофосфатную группу
Д Н К фага Т7 (4 нМ) инкубировали с R.EcoRII
(CiLEcoun дюир 225 нМ) в присутствии (дор. 2-8)
или в отсутствие (дор. 1) указанных ДНКдуплексов (5 мкМ) при ЗТ'С, 60 мин, в буфере
А, содержащем S м М MgCb. Продукты
расщепления анализировали в 0.5% агарозном
геле, прокрашенном этидий бромидом.
^щшШшш
" " " ^ " т Wfv ^ ^ Wm ^Ят ^Шг ^w
Модифицированные ДНК-дуплексы X R S , X I S , X I I I S , X T V R , X V I R S , X V I I S и X I X s активируют
расщепление Д Н К фага Т7 (рис. 3, дор. 3-9) так же, как и немодифицированный ДНКдуплекс I X (рис. 3, дор. 2). Вероятао, изменения кинетических констант, наблюдаемые при
расщеплении ДНК-дуплексов X R S , X I s , Х П Ь , X I V R , X V I R S , X V I I s и X l X g (табл. 2) связаны с
нарушением контактов между каталитическими доменами R.EcoRII и фосфатными группами
Д Н К в позициях 1 , 2, 4, 5, 7, 8 и 10 (рис. 2). Таким образом, можно предположить, что
контакп>1, найденные на основании изучения стационарной кинетики гидролиза Psсодержащих ДНК-дуплексов, отражают
контакты между
каталитическими
доменами
R.EcoRII и фосфатными труппами ДНК.
Для расщепления Д Н К Э Р необходимы один или несколько ионов Mg^^ Согласно
механизму расщепления Д Н К Э Р и по данным Р С А комплексов Э Р с ДНК, ионы Mg^'^
образуют контакт с расщепляемой фосфатной группой и в некоторых случаях - с
фосфатными труппами, расположенными рядом с расщепляемой связью. В случав R.EcoRII,
чтобы
определить, участвуют
ли в координации ионов Mg^'^ фосфатные группы,
расположенные рядом с расщепляемой фосфатной группой, была изучена стационфвая
кинетика расщепления ДНК-дуплексов X I s и X V I I s в присутствии ионов Мп^^. Эти ДНКдуплексы плохо расщепляются в присутствии ионов Mg^* (табл. 2). Ионы Mg^* обладают
12
хорошим сродством к атому кислорода и плохим сродством к атому серы, поэтому
замещение атома кислорода фосфатной группы ДНК на атом серы может нарушать контакты
с ионами Mg^'^. Ионы Мп^^ обладают хорошим сродством к атому серы, поэтому если
ухудшение расщепления в присутствии ионов Mg^* Ps-содержащих ДНК-дуплексов связано
с шфушевием координации ионов Mg^'^, то замена ионов Mg^'^ на Мп^'^ будет улучшать
расщепление таких ДНК-дуплексов. В случае ДНК-дуплексов XIs и X V I I s , в которых npo-S;,
атом кислорода фосфатных групп в позициях 2 и 8 замешен на атом серы, соответственно,
замена ионов Mg^* на ионы Мп * приводила к увеличению значений к,^ относительно
значений к^^ для немодифицированного ДНК-дуплекса I X , в 3 и 9 раз, соответственно.
Вероятно,
про-5;,
атомы
кислорода
фосфатных
групп,
расположенных
рядом
с
расщепляемыми связями с 3'-конца, участвуют в координации кофактора.
2.
Зондирование
контактов
эндонуклеязы
ЕсоКП
с
группами
атомов
ДНК,
расположенными в малой бороздке, с помощью ДНК-дуплексов, содержащих остатки
(+)- или (-)-nipaHc-aHinii-6eH3o[<i]nHpeHa-N'-dG.
Для зондирования контактов R.EcoRII с труппами атомов, расположенными в малой
бороздке ДНК, получен набор 18-звенных ДНК-дуплексов (-)XXIII-(+)XXIV, содержащих в
участке узнавания EcoRII остатки (+)- или (-)-ш/«ис-ан»1и-бензо[а]пирена-Ы^-(1С ((+)dG*
или (-)dG*) вместо одного из остатков dG в верхней цепи ДНК-дуплекса X X I I (схема 3)
:\А>
5'-GAGCCAACCTG,G2CTCTGA
З'-CTCGGTTGGAC-CrGAGACT
ХХП
'
(-)ХХШ- Gi = (-)dG*;
(+)XXni-Gi = (+)dG*;
(-)XXIV-G2=(-)dG*;
(+)XXIV-G2=(+)dG*.
Схема 3
С помощью ЯМР-спехтроскопии установлено, что в случае (+)- и {-)-транс-анти-В[а]¥-И^dG-аддуктов остаток бевзо[а]пиреяа расположен в малой бороздке ДНК, причем в случае
(+)-диастереомера он направлен к S'-концу модифицированной цепи, а в случае (-)диасгереомера - к З'-концу (Geacintov et al, 1997). Таким образом, введение остатков (+)dG*
или (-)dG* может стерическн препятствовать образованию контактов R.EcoRII с группами
атомов ДНК, расположенными в малой бороздке двойной спирали.
в присутствии аналога кофактора, ионов Са^'^, R.EcoRII не расщепляет ДНК, однако
образуется специфический комплекс R.EcoRII с ДНК, состоящий из димера R.EcoRn и двух
молекул ДНК, одна из которых находится в эффекториом, а другая - в каталитическом
доменах R.EcoRn (Babkina et Ы, 2002).
ДНКдуплексы
1 1Ш I
йР
•яв
£1
ио
ILEcaRn
Комплекс
11.ЕсоКЩДНК
g-'Д
Ш^
^М
ЩЩ' W F ^^
ДНКдуплексы
{:
Рис. 4. Связывание R.EcoRII с
вемодифицировавяым
ДНКдуплехсом X X I I (дор. 6) и
В[а]РОЕ-модифицированными
ДНК-дуплексами (пор. 7-10).
'^Р-меченные
ДНК-дуплексы
(Сднк 0.2S мкМ) инкубировали
с R.ECORII (Ск.Есо1ш л>иер 0.2
10 мкМ) в буфцж А, содержащш
5 м М СаСЬ- Радиоавтограф
неденатурирующего
6%-ного
П А А Г . " + " и "-" обозначает
присутствие
и
отсутствие
R.EcolUI, соответственно.
^1
4»1К •
•
Образование комплекса R.EcoRII с Д Н К в присутствии иовов
у^огдшалось при
модификации остатка dGi (рис. 4, дор. 7 и 8) и полностью отсутствовало при модификации
остатка dGj (рис. 4, дор. 9 и 10). Как упоминалось выше, при расщеплении Д Н К R.EcoRII оба
домена R.EcoRII образуют контакты с ДНК, поэтому расщепление R.EcoRII B[a]PDEмодифицированных ДНК-дуплексов может ухудшаться, если нарушаются ДНК-белковые
контакты хотя бы в одном из доменов. Расщепление R.EcoRII модифицированной и
немодифицированной
цепей
ДНК-дуплексов
(-)XXIII-(+)XXIV
было
полностью
блокировано (данные не приведены). Таким образом, шфушевие комплексообразования и
расщепления
R.EcoRII
В[а]РОЕ-модифицированных
ДНК-дуплексов
предполагает
существование ковтактов между эффекгорными и/или каталитическими доменами R.EcoRII
и группами атомов ДНК, расположенными в малой бороздке.
Для зондирования контактов между каталитическими доменами R E c o R I I и малой
бороздкой ДНК было изучено расщепление В[а]Р-А^-дС-содерхащих ДНК-дуплексов в
присутствии короткого немоднфицированного ДНК-дуплекса X X V (S'-ACCTACCTGGTCJGT/З'TGGATGGACCACCA),
выступающего
в
качестве
эффектора,
когда
контакты
между
эффекгорными доменами R.EcoRII и ДНК сохраняются, а могут нарушаются контакты
между каталитическими доменами и ДНК. В присутствии эффектора X X V , расщепление
R.EcoRII обеих цепей ДНК-дуплексов Х Х Ш и X X I V было блокировано (данные не
приведены). Следовательно, контакты между каталитическими доменами R.EcoRII и малой
бороздкой ДНК, по-видимому, необходимы для функционирования R.EcoRII.
Для зондирования контактов между эффекторными доменами R.EcoRII и Д Н К была
изучена активация расщепления R.EcoRII Д Н К фага Т7 в присутствии В[а]Р-Л^-<Юсодержащих ДНК-дуплексов, выступающих в качестве эффекторов (рис. 5).
Продукты
гидролиза
Ряс. 5. Активация расщепления ДНК фага Т7
эндонуклеазой EcoRII в присутствии ДНКдуплексов, содержащих остатки B[a]P-Af^-dG.
даК фага Т7 (12 нМ) инкубировали с R.EcoRII
(400 нМ) в присутствии (дор. 2-9) или в
отсутствие (дор. 1) указанных ДНК-дуолексов (5
мкМ) при 37°С, 60 мин. Продукты расщепления
анализировали
в
0.5%
аг^юзном
геле,
прокрашенном этидий бромидом.
Как упоминалось выше, расщепление R.EcoRII Д Н К фага Т7 будет наблюдаться только при
условии, если не нарушаются ДНК-белковые контакты в эффекторном домене R.EcoRII.
Только ДНК-дуплексы X X I I I сохраняют способность активировать расщепление Д Н К фага
Т7 (рис. S, дор. 3 и 4), хотя и в меньшей степени, чем немодифицироваяный ДНК-дуплекс
Х Х П . Отметим, что неспособность ДНК-дуплексов Х Х Г У активировать расщепление ДНК
фага Т7 может возникать из-за отсутствия их связывания с R.EcoRII (рис. 4, дор. 9 и 10). Эти
данные предполагают наличие взаимодействий между эффекторными доменами R.EcoRII и
группами атомов ДНК, расположенными в малой бороздке.
Таким образом, для функционирования R.EcoRII необходимо образование ковтактов
между группами атомов ДНК, расположенными в малой бороздке, и как эффекторными, так
и каталитическими доменами R.EcoRII.
3. Идентификация участка эадонуклеазы ЕсоНП, взаимодействующего с цеятральвой
нуклеотидной парой участка узнавания в Д Н К , методом фотояффинной модификация.
Для идентификации области(ей) EcoRII, образующей(их) специфические контакты с
каждым гетероциклическим основанием АЛ'-пары участка узнавания EcoRII в фермеятсубстратном комплексе, была проведена фотоаффинная модификация R.EcoRII ДНКдуплексами, содержащими в участке узнавания EcoRII остаток 5-иододезоксиурндина (IdU)
15
вместо ОСтапса d A ( X X V , 5'-AGAGCCAGGTTGGC/3'-TCTCGG-IdU-CCAACCG) ИЛИ d T ( X X V I , 5'-
AGAGCC-IdU-GGTTGGC/3'-TCTCGGTCCAACCG) В условиях, разработанных ранее Бабкиной
О-В. Комплекс К.ЕсоКП-ДНК формировали в присутствии ионов Сг^*, при молярном
соотношении
К.ЕсоК11д„кр:ДНК-дуплекс,
равном
1:2
(схема
4).
Фотоаффивную
модификацию R.EcoRII ДЕЖ-дуплексами X X V и X X V I проводили мягким УФ-облучением
(X > 300 им) комплекса R.EcoRII-ДНК. Установление места фотоприсоединения ДНКдуплексов X X V и X X V I к R.EcoRII осуществляли с помощью полного расщепления белка
химотрипсином
в
составе
каждого
ковалентного
коньюгата
(при
соотношении
R.EcoRn:xHMOTpHncHH, равном 30:1 (по массе)). В этих условиях из каждого коньюгата бьш
получен только один олигонуклеотидопептид (ОН-пептид) (схема 4).
I
I
Ш
тг d}^
REcoRn
ОН-пмпцд
П ^ - дниср R-EcoRII, ш п с п я субь«
ГТЛЛ жяаазклгязчкЛ ( / ^ ) домен.
содерзюгг эфф^кгориый (|—р и
Схема 4
Полученные ОН-пеппщы, бкши проанализированы методами M A L D I масс-спектрометрии и
секвенирования по Эдману. Молекулярная масса (М,) каждого из пептидных фрагментов в
обоих
ОН-пешидах
была
равна
2713
Да.
Она
^""VKNSLDPDEQLLDRRRVEYDIF^',
теоретическая
Определены
последовательности
аминокислотные
наиболее
масса
которого
соответствует
составляет
ОН-пептидов,
пептиду
2718 Да.
полученных
при
фотоприсоединении к R.EcoRII ДНК-дуплексов X X V и X X V I : V*NSLDPDEQLL"RRV и
V'NSLDP ("*" - непрочитанный а.о.), соответственно. М , и первичная структура пептидных
фрагментов совпадают для обоих ОН-пептидов, значит, места присоединения к ферменту
ДНК-дуплексов X X V (замещение остатка dT на IdU) и X X V I (замещение остатка dA на IdU)
в составе ДНК-белкового коньюгата совпадают. Ранее такой же вывод был сделан Бабкиной
О.В. на освовавин топ), что при расщеплении продуктов фотоприсоединения R.EcoRII к
ДНК-дуплексам X X V и X X V I химическими реагентами получались идентичные наборы ОНпептидов.
Последующая
обработка
неспещ1фической
протеиназой
К
ОН-пептида,
полученного из коньюгата R.EcoRII-CZJHK-flynfleKC X X V ) , и анализ полученных продуктов с
помощью M A L D I масс-спесгрометрин позволили сузить район фотоприсоединения до
области ^ ^ 4 T Y D ^ " Найденная область находится в каталитическом домене R.EcoRII (схема
16
4 и рис. 6). Фотоприсоединение остатка IdU обычно происходит к электров-богатым а.о.:
Туг, Phe, Tip, His или M e t Поэтому, возможно, что из области ^ ^ * V E Y D " ' ковалевтяо
присоединяется к А/Т-паре участка узнавания остаток Y^^. Отсутствие фотоприсоединения
IdU-содержащих
ДНК-дуплексов
к
эффекторвым
доменам
R.EcoRn
позволяет
предположить, что А/Т-пара участка узнавания, расположенного в ДНК-связывающей
полости, образованной эффекторными доменами R.EcoRII, не сближена с элепрон-богатыми
а.о. По данным РСА фермевта R.EcoRII область ^^*VEYD^' находится внутри ДНКсвязывающей полости, образуемой каталитическими доменами R.EcoRII (рис. 6), вне
каталитяческого кора R.EcoRII я
принадлежит центральной части а-спирали И-10,
принимающей участие в димеризации субьедивиц R-EcoRQ (Zhou el al, 2004).
ш
/ЛУ^^Р'-'
■>|f|i-'
5*_
,4/ ^
К. ф^X
, ^. V"- bi.-С i
^К-^Г
Рис. 6. Струк1ура ДНК-связывающей полости,
образованной
из
двух
С-концевых
каталитических доменов R.EcoRII, по данным
РСА муташной формы R88A R.EcoRII (PDB код
1NA6). черным цветом выделена область
^^*VEYD^". N-концевые эффекторные домены
R.EcoRn не приведены.
'
По данным моделирования комплекса каталитического домена R.EcoRn с ДНК-дуплексом
5'-CCTGG/3'-GGACC
центральная часть спирали Н Ю сближена с АУТ-парой участка
узнавания (Zhou et al, 2004). Таким образом, в комплексе R.EcoRII-AHK область фермента
^ " V E Y D ^ " сближена с А/Г-парой участка узнавания. Участие а-спиралн, обеспечивающей
димеризацию субьедишщ Э Р , в узнавании ДНК характерно для семейства ЭР, образующих
5'-выс1упающие концы при расщеплении ДНК.
4. Изучение структуры комплекса К.Есо1Ш-ДШС с помощью флуорссценцив.
Ввиду отсутствия РСА комплекса R.EcoRII-ДНК неизвестно, как ориентированы
участки узнавания EcoRII друг относительно друга в комплексе. Для решения этого вопроса
мы изучали резонансный перенос энергии возбуждения флуоресценции (FRET, Fluorescence
Resonance Energy Transfer) в комплексе Н.Есо1Ш-ДНК между флуоресцентными метками,
находящимися на разных концах молекулы ДНК, содержащей два участка узнавания EcoRII
(табл. 3). Эффективность F R E T определяли в присутствии ионов Са^'^ в комплексе R.EcoRIIДНК
между
5(6)-карбоксифлуоресцеияом
(ГАМ)
(донором)
и
5(6)-
КЕфбокситетраметилродамином ( T A M R A ) (акцептором), ковалентно присоединенными к S'-
концам молекулы ДНК, содержащей два участка узнавания EcoRII на расстоянии 309 н.п.
(табл. 3).
Табл. 3. ДНК, содержащие два участка узнавания ЕсоКП и флуоресцентные метки.
R,
Обозначение
""^TiMXAVI
'^""TAUIUi
jjfj.FAUW
'-'"'Нлшлг
rfVrjFAUS
'^"■^лшл$
DNA"'"'
'^""TAURAi
DNA^^""'
'
399 мл.
'
'
Ri
5'-FAM-ACGT0GCTGO
ТСЮАССОАСС
5'-FAM-ACGTGCCTGG
TGCACCGACC
5'-FAM-ACGTGGCTGG
TGCACCX3ACC
5'-FAM-GCTG0
COACC
5'-FAM-0CTGG
COACC
5'-FAM-GCTG0
COACC
5'-FAM-GCT0G
COACC
Определение эффективности F R E T
Ri
(E'''^)
Rj
CAGOTAGATG
GTCCAT CTAC-TAMRA-S'
CAGGT
GTCCA-TAMRA-5'
CAG
GTC-TAMRA-5'
CAGGTAOATO
GTCCAT CTAC-TAMRA-S'
CAGGT
GTCCA-TAMRA-5'
CAG
GTC-TAMRA-5'
CAGGT
GTCCA-5'
позволяет сопгасно уравнению Ферстера
^FiiET _ /{^ Д/{« + /j') (где Кд _ расстояние Ферстера, равное 55А) определить расстояние (R)
между красителями. Однако для определения пространственного расположения двух
участков узнавания в комплексе R.EcoRII-ДНК необходимо иметь набор расстояний между
красителями, расположенными на различном удалении от участков узнавания.
саобяаииЩС
1внИК.Есяга1лимц|
4«iMR.EeoRI(*H4>
77HMRECORIIWM4>
Рис.
7.
красителей
Изменение
в
составе
спектра
ДНК
флуоресценции
DNA'^^^
при
образовании комплекса R.EcoRII-flHK. Л^ 495 им,
Сднк 50 нМ, буфер А, содержащий 5 м М СаСЬ.
Вставка: схематическое изображение образования
петли
ДНК
при
связывании
R.EcoRII
двухсайтовой ДНК, содержащей на концах донор
(D) и акцептор (А). Е 9 - участок узнавания
СЮ
EcoRII. П ^ - димер R.EcoRII, каждая субьединица
содержит
эффекторный(квадрат)
н
каталитический- (кружок) домены.
Для получения этих данных варьировали расстояние мея;ду участком узнавания и F A M (Y=S
или 10 н.п.) или между участком узнавания и T A M R A (Х=3, 5 или 10 н.п.) (табл. 3 и рис.
8Л), изменяя длину ДНК. Эффективность F R E T между красителями в комплексах R.EcoRIIДНК определяли по тушению флуоресценции донора ( F A M ) при 520 нм и по разгоранию
флуоресценции акцептора ( T A M R A ) при 580 нм. В качестве примера на рис. 7 показано, как
18
по мере увеличения концентрации R.EcoRII до 46 нМ (до молфного соотношения
R.EcoRn^Mcp: OAf^SISus' равного
1:1)
происходило увеличение эффективности
FRET
вследствие сближения красителей в комплексе R.EcoRII-ДНК.
309 ■
А) Д^
GGTCC —
■ CCAGG — TAMRA-5
5'-FAM—CCTGG— GGACC-
? ^ -
TAMRA
^^J
FAM
TAMRA
Х*3.4А
2Л*ЗЛк
2 3 4 5 6 7 8 9
10 11
Расстояние до ищаптора (X), н.п.
Рис. 8. (А) Схематическое изображение двухсайтовой ДНК, содержащей на расстоянии Y и
X Н.П. от участка узнавания EcoRII донор ( F A M ) и акцептор ( T A M R A ) , соответственно. (Б)
Зависимость Е"'"
между красителями, расположенными на концах ДНК в комплексе
R.EcoRn-flHK от расстояния X , н.п. (■ и ▲ ) - значения £ ™ " ' для Y=5 и 10 н.п.,
соответственно, полученные в условиях: Сдис 50 нМ, Ск.Есок11ш1мер 50 нМ, 5 мМ СаСЬ. (-о- и V-) - теоретические значения Е''""^ для Y=5 и 10 н.п., соответственно, рассчитанные исходя
из модели, изображенной справа и из того, что 26% ДНК в комплексе К.ЕсоК11-ДНК
находится в форме петли. ( В ) Предполагаемая модель петли ДНК, образуемой R.EcoRII,
а=70+10 градусов и Ь=2()+10 А. ^Ш - участок узнавания EcoRII. Указаны расстояния в
ангстремах.
Для различных расстояний от красителей до участков узнавания (X и Y нуклеотидных щр)
был получен набор значений эффективностей F R E T (рис. 8Б, ■ и А ) . Так как неизвестно,
какая часть Д Н К в комплексе R.EcoRII-ДНК находится в форме петли, анализировали не
эффективности FRET, а их отношения, не зависящие от того, какая доля молекул ДНК
находится в форме петли. Затем были рассчитаны теоретические отношения Е'''^
для
всевозможных ориентации двух участков узнавания друг относительно друга в комплексе
R.EcoRII-ДНК. Минимальному отклонению теоретических значений отвошеЕий Е''""^ от
экспериментально определенных соответствовала модель, приведённая на рис. 8В. Согласно
этой модели, расстояние между центрами участков узнавания, h, составляет 20+10 А, а
значение угла а составляет 7()+10 градусов.
19
выводы
1. Для зондирования контактов эидонуклеазы рестрикции EcoRII (R.EcoRH) с
угяеводофосфатным остовом Д Н К было изучено взаимодействие этого фермента с ДНКдуплексами, содержащими в участке узнавания EcoRII остатки 1-(Р-0-2'-дезокси-треопеятафуранозил)1СИтозина (dC,) или 1-(Р-В-2'-дезокси^грео-пентафуранозш1)тимина (dT,), а
также хиральную (Л;,)- или (5;,)-тиофосфатную (Ps) группу.
а) Изменение пространственного расположения двух из пятя межнуклеотидных
фосфатных групп при введении остатков d C , или dT, нарушало образование комплекса
К.ЕсоЯП-ДНК в отсутствие ионов Mg^*. Сделано предположение, что эффекторные домены
R EcoRII образуют контакты с зтими группами. Модификация трбх из пяти фосфатных групп
блокировала расщепление ДНК-дуплексов в присутствии аллостерического эффектора.
Возможно, каталитические домены образуют контакты с этими фосфатными группами.
б) Последовательное замещение каждой из двенадцати межнуклеотидных фосфатных
групп участка узнавания EcoRII на хиральную (Rp)- или (5';,)^гиофосфатную (Ps) группу в
большинстве случаев не влияло на эффективные константы Михаэлиса (К^),
а уменьшало
каталитические константы гидролиза (кип) ДНК-дуплексов. Обнаружена
зависимость
значений ATjf* и к,^ от позиции и стереохимии Ps-группы. Вьщелеяы семь фосфатных
групп, необходимых
для
каталитического
превращения
субстрата,
осуществляемого
R EcoRII Эти фосфатные группы взаимодействуют с каталитическими доменами R.EcoRII.
Сделано предположение, что про-5^;> атомы кислорода фосфатных групп, расположенных с
З'-конца от расщепляемых связей участвуют в координации ионов Mg^^
2. С помощью анализа субстратных свойств 18-звенных Д Н К дуплексов, содержащих
остатки {+)- или (-)-TO/jaHc-<JHinu-6eH3o[a]nHpeHa-N^-dG
в участке узнавания EcoRII,
установлено, что как эффекторные, так и каталвтические домены R.EcoRII образуют
контакты с группами атомов ДНК, расположенными в малой бороздке.
3.
С
помощью
фотоаффинной
модификации
R.EcoRII
ДНК-дуплексами,
содержащими остаток 5-иодо-2'-дезоксиурщщва вместо остатков dA или dT участка
узнавания EcoRII, идевтяфицировава область ^^VEYD^^^, находящаяся в центральной части
а-спирали Н Ю каталитического домена R.EcoRII, сближенная с центральной нуклеотидвой
парой участка узнавания EcoRII.
4. Изучен перенос энергии возбуждения флуоресценции в комплексе R.EcoRII-ДНК
между красителями, присоединбннымв к разным концам ДНК, содержащей два участка
узнавания. Предложена модель комплекса R.EcoRII-ДНК,
согласно которой участки
узнавания сближены на расстояние 20±\ О А и располагаются под углом 70+10 градусов.
20
Основные результаты диссертация изложены в следующих публикациях:
1. Petrauskene 0.V, Yakovleva J.N., Alekseev Ya.I., Subach F.V.. Babkina O.V., Gromova
E.S. DNA duplexes containing altered sugar residues as probes of EcoRII and Mval endonuclease
interactions with sugar-pbospbate backbone. // Journal of Biomolecular Stiucture & Dynamics,
2000, V. 17, p. 857-870.
2. СУбач Ф.В.. Мюллер С , Ташлицкий В.Н., Штраускене О.В., Громова Е.С.
Получение ДНК-дуплексов, содержащих в различных положениях участка узнавания
эндонуклеазы рестрикции EcoRII хиральные межнуклеогндные тиофосфатяые группы. //
Биооргаяическая химия, 2003, т. 29, с. 623-631.
3. Baskunov V.B., Subacb F.V.. Kolbanovskiy А., Kolbanovskiy М., Eremin S.A., Johnson
F., Bonala R., Geacintov N.E., and Gromova E.S. Effects of Benzo[a]pyrene-Deoxyguanosine
Lesions on DNA Methylation Catalyzed by EcoRII DNA Methyltransferase and on DNA Qeavage
Effected by EcoRII Restriction Endonuclease. // Biochemistry, 2005, v. 44, p. 1054-1066.
Материалы работы также опубликованы в виде тезисов сообщений на междушфодных
конференциях (см. стр. 5).
21
e5-2 27 0S
Р Н Б Русский фонд
2006-4
23179
Подписано в печать 17 ноября 2005 г.
Заказ 514. Формат 60 х 90/16.
Тираж 110 экз.
Отпечатано в салоне оперативной печати ПКФ.
Москва, Садовая-Чернофязская, ЗБ.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
928 Кб
Теги
bd000102834
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа