close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

bd000102933

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Селиванова Ольга Сергеевна
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
Н Е Ф Р О П Р О Т Е К Т О Р Н Ы Х СВОЙСТВ Г Л И Ц И Н А
14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
(^€-<>-е-*^
Казань-2005
Работа
выполнена
в
ГОУ
ВПО
«Ульяновский
государственный
университет» Федерального агентства по образованию.
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор
Напалкова Светлана Михайловна
Официальные оппоненты: доктор медицинских паук, профессор
Гараев Рамиль Суфиахметоввч
кандидат медицинских наук, доцент
Хазиахметова Вероника Николаевна
Ведущая организация:
ГОУ ВПО «Московский государственный медикостоматологический университет»
л^
Защита состоится «^ту> ^-^^^^-/U^ 200 g г. в «l£y> часов на заседании
диссертационного
совета
Д
208.034.01
при
ГОУ
ВПО
«Казанский
государственный медицинский университет» по адресу: 420012, г. Казань, ул.
Бутлерова, д. 49.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО
«Казанский государственный медицинский университет» (420012, г. Казань, ул.
Бутлерова, д. 49 б).
Автореферат разослан «/^» ^C€>.^/t^ 2005 года
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор биологических наук,
профессор
л
(у^
'"^
^•^- Нигматуллина
200^-4
23647
цгте
1
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Одной из основных причин развития токсиче­
ских нефропатий является применение лекарственных средств, в том числе аминогликозидных антибиотиков (Яковлева О.А., Царук В.В., 2000; Guo X., Nzerue С ,
2002). Самый известный антибиотик этой фуппы - гентамицин - широко применяегся для лечения тяжелых инфекционно-воспалительпых заболеваний, вызываемых
грамотрицательной микрофлорой (Навашип С М . и др., 1977; АН В.Н., 1995). Ме­
ханизм стимуляции гентамицином поражения почек до настоящего времени оста­
ется открытым (Price К.Е., 1986). Большинство исследователей связывают его с
развитием окислительного стресса и ослаблением антиоксидантной защиты почек
(Yang С. L. et al., 1995; Fauconneau В. et al., 1995; Baliga R. et al., 1999; Cuzzocrea S.
et al., 2002; Sener G. et al., 2002; Maldonado P.D. et al., 2003).
Еще одной частой причиной лекарственной нефропатий является примене­
ние цитостатических препаратов (Любимова Н.В. и др., 1997; Bizzi А. et al., 1983;
Giri S.N. et al., 2004). Наиболее эффекгивным противоопухолевым антибиотиком
считается доксорубицин, который широко применяется для лечения гемобластозов
и солидных злокачественных опухолей (Булкина З.П., 1991; Weiss R.B., 1992;
Singal Р.К., llliskovic N., 1998). В последние годы дискутируется вопрос о генезе
токсичности доксорубицина. Среди многочисленных теорий наименьшее значение
для цитостатического действия на опухоль и, наоборот, наибольшее для токсиче­
ского в отношении нормальных тканей имеет образование свободных радикалов
кислорода (Гершанович М.Л., 2004; Wu S.H. et al., 1990; Wang S. et al., 2004).
Причиной повреждения почек может быть не только применение лекарст­
венных препаратов, но и некоторые лечебные манипуляции, например дистанци­
онная ударно-волновая литотрипсия (ДУВЛ), часто применяемая в урологической
практике (Дзеранов Н.К. и др., 2003). В связи с ее широким внедрением актуаль­
ным стал вопрос более глубокого изучения повреждающего действия ударной вол­
ны на паренхиму почек (Кадыров З.А., 1994; Лопаткин Н.А., Дзерагюв Н.К., 2003).
Установлено, что проведение дистанционной литотрипсии почечных камней вызы­
вает активацию процессов перекисногр йвВ£Л9ЩКОПЛ>Л'В9ё()Р4ие антиоксидантной
1
БИБЛИОТЕКА
J
!__^2ж
2
защиты в плазме, моче и эритроцитах больных (Голованов С.А. и др., 1998).
Перспективным подходом к снижению действия повреждающих факторов, в
основе которых лежат процессы образования активных форм кислорода, является
поиск веществ-метаболитов, обладающих антиоксидантными свойствами (Малы­
шев В.В. и др., 1996; Парфенов В.Л., 2002; Измайлов И.А., 2003). Среди таких ве­
ществ наш интерес привлекла аминокислота глицин, проявляющая антиоксидантную активность (Лурье Е.Ю. и др., 1992; Малышев В.В. и др., 1996; Ligumsky М. et
al., 1995; Deters М. et al., 1998). Нефропротекторные эффекты глицина были обна­
ружены на модели хронической кадмиевой интоксикации у крыс, ведущим звеном
развития которой является окислительный стресс (Shaikh Z.A., Tang W., 1999).
Однако возможность снижения глицином нефротоксических эффектов аминогликозидных и антрациклиновых антибиотиков, а также повреждающего дейст­
вия на почки ударно-волновой литолрипсии не изучена, что послужило предпосыл­
кой для проведения нашего исследования.
Выполненная работа является разделом комплексной профаммы исследова­
ний Института медицины, экологии и физической культуры Ульяновского госу­
дарственного университета в соответствии с научной темой «Экспериментальное
исследование фармакологических эффектов веществ метаболического типа дейст­
вия. Коррекция с помощью аминокислот побочных эффектов антиаритмических и
противоопухолевых средств» (номер государственной регистрации 01.200.2 11664).
Цель работы - экспериментальное изучение нефропротекторных свойств
глицина на гентамициновой, доксорубициновой и ударно-волновой моделях пора­
жения почек.
Задачи исследования. В соответствии с поставленной целью исследования
при выполнении работы предполагалось решение следующих задач:
1) Изучить влияние глицина на функциональные показатели, структурные
изменения, процессы липопероксидации и состояние антиоксидантной защиты по­
чек в условиях гентамициновой нефропатии у крыс.
2) Исследовать изменения функциональных показателей, гистологических
характеристик, показателей окислительного стресса и активности антиоксидант­
ных ферментов на фоне применения глицина в условиях доксорубицинового пора­
жения почек у крыс.
3) Оценить эффекты ударно-волнового воздействия на функциональные по­
казатели, маркеры оксидативного стресса и состояние антиоксидантнои защиты в
ночках у крыс.
4) Изучить возможность глицина влиять на негативные эффекты ударных
волн на почки у крыс.
5) Провести сравнительный анализ нефропротекторной активтгости глицина с
мелатонином и а-токоферола ацетатом.
Н а у ч н а я новизна. В настоящей работе автором впервые проведено экспе­
риментальное изучение влияния ударных воли на функциональные показатели, перекисное окисление липидов и активность антиоксидантных ферментов в почечной
ткани у крыс. В ходе выполнения исследования усовершенствована эксперимен1альная ударно-волновая модель механического повреждения почек у крыс. Впер­
вые выявлено, что в почечной паренхиме животных после воздействия ударных
волн происходит увеличение продуктов липопероксидации и ослабление антиок­
сидантнои ферментной защиты.
Диссертантом впервые осуществлено комплексное экспериментальное фар­
макологическое исследование протекторных свойств глицина в условиях нефропатий различного генеза. Установлено, что глицин предупредил развитие гентамицинового, доксорубицинового и ударно-волнового повреждений почек у крыс.
Впервые проведен сравнительный анализ нефропротекторных свойств гли­
цина с мелатонином и а-токоферола ацетатом. Показано, что нефропротекторная
активность глицина при гентамициновой и доксорубициновой нефропатиях у крыс
сопоставима, а по некоторым параметрам даже выше эффективности мелатонина, а
при ударно-волновом повреждении - а-токоферола ацетата.
Полученные автором данные о нефропротекторных свойствах аминокислоты
глицин являются новыми для фармакологии и токсикологии.
Научно-практическая ценность работы. Результаты проведенного экспе­
риментального исследования расширяют представление о фармакологических
свойствах 1-лицина. В работе показана перспективность использования его для
профилактики гентамицинового, доксорубицинового и ударно-волнового повреж­
дения почек, а также подтверждена целесообразность более глубокого изучения
цитопротекторной активности данной аминокислоты.
Усовершенствованная зкспериментальная ударно-волновая модель может
использоваться для изучения механизмов повреждающего действия ударных волн
на паренхиму почек и тестирования потенциальных нефронротекторных средств.
Результаты исследования внедрены в научно-исследовательскую работу и
используются в учебном процессе на кафедре фармакологии с курсом клинической
фармакологии медицинского факультета Института медицины, экологии и физиче­
ской культуры Ульяновского государстветтного университета.
Основные положения, выносимые на защиту:
1) Глицин предупреждает вызванную гентамицином почечную недостаточ­
ность и оказывает положительное влияние на структурные изменения в почках у
крыс.
2) Глицин препятствует развитию доксорубицин-индуцированной азотемии и
уменьшает выраженность протеинурии и клубочкового повреждения в почках у
крыс.
3) Ударно-волновое воздействие вызывает развигие оксидативного стресса и
ослабление антиоксидантной защиты почек у крыс, устраняемые превентивным
введением глицина.
4) Иефропротекторная активность глицина не уступает, а по некоторым по­
казателям даже превышает эффективность мелатонина в условиях гентамициновой
и доксорубициновой нефропатии и а-токоферола ацетата в условиях ударноволнового повреждения почек у крыс.
Основные сведения об апробации работы. Результаты исследований, пред­
ставленные в диссертации, докладывались и обсуждались на VII Всероссийской
медико-биологической конференции молодых ученых «Человек и его здоровье»
(Санкт-Петербург, 2004), на X X X I X научно-практической межрегиональной кон­
ференции врачей «Медицинские аспекты охраны и укрепления здоровья» (Улья­
новск, 2004), на Х Х Х Х научно-практической межрегиональной конференции вра­
чей «Актуальные вопросы здравоохранения: проблемы, поиски, ретения» (Улья­
новск, 2005), на II Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы
здоровья и среды обитания современного человека» (Ульяновск, 2005) и были
представлены на ХП Российском национальном конфессе «Человек и лекарство»
(Москва, 2005).
Публикации. В ходе выполнения исследования по теме диссертации опуб­
ликовано 11 работ.
Структура и объём работы. Диссертационная работа состоит из введения,
обзора литературы (глава I), описания материалов и методов исследования (глава
II), изложения собственных результатов (главы III-V), обсуждения и выводов. Ра­
бота изложена на 122 страницах машинописного текста, документирована 9 табли­
цами и иллюстрирована 23 рисунками. Библиофафический указатель включает 292
источника, из них 96 работ отечественных и 196 - иностранных авторов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследования явилась аминокислота глицин (таблетки по 100 мг
производства Ф Г У П «Мосхимфармпрепараты» им. Н.А. Семашко, г. Москва). Для
воспроизведения повреждения почек применялись гентамициновая (Pariat С. et а!.,
1988; Beauchamp D. et al., 1997; Prins J . M . et al., 1997), доксорубициновая (Bizzi A.
et al., 1983; Dziegiel P. et al., 2002) и ударно-волновая (Гарилевич Б.А. и др., 2003)
модели. Гентамицина сульфат — 4% раствор в ампулах по 2 мл, производитель
ОАО «Дальхимфарм», г. Хабаровск. Доксорубщина гидрохлорид - лиофизированный порошок во флаконах по 10 мг, производитель ООО «ЛЭНС-ФАРМ», г. Моск­
ва. Ударно-волновое воздействие проводили на литотрипторе Lithostar-Plus
(Siemens, Германия).
в качестве препаратов сравнения использовались мелатонин
{Мелаксен'^ -
таблетки, покрытые оболочкой, по 3 мг, производитель Unipharm, Inc. New York,
U S A ) и а-токоферола ацетат
( 3 0 % раствор во флаконах по 15 мл, производитель
А О «Белхимпрепараты», Беларусь) Таблстированныс формы и лиофизированные
порошки растворяли в изотоническом растворе натрия хлорида до необходимой
концентрации.
Работа выполнена на 98 белых нелинейных половозрелых крысах-самцах ве­
сом 240-290 г. Животные были разделены на 14 фупп по семь крыс в каждой {таб­
лица 1).
Схема проведения исследования
Таблица I
п/п
Условия эксперимента
Интактные
животные
Контрольные Животные (0,5 мл 0,9% N a C l внутрибрюшинно 7 дней)
Гентамицин (100 мг/кг/сутки внутрибрюшинно 7 дней)
Мелатонин (10 мг/кг/сутки внутрибрюшинно за 30 минут до каждой инъекции гентамицина)
Глицин (50 мг/кг/сутки внутрибрюшинно за 30 минут до каждой инъекции
гентамицина)
Глицин (50 мг/кг/сутки внутрибрюшинно 7 дней)
Контрольные животные (0,5 мл 0,9% NaCl однократно внутрибрюшинно)
Доксорубицин (7,5 мг/кг внутрибрюшинно однократно)
Мелатонин (10 мг/кг внутрибрюшинно за 30 минут до инъекции доксорубицина)
10 Глицин (50 мг/кг внутрибрюшинно за 30 минут до инъекции доксорубицина}
11 Глицин (50 мг/кг внутрибрюшинно однократно)
12 ДУВЛ (4,5 Д ж 1000 импульсов однократно)
13 Витамин Е (50 мг/кг/сутки внутрибрюшинно в течение 7 дней) до ДУВЛ
14 Глицин (50 мг/кг/сутки внутрибрюшинно в течение 7 дней) до ДУВЛ
Все манипуляции, причиняющие животным боль, проводили под общим нар­
козом (этаминал-натрий из расчета 50 мг/кг внутрибрюшинно). Животные умер­
щвлялись путем декапитации на седьмой день после последней инъекции (гентамициновая и доксорубициновая модель) и на пятый день после Д У В Л (ударноволновая модель). При этом производился забор крови путем пункции сердца для
исследования концентрации креатинина (Popper Н., 1937), мочевины (коммерче-
7
ский набор фирмы «Ольвекс», г. Москва) и глутатионпероксидазы (Beutler R.,
1971). Моча забиралась из мочевого пузыря для определения концентрации общего
белка (Bradford М.М., 1976). Немедленно после забора биологических жидкостей
левая и правая почки удалялись и взвешивались. Левая почка использовалась для
изучения показателей перекисного окисления липидов и состояния антиоксидантной системы. Правая почка использовалась для гистологического исследования с
помощью световой микроскопии (гентамицииовая и доксорубициновая модели).
В качестве показателей интенсивности перекисного окисления липидов в гомогенате почек исследовались концентрации малонового диальдегида (Андреева
Л.Б. и др., 1988), белковых карбонильных фупп (Levin R.L. et а!., 1990) и восста­
новленного глутатиона (Ellman G.L., 1972). О состоянии антиоксидантной системы
судили по активности в почечном гомогенате ферментов супероксиддисмутазы
(McCord J.M., Fridovich I., 1969), глутатионпероксидазы (Beutler R., 1971) и глутатионредуктазы (Carlberg I. et al., 1975). Оптическую плотность измеряли на спек­
трометре СФ-46 (Россия).
Для изучения структурных изменений удаленную правую почку помещали
для фиксации в 10% нейтральный раствор формальдегида с последующим дегид­
рированием в спиртах восходящих концентраций и заключением в парафин. Полу­
ченные срезы почечной ткани толщиной 6-7 цм окрашивали по общепринятой ме­
тодике гематоксилином и эозином (Меркулов Г.А., 1969) и подвергали исследова­
нию под микроскопом «Люмам-Р8)>. На каждом срезе оценивалось и подсчитывалось количество канальцев/клубочков с гистопатологическими альтерациями, рас­
считывалось процентное отношение канальцев/клубочков с гистопатологическими
альтерациями к их общему количеству. Затем почечные срезы животных диффе­
ренцировали по степеням выраженности канальцсвых/клубочковых измене1гий (0IV степень).
Все полученные результаты исследования были подвергнуты статистической
обработке на персональном компьютере с помощью пакетов прикладных программ
Unistat Statistical Package 5.001. Оценку достоверности различий проводили по «х^»
и t-критерию Стьюдента.
8
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Введение изотонического раствора контрольным животным по схеме, анало­
гичной введению аминогликозидного и анфациклинового антибиотиков, а также
применение только глицина не привели к достоверным изменениям изучаемых по­
казателей по сравнению с животными интактной группы.
18
D1 U2
16 П6
a i Ш2 В З Q4 В 5 Об
Рис. 1. Влияние исследуемых препаратов на некоторые функциональные по­
казатели почек у крыс (гентамициновая модель): 1 - интактные живот­
ные, 2 - контроль, 3 - гентамицин, 4 - мелатонин + гентамицин, 5 - глицин +
гентамицин, 6 ~ глицин.
Примечание: статистически достоверно по сравнению с интактной группой
"^^ - при р<0,01 и '''^ - при р<0,001; с контрольной группой °° - при р<0,01 и
°°° - при р<0,001; с группой животных, получавших только гентамицин
** - при р<0,05 и *** - при р<0,001; * - с группой животных, получавших ме­
латонин + гентамицин (р<0,05).
Первая часть исследования была посвящена изучению влияния глицина на
вызванные гентамицином изменения в почках у крыс. Гентамицин (100 мг/кг/сутки
внутрибрюшинно в течение 7 дней) вызвал повышение в сыворотке крови концен­
трации креатинина на 38% (с 0,80±0,05 до 1,10±0,07 мг/100 мл, р<0,01) и мочевины
на 72% (с 18,98+0,56 до 32,56±0,79 мг/100 мл, р<0,001) iio сравнению с контроль­
ными животными, чго свидетельствовало о развитии острой почечной недостаточ­
ности у крыс. Профилактическое введение глицина (50 мг/кг/сутки внутрибрюшин1ю) за 30 минут до каждой инъекции аминогликозидного антибиотика преду-
предило эти изменения, тогда как применение мелатонина по той же схеме в дозе
IО мг/кг предотвратило только повышение креатинина, концентрация мочевины в
сыворотке крови животных этой ф у п п ы была ниже, но достоверно отличалась от
контрольных животных (р<0,01) (рис. 1).
У животных, получавших гентамицин, наблюдалась потеря в весе по сравне­
нию с контрольной группой (р<0,01). Это объясняется тем, что при острой почеч­
ной недостаточности наблюдается увеличение катаболизма, что приводит к ацидо­
зу, который сопровождается анорексией (Ali В.Н. et al., 1992), т.е. уменьшается ко­
личество принимаемой животными пипщ. А предупреждение потери в весе как
глицином, так и мелатонином было связано, возможно, с предотвращением ими
развития острой почечной недостаточности.
Введение гентамицина привело к повреждению 6 3 % проксимальных трубо­
чек. 14% животных данной группы имели I I степень, а 8 6 % - 1П степень выражен­
ности тубулопатии. Известно, что проксимальные канальцы являются первичным
очагом кумуляции значительной концентрации антибиотика в почках (Silverblatt
F.J. et a l , 1979), это и обуславливает повреждение при гентамициновой нефропатии
в основном тубулярной структуры (Pcdraza-Chaverri J . et al., 2000). Результаты гис­
тологического анализа почечных срезов, полученные в ходе нашего экспериметтта,
согласовывались с этими данными.
Эпителий проксимальных канальцев является основной локализацией синте­
за фермента глутатионпероксидазы (Avissar N. et а!., 1994). У животных гентами­
циновой группы наблюдалось 47%-ное снижение активности данного фермента в
сыворотке крови по сравнению с контрольными животными (с 4,38±0,48 до
2,32±0,27 мкмоль/мин/мл, р<0,01), что подтвердило наличие повреждения канальцевой структуры почек (рис. 2).
Тубулопатия обусловливает развитие отека интерстициальной ткани, поэто­
му у животных, получавших только гентамицин, наблюдалось увеличение соотно­
шения веса почек к общему весу [(вес правой + вес левой почки)/вес крысы х 100]
(с 0,89+0,06 до 1,08±0,05 г, р<0,05).
Глицин уменьшил выраженность канальцевого повреждения, которое соста-
10
вило 14% от общего числа проксимальных трубочек. У 14% крыс данной группы
была I степень, у 57%) - I I и у 2 9 % - 111 степень повреждения. На почечных срезах
животных, получавших мелатонин, 2 8 % канальцев было повреждено и достоверно
различалось по сравнению с интактными и контрольными животными (р<0,01).
2 9 % крыс имели I I степень и 7 1 % - И1 степень выраженности повреждения. При
этом сохранилась активность фермента глутатионпероксидазы в сыворотке крови
животных, получавших профилактически глицин и мелатонин, а соотношение веса
почек к общему весу животных при введении глицина достоверно не отличалось or
контрольных данных (1,04±0,06 г), в мелатониновой группе оно было достоверно
вьште, чем у контрольных животных (1,06±0,04 г, р<0,05).
□ 1
02
15 а б
Рис. 2. В л и я н и е исследуемых препаратов на активность глутатионпероксида­
з ы в сыворотке крови к р ы с (гентамициновая модель): 1 - интактные ж и ­
вотные; 2 - контроль; 3 - гентамицин; 4 - мелатонин + гентамицин; 5 - гли­
цин + гентамицин; 6 - глицин.
Примечание: статистически достоверно по сравнению с
- интактнои груп­
пой (при р<0,01); ° ° - контрольной группой (при р<0,01); с группой живот­
ных, получавших только гентамчцин * - при р<0,05 и ** - при р<0,01.
О степени свободно-радикального окисления в почках при гентамициновом
повреждении м ы судили по концентрации продуктов переокисления и активности
антиоксидантных ферментов. Гентамицин вызвал повышение содержания белко­
вых карбонильных групп на 4 2 % (р<0,01), малонового диальдегида на 2 4 %
(р<0,01), а также снижение концентрации восстановленного глутатиона на 12,5%
(р<0,05) по сравнению с контрольными животными. Введение глицина позволило
11
предупредить гентамицин-индуцированное увеличение содержания малонового
диальдегида и белковых карбонильных групп, а также понижение концентрации
восстановленного глутатиона в почечном гомогенате живот1н,1х. Мслатонин же
устранил только повышение концентрации малонового диальдегида и снижение
содержания восстановленного глутатиона, вызванные гентамицином (таблица 2).
Таблица 2
В л и я н и е исследуемых препаратов на содержание показателей оксидативного
стресса и активность антиоксидантимх ферментов в почках у к р ы с
(гентамициновая модель)
Группа
Белковые карбо­
нильные группы
(моль/мг белка)
Малоновый диальдегид (нмоль/
мг белка)
Восстановлен ный
глутатион (мкг/
мг белка)
СупероксиддисMyiasa(MKMOJib/
Интактные
Контроль
I ентамицин
2,02±0,12
1,92±0,12
1,92±0.07
Мелатонин +
Глицин +
Глицин
генгамицин
1 ентамицин
2,7310,14"°°
2,39±0,14°
2,31 ±0,09*
1,97±0,15
1,90±0,09
2,36+0,09"°°
2,0310,06 *
2,06±0,04 *
1.93±0,12
2,73 f 0,05
2,73+0,07
2.39±0,07 "
2,63±0,07 ♦
2,68+0,09 *
2,72+0,09
1,85±0,09
1,86±0,08
1,54±0,06°
1,87+0,08*
1,80±О06*
1,84+0,06
1,96±0,08
1,97±0,07 0,80+0,07 * " ° ° °
1,88+0,11***
1,91 ±0,09
5,39+0 П
5,37+0,13 2.96+0,24 " * ° ° ° 4.73+0,21°***
5,08±0,16***
5.41+0.12
мии/мг б е л к а )
1 лугатионпероксидаза ( м к м о л ь /
мин/мг б е л к а )
1,77±0,08***
Глутатионредуктаза ( н м о л ь / м и и /
мг б е л к а )
Примечание: статистически достоверно по сравнению с интактной фуппой
'^ - при р<0,01 и ^""^ - при р<0,001; с контрольной группой ° - при р<0,05, ° ° - при
р<0,01 и ° ° ° - при р<0,001; с группой животных, получавших только гентамицин
* - при р<0,05 и **♦ - при р<0,001.
Развитию оксидативного стресса в почках крыс гентамициновой группы так­
же способствовал тот факт, что активные формы кислорода, образование которых
повышается под действием аминогликозидного антибиотика, могут стимулировать
инактивацию антиоксидантных ферментов - супероксиддисмутазы, глу1атио1шероксидазы и глутатионрелуктазы в корковом веществе почек (Rister М., Baehncr
R.L., 1976; Padmaja S., 1998; MacMiUan-Crow L.A., 1999), что и наблюдалось у
12
крыс, получавших гентамицин. Активность супероксиддисмутазы понизилась на
17% (р<0,05), глутатионпсроксидазы - на 1 1 % (р<0,001), а 1лутатионредуктазы на 45% (р<'0,001) по сравнению с контрольными животными (таблица 2).
Кроме того, уменьшение активности антиоксидантных ферментов может
влиять на уровень клубочковой фильтрации. Супероксиддисмутаза и гл)'татионпероксидаза катализируют реакции обезвреживания супероксид аниона и перекиси
водорода соответственно (Fridovich I., 1995; Aral N. ct al., 1999). Следовательно,
ослабление активности супероксиддисмутазы способствует увеличению концен­
трации супероксид аниона, который реагирует с оксидом азота с образованием пероксинитрита, еще более цитотоксичного оксирадикала. N 0 является активным вазодилятатором, поэтому его инактивация приводит к уменьшению клубочковой
фильтрации (Rivas-Cabanero L. et al., 1997).
Глицин сохранил активность всех трех изучаемых антиоксидантных фермен­
тов, которые значительно улучшили антиоксидантный статус животных, Мелатонии предупредил гентамицин-индуцированное уменьшение активности только су­
пероксиддисмутазы и глутатионпероксидазьт в почках крыс {таблица 2).
Нап1и результаты указывают, что развитие оксидативного стресса и умень­
шение активности антиоксидантных ферментов можно считать одним из патогене­
тических звеньев гентамициновой нефротоксичности у крыс, а протекторный эф­
фект глицина объясняется, хотя бы частично, антиоксидантными свойствами ами­
нокислоты, которые проявляются в способности сохранять активность антиокси­
дантных ферментов и предупреждать развитие оксидативного стресса в почках
крыс.
Интересно, что антиоксидантные свойства глицина оказались соотносимыми
со свойствами препарата сравнения мелатонина, а по некоторым параметрам даже
выше. Например, глицин, в отличие от мелатонина, предупредил повьннение кон­
центрации белковых карбонильных групп и сохранил активность глутатионредуктазы в гомогенате почек животных; глицин в большей степени снизил гентамицининдуцированное повреждение проксимальных трубочек; уменьшил выраженность
интерстициального отека (соотношение веса почек/обп;ему весу) и понизил кон-
13
центрацию мочевины в сыворотке крови животных.
Таким образом, нами было установлено, что глицин предупреждает развитие
гейтам ициновой нефропатии у крыс.
ai
Q2 и з В4 В5 D6
a^ 02 ШЗ В4 35 0£
Рис. 3. Изменение концентрации мочевины в сыворотке крови и общего белка
в моче животных под влиянием исследуемых препаратов (доксорубициновая модель): 1 - интактные животные, 2 - контроль, 3 -доксорубицип,
4 - мелатонин + доксорубицин, 5 - глицин + доксорубицип, 6 - глицин.
Примечание: статистически достоверно по сравнению с '^'^ - интактной
группой (при р<0,001); контрольной группой ° - при р<0,05 и °°° - при
р<0,001; *** - группой животных, получавших только доксорубицин (при
р<0,001).
Целью второй части исследования явилось определение возможности с по­
мощью глицина предупреждать или снижать проявления доксорубициновой неф­
ропатии у крыс. Однократное внутрибрюшинное введение доксорубицина в дозе
7,5 мг/кг привело к поражению почек крыс, которое характеризовалось 17тикратным повышением общего белка в моче (с 5,11±1,48 до 92,82±11,77 мг/мл,
р<0,001) и 40%-ным увеличением концентрации мочевины в сыворотке крови (с
18,97±0,41 до 26,58±0,37 мг/мл, р<0,001) по сравнению с контрольными животны­
ми. Доксорубицин-индуцированное повышение концентрации мочевины в сыво­
ротке крови было нивелировано введением как глщщна (50 мг/кг внутрибрюшинно), так и мелатонина (10 мг/кг виутрибрюшинно) за 30 минут до инъекции антрациклина. Вызванную протеинурию полностью устранить не удалось, но выражен­
ность ее уменьшилась в 8 раз под действием глицина и в 5 раз - под действием ме-
14
латонина (рис. 3).
У крыс, получавших доксорубицин, отмечалась значительная потеря в весе
(р<0,001) и увеличение соотношения веса почек к общему весу [(вес правой почки
+ вес левой почки)/вес животного х 100] (с 0,89+0,06 до 1,76±0,07 г, р<0,001) по
сравнению с контрольными животными. Глицин, как и мелатонин, предотвратили
потерю в весе животных, получавших противоопухолевый антибиотик. Это явля­
ется положительным фактором, т.к. для больных злокачественными заболеваниями
независимо от химиогерапии кахексия является ведущим симптомом. Это действие
обусловлено способностью глицина и мелагонина снижать системное токсическое
действие доксорубицина.
Известно, что при доксорубициновом поражении почек повреждается пре­
имущественно клубочковая структура, чем и обусловлена выраженная протеинурия (Bertani Т. et al., 1982; Remuzzi G. et al., 1985). Данные, полученные в ходе на­
шего исследования, подтвердили этот факт. На почечных срезах животных, полу­
чавших доксорубицин, 42% клубочков были повреждены. 14% животных имели I
степень, 72% - II cienenb и 14% - III степень выраженности клубочкового повреж­
дения. Профилактическое введение глицина привело к уменьшению числа повреж­
денных клубочков до 15%, а мелатонина - до 20%. У 28,5% животных, полу1авших
глицин, была О сгенень, у 43% - I степень, а у 28,5% - II степень повреждения. У
14% животных, получавших мелатонин, была О степень, у 43% -1 степень и у 43% II степень гломерулопатии.
Однократное введение доксорубицина вызвало повышение концентрации
белковых карбонильных групп на 28% (р<0,05) и малонового диальдегида на 14%
(р<0,01), а также снижение содержания восстановленного глутатиона на 14%
(р<0,01) в почечном гомогенате по сравнению с контрольной группой (таблица 3).
Полученные нами данные согласуются с целым рядом исследований доксорубицин-индуцированного оксидативного стресса в почках крыс (Venkatesan N. et al.,
1997; Zima Т. et al., 1997; Dziegiel P. et al., 2002; Malarkodi K.P. et al., 2003; Giri T. et
al., 2004; Yagmurca M. et al., 2004).
Флавиновые редуктазы (цитохром-Р450 редуктазы, цитохром Ьз-редуктазы,
15
ПАДФН-дегидрогеназы, ксантииоксидачы) способны восстанавливать доксорубицин в клетках из формы хинона до семихинона (Davies K.J., Doroshow J.H., 1986). В
этой форме он является свободным радикалом и способен восстанавливать кисло­
род до супероксиданион радикала, окисляясь до исходной хиноновой формы
(Powis G., 1989), что приводит к снижению концентрации восстановленного глута­
тиона и развитию оксидативного стресса (Klatt Р., I.amas S., 2000).
Глицин и мелатонин предотвратили вызванное доксорубицином повышение
концентрации малонового диальдегида в почках крыс, тогда как на увеличение со­
держания белковых карбонильных групп оба препарата не повлияли. Глицину, в
отличие
от
мелатонина,
также
удалось
предупредить
доксорубицин-
индуцированное снижение концентрации восстановленного глутатиона в почках
крыс {таблица 3).
Таблица 3
Влияние исследуемых препаратов на содержание маркеров оксидативного
стресса и активность антиоксидантных ферментов в почках у крыс
(доксорубицнновая модель)
Группа
Интактиые
Белковые карбониль­
ные группы (моль/мг 2,02±0,12
белка)
Малоновый диальде1,92+0,07
гил (нмоль/мг белка)
Восстановленный
глутатион (мкг/мг
2,73±0,05
белка)
Глутатионпероксидаза (мкмоль/мип/мг
1,9610,08
белка)
Глутатионредуктаза
(нмоль/мии/мг бел­
5,39±0,13
ка)
Контроль
Доксорубицин
Мелатонин +
доксоруби1(ИН
Глицин +
доксорубицин
Глицин
2,06+0.18
2,64+0,16'°
2,16±0,10
2,19+0.08
2,04±0,12
1,90±0,05
2,17±0,0б"°°
1,9810.05*
1,93+0,06*
1,88+0,10
2,75+0,08
2,34±0,08 * * "
2,60±0,08
2,71+0,06 *♦
2,76±0,09
1,93 ±0,13
1,44+0,06'°
1,91±0,05 **♦
1,86+0,08***
1,93±0,14
4 , 2 9 1 0 , 1 1 " ° ° 5,14±0,08° ***
5,32+0,10***
5,41 ±0,13
5,39±0,18
Примечание: статистически достоверно по сравнению с интакттюй группой
'^ - при р<0,05 и '^ при р<0,01; с контрольной группой ° - при р<0,05 и °° - при
р<0,01; с группой животных, получавших только доксорубицин * - при р<0,05,
♦* - при р<0,01 и *** - при р<0,001.
16
Наличие у глицина более выраженных нефропротекторных свойств по срав­
нению с мелатонином было подтверждено и в условиях доксорубициновой нефропатии у крыс. Аминокислота, в отличие от мелатонина, предотвратила протеинурию и понижение концентрации восстановленного глутатиона в почках животных,
а также более благоприятно повлияла на структурные изменения в почках живот­
ных, индуцированные доксорубицином.
Полученные результаты показали, что глицин является эффективным про­
тектором доксорубицин-индуцированного повреждения почек.
Таблица 4
Влияние ударно-волнового воздействия и исследуемых препаратов на функ­
циональные показатели, маркеры оксидативного стресса и антиоксидантных
ферментов в почках у крыс
Группа
Мочевина сыворотки
крови(мг/100мл)
Белковые карбонильные
группы (моль/мг белка)
Малоновый диальдегид
(нмоль/мг белка)
Восстановленный глутатион (мкг/мг белка)
Супероксиддисмутаза
(мкмоль/ мин/мг белка)
Глутатионпероксидаза
(мкмоль/ мин/мг белка)
Глутатионредуктаза
(нмоль/ мин/мг белка)
Интактные
18,91+1,56
ДУВЛ
Витамин Е +
ДУВЛ
Глицин +
ДУВЛ
Глицин
27,34±1,21 ° ° ° 20,2410,80 ** 20,2610,74 *♦ 18,8210,61
2,02±0,12
2,47+0,08 °
2,0610,09 *
2,06+0,08 **
1,9710,15
1,92+0,07
2,48+0,11 ''°
1,98+0,12*
1.92Ю.13*
1,9310,12
2,73±0,05
2,29+0,04 °°°
2,67+0,09 **
2,6510,18
2,72+0,09
1,85±0,09
1,5210,08°
1,8610,15*
1,85+0,09 *
1,8410,06
1,96+0,08
1,56+0,09°
1,8010,10
1,89+0,11 *
1,91+0,09
3,80±0,18°°° 5,0110,10 ° * * * 5,1510,22 **
5,4110,12
5,39±0,13
Примечание: статистически достоверно с интактной группой ° - при р<0,05,
°° - при р<0,01 и ° ° ° - при р<0,001; с группой животных, подвергшихся ударноволновому воздействию * - при р<0,05, ** - при р<0,01 и *** - при р<0,001.
Заключительная часть нашего исследования была посвящена изучению влия­
ния ударно-волнового воздействия на функциональные показатели, процессы пе­
реокисления и состояние антиоксидантной защиты почек у крыс, а также оценке
протекторных возможностей глицина в условиях ДУВЛ повреждения. Ударноволновое воздействие (мощностью 4,5 Дж, 1000 импульсов) вызвало 45%-1юе по­
вышение концентрации мочевины в сыворотке крови животных по сравнению с
17
интактнои группой (р<0,001), что было устранено введением как глицина (50 мг/кг
внутрибрюшинно), так и витамина Е (50 мг/кг внутрибрюшинно) в течение '' дней
до Д У В Л (таблш^а 4). Достоверных изменений в концентрации креатинина в сы­
воротке крови и общего белка в моче ударные волны не вызвали.
Однако Д У В Л привела к повышению содержания белковых карбонильных
групп на 22% (р<0,05) и малонового диальдегида на 29% (р<0,01), а также к сни­
жению концентрации восстановленного глутатиона на 16% (р<0,001) по сравнению
с интактными животными (таблица 4). Полученные нами данные согласуются с
результатами исследования С.А. Голованова с соавторами (1998), в котором было
показано, что после проведения сеансов ударно-волттового дробления камней на­
блюдается повышение концентрации продуктов перекисного окисления - малоно­
вого диальдегида и диеновых конъюгатов в плазме, моче и эритроцитах больных.
Токоферола ацетат предупредил изменения всех перечисленных показателей окис­
лительного стресса в почках, а глицин устранил лишь повышение белковых карбо­
нильных групп и малонового диальдегида, вызванные ДУВЛ.
На пятые сутки после ударно-волнового воздействия наблюдалось снижение
активности глутатионредуктазы на 26% (р<0,001), супероксиддисмутазы на 18%
(р<0,05) и глутатионпероксидазы на 20% (р<0,05) в гомогенате почек крыс по
сравнению с интактными животными {таблица 4). С.А. Голованов с соавторами
(1998) установили, что наибольшую чувствительность к действию ударных волн
проявляет ферментное звено антиоксидаптной системы, активность которого сни­
жается, что и подтвердили полученными нами данные. Глицин, в отличие от токо­
ферола, предотвратил ослабление активности всех трех исследуемых антиоксидантных ферментов в почках у крыс. Витамин Е устранил снижение активности
лишь глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы.
Таким образом, подтвердилась значительная роль окислительного механизма
повреждающего действия ударных волн на почечную паренхиму и способность
глицина предупреждать негативные эффекты ДУВЛ на почки у крыс.
Суммируя выше сказанное, можно заключить, что 1лицин предупреждает
гентамициновое, доксорубициновое и ударно-волновое повреждение почек у крыс
18
и может рассматриваться в качестве перспективного средства для профилактики
указанных нефропатий.
ВЫВОДЫ
1) Глицин обладает свойствами нефропротектора в условиях геншмицинового, доксорубицинового и ударно-волнового повреждения почек у крыс.
2) Применение глицина позволяет предупредить вызванную гентамицином
почечную недосгаточность и оказывает гюложительное влияние на структурные
изменения в почках крыс за счет предотвращения развития окислительного стресса
и сохранения активности антиоксидантных ферментов.
3) Глицин препятствует развитию доксорубицин-индуцированного оксидативного стресса и ослаблению антиоксидантной защиты в почках, что позволяет
устранить вызванную антибио гиком азотемию и уменьшить выраженность протеинурии и гломерулопатии у крыс.
4) Ударно-волновое воздействие вызывает увеличение уровня мочевины в
сыворотке крови, повышение концентрации малонового диальдегида и белковых
карбонильных групп, а также снижение активности антиоксидантных ферментов в
гомогенате почек крыс.
5) Введение глицина в течение семи дней до проведения ударно-волнового
воздействия устраняет вызываемые функциональные и оксидативные изменения в
почках у крыс.
6) Нефропротекторная активность глицина не уступает, а по некоторым па­
раметрам даже превосходит эффективность мелатонина в условиях гентамициновой и доксорубициновой нефропатий и а-токоферола ацетата при ударно-волновом
повреждении почек животных.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
Наличие у глицина нефропротекторных свойств в условиях гентамициновой,
доксорубициновой и ударно-волновой нефропатий позволяет рекомендовать даль­
нейшее изучение возможности его использования у больных при терапии инфек­
ционных заболеваний, в онкологической и урологической практике.
19
С П И С О К РАБОТ, О П У Б Л И К О В А Н Н Ы Х ПО Т Е М Е ДИССЕРТАЦИИ
1. Селиванова О. С. Морфологическая картина мочи как метод оптимизации
эффективности лечения мочекаменной болезни /О. С. Селиванова, И. В. Акулина
//Человек и его здоровье: сб. тезисов VII Всероссийской медико-биологической
конференции молодых ученых «Человек и его здоровье». - СПб., 2004. - С. 256.
2. Селиванова О. С. Возможности применения современных методов диаг­
ностики мочекаменной болезни для оценки литолитической акгивности лекарст­
венных
препаратов /О. С. Селиванова, С. М. Напалкова, С. Н.
Миков
//Медицинские аспекты охраны и укрепления здоровья: материалы X X X I X научнопрактической межрегиональной конференции врачей. - Ульяновск, 2004. - С. 612613.
3. Селиванова О. С. Возможности оценки эффективности фармакотерапии с
помощью абсорбционной инфракрасной спектроскопии биологических жидкое! ей
/О. С. Селиванова, С. М. Напалкова, С. Н. Миков //Ученые записки Ульяновского
государственного университета /под ред. проф. В. Ф. Сыча. - Ульяновск: УлГУ,
2004. - Сер. Биология, выпуск 1 (8). - С. 127-128.
4. Клочков В. В. Распространенность мочекаменной болезни в городе Улья­
новске /В. В. Клочков, С. М. Напалкова, О. С. Селиванова //Известия высших
учебных заведений Поволжский регион. Сер. Медицина. - 2004. - Выпуск 3(12).С. 58-62.
5. Возможности коррекции оксидативного стресса, вызванного доксорубицином, в почках крыс ЛО. В. Саенко [и др.] //Человек и лекарство: тез, докладов
X I I Российского национального конгресса. - М., 2005. - С. 791.
6. Влияние эритропоэтина на доксорубицин-индуцированный оксидативный
стресс у крыс /Ю. В. Саенко [и др.] //Актуальные вопросы здравоохранения. Про­
блемы, поиски, решения: материалы Х Х Х Х научно-практической межрегиональ­
ной конференции врачей. - Ульяновск: ОГУП «Облтипография «Печатный двор»,
2005.-С. 686-688.
7. Селиванова О. С. Возможность коррекции глицином цитотоксических
эффектов доксорубицина у крыс /О. С. Селиванова //Актуальные вопросы здраво-
20
охранения. Проблемы, OOVICKH, решения: материалы Х Х Х Х научно-практической
межрегиональной конференции врачей. - Ульяновск: ОГУП «Облтипофафия «Пе­
чатный двор», 2005. - С. 688-689.
8. Глицин и эмоксипин в предупреждении развития оксидативного стресса в
почках крыс, вызванного дистанционной ударноволновой литочрипсией /О. С. Се­
ливанова [и др.] //Ученые записки Ульяновского государственного университета
/под ред. проф. В. Ф. Сыча. - Ульяновск: УлГУ, 2005. - Сер. Биология, выпуск 1
(9). - С. 75-77.
9. Эритропоэтин снижает проявления оксидативного стресса, индуцирован­
ного доксорубицином, в почках крыс /Ю. В. Саенко [и др.] //Нефрология. - 2005. Т. 9, №2.-С.96-100.
10. Селиванова О. С. Возможности коррекции глицином оксидативного
стресса, индуцированного доксорубицином, в почках крыс /О. С. Селиванова, С.
М. Напалкова, Ю. В. Саенко //Актуальные вопросы здоровья и среды обитания со­
временного человека: материалы 2-й Всероссийской научной конференции /под
ред. В. И. Мидленко. - Ульяновск: УлГУ, 2005. - С. 81-82.
11. Селиванова О. С. Глицин как средство предупреждения гентамицининдуцированного повреждения почек у крыс /О.С. Селиванова //Актуальные во­
просы здоровья и среды обитания современного человека: материалы 2-й Всерос­
сийской научной конференции /под ред. В. И. Мидленко. - Ульяновск: УлГУ, 2005.
- С . 103.
Подписано в печать 1.11.05.
Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1,0.
Тираж 100 экз. Заказ №146/Л5"СЗ
Отпечатано с оригинал-макета
в лаборатории оперативной полиграфии
Ульяновского государственного университета
432970, г. Ульяновск, ул. Л. Толстого, 42
IH23585
РНБ Русский фонд
2006-4
23347
ь
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
954 Кб
Теги
bd000102933
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа